DE60024302T2

DE60024302T2 - Zelllinien und konstrukte für die herstellung von e1-deletierten adenoviren in abwesenheit von replikationskompetentem adenovirus

Info

Publication number: DE60024302T2
Application number: DE60024302T
Authority: DE
Inventors: Guangping Gao; M. James WILSON
Original assignee: University of Pennsylvania Penn
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 1999-09-29
Filing date: 2000-09-12
Publication date: 2006-08-17
Anticipated expiration: 2020-09-13
Also published as: WO2001023597A2; AU779198B2; US6365394B1; EP1226264A2; CY1105440T1; WO2001023597A9; AU1251801A; DK1226264T3; US20060003451A1; ES2253270T3; CA2384382A1; ATE310829T1; EP1226264B1; DE60024302D1; EP1226264B9; US20020090717A1; JP2003510089A; WO2001023597A3

Description

Die vorliegende Arbeit wurde unterstützt von NIDDK (DK47757-06 & DK49136-05), NHLBI (HL49040-08) und NICHD (HD32649-05) der National Institutes of Health. Die US-Regierung kann an der vorliegenden Erfindung gewisse Rechte besitzen.
Erfindungsgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet von Konstrukten und Verfahren zur Herstellung von Virusvektoren und insbesondere zur Herstellung von Adenoviren.
Stand der Technik
Nach früheren Beschreibungen eignen sich rekombinante Adenoviren zur Zuführung von Transgenen an Zellen für verschiedene Zwecke, einschließlich sowohl therapeutischer als auch prophylaktischer (Impfstoff-)Verwendungen. Allerdings werden für die erfolgreiche Kommerzialisierung E1-deletierter Adenoviren geeignete Herstellungsverfahren benötigt, die erst noch entwickelt werden müssen. Bei der Infektion einer E1 trans-komplementierenden Zellinie mit dem Vektor und der Reinigung des erhaltenen Lysats handelt es sich um ein einfaches und im Maßstab anpaßbares Verfahren, mit dem ausreichende Mengen an Produkt erhalten werden. Unglücklicherweise wurde die Herstellung E1-deletierter Adenovirusvektoren für Gentherapie durch das durch homologe Rekombination zwischen dem Vektor und transfektiertem E1-Gen verursachte Auftreten von replikationskompetentem Adenovirus (RCA) geplagt.
Zur Vermeidung von RCA wurden mehrere Strategien beschrieben. Allerdings führte bis jetzt keiner dieser Ansätze zu einer E1-komplementierenden Zellinie, die stabil ist und hohe Ausbeuten an Adenoviren mit E1-Defekt in Abwesenheit von nachweisbarem RCA produziert.
Vom J.-L. Imler et al., Gene Ther., 3: 75–84 (196) wird eine A549-Zelle beschrieben, die mit offenen Leserastern (open reading frames, ORFs) für E1a und E1b und dem daran angrenzenden pIX-Gen stabil transfiziert wurde. Dabei wurde das E1a vom Phosphorglyceratkinase-Promotor angetrieben und das RCA angeblich eliminiert. Neuere Veröffentlichungen, in denen dieses System beschrieben wird, zeigen jedoch, daß von Imler keine E1b-Proteinexpression nachgewiesen werden konnte. Siehe Introgene WO 97/00326, veröffentlicht am 3. Januar 1997.
In dieser Introgene-Anmeldung wurde ein alternatives System zu dem oben zitierten System von Imler beschrieben. Diese Anmeldung beschreibt aus bestimmten menschlichen diploiden Zellen abgeleitete Zellinien, wobei E1a und E1b, jedoch nicht pIX exprimiert werden (ECACC Nr. 96022940). Die Zellen wurden durch Transfektion menschlicher embryonaler Retinoblasten (HER-Zellen) mit einem Vektor, der die Nukleotide 459–3510 von Ad enthält, was E1a, E1b entspricht, jedoch ohne den E1a-Promoter, einen Teil des für das 8,3 kb große E1b-Protein codierenden E1b-Gens und jegliche pIX-Sequenzen, hergestellt.
Ein weiteres System zur Vermeidung von RCA wird bei Massie, US-PS 5,891,690 beschrieben. Dieses Patent beschreibt eine Ad-E1-komplementierende Zellinie mit einem stabil integrierten Komplementationselement, das einen Teil des Ad-E1-Bereichs umfaßt, der das E1a-Gen und das E1b-Gen abdeckt, dem jedoch die 5'-ITR, die Verpackungssequenz und der E1a-Promotor fehlt. Ferner steht das E1a-Gen unter der Kontrolle eines ersten Promotorelements und das E1b-Gen unter der Kontrolle eines zweiten Promotors. Eine von Massie beschriebene und beanspruchte spezifische Zellinie enthält die Nukleotide 532–3525 von Ad5, was E1a, den E1b-Promotor und einen Teil des E1b-Gens beinhaltet. Diese Zellinie enthält weder den Carboxyterminus des E1b-Gens, das für das 8,3 kb große Produkt codiert, noch pIX-Gensequenzen.
Was im Fachgebiet benötigt wird, ist eine stabile E1-komplementierende Zellinie, die alle adenoviralen E1a- und E1b-Genprodukte exprimiert und hohe Ausbeuten an Adenoviren mit E1-Defekt in Abwesenheit von nachweisbaren RCA liefert.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Vorteilhafterweise werden durch die vorliegende Erfindung E1-exprimierende Zellinien bereitgestellt, die stabil sind, sich an die Suspensionskultur in serumfreiem Medium anpassen lassen und hohe Vektorausbeuten ergeben. Signifikanterweise gestatten die Zellinien die Isolierung und Subkultur von E1-deletierten rekombinanten Adenoviren in einer von replikationskompetentem Adenovirus (RCA) freien Umgebung. Ferner führen die erfindungsgemäßen Zellinien auf wirksame Weise zu Vektorplaques und gestatten so die Isolierung und Subkultur neuer Rekombinanten in einer RCA-freien Umgebung.
Somit wird in einem Aspekt der Erfindung eine E1-komplementierende Zellinie bereitgestellt, die sich zur Produktion rekombinanter Adenoviren mit E1-Defekt in Abwesenheit von nachweisbarem replikationskompetentem Adenovirus eignet. Dabei umfaßt die E1-komplementierende Zellinie eine mit einem das offene Leseraster (ORF) von Adenovirus-E1a und Adenovirus-E1b unter der Kontrolle eines Phosphorglyceratkinase-Promotors (PGK-Promotors) codierende Nukleinsäuresequenzen umfassenden Nukleinsäuremolekül stabil transformierte aneuploide Zellinie. Die Nukleinsäuresequenzen umfassen ferner eine Deletion aller sich 5' zu den Adenovirus-E1a-ORF codierenden Sequenzen befindenden Adenovirussequenzen. Bei der aneuploiden Zellinie handelt es sich um eine HeLa-Zellinie.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Verpackung adenoviraler Partikel mit E1-defekt in Abwesenheit von replikationskompetentem Adenovirus bereitgestellt. Das Verfahren ist nachfolgend in Anspruch 7 definiert. Dabei wird ein rekombinanter Vektor in Zellen von der erfindungsgemäßen E1-komplementierende Zellinie eingeführt, wobei der Vektor einen Defekt im Adenovirus-E1-Bereich, zur Replikation und Verpackung notwendige Adenovirus-5'- und -3'-Cis-Elemente, Adenovirus Adenovirus-pIX sowie zur Expression der adenoviralen Gene notwendige Regulationssequenzen und gegebenenfalls ein Transgen enthält.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Amplifikation adenoviraler Partikel mit E1-Defekt in Abwesenheit von nachweisbaren replikationskompetentem Adenovirus bereitgestellt. Das Verfahren ist nachfolgend in Anspruch 15 definiert. Dabei werden Zellen von der erfindungsgemäßen E1-komplementierende Zellinie mit einem Adenovirus mit E1-Defekt infiziert und unter Bedingungen, die der Zelle die Expression der Proteine E1a und E1b gestatten, kultiviert.
Weitere erfindungsgemäße Aspekte und Vorteile sind aus der folgenden ausführlichen Beschreibung der Erfindung leicht ersichtlich.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Bei 1 handelt es sich um eine schematische Darstellung der Strukturen des E1-deletierten rekombinanten adenoviralen Vektors der Ad5-DNA-Sequenz in 293-Zellen und des PGK-Ad5E1-Fragments in der neuen E1-Zellinie.
