DE69637432T2

DE69637432T2 - Adenovirale vektoren für die gentherapie

Info

Publication number: DE69637432T2
Application number: DE69637432T
Authority: DE
Inventors: Donna Belmont ARMENTANO; Helen Westboro ROMANCZUK; Samuel C. Shrewsbury Wadsworth
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 1995-03-24
Filing date: 1996-03-20
Publication date: 2009-03-05
Anticipated expiration: 2016-03-21
Also published as: US5824544A; DE69637432D1; EP1923467A2; US5707618A; EP1923467A3

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Adenovirusvektoren zur Verwendung bei der Gentherapie, die dazu bestimmt sind, die Erzeugung von replikationskompetenten Adenoviren (RCA) während der in vitro-Vermehrung und der klinischen Verwendung zu verhindern. Die Erfindung stellt auch Verfahren für die Herstellung neuer Virusvektoren zur Verfügung. Diese Vektoren maximieren die Sicherheit für klinische Anwendungen, bei denen Adenovirusvektoren verwendet werden, um Gene für die Gentherapie in Empfängerzellen zu transferieren.
Hintergrund der Erfindung
Die Aussichten für die Gentherapie, genetische Krankheiten zu korrigieren oder therapeutische Moleküle zuzuführen, hängen von der Entwicklung von Gentransfervehikeln ab, die exogene Nucleinsäuren einer Empfängerzelle sicher zuführen können. Bis heute haben sich die meisten Anstrengungen auf die Verwendung von virusabgeleiteten Vektoren konzentriert, die ein heterologes Gen (Transgen) tragen, um die natürliche Fähigkeit eines Virus auszunutzen, einer Zielzelle genomischen Inhalt zuzuführen.
Die meisten Versuche, virale Vektoren für die Gentherapie zu verwenden, haben sich auf Retrovirusvektoren gestützt, und zwar hauptsächlich aufgrund ihrer Fähigkeit, sich in das zelluläre Genom zu integrieren. Jedoch werden die Nachteile der retroviralen Vektoren zunehmend klarer, einschließlich ihres Tropismus nur für sich teilende Zellen, die Möglichkeit der insertionellen Mutagenese bei der Integration in das Zellgenom, der verringerten Expression des Transgen im Lauf der Zeit, der schnellen Inaktivierung durch Serumkomplement und der Möglichkeit der Erzeugung von replikationskompetenten Retroviren (Jolly, D., Cancer Gene Therapy 1: 51–64, 1994; Hodgson, C. P., Bio Technology 13: 222–225, 1995).
Das Adenovirus ist ein nucleäres DNA-Virus mit einem Genom von etwa 36 kb, das in den Untersuchungen auf dem Gebiet der klassischen Genetik und Molekularbiologie gut charakterisiert worden ist (Horwitz, M. S., "Adenoviridae and Their Replication" in Virology, 2. Auflage, Fields, B. N., et al., Herausgeber, Raven Press, New York, 1990). Das Genom ist in frühe (als E1–E4 bekannt) und späte (als L1–L5 bekannt) transcriptionelle Einheiten klassifiziert, wobei Bezug genommen wird auf die Erzeugung von zwei temporalen Klassen von viralen Proteinen. Die Abgrenzung zwischen diesen Ereignissen ist die virale DNA-Replikation.
Adenovirusbasierte Vektoren bieten mehrere einzigartige Vorteile, einschließlich des Tropismus für sowohl sich teilende als auch für sich nicht teilende Zellen, eines minimalen pathogenen Potentials, der Fähigkeit, sich für die Herstellung von Vektorstämmen auf einen hohen Titer zu replizieren, und des Potentials, große Inserts zu tragen (Berkner, K. L., Curr. Top. Micro. Immunol. 158: 39–66, 1992; Jolly, D., Cancer Gene Therapy 1: 51–64, 1994). Die Clonierungsfähigkeit eines Adenovirusvektors beträgt etwa 8 kb, was sich aus der Deletion von bestimmten Regionen des Virusgenoms ergibt, die für das Viruswachstum entbehrlich sind, z. B. E3, Deletionen von Regionen, deren Funktion in trans aus einer Verpackungszelllinie, z. B. E1, wiederhergestellt wird, und seine Komplementation durch 293 Zellen (Graham, F. L., J. Gen. Virol. 36: 59–72, 1977), sowie die obere Grenze für ein optimales Verpacken, das etwa 105%–108% der Wildtyplänge beträgt.
Gene, die bis heute durch adenovirale Vektoren exprimiert worden sind, umfassen p53 (Wills et al., Human Gene Therapy 5: 1079–1088, 1994), Dystrophin (Vincent et al., Nature Genetics 5: 130–134, 1993), Erythropoietin (Descamps et al., Human Gene Therapy 5: 979–985, 1994), Ornithintranscarbamylase (Stratford-Perricaudet et al., Human Gene Therapy 1: 241–256, 1990), Adenosindesaminase (Mitani et al., Human Gene Therapy 5: 941–948, 1994), Interleukin-2 (Haddada et al., Human Gene Therapy 4: 703–711, 1993) und α1-Antitrypsin (Jaffe et al., Nature Genetics 1: 372–378, 1992).
Der Tropismus von Adenoviren für Zellen des Atemwegs ist von besonderer Bedeutung für die Verwendung des Adenovirus in der Gentherapie für Mukoviszidose (CF), die die häufigste autosomal-rezessive Krankheit bei Kaukasiern ist, die aufgrund von Mutationen eine Lungendysfunktion in dem Transmembrankonduktanzregulator-(CFTR-)Gen verursacht, das den cAMP-geregelten Cl^–-Kanal im Atemwegsepithelium stört (Zabner, J. et al., Nature Genetics 6: 75–83, 1994). Adenovirusvektoren, die gentechnisch verändert sind, um das CFTR-Gen zu tragen, wurden entwickelt (Rich, D. et al., Human Gene Therapy 4: 461–476, 1993), und Untersuchungen haben die Fähigkeit dieser Vektoren gezeigt, CFTR dem Nasenepithelium von CF-Patienten (Zabner, J. et al., Cell 75: 207–216, 1993), dem Atemwegsepithel von Baumwollratten und Primaten (Zabner, J. et al., Nature Genetics 6: 75–83, 1994), und dem respiratorischen Epithelium von CF-Patienten (Crystal, R. G. et al., Nature Genetics 8: 42–51, 1994) zuzuführen.
Eines der kritischen Probleme, die bei der Entwicklung von sicheren viralen Vektoren verbleiben, ist es, die Erzeugung eines replikationskompetenten Virus während der Vektorerzeugung in einer Verpackungszelllinie oder während der Gentherapiebehandlung einer Person zu verhindern. Die Erzeugung dieser replikationskompetenten Viren stellt die Gefahr einer unbeabsichtigten Virusinfektion mit den damit verbundenen pathologischen Folgen für den Patienten dar.
Das Vorhandensein des Wildtyp-Adenovirus in den Empfängerzellen der humanen Kandidaten für die Gentherapie stellt eine Möglichkeit für das Erzeugen des replikationskompetenten Adenovirus (RCA) aufgrund von homologen DNA-Sequenzen dar, die in dem Vektor und den Empfängerzellen vorhanden sind (Jolly, D., Cancer Gene Therapy 1: 51–64, 1994).
Des weiteren kann die Erzeugung von neuen Viren, die ein Transgen tragen, die Dosierungserfordernisse für die optimale Gentherapie stören, da Extrakopien des Gens durch neue Viren, die das Transgen tragen, erzeugt werden können. Es ist deshalb entscheidend, Vektoren zu entwickeln, die nicht nur replikationsdefektiv sind, sondern dazu bestimmt sind, das rekombinogene Potential auf ein Minimum herabzusetzen sowie die schädlichen Wirkungen eines Rekombinationsereignisses durch Selbstzerstörung zu begrenzen.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung stellt Gentherapievektoren zur Verfügung, die wirksam sind, um Patienten nützliche Gene zuzuführen, die konstruiert sind, um toxische oder immunologische Konsequenzen für den Patienten auf ein Minimum herabzusetzen.
Die Erfindung betrifft neue Adenovirusvektoren, die durch das Auftreten eines Rekombinationsereignisses innerhalb einer Verpackungszelle oder einer Empfängerzelle inaktiviert werden und deshalb die Erzeugung von replikationskompetenten Adenoviren (RCA) verhindern. Die Inaktivierung kann durch den Verlust eines wesentlichen Gens oder durch die Erzeugung eines Vektorgenoms, das nicht verpackt werden kann, auftreten.
Die Erfindung betrifft auch Vektoren, die das Auftreten eines Rekombinationsereignisses mit Verpackungszellen oder Empfängerzellen durch Vektorgenomumgruppierungen auf ein Minimum herabsetzen, die die Homologie mit viralen Sequenzen verringern, die in einer Verpackungszelle oder einer Empfängerzelle möglicherweise vorhanden sind, um die Erzeugung von RCA zu verhindern.
