DE69534878T2 - Neuartige adenovirale vektoren, verpackungsszellinien, rekombinante adenoviren und verfahren - Google Patents

Neuartige adenovirale vektoren, verpackungsszellinien, rekombinante adenoviren und verfahren Download PDF

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue replikationsdefiziente adenovirale Vektoren und neue Verpackungszellinien. Insbesondere weisen die neuen Verpackungszellinien die komplementäre Funktion für die Deletionen der frühen Genregion E1, E4 und gegebenenfalls der E3 von humanem Adenovirus auf.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Replikationsdefekte retrovirale Vektoren als Gentransfervehikel stellen die Grundlage für humane Gentherapie bereit. Retrovirale Vektoren werden gentechnisch durch Entfernen oder Verändern aller viralen Gene hergestellt, so daß in mit dem Vektor infizierten Zellen keine viralen Proteine hergestellt werden und keine weitere Virusausbreitung erfolgt. Die Entwicklung von Verpackungszellinien, die für die Propagation von retroviralen Vektoren erforderlich sind, war der wichtigste Schritt in Richtung zu der Realität humaner Gentherapie. Die herausragendsten Vorteile retroviraler Vektoren für die Gentherapie sind die hohe Wirksamkeit des Gentransfers und die präzise Integration der transferierten Gene in zelluläre genomische DNA. Jedoch sind mit retroviralen Vektoren auch größere Nachteile verbunden, nämlich die Unfähigkeit retroviraler Vektoren, nicht teilende Zellen zu transduzieren, und die potentielle insertionale Mutagenese.
  • Humane Adenoviren sind als lebende virale Impfstoffe entwickelt worden und stellen eine weitere Alternative für in-vivo-Genzuführungsvehikel für humane Gentherapie bereit [Graham & Prevec in New Approaches to Immunological Problems (Neue Herangehensweisen für immunologische Probleme), Ellis (Hrsg.), Butterworth-Heinemann, Boston, MA, S. 363-390 (1992), Rosenfeld et al., Science 252: 431-434 (1991), Rosenfeld et al., Cell 68: 143-155 (1992) und Ragot et al., Nature 361: 647-650 (1993)]. Die Merkmale, welche rekombinante Adenoviren zu potentiell kraftvollen Genzuführungsvektoren machen, sind ausgiebig überprüft worden [Berkner, Biotechniques 6: 616-629 (1988) und Kozarsky & Wilson, Curr. Opin. Genet. Dev. 3: 499-503 (1933)]. Kurz gesagt können rekombinante Adenoviren in großen Mengen gezüchtet und gereinigt werden und infizieren wirksam in vivo ein weites Spektrum von sich teilenden und nicht teilenden Säugerzellen. Darüber hinaus kann das adenovirale Genom mit relativer Leichtigkeit manipuliert werden und sehr große Insertionen von DNA aufnehmen.
  • Die erste Generation von rekombinanten adenoviralen Vektoren, die gegenwärtig erhältlich ist, hat eine Deletion in der viralen frühen Genregion l (hier genannt E1, welche die E1a- und E1b-Region von den Einheiten 1,30 bis 9,24 der genetischen Karte umfaßt), welche für die meisten Verwendungen durch ein Transgen ersetzt wird. Ein Transgen ist ein heterologes oder fremdes (exogenes) Gen, das durch einen viralen Vektor getragen und in eine Wirtszelle transduziert wird. Deletion der viralen E1-Region macht den rekombinanten Adenovirus defekt für Replikation und unfähig, in den nachfolgend infizierten Zielzellen infektiöse virale Partikel zu erzeugen [Berkner, Biotechniques 6: 616-629 (1988)]. Die Fähigkeit, E1-deletierte Adenoviren zu erzeugen, basiert auf der Verfügbarkeit der humanen embryonalen Nieren-Verpackungszellinie, genannt 293. Diese Zellinie enthält die E1-Region des Adenovirus, welche die E1-Region-Genprodukte bereitstellt, die in dem E1-deletierten Virus fehlen [Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59-72, (1977)]. Jedoch haben die inhärenten Fehler der gegenwärtigen rekombinanten Adenoviren der ersten Generation zunehmende Bedenken über ihre schließliche Nutzung bei Patienten hervorgerufen. Verschiedene neuere Studien haben gezeigt, daß E1-deletierte Adenoviren nicht vollständig Replikationsinkompetent sind [Rich, Hum. Gene Ther. 4: 46176 (1993) und Engelhardt et al., Nature Genet. 4: 27-34 (1933)]. Drei allgemeine Begrenzungen sind mit der Technologie des adenoviralen Vektors verbunden. Erstens haben Infektion sowohl in vivo als auch in vitro mit dem adenoviralen Vektor bei hoher Multiplizität der Infektion (abgekürzt MOI) zu Cytotoxizität für die Zielzellen geführt, zurückzuführen auf die Akkumulation von Penton-Protein, welches selbst toxisch für Säugerzellen ist [(Kay, Cell biochem. 17E: 207 (1993)]. Zweitens bewirken Immunantworten des Wirts gegen adenovirale späte Genprodukte, einschließlich Penton-Protein, die entzündliche Reaktion und Zerstörung des infizierten Gewebes, welches die Vektoren aufgenommen hatte [Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4407-4411 (1994)]. Letztlich verhindern Immunantworten und cytotoxische Wirkungen des Wirts gemeinsam die langfristige Expression von Transgenen und bewirken verminderte Niveaus von Genexpression nach nachfolgender Verabreichung von adenoviralen Vektoren [Mittal et al., Virus Res. 28: 67-90 (1993)].
  • Angesichts dieser Hindernisse sind weitere Veränderungen in der Gestaltung des adenoviralen Vektors erforderlich, um die Fähigkeit des Virus, späte virale Genproteine zu exprimieren, zu lähmen, wobei cytotoxische Reaktionen des Wirts und die Erwartung abnehmender Immunantwort des Wirts vermindert werden. Engelhardt et al. haben kürzlich eine temperaturempfindliche (ts) Mutation innerhalb der Region des E2A-codierten DNA-Bindungsproteins (DBP) des E1-deletierten rekombinanten adenoviralen Vektors konstruiert [Engelhardt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 6196200 (1994)], welchem nicht gelingt, bei nicht permissiven Temperaturen in vitro späte Genprodukte zu exprimieren. Über verminderte Entzündungsreaktionen und verlängerte Transgenexpression in Tierlebern, infiziert mit diesem Vektor, wurde berichtet (Engelhart et al. 1994). Jedoch kann die ts-DBP-Mutation in vivo nicht ein voll inaktives Genprodukt bewirken und wird daher unfähig sein, späte Genexpression vollständig zu blockieren. Weitere technische Fortschritte werden benötigt, die eine zweite letale Deletion in die adenoviralen E1-deletierten Vektoren einführen würden, um späte Genexpression in vivo vollständig zu blockieren. Neue Verpackungszellinien, die die Herstellung von rekombinanten Adenoviren der zweiten (und dritten) Generation, durch die Deletion der E1- und E4-Genregion replikationsdefekt gemacht, anpassen können, halten die größte Aussicht in Richtung zu der Entwicklung von sicheren und wirksamen Vektoren für humane Gentherapie. Die vorliegende Erfindung stellt derartige Verpackungszellinien und resultierende mutante Viren und rekombinante virale Vektoren (zum Beispiel adenovirale oder AAV-abgeleitete) bereit, die das interessierende Transgen tragen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Demgemäß hat die vorliegende Erfindung im allgemeinen zum Ziel, ein verbessertes adenovirales Vektorsystem bereitzustellen, um die Schwierigkeiten zu vermeiden, die beim Verwenden von gegenwärtig verfügbaren adenoviralen Vektoren der ersten Generation gefunden werden, indem adenovirale Vektoren der zweiten und dritten Generation bereitgestellt werden, die von mindestens zwei DNA-Sequenzen der frühen Region deletiert sind und die imstande sind, fremde, therapeutische oder Transgene in somatische Zellen zuzuführen.
  • Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung rekombinante adenovirale Vektoren der zweiten und dritten Generation (Adenoviren) bereit, die mindestens zwei letale Deletionen beherbergen, nämlich die Gene der frühen E1- und E4-Region. Gegebenenfalls kann dieser Vektor auch von der frühen E3-Genregion deletiert sein. Insbesondere trägt dieser rekombinante virale Vektor ein Transgen, zum Beispiel, das β-Galactosidase-Gen, eingeführt in entweder die E1- oder die E4-Region. In einer spezielleren Ausführungsform können die rekombinanten Adenoviren ein therapeutisches Gen enthalten, das die E1- oder E4-Region (oder gegebenenfalls die E3-Region) ersetzt, und das therapeutische Gen wird in einer als Ziel genommenen Wirtszelle exprimiert und/oder transkribiert.
  • Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine neue Verpackungszellinie bereitzustellen, welche Funktionen der E1-, E4- und gegebenenfalls der E3-Genregion eines defekten Adenovirus, deletiert von der E1-, E4- und gegebenenfalls E3-Region, komplementiert, wodurch die Herstellung der vorstehend beschriebenen rekombinanten adenoviralen Vektoren der zweiten Generation erlaubt wird, denen die E1-, E4- und gegebenenfalls die E3-DNA-Region fehlt. Die bevorzugte Verpackungszellinie, abgeleitet von humanen embryonalen Nierenzellen (293-Zellinie) enthält die E1- und E4-Genregion des Adenovirus, integriert in sein Genom. In einer speziellen Ausführungsform ist die Verpackungszellinie hier als 293-E4 identifiziert und am 30. August 1994 bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, nach dem Budapester Vertrag hinterlegt und dort als ATCC # CRL 11711 bezeichnet worden.
  • Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine neue Verpackungszellinie bereitzustellen, welche Funktionen der E1-, E4- und gegebenenfalls der E3-Genregion eines defekten Adenovirus, deletiert von der E1-, E4- und gegebenenfalls E3-Region, komplementiert, wodurch die Herstellung der vorstehend beschriebenen rekombinanten adenoviralen Vektoren der zweiten Generation erlaubt wird, denen die E1-, E4- und gegebenenfalls die E3-DNA-Region fehlt. Die bevorzugte Verpackungszellinie, abgeleitet von humanen embryonalen Nierenzellen (293-Zellinie), enthält die Adenovirus-E1- und die minimale wesentliche ORF6-Region des Ad5-E4-Gens, integriert in das 293-Zellgenom. In einer speziellen Ausführungsform ist die Verpackungszellinie hier als 293-ORF6 identifiziert und am 25. Oktober 1995 bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, nach dem Budapester Vertrag hinterlegt und dort als ATCC # CRL 11990 bezeichnet worden.
  • Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine neue Verpackungszellinie bereitzustellen, welche Funktionen der E1-, E2A- und gegebenenfalls der E3-Region eines defekten Adenovirus, deletiert von der E1-, E2A- und gegebenenfalls E3-Region, komplementiert, wodurch die Herstellung der vorstehend beschriebenen rekombinanten adenoviralen Vektoren der zweiten Generation erlaubt wird, denen die E1-, E2A- und gegebenenfalls die E3-DNA-Region fehlt. Die bevorzugte Verpackungszellinie, abgeleitet von humanen embryonalen Nierenzellen (293-Zellinie), enthält E1- und E2A-Genregion des Adenovirus, integriert in das 293-Zellgenom.
  • Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine neue Verpackungszellinie bereitzustellen, welche Funktionen der E1-, E2A-, E4- und gegebenenfalls der E3-Region eines defekten Adenovirus, deletiert von der E1-, E2A-, E4- und gegebenenfalls E3-Region, komplementiert, wodurch die Herstellung der vorstehend beschriebenen rekombinanten adenoviralen Vektoren der zweiten und dritten Generation erlaubt wird, denen die E1-, E2A-, E4- und gegebenenfalls die E3-DNA-Region fehlt. Die bevorzugte Verpackungszellinie, abgeleitet von humanen embryonalen Nierenzellen (293-Zellinie), enthält die E1-, E2A- und E4-Genregion des Adenovirus, integriert in das 293-Zellgenom.
  • Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Plasmid bereitzustellen, das verwendet wird, um die E4-Region in die 293-Zellen einzuführen. Das bakterielle Plasmid umfaßt die Adenovirus-E4-Region, die frei von dem E4-Promotor und mit einem zellulären induzierbaren Hormon-Gen-Promotor substituiert ist, der durch ein CRE bindendes Protein, wie beispielsweise α-Inhibin, β-Inhibin, α-Gonadotrophin, Cytochrom c, Cytochrom-c-Oxidase-Komplex (Untereinheit IV) und Glucagon, reguliert wird. Die E4-Genregion ist operabel mit dem CREB-Promotor in dem vorstehend bereitgestellten Plasmid verknüpft. In einer speziellen Ausführungsform umfaßt das Plasmid den vorstehend beschriebenen Adenovirus und einen Mäuse-alpha-(α)-Inhibin-Promotor, welcher als pIK6.1 MIP(α)-E4 identifiziert und am 30. August 1994 bei der ATCC nach dem Budapester Vertrag hinterlegt und dort als ATCC # 75879 bezeichnet worden ist.
  • Noch eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Plasmid bereitzustellen, das die minimale wesentliche E4-Genregion, die Region des offenen Leserahmen 6 (ORF6), in die 293-Zellen einführt. Das bakterielle Plasmid umfaßt das Adenovirus-ORF6-Fragment der E4-Genregion, das frei von dem E4-Promotor und mit einem zellulären induzierbaren Hormon-Gen-Promotor substituiert ist, der durch ein CRE bindendes Protein, wie beispielsweise α-Inhibin, β-Inhibin, α-Gonadotrophin, Cytochrom c, Cytochrom-c-Oxidase-Komplex (Untereinheit IV) oder Glucagon, reguliert wird. Das ORF6-Genfragment ist operabel mit dem CREB-Promotor in dem vorstehend bereitgestellten Plasmid verknüpft. In einer speziellen Ausführungsform umfaßt das Plasmid das Adenovirus-ORF6-Fragment und einen Mäuse-(α)-Inhibin-Promotor, welcher als pIK6.1 MIP(α)-E4-ORF6 identifiziert und am 25. Oktober 1995 bei der ATTC nach dem Budapester Vertrag hinterlegt und dort als ATCC # 97325 bezeichnet worden ist.