Bei 2A handelt es sich um die grafische Auftragung der Wachstumskinetik eines E1-deletierten rekombinanten Adenovirus, H5.CBLacZ, in der 293- und der neuen E1-Zelllinie. Siehe Beispiel 2C hinsichtlich Einzelheiten der Arbeit. Die Ausbeute an H5.CBLacZ-Virus in den Zellinien ist jeweils auf der y-Achse im logarithmischen Maßstab gezeigt. Die Zeitpunkte sind auf der x-Achse gezeigt.
Bei 2B handelt es sich um ein Balkendiagramm, das die relative Plaque-Bildungseffizienz (RPE) für das H5.CBLacZ-Virus auf neuen E1-Zellinien zeigt, die mit 293-Zellen verglichen wurden. Siehe Beispiel 2D hinsichtlich Einzelheiten der Arbeit. RPEs wurden als Prozentanteil des H5.CBLacZ-Virustiters berechnet. Gefüllte Balken: mittlere RPE für jede Zellinie aus drei verschiedenen Experimenten; die Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Mit der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung E1-deletierter Adenoviren in Abwesenheit von nachweisbarem replikationskompetentem Adenovirus (RCA) ebenso wie bei diesem Verfahren geeignete Zellinien und Vektoren bereitgestellt. Die erhaltenen E1-deletierten Adenoviren eignen sich ganz besonders zur Verwendung bei der Zuführung von Genen an einen Säuger, da diese Adenoviren im wesentlichen frei von kontaminierendem RCA sind.
In einer wünschenswerten Ausführungsform werden durch die Erfindung auf HeLa basierende Zellinien bereitgestellt, die den E1-Lokus von einem aus dem Gen für Phosphorglyceratkinase (PGK) stammenden Promotor stabil exprimieren. Diese Zellinien weisen keine adenoviralen Sequenzen 5' des offenen Leserasters (ORF) von E1 sowie eine reduzierte (oder keine) Homologie 3' zu E1 auf. Die genannte Zellinie unterstützt die Plaque-Bildung und Amplifikation E1-deletierter Vektoren auf Niveaus, die gleich oder besser als die von 293-Zellen sind, ohne daß dabei RCA auftritt.
Bei einer solchen Zellinie handelt es sich beispielsweise um die Zellinie GH329, die bei der American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA am 29. September 1999 hinterlegt und der Zugangsnummer PTA-803 zugeordnet wurde. Die genannte Hinterlegung wurde gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags und in Übereinstimmung mit den Erfordernissen nach 37 CFR §§ 1, 801 ff. durchgeführt. Es stellte sich heraus, daß die GH329-Zellen E1-deletierte Virusvektoren in Abwesenheit nachweisbarerer replikationskompetenter Adenoviren (RCA) über mindestens 20 Passagierungen komplementieren (und deren Replikation gestatten). Zur Zeit wird vermutet, daß GH329 jeweils eine Einzelkopie der Proteine E1a und E1b exprimiert. Die mit der GH329-Zellinie erhaltenen Ausbeuten sind jedoch mindestens gleichwertig zu den in 293-zellen erhaltenen Ausbeuten, wobei in diesen Zellen RCA nach 5 bis 10 Passagierungen beobachtet wird.
Als Zellinie ist weiterhin die Zellinie GH364 geeignet, die zwischen 5 und 10 Kopien der Proteine E1a und E1b exprimiert. Eine weitere erfindungsgemäße Zellinie ist auch die Zellinie GH354. Es stellte sich heraus, daß die GH354-Zellen E1-deletierte Virusvektoren in Abwesenheit von nachweisbarem RCA über mindestens 20 Passagierungen komplementieren (und deren Replikation gestatten). Ferner sind wie bei der Zellinie GH329 die mit der Zellinie GH354 erhaltenen Ausbeuten mindestens gleichwertig zu den in 293-Zellen erhaltenen Ausbeuten.
Die erfindungsgemäßen Zellinien eignen sich ganz besonders zur Produktion von E1-deletiertem Adenovirus für die vorklinische und klinische Verwendung, da sie sich leicht an das Wachstum in serumfreien Medien anpassen lassen. Die erfindungsgemäßen Zellinien, z. B. GH329, können an das Wachstum in serumfreien Medien mit dem Fachmann allgemein bekannten Techniken angepaßt werden. Diese an serumfreie Medien angepaßten Zellinien sind von der folgenden Erfindung umfaßt.
Gegebenenfalls können von einer erfindungsgemäßen Zellinie weitere geeignete Zellinien abgeleitet werden. So kann beispielsweise die Zellinie GH329 (oder GH354 oder GH364) so modifiziert werden, daß sie ein anderes gewünschtes Protein bzw. andere gewünschte Proteine unter Verwendung der hier beschriebenen Techniken, ebenso wie von im Fachgebiet bekannten Techniken, stabil exprimiert. In einer wünschenswerten Ausführungsform kann ein Derivat der Zellinie GH329 hergestellt werden, indem GH329-Zellen stabil transformiert werden, so daß sie eine oder mehrere Sequenzen, die zur Replikation des E1-deletierten Virus benötigte adenovirale Proteine (oder funktionelle Fragmente davon) exprimieren, enthalten.
Zusätzlich zu den von der Zellinie bereitgestellten adenoviralen E1a- und E1b-Funktionen gehören zu den benötigten adenoviralen Funktionen E2a und E4-ORF6. Somit kann in einer Ausführungsform eine von GH329 abgeleitete Zellinie hergestellt werden, die die benötigten Funktionen des E2-Bereichs oder des E4-Bereichs oder Kombinationen daraus exprimiert. Geeigneterweise sind in dem bzw. den zur Herstellung der von GH329 abgeleiteten Zellinie verwendeten Nukleinsäuremolekül bzw. -molekülen keine adenoviralen Sequenzen 5' des E1-codierenden Bereichs und lediglich die zur Expression der gewünschten funktionellen Proteine in der Wirtszelle benötigten minimalen adenoviralen Sequenzen vorhanden. Mit den hier angegebenen Informationen kann ein Fachmann leicht weitere von GH329 abgeleitete Zellinien konstruieren.
I. E1-komplementierende Zellinie
A. Zielzellen
Der zur Transformation von HeLa-Zellen und zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zellinie GH329 verwendete Vektor kann zur Entwicklung anderer E1-trans-komplementierender Zellinien verwendet werden. Solche anderen Zellinien leiten sich von HeLa-Zellen, einer aus einem Zervixkarzinom stammenden aneuploiden epithelähnlichen Zelle [ATCC CCL2], ab. Die Auswahl an die Zellen bereitstellenden Säugerspezies stellt keine Beschränkung der vorliegenden Erfindung dar.
B. Transformierendes DNA-Molekül
Geeigneterweise werden die Zielzellen mit einem DNA-Molekül transformiert, das als Minimum für Adenovirus-E1a und –E1b unter der Kontrolle eines PGK-Promotors codierende DNA-Sequenzen trägt. Diesem Molekül fehlen adenovirale Sequenzen 5' des E1-Bereichs, wobei vorzugsweise der native E1a-Promotor ausgeschlossen ist, und enthält minimale Sequenzen 3' des E1-Bereichs (d. h. enthält gegebenenfalls pIX-Teilsequenzen).
Die bei der vorliegenden Erfindung geeigneten die Gene für Adenovirus E1a und E1b codierenden DNA-Sequenzen können unter allen bekannten Adenovirustypen, einschließlich der bisher identifizierten 41 menschlichen Typen, ausgewählt werden. Analog können Adenoviren, von denen bekannt ist, daß sie andere Tiere infizieren, die Gensequenzen liefern. Die Auswahl des Adenovirustyps für jede E1a- und E1b-Gensequenz stellt keine Beschränkung der vorliegenden Erfindung dar. Die Sequenzen für eine Anzahl von Adenovirus-Serotypen, einschließlich der des Serotyps Ad5, sind von Genbank erhältlich. Verschiedene Adenovirusstämme sind von der ATCC erhältlich oder können auf Anfrage von verschiedenen kommerziellen und institutionellen Quellen bezogen werden. In der folgenden beispielhaften Ausführungsform handelt es sich bei den E1a- und E1b- Gensequenzen um diejenigen des Adenovirusserotyps 5 (Ad5).