Diese Vektordesigns erhöhen die Sicherheit von rekombinanten Adenovirusvektoren zur Verwendung als Gentransvervehikel bei Gentherapieanwendungen.
So stellt die Erfindung unter einem Aspekt eine Nucleotidsequenz zur Verfügung, die Elemente eines Adenovirusgenoms sowie ein heterologes Gen von Säugerursprung, das unter der Kontrolle eines eukaryontischen transcriptionellen Promotors steht, enthält. Diese Nucleotidsequenz kann als Vektor wirken, der die Expression des vorstehend erwähnten heterologen Gens gestattet, wenn der Vektor in eine Zelle einer Person eingebracht wird. Diese Nucleotidsequenz ist des weiteren durch das Fehlen der Sequenz eines ersten Elements des Adenovirusgenoms gekennzeichnet, das wesentlich für die Replikation oder Verpackung des Adenovirus in einer Wirtssäugerzelle und das Einbringen eines zweiten Elements des Adenovirusgenoms, das selbst wesentlich für die Replikation oder das Verpacken des Adenovirus in einer Wirtssäugerzelle ist, in die Nucleotidsequenz an oder direkt benachbart der Stelle der Nucleotidsequenz ist, die anderweitig durch das erste Element belegt ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Nucleotidsequenz, bei der das erste Element die E1a–E1b-Region des Adenovirusgenoms ist und das zweite Element eine beliebige sein kann von der E4-Region des Adenovirus, der Region E2A, dem für das terminale Protein codierenden Gen oder den strukturellen Adenovirusproteinen, wie der Faser L5.
Ein weiterer Aspekt stellt eine Nucleotidsequenz zur Verfügung, die Elemente eines Adenovirusgenoms und eines heterologen Gens von Säugerursprung enthält, das unter der Kontrolle eines eukaryontischen transcriptionellen Promotors steht, in dem die E1a–E1b-Region des Adenovirusgenoms fehlt und wo eine Füllersequenz in die Nucleotidsequenz in einer anderen Stelle als derjenigen des heterologen Gens des Säugerursprungs inseriert worden ist. Ein Vektor, der diese Sequenz enthält, ist des weiteren dadurch gekennzeichnet, dass die richtige Rekombination der Sequenz mit einem Element, das in einer Helferzelle vorhanden ist, die verwendet wird, um die Sequenz zu replizieren oder zu verpacken, oder mit einem Element, das in einer Zelle einer Person vorhanden ist und eine Homologie mit der E1a-E1b-Region besitzt, zur Herstellung einer verlängerten Nucleotidsequenz führt, die wesentlich weniger wirksam ist als eine nichtmodifizierte Nucleotidsequenz beim Verpacken in die Helferzelle oder eine Zelle dieser Person.
Die Erfindung stellt auch eine Nucleotidsequenz, wie vorstehend angegeben, zur Verfügung, die das Gen für das adenovirale Protein IX und ein heterologes Gen von Säugerursprung umfasst, das unter der Kontrolle eines eukaryontischen transcriptionellen Promotors steht. Diese letztere Nucleotidsequenz ist dadurch gekennzeichnet, dass die E1a–E1b-Region des Adenovirusgenoms fehlt und das Gen, das für das Protein IX codiert, an eine Stelle repositioniert wird, die von seiner normalen Stelle in dem Wildtyp-Adenovirusgenom abweicht.
Die Erfindung stellt des weiteren eine Nucleotidsequenz, wie vorstehend angegeben, zur Verfügung, die das Gen für das adenovirale Protein IX deletiert und ein heterologes Gen von Säugerursprung aufweist, das unter der Kontrolle eines eukaryontischen transcriptionellen Promotors steht. Diese Nucleotidsequenz ist auch dadurch gekennzeichnet, dass die E1a-E1b-Region des Adenovirusgenoms fehlt und dass die Sequenz etwa 90% der Länge des Adenovirusgenoms nicht übersteigt.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Verfügung für das Minimieren der Aussetzung einer Person, die sich einer Gentherapie unterzieht, bei der ein Virusvektor zum Zuführen eines heterologen Gens verwendet wird, an einen replikationskompetenten Virus. Dieses Verfahren umfasst den Schritt des Behandelns der Person mit einer Gentherapiezusammensetzung, die selbst einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und einen oder einen anderen der Vektoren, die die vorstehend beschriebenen Nucleotidsequenzen aufweisen, umfasst.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 Schematisches Diagramm von gegenwärtigen Vektorkonstrukten und die Darstellung eines Rekombinationsereignisses in 293 Zellen. Neue Konstrukte werden gezeigt, die einen replikationsinkompetenten Vektor durch die Deletion eines wesentlichen Gens nach der Rekombination erzeugen.
2 Gezeigt wird ein neuer Vektor der Erfindung, der bei Rekombination mit dem Wildtyp-Virus replikationsinkompetente Vektoren erzeugt, bei denen ein wesentliches Gen oder Segment deletiert ist.
3 Gezeigt wird das 3'-Ende eines neuen Vektors, bei dem das Protein IX zu der E4-deletierten Region repositioniert ist, um die Rekombination zwischen einem Vektor und 293 Zellen auf ein Minimum herabzusetzen.
4A–D Vergleich der DNA-Sequenzen von Adenovirusserotypen 2 und 5 von dem Nucleotid 1–600 (Adenovirus Typ 2: SEQ ID NO: 1 und Adenovirus Typ 5: SEQ ID NO: 3) und 3041–4847 (Adenovirus Typ 2: SEQ ID NO: 2 und Adenovirus Typ 5: SEQ ID NO: 4). Die Adenovirus-2-Sequenz ist auf der oberen Zeile und die Adenovirus-5-Sequenz ist auf der unteren Zeile zu sehen.
5 Schematisches Diagramm von verschiedenen Adenovirusvektoren, deren E1-Region deletiert ist und die das CFTR-Gen enthalten, das in die E1-Stelle in den Adenovirusgenom cloniert ist. Das CFTR-Gen steht unter der Kontrolle eines spezifischen eukaryontischen transcriptionellen Promotors und der poly-A-Stelle, wie in jedem Vektor gezeigt ist. Zusätzliche Änderungen des Adenovirusgenoms in jedem Vektor werden gezeigt.
6 BclI Restriktionsenzymanalyse der Wildtyp-Adenovirusserotypen 2 und 5 und der Adenovirusvektoren, die in 5 gezeigt sind. Das Restriktionsenzymmuster der RCA, die während der Vektorherstellung in 293 Zellen erzeugt wurden, wird unter jedem Vektor gezeigt.
7 Schematisches Diagramm der RCA, die während der Vektorherstellung in 293 Zellen erzeugt wurden. Die Struktur der RCA wird unter Bezugnahme auf die spezifischen Nucleotidgrenzen der Rekombinationsstelle und auf die Serotypquelle der E1-Region und des Protein-IX-Gens gezeigt.
8A Schematisches Diagramm der Konstruktion von pAd2/E1ACFTRsvdra-.
9 Schematisches Diagramm der Konstruktion von pAdE4ORF6ΔE3B.
10 Schematisches Diagramm der in vivo-Rekombinationsschritte, die zur Erzeugung von Ad2/CFTR-7 verwendet werden.
11 Schematisches Diagramm von Experimenten, um die RCA-Erzeugung während mehrerer Passagen der Adenoviren in 293 Zellen zu untersuchen. Der Zeitplan der Passagen wird zusammen mit dem RCA-Bioassay gezeigt, der nach den Passagen 3, 6, 9 und 12 durchgeführt wurde. HA bezieht sich auf die HeLa- und A549-Zellen, die in dem Assay sequentiell verwendet wurden; die zwei Zahlen, die folgen, geben jeweils die Anzahl von Tagen der Infektion in jeder Zelllinie an. Die infektiöse Dosis, die in dem RCA-Assay verwendet wurde, ist gezeigt, wobei E = Exponent ist und in infektiösen Einheiten (IU) ausgedrückt ist.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung betrifft Adenovirusvektoren, die durch das Auftreten eines legitimen Rekombinationsereignisses innerhalb einer Verpackungszelle oder einer Empfängerzelle inaktiviert werden und deshalb die Erzeugung der replikationskompetenten Adenoviren (RCA) verhindern. Die legitime Rekombination ist diejenige, die von der spezifischen und normalen Basenpaarung bei Sequenzen abhängt, bei denen man erkannt hat, dass sie füreinander eine Homologie besitzen. Die Inaktivierung kann durch den Verlust eines wesentlichen Gens oder durch die Erzeugung eines Vektorgenoms auftreten, das nicht verpackt werden kann.