  • Noch eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Plasmid bereitzustellen, das das Adenovirus-5-E2A-Gen einführt, das das Adenovirus-DNA-Bindungsprotein (DBP) in die 293-Zellen codiert. Das bakterielle Plasmid umfaßt die Adenovirus-E2A-Genregion, die frei von dem E2A-Promotor und mit einem zellulären induzierbaren Hormon-Gen-Promotor substituiert ist, der durch ein CRE bindendes Protein, wie beispielsweise α-Inhibin, β-Inhibin, α-Gonadotrophin, Cytochrom c, Cytochrom-c-Oxidase-Komplex (Untereinheit IV) oder Glucagon, reguliert wird. Das E2A-Genfragment ist operabel mit dem CREB-Promotor in dem vorstehend bereitgestellten Plasmid verknüpft. In einer speziellen Ausführungsform umfaßt das Plasmid das Adenovirus-E2A-Gen und einen Mäuse-(α)-Inhibin-Promotor, welcher als pIK6.1 MIP(α)-E2A identifiziert und am 25. Oktober 1995 bei der ATTC nach dem Budapester Vertrag hinterlegt und dort als ATCC # 97325 bezeichnet worden ist.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 schildert die Konstruktion des pIK6.1-MIP(α)-E4-Plasmids, wie sie nachstehend in Beispiel 1 beschrieben ist.
  • 2 schildert die Konstruktion des ADV-β-gal-Plasmids, wie sie nachstehend in Beispiel 1 beschrieben ist.
  • 3(A)-3(E) sind Veranschaulichungen und die Southern-Analyse von 293-E4-Zellinien, wie sie nachstehend in Beispiel 3 beschrieben sind. (A) Die Restriktionsmuster der eingeführten MIP(α)-E4 und der Sonden, verwendet in Southern Blots, sind in dieser Veranschaulichung geschildert. Der ausgezogene Pfeil stellt die Mäuse-(α)-Inhibin-Promotorregion dar. Der offene Kasten stellt die volle Länge der E4- Region dar. Die Mäuse-Inhibin-Sonde ist das 283-bp-PCR-Produkt, beschrieben in Beispiel 1. Die E4-Sonde ist das Sma-I-H-Fragment (mu = 92 bis 98,4). Restriktionsenrymstellen sind wie folgt abgekürzt: H, Hind III; S, Sfi I; N, Neo I. (B) DNA wurde mit Hind III und Sfi I digeriert und mit der E4-Sonde hybridisiert. (C) DNA wurde mit Neo I digeriert und mit der E4-Sonde hybridisiert. (D) Die E4-Sonde wurde von dem Hind-III- und Sfi-I-Digestions-Blot gestrippt und die DNA wurde noch einmal mit der Inhibin-Promotorsonde sondiert. (E) Die Inhibinsonde wurde aus dem Hind-III- und Sfi-I-Digestions-Blot ausgewaschen und die DNA wurde noch einmal mit der E1-Sonde sondiert, welche ein Hind-III-E-Fragment von mu 7,7 bis mu 17,1 ist.
  • 4A-4J sind Photographien, die die cytopathische Wirkung von H5dl1014 auf W162-, 293- und 293-E4-Zellinien in Gegenwart oder Abwesenheit von cAMP zeigen, wie nachstehend in Beispiel 10 beschrieben ist. Parentale 293-Zellen sind in den Tafeln A-D dargestellt; 293-E4-Zellen sind in den Tafeln E-G dargestellt und W162-Zellen sind in den Tafeln H-J dargestellt. Die Zellen ohne Infektion sind in den Tafeln A, E und H gezeigt. Die Zellen, infiziert mit H5dl1014 ohne eine Zugabe von cAMP, sind in den Tafeln C, F und I gezeigt und die Zellen, infiziert mit H5dl1014 mit einer Zugabe von 1 mM cAMP, sind in den Tafeln D, G und J gezeigt. Tafel B stellt 293-Zellen mit einer Scheininfektion und einer Zugabe von 1 mM cAMP dar.
  • 5 schildert die Konstruktion und die Struktur der rekombinanten Viren Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE4 und Ad5/ΔEa(β-gal)ΔE3, wie sie nachstehend in Beispiel 5 beschrieben sind.
  • 6 veranschaulicht die Restriktionsenzymanalyse von rekombinanten Viren, wie sie nachstehend in Beispiel 5 beschrieben ist.
  • 7 stellt die Northern-Analyse von Transkripten in Hela-Zellen, infiziert mit rekombinanten Adenovirus-Vektoren, dar. Die gesamte RNA wurde 4, 24 und 48 h nach der Infektion isoliert. Tafel A sind die Transkripte, identifiziert durch Hybridisieren mit einer 32P-markierten β-gal-DNA-Sonde. Tafel B sind die Transkripte, hybridisiert mit der Ad5-E4-Sonde. Tafel C sind die Transkripte, nachgewiesen durch Hybridisieren mit der DNA-Sonde mit der Ad5-L3-Region. Tafel D sind die Transkripte, sondiert mit dem PCR-Produkt mit der radioaktiv markierten L5-Region.
  • 8 stellt das Ethidiumbromid-gefärbte Agarosegel der RT-PCR-Produkte dar, wie nachstehend in Beispiel 15 beschrieben ist.
  • 9 stellt eine Southern-Blot-Analyse der Produkte der L3-reverse-Transkription-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) dar. Die RT-Produkte aus den +RT-Reaktionsgemischen wurden auf dem Agarosegel laufen gelassen, auf Nylonmembran überführt und dann mit dem endmarkierten Oligomer sondiert, wobei mit der inneren Sequenz der L3-RT-PCR-Produkte hybridisiert wurde.
  • 10 veranschaulicht die Konstruktion des ORF-6-E4-Plasmids, wie sie nachstehend in Beispiel 18 beschrieben ist.
  • 11(A) ist ein schematisches Restriktionsmuster des pIK6.1MIP(α)-ORF6-Plasmids. Das Plasmid pIK6.1MIP(α)-ORF6 enthält das 910-bp-PCR-Produkt der Adenovirus-5-E4-ORF6-Codierungssequenz von der Nucleotidsequenz 1876 bis 2756 von dem rechten Ende des viralen Genoms, welches unter der Kontrolle des Mäuse-α-Inhibin-Promotors ist. Der offene Pfeil stellt die Mäuse-α-Inhibin-Promotorregion dar. Der kreuzschraffierte Kasten stellt die ORF6-Codierungsregion dar. Die ORF6-Sonde ist das PCR-Produkt. Restriktionsenzym-Stellen sind wie folgt abgekürzt: H, Hind III; X, XmnI. 11(B) stellt einen Southern Blot von 293-ORF6-Zellinien, sondiert mit der ORF6-Sonde (untere Photographie) dar. Der gleiche Blot wurde mit der E1-Sonde (obere Photographie), welche ein Hind-III-E-Fragmant von mu 7,7 bis mu 17,1 ist, rehybridisiert.
  • 12 veranschaulicht die Konstruktion des pIK6.1MIP(α)-E2A-Plasmids.
  • 13 schildert die Konstruktion des Plasmids, umfassend DNA-Sequenzen, die die Virusassoziierte RNA-Genregion transkribieren.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Eine Strategie, entworfen, um die Probleme, verbunden mit gegenwärtigen, in der frühen Region deletierten adenoviralen Vektoren, zu umgehen, ist, eine zweite wesentliche Deletion einer Genregion in den adenoviralen Vektor einzuführen. Mehrere transformierte Zellinien einer frühen Genregion des Adenovirus, welche das Wachstum von E1-, E2A- bzw. das Wachstum von E4-mutantem Virus unterstützen, sind etabliert worden [Grahan et al., J. Gen Virol. 36: 59-72 (1977), Weinberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 5383-5386 (1983) und Brough et al. Virology 190: 62434 (1992)]. Jedoch bietet keine Zellinie die Funktionen von zwei Genregionen gleichzeitig und bei permissiven Temperaturen. Die Etablierung einer derartigen Zellinie, welche die Fähigkeit, die Funktion von E1 und einer zweiten wesentlichen Genregion in trans (z.B. E4) zu komplementieren, und die Fähigkeit, als Verpackungszellinie für die Propagation von rekombinanten viralen Vektoren, enthaltend derartige doppelte (oder möglicherweise dreifache oder vierfache) Deletionen, zu funktionieren, besitzt, kann die Nachteile der gegenwärtig verfügbar adenoviralen Vektoren der ersten Generation beseitigen.
  • Untersuchungen der Genfunktionen der frühen Region (ER) des Adenovirus haben gezeigt, daß die Deletion der E4-Region zu einem Versagen bei der Akkumulation von viralen späten Transkripten; einer Verringerung der Synthese von viralem späten Protein; einem Aufbau eines defekten viralen Partikels und einem Versagen der Hemmung der Wirtsproteinsynthese im Stadium später Infektion führt [Sandler et al., J. Virol. 63: 624-630 (1989), Bridge & Ketner, Virology 174: 345-353 (1990), Ross & Ziff, J. Virol. 66: 3110-3117 (1992), Bridge et al., Virology 193: 794-801 (1993), und Bett et al., J. Virol. 67: 5911-5921 (1993)]. Duale Entfernung der E1- und E4-Genregionen aus den rekombinanten Adenovirus-Vektoren kann daher die pathogenen Wirkungen direkter Cytotoxizität auf die als Ziel genommenen Zellen und entzündliche Reaktionen in dem menschlichen Körper dramatisch minimieren oder beseitigen. Die E4-Deletion in einem rekombinanten adenoviralen Vektor der zweiten Generation würde den zusätzlichen Vorteil bereitstellen, die Fähigkeit dieses Vektorsystems zu vergrößern, humane Gen-Inserts, so groß wie 10 kb, aufzunehmen.
  • In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wurde die erfolgreiche Etablierung einer neuen Verpackungszellinie demonstriert, welche das Wachstum von sowohl der E1- als auch der E4-Deletion in E1- und E4-defizienten Adenoviren unterstützt. Da eines von den E4-Genprodukten [294R-Protein des offenen Leserahmens (ORF) 6] in Verbindung mit dem E1b-Genprodukt (496R-Protein) eine Funktion hat, zellulären mRNA-Transport zu hemmen, was zu dem Aufhören der Synthese von zellulärem Protein führt (Bridge & Ketner, 1990), würde von der Überexpression der E4-Genregion erwartet werden, letztlich zum Zelltod zu führen. Ein Haupthindernis für die Einführung der E4-Genregion in 293-Zellen wurde überwunden, d.h. die trans-Aktivierung des E1a-Genprodukts in den parentalen 293-Zellen, welche die Überexpression der E4-Gene bewirkt, welche ansonsten zum Zelltod führen würde. In der vorliegenden Erfindung wird der E4-Promotor mit einem zellulären induzierbaren Hormon-Gen-Promotor ersetzt, nämlich einem Gen, das durch einen nuklearen Faktor, genannt CRE bindendes Protein (CREB), reguliert wird. Insbesondere wird der Promotor, der den E4-Promotor ersetzt, aus der CREB-regulierten Genfamilie, wie beispielsweise α-Inhibin, beta-(β)-Inhibin, α-Gonadotropin, Cytochrom c, Cytochrom-c-Oxidase-Komplex (Untereinheit IV), Glucagon usw., gewählt, die in Tabelle I auf Seite 15695 bei Kim et al., J. Biol. Chem., 268: 15689-15695 (1993) aufgeführt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der CREB-regulierte Genpromotor ein Säuger-α-Inhibin, am meisten bevorzugt Mäuse-α-Inhibin. In diesem Fall wurde gezeigt, daß eine 165-Basenpaar-Sequenz der Mäuse-Inhibin-Promotorregion die Expression des heterologen Gens mit einem niedrigen Grundniveau steuert und die Niveaus der Expression des heterologen Gens in Reaktion auf die Induktion von cAMP oder Adenylcyclase-Aktivatoren vergrößert [Su & Hsueg, Biochem. and Biophys. Res. Common. 186, 293-300 (1992)]. Eine 8-bp-Palindrom-Sequenz, genannt cCAMP-Response-Element (CRE), ist für diesen induktorischen Effekt verantwortlich und wurde innerhalb der Inhibin-Promotorregion identifiziert. Tatsächlich enthalten alle frühen Adenovirus-Gen-Promotoren das CRE-ähnliche Element, welches diese frühen Gene ansprechend auf die Induktion von cAMP macht [Jones et al., Genes Dev. 2: 267-281 (1988)]. Es ist klar, daß E1a-trans-Aktivierung und die cAMP-Verstärkung auf frühe Adenovirus-Gene über unabhängige Mechanismen wirken [Leza & Hearing, J. Virol. 63: 3057-3064 (1989) und Lee et al., Mol. Cell. Biol. 9: 4390397 (1989)]. Der Ersetzung des E4-Promotors mit dem Mäuse-α-Inhibin-Promotor entkoppelt die E1a-Transaktivierung von der cAMP-Induktion an dem E4-Gen. In der vorliegenden Erfindung wird eine Sequenz voller Länge der E4-Region in die 293-Zellen eingeführt, wodurch die cAMP-Induktion noch in einer kontrollierten Weise wirksam beim Induzieren von E4-Genexpression in den transformierten Zellen ist. Es sollte auch vermerkt werden, daß diese neue 293-E4-Verpackungszellinie auch Adenoviren, enthaltend die E3-Deletion zusätzlich zu der E1- und E4-Deletion, gewinnen kann (unterstützt ihr Wachstum), weil die Deletion der E3-Region nicht die Lebensfähigkeit des Virus beeinflußt.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden bakterielle Plasmide unter Verwendung von standardmäßigen Klonierungsverfahren und Ausgangsmaterialien, beschrieben bei Finer et al. 1994 und Finer et al. WO 94/29438, hergestellt. Das parentale Plasmid pIK6.1MMSV-E4 (ΔE4pro) ist von pIK6.1.MMSVNhe (Finer et al. WO 94/29438) abgeleitet und enthält die Sequenz voller Länge der adenoviralen E4-Region, ausgenommen die Abwesenheit des E4-Promotors, der mit dem MMSV-Promotor substituiert ist. Unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Klonierungstechniken wird der MMSV-Promotor mit einem von den vorstehend beschriebenen CREB-regulierten Promotoren ersetzt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Promotor, der operabel mit der adenoviralen promotorlosen E4-Genregion verknüpft ist, Säuger-alpha-Inhibin, am meisten bevorzugt abgeleitet von der Maus. Das resultierende bevorzugte Plasmid wird als pIK6.1 MIP(α)-E4 bezeichnet und ist bei der ATCC, Rockville, MD unter den Bedingungen des Budapester Vertrages als ATCC #75879 hinterlegt. Die Plasmide, enthaltend die CREB-regulierten Promotoren, operabel mit dem adenoviralen E4-Genfragment, ORF6 oder adenoviralem E2A-Gen verknüpft, wurden unter Verwendung des vorstehenden pIK6.1 MIP(α)-E4-Plasmids als Ausgangsmaterial konstruiert. Die promotorlose E4-Region wurde mit einem PCR-Produkt des ORF6-Fragments der E4-Gen- oder E2A-Genregion ersetzt, um das pIK6.1-MIP(α)-ORF6- und pIK6.1-MIP(α)-E2A-Plasmid zu konstruieren, die operabel mit dem α-Inhibin-Promotor verknüpft sind. Plasmide wurden bei der ATCC, Rockville, MD, mit den charakteristischen Merkmalen der vorstehend beschriebenen ORF6- und E2A-Plasmide, operabel verknüpft mit Mäuse-α-Inhibin, mit ATCC #97325 bzw. ATCC # hinterlegt. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann man einen beliebigen von den CREB-regulierten Promotoren in Substitution des Inhibin-Promotors verwenden und ähnliche Ergebnisse erreichen, wenn das Plasmid in die nachstehend beschriebenen Verpackungszellinien transfiziert wird.