Unter „adenovirale DNA, die das E1a-Genprodukt exprimiert" versteht man ein beliebiges Adenovirus-Gen, das für E1a oder einen beliebigen funktionellen E1a-Anteil codiert. Analog fallen darunter alle Allele oder andere Modifikationen des E1a-Gens oder funktionellen Anteils davon. Solche Modifikationen können absichtlich eingeführt werden, indem man auf herkömmliche gentechnische oder mutagene Techniken zurückgreift, um die Expression oder Funktion von E1a in gewisser Weise zu verbessern, ebenso wie es sich dabei um natürlich vorkommende allelische Varianten davon handeln kann.
Unter „adenovirale DNA, die das E1b-Genprodukt exprimiert" versteht man ein beliebiges Adenovirus-Gen, das für E1b oder einen beliebigen funktionellen E1b-Anteil codiert. Analog fallen darunter alle Allele oder andere Modifikationen des E1b-Gens oder funktionellen Anteils davon. Solche Modifikationen können absichtlich eingeführt werden, indem man auf herkömmliche gentechnische oder mutagene Techniken zurückgreift, um die Expression oder Funktion von E1b in gewisser Weise zu verbessern, ebenso wie es sich dabei um natürlich vorkommende allelische Varianten davon handeln kann.
Bei dem das AD-E1a bzw. Ad-E1b tragenden Nukleinsäuremolekül kann es sich um eine beliebige Form handeln, die diese Komponenten in die Wirtszelle überträgt. In geeignetster Weise sind diese Sequenzen in einem Vektor enthalten. Ein „Vektor" umfaßt, ohne darauf beschränkt zu sein, ein beliebiges genetisches Element, wie beispielsweise ein Plasmid, einen Phagen, ein Transposon, Cosmid, Chromosom, Virus, Virion usw. In einer besonders geeigneten Ausführungsform handelt es sich bei dem Nukleinsäuremolekül um ein Plasmid, das Ad-E1a, Ad-E1b, pIX-Teilsequenzen sowie den PGK-Promotor trägt.
Das Nukleinsäuremolekül kann andere nicht-virale Sequenzen, wie beispielsweise solche, welche gewisse selektionierbare Reporter oder Markergene codieren, z. B. unter anderem Sequenzen, die für Hygromycin oder Purimycin oder das Neomycin-Resistenzgen für G418-Selektion codieren, enthalten. Das Molekül kann ferner andere Komponenten enthalten.
Zur Konstruktion der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können herkömmliche Techniken eingesetzt werden. Siehe allgemein Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York.
Ist das gewünschte Nukleinsäuremolekül konstruiert, so kann es mit einem geeigneten Verfahren in die Zielzelle übertragen werden. Zu solchen Verfahren gehören beispielsweise Transfektion, Elektroporation, Zuführung mittels Liposomen, Membranfusionstechniken, Hochgeschwindigkeitskügelchen mit DNA-Beschichtung, Virusinfektion und Protoplastenfusion. Anschließend werden die Zellen nach Standardverfahren kultiviert und gegebenenfalls in Medien mit einem Antibiotikum ausgebracht, um auf Zellen zu selektionieren, die die das Resistenzgen exprimierenden Zellen enthalten. Nach einer Selektionsperiode werden die resistenten Kolonien isoliert, expandiert und auf E1-Expression durchmustert. Siehe Sambrook et al., oben zitiert.
II. Verwendung von E1-komplementierenden Zellen bei der Herstellung von E1-deletiertem Adenovirus
Die erfindungsgemäßen E1-komplementierenden Zellen eignen sich für verschiedene Zwecke. In geeignetster Weise werden die Zellen (z. B. die GR329) bei der Verpackung von rekombinantem Virus (d. h. Viruspartikeln) von Vektoren mit E1-Defekt sowie bei der Produktion von Adenoviren mit E1-Defekt in hoher Ausbeute in Abwesenheit von nachweisbarem RCA eingesetzt.
Die Ad5-E1a und -E1b exprimierenden erfindungsgemäßen Zellen eignen sich zur Verwendung bei der Verpackung von rekombinantem Virus von Vektoren mit E1-Defekt (z. B. Plasmiden), die Sequenzen von Ad5 und Ad2 enthalten. Ferner wird erwartet, daß sich diese Zellen als geeignet bei der Produktion von rekombinantem Virus von anderen, dem Fachmann bekannten Ad-Serotypen erweisen.
A. Verpackung von Vektoren mit E1-Defekt
In einer bevorzugten Ausführungsform wird bei diesem erfindungsgemäßen Verfahren ein E1-deletierter Vektor, der ein Transgen enthält, in ein zur Zuführung des Transgens an eine Wirtszelle geeignetes E1-deletiertes Adenoviruspartikel verpackt. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der E1-deletierte Vektor alle zur Produktion und Verpackung eines infektiösen Adenoviruspartikels, das lediglich in Gegenwart komplementierender E1-Proteine, wie sie beispielsweise von der erfindungsgemäßen Zellinie bereitgestellt werden, repliziert, notwendigen adenoviralen Gene. Der Vektor enthält Defekte sowohl in der E1a- als auch in der E1b-Sequenz, wobei sehr wünschenswert ist, daß darin alle oder die meisten für diese Proteine codierenden Sequenzen deletiert sind.
Als Minimum enthält der zu verpackende E1-deletierte Vektor zur Replikation und Verpackung notwendige adenovirale 5'- und 3'-Cis-Elemente, ein Transgen sowie ein pIX-Gen oder ein funktionelles Fragment davon. Ferner enthält der Vektor Regulationssequenzen, die die Expression des codierten Transgenprodukts in einer Wirtszelle gestatten und die mit dem Transgen operativ verknüpft sind. „Operativ verknüpfte" Sequenzen wie sie hier verwendet werden, umfassen sowohl Expressionskontrollsequenzen, die an das interessierende Gen angrenzen, als auch Expressionskontrollsequenzen, die in trans oder in einem bestimmten Abstand zur Kontrolle des interessierenden Gens wirken. Ebenso enthält der Vektor Regulationssequenzen, die mit anderen Genprodukten, z. B. dem pIX-Gen, die vom Vektor getragen werden, operativ verknüpft sind.
1. Adenovirale Elemente
Der zu verpackende Vektor mit E1-Defekt enthält als Minimum cis-wirkende Adenovirus-5'- und -3'-ITR-Sequenzen (ITR = inverted terminal repeat) eines Adenovirus (die als Replikationsursprünge fungieren) sowie die native 5'-Verpackungs/Enhancer-Domäne. Hierbei handelt es sich um zur Verpackung linearer Ad-Genome erforderliche 5'- und 3'-cis-Elemente, die ferner die Enhancerelemente für den E1-Promoter enthalten.
Ferner wird der in ein Viruspartikel zu verpackende E1-deletierte Vektor so manipuliert, daß er das pIX-Genprodukt exprimiert. In geeignetster Weise ist dabei das pIX-Gen intakt, wobei es den nativen Promotor enthält und für das Vollängenprotein codiert. Falls gewünscht, kann jedoch der native pIX-Promotor gegen eine anderen gewünschten Promotor ausgetauscht werden. Als Alternative können für ein funktionelles Fragment von pIX codierende Sequenzen zur Verwendung im Vektor ausgewählt werden. In noch einer weiteren Alternative können die für pIX oder ein funktionelles Fragment davon codierenden nativen Sequenzen modifiziert werden, um die Expression zu verbessern. So können die nativen Sequenzen beispielsweise durch stellengerichtete Mutagenese oder eine andere geeignete Technik modifiziert werden, um bevorzugte Codons zur Verstärkung der Expression in einer ausgewählten Wirtszelle zu inserieren. Gegebenenfalls kann das pIX der E1-komplementierenden Zellinie auf einem getrennten Molekül zugeführt werden.