Die Erfindung betrifft auch Vektoren, die das Auftreten eines Rekombinationsereignisses bei Verpackungszellen oder Empfängerzellen durch Vektorgenom-Umgruppierungen, die die Homologie mit viralen Sequenzen verringern, die in einer Verpackungszelle oder einer Empfängerzelle vorhanden sein können, auf ein Minimum herabsetzen, um die Erzeugung von RCA zu verhindern. Empfängerzellen, die das Ziel für eine Gentherapie sind, können eine Wildtyp-Adenovirus-DNA-Sequenz enthalten, die sich mit einem Adenovirus rekombinieren kann (Jolly, D., Cancer Gene Therapy 1: 51–64, 1994).
Diese Vektordesigns erhöhen deshalb die Sicherheit der rekombinanten Adenovirusvektoren zur Verwendung als Gentransfervehikel bei Gentherapieanwendungen.
So stellt die Erfindung unter einem Aspekt eine Nucleotidsequenz zur Verfügung, die Elemente eines Adenovirusgenoms sowie ein heterologes Gen von Säugerursprung enthält, das unter der Kontrolle eines eukaryontischen transcriptionellen Promotors steht. Diese Nucleotidsequenz kann als Vektor wirken, der die Expression des vorstehend erwähnten heterologen Gens gestattet, wenn der Vektor in eine Zelle einer Person eingebracht worden ist. Die Nucleotidsequenz ist des weiteren durch das Fehlen eines ersten Elements des Adenovirusgenoms aus der Sequenz, das für die Replikation oder Verpackung des Adenovirus in einer Wirtssäugerzelle wesentlich ist, und das Einbringen eines zweiten Elements des Adenovirusgenoms gekennzeichnet, das selbst wesentlich für die Replikation oder Verpackung des Adenovirus in einer Wirtssäugerzelle in die Nucleotidsequenz an der oder direkt benachbart der Stelle der Nucleotidsequenz ist, die ansonsten von dem ersten Element belegt ist.
Es ist gemäß der Praxis der Erfindung ersichtlich, dass die Bezugnahme auf Elemente des viralen Genoms (wie das erste und das zweite Element, auf die hier Bezug genommen wird), die als wesentlich bezeichnet werden, auch die Bezugnahme auf Elemente umfasst, die die Replikation oder das Verpacken erleichtern, die jedoch für solche Prozesse nicht absolut wesentlich sind.
Mit Bezug auf diesen Aspekt der Erfindung ist das heterologe Gen jedes Gen, das als brauchbar erkannt wird. Repräsentative Beispiele umfassen Gene von Säugerursprung, die beispielsweise für Proteine oder brauchbare RNAs codieren, virale Proteine wie Herpesthymidinkinase und bakterielles Choleratoxin für die zytotoxische Therapie.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Nucleotidsequenz, bei der das erste Element die E1a–E1b-Region des Adenovirusgenoms ist und das zweite Element ein beliebiges sein kann aus der E4 Region des Adenovirus, der Region E2A, dem Gen, das für terminales Protein codiert oder dem strukturellen Adenovirus wie der Faser L5.
Ein weiterer Aspekt stellt eine Nucleotidsequenz zur Verfügung, die Elemente eines Adenovirusgenoms und ein heterologes Gen von Säugerursprung enthält, das unter der Kontrolle eines eukaryontischen transcriptionellen Promotors steht, bei dem die E1a–E1b-Region des Adenovirusgenoms fehlt und wo eine Füllersequenz in die Nucleotidsequenz an einer anderen Stelle als derjenigen des heterologen Gens von Säugerursprung inseriert wurde. Ein Vektor, der diese Sequenz enthält, ist des weiteren dadurch gekennzeichnet, dass die legitime Rekombination der Sequenz mit einem Element, das in einer Helferzelle vorhanden ist, die zum Replizieren oder Verpacken der Sequenz verwendet wird, oder mit einem Element, das in einer Zelle einer Person vorhanden ist und eine Homologie mit der E1a–E1b-Region aufweist, zur Herstellung einer verlängerten Nucleotidsequenz führt, die beträchtlich weniger wirksam als eine nichtmodifizierte Nucleotidsequenz beim Verpacken in die Helferzelle oder in eine Zelle der Person ist.
Unter zusätzlicher Sequenz wird eine inerte Sequenz verstanden, die die Wirkung des Vektors nicht nachteilig beeinflusst. Die Länge der zusätzlichen Sequenz wird auf der Grundlage der Länge der deletierten Sequenz ausgewählt. Beispielsweise beträgt dann, wenn die Deletion aus der E1-Region besteht, ein akzeptables Insert etwa 3 kb, was auf Prinzipien, die Fachleuten auf der Grundlage von der Erwägung einer Vektorlänge für das optimale Verpacken bekannt sind, beruht.
Die Erfindung stellt auch eine Nucleotidsequenz, wie vorstehend angegeben, zur Verfügung, die das Gen für das adenovirale Protein IX und ein heterologes Gen von Säugerursprung enthält, das unter der Kontrolle einer eukaryontischen transcriptionellen Promotors steht. Diese letztere Nucleotidsequenz ist dadurch gekennzeichnet, dass die E1a–E1b-Region des Adenovirusgenoms fehlt und das Gen, das für das Protein IX codiert, zu einer Stelle repositioniert wurde, die von seiner normalen Stelle in dem Wildtyp-Adenovirusgenom abweicht.
Vorzugsweise wird es zu einer Stelle um im Allgemeinen wenigstens etwa 100 Nucleotide entfernt, vorzugsweise um etwa 500 Nucleotide entfernt und am meisten bevorzugt um etwa 100 Nucleotide entfernt, repositioniert.
Die Erfindung stellt auch eine Nucleotidsequenz, wie vorstehend angegeben, zur Verfügung, die das Gen für das adenovirale Protein IX deletiert und ein heterologes Gen von Säugerursprung umfasst, das unter der Kontrolle eines eukaryontischen transcriptionellen Promotors steht. Diese Nucleotidsequenz ist auch dadurch gekennzeichnet, dass die E1a–E1b-Region des Adenovirusgenoms fehlt und dass die Sequenz etwa 90% der Länge des Adenovirusgenoms nicht übersteigt.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Minimieren der Aussetzung einer Person, die sich einer Gentherapie unter Verwendung eines Virusvektors zur Zuführung eines heterologen Gens unterzieht, an ein replikationskompentes Virus zur Verfügung, wobei das Verfahren den Schritt des Behandelns dieser Person mit einer Gentherapiezusammensetzung umfasst, die selbst einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthalten, und Vektoren, die die vorstehend beschriebenen Nucleotidsequenzen verwenden.
Rekombinationsabhängige Zielsequenzdeletionsvektoren
Dieser Aspekt der Erfindung betrifft Vektoren, die die Erzeugung von RCA durch ein Adenovirusvektordesign verhindern, bei dem ein wesentliches Gen oder genomisches Segment (das Deletionsziel) innerhalb einer Region eingebracht wird, die potentiell einer Rekombination unterliegt, weil eine Verpackungszelle oder Empfängerzelle homologe virale Sequenzen enthält. Das Ergebnis eines potentiellen Rekombinationsereignisses zwischen zellulären Sequenzen und dem Vektor ist es, dass dieses wesentliche Gen- oder genomische Segment bei der Rekombination deletiert wird, wodurch der virale Vektor replikationsinkompetent gemacht wird. Dies wird durch die Umgruppierung des Genoms erzielt, sodass das Deletionsziel von seiner ursprünglichen genomischen Stelle bewegt wird, damit es sich innerhalb der Region befindet, die potentiell einer Rekombination unterliegt. Obwohl die Rekombination eine fehlende virale Sequenz wiederherstellen kann, wird das Virus durch den Verlust eines wesentlichen Gens beeinträchtigt, der durch das Rekombinationsereignis verursacht wird.
Bei einer Ausführungsform der Erfindung ist dieses Vektordesign anwendbar, um Rekombinationsereignisse in einer Verpackungszelllinie wie 293 Zellen zu verhindern (Graham, F. L., J. Gen. Virol. 36: 59–72, 1977). Diese Zellen, die eine intakte ansteckende virale E1-DNA-Sequenz enthalten, die von dem Adenovirus 5 von der 5'-ITR zu etwa dem Nucleotid 4300 abgeleitet ist (der Bezug für die Nummerierung ist Roberts, R. J., in Adenovirus DNA, Oberfler, W., Herausgeber, Matinus Nihoft Publishing, Boston, 1986), das in das Genom integriert ist, sind imstande, die E1-Genprodukte in trans einem mit Bezug auf E1 deletierten Adenovirusvektor zuzuführen. Die Erzeugung von RCA ist aus der Rekombination zwischen den E1-Sequenzen in der Zelle und den übrigen Sequenzen an der Grenze von E1 in dem Vektor, wie dem Protein IX möglich, wenn ausreichend flankierende homologe Sequenzen vorhanden sind, um ein legitimes Rekombinationsereignis zu erleichtern.