  • Die neuen 293-E4-Verpackungszellinien waren durch die E4-Region stabil transformiert und zeigten die gleiche Morphologie und die Wachstumsrate wie parentale 293-Zellen. Dies zeigt an, daß das niedrige Niveau der E4-Genexpression unter der Kontrolle des Mäuse-α-Inhibin-Promotors keine extensive Hemmung der Wirtszell-Proteinsynthese bewirkt. Der mutante Adenovirus, H5dl1014 [Bridge et al., Virology 193: 794-801 (1993)], wurde verwendet, um die Komplementierungsaktivität der vorstehend beschriebenen 293-E4-Verpackungszellinie zu untersuchen, weil er letale Deletionen in der E4-Region trägt und nur in W162-Zellen (Bridge & Ketner, 1989) wachsen kann. Die W162-Zellinie ist eine Vero-(Affennieren)-Zellinie, transformiert durch Adenovirus-E4-DNA, und komplementiert das Wachstum von Adenoviren mit E4-Deletion. Es wurde gezeigt, daß der H5dl1014-Virus merklich verringerte Niveaus von DNA erzeugte und dabei versagte, spätes Protein zu synthetisieren, zurückzuführen auf ein intaktes ORF4 [Bridge et al. (1993)] in seiner meistenteils deletierten E4-Region. Zellinien wurden gefunden, die den H5dl1014-Virus mit Titern erzeugten, die mit den in W162-Zellen erzeugten vergleichbar waren (siehe Tabelle IV, Gruppen 1 und 2 in Beispiel 11, nachstehend).
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen von Replikations-defekten Adenoviren, wobei das Verfahren (a) Transfizieren von Verpackungszellinien der vorliegenden Erfindung mit einem rekombinanten adenoviralen Vektor, wobei der adenovirale Vektor entweder (i) ein Transgen und eine letale Deletion oder Mutation in der frühen E4-Genregion und eine letale Deletion oder Mutation in der frühen E1-Genregion; oder (ii) ein Transgen, eine letale Deletion oder Mutation in der frühen E2A-Genregion und eine letale Deletion oder Mutation in der frühen E4-Genregion und der frühen E1-Genregion umfaßt; und (b) Gewinnen des hergestellten Replikations-defekten Adenovirus umfaßt. Wie hier beschrieben bezeichnet der Begriff „rekombinanter Adenovirus" oder „rekombinanter adenoassoziierter Virus" (auf dem Fachgebiet auch als rekombinante virale Vektoren bekannt) einen Virus, wobei das Genom Deletionen, Insertionen und/oder Substitutionen von einem oder mehreren Nucleotiden enthält und der Virus weiterhin ein Transgen trägt.
  • In einem speziellen Aspekt dieser Ausführungsform werden die vorstehend beschriebenen neuen 293-E4-Verpackungszellinien verwendet, um eine zweite Generation von rekombinantem Virus, genannt Ad5/ΔE1(β-gal)E4, zu erzeugen. Obwohl die 293-E4-Verpackungszellinie die E1- und E4-Genregion des adenoviralen Serotyps-5 enthält, können andere Serotypen von mutanten und rekombinanten Adenoviren, zum Beispiel Serotyp 2, 7 und 12, gewonnen werden, zurückzuführen auf den hohen Grad von struktureller und funktioneller Homologie unter den adenoviralen Serotypen. Darüber hinaus können mutante und rekombinante Adenoviren von Serotypen anders als Serotyp 5 von den nachstehend beschriebenen anderen neuen adenoviralen Verpackungszellinien der vorliegenden Erfindung gewonnen werden.
  • In-vitro-Untersuchungen demonstrieren, daß die Infektion der neuen rekombinanten Adenovirusvektoren der vorliegenden Erfindung in nicht permissiven humanen Zellen keine cytopathischen Wirkungen zeigt und die Wirksamkeit der Transgenexpression bei Niveaus ist, die mit denen von herkömmlichen E1-deletierten Viren vergleichbar ist. Es wird erwartet, daß die Immunantworten und die Entzündungsreaktionen des Wirts an den Stellen, infiziert mit neuen rekombinanten Adenoviren der zweiten Generation der vorliegenden Erfindung im Vergleich zu gegenwärtig verfügbaren rekombinanten Adenoviren der ersten Generation, verringert sind. Die Etablierung der dualen komplementierenden Verpackungszellinie der vorliegenden Erfindung markiert ein signifikantes Ereignis in der Evolution von sichereren und wirksameren adenoviralen Gentransfervektoren. Das Verfahren, verwendet bei der Konstruktion der 293-E4-Zellinien der vorliegenden Erfindung, ist von allgemeiner Verwendbarkeit bei der Herstellung anderer Verpackungszellinien, welche zusätzliche adenovirale Regionen enthalten, welche weitere Deletionen der adenoviralen Vektoren der vorliegenden Erfindung komplementieren, oder bei der Konstruktion anderer viraler Vektoren.
  • So betrifft in einer anderen Ausführungsform die vorliegende Erfindung neue adenovirale Verpackungszellinien, die durch die vorstehend beschriebenen Verfahren Deletionen zusätzlich zu E1, E4 und gegebenenfalls E3 gewinnen können. In diesem Beispiel wurde eine Verpackungszellinie eines adenoviralen Vektors, welche die E2A-Mutation oder Deletion, zusätzlich zu der E1-, E3- und E4-Deletion, gewinnen kann, konstruiert, indem von der vorstehend beschriebenen neuen Verpackungszellinie, nämlich der 293-E4-Verpackungszellinie, ausgegangen wird. Das E2A-Genprodukt ist ein regulatorisches Protein, speziell ein DNA-Bindungsprotein. Dieses Gen kann in die 293-E4-Verpackungszellinie eingeführt werden, indem das E2A-Gen unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors, operabel verknüpft mit dem E2A-Gen in einer ähnlichen Weise wie vorstehend beschrieben, plaziert wird. Der induzierbare Promotor kann aus der vorstehend beschriebenen gleichen Familie von CREB-regulierten Genen ausgewählt werden, die verwendet werden, um den E2-Genpromotor zu ersetzen.
  • In noch einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Verpackungszellinie eines adenoviralen Vektors, die den rekombinanten Virus des Adenovirus gewinnen kann, enthaltend nur die minimalen wesentlichen cis-Elemente (invertierte terminale Wiederholungen (ITRs) und Verpackungssignalsequenz) [Hering et al., Virol. 61: 2555-2558 (1987)] und die Protein-IX-Sequenz [Ghosh-Choudury et al., EMBO J. 6: 1733-1739 (1987)]. Diese Zellinie kann durch Einführen der Adenovirus-DNA-Sequenz von etwa mu 11,2 bis ungefähr 99 in die vorstehend beschriebene neue 293-E4-Zellinie etabliert werden. Ein Plasmid, tragend die vorstehende Adenovirus-DNA-Sequenz, kann konstruiert und in die 293-Zellen transfiziert werden. Diese DNA-Sequenz stellt die Sequenz von dem Gen nach E1b bis zu dem 3'-Ende des viralen Strukturgens dar (Sanbrook et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 39: 61532 (1974); Ziff & Evans, Cell 15: 1463-1476 (1978)]. Die eingeführte Adenovirussequenz enthält virale Strukturgene und fast die gesamten funktionellen Genregionen außer E1a und E1b. Weil die konstitutive Expression oder Überexpression von viralen Genprodukten sehr toxisch für die Zellen ist, kann die eingeführte adenovirale DNA manipuliert werden, um adenovirale native Promotoren mit heterologen Promotoren zu ersetzen. Zum Beispiel können die frühen Genregionen, welche virale regulatorische Proteine codieren, unter die Kontrolle der CREB-regulierten Promotoren, welche etwa 2 bis 10-fache Induktionswirksamkeit haben, plaziert werden. In dem Fall der Genregion, die virale Strukturproteine codiert, kann der native hauptsächliche späte Promotor durch einen straff kontrollierten exogenen Promotor ersetzt werden, wie beispielsweise den auf Tetracyclin ansprechenden Promotor, welcher in Anwesenheit von Tetracyclin ein Induktionsniveau von bis zu etwa dem 105-fachen hat [Manfred & Hermann, PNAS 89: 5547-5551 (1992)].
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung neue adenoviral-assoziierte (AAV) Verpackungszellinien, die in der folgenden Weise hergestellt werden. Die neue komplementierende Zellinie enthält die E1a-, E1b-, E2A- und E4-Genregion und die DNA-Sequenz, die Virus-assoziierte RNA codiert. Diese Zellinie kann durch Einführen der Adenovirus-DNA-Sequenz, codierend die Virusassoziierte RNA (etwa 600 NTs von mu 28-30) [Mathews, Cell 6: 223-229 (1975) und Petterson & Philipson, Cell 6: 1-4 (1975)], in die vorstehend konstruierte neue 293-E4-Verpackungszellinie, die die E1 und E4-Deletion, die E2A-Mutation von Adenovirus und gegebenenfalls E3 gewinnt, konstruiert werden. Der Wildtyp-AAV, hergestellt von dieser Verpackungszellinie, wird frei von Helfer-Adenovirus sein. Der rekombinante adeno-assoziierte Virus oder mutante AAV wird nur die minimalen wesentlichen cis-Elemente enthalten und wird durch Cotransfizieren eines nicht verpackenden komplementierenden AAV-Plasmids erzeugt, welches zum Verpacken defekt ist, aber die Wildtyp-AAV-Genprodukte liefert [Samulski et al., J. Virol. 61: 3096-3101 (1987)]. Darüber hinaus werden die rekombinanten adenoassoziierten viralen Vektoren oder der mutante AAV, gewonnen aus dieser Zellinie, frei von Helferviren, d.h. Adenoviren, sein.
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung noch eine andere neue AAV-Verpackungszellinie, konstruiert durch Ausgehen von der vorstehend beschriebenen AAV-Verpackungszellinie. Diese Verpackungszellinie enthält die E1a-, E1b-, E2A- und E4-Genregion, die DNA codierend Virus-assoziierte RNA, und zusätzlich die AAV-Virus-Replikation-(rep)-Genregionen. Die rep-Genregion codiert mindestens vier Replikations-(Rep)-Proteine, die wesentlich für AAV-DNA-Replikation und Transregulation von AAV-Genexpression sind [(zur Übersicht siehe Bervis & Bolienzsky, Adv. Virus Res. 32: 243-306 (1987)]. Sie wird konstruiert, indem die AAV-rep-Genregion in die vorstehend beschriebene AAV-Verpackungslinie, die schon die E1-, E2A- und E4-Genregion und DNA-Sequenzen, codierend die Virus-assoziierte RNA, enthält, in der Weise eingeführt wird, die den P5-Promotor [(Yang et al., J. Virol. 68: 4847856 (1994)] mit einem induzierbaren Promotor, ausgewählt aus der früher beschriebenen CREB-regulierten Genfamilie, ersetzt. Der neue AAV-Virus und sein rekombinanter Virus, gewonnen aus der Zellinie, wird frei von Helferviren (Adenoviren) sein und ist Rep- [Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 97-129 (1992)].
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine andere neue AAV-Verpackungszellinie, die konstruiert wird, indem von der in dem vorangehenden Abschnitt beschriebenen AAV-Verpackungszellinie ausgegangen wird. Diese Verpackungszellinie enthält die E1a-, E1b-, E2A-, E4-Genregion, die DNA, codierend die Virus-assoziierte RNA, die AAV-Virus-Replikation-(rep)-Genregion und zusätzlich die AAV-cap-Genregion. Die cap-Genregion codiert eine Familie von Capsid-Proteinen, d.h. VP1, VP2 und VP3 [Janik et al., J. Virol. 52: 591-597 (1984)]. Die Synthese von allen drei mRNAs wird von einem einzigen Promotor, genannt P40, gestartet [Janik et al., (1984)]. Diese Genregion wird in die vorstehend beschriebene AAV-Verpackungszellinie eingeführt, indem der P40-Promotor mit einem induzierbaren Promotor, ausgewählt aus entweder den CREB-regulierten Promotoren oder dem auf Tetracyclin ansprechenden Promotor, ersetzt wird. Der neue AAV-Virus und sein aus der Zellinie gewonnener rekombinanter Virus werden frei von Helferviren (Adenoviren) sein und nur die minimalen wesentlichen cis-Elemente enthalten (Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 97-129 (1992)].