Ein beispielhafter lediglich die minimalen adenoviralen Sequenzen enthaltender Vektor wird als AdΔE1–E4-Vektor bezeichnet, wobei darin alle funktionellen adenoviralen Gene, einschließlich E1, E2, E3, E4, intermediäres Gen IXa und späte Gene Ll, L2, L2, L4 und L5) mit Ausnahme des vorhandenen intermediären Gens IX fehlen. Allerdings enthält in einer bevorzugten Ausführungsform der E1-deletierte Vektor zusätzlich zu den oben beschriebenen minimalen adenoviralen Sequenzen funktionelle adenovirale E2- und E4-Bereiche. In einer weiteren geeigneten Ausführungsform umfassen die adenoviralen Sequenzen im E1-deletierten Vektor die 5'- und 3'-Cis-Elemente, funktionelle E2- und E4-Bereiche, die intermediären Gene IX und IXa und die späten Gene L1 bis L5. Allerdings kann der E1-deletierte Vektor vom Fachmann konstruiert werden, und zwar unter Berücksichtigung der erforderlichen Minimalsequenzen, und ist nicht auf diese beispielhaften Ausführungsformen beschränkt.
Der Vektor wird so konstruiert, daß das Transgen und die pIX codierenden Sequenzen stromabwärts von den 5'-ITRs und stromaufwärts von den 3'ITRs lokalisiert sind. Bei dem Transgen handelt es sich um eine Nukleinsäuresequenz, die zur Adenovirussequenz heterolog ist und für ein interessierendes Polypeptid, Protein oder anderes Produkt codiert. Das Transgen ist mit regulatorischen Komponenten auf eine Weise, die die Transkription des Transgens gestattet, operativ verknüpft.
2. Transgen
Die Zusammensetzung der Transgensequenz hängt von der Verwendung, die für das erhaltene Virus vorgesehen ist, ab. So umfaßt beispielsweise eine Art von Transgensequenz eine Reportersequenz, die bei der Expression ein nachweisbares Signal produziert. Zu derartigen Reportersequenzen gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, für β-Lactamase, β-Galactosidase (LacZ), alkalische Phosphatase, Thymidinkinase, grün fluoreszierendes Protein (GFP), Chloramphenicol-Acetyltrans ferase (CAT), Luciferase, membrangebundene Proteine, einschließlich z. B. CD2, CD4, CD8, das Influenza-Hemagglutininprotein und andere, im Fachgebiet allgemein bekannte Proteine, für die dagegen gerichtete Antikörper mit hoher Affinität existieren oder sich mit herkömmlichen Mitteln herstellen lassen, sowie Fusionsproteine, die ein in geeigneter Weise an eine Antigen-Tag-Domäne aus u. a. Hemagglutinin oder Myc fusioniertes membrangebundenes Protein umfassen, codierende DNA-Sequenzen.
Wünschenswerterweise handelt es sich bei dem Transgen jedoch um eine Nicht-Markersequenz, die für ein Produkt codiert, das in der Biologie und Medizin nützlich ist, wie beispielsweise Proteine, Peptide, Antisense-Nukleinsäuren (z. B. RNAs), Enzyme oder katalytische RNAs. Dabei kann das Transgen zur Korrektur oder Milderung genetischer Schwächen, wozu Schwächen, bei denen normale Gene auf einem geringeren als dem Normalniveau exprimiert werden, oder Schwächen, bei denen das funktionelle Genprodukt nicht exprimiert wird, gehören können, verwendet werden. Eine wünschenswerte Art von Transgensequenz codiert für ein therapeutisches Protein oder Polypeptid, das in einer Wirtszelle exprimiert wird. Ferner umfaßt die Erfindung die Verwendung mehrerer Transgene (beispielsweise zur Korrektur oder Linderung eines Gendefekts, der von einem Protein mit mehreren Untereinheiten verursacht wird. In bestimmten Situationen kann zur Codierung jeweils einer Untereinheit eines Proteins oder zur Codierung unterschiedlicher Peptide oder Proteine ein unterschiedliches Transgen verwendet werden. Dies ist dann wünschenswert, wenn die für die Proteinuntereinheit codierende DNA groß ist, beispielsweise bei einem Immunglobulin, dem aus Blutplättchen stammenden Wachstumsfaktor oder einem Dystrophinprotein. Damit die Zelle das aus mehreren Untereinheiten bestehende Protein produzieren kann, wird eine Zelle mit dem jede der verschiedenen Untereinheiten enthaltenden rekombinanten Virus infiziert. Als Alternative können unterschiedliche Untereinheiten eines Proteins auch vom gleichen Transgen codiert werden. In diesem Fall enthält ein einziges Transgen die jeweils für die Untereinheiten codierende DNA, wobei die DNA für jede Untereinheit durch eine interne Ribozymeintrittsstelle (IRES) getrennt ist. Dies ist dann wünschenswert, wenn die für die Untereinheiten codierende DNA jeweils klein ist, beispielsweise wenn die für die Untereinheiten codierende DNA und die IRES insgesamt weniger als fünf Kilobasen aufweisen. Zu weiteren geeigneten Genprodukten gehören Moleküle, die eine Immunantwort induzieren, nicht natürlicherweise vorkommende Polypeptide, wie beispielsweise chimärische oder Hybridpolypeptide mit einer nicht natürlich vorkommenden, Insertionen, Deletionen oder Aminosäuresubstitution enthaltenden Aminosäuresequenz. So könnten beispielsweise einzelkettige gentechnisch hergestellte Immunoglobuline bei bestimmten Patienten mit geschwächter Immunabwehr geeignet sein. Zu weiteren Arten nicht natürlich vorkommender Gensequenzen gehören Antisense-Moleküle sowie katalytische Nukleinsäuren wie beispielsweise Ribozyme, die zur Reduzierung der Überexpression eines Gens eingesetzt werden können. Jedoch kann das ausgewählte Transgen für ein beliebiges Produkt codieren, das zur Zuführung an einen Wirt wünschenswert ist oder das man untersuchen möchte. Dabei stellt die Auswahl der Transgensequenz keine Beschränkung der vorliegenden Erfindung dar.
3. Regulationssequenzen
Zusätzlich zu den oben identifizierten Hauptelementen für den Vektor (z. B. den Adenovirussequenzen und dem Transgen) enthält der Vektor auch herkömmliche Kontrollelemente, die zum Antreiben der Expression des Transgens in einer das Transgen enthaltenden Wirtszelle benötigt werden. Somit enthält der Vektor einen ausgewählten Promotor, der mit dem Transgen verknüpft und zusammen mit dem Transgen zwischen den Virussequenzen des Vektors lokalisiert ist. Dabei können geeignete Promotoren leicht unter konstitutiven und induzierbaren Promotoren ausgewählt werden. Die Auswahl dieser und anderer üblicher Vektorelemente findet in herkömmlicher Weise statt, wobei viele geeignete Sequenzen zur Verfügung stehen [siehe z. B. Sambrook et al., und darin zitierte Literaturstellen].
Zu den konstitutiven Promotoren gehören beispielsweise, ohne darauf beschränkt zu sein, der retrovirale LTR-Promotor des Rous-Sarcoma-Virus (RSV) (gegebenenfalls mit dem RSV-Enhancer), der Cytomegalovirus (CMV)-Promotor (gegebenenfalls mit dem CMV-Enhancer) [siehe z. B. Boshart et al., Cell, 41: 521–530 (1985)], der SV40-Promotor, der Dihydrofolatreduktasepromotor, der β-Actin-Promotor, der Phosphoglycerinkinase (PGK)-Promotor sowie der EF1α- Promotor [Invitrogen]. Induzierbare Promotoren werden durch von außen zugeführte Verbindungen reguliert, und dazu gehören der durch Zink Induzierbare Metallothionin (MT)-Promotor aus Schaf, der durch Dexamethason (Dex) Induzierbare MMTV(Mouse Mammary Tumor Virus)-Promotor, das T7-Polymerase-Promotorsystem [WO 98/10088]; der Ecdyson-Promotor aus Insekten [No et al., Proc. Nat1. Acad. Sci. USA 93: 3346–3351 (1996)], das durch Tetracyclin reprimierbare System [Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547–5551 (1992)], das durch Tetracyclin Induzierbare System [Gossen et al., Science 268: 1766–1769 (1995), siehe auch Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2: 512–518 (1998)], das durch RU486 Induzierbare System [Wang et al., Nat. Biotech., 15: 239–243 (1997) und Wang et al., Gene Ther., 4: 432–441 (1997)] sowie das durch Rapamycin Induzierbare System [Magari et al., J. Clin. Invest., 100: 2865–2872 (1997)].