Bei einer spezifischen Ausführungsform wird ein Adenovirusvektor, der mit Bezug auf die E1-Region und die E4-Region mit Ausnahme des ORF6-Gens deletiert ist, konstruiert, indem eine Expressionskassette in die E4-deletierte Region inseriert wird (1). Das ORF6-Gen wird zu der E1-deletierten Region bewegt. Die E4-Region eines Adenovirusvektor kann mit Ausnahme des ORF6 aufgrund seiner Rolle bei der DNA-Replikation, der späten mRNA-Ansammlung und dem Shutoff der Wirtsproteinsynthese deletiert werden (Bridge, E. et al., J. Virol. 63: 631–638, 1989; Huang, M. et al., J. Virol. 63: 2605–2615, 1989). Wenn ein Rekombinationsereignis zwischen den viralen Sequenzen und 293 Zellen stattfindet, werden die E1-Sequenzen angelagert und das ORF6-Gen wird deletiert, sodass der Vektor immer noch replikationsdefektiv ist.
Unter einem weiteren Aspekt der Erfindung kann ein Vektor maßgeschneidert werden, um die Erzeugung von RCA aus einer beliebigen Verpackungszelllinie zu verhindern. Das Deletionszielgen oder -segment wird gentechnisch in die Region des Vektors verbracht, der eine Homologie mit der DNA besitzt, die in der Verpackungszelllinie enthalten ist. So bewirkt eine Rekombination innerhalb dieser Region, dass das Zielgen oder -segment deletiert wird, was zu der Erzeugung von replikationsinkompetenten viralen Vektoren führt. Vektoren, bei denen das Deletionsziel in die E2- oder E4-Regionen inseriert wird, können beispielsweise dazu gestaltet sein, Rekombinationsereignisse in Verpackungszelllinien zu umgehen, die E2- oder E4-Genprodukte liefern (Klessig, D. et al., Mol. Cell. Biol. 4: 1354–1362, 1984; Weinberg, D. et al., PNAS 80: 5383–5386, 1983). Analoge Konstrukte, die dazu gestaltet werden, eine Rekombination in analogen Verpackungszelllinien zu umgehen, fallen unter den Umfang der Erfindung.
Bei einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung kann dieses Vektordesign verwendet werden, um die Bildung von RCA aus der Rekombination mit dem Wildtyp-Adenovirus, das in der Zelle eines Patienten vorhanden sein kann, zu verhindern. Das Vorhandensein des Wildtyp-Adenovirus in humanen Kandidaten für die Gentherapie auf der Basis des Adenovirus kann eine Quelle viraler DNA-Sequenzen für Rekombinationsereignisse bieten, die RCA aus einem replikationsinkompetenten Adenovirusvektor erzeugen (Jolly, D., Cancer Gene Therapy 1: 51–64, 1994). Das Verhindern der RCA-Produktion kann durch das Verbringen von wesentlichen Genen oder Segmenten in eine oder mehrere Regionen in dem Vektor, der potential einer Rekombination mit dem Wildtyp-Adenovirus unterliegt, bewirkt werden. Durch Verbringen von wesentlichen Targets in potentielle Stellen für die Rekombination dient bzw. dienen das eine oder die mehreren Rekombinationsereignis(se) dazu, die wesentlichen viralen Gene zu deletieren und dadurch den viralen Vektor replikationsinkompetent zu machen.
Bei einer weiteren Ausführungsform, die in 2 gezeigt ist, wird ein Vektor konstruiert, der bei Rekombination mit dem Wildtypvirus replikationsinkompetent gemacht wird. Der Vektor enthält das ORF6-Gen, das in der deletierten E1-Region positioniert ist, und eine Expressionskassette, die in die deletierte E4-Region inseriert ist. Der zentrale Abschnitt des Vektorgenoms ist zu dem Wildtyp-Adenovirus homolog, und bei einem Rekombinationsereignis sind die so erzeugten Vektorgenome replikationsinkompetent wie in 2 gezeigt ist.
Wesentliche Adenovirusgene oder genomische Segmente, die positioniert werden können, um als Targets für die Deletion bei einem Rekombinationsereignis zu dienen, umfassen ORF6, L5 (Faserprotein), die gesamte E4-Region, die E2A-Region, das terminale Protein oder alle anderen wesentlichen viralen Gene oder Segmente.
Rekombinationsabhängige, verpackungsdefektive Vektoren
Dieser Aspekt der Erfindung betrifft Vektoren, die beim Auftreten eines Rekombinationseignisses mit einer Verpackungszelle oder einer Empfängerzelle verpackungsdefektiv gemacht werden, was die Erzeugung von RCA verhindert. Dieses Design macht sich die Beschränkungen zunutze, die es bezüglich der Genomlänge gibt, die in ein Adenovirus-Virion verpackt werden kann. Die Größe eines Adenovirus-Genoms, das optimal in neue Virionen verpackt werden kann, kann seine Wildtyplänge um bis zu etwa 105–108% übersteigen und trotzdem in neue Virionen verpackt werden (Berkner, K. L., Curr. Top. Micro. Immunol. 158: 39–66, 1992). Wenn ein Rekombinationsereignis ein Virusgenom erzeugt, das die Verpackungsgrenze übersteigt, wird es nicht verpackt und RCA werden nicht erzeugt.
Vektoren, die nach einer Rekombination verpackungsdefektiv sind, können durch gentechnisches Verändern der Vektor-DNA derart, dass seine Länge mindestens 101% der Wildtyplänge beträgt, geschaffen werden. Dies kann sogar mit Vektoren, die Deletionen des Wildtyp-Adenovirusgenoms enthalten, wegen der Insertion einer heterologen DNA-Sequenz, die die Deletion ausgleicht und das Genom nahe der Wildtyplänge hält, durchgeführt werden.
Die heterologe DNA-Sequenz kann allein für ein Gen, das von Interesse ist, codieren. Alternativ kann in Fällen, in denen ein heterologes Gen von kleiner Größe ist, eine zusätzliche heterologe Füller-DNA-Sequenz hinzugefügt werden, um das Vektorgenom zu einer Größe von mindestens 101% der Wildtyplänge zu bringen. Füller ist ein Begriff, der allgemein in der Technik anerkannt ist, um eine funktionell inerte Sequenz zu definieren, die die Länge davon wie bestimmte Abschnitte des Bakteriophagen Lambda verlängern soll.
Bei einer weiteren Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung wird ein Vektor gestaltet, bei dem die E1-Region sowie die E4-Region mit Ausnahme des ORF6-Gens für eine Gesamtdeletion von 5 kb deletiert wird und das CFTR-Gen in die E4-Deletionsregion inseriert wird. Diese Vektorgröße beträgt 101,3% der Wildtyplänge. Beispielsweise nach einem E1-vermittelten Rekombinationsereignis in 293 Zellen, das die E1-Region in den Vektor inseriert, vergrößert sich das Genom auf etwa 108% der Wildtyplänge, was es verpackungsdefektiv macht und die Erzeugung von RCA verhindert.
Es ist für Fachleute ersichtlich, dass das Konzept der rekombinationsabhängigen, verpackungsdefektiven Adenovirusvektoren durchgeführt werden kann. Dazu verwendet man eine beliebige Anzahl von viralen oder nichtviralen DNA-Fragmenten, die gentechnisch in eine beliebige Anzahl von Stellen im Vektor verbracht werden, mit dem Gesamtziel, eine Vektorgröße aufrechtzuerhalten, die bei der Rekombination die optimale Verpackungslänge übersteigt.
Umgruppierte Genomvektoren, die die Rekombination und Erzeugung von RCA mittels Rekombination auf ein Minimum herabsetzen
Unter diesem Aspekt der Erfindung wird das Vektorgenom, das von dem Wildtyp-Adenovirus abgeleitet ist, umgruppiert, um die lineare Gruppierung der viralen Codierungsregionen zu stören. Bei einer Ausführungsform verringert dieses "Durcheinanderbringen" des Genoms das Potential für eine Rekombination zwischen einem Wildtyp-Adenovirus, der in einem humanen Kandidaten für die Gentherapie gefunden werden kann, und dem Adenovirusvektor. Diese Verringerung ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass lange Strecken von homologen DNA-Sequenzen zwischen der Zelle und dem Vektor eliminiert werden, wenn die viralen Sequenzen in dem Vektor umgruppiert werden. Die Wahrscheinlichkeit der Rekombination wird verringert, wenn die Länge der homologen Regionen verringert wird. Auf diese Weise wird die Erzeugung von RCA auf ein Minimum herabgesetzt. Regionen des Adenovirusgenoms, die durcheinander gebracht werden können, umfassen beispielsweise die E2A-Region, die E4-Region, ORF6, L5 (Faserprotein), terminales Protein oder jede beliebige Kombination derselben und anderer Regionen des viralen Genoms, die zu einem durcheinander gebrachten Genom führen, dessen lineare Sequenz von dem Wildtyp abweicht.