  • In noch einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine spezielle Verpackungszellinie der zweiten Generation für die Propagation von sowohl E1- als auch E4-deletierten Vektoren und Viren bereit. Diese Linie wurde durch die Einführung der minimalen wesentlichen E4-Genregion, der Region des offenen Leserahmens 6 (ORF6), gesteuert durch den Mäuse-α-Inhibin-Promotor, etabliert und stellt die gleiche Funktion wie die als 293-E4 bezeichnete vorstehend beschriebene Zellinie bereit. Es wird erwartet, daß die Verwendung dieser Verpackungszellinie für die Herstellung von E1-, E4- und doppelt deletierten rekombinanten adenoviralen Vektoren das Problem eines möglichen homologen Rekombinationsereignisses in der E4-Region beseitigt. So sollte die Expansion und Passage von gereinigten Ausgangsmaterialien von E1/E4-deletiertem rekombinanten Adenovirus, zum Beispiel, absolut frei von irgendeiner Kontamination durch Replikations-kompetente Adenovirus-(RCA)-Partikel sein. Die Strategie der Erzeugung dieser sichereren dualen Verpackungszellinie bestand darin, ein 910-bp-DNA-Fragment einzuführen, welches nur die ORF6-Codierungsregion (Ad5-Nucleotide 1876-2756 vom rechten Ende des Genoms) in 293-Zellen anstatt einer vollen Länge der E4-Genregion umfaßt. Es gibt viele existierende E4-Deletions-mutante Viren. Diejenigen, die einen ernsthaft defekten Phänotyp zeigen, haben alle E4-Deletionen, die sich wesentlich über die Region des ORF6 hinaus erstrecken. Zum Beispiel sind einige von diesen Deletionen wie folgt: NTs 575 bis 2845 als der Grenze der zwei Deletionen innerhalb der E4-Region des H5dl1014; gleiche Endpunkte der Deletion in dem H5dl366; von 932/937 bis 2942/2946 innerhalb von Tandem-Repetitionssequenzen des H2dl808; und von 981 bis 2845 in dem H5dl1004. Zurückzuführen auf das Fehlen von überlappenden Sequenzen zwischen dem integrierten ORF6-DNA-Fragment und einem rekombinanten Adenovirus-Vektor, welcher eine große Deletion der E4-Region trägt, wird das Repairment der E4-Deletion durch homologe Rekombination im wesentlichen null.
  • Frühere Berichte haben gezeigt, daß entweder das ORF3- oder das ORF6-Genfragment allein ausreichend ist, um die E4-Funktion, notwendig für den normalen Adenovirus-Lebenszyklus, bereitzustellen. Es wird angenommen, daß das ORF3- und ORF6-Gensegment redundante Funktionen, beteiligt an viraler DNA-Replikation, Transport und Akkumulation und Wirtszell-Absperren von späten viralen mRNAs haben. Obwohl andere ORFs der E4-Region wichtige regulatorische Rollen in der Multiplikation des Virus haben, sind sie dispensibel. Um zu bestätigen, daß die bereitgestellten 293-ORF6-Zellinien der vorliegenden Erfindung nicht nur intakte E1- und ORF6-DNA-Sequenzen enthalten, sondern auch die komplementierenden Aktivitäten von E1- und E4-Funktionen besitzen, wurden ein E1-deletierter mutanter Virus, ein E4-deletierter mutanter Virus ebenso wie der E1/E4-deletierte rekombinante Virus verwendet, um die 293-ORF6-Zellinien zu infizieren. Es wurde gezeigt, daß die Titer dieser Viren, gemessen auf individuellen 293-ORF6-Monoschichten, mit den Titern kompatibel waren, die auf jeder permissiven Zellinie des Virus gemessen wurden. Daher erfüllt die 293-E1/ORF6-Verpackungszellinie der vorliegenden Erfindung nicht nur die Sicherheitsanforderung zur Verwendung bei menschlichen Patienten, sondern stellt auch wirksam E1- oder E4-Deletions-mutante Viren und doppelt deletierte E1/E4-Viren und Vektoren her. Diese Zellinie wurde bei der ATTC in Rockville, MD, am 25. Oktober 1995 hinterlegt und als ATCC # 11990 bezeichnet.
  • In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine 293-E2A-Verpackungszellinie bereit, die sowohl die E1- als auch die E2A-Genfunktion in trans gleichzeitig komplementiert. Das 72-Kd-DNA-Bindungsprotein des humanen Adenovirus (DBP) ist in dem Infektionskreislauf des Virus wichtig. Bei nicht permissiver Temperatur hemmen die ts-Mutationen innerhalb der DBP-Codierungsregion (E2A-Region) vitale DNA-Replikation [Friefeld et al., Virology 124: 380-389 (1983)] und versagen dabei, frühe Genexpression im späten Zustand des viralen Lebenszyklus zu regulieren [Carter et al., J. Virol. 25: 664-674 (1978)]. Obwohl die Herstellung von E1-deletiertem, E2A-mutiertem (ts-Mutation) Adenovirus-Vektor keine spezielle Verpackungszellinie erfordert, kann die ts-DBP-Mutation kein volles inaktives Genprodukt in dem Temperatur-permissiven in-vivo-Zustand hervorrufen [Engelhardt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 6196-200 (1994)]. Eine Deletion innerhalb der indispensiblen Region des E2A-Gens (die Genregion, codierend den Carboxyl-terminalen Anteil des DBP) ist letal für den Adenovirus [Vos et al., Virology 172: 634-642 (1989)] sowohl in vitro als auch in vivo. Um einen rekombinanten Vektor, enthaltend sowohl E1- als auch E2A-Genregion-Deletion, zu erzeugen, wird die Etablierung einer Komplementationszellinie absolut notwendig. Die vorliegende Erfindung stellt ein adenovirales Verpackungssystem bereit, wo rekombinante adenovirale Vektoren und mutante Adenoviren erzeugt werden. Es wird erwartet, daß die Kombination der E1-Deletion und E2A-Deletion eines rekombinanten Adenovirus-Vektors zu vollständiger Replikationsinkompetenz führt und bei Menschen sicherer zu verwenden ist.
  • In noch einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung weiterhin eine dreifache Verpackungszellinie bereit, die imstande ist, die Funktionen der adenoviralen E1-, E2A- und E4-Genregion in trans gleichzeitig zu komplementieren. Der rekombinante Adenovirus-Vektor, erzeugt aus dieser Verpackungszellinie, beherbergt drei frühe Genregion-Deletionen, was den verpackten adenoviralen Vektor, mit dem zusätzlichen Vorteil extensiver Kapazität für Insertionen von Transgen größerer Größe, absolut sicher für alle humanen Anwendungen macht.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin die Herstellung von Replikations-defekten Adenoviren bereit, die ein Transgen enthalten, welches in den Zielzellen exprimiert wird. Die Replikations-defekten Adenoviren werden unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Verpackungszellinien hergestellt, welche ein oder mehrere unterschiedliche Nucleotidsequenzen umfassen, die imstande sind, den Teil des Adenovirus oder AAV-Genoms zu komplementieren, der wesentlich für die Replikation des Virus ist und welcher nicht in dem Replikations-defekten Adenovirus vorhanden ist. Replikations-defekter Adenovirus enthält nicht länger Gene, die für die Virus-Replikation in infizierten Zielzellen erforderlich sind. Genauer gesagt enthält der Replikations-defekte Adenovirus nur die minimalen wesentlichen cis-Elemente (d.h. ITRs und Verpackungssignalsequenz) und Protein-IX-Sequenz und ist frei von der E1- (speziell E1a- und E1b-) und E4-Region und kann zusätzlich frei von E3- und E2A-Region und den viralen Strukturgenen sein.
  • Der Replikations-defekte Adenovirus wird ebenfalls dadurch gekennzeichnet, daß er imstande ist, die Expression und die Produktion des (der) ausgewählten Transgenprodukts(e) in den als Ziel genommenen Zellen zu lenken. So umfaßt der Replikations-defekte Adenovirus zumindest alle Sequenzen der adenoviralen DNA-Sequenz, die wesentlich für Encapsidierung und die physikalischen Strukturen zur Infektion der als Ziel genommenen Zellen sind, und ein ausgewähltes Transgen, welches in den als Ziel genommenen Zellen exprimiert wird.
  • Das Transgen kann ein Cytokin-Gen, Suizid-Gen, Tumorsuppressor-Gen, Schutz-Gen, virales Protein oder eine Kombination davon, ausgewählt aus der Liste, bereitgestellt in Tabelle II, codieren. Wenn ein Cytokin-Gen gewählt wird, kann die Expression des Gens in einer als Ziel genommenen Zelle eine Behandlung für Malignitäten durch Stimulieren zellulärer Immunantworten bereitstellen, welche zu Unterdrückung von Tumorwachstum und/oder Töten von Tumorzellen führen. Wenn ein Suizid-Gen ausgewählt wird, wird das Gen, wenn exprimiert in der Tumorzelle, die Tumorzelle befähigen, in Anwesenheit spezieller Arzneimittel zerstört zu werden. Zum Beispiel wird das Thymidin-Kinase-Gen, wenn exprimiert in Tumorzellen, den Tumor befähigen, in Anwesenheit von Gancyclovir zerstört zu werden.
  • Die folgenden Beispiele werden angeboten, um die vorliegende Erfindung zu veranschaulichen und sollen nicht in irgendeiner Weise anderweitig den Umfang dieser Erfindung begrenzen.
  • BEISPIELE
  • BEISPIEL 1
  • Konstruktion von Plasmiden
  • Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion der Plasmide, die verwendet werden, um die E4-Genregion in die 293-Zellen einzuführen. Die konstruierten Plasmide sind schematisch in 1 dargestellt. Das parentale Plasmid pIK6.1 MMSV-E4 (ΔE4 pro.), abgeleitet von dem pIK6.1 MMSV enpoNhe (Hpa) [Finer et al., Blood 83: 43-50 (1994)] enthält die promotorlose E4-Region von 15 bp stromaufwärts der Transkriptionsstartstelle bis 810 bp stromabwärts der E4-Polyadenylierungsstelle. Das E4-Gen ist mit dem Moloney-Ratten-Sarkom-Virus-U3-Fragment verknüpft. Das pIK6.1.MIP(α)-E4 wurde durch Ligation eines 238-bp-Fragments des HindIII-XbaI-PCR-Produkts von Mäuse-alpha-Inhibin-Promotor [MIP(α)] (Su & Hsueh, Biochem. and Biophys. Res. Common. 186: 293-300, 1992) mit dem 2,9-kb-XbaI-StuI-Fragment und dem 3,9-kb-StuI-HindIII-Fragment des pIK6.1 MMSV-E4 (E4 pro.) konstruiert. Die Primer, die für PCR des MIP (α) verwendet wurden, waren 5'-gcgcaagcttcGGGAGTGGGAGATAAGGCTC-3' (SEQ ID NO:1) und 5'-ggcctctagaAGTTCACTTGCCCTGATGACA-3' (SEQ ID NO:2). Die Sequenzen, enthaltend entweder die Hind-III-Stelle oder die Xba-I-Stelle, in Kleinbuchstaben sind vorhanden, um das Klonieren zu erleichtern. Der klonierte α-Inhibin-Promotor wurde sequenziert, um die Genauigkeit der Sequenz zu verifizieren.
  • Das Plasmid ADV-β-gal, verwendet, um rekombinante Adenoviren zu erzeugen, wurde konstruiert, wie in 2 gezeigt ist. Das Ausgangsplasmid ADV-1 enthält das linke Ende des Adenovirus-5-Xho-I-C-Fragments (mu 0-15,8) mit einer Deletion von den Nucleotiden 469-3326 (mu 1,3-9,24) auf dem Grundgerüst von PCR II (In Vitrogen, San Diego, CA). Eine Polylinker-Kassette wurde in die Deletionsstelle insertiert. Verschiedene Restriktionsstellen am linken Ende der Adenovirussequenz können bequem verwendet werden, um das Plasmid zu linearisieren. Das resultierende ADV-β-gal-Plasmid wurde durch Insertion eines Bst BI-BI-Xba-I-Fragments des E.-coli-β-Galactosidase-Gens, vorangetrieben durch den Mäuse-pgk-Promotor, in die ADV-1-kompatiblen Stellen Spe I und Cla I in der E1-Region konstruiert und wurde später verwendet, um den rekombinanten Virus zu erzeugen.
  • BEISPIEL 2
  • Transfektion und Auswahl von 293-E4-Zellinien Dieses Beispiel beschreibt den Prozeß der Transfektion und Selektion, angewendet, um 293-E4-Zellinien zu etablieren. Die 293-Zellen, erhalten von der American Type Culture Collection, ATCC #CRL 1573, wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), 1 g/l Glucose (JRH Biosciences), 10% Spender-Kälberserum (Tissue Culture Biologics) gezüchtet. Die Zellen wurden mit 5 × 105 pro 10 cm Platte 48 Stunden vor dem Transfektionsexperiment eingeimpft. Zehn μg pIK.MIP(α)-E4 und 1 μg pGEM-pgkNeo.pgkpolyA, enthaltend das Neor-Gen wurden durch Calciumphosphatmitfällung in 293-Zellen cotransfiziert [Wigler et al., Cell 57: 777-785 (1979)]. Die transfizierten Zellen wurden in normalem Medium 24 Stunden nach der Transfektion 1:20 aufgeteilt. Nachdem die Zellen mit der Platte verbunden worden waren, wurde das Medium zu selektivem Medium, enthaltend 1 mg/ml G418 (Sigma, St. Louis, MO) geändert. Den Zellen wurde alle drei Tage für etwa 2-3 Wochen von neuem frisches selektives Medium zugeführt. Isolierte Klone wurden aufgenommen, expandiert und in dem selektiven Medium für 5-6 Passagen gehalten. Die etablierten 293-E4-Zellinien wurden routinemäßig in dem normalen Medium gehalten.
  • BEISPIEL 3
  • Southern-Transfers und Hybridisierung
  • Genomische DNA von 293-E4-Zellinien wurde mit gewünschten Restriktionsenzymen digeriert und mit Phenol/Chloroform gereinigt. 10 μg digerierte DNA wurden auf 0,8%-1% Agarosegel laufen gelassen und auf eine Nylonmembran überführt (Zetabind, America Bioanalytical, Natick, MA). DNA von 293-E4-Zellinien wurde mit Restriktionsenzymen digeriert und analysiert. DNA von Wildtyp-Adenovirus 5, pIK6.1-MIP(α)-E4-Plasmid und parentale 293-Zellen wurden ebenfalls mit den gleichen Enzymen digeriert und als Kontrollen verwendet. Restriktionsfragmente der E4-Region, α-Inhibin-Promotorsequenz und die E1-Region wurden durch Hybridisierung mit den geeigneten 32P-markierten Sonden und nachfolgende Autoradiographie nachgewiesen.