4. Andere Vektorelemente
Der die das Transgen sowie Regulationssequenzen (z. B. Promotoren, PolyA-Sequenzen usw.) flankierenden Ad-ITRs tragende Vektor kann in einer beliebigen Form vorliegen, mit der diese Komponenten in die Wirtszelle übertragen werden. Vorzugsweise liegt der Vektor in Form eines Plasmids vor. Zur Vermeidung einer homologen Rekombination enthält das Plasmid vorzugsweise keine Adenovirussequenzen im E1-Bereich oder dem Bereich 5' des E1-Bereichs. Es kann nicht-virale Sequenzen enthalten, wie beispielsweise solche, die für bestimmte selektionierbare Reporter oder Markergene codieren, beispielsweise unter anderem für Hygromycin oder Purimycin codierende Sequenzen. Andere Bestandteile des Plasmids können einen Replikationsursprung sowie „Amplicon", wie z. B. das Amplicon-System, bei dem das nukleäre Antigen des Epstein-Barr-Virus eingesetzt wird, enthalten, beispielsweise die Vektorkomponenten in pCEP4 (Invitrogen). Siehe auch J. Horvath et al., Virology, 184: 141–148 (1991). Dieses Amplicon-System oder ähnliche Amplicon-Komponenten gestatten die episomale Replikation mit hoher Kopienzahl in den Zellen.
Weitere heterologe Nukleinsäuresequenzen, die gegebenenfalls in diesem Vektor vorhanden sind, umfassen Sequenzen, die für die effiziente Polyadenylierung des RNA-Transkripts erforderliche Signale bereitstellen, sowie Introns mit funktionellen Spleißdonor- und -Akzeptorstellen. Eine übliche Poly-A-Sequenz, die in den bei der vorliegenden Erfindung geeigneten Vektoren eingesetzt wird, ist die aus dem Papovavirus SV-40 stammende Sequenz. Die Poly-A-Sequenz wird im allgemeinen hinter den Transgensequenzen und vor der 3'-ITR-Sequenz eingefügt. Ein in der vorliegenden Erfindung geeigneter Vektor kann auch ein Intron enthalten, das wünschenswerterweise zwischen der Promotor-Enhancer-Sequenz und dem Transgen lokalisiert ist. Eine mögliche Intronsequenz stammt ebenso aus SV-40 und ist unter der Bezeichnung SV-40T-Intronsequenz bekannt. Die Auswahl dieser und anderer üblicher Vektorelemente findet in herkömmlicher Weise statt, wobei viele derartige Sequenzen zur Verfügung stehen [siehe z.B. Sambrook et al. und darin zitierte Literaturstellen, beispielsweise auf Seite 3.18–3.26 und 16.17–16.27].
5. Co-Transfektion adenoviraler Sequenzen
Vorzugsweise enthält der E1-deletierte Vektor alle zur Verpackung und Replikation in Gegenwart der erfindungsgemäßen E1-komplementierenden Zellinie benötigten funktionellen adenoviralen Sequenzen. Dabei werden neben den von der trans-komplementierenden Zellinie bereitgestellten E1a- und E1b-Funktionen die funktionellen Adenovirus-E2a- und -E4-ORF6-Bereiche benötigt. Allerdings können dort, wo die benötigten Funktionen im E1-deletierten Vektor fehlen, (d. h. der E1-deletierte Vektor enthält ferner funktionelle Deletionen in E2a und/oder E4-ORF6), diese Funktionen aus anderen Quellen bereitgestellt werden. In einer Ausführungsform können dabei diese Funktionen durch Co-Transfektion der E1-komplementierenden Zellinie mit einem oder mehreren zur Steuerung der Expression der benötigen adenoviralen Funktionen fähigen Nukleinsäuremolekülen bereitgestellt werden. Als Alternative kann eine modifizierte erfindungsgemäße GH329-Zellinie, die zur Bereitstellung der erforderlichen adenoviralen Funktionen transformiert wurde, benutzt werden.
Beispielsweise kann ein Vektor, in dem E1 deletiert ist und der einen Defekt im E2-Bereich aufweist, in erfindungsgemäßen GH329-Zellen komplementiert werden, indem die Zellen mit einem die benötigten E2-Funktionen (z. B. E2a) exprimierenden Nukleinsäuremolekül (z. B. einem Plasmid) transfiziert werden. In einem weiteren Beispiel kann ein Vektor, dem die Funktionen E1 bis E4 fehlen, in GH329-Zellen komplementiert werden, indem die Zellen mit einem funktionelles E2, E3 und E4 (z. B. E4-ORF6) exprimierenden Nukleinsäuremolekül transfiziert werden. Dort, wo ein Nukleinsäuremolekül in die erfindungsgemäßen Zellen cotransfiziert wird, enthält ein solches Nukleinsäuremolekül keine adenoviralen E1-Sequenzen; ebenso enthält es keine Sequenzen 5' des E1-Bereichs. Die Konstruktion dieser Nukleinsäuremoleküle liegt im Bereich des fachmännischen Könnens.
Geeigneterweise wird ein ausgewählter rekombinanter Vektor, wie oben beschrieben, in E1-komplementierende Zellen von einer erfindungsgemäßen Zellinie unter Verwendung herkömmlicher Techniken, wie beispielsweise den im Fachgebiet bekannten Transfektionstechniken, eingeführt [siehe K. Kozarsky et al., Som. Cell and Molec. Genet., 19(5). 449 bis 458 (1993)]. Danach werden rekombinante E1-deletierte Adenoviren isoliert und nach Transfektion gereinigt. Reinigungsverfahren sind dem Fachmann allgemein bekannt und können leicht ausgewählt werden. So können die Viren beispielsweise einer Plaque-Reinigung und die Lysate einer Cäsiumchloridzentrifugation ausgesetzt werden, um gereinigtes Virus zu erhalten.
B. Amplifikation E1-deletierter Adenoviren
Die erfindungsgemäße E1-trans-komplementierende Zelllinie (oder ein Derivat davon) kann zur Amplifikation eines Adenovirus mit E1-Defekt verwendet werden. Geeigneterweise wurde dabei vor der Verwendung in diesem Verfahren das Adenovirus mit E1-Defekt isoliert und von Zelltrümmern und anderen Virusmaterialien gereinigt. Dies ist insbesondere dann wünschenswert, wenn das zu amplifizierende Adenovirus mit E1-Defekt mit anderen Verfahren als denen der vorliegenden Erfindung produziert wird. Geeignete Reinigungsverfahren, beispielsweise Plaque-Reinigung, sind dem Fachmann allgemein bekannt.
Eine Kultur oder vorzugsweise eine Suspension von Zellen von einer erfindungsgemäßen E1-trans-komplementierende Zellinie, z. B. GH329, wird unter Verwendung herkömmlicher Verfahren mit dem Adenovirus mit E1-Defekt infiziert. Dabei kann ein geeigneter MOI-Wert (multiplicity of infection) leicht ausgewählt werden. Allerdings ist ein MOI-Wert im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 100, etwa 0,5 bis etwa 20 und/oder etwa 1 bis etwa 5 wünschenswert. Die Zellen werden dann unter Bedingungen kultiviert, die das Zellwachstum und die Replikation des Adenovirus mit E1-Defekt in Gegenwart des von den erfindungsgemäßen Zellinien exprimierten E1 gestattet. Geeigneterweise werden die Viren fortgesetzten Passagierungen mit bis zu 5, 10 oder 20 Passagierungen ausgesetzt. Falls gewünscht, können die Viren jedoch auch weniger oder mehr Passagierungen unterzogen werden.
Die Zellen werden zwei bis drei Runden aus Einfrieren und Auftauen ausgesetzt, und das erhaltene Lysat wird dann zum Einsammeln einer Zentrifugation unterzogen, wobei der Überstand gesammelt wird. Zur Aufkonzentration des rAd-ΔE1 gegenüber den Zellproteinen im Lysat werden herkömmliche Reinigungstechniken, wie beispielsweise Chloridgradientenzentrifugation oder Säulenchromatographie, verwendet. Vorteilhafterweise werden allerdings bei dem erfindungsgemäßen Verfahren über die Verwendung der erfindungsgemäßen Zellinien die Probleme mit kontaminierendem RCA, die die herkömmlichen Produktionstechniken plagen, vermieden.
III. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren produziertes E1-deletiertes Ad
Die gemäß der vorliegenden Erfindung produzierten E1-deletierten Adenoviren eignen sich für verschiedene Anwendungen und insbesondere für In-vivo-Anwendungen, da die vorliegende Erfindung die Produktion dieser Adenoviren in serumfreien Medien und in Abwesenheit von nachweisbarem RCA gestattet. Somit sind die erfindungsgemäß produzierten E1-deletierten Adenoviren weitgehend frei von Verunreinigung mit RCA.
In einer Ausführungsform wurden E1-deletierte Viren als geeignet für Anwendungen erachtet, bei denen eine transiente Transgenexpression als Therapie dient (z. B. p53-Gentransfer bei Krebs und VEGF-Gentransfer bei Herzkrankheiten). Allerdings sind die E1-deletierten Adenoviren nicht auf eine Verwendung beschränkt, bei der eine transiente Transgenexpression erwünscht ist. Die E1-deletierten Adenoviren eignen sich in verschiedenen Situationen, bei denen die Zuführung und Expression eines ausgewählten Transgens gewünscht wird.
Geeignete Dosen an E1-deletierten Adenoviren können vom Fachmann je nach dem behandelten Leiden, der Gesundheit, dem Alter und dem Gewicht des tierischen oder menschlichen Patienten und anderen verwandten Faktoren leicht bestimmt werden. Allerdings kann im allgemeinen eine für einen erwachsenen Menschen mit einem Gewicht von etwa 80 kg geeignete Dosis im Bereich 10¹⁰ bis 10¹⁸ und vorzugsweise von etwa 10¹⁴ bis 10¹⁶ Viruspartikel pro Dosis liegen. Diese Dosis kann in etwa 0,01 ml bis etwa 1 ml eines physiologisch verträglichen Trägers suspendiert und mit beliebigen geeigneten Mitteln zugeführt werden. Die Dosis kann je nach Bedarf oder Wunsch täglich, wöchentlich, monatlich oder in anderen ausgewählten Zeitabständen wiederholt werden.
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung der Herstellung der beispielhaften erfindungsgemäßen Zellinien und ihrer Verwendung bei der Produktion von über 20 Passagierungen von nachweisbarem RCA freiem E1-deletierten Adenovires bereitgestellt. Dabei stellen diese Beispiele keine Beschränkung des Erfindungsumfangs dar. Dem Fachmann ist ersichtlich, daß trotz der Aufführung spezifischer Reagentien und Bedingungen in den folgenden Beispielen Modifikationen durchgeführt werden können, die vom Erfindungsumfang umfaßt sind.
Beispiel 1 – Herstellung E1-komplementierender Zellinien
Wie in diesem Beispiel beschrieben, wurden Vero-, A549- und HeLa-Zellen mit Plasmidkonstrukten, die ein von Basenpaar 511 bis 3924 reichendes 3,4 kb großes DNA-Fragment des Ad5-Genoms (offene Leseraster für E1a und E1b und Teil des pIX-Gens) trugen, stabil transfiziert. In 1 ist eine schematische Darstellung der relevanten Konstrukte aufgeführt. In diesen Konstrukten wurde der native E1a-Promotor entweder durch Sequenzen aus den frühen Genen des Cytomegalovirus (CMV) oder dem Gen für menschliche Phosphoglyceratkinase (PGK) ersetzt. Dabei gibt es keine Überlappung mit dem unten beschriebenen 5'-Bereich des E1-deletierten Vektors (Basenpaar 0–360) und eine reduzierte Überlappung am 3'-Bereich (Vektor beginnt bei Basenpaar 3312, während die Adenovirussequenz sich in 293- bis zu Basenpaar 4300 ausdehnt).
A. Konstruktion der PGKE1-Plasmide
Der Ad5-E1-Bereich (m. u. 1,42–10,9) wurde in den Vektor pBluescript SK(–) kloniert. Das 3,4 kb große E1-Fragment wurde weiter in ein Plasmid subkloniert, das die Expression von aus dem Gen für Phosphoglyceratkinase [PGK] [Adra et al., Gene, 60: 65–74 (1987)] oder dem „immediate early"-Gen aus Cytomegalovirus [CMV] [Thomsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 659–663 (1984)] stammenden Promotoren gestattete. Beide enthielten das Neomycin-Resistenzgen für die G418-Selektion.
B. Transfektionen und Selektion eines G418-resistenten Klons
HeLa-, A549- und Vero-Zellen wurden von der ATCC bezogen und jeweils in Form eines Monolayers [Einfachschicht] in mit 10% fötalem Rinderserum supplementiertem DMEM (Dulbecco modified Eagle's minimal essential medium) gehalten. Die Plasmide wurden mittels Calciumphosphatpräzipitation auf die in 100-mm-Platten ausgebrachten Zellen transfiziert, wobei für jede Platte jeweils 10 μg Plasmid-DNA eingesetzt wurde. 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen trypsinisiert und in verschiedenen (von 1:5 bis 1:40 reichenden Verdünnungen) in G418-haltigen Medien ausgebracht. Nach zwei Wochen Selektion wurde die G418-resistente Klonierung isoliert, expandiert und auf E1-Expression durchmustert.
Aus den A549-Transfektanten bildete sich nur ein stabiler Klon heraus, während von den HeLa-Transfektanten 70 Klone und von den Vero-Zellen-Transfektanten 50 Klone isoliert wurden (Daten nicht gezeigt).
C. – Screening-Verfahren für neue E1-Linien
Stabile G418-resistente Klone wurden zunächst einem Screening mit einem "blue comet"-Test (blue comet formation assay) unterzogen, bei dem 1 × 10⁶ Zellen in 6-Loch-Platten mit 200 LFU (LacZ forming units) H5.CBLacZ [einem E1-deletierten Adenovirus mit Expression von LacZ von einem β-Actin-Promotor] [Gao et al., J. Virol., 70: 8934 bis 8943 (1996)] infiziert wurden. Sechs Tage nach der Infektion wurden die Zellen histochemisch mit 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-gal) umgefärbt und in jeder Vertiefung Kometen aus blauen Zellen ausgezählt. Anschließend wurden die stark positiven Klone in 4-Loch-Glaskammer-Objektträgern 24 Stunden lang ausgebracht. Das Expressionsniveau der Proteine E1a und E1b in den Zellen wurde mittels Immunfluoreszenzfärbung unter Verwendung von monoklonalen Maus-Antikörpern (Oncogene Science) beurteilt.
Die G418-resistenten Klone wurden expandiert und zunächst einem Screening auf ihre Fähigkeit zur Unterstützung der Vermehrung eines E1-deletierten Adenovirusvektors, der das LacZ-Transgen trug, unterzogen; die einzigen Klone, die zur Aufrechterhaltung der Replikation des E1-deletierten Adenovirus fähig waren, stammten von HeLa ab.
Beispiel 2 – Charakterisierung neuer E1-komplementierender Zellinien
A. Genetischer Aufbau
Aus den E1-komplementierenden Klonen wurden jeweils genomische Gesamt-DNAs isoliert, zur Freisetzung eines internen, E1 enthaltenden Plasmidfragments mit entsprechenden Restriktionsendonukleasen verdaut und nach Elektrophorese mittels DNA-Hybridisierung bewertet. Insbesondere wurden DNAs auf 1%-Agarosegelen aufgetrennt, auf Nylonfilter übertragen und mit einem 1,1 kb großen E1-HindIII/SmaI-Fragment hybridisiert.
Alle getesteten Zellinien weisen wenigstens eine Kopie des in das HeLa-Genom integrierten E1-Gens auf. Ein PGK-E1-Klon (GH364) und eine CMV-E1-Zelllinie (GH414) tragen 5–10 Kopien des E1-Gens.