Dieses Konzept kann auf Vektoren angewandt werden, bei denen mehr als eine Region des Adenovirus deletiert ist, sodass die Wiederherstellung der Replikationskompetenz mehrere Rekombinationsereignisse erfordert, von denen jedes weniger wahrscheinlich gemacht wird, wenn die lineare Homologie zwischen dem Vektor und der Zelle durch das Durcheinanderbringen verringert wird.
Dieses Konzept kann analog auf das Minimieren der Rekombination zwischen einem Adenovirusvektor und einer Verpackungszelllinie durch Gestalten des Vektors angewandt werden, sodass Strecken der Homologie mit der Zelllinie durch eine Umgruppierung gestört werden, was ihre wirksame Länge und die Wahrscheinlichkeit der Rekombination verringert. Bei einem Beispiel dieser Ausführungsform der Erfindung wird das Potential für eine Rekombination zwischen einem Adenovirus und 293 Zellen durch Umgruppieren der Protein-IX-Sequenzen in dem Vektor verringert. Die Protein-IX-Sequenzen werden oft an der rechten Grenze der deletierten E1-Region in einem Vektor gefunden. Protein-IX-Sequenzen sind auch innerhalb der 293 Zellen an der Grenze des E1-Adenovirusinserts enthalten und können die Rekombination zwischen dem Vektor und zellulären Sequenzen erleichtern. Das Ergebnis ist es, dass die Wiederherstellung der E1-Sequenzen zu dem Vektor durch ein von dem Protein IX vermitteltes Rekombinationsereignis stattfinden kann. Die Verschiebung oder Mutagenese einer Protein-IX-Grenze von der E1-Deletionsregion in einem Vektor verringert die Wahrscheinlichkeit eines solches Ereignisses und der Erzeugung von RCA. Ein solcher Vektor ist nachstehend in Beispiel 1 und 3 beschrieben.
Ad2/CFTR-8 ist eine besondere Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung und ist in 5 gezeigt.
Verhindern von RCA mit Vektoren, die mit Bezug auf die Homologie mit Verpackungszelllinien deletiert sind
Dieser Aspekt der Erfindung betrifft Vektordesigns, die die Erzeugung von RCA während der Vektorherstellung durch die Deletion von rekombinogenen DNA-Sequenzen verhindern. Die RCA-Erzeugung kann während der Vektorherstellung stattfinden, wenn Regionen der Homologie zwischen den viralen DNA-Sequenzen in einem replikationsinkompetenten Deletionsvektor und den viralen DNA-Sequenzen in einer Verpackungszelllinie existieren, die virale Proteine in trans zuführt. Die Vektoren bei dieser Ausführungsform der Erfindung sind so gestaltet, dass Regionen der Homologie zwischen dem viralen Genom und der Verpackungszelllinie des weiteren durch die Deletion der nichtwesentlichen viralen DNA auf ein Minimum herabgesetzt werden. Diese Vektoren werden auf minimale virale Sequenzen herunter geschnitten, die erforderlich sind, um das Ziel des Transportierens eines Gens, das von Interesse ist, in die Zielzelle zu erreichen und das Gen der Zelle für die Expression darzubieten, jedoch sind sie so gestaltet, dass die maximale Sicherheit durch das Verhindern der RCA-Bildung erreicht wird.
Adenovirus-DNA-Sequenzen, die bis heute in Vektordesigns deletiert wurden, umfassen Sequenzen von den E1-, E3- und E4-Regionen des viralen Genoms (Berkner, K. L., Curr. Top. Micro. Immunol. 158: 39–66, 1992). Die vorliegende Erfindung stellt Vektoren zur Verfügung, bei denen die Protein-IX-Region des viralen Genoms deletiert wurde, um jegliche Homologie mit einer Verpackungszelllinie, die die Adenovirus-Sequenzen enthält, weiter zu verringern. Diese Deletion ist besonders brauchbar, wenn Vektoren in einer Zelllinie verpackt werden, die Protein-IX-Sequenzen in dem viralen Insert in dem Zellgenom enthält. Beispielsweise enthält die 293 Zelllinie, die weit verbreitet bei der Adenovirusvektorherstellung verwendet wird, die E1-Regionen und die Protein-IX-Sequenz, die von dem Adenovirus-Serotyp 5 abgeleitet ist (Graham, F. L., J. Gen. Virol. 36: 59–72, 1977) und ist für das Wachstum von E1-Deletionsvektoren zulässig.
Ein bestimmter Vektor der vorliegenden Erfindung, Ad2/CFTR-7, wurde konstruiert, um das für das Protein IX codierende virale Gen zu deletieren. Dieses Gen ist an der rechten Grenze der E1B-Region zu finden und codiert für ein Protein, das an der Verpackung von Genomen voller Länge während des Zusammenfügens beteiligt ist (Ghosh-Choudhury, G. et al., J. EMBO 6: 1733–1739, 1987). Die Protein-IX-DNA-Sequenz in einem Vektor hat das Potential zur Rekombination mit Protein-IX-Sequenzen, die innerhalb des Adenovirus-E1-Inserts in der 293 Zelllinie enthalten sind. Da ein solches Rekombinationsereignis RCA im Verlauf der Vektorherstellung erzeugen kann, stellt der hier beschriebene Vektor ein Mittel zur Verfügung, um diese Möglichkeit durch das Entfernen der rekombinogenen Protein-IX-Sequenzen zu vermeiden.
Das Entfernen des Protein-IX-Gens wird durch ein Vektordesign toleriert, das die Menge der zu verpackenden DNA verringert, da das Protein IX Genome verpacken muss, die mindestens 90% der Wildtyplänge betragen (Ghosh-Choudhury, G. et al., J. EMBO 6: 1733–1938, 1987). Dies kann durch Deletionen von nichtwesentlichen Sequenzen oder durch die Deletion von Sequenzen erreicht werden, die in cis nicht notwendig sind und deren Genprodukte in trans geliefert werden können. Solche Sequenzen umfassen diejenigen, die von den Adenovirus-E1-, -E3- und -E4-Regionen des Genoms abgeleitet sind. In Ad2/CFTR-7 wurde die E3-Region verringert, um die Genomlänge zu verringern. Es kann wünschenswert sein, die Größe des viralen Genoms mit E3-Deletionen zu verringern und dennoch einige E3-Sequenzen aufgrund der Tatsache beizubehalten, dass E3-Proteine an der Minimierung der Wirtsimmunreaktion auf Adenovirusproteine beteiligt sind (Horwitz, M. S., Adenoviridae and their Replication, in Virology, 2. Auflage, Fields, B. N. et al., Herausgeber, Raven Press, New York, 1990). Auf diese Weise können ungünstige Folgen der Einführung des viralen Vektors in einen Patienten verhindert werden.
Die Fähigkeit eines Adenovirusvektordesigns, das Potential für die RCA-Erzeugung auf ein Minimum herabzusetzen, kann durch Bestimmen des RCA-Niveaus in einem Zyklus der Vektorherstellung unter Verwendung eines Bioassays bewertet werden. Das Assay bewertet RCA, die während der Vektorherstellung unter Verwendung von Zelllinien erzeugt werden, die replikationsinkompetente Deletionsvektoren nicht zulassen und nur das Wachstum des Wildtyp-Adenovirus unterstützen. Diese Zelllinien sind mit einem Vektorstamm infiziert und die Gegenwart oder das Fehlen einer beobachtbaren zytopathischen Wirkung (CPE) wird verwendet, um mit Bezug auf eine beliebige Erzeugung von RCA zu bewerten.
In Fällen, in denen ein Adenovirusdeletionsvektor, der replikationsinkompetent ist, in einer Zelllinie verpackt wurde, die Adenovirussequenzen enthält, die wesentliche virale Proteine in trans liefern, enthalten RCA, die aus einem Rekombinationsereignis erzeugt wurden, eine Mischung aus viralen DNA-Sequenzen aus beiden Quellen. Ein solches Hybridgenom in den RCA kann charakterisiert werden, wenn die viralen Sequenzen in der Zelllinie und der Vektor von verschiedenen Virusserotypen abgeleitet sind. Auf diese Weise kann die Sequenzheterogenität unter Virusserotypen verwendet werden, um ein Rekombinationsereignis durch eine beliebige Anzahl von Techniken, die Fachleuten bekannt sind, wie Restriktionsenzymanalyse oder direkte DNA-Sequenzierung, zu identifizieren. Der Vergleich von sequenzierten Regionen in den RCA mit der bekannten Sequenz der Adenovirusserotypen gestattet die Identifikation der Quelle der getesteten Sequenzen. So kann das Rekombinationsereignis, das zu den RCA führt, mittels Sequenzanalyse genau analysiert werden.