  • BEISPIEL 4
  • Herstellung von Virusausgangsmaterialien
  • W162-Zellen wurden in DMEM, 4,5 g/l Glucose und 10% CS gezüchtet. Die W162-Zellinie ist eine Vero-Affennieren-Zellinie, transformiert durch Adenovirus-E4-DNA, und unterstützt das Wachstum von E4-deletierten Adenovirus-Mutanten [Weinberg & Ketner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 5383-5386 (1983)]. Der H5dl1014-Virus ist früher bei Bridge & Ketner, J. Virol. 63: 63138 (1989) beschrieben worden. Dieser Adenovirus-5-Virusstamm hat zwei Deletionen innerhalb der E4-Region und kann nur in W162-Zellen wachsen (Bridge & Ketner, 1989). Propagation und Titration des H5dl1014-Virus wurden auf W162-Zellen ausgeführt. Für Bewertung der Herstellung des H5dl1014-Virus aus 293-E4-Zellinien der vorliegenden Erfindung, wurden die W162-, 293- und 293-E4-Zellinien gezählt und in die Platte mit 6 Vertiefungen mit 1 × 105/Vertiefung aufgebracht und mit H5dl1014 bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 50 Plaque erzeugenden Einheiten (pfu) pro Zelle infiziert. Die Virusausgangsmaterialien wurden durch Ernten der Zellen 48 h nach der Infektion hergestellt. Die Zellen wurden ausgefällt und in 200 μl serumfreien Medium resuspendiert. Die Zellsuspensionen durchliefen drei Zyklen des Gefrierens und wurden aufgetaut, um die viralen Partikel aus den Zellen freizusetzen. Die Zellendebris wurde durch Zentrifugation ausgetragen. Die Titer des Virus, hergestellt von den infizierten Zellen, wurden durch Plaquebildung auf Monoschichten von W162-Zellen bestimmt.
  • BEISPIEL 5
  • Konstruktion von rekombinanten Viren
  • Die 293-Zellinie und die 293-E4-Zellinie wurden 48 Stunden vor dem Experiment mit 2,5 × 106/Platte in einer 10-cm-Platte aufgebracht. Eine Stunde vor der Cotransfektion wurden den Zellen 10 ml frisches Medium zugeführt. Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE3-Virus wurde durch Cotransfektion von 10 μg von durch Bst BI linearisiertem ADV-β-gal mit 4 μg H5dl327 (Thimmappaya et al., Cell 31: 543-551 (1982), digeriert mit Cla I, hergestellt. Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE4-Virus wurde durch Cotransfektion von 10 μg von Bst-BI-linearisiertem ADV-β-gal und 4 μg von C1a-I-digeriertem H5dl1014 auf 293-E4-Zellinien durch die Technik der Calciumphosphatausfällung erzeugt. Vierundzwanzig Stunden nach der Cotransfektion wurde das Medium entfernt, und die Monoschichten der Kultur wurden mit 10 ml DMEM-Medium, enthaltend 20 mM MgCl2, 5% CS und 0,5% Edelagar (DIFCO Lab. Detroit, MI), überdeckt. Die Plaques wurden aufgenommen und in 100 μl PBS resuspendiert. Proben verdünnter Plaque wurden sofort 2 bis 3 Runden der Reinigung als blaue Plaque unterworfen. Die Reinigung als blaue Plaque wurde als regulärer Plaque-Assay ausgeführt, außer daß die Kulturen mit einer zweiten Schicht von Weichagar, enthaltend 1 mg/ml X-gal, überdeckt wurden, wenn Plaques erschienen. Nach Inkubation für 2 Stunden wurden Plaques, welche den rekombinanten Virus, tragend das β-Galactosidase-Gen, enthielten, blau gefärbt. Die Reinheit des rekombinanten Virus wurde durch keine Kontamination von weißen Plaques bestimmt. Die gereinigten Plaques wurden expandiert und die DNA des Lysats wurde analysiert (6), wie früher beschrieben wurde [Graham & Prevec [1992)]. Adenovirale DNA wurde mit Sma I digeriert und auf 0,8% Agarosegel fraktioniert. DNA-Proben von H5dl1014 und den Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE3-Viren wurden aus CsCl-Gradientgereinigten Virusausgangsmaterialien extrahiert. DNA von dem Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE4 wurde aus den Virusinfizierten Zellen extrahiert.
  • BEISPIEL 6
  • Histochemische Färbung
  • Achtundvierzig Stunden nach rekombinanter vitaler Infektion mit Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE3-Virus (Viren mit E1- und E3-Deletion) und Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE4-Virus (Viren mit E1- und E4-Deletion) bei 20 MOI werden die Monoschichten von Zellen einmal in PBS gewaschen und für 10 min bei Raumtemperatur mit 0,5% Glutaraldehyd (Sigma, St. Louis, MO) in PBS fixiert. Die Zellen wurden dreimal mit PBS, enthaltend 1 mM MgCl2, gewaschen und dann mit 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β,D-Galactosidase (X-gal, Sigma) gefärbt, wie früher beschrieben wurde (Thimappaya et al., 1982). Die X-gal-Lösung mit 40 mg/ml in Dimethylformamid wurde auf 1 mg/ml in KC-Lösung (PBS, enthaltend 5 mM K3Fe(CN)6, 5 mM K4Fe(CN)6·3H2O) verdünnt. Nach dem Anfärben für 2-4 Stunden wurden die Zellen mit H2O gewaschen und unter einem Lichtmikroskop inspiziert.
  • BEISPIEL 7
  • Assay der β-Galactosidase-Aktivität
  • Zellen wurden mit sowohl Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE3-Virus als auch Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE4-Virus mit 20 MOI infiziert, für Enzymaktivität bewertet, wie bei McGregor et al., Somatic Cell Mol. Genetic. 13: 253-264 (1987) beschrieben ist, mit den folgenden Modifizierungen. Zellen in einer Platte mit 6 Vertiefungen wurden zweimal mit PBS gewaschen und in der Vertiefung durch Zugabe von 200 μl von 2x Z-Puffer (1x Z-Puffer: 60 mM Na2PO4·7H2O, 40 mM NaH2PO4·H2O, 10 mM KCl, 1 mM MgSO4·7H2O) und 200 μl von 0,2% Triton X-100 lysiert. Nach Inkubation bei Raumtemperatur für 5-10 min wurden 100 μl von jeder Probe in die Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen überführt. Nach Zugabe von 50 μl 2-Nitrophenyl-β-D-galaetopyranosid (2 mg/ml) wurde die Reaktion für 5 min bei Raumtemperatur ablaufen lassen und durch Hinzufügen von 50 μl Stoplösung (1 M Na2CO3) gestoppt. Die Fluoreszenz wurde bei 420 nm auf einem Mikrotiterplattenlesegerät (Molecular Devices Co. Menlo Park, CA) gemessen.
  • BEISPIEL 8
  • Konstruktion von 293-E4-Zellininen
  • Der Zweck der Einführung der Ad5-E4-Genregion in 293-Zellen ist, daß die abgeleitete Zellinie imstande ist, die zwei letale Deletionen (E1 und E4) enthaltenden rekombinanten Adenoviren zu verpacken. Das Plasmid pIK.MIP(α)-E4 trägt die Region voller Länge der Ad5-E4-Region von 15 bp stromaufwärts der Transkriptionsstartstelle bis 810 bp stromabwärts der Polyadenylierungsstelle (1). Die E4-Genregion (mu 88,9-98,8) war direkt mit 238 bps des Mäuse-α-Inhibin-Promotors, enthaltend die ersten 159 bps der Promotorregion und 5'-untranslatierten Region, verknüpft. Diese Promotorsequenz ist für basale Expression erforderlich (Su & Hseuh (1992)). Innerhalb dieser Promotorregion gibt es ein cyclisches-Adenosin-3',5'-monophosphat-(cAMP)-Response-Element (CRE), welches ein erhöhtes Niveau von Genexpression, induziert durch entweder cAMP oder Adenylcyclase-Aktivator, erlaubt [Pasi et al., Mol. Endocrinol. 5: 521-534 (1991)]. Das pIK.MIP(α)-E4 wurde in 293-Zellen zusammen mit dem pGEM-pgkNeo.pghpolyA, welches ein Neomycin-resistentes Gen trägt, durch Calciumphosphatausfällung mit einem Molverhältnisäquivalent bis 10:1 eingeführt. Eine Gesamtmenge von 66 G418-resistenten Klonen wurde zur weiteren Analyse aufgenommen.
  • BEISPIEL 9
  • Identifizierung von E4-Transfektanten
  • Um die Integration der eingeführten Adenovirus-E4-Region zu untersuchen, wurde genomische DNA von jedem Klon mit entweder Hind-III- und Sfi-I- oder Neo-I-Restriktionsenzymen digeriert und durch Southern-Transfer analysiert. 3A zeigt eine Restriktionskarte der eingeführten α-Inhibin-E4-Region und entsprechender Regionen der E4-Sonde (Sma-I-H-Fragment von Ad5) und der Inhibin-Promotorsonde. 17 Klone von einer Gesamtmenge von 66 stellten die korrekten DNA-Muster dar, wie sie für eine E4-Region-DNA-Integration voller Länge in den Screen-Blots beider Digestionen vorhergesagt wurde. Andere Klone zeigten entweder keine Integration oder eine Integration mit variablen Größen der E4-Region. 3B-3E stellen die Southern Blots von genomischer DNA, extrahiert aus den 17 Klonen mit Integration voller Länge und zwei Klonen, welche variable Größen von E4-Region-Integration auf den anfänglichen Screening-Blots enthalten, dar. Die DNA wurde extrahiert, nachdem diese 19 Zellinien in dem nichtselektiven Medium für mehr als 30 Passagen gehalten wurden. Wie in 3B und 3C gezeigt, stellen 15 Zellinien die charakteristischen Fragmente von 0,9 kb und 3,2 kb in HindIII/SfiI-Digestion und Fragmente von 1,6 kb und 2,1 kb in Nco-I-Digestion dar. Es gab keine nachweisbaren E4-Region-Sequenzen in zwei Zellinien (Linien 13 und 29), welche die gleichen Integrationsmuster wie die anderen 15 Linien in den Screening Blots hatten, was ein unstabiles Integrationsereignis in diesen zwei Linien anzeigt. Die Linien 16 und 19 sind Beispiele von Zellinien, welche die E4-Genregion mit variablen Restriktionsmustern behielten. Die 0,9-kb-Bande von allen 15 Linien hybridisierte mit der Mäuse-Inhibin-Promotorsequenz in der Hind-III/Sfi-Digestion (3D). Das 3,1-kb-Fragment zusammen mit dem 2,1-kb-Fragment wurde mit der Inhibin-Promotorsonde in dem Nco-I-Digestionsblot hybridisiert. Diese Ergebnisse zeigen an, daß eine Genregion voller Länge von E4 in diese 15 Zellinien stabil integriert wurde. Um die Möglichkeit auszuschließen, daß diese Zellinien überleben und eine volle Länge der E4-Region aufgrund eines Verlustes der E1-Genregion aufrecht erhalten können, wurden die Blots noch einmal mit dem Ad5-Hind-III-E-Fragment (mu 7,7-17,1) sondiert. Alle 19 Linien haben ein Fragment gleicher Größe, nachgewiesen durch die E1-Sonde, wie das in der parentalen 293-Zellinie (3e). Daher war das E1-Gen in den 293-E4-Zellinien nicht verändert.
  • BEISPIEL 10
  • Screen der biologischen Aktivität der 293-E4-Zellinien
  • Um zu bestimmen, ob diese Zellinien imstande waren, das Wachstum des E4-Deletions-Virus zu unterstützen, wurde jede von den Zellinien mit einem Adenovirus-E4-Deletions-mutanten Virus H5dl1014 infiziert [Bridge & Ketner (1989)]. Der E4-defekte Stamm H5dl1014 enthält zwei Deletionen von um 92 bis 93,8 und mu 96,4 bis 98,4. Die Deletionen zerstören alle offenen Leserahmen der E4-Region außer ORF 4. Dieser Virus erzeugt wesentlich weniger virale DNA und späte virale Proteine in Hela-Zellen, ähnlich dem, was in Zellen, infiziert mit H2dl808 und H5dl366, gesehen wird [Halbert et al., J. Virol. 56: 56: 250-256 (1985)]. Die einzige permissive Zellinie für das Wachstum von H5dl1014 ist W162 [Weinberg & Ketner (1983)]. Wenn die parentalen 293-Zellen, W162-Zellen und alle 15 Linien mit H5dl1014 bei MOI 25 mit oder ohne Zugabe von 1 mM cAMP infiziert wurden, zeigten 6 Zellinien vergleichbare cytopathische Wirkung (CPE), wie sie auf W162-Zellen 3-4 Tage nach der Infektion beobachtet wurde (4). Die CPE erschien sowohl in W162-Zellen als auch in einigen der 293-E4-Zellinien in Anwesenheit von cAMP viel schneller. Die parentalen 293-Zellen zeigten CPE mit viel milderem Niveau (4). Dieses Ergebnis zeigt, daß 293-E4-Zellinien (enthaltend sowohl E1- als auch E4-Genregionen) das Wachstum von E4-deletierten Viren (z.B. H5dl1014-Virus) so wirksam wie Zellinien, enthaltend nur die E4-Genregion (z.B. W162-Zellinie), unterstützen.
  • BEISPIEL 11
  • Induktion der H5dl1014-Herstellung auf 293-E4-Zellinien
  • Um die Fähigkeit von 293-E4-Zellinien, H5dl1014-mutanten Virus herzustellen, quantitativ zu untersuchen und zu bestimmen, ob es eine spezifische Induktion von E4-Genexpression in den 293-E4-Zellinien gibt, wurde der Titer des H5dl1014, erzeugt in den 293-E4-Zellinien, in Anwesenheit oder Abwesenheit von cAMP gemessen. Virusausgangsmaterialien wurden aus jeder Zellinie durch Infizieren der gleichen Anzahl von Zellen mit H51014 bei MOI 50 hergestellt. 48 h nach der Infektion wurde der Überstand jeder Zellinie entfernt und die Zellen wurden in 1/10 des ursprünglichen Volumens von serumfreiem Medium resuspendiert. Titration der Virusausgangsmaterialien wurde auf W162-Zellen durch Plaque-Assay durchgeführt. Wie in Tabelle 1 dargestellt kann das Phänomen der Virusherstellung aus diesen 15 Linien im allgemeinen in drei Gruppen klassifiziert werden. Gruppe 1, welche die Linien 8, 50 und 51 einschließt, zeigte um 4 bis 6 Größenordnungen erhöhte virale Titer, verglichen mit dem Titer, erzeugt von 293-Zellen. Linie 8 und 51 hatten in Anwesenheit von cAMP eine 10-fache Zunahme der viralen Titer. Gruppe 2, welche die Linien 12, 27 und 61 einschließt, erzeugte ähnliche Titer von Virus wie den von W162-Zellen erzeugten. Die Titer nahmen mit Ausnahme der Linie 12, in der in Anwesenheit von cAMP das Niveau der Virusherstellung um 7 Größenordnungen zunahm, um das 1000-10000-fache zu. Diese Ergebnisse zeigen eine induzierte E4-Genexpression in diesen drei Zellinien an. Gruppe 3 schließt die verbleibenden Zellinien ein, welche die Virustiter im wesentlichen mit Niveaus ähnlich denen, erzeugt von parentalen 293-Zellen in Anwesenheit oder Abwesenheit von cAMP, erzeugten. Die induzierte E4-Genexpression wird ebenfalls in verschiedenen Zellinien in dieser Gruppe angezeigt.