B. Produktion von E1-Proteinen
Von jedem Klon wurden Zellpellets aus 60-mm-Platten geerntet und in 200 μl Lysepuffer (20 mM Tris-Cl, pH 8,0, 140 mM NaCl, 1% NP40 (v/v), 1 mM PMSF, jeweils 1 μg/ml Leupeptin, Antipain, Chymostatin, Sojabohnen-Trypsininhibitor) resuspendiert. Die Lysate wurden eine Stunde auf Eis inkubiert und 30 Minuten in einer Mikrozentrifuge bei 14000 UpM und 4°C zentrifugiert. Die Überstände wurden gesammelt und Gesamtproteinkonzentrationen mit dem Lowry-Verfahren bestimmt. Proben (50 μg) wurden auf, 10%-SDS-PAGE-Gelen aufgetrennt und auf Nitrocellulosemembranen elektrotransferiert. Die Proteine E1a und E1b wurden mit dem ECL (enhanced chemiluminescence)-System (Amersham Life Science, Arlington Heights, IL) mit einem polyklonalen Maus-Antikörper (PharmMingen, San Diego, CA) bzw. monoklonalen Ratte-Antikörpern(Oncogene Science) nachgewiesen. Als Kontrollen wurden Gesamtzellproteine aus 293-Zellen verwendet.
Die Western-Blot-Analyse zeigte hinsichtlich Gesamtexpression und den Verhältnissen von E1a- zu E1b-Proteinen zwischen verschiedenen Klonen variable E1-Proteinexpressionsprofile. Mit dem Anti-Ad5-Antikörper wurde das E1a-Protein als Doppelbande bei ungefähr 35–46 kDa identifiziert.
C. Wachstumskinetik eines rekombinanten E1-deletierten Virus H5.CBLacZ auf den neuen E1 komplementierenden Zellinien
HeLa-, 293-Zellen und die Zellen der neuen E1-Zellinien wurden mit H5.CBLacZ bei einem MOI-Wert (multiplicity of infection) gleich 0,5 infiziert. Die infizierten Zellen wurden 24, 48, 72, 96 und 120 Stunden nach der Infektion geerntet. Die Zellen wurden im Infektionsmedium durch drei Runden von Einfrieren/Auftauen lysiert und der Virustiter über Infektionen in Verdünnungsreihen auf 293-Zellen und anschließender histochemischer Anfärbung mit X-gal bestimmt. Die Zellen wurden histochemisch nach 20 Stunden mit X-gal angefärbt und blaue Zellen gezählt. Die Titer sind in LFU (LacZ forming units [LacZ bildende Einheiten]) pro ml ausgedrückt, wobei eine LFU als diejenige Menge an Virus definiert ist, die zum Hervorrufen einer visuell nachweisbaren LacZ-Expression in einer Zelle 24 Stunden nach der Infektion ausreicht.
Die Ausbeute an H5.CBLacZ-Virus in den Zellinien ist jeweils in 2A gezeigt, wobei es sich bei der y-Achse um eine logarithmische Achse handelt, und die Zeitpunkte auf der x-Achse dargestellt sind. Zwei Zellinien, GH329 und GH354, waren im Hinblick auf die Produktion (2A) an E1-deletiertem Virus gleichwertig zu, wenn nicht gar besser als 293-Zellen.
D. Relative Plaque-Bildungseffizienzen (RPEs) für H5.CBLacZ-Virus auf neuen E1-Zellinien
Die neuen E1-Zellinien wurden mit 293-Zellen auf ihre Fähigkeiten zur Unterstützung der Plaque-Bildung vom H5.CBLacZ-Virus verglichen. Dabei wurden die Zellen mit einer Anzahl von Verdünnungsreihen vom H5.CBLacZ-Virus infiziert und nach 20 Stunden mit Top-Agar überschichtet. Die Plaques wurden durch Anfärben mit Neutralrot am Tag 10 nach der Infektion nachgewiesen. Die RPEs wurden als Prozentanteil des Titers des H5.CBLacZ-Virus im Vergleich mit dem auf 293-Zellen berechnet. Dabei wurden die Zellen mit einer Anzahl von Verdünnungsreihen vom H5.CBLacZ-Virus infiziert und nach 20 Stunden mit Top-Agar überschichtet.
Die Plaques wurden durch Anfärben mit Neutralrot am Tag 10 nach der Infektion nachgewiesen. RPEs wurden als Prozentanteil des H5.CBLacZ-Virustiters berechnet. Gefüllte Balken: mittlere RPE für jede Zellinie aus drei verschiedenen Experimenten; Fehlerbalken: Standardabweichungen. Zwei Zellinien, GH329 und GH354, waren im Hinblick auf die Plaque-Bildungseffizienz (2B) von E1-deletiertem Virus gleichwertig mit, wenn nicht gar besser als 293-Zellen.
Beispiel 3 – Nachweis von RCAs in den Präparationen des rekombinanten E1-deletierten Virus nach mehreren Passagierungen entweder in 293- oder in GH329-Zellen
Die Neigung zur Erzeugung von RCAs wurde mittels Passagierungsserien eines E1-deletierten LacZ-Virus (ursprünglich isoliert auf GH329) und sowohl GH329- als auch 293-Zellen untersucht. Dabei wurde ein Teil eines jeden Lysats zur Infektion einer nicht-E1-exprimierenden Zellinie (A549) zur Beurteilung auf RCA, das sich als Cytopathologie nach einer Passagierungsserie präsentierte und durch DNA-Hybridisierungsanalyse bestätigt wurde, wie folgt verwendet. Da jedoch rohe Hirt-DNAs für die Southern-Blot-Analyse verwendet wurden, wäre es schwierig, den Test zur Qualifizierung der Menge an RCAs in jeder Probe zu verwenden.
H5.CBLacZ-Virus wurde zweimal auf GH329-Zellen nach der Standardvorschrift (Gao et al., J. Virol., 70: 8934–8943 (1996)) Plaque-gereinigt. Die durch histochemische Anfärbung mit X-gal identifizierten blauen Plaques wurden selektioniert, zu einer großen Präparation in GH329-Zellen expandiert und mittels CsCl-Gradientenzentrifugation gereinigt. Das gereinigte H5.CBLacZ-Virus wurde als Passagierung 0 (PO) bezeichnet und gleichzeitig über bis zu 20 Passagierungen für fortlaufende Passagierungen auf 293- und GH329-Zellen verwendet. Präparationen im Großmaßstab von in jeder Zellinie angezogenen Viren wurden aus den Passagierungen 5, 10, 15 und 20 CsCl-Gradienten-gereinigt. A549-Zellen wurden von der ATCC erhalten und in mit 10% FBS supplementiertem F-12K-Medium kultiviert. Für den RCA-Test wurden die Zellen bei einer Dichte von 1 × 10⁷ Zellen pro 150-mm-Platte 24 Stunden vor der Virusinfektion ausgebracht. Gesamtmengen von jeweils 1 × 10⁸ PFU der Testviren wurden in 80 ml F-12K-Medium mit 2% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin/Streptomycin (P/S) verdünnt und auf vier 150-mm-Platten von A549-Zellen gegeben, nachdem das Wachstumsmedium jeweils von allen Platten entfernt worden war. 24 Stunden nach der Infektion wurde in jede Platte jeweils 1,6 ml FBS gegeben. Als Positivkontrolle wurde allen 1 × 10⁸ PFU-Testartikeln für das oben beschriebene Infektionsverfahren jeweils 1 PFU Ad5-Wildtypvirus zugesetzt. Parallel dazu wurden ebenso Negativkontrollplatten analysiert. Von jeder Platte wurden 14 Tage später infizierte Zellen geerntet und im Infektionsmedium durch drei Runden von Einfrieren und Auftauen lysiert. 20% des Gesamtzelllysats von jeder Platte wurden zur Infektion einer Platte von A549-Zellen nach der oben beschriebenen Vorschrift verwendet. Sieben Tage nach der Infektion wurden die Platten unter einem Lichtmikroskop auf cytopathische Effekte untersucht. Mit dem in dieser Untersuchung verwendeten RCA-Test läßt sich ein PFU RCA in 10⁸ PFU rekombinanten Viren nachweisen. Die infizierten Zellen von jeder Platte wurden mit dem Medium geerntet und zum Sammeln des Zellpellets herunterzentrifugiert. Die Zellpellets wurden jeweils in 0,5 ml 10 mM Tris-Cl, pH 8,0 resuspendiert und durch drei Runden von Einfrieren und Auftauen lysiert. Nach 15 min Zentrifugation bei 3200 UpM in einer Sorvall-26-Zentrifuge wurde jeweils der Überstand der Proben gesammelt. Von jedem Überstand wurde ein Drittel mit einem gleichen Volumen an 2 × Pronase-Lösung (2 mg/ml Pronase, 100 mM Tris-Cl, pH 7,6, 2 mM EDTA, 1% SDS, die Lösung bei 37°C 45 min inkubieren) gemischt, vier Stunden bei 37°C inkubiert mit Phenol-Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Die rohen Virus-DNA-Proben wurden in einem gleichen Volumen TE-Puffer resuspendiert und einer Verdauung mit Nsi I-Endonuklease sowie einer Southern-Blot-Analyse unterzogen. Die Blots wurden mit einer 420 bp großen E1-XbaI/ClaI-DNA-Sonde hybridisiert.