Ein spezifisches Beispiel der Verwendung der RCA-Genomanalyse zum Identifizieren der Art des Rekombinationsereignisses kann unter Verwendung von Adenovirusvektoren gezeigt werden, die mit Bezug auf die E1-Region deletiert sind und bei denen das Gen, das von Interesse ist, in die E1-Stelle cloniert ist. Diese Vektoren werden in 293 Zellen erzeugt. In Fällen, in denen der Vektor aus einem Adenovirusserotyp erzeugt wird, der sich von demjenigen unterscheidet, der zum Konstruieren der 293 Zelllinie, d. h. dem Adenovirus 2, verwendet wird, können jegliche RCA, die durch die Rekombination zwischen den Adenovirus-5-Sequenzen in der Zelle und den Adenovirus-2-Sequenzen in dem Vektor erzeugt werden, durch verschiedene Restriktionsenzymmuster zwischen den zwei Serotypen charakterisiert werden. Des weiteren kann die DNA-Sequenzierung verwendet werden, um spezifische Sequenzänderungen zu identifizieren. Wenn E1-Deletionsvektoren verwendet werden, werden alle RCA, die aus einem Rekombinationsereignis erzeugt werden, die E1-Region aus dem Adenovirus-5-Insert in den 293 Zellen inkorporieren, und das Vorhandensein dieser Sequenzen in den RCA kann durch die Charakterisierung der E1-Region identifiziert werden. Die E1-Region der RCA kann mittels Restriktionsenzymanalyse kartiert und/oder direkt sequenziert werden, um den Ursprung dieser Sequenz zu bestimmen. Deshalb kann der Fachmann bestätigen, dass die RCA eine Mischung aus Adenovirus-2- und Adenovirus-5-Sequenzen enthalten, was anzeigt, dass ein Rekombinationsereignis zwischen der Zelle und den viralen Vektor-DNA-Sequenzen stattgefunden hat.
Obwohl Vektoren, bei denen das Protein IX deletiert ist, eine besondere Relevanz für das Verhindern der RCA während der Vektorherstellung in Verpackungszelllinien, die Protein-IX-Sequenzen – d. h. 293 Zellen – enthalten, haben, ist für Fachleute ersichtlich, dass das Konzept der Verwendung von Gen- oder Sequenzdeletierung analog auf das Design von Vektoren erweitert werden kann, die jegliche Regionen viraler Sequenzen auf ein Minimum herabsetzen oder deletieren, wenn sie in Zelllinien verwendet werden, die homologe virale Sequenzen enthalten und deshalb das Potential haben, RCA zu erzeugen.
Parameter der Vektoren
Die Adenovirusvektoren der Erfindung können von dem Genom verschiedener Adenovirusserotypen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Adenovirus 2, 4, 5 und 7 und im Allgemeinen nichtonkogene Serotypen, abgeleitet werden.
Die Adenovirusvektoren der Erfindung können gentechnisch verändert werden, um jedes heterologe Gen für die Zuführung und Expression zu einer Zielzelle zu tragen. Das Gen kann in verschiedene Stellen innerhalb der Vektoren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, die E1-Region, die E2-Region, die E3-Region und die E4-Region unter Verwendung von Techniken, die Fachleuten bekannt sind, gentechnisch verbracht werden (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. et al., Herausgeber, Wiley and Sons, New York, 1995). Das in den Adenovirusvektor clonierte heterologe Gen kann gentechnisch als vollständige transcriptionelle Einheit, einschließlich eines geeigneten Promotors und Polyadenylierungssignals, gentechnisch hergestellt werden. Solche Promotoren enthalten beispielsweise den Adenovirus-E1-Promotor oder -E4-Promotor sowie andere, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, den CMV-Promotor und den PGK-Promotor. Geeignete Polyadenylierungssignale an dem 3'-Ende des heterologen Gens umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die BGH- und SV40-Polyadenylierungssignale. Die E3-Region des Adenovirusgenoms kann deletiert werden, um die Clonierungsfähigkeit eines Vektors zu erhöhen, oder sie kann in dem Vektorkonstrukt gemäß den Bedingungen, die jemand, der die vorliegende Erfindung durchführt, vorfindet, belassen werden. Gegenwärtig ist es bevorzugt, mindestens einen beträchtlichen Abschnitt der E3-Region in dem Vektor zu belassen, um unter einigen Aspekten die Immunreaktion des Patienten auf das Vektorkonstrukt, einschließlich ernsthafter entzündlicher Folgen, auf ein Minimum herabzusetzen.
Gene, die gentechnisch in die Adenovirusvektoren der Erfindung verbracht werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, CFTR für CF, α1-Antitrypsin für Emphysem, lösliches CD4 für AIDS, ADA für Adenosindesaminasemangel und andere Gene, die im Stand der Technik als für die Gentherapie brauchbar erachtet werden.
Die Vektoren der vorliegenden Erfindung können eine Anwendung in der Gentherapie für die Behandlung von Krankheiten haben, die es erfordern, dass ein Gen zu den Empfängerzellen zum Zweck des Korrigierens eines fehlenden oder fehlerhaften Gens oder zum Zweck des Zurverfügungstellens eines therapeutischen Moleküls für die Behandlung eines klinischen Zustands transferiert wird.
Die Vektoren der vorliegenden Erfindung können für ex vivo und in vitro Gentherapieanwendungen adaptiert werden.
Es ist ersichtlich, dass die Konzepte der Vektordesigns, die in den vorstehenden Abschnitten enthalten sind, analog auf andere virale Vektoren verwendet werden können, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Retrovirus, Herpes, adenoassoziierten Virus, Papovavirus, Vaccinia und andere DNA- und RNA-Viren.
Beispiel 1: Konstruktion eines durcheinander gebrachten Adenovirusvektors, der die Protein-X-abhängige Rekombination verhindert
Ein neuer Adenovirusvektor wird konstruiert durch Beginnen mit dem Plasmid Ad2E4ORF6 (PCT-Veröffentlichung Nummer WO 94/12649 ), bei dem E1 deletiert ist und bei dem E4-Sequenzen von der ClaI-Stelle bei 34077 zu der TaqI-Stelle bei 35597 deletiert sind. Die ORF6-Sequenz von 33178 bis 34082 wird in die E4-Region inseriert. Die frühe SV40-poly-A-Sequenz wird benachbart der ORF6 inseriert, die auch dazu dient, das Durchlesen von dem ORF6-Gen in die L5-(Faser-)Sequenzen zu verhindern. Das Protein IX wird aus seiner ursprünglichen Stelle in dem Virusgenom in die E4-deletierte Region als BamHI-Fragment repositioniert. Das Protein-IX-Fragment enthält seinen eigenen Promotor und kann in jeder Richtung in den Vektor cloniert werden. Das Konstrukt ist in 3 gezeigt. Das Plasmid wird in 293 Verpackungszellen transfiziert, um einen Vektorstamm unter Verwendung von Standardtechniken herzustellen (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F., et al., Herausgeber, Wiley & Sons, 1995). Der sich ergebende Vektor ist gegenüber einem Rekombinationsereignis mit viralen Sequenzen in den 293 Zellen aufgrund des Repositionierens des Protein-IX-Gens weniger empfänglich, was die Homologie zwischen dem Vektor und den 293 Zellen verringert.
Ad2/CFTR-8 ist ein Beispiel eines Adenovirusvektors, bei dem das Protein IX in die E4-Region des Virusgenoms repositioniert wurde, und ist in 5 gezeigt.
Beispiel 2: Analyse von RCA durch Serotypsequenzheterogenität
Die Erzeugung von RCA, die sich aus der Rekombination zwischen einem Adenovirusvektor und 293 Zellen ergeben, wurde mittels Sequenzanalyse des replikationskompetenten Virus, der sich während der Vektorherstellung ergab, analysiert. Die Vektoren wurden von dem Adenovirus-Serotyp 2 abgeleitet und mit Bezug auf die E1-Region deletiert, enthielten jedoch die Protein-IX-Sequenz. Die 293 Zellen enthalten die E1-Region und die Protein-IX-Sequenz von dem Adenovirus-Serotyp 5. Die Sequenzheterogenität zwischen den Adenovirus-Serotypen 2 und 5 wurde verwendet, um die Quelle der E1- und Protein-IX-Sequenzen zu identifizieren, die in den RCA enthalten waren. Wenn die Protein-IX-Sequenz in den RCA von dem Adenovirus 5 abgeleitet ist, dann kann ein homologes Rekombinationsereignis zwischen dem Vektor und den 293 Zellen bewertet werden. Die Sequenzheterogenität zwischen diesen Adenovirusserotypen von dem Nucleotid 1–600 (Adenovirus Typ 2: SEQ ID NO: 1 und dem Adenovirus Typ 5: SEQ ID NO: 3) und 30414847 (Adenovirus Typ 2: SEQ ID NO: 2 und dem Adenovirus Typ 5: SEQ ID NO: 4) ist in 4A–D gezeigt.