  • Die 10-fache Induktion wurde auch in den W162-Zellen und parentalen 293-Zellen beobachtet, wenn die Zellen mit cAMP behandelt wurden. Es ist möglich, daß diese 10-fache Zunahme in der Virusausbeute auf den Verstärkungseffekt von cAMP bei anderer früher Genexpression des Adenovirus zurückzuführen ist [Leza & Hearing, J. Virol. 63: 3057-3064 (1989)], welche auch CRE-Elemente enthält, die eine Zunahme in viraler DNA-Synthese bewirken.
  • TABELLE IV: TITER VON H5DL1014, ERZEUGT VON DEN ZELLINIEN W162, 293 UND 293-E4
    Figure 00180001
  • Der Titer wurde durch Plaque-Assay von W162-Monoschichtkultur bestimmt. die Werte in der Tabelle sind die Mittelwerte von Titern, gemessen an doppelten Proben.
  • BEISPIEL 12 Herstellung von Ad5/ΔE1-(β-gal)ΔE4-Virus Um rekombinanten Virus zu gewinnen, welcher letale Deletionen in sowohl der E1-Region als auch der E4-Region beherbergt, wurden die beiden wirksamsten Zellinien, Linie 8 und Linie 61, benutzt. Das ADV-β-gal-Plasmid wurde durch BstBI linearisiert und mit Cla-I-digeriertem H5dl1014 in die Monoschichten von 293-E4-Zellinien cotransfiziert (5). Der rekombinante Virus wurde durch in-vivo-Rekombination zwischen der überlappenden adenoviralen Sequenz von ADV-β-gal und dem großen Cla-I-Fragment von H5dl1014 (mu 2,55-100) erzeugt. Plaques, die 7-10 Tage nach der Transfektion erschienen, wurden isoliert und durch blauen Plaque-Assay gereinigt. Die finale gereinigte blaue Plaque und die virale DNA wurden analysiert (6). Für die folgenden vergleichenden Untersuchungen des rekombinanten Virus mit doppelter Deletion wurde der Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE3-Virus erzeugt. Dieser Virus wurde durch Cotransfektion von Bst-BI-linearisiertem ADV-β-gal-Plasmid mit Cla-I-digeriertem H5dl327 [Thimmappaya et al. (1982)] in 293-Zellen erzeugt (5).
  • BEISPIEL 13
  • In-vitro-Bewertung des Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE4-Virus
  • Um die Infektiosität dieser zweiten Generation von rekombinantem Virus zu bewerten, wurde die Infektiosität mit der β-gal-Genexpression des Virus mit der doppelten letalen Deletion und des Virus mit der einzigen letalen Deletion in Hela-, 293-, W162- und Linie-61-Zellen verglichen. Die Zellen wurden mit diesen zwei Stämmen von rekombinanten Viren bei 20 MOI für 48 h infiziert. Expression wurde bei beiden Infektionen beobachtet, wie sie durch sowohl histochemische Färbung als auch den vorstehend beschriebenen Assay der β-Galactosidase-Aktivität nachgewiesen wurde. Die aufgehobene cytopathische Wirkung des Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE4-Virus wurde ebenfalls durch den Plaque-Assay getestet. Die 293-E4 war die einzige permissive Zellinie für alle drei Stämme von Virus (Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE4, Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE3 und H5dl1014). Die 293-Zellen waren permissiv für den Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE3-Virus, semi-permissiv (niedriges Niveau der Virusproduktion) für den H5dl1014-Virus, aber nicht permissiv für den Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE4-Virus. Die W162-Zellinie war permissiv für den H5dl1014-Virus, aber nicht permissiv für den Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE3-Virus und Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE4-Virus. Hela-Zellen waren für alle drei Stränge von Viren nicht permissiv. Diese Ergebnisse demonstrieren, daß der Virus mit doppelter Deletion keinerlei cytopathische Wirkung auf die getesteten humanen Zellinien verursacht. Abwesenheit von cytopathischen Wirkungen nach der Infektion der Viren mit doppelter Deletion bei MOI 20 läßt vermuten, daß in vivo diese Viren keine späten Genprodukte exprimieren. Dies sollte die Immunantwort gegen Zellen, infiziert mit rekombinantem Virus, beseitigen, wodurch die Transgenexpression verlängert wird.
  • BEISPIEL 14
  • Wirksame Transgen-Expression und Expression von verkürztem E4-Gen in vitro
  • Um die Transgenexpression, vermittelt durch Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE4 auf dem Transkriptionsniveau, zu bestimmen und die E4-Transkription von dem Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE4-Virus physikalisch zu visualisieren, wurde Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE4-virale RNA durch Northern Blot analysiert. Die gesamte RNA wurde von Hela-Zellen 4, 24 und 48 h nach der Infektion von rekombinanten Adenoviren mit 20 pfu/Zelle geerntet. Die gesamten RNAs, extrahiert aus Hela-Zellen, infiziert mit H5dl327 und Ad5/ΔE1(β-gal), wurden als Vergleich verwendet. RNAzol-B-Reagenz (Tel-Test, Inc. Friendswood, TX) wurde zur Extraktion der gesamten RNA verwendet. 10 μg gesamte RNAs wurden in einem 1%igen denaturierenden Gel elektrophoresiert, auf ein Membranfilter überführt und mit radioaktiven DNA-Sonden hybridisiert. Die Northern Blots wurden aufeinanderfolgend mit radiomarkiertem 1,65-kb-EcoRV-AccI-Fragment von β-gal, 2,30-kb-SmaI-H-Fragment der Ad5-E4-Region (mu 92,0-98,4), 765 bps des PCR-Produkts der LS-Region und dem 1,45 kb SmaI I Fragment der L3-Region (mu 52,6-56,6) sondiert. Die PCR-Primer zur Amplifizierung der Adenovirus-L5-Region waren 5'-GAGGACTAAGGATTGATT-3'(NTs 31811-31828) (SEQ ID NO: 3) und 5'-CGTGAGATTTTGGATAAG-3' (NTs 32549-32566) (SEQ ID NO: 4).
  • Die Zellen, infiziert mit entweder dem Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE4 oder dem Ad5/ΔE1(β-gal), akkumulierten 4 h nach der Infektion das gleiche Niveau von β-gal-mRNA (7, Tafel A). Jedoch akkumulierten die Zellen, infiziert mit Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE4 24 und 48 Stunden nach der Infektion allmählich ein niedrigeres Niveau von β-gal, verglichen mit den Zellen, infiziert mit Ad5/ΔE1(β-gal). Dieses leicht verringerte Niveau von β-gal-Transkript, vermittelt durch Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE4, ist mit einem leicht verringerten Niveau von β-Galactosidase-Enzym-Aktivität in infizierten Hela-Zellen, bewertet 24 h nach der Infektion, wie bereits beschrieben, vereinbar. Wenn der gleiche Blot mit adenoviraler E4-Sonde rehybridisiert wurde, welche sich von 92,0 bis 98,4 mu erstreckt und nicht das 3'-Ende der L5-Region überlappt [Fraser et al., J. Mol. Biol. 155: 207-233, (1982)], wurde ein charakteristisches Muster polysomaler mRNAs [Tiggs et al., J. Virol. 50: 106-117, (1984)] in sowohl H5dl327- als auch Ad5/ΔE1(β-gal)-infizierten Proben gezeigt, obwohl das Niveau der E4-Transkripte in Ad5/ΔE1(β-gal)-infizierten Zellen dramatisch verringert ist. Jedoch gibt es nur eine Spezies von E4-Transkripten mit einer Größe entsprechend 1,5 kb in Zellen, infiziert mit dem Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE4 (7, Tafel B). Diese Beobachtung ist vermutlich auf zwei große Deletionen innerhalb dieses E1/E4-deletierten Vektors zurückzuführen, welche alle die offenen Leserahmen innerhalb der E4-Region mit der Ausnahme des ORF4 zerstörten und zu der Herstellung von das ORF4-Protein codierenden, verkürzten Transkripten führten. Dieses Beispiel unterstützt die in Beispiel 13 beschriebenen Ergebnisse, daß das Transgen, freigesetzt von dem Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE4-rekombinanten adenoviralen Vektor, wirksam exprimiert wird.
  • BEISPIEL 15
  • Verringerte oder beseitigte adenovirale späte Genexpression in vitro
  • Es wurde berichtet, daß der parentale mutante Adenovirus H5dl1014, welcher verwendet wurde, um den rekombinanten adenoviralen Vektor Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE4 zu erzeugen, ernsthafte Defekte in der späten Genexpression zeigt [Bridge und Ketner, J. Virol. 63: 631-638 (1989)]. Um zu bestimmen, ob die Kombination der Deletionen der E1- und E4-Region in Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE4 zu profunderen Defekten oder kompletter Blockade der späten Genexpression führen könnte, wurde die Akkumulation später mRNAs von Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE4 in nichtpermissiven Hela-Zellen durch die Methoden sowohl von Northern Blot als auch Polymerasekettenreaktion mit reverser Transkription (RT-PCR) gemessen. Der Northern-Blot (beschrieben in Beispiel 14 und 7) wurde mit der L5-Sonde, welche das PCR-Produkt der Ad5-Sequenz von NTs 31811 bis 32566 innerhalb der Faserprotein-Codierungsregion (LS-Region) ist, und der L3-Sonde, welche das SmaI-I-Fragment von mu 52,6-56,6 innerhalb der Hexon-Protein-Codierungsregion ist, rehybridisiert. Es gab ein niedriges Niveau der Akkumulation von L5-Transkripten und ein nachweisbares Niveau von L3mRNA in den Zellen, infiziert mit E1-deletiertem Vektor 48 h nach der Infektion (7, Tafel C und D). Jedoch waren beide späte Transkripte in den Zellen, infiziert mit dem E1/E4-deletierten adenoviralen Vektor, nicht nachweisbar.
  • Die Anmelder haben weiterhin das RT-PCR-Verfahren mit erhöhter Nachweisempfindlichkeit angewendet, um zu bestimmen, ob adenovirale späte Gentranskripte in dem Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE4 rekombinanten Vektor exprimiert wurden. Die gesamte RNA wurde mit RNase-freier DNase (Promega Corp., Madison WI) mit 1 Einheit/μg bei 37°C für 60 min behandelt. Der erste Strang von cDNA wurde unter Verwendung von pd(N)6 als Primer (Pharmacia, Alameda, CA) synthetisiert. Die gleiche Gruppe von Kontrollreaktionen wurde durch Weglassen der reversen Transkriptase ausgeführt. Beide Zubereitungen (RT+ und RT-) wurden dann unter Verwendung der gleichen L5-Primer wie bereits beschrieben (siehe Beispiel 14) amplifiziert. Die Primer für die L3-region waren 5'-CCTACGCACGAC-3' (SEQ ID NO: 5) (NTs 18996-19007); 5'-TGTTTGGGTTAT-3' (SEQ ID NO: 6) (NTs 20318-20329). Nach der Amplifikation wurden die RT-Produkte auf einem 1 %-Agarosegel laufen gelassen und durch Anfärben mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Die L5-mRNA wurde sowohl in Zellen, infiziert mit Ad5/ΔE1(β-gal), als auch in denen mit Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE4 identifiziert (8). Es gab keine nachweisbaren L3-mRNA-Transkripte in Zellen, infiziert mit Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE4 (8). Die RT-PCR-Reaktion unter Verwendung von β-Actin-Primern wurde als interne Kontrolle verwendet. Die β-Actin-Primer, die für die RT-PCR benutzt wurden, waren die Consensus-Sequenzen zwischen der Ratte und dem Menschen, wie bei Fraser et al., J. Virol. 63, 63138 (1989) beschrieben ist.
  • Um die Empfindlichkeit des Nachweises der Hexon-Protein-Sequenz (innerhalb der L3-Region) zu vergrößern, wurden RT-PCR-Produkte durch Southern Blot weiter analysiert, mit einem Oligomer 5'-GACCGTGAGGATACT-3' (SEQ ID NO: 7) sondiert, welches mit der internen Region der RT-PCR-Produkte der Hexon-Protein Codierungsregion hybridisierte (9). L3-Transkripte wurden in den Zellen, infiziert mit dem doppelt deletierten adenoviralen Vektor Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE4, nicht nachgewiesen, was die Ergebnisse der vorstehend und in 8 beschriebenen Untersuchung bestätigt. Diese Ergebnisse zeigen an, daß die Kombination der E1- und E4-Deletion innerhalb des Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE4-Vektors zu einer vollständigen Defizienz der L3-mRNA, welche das Adenovirus-Capsidprotein Hexon codiert, führen sollte.