Die Ergebnisse zeigten, daß zwischen den Passagierungen 5 und 10 auf 293-Zellen signifikante Mengen an RCA auftraten, wohingegen nach 20 Passagierungen auf GH329 kein RCA nachgewiesen wurde. Die Empfindlichkeit des RCA-Tests wurde bestätigt, indem GH329-Zellen mit 0 Passagierungen in Gegenwart des Vektors 1 PFU Wildtyp-Ad zugesetzt wurde.
Obgleich die Erfindung mit Bezug auf eine besonders bevorzugte Ausführungsform beschrieben wurde, ist ersichtlich, daß sich Modifikationen innerhalb des Umfangs der beigefügten Ansprüche durchführen lassen.

Claims

E1 komplementierende Zellinie, geeignet zur Produktion rekombinanter Adenoviren mit E1-Defekt in Abwesenheit von nachweisbarem replikationskompetentem Adenovirus, wobei die E1 komplementierende Zellinie eine mit einem das offene Leseraster (ORF [open reading frame]) von Adenovirus-E1a und Adenovirus-E1b unter der Kontrolle eines Phosphoglyceratkinasepromotors (PGK-Promotors) codierende Nukleinsäuresequenzen umfassenden Nukleinsäuremolekül stabil transformierte aneuploide Zellinie umfaßt, wobei die Nukleinsäuresequenzen ferner eine Deletion aller sich 5' zu den Adenovirus-E1a-ORF codierenden Sequenzen befindenden Adenovirussequenzen umfassen und wobei es sich bei der aneuploiden Zellinie um eine HeLa-Zellinie handelt.
E1 komplementierende Zellinie nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Nukleinsäuremolekül um einen Plasmidvektor handelt.
E1 komplementierende Zellinie nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Nukleinsäuremolekül mehrere Kopien der Adenovirus-E1a und Adenovirus-E1b codierenden Sequenzen umfaßt.
E1 komplementierende Zellinie nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die E1 komplementierende Zellinie mehrere Kopien des Nukleinsäuremoleküls umfaßt.
E1 komplementierende Zellinie nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Adenovirus-E1a codierenden Sequenzen und die E1b codierenden Sequenzen unabhängig ausgewählt sind aus Adenovirus-Typ 5.
Adenovirus-E1 komplementierende Zellinie mit der Bezeichnung GH329, hinterlegt bei der ATCC unter der Zugangsnummer PTA-803.
Verfahren zur Verpackung adenoviraler Partikel mit E1-Defekt in Abwesenheit von replikationskompetentem Adenovirus, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: (a) Bereitstellen von Zellen von einer E1 komplementierenden Zellinie, die eine mit einem das offene Leseraster (ORF) von Adenovirus-E1a und Adenovirus-E1b unter der Kontrolle eines Phosphoglyceratkinasepromotors (PGK-Promotors) codierende Nukleinsäuresequenzen umfassenden Nukleinsäuremolekül stabil transformierte aneuploide Zellinie umfaßt, wobei die Nukleinsäuresequenzen ferner eine Deletion aller sich 5' zu den Adenovirus-E1a-ORF codierenden Sequenzen befindenden Adenovirussequenzen umfassen und wobei es sich bei der aneuploiden Zellinie um eine HeLa-Zellinie handelt; (b) Transfizieren der Zellen mit einem rekombinanten Vektor, der von 5' nach 3' Adenovirus-5'-ITR-Sequenzen (ITR = inverted terminal repeat), Adenovirus-pIX codierende Nukleinsäuresequenzen unter der Kontrolle von Sequenzen, die die Expression von Adenovirus-pIX in den Zellen steuern, einen Defekt im Adenovirus-E1-Bereich und Adenovirus-3'-ITR-Sequenzen umfaßt; und (c) Kultivieren der transfizierten Zellen unter Bedingungen, die die Verpackung des Vektors mit E1-Defekt in ein rekombinantes adenovirales Partikel mit E1-Defekt gestatten.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der rekombinante Vektor ferner ein ausgewähltes Transgen umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Transgen zwischen den 5'- und 3'-ITR-Sequenzen lokalisiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, bei dem ferner die Zellen mit einem zweiten rekombinanten Vektor, der Adenovirussequenzen, die wenigstens ein adenovirales Gen und einen Defekt im Adenovirus-E1-Bereich codieren, umfaßt, transfiziert werden.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der zweite rekombinante Vektor Adenovirus-E2a codiert.
Verfahren nach Anspruch 10 oder Anspruch 11, wobei der zweite rekombinante Vektor Adenovirus-E4 oder E4-ORF6 codiert.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei der zweite rekombinante Vektor E4-ORF6 codiert.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei es sich bei der E1 komplementierenden Zellinie um GH329, ATCC PTA-803, handelt.
Verfahren zur Amplifikation adenoviraler Partikel mit E1-Defekt in Abwesenheit von replikationskompetentem Adenovirus, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: (a) Infizieren einer E1 komplementierenden Zellinie mit Adenoviren mit E1-Defekt, die Adenovirus-5'- und -3'-ITR-Sequenzen, Adenovirus-pIX codierende Nukleinsäuresequenzen unter der Kontrolle von Sequenzen, die die Expression von Adenovirus-pIX in den Zellen steuern, und einen Defekt im Adenovirus-E1-Bereich umfassen, wobei die Zellinie eine mit einem das offene Leseraster (ORF) von Adeno virus-E1a und Adenovirus-E1b unter der Kontrolle eines Phosphoglyceratkinasepromotors (PGK-Promotors) codierende Nukleinsäuresequenzen umfassenden Nukleinsäuremolekül stabil transformierte aneuploide Zellinie umfaßt, wobei die Nukleinsäuresequenzen ferner eine Deletion aller sich 5' zu den Adenovirus-E1a-ORF codierenden Sequenzen befindenden Adenovirussequenzen umfassen und wobei es sich bei der aneuploiden Zellinie um eine HeLa-Zellinie handelt; (b) Passagieren der adenoviralen Partikel mit E1-Defekt auf der E1 komplementierenden Zelllinie mit 2 bis 20 Passagen und (c) Sammeln der adenoviralen Partikel mit E1-Defekt.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Adenoviren mit E1-Defekt aus (a) in den folgenden Schritten präpariert werden: (i) Bereitstellen von Zellen von einer E1 komplementierenden Zellinie, die eine mit einem das offene Leseraster (ORF) von Adenovirus-E1a und Adenovirus-E1b unter der Kontrolle eines Phosphoglyceratkinasepromotors (PGK-Promotors) codierende Nukleinsäuresequenzen umfassenden Nukleinsäuremolekül stabil transformierte aneuploide Zellinie umfaßt, wobei die Nukleinsäuresequenzen ferner eine Deletion aller sich 5' zu den Adenovirus-E1a-ORF codierenden Sequenzen befindenden Adenovirussequenzen umfassen und wobei es sich bei der aneuploiden Zellinie um eine HeLa-Zellinie handelt; (ii) Transfizieren der Zellen mit einem rekombinanten Vektor, der Adenovirus-5'- und -3'-ITR-Sequenzen, Adenovirus-pIX codierende Nukleinsäuresequenzen unter der Kontrolle von Sequenzen, die die Expression von Adenovirus- pIX in den Zellen steuern, und einen Defekt im Adenovirus-E1-Bereich umfaßt; (iii) Kultivieren der transfizierten Zellen unter Bedingungen, die die Verpackung des Vektors mit E1-Defekt in ein rekombinantes adenovirales Partikel mit E1-Defekt gestatten; und (iv) Reinigen der rekombinanten adenoviralen Partikel mit E1-Defekt von Zelltrümmern.