Die mit Bezug auf die RCA-Erzeugung während der Herstellung analysierten Vektoren sind in 5 gezeigt. 6 zeigt die Ergebnisse der BclI-Restriktionsenzymanalyse jedes Vektors und der RCA, die während der Vektorherstellung in 293 Zellen erzeugt wurden. Durch Bezugnahme auf die Restriktionsstellen in den Wildtyp-Adenovirus 2 und 5 Serotypen können die RCA mit Bezug auf die Quelle ihrer Sequenzen charakterisiert werden. Auf eine solche Weise kann das Rekombinationsereignis zwischen einem Vektor und einer Verpackungszelllinie, die zu RCA führt, identifiziert werden. 7 ist ein schematisches Diagramm der Sequenzanalyse der RCA, die während der Herstellung jedes Vektors in 293 Zellen erzeugt werden. Die Adenovirus-5-Sequenzen, die in 293 Zellen enthalten sind, die an der Oberseite jeder schematischen Darstellung erscheinen, sind potentiell für ein Rekombinationsereignis mit der Protein-IX-Sequenz in dem Vektor verfügbar. Die Fig. zeigt die Rekombinationsstellen an den 5'- und 3'-Enden des E1-Inserts in den RCA für jeden getesteten Vektor. Bei den während der Herstellung der Vektoren Ad2/CFTR-2, Ad2/CFTR-5 und Ad2/CFTR-6 erzeugten RCA wird die Protein-IX-Sequenz an der 3'-Grenze des E1-Fragments in den RCA von dem Adenovirus 5 abgeleitet, was anzeigt, dass ein Rekombinationsereignis zwischen dem Vektor und den 293 Zellen stattfand, das von der Protein-IX-Sequenz vermittelt wurde. Die Ergebnisse von Ad2/CFTR-3 und Ad2/CFTR-1 waren variabel, und die Rekombination, die nicht von dem Protein IX vermittelt wurde, wurde festgestellt.
Die Ergebnisse der Rekombinationsanalyse der RCA zeigen, dass die Protein-IX-Sequenz in einem Adenovirusvektor als rekombinogene Stelle für die Erzeugung von RCA in einer Zelllinie dient, die eine homologe Protein-IX-Sequenz enthält.
Beispiel 3: Konstruktion und Analyse von Ad2/CFTR-7
Eine Reihe von Clonierungsschritten war erforderlich, um die Plasmide, die ein Zwischenprodukt zu der endgültigen Konstruktion des Vektors Ad2/CFTR-7 sind, zu konstruieren. Die in vivo-Rekombinationsschritte zum Ableiten von Ad2/CFTR-7 sind nachstehend detailliert angegeben. Ein RCA-Assay wurde verwendet, um zu bestimmen, ob das Ad2/CFTR-7-Vektordesign die RCA-Erzeugung während der Passage in 293 Zellen verringerte.
Konstruktion von pAd2/E1aCFTRsvdra-
Die Clonierungsschritte und Plasmide, die bei dem Konstruieren des Zwischen-Plasmids pAd2/E1aCFTRsvdra- verwendet werden, sind nachstehend beschrieben und in 8A und 8B gezeigt. Das Ausgangsplasmid pAd2/CMV-2 enthält ein Insert von etwa 7,5 kb, das in ClaI- und BamHI-Stellen von pBR322 cloniert sind, das die ersten 10.680 Nucleotide von Ad2 mit Ausnahme einer Deletion von Sequenzen zwischen den Nucleotiden 357 und 3498 enthält. Diese Deletion eliminiert den E1-Promotor, E1A und den größten Teil der E1B-Codierungsregion. Das Plasmid pAd2/CMV-2 enthält auch einen CMV-Promotor, der in die ClaI- und SpeI-Stellen an der Stelle der E1-Deletion inseriert ist, und eine stromabwärtige SV40 Polyadenylierungs-(poly-A-)Sequenz (ursprünglich ein 197 bp BamHI-BclI-Fragment), die in die BamHI-Stelle cloniert ist.
Die erste Reihe von Clonierungsschritten deletierte zunächst einen Abschnitt des SV40 polyA und einen Abschnitt des Protein-IX-Gens und anschließlich den Rest des Protein-IX-Gens. Das Plasmid pAd2/CMV-2 wurde mit SpeI und HindIII verdaut. Das 3156 bp Fragment, das die SV40 polyA- und Ad2-Sequenzen enthielt, wurde in die gleichen Stellen des pBluescript SKII (Stratagene) ligasiert, um das Plasmid pBSSK/s/h zu erzeugen. Das 656 bp MunI-Fragment, das 60 Nucleotide der SV40 polyA- und die Mehrheit der Protein-IX-Sequenzen von Ad2 enthielt, wurde aus diesem Plasmid ausgeschnitten, um das Plasmid PBS-SH munzu erzeugen. Dieses Plasmid wurde mit DraI und HindIII verdaut, und das 2210 bp Fragment wurde in die EcoRV- und HindIII-Stellen des pBluescript SKII-(Stratagene) cloniert, was zu dem Plasmid pBSDra-HindIII führte. In diesem Schritt wurde der Rest des Protein-IX-Gens entfernt. Das EcoRI-HindIII Fragment (2214 bp) dieses Plasmids wurde dann in die MunI- und HindIII-Stellen des Plasmid-pBS-Shmun- erzeugenden pBS-SH.dra- cloniert. In diesem Schritt wird das Segment des Ad2-Genoms mit der Protein-IX-Deletion mit dem gestutzten SV40 polyA-Segment wieder vereinigt. Das Plasmid pBS SH.dra- hat so eine 60 bp Deletion des SV40 polyA, eine Deletion der Protein-IX-Gens und die Ad2-Sequenzen von bp 4020 bis 10680. Dieses Insert ist auch von Polylinkerstellen umgeben.
In der nächsten Reihe von Clonierungsschritten wurde das vorstehend erzeugte DNA-Segment, das die SV40 polyA- und die Protein-IX-Deletion enthielt, mit den Sequenzen zusammengefügt, die erforderlich sind, um das linke Ende des Ad2-Genoms zu vervollständigen. pBS-SH.dra- wurde mit AvrII und HindIII verdaut und das 2368 bp Fragment wurde in die AvrII- und HindIII-Stellen des Plasmids pAdE1aBGH cloniert, wodurch die BHG polyA-, Protein-IX- und Ad2-Sequenzen von diesem Plasmid wirksam ersetzt wurden und so das Plasmid pAd2/Elasvdra- erzeugt wurde.
In der nächsten Reihe von Clonierungsschritten wurde die CFTR cDNA stromabwärts des E1-Promotors in pAd2/Elasvdra- eingeführt. Um dies zu erreichen, wurde ein SwaI- und AvrII-Fragment, das die CFTR cDNA enthielt, aus dem Plasmid pAdPGKCFTRsv freigesetzt und in die SwaI- und AvrII-Stellen des pAd2/Elasvdra- inseriert, um das Plasmid pAd2/Elasvdra- zu erzeugen. Dieses Plasmid wurde bei der nachstehend beschriebenen in vivo-Rekombination verwendet.
Konstruktion von pAd2/ORF6EΔ1.6
Die Clonierungsschritte und Plasmide für das Herstellen von pAd2/ORF6EΔ1.6 sind in 9 detailliert angegeben. Das Ausgangsplasmid, pAdE4ORF6, wurde in der PCT-Veröffentlichung Nummer WO 94/12649 beschrieben. Die 1,6 kb Deletion innerhalb der E3-Region dieses Plasmids wurde mittels einer Drei-Wege-Ligasierung von zwei PCR-Fragmenten in mit MluI und EagI geschnittenem pAdE4ORF6 konstruiert. Die PCR-Fragmente wurden beide unter Verwendung von pAdE4ORF6 DNA hergestellt und das erste PCR-Fragment entsprach Ad2-Nucleotiden 27123 bis 29292 (2169 bp) und war von EagI- bzw. RsrII-Stellen flankiert. Das zweite PCR-Fragment entsprach den Ad2-Nucleotiden 30841 bis 31176 (339 bp) und war von RsrII- bzw. MluI-Stellen flankiert. Bei Ligasierung mit mit MluI und EagI geschnittener pAdE4ORF6 DNA enthielt das sich ergebende Plasmid pAdORF6Δ1.6 eine Deletion der Ad2-Nucleotide 29293 bis 30840 (1547 bp) oder die gesame E3b mit Ausnahme der polyA-Stelle. Es behielt den Rest der Ad2-Sequenzen von 27123 bis 35937 zurück und enthält jetzt auch eine einzelne RsrII-Stelle.