  • BEISPIEL 16
  • Persistente Transgenexpression in vivo
  • Um zu bestimmen, ob verringerte oder beseitigte späte Adenovirus-Genexpression des E1/E4-deletierten adenoviralen Vektors die Transgenexpression verlängern könnte, wurde die β-gal-Genexpression in Zellen, infiziert mit entweder E1-deletiertem Vektor oder E1/E4-deletiertem Vektor, untersucht. Der doppelt deletierte Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE4-rekombinante Virus and der Ad5/ΔE1(β-gal)-rekombinante Virus wurden in den folgenden in-vivo-Experimenten verwendet. Virusausgangsmaterialien wurden aus der Suspension von komplementierenden Verpackungszellen hergestellt und durch doppeltes CsCl-Banding gereinigt, wie bei Graham und Prevec, Methods Mol. Biol. 7: 109-128 (1991) beschrieben ist. Alle verwendeten Ausgangsmaterialien waren frei von Kontamination von E1 enthaltendem Virus, bestimmt durch PCR-Analyse unter Verwendung von E1-Region-(NTs 13-1338)-Primer und E2-Region-(NTs 5053-5072) Primer, wie bei Lochmuller et al., Hum. Gene Ther. 5: 1485-1491 (1994) beschrieben ist. Fünf Tiere, infiziert mit jedem Stamm von rekombinantem Virus, wurden am Tag 3, 7, 14, 21, 28, 35 und 77 nach der Infektion getötet. Histochemische X-gal-Färbung, früher beschrieben, wurde an den gefrorenen Schnitten der vorstehenden infizierten tierischen Lebern durchgeführt. Die Färbung zeigte, daß ungefähr 100% der Gewebe das β-Galactosidase-Gen in mit sowohl E1-deletiertem als auch E1/E4-deletiertem adenoviralen Vektor infizierten Lebern am Tag 3 und 7 exprimierten. Es gab einen scharfen Rückgang der X-gal-Färbung von 14 Tagen (75-85%) bis 35 Tagen (15-25%) in den mit dem E1-deletierten Vektor infizierten Lebern. Nach 77 Tagen färbten sich nur 1-2% der Lebern in mit E1-deletiertem Adenovirus infizierten Tieren blau. Im Gegensatz dazu wurde die β-Galactosidase-Genexpression mit einem Niveau von 85% für 28 Tage in den Lebern, infiziert mit dem E1/E4-deletierten Virus, aufrechterhalten. Darüber hinaus exprimierten am Tag 77 ungefähr 65-75% der mit dem E1/E4-deletierten Virus infizierten Tierlebern das β-Galactosidase-Gen. Dieses Beispiel demonstriert, daß die Beseitigung der späten Adenovirus-Genexpression in einem doppelt E1/E4-deletierten adenoviralen Vektor (Adenovirus) die Expression eines Transgens, plaziert in dem viralen Vektor, verglichen mit einem einfach deletierten Adenovirus, z.B. E1-deletiertem Adenovirus, signifikant verlängern konnte.
  • BEISPIEL 17
  • Verringerte cytopathische Wirkungen und Immunantworten eines Wirts in vivo
  • Um zu bestimmen, ob es eine inverse Korrelation zwischen einer verlängerten Trangenexpression und verringerten cytopathischen Wirkungen bei Tieren, infiziert mit dem E1/E4-deletierten Adenovirus, gibt, wurden statistische Leber-Hämatoxylin/Eosin-(H&E)-gefärbte Schnitte von fünf Tieren pro jeder experimentellen Gruppe untersucht. Gefrorene Leberschnitte (6 μm) wurden in 0,5% Glutataldehyd fixiert und für β-gal-Aktivität durch Färben in X-gal-Lösung gefärbt. Für morphologische Untersuchung wurden die Paraffinleberschnitte mit H&E gefärbt. Statistische Schnitte wurden überprüft. Pathologische Veränderungen wie beispielsweise Aufblähung der Zellen, Nekrose des Gewebes, Verlust von lobulärer Struktur und entzündliche Infiltration wurden zwischen Tag 3 und 7 beobachtet und setzten sich bis zum Tag 35 bei Tieren, infiziert mit E1-deletiertem Adenovirusvektor, fort. Bis zum Tag 77 hatten sich die meisten Tiere mit der gleichen Infektion morphologisch von diesen Gewebeschäden erholt. Jedoch wurde keine von den vorstehenden pathologischen Veränderungen zwischen dem Tag 3 und 7 beobachtet, außer daß eine leichte entzündliche Infiltration nach Tag 14 und bei den Tieren, infiziert mit E1/E4-deletiertem Adenovirusvektor, erschien. Bis zum Tag 77 waren alle Tiere, die mit diesem doppelt deletierten Virusvektor infiziert waren, morphologisch zum normalen Zustand zurückgekehrt. Dieses Beispiel demonstriert, daß verringerte cytopathische Wirkungen durch den doppelt deletierten Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE4-rekombinanten adenoviralen Vektor vermittelt werden. Die verlängerte Transgenexpression bei Tieren, infiziert mit dem doppelt deletierten adenoviralen Vektor, kann auf verminderte Geweberegenerierungsaktivität in der Leber, verglichen mit den Lebern von Tieren, infiziert mit dem Ad5/ΔE1(β-gal)-Vektor, zurückzuführen sein.
  • BEISPIEL 18
  • Konstruktion von E4-ORF-6-Plasmid
  • Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion des pIK6.1MIP(α)-ORF6-Plasmids. Der Expressionsvektor der E4-ORF6-Region wurde konstruiert, wie in 10 veranschaulicht ist. Das parentale pIK6.1-MMSV-E4 (ΔE4 pro.), abgeleitet von dem pIK6.1.MMSVNhe [auch bezeichnet als pIK6.1 MMSVenpoNhe(Hpa) oder pkat1 bei Finer et al., Blood, 1994 und Finer et al., in der internationalen Anmeldung WO 94/29438], enthält die Sequenz voller Länge der E4-Region außer der Promotorsequenz. Das pIK6.1MIP(α)-E4 wurde durch Ligation eines 238-bp-Fragments des Hind-III-Xba-I-PCR-Produkts von Mäuse-α-Inhibin-Promotor [MIP(α)] mit dem 2,9-kb-Xba-I-Stu-I-Fragment und dem 3,9-kb-Stu-I-Hind-III-Fragment des pIK6.1 MMSV-E4 (ΔE4 pro.) konstruiert. Das pIK6.1MIP(α)-ORF6-Plasmid wurde durch Ersetzen der promotorlosen E4-Region mit einem PCR-Produkt des ORF6-Fragments konstruiert. Die PCR-Primer für die E4-ORF6-Codierungsregion sind 5'-gccaatctagaGCTTCAGGAAATATGACT-3' (Ad5 NTs 34072 bis 34089) (SEQ ID NO:8) und 5'-catctctcgagGGAGAAGTCCACGCCTAC-3' (Ad5 NTs 33179 bis 33196) (SEQ ID NO:9). Die Sequenzen, enthaltend entweder die XhoI-Stelle oder die Xba-I-Stelle, in Kleinbuchstaben waren vorhanden, um das Klonieren zu erleichtern. Die Transkription des ORF6 wird durch den Mäuse-α-Inhibin-Promotor vorangetrieben und die heterologen Polyadenylierungssignale (SV40 polA) auf dem Plasmidgrundgerüst stromabwärts von der ORF6-Region wurden benutzt. Das klonierte ORF6-DNA-Fragment wurde sequenziert, um die Genauigkeit der Sequenz zu verifizieren. Das pIK6.1MIP(α)-ORF6 wurde verwendet, um die Verpackungszellinie zu erzeugen, wie nachstehend beschrieben ist.
  • BEISPIEL 19
  • Konstruktion von 293-ORF6-Zellinien
  • Das folgende Beispiel beschreibt die Konstruktion von 293-ORF6-Zellinien. Um die potentielle Möglichkeit der Erzeugung von E4 enthaltendem Virus zu beseitigen, wurde diese neue Verpackungszellinie etabliert, indem eine minimale wesentliche Ad5-E4-ORF6-Codierungsregion in 293-Zellen eingeführt wurde. Das Plasmid pIK.MIP(α)-ORF6 trägt ein 910-bp-PCR-Fragment der Ad5-E4-ORF6-Codierungsregion von Nucleotid 1846 bis 2756, numeriert von dem rechten Ende des Genoms. Die ORF6-Region wurde stromabwärts der Mäuse-α-Inhibin-Promotorregion wie bereits beschrieben kloniert. Das pIK6.1MIP(α)-ORF6 wurde in 293-Zellen mit einem Plasmid, enthaltend das Neor-Gen, cotransfiziert. Vierundfünfzig G418-resistente Klone wurden isoliert, expandiert und für Integration der E4-ORF6-Sequenz durch Southern Blotting gescreent (11). Genomische DNA von jedem Klon wurde mit Hind III und XmnI digeriert und mit dem ORF6-PCR-Fragment hybridisiert (11, Tafel A). Acht von den insgesamt 54 gescreenten Klonen behielten mindestens eine Kopie des vorhergesagten 1,7-kb-Fragments für die intakte ORF6-Region. Die Blots wurden mit der E1-Sonde rehybrisisiert, welche ein Ad5-Hind-III-E-Fragment ist (mu 7,7-17,1) (11, Tafel B). Alle acht 293-ORF6-Zellinien zeigten das Fragment gleicher Größe, nachgewiesen durch die E1-Sonde, wie das in den parentalen 293-Zellen gefundene ( 11). Dieses Beispiel demonstriert, daß die Struktur des E1-Gens sich in den Zellinien nicht verändert hat. Nicht nur haben die vorstehenden Zellinien das intakte E1-Gen, sondern sie behalten auch mindestens eine Kopie der E4-ORF6-Region.
  • BEISPIEL 20
  • Komplementation der E4-Funktion durch 293-ORF6-Zellinien
  • Die 293-ORF6-Zellinien wurden für ihre Fähigkeit gescreent, nach Infektion mit dem E4-deletierten mutanten Adenovirus, H5dl1014, Virus herzustellen. Der H5dl1014-Adenovirus enthält zwei Deletionen, welche alle die offenen Leserahmen der E4-Region mit der Ausnahme von ORF4 zerstören, was zu der Herstellung von wesentlich weniger viraler DNA und späten viralen Proteinen in Hela-Zellen führt. Die W162-Zellinie, welche eine intakte E4-Region enthält, ist eine permissive Zellinie für das Wachstum von H5dl1014 [Bridge und Ketner, J. Virol. 63: 631-638 (1989)]. Wenn die parentalen 293-, W162-, 293-E4- und 293-ORF6-Zellinien mit H5dl1014 bei einem MOI von 25 pfu infiziert wurden, zeigten alle acht 293-ORF6-Zellinien vergleichbare cytopathische Wirkung (CPE), wie in W 162-Zellen ebenso wie in 293-E4-Zellen 3-4 Tage nach der Infektion beobachtet wurde. Quantitative Analyse der Herstellung von H5dl1014 wurde durch Plaque-Assay mit begrenzender Verdünnung auf den Monoschichten von dem 293-ORF6 und Kontrollzellinien durchgeführt. Die Titer des H5dl1014, erzeugt durch 293-ORF6, sind im ähnlichen Bereich von denen, erzeugt durch sowohl W162- als auch 293-E4-Zellen. (Tabelle V). So sind 293-ORF6-Zellinien, welche nur ein kleines wesentliches DNA-Fragment der E4-Genregion enthalten, ausreichend, um die E4-Funktion zu komplementieren und das Wachstum des mutanten Virus mit E4-Deletion zu unterstützen.
  • BEISPIEL 21
  • Komplementierung der E1-Funktion durch 293-ORF6-Zellinien
  • Southern-Analyse demonstrierte, daß alle von den untersuchten 293-ORF6-Zellinien eine Kopie der intakten E1-Region enthalten. Diese Linien wurden auf ihre biologische Aktivität bewertet, die E1-Funktion zu komplementieren. (Assay der Komplementierungsaktivität wie in Tabelle V angegeben). Monoschichten von W162-, 293-, 293-E4- und 293-ORF6-#34-Zellinien wurden mit dem E1-deletierten mutanten Virus infiziert, H5dl312 und virale Produktion wurden durch Plaque-Assay mit begrenzender Verdünnung bestimmt. Jede von den acht 293-ORF6-Zellinien erzeugte den E1-deletierten Virus mit einem Niveau, ähnlich dem, das durch die parentalen 293-Zellen erzeugt wurde (Tabelle V). Daher besitzen die 293-ORF6-Zellinien die Fähigkeit, sowohl die E1- als auch die E4-Genprodukt-Funktionen zu komplementieren. TABELLE 5: CHARAKTERISIERUNG DER E4-ORF6-ZELLINIEN DURCH BIOLOGISCHE KOMPLEMENTIERUNGSAKTIVITÄT
    Figure 00240001
    • a Die Titer von H5dl1014-Lysaten, erzeugt von Zellinien, wurden durch Plaque-Assay auf W162-Monoschichtkultur bestimmt.
    • b Die Titer von H5dl312-Ausgangsmaterial und dE1/dE4-Ausgangsmaterial wurden auf Zellinien bestimmt.
    • c Die Werte in der Tabelle sind der Mittelwert von Titern, gemessen an doppelten Proben.
  • BEISPIEL 22
  • Gleichzeitige Komplementierung von sowohl E1- als auch E4-Funktion durch 293-ORF6-Zellinien
  • Dieses Beispiel beschreibt die Fähigkeit der 293-ORF6-Zellinien, rekombinanten Virus zu gewinnen, welcher Deletionen in sowohl der E1- als auch der E4-Region beherbergt. Die Zellinie 34 wurde zum weiteren Testen aus den zwei Zellinien, welche den höchsten Titer von H5dl1014 erzeugten, d.h. der Zellinie 21 und 34, ausgewählt. Der E1/E4 doppelt deletierte rekombinante Virus Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE4, konstruiert wie bereits beschrieben, enthält das E.-coli-β-Galactosidase-Gen, welches unter der Kontrolle des pgk-Promotors ist. Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE4 wurde durch Rekombination unter Verwendung von H5dl1014 als parentalem Virus wie bereits beschrieben erzeugt. Quantitative Analyse der Herstellung von Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE4 wurde durch Plaque-Assay mit begrenzender Verdünnung auf den Monoschichten der Kontrollzellinien und der 293-ORF6-34-Linie durchgeführt. Plaques, welche sich mit X-gal-Färbung blau färbten, erschienen auf den Monoschichten von 293-E4 und 293-ORF6-34 7-10 Tage nach der Infektion. Der Titer des Ad5/ΔE1(β-gal)ΔE4, erzeugt von der 293-ORF6-34-Zellinie, war der gleiche wie der Titer, erzeugt von der 293-E4-Zellinie. Dieses Beispiel demonstriert, daß die 293-ORF6-34-Zellinie imstande ist, das Wachstum des Virus mit letalen Deletionen von sowohl E1 als auch E4 zu unterstützen. Die neuen Verpackungszellinien, beschrieben in Beispiel 19, sind vorteilhaft für die Propagation von E1/E4-deletierten rekombinanten adenoviralen Vektoren, weil sie Virus mit hohem Titer erzeugen und nicht imstande sind, Replikations-kompetenten Adenovirus (RCA) zu erzeugen, was auf die Abwesenheit von Überlappung zwischen der E4-Deletion innerhalb des Vektors und dem E4-ORF6-exprimierenden Plasmid, vorhanden in der transfizierten Zellinie, zurückzuführen ist.