In vivo-Rekombinationsschritte zum Ableiten von Ad2/CFTR-7
Die Rekombinationsschritte, die zum Ableiten des DANN-Konstrukts von Ad2/CFTR-7 verwendet werden, sind in 10 gezeigt.
Das Plasmid pAd2E40RF6Δ1.6, das mit ClaI (Polylinkerregion des Plasmids an Ad2 bp 35937 vorbei) linearisiert wurde, und Ad2 DNA, die mit PacI (bp 28622 of Ad2) verdaut wurde, und AseI (mehrere Schnitte 3' von PacI) wurden in 293 Zellen unter Verwendung der CaPO₄-Transfektion eingeführt. Das gewünschte rekombinante Virus, das sich aus diesem Schritt ergab, AdORF6Δ1.6, war plaquegereinigt und wurde verwendet, um einen Samenstamm zu erzeugen. Als nächstes wurde pAd2/E1aCFTRsvdra- mit BstBI an der Stelle gespleißt, die der einzelnen BstBI-Stelle bei 10670 in Ad2 entspricht. Genomische DNA von Ad2/ORF6E3Δ1.6 wurde mit PshAI verdaut, das sich zweimal in der 5'-Region des Virus spleißt. Das Plasmid und genomische DNAs wurden dann mit CaPO₄ (Promega) in 293 Zellen transfiziert. Der gewünschte rekombinante Vektor, der sich aus diesem Schritt ergibt, Ad2/CFTR-7, wurde plaquegereinigt und verwendet, um einen Samenstamm zu erzeugen. Ad2/CFTR-7 ist in 5 gezeigt.
Beispiel 4: RCA-Assay von Vektoren, die in 293 Zellen passagiert wurden
Der Ad2/CFTR-7-Vektor wurde getestet, um zu bestimmen, ob sich die RCA-Erzeugung während Blindpassagen im Vergleich zu anderen Vektoren ergab, bei denen die Protein-IX-Region zurückbehalten wird. Ein RCA-Bioassay wurde verwendet, um mit Bezug auf RCA zu bewerten. Ein schematisches Diagramm des RCA-Assaydesigns ist in 11 gezeigt.
Ein schematisches Diagramm der getesteten Vektoren ist in 5 gezeigt. Die im Vergleich mit Ad2/CFTR-7 getesteten Vektoren umfassen Ad2/CFTR-1, Ad2/CFTR-2 und Ad2/CFTR-6. Alle diese Kontrollvektoren enthalten das Protein-IX-Gen.
Ein Samenstamm jedes Vektors wurde durch das Züchten des Virus in 293 Zellen hergestellt, die die Adenovirus-E1-Region enthalten und die Replikation von E1-Deletionsvektoren zulassen. Dieser Samenstamm wurde auf 293 Zellen titriert.
Das serielle Passagieren des Samenstamms wurde bei 293 Zellen durchgeführt. Ein Inokulum des Virus mit einer M. O. I. (Multiplizität der Infektion) von 5 bis 10 wurde verwendet, um die Zellen zu infizieren. Jede Passage wurde geerntet, wenn beobachtet wurde, dass die zytopathische Wirkung (CPE) 100% betrug, und ein Lysat wurde gemäß Standardtechniken hergestellt.
Ein Assay der RCA-Erzeugung in 293 Zellen wurde mittels eines Bioassays für ein replikationskompetentes Virus durchgeführt, das unter Verwendung von HeLa-Zellen und A549-Zellen getestet wurde. Diese Zelllinien enthalten keine Adenovirus-E1-Sequenzen und sind deshalb nur für Viren zulässig, die die E1-Region durch Design enthalten oder sie durch ein Rekombinationsereignis erworben haben. Deshalb bewertet das Assay mit Bezug auf jegliche RCA, die aus einem Rekombinationsereignis zwischen einem E1-deletierten Vektor und den 293 Zellen erzeugt wurden.
Ausgewählte Passagen jedes Vektors durch 293 Zellen wurden mittels des RCA-Assays analysiert. Das Assay wurde durch Infizieren von HeLa-Zellen mit der zu testenden Vektorpassage mit einer MOI von 20 durchgeführt. Diese Infektion wurde 4 Tage fortschreiten gelassen, danach wurden die Zellen geerntet und ein Lysat wurde mittels Standardtechniken hergestellt. Das Lysat wurde dann verwendet, um A549 Zellen zu infizieren und diese Infektion schritt 10 Tage fort. Die Zellen wurden mit Bezug auf das Vorhandensein oder das Fehlen von CPE durchmustert. In der Tabelle 1 sind die Ergebnisse der RCA-Assays angegeben, die mit ausgewählten Passagen jedes getesteten Vektors durchgeführt wurden. Eine Passage wurde als BESTANDEN angegeben, wenn keine RCA beobachtet wurden, und als DURCHGEFALLEN angegeben, wenn RCA beobachtet wurden, wie mittels jeder Beobachtung von CPE bestimmt. Die Dosis des bei dem RCA-Assay getesteten Vektors wurde wie gezeigt variiert.
Die Ergebnisse des RCA-Assays zeigen, dass RCA bei der Passage 12 von den Vektoren Ad2/CFTR-2 and Ad2/CFTR-6 und bei der Passage 3 von dem Vektor Ad2/CFTR-1 beobachtet werden konnten. Im Gegensatz hierzu wurden keine RCA bei der Passage 12 von dem Vektor Ad2/CFTR-7 selbst bei der höchsten getesteten Dosis beobachtet. Dieser Vektor hat die niedrigsten Werte von RCA der getesteten Vektoren. Die Ergebnisse zeigen, dass das Entfernen der Protein-IX-Sequenzen die Erzeugung von RCA in 293 Zellen beträchtlich verringerte.
Beispiel 5: Adenovirusvektoren mit minimaler E4-Sequenz
Das Plasmid pAdE4ORF6 wurde in der PCT-Veröffentlichung Nummer WO 04/12649 beschrieben und zum Konstruieren von Ad2-ORF6/PGK-CFTR verwendet, das auch in der gleichen Veröffentlichung beschrieben wurde. Es enthält das CFTR-Gen unter der Kontrolle des PGK-Promotors. Ad2/CFTR-8, das in 5 gezeigt ist, ist ein Adenovirusvektor, der äquivalent zu Ad2-ORF6/PGK-CFTR ist.
Weitere Modifikationen dieses Vektordesigns sind ein Aspekt der vorliegenden Erfindung. Das CFTR-Gen kann alternativ unter die Kontrolle des CMV-Promotors, wie durch Ad2/CFTR-5 veranschaulicht und in 5 gezeigt, gestellt werden. Andere Promotoren, die verwendet werden können, umfassen den späten Hauptpromotor (MLP) des Adenovirus wie in dem Vektor Ad2/CFTR-4 gezeigt. Die BGH- und SV40-polyA-Elemente sowie andere, die Fachleuten bekannt sind, können bei der Vektorkonstruktion verwendet werden.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Rekombinanter Adenovirusvektor mit einer deletierten E1-Region des Adenovirusgenoms, in welchen ein heterologes Gen eingesetzt wurde und in welchem das Protein IX-Gen in dem Adenovirusgenom zu einem Ort davon, welcher verschieden von dem Ort ist, in welchem das Protein IX-Gen normalerweise vorliegt, örtlich verändert wurde, so dass die Erzeugung von Replikations-kompetenten Adenoviren minimiert oder beseitigt ist, wobei die Region, welche das IVa2-Protein kodiert, örtlich nicht verändert ist.
Vektor nach Anspruch 1, in welchem ein oder mehr offene Leserahmen der E4-Region deletiert sind.
Vektor nach Anspruch 2, in welchem das Protein IX-Gen zur E4-Region örtlich verändert ist.
Vektor nach Anspruch 2, in welchem ORF6 der E4-Region erhalten ist.
Vektor nach Anspruch 4, in welchem das Protein IX-Gen benachbart zum ORF6-Gen eingesetzt ist.
Vektor nach Anspruch 1, in welchem das heterologe Gen ein Gen, welches CFTR kodiert, ist.
Vektor nach Anspruch 1, in welchem das heterologe Gen operativ mit einem eukaryotischen Promotor verbunden ist, um so die Expression des Gens zu ermöglichen.
Vektor nach Anspruch 1, wobei das Adenovirus unter den Adenovirus-Serotypen 2, 4, 5 und 7 ausgewählt ist.