  • BEISPIEL 23
  • Konstruktion von E2A-Plasmid
  • Das pIK6.1MIP(α)-E2A-Plasmid wurde von dem pIK6.1MIP(α)-E4 wie vorstehend beschrieben abgeleitet. Das promotorlose E4-Gen wurde mit dem Ad5-E2A-Gen von 21562 bis 24627 (mu 59,9 bis 68,3) [Klessig et al., Mol. Cell. Bio. 4: 1354-1362 (1984)] mit der vorhandenen zweiten Leading-Sequenz ersetzt. Das Ad5-E2A-Gen codiert das Adenovirus-DNA-Bindungsprotein (DBP) und ist für Adenovirus-DNA-Replikation erforderlich [Van der Vliet und Sussenbach, Virology, 67: 41526 (1975)]. Das Gen (mu 61,5-68), dem sein eigener Promotor und die erste Leader-Sequenz fehlt, wurde stromabwärts von der Mäuse-α-Inhibin-Promotorregion kloniert. Ein PCR-Produkt von mu 65,2 bis 68,3 wurde unter Verwendung der Primer 5'-tccatttctagaTCGGCTGCGGTTG-3' (SEQ ID NO: 10) (Ad5 NTs 24615 bis 24627) und 5'-ACGTGGTACTTGTCCATC-3' (SEQ ID NO: 11) (Ad5 NTs 23443 bis 23460) erzeugt. Die Sequenz, enthaltend die Xba-I-Stelle, in Kleinbuchstaben ist vorhanden, um Ligation und Klonierung zu erleichtern. Das PCR-Produkt wurde mit sowohl Xba I als auch Pvu I digeriert und mit dem Ad5-Bam-HI- und Pvu-I-DNA-Fragment von NTs 21562 bis 23501 (mu 59,9 bis 65,2) ligiert. Die promotorlose E2A- DNA-Sequenz wurde darauf verwendet, um die promotorlose E4-Region auf dem Plasmid pIK6.1MIP(α)-E4 zu ersetzen. Die Transkription des klonierten E2A-Gens wird durch den Mäuse-α-Inhibin-Promotor vorangetrieben und die heterologen Polyadenylierungssignale (SV40 polA) auf dem Plasmidgrundgerüst stromabwärts von der E2A-Region wurden benutzt. Das klonierte E2A-Gen wurde sequenziert, um die Genauigkeit der Sequenz zu verifizieren. Das pIK6.1MIP(α)-E2A-Plasmid wurde verwendet, um die Verpackungszellinie zu erzeugen, wie nachstehend beschrieben ist.
  • BEISPIEL 24
  • Konstruktion der 293-E2A-Zellinie
  • Das folgende Beispiel beschreibt die Konstruktion der 293-E2A-Zellinien. Um eine Verpackungszellinie zu konstruieren, welche imstande ist, sowohl die E1- als auch die E2A-Genfunktion in trans gleichzeitig zu komplementieren, wurde das Plasmid pIK. MIP(α)-E2A mit einem Plasmid, enthaltend das Neo'-Gen, in 293-Zellen cotransfiziert. Die 293-Zellen (ATCC CRL1573) wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Nährmedium (DMEM), 1 g/l Glucose (JRH Biosciences, Denver, PA), 10% Donor-Kälberserum (Tissue Culture Biologics, Tulare, CA), gezüchtet. Die Zellen wurden mit 5 × 105 pro 10 cm Platte 48 Stunden vor der Transfektion eingeimpft. Zehn mg von pIK6.1MIP(a)-ORF6 und 1 mg von pGEM-pgkNeo.pgkpolyA, codierend das Neomycin-Resistenzgen unter der Kontrolle des Mäuse-Phosphoglycerat-Kinase-Promotors, wurden durch Calciumphosphatmitfällung in 293-Zellen cotransfiziert [Wigler et al., Cell 16: 777-785 (1979)].
  • Fünfzig G418-resistente Klone wurden isoliert, expandiert und durch Southern Blotting auf Integration der E2A-Sequenz gescreent. Genomische DNA von jedem Klon wurde mit Xba I und Afl II digeriert und mit der E2A-Sonde hybridisiert. Zwölf von den insgesamt 50 gescreenten Klonen behielten mindestens eine Kopie des vorhergesagten 1,44-kb-Fragments für die intakte E2A-Region. Die Blots wurden noch einmal mit der E1-Sonde (Ad5-Hind-III-E-Fragment von mu 7,7-17,1) sondiert. Alle zwölf 293-E2A-Zellinien haben ein Fragment mit der gleichen Größe wie das in den parentalen 293-Zellen. Dieses Beispiel demonstriert, daß die Struktur des E1-Gens sich in diesen Zellinien nicht verändert hat und daß die Zellinien mindestens eine Kopie des E2A-Gens behalten.
  • BEISPIEL 25
  • Konstruktion der 293-E4/E2A-Zellinie
  • Das folgende Beispiel beschreibt die Konstruktion der 293-E4/E2A-Zellinien. Um eine Verpackungszellinie zu konstruieren, welche imstande ist, die Funktionen des E1, des E2A und des E4 in trans gleichzeitig zu komplementieren, wurde das Plasmid pIK.MIP(α)-E2A in 293-E4-Zellen mit einem Plasmid, enthaltend das Neo'-Gen, cotransfiziert. Die 293-E4-Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), 1 g/l Glucose (JRH Biosciences, Denver, PA), 10% Donor-Kälberserum (Tissue Culture Biologics, Tulare, CA) gezüchtet. Zellen wurden mit 5 × 105 pro 10 cm Platte 48 Stunden vor der Transfektion eingeimpft. Zehn mg von pIK6.1 MIP(α)-ORF6 und 1 mg von pGEM-pgkNeo.pgkpolyA, codierend das Neomycin-Resistenzgen unter der Kontrolle des Mäuse-Phosphoglycerat-Kinase-Promotors, wurden durch Calciumphosphatmitfällung in 293-Zellen cotransfiziert [Wigler et al., 1979]. Fünfzig G418-resistente Klone wurden isoliert, expandiert und für Integration der E2A-Sequenz durch Southern Blotting gescreent. Genomische DNA von jedem Klon wurde mit Xba und Afl II digeriert und mit der E2A-Sonde hybridisiert. Einundzwanzig von den insgesamt 50 gesreenten Klonen behielten mindestens eine Kopie von dem vorhergesagten 1,44-kb-Fragment für intakte E2A-Region. Die Blots wurden mit der E1-Sonde (Ad5-Hind-III-E-Fragment von mu 7,7-17,1) und E4-Sonde (Sma1-H-Fragment von mu 92-98,4) noch einmal sondiert. Alle einundzwanzig 293-E2A-Zellininen haben die gleichen integrierten E1- und E4-DNA-Muster wie diejenigen ihrer parentalen Zellinie 293-E4. Dieses Beispiel demonstriert, daß die Strukturen des E1- und E4-Gens in diesen Zellinien nicht geändert wurden und zusätzlich eine Kopie des E2A-Gens in allen von diesen Linien behalten wird.
  • BEISPIEL 26
  • Konstruktion von Virus-assoziiertem RNA-(VARNA)-Plasmid
  • Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion des pIK6.1-VARNA-Plasmids. Das pIK6.1-VARNA-Plasmid wurde von dem pIK6.1 abgeleitet, welches früher von Finer et al. in WO 94/29438 beschrieben wurde. Ein PCR-Produkt, welches Ad5-VA-RNA1- und VA-RNA2-Gen mit ihrem endogenen Promotor für RNA-Polymerase III von mu 29 bis 30,1 enthält, wurde in das pIK6.1-Plasmid kloniert. Das PCR-Produkt wurde unter Verwendung der Primer 5'-tactaacctaggACGCGGTCCCAGATGTTG-3' (Ad5 Nts 10504 bis 10521) (SEQ ID NO: 12) und 5'-tactaacactacCCGCTGCTCTTGCTCTTG-3' (Ad5 NTs 11095 bis 11112) (SEQ ID NO:13) erzeugt. Diese Sequenzen, enthaltend entweder die Avr-II- oder die Dra-III-Stelle, in Kleinbuchstaben waren vorhanden, um das Klonieren zu erleichtern (13). Das klonierte Virusassoziierte RNA-Gen wurde sequenziert, um die Genauigkeit der Sequenz zu verifizieren.
  • Die vorstehend beschriebenen speziellen Ausführungsformen der Erfindung sind daher als veranschaulichend und nicht als beschränkend anzusehen. Der Umfang der Erfindung ist wie in den angefügten Ansprüchen angegeben, anstatt auf die Beispiele, die in der vorhergehenden Beschreibung enthalten sind, begrenzt zu sein.
  • SEQUENZAUFLISTUNG
    Figure 00280001
  • Figure 00290001
  • Figure 00300001
  • Figure 00310001
  • Figure 00320001
  • Figure 00330001
  • Figure 00340001

Claims (25)

  1. DNA-Plasmid, umfassend einen offenen Leserahmen ORF6 des adenoviralen Genfragments E4, operabel verknüpft mit einem induzierbaren Promotor.
  2. DNA-Plasmid nach Anspruch 1, wobei der induzierbare Promotor ein cAMP-Response-Element (CRE) enthält.
  3. DNA-Plasmid nach Anspruch 2, wobei der induzierbare Promotor durwch ein CRE bindendes Protein reguliert wird.
  4. DNA-Plasmid nach Anspruch 2, wobei der induzierbare Promotor ein Säuger-alpha-Inhibin-Promotor ist.
  5. DNA-Plasmid nach Anspruch 4, wobei der induzierbare Promotor ein Mäuse-alpha-Inhibin-Promotor ist.
  6. DNA-Plasmid nach Anspruch l, wobei der induzierbare Promotor ein durch Arzneimittel induzierbarer, auf Tetracyclin ansprechender Promotor ist.
  7. DNA-Plasmid nach Anspruch 1, welches weiterhin ein adenovirales E2A-Genfragment, operabel verknüpft mit einem induzierbaren Promotor, exprimiert.
  8. DNA-Plasmid nach Anspruch 1, wobei das Plasmid pIK6.1 MIP(α) - E4 ORF6, bezeichnet als ATCC # 97325, ist.
  9. DNA-Plasmid nach Anspruch 1, wobei das Plasmid pIK6.1 MIP(α) - E4, bezeichnet als ATCC # 75879, ist.
  10. Verpackungszellinie, abgeleitet von einer 293-Zelle, die das Wachstum eines mutanten Adenovirus, defekt in der Replikation, oder eines rekombinanten adenoviralen Vektors unterstützt, wobei der Adenovirus oder adenovirale Vektor ein Transgen, eine letale Deletion oder Mutation in jeder von der frühen E1-Genregion und einer wesentlichen Region der frühen E4-Genregion umfaßt.
  11. Verpackungszellinie nach Anspruch 10, wobei der Adenovirus oder adenovirale Vektor weiterhin eine letale Deletion oder Mutation in der frühen E2A-Genregion umfaßt.
  12. Verpackungszellinie nach Anspruch 10, wobei der Adenovirus oder adenovirale Vektor weiterhin eine Deletion oder Mutation in der E3-Genregion umfaßt.
  13. Verpackungszellinie nach Anspruch 10, wobei die 293-Zellen Zellen, transfiziert mit dem E4-ORF6-DNA-Genfragment des Adenovirus 5, bezeichnet als ATCC CRL# 11990, sind.
  14. Verpackungszellinie nach Anspruch 10, die die Funktion der frühen E4-Genregion ausfüllt und das Wachstum eines mutanten Adenovirus unterstützt, wobei die Nucleotidsequenz, codierend die frühe E4-Genregion, operabel mit einem induzierbaren Promotor verknüpft ist.
  15. Verpackungszellinie nach Anspruch 14, die weiterhin die Funktion der frühen E2A-Genregion ausfüllt, wobei die Nucleotidsequenzen, codierend die frühe E2A- und E4-Genregion, operabel mit einem induzierbaren Promotor verknüpft sind.
  16. Verpackungszellinie nach den Ansprüchen 10, 11 oder 15, die die Funktion der frühen E1-, E2A- und E4-Genregion ausfüllt.
  17. Verpackungszellinie nach den Ansprüchen 12 oder 15, die weiterhin die Funktion der frühen E3-Genregion ausfüllt.
  18. Rekombinanter adenoviraler Vektor, wobei der Vektor ein Transgen, eine letale Deletion oder Mutation in der frühen E1-Genregion und eine letale Deletion oder Mutation in einer wesentlichen Region der frühen E4-Genregion umfaßt, so daß, wenn der resultierende rekombinante Adenovirus gewonnen wird, er zur Replikation Komplementation von sowohl der adenoviralen frühen E1- als auch der adenoviralen frühen E4-ORF6-Genregion erfordert.
  19. Rekombinanter adenoviraler Vektor nach Anspruch 18, wobei der Vektor weiterhin eines oder beide von einer letalen Deletion oder Mutation in der frühen E2A- und einer letalen Deletion oder Mutation in der frühen E3-Genregion umfaßt.
  20. Rekombinanter adenoviraler Vektor nach den Ansprüchen 18 oder 19, wobei das Transgen ein Cytokin-Gen, Suizid-Gen, Tumorsuppressor-Gen, Schutz-Gen oder virales Protein codiert.
  21. Verfahren zum Herstellen eines replikationsdefekten Adenovirus, wobei das Verfahren umfaßt: (a) Transfizieren der Verpackungszellinie nach Anspruch 10, 11, 12, 13 oder 14 mit einem rekombinanten adenoviralen Vektor, wobei der adenovirale Vektor ein Transgen und eine letale Deletion oder Mutation in der frühen E4-Genregion und eine letale Deletion oder Mutation in der frühen E1-Genregion umfaßt; und (b) Gewinnen des hergestellten replikationsdefekten Adenovirus.
  22. Verfahren zum Herstellen eines replikationsdefekten Adenovirus, wobei das Verfahren umfaßt: (a) Transfizieren der Verpackungszellinie nach Anspruch 11, 15 oder 16 mit einem rekombinanten adenoviralen Vektor, wobei der adenovirale Vektor ein Transgen, eine letale Deletion oder Mutation in der frühen E2A-Genregion und eine letale Deletion oder Mutation in der frühen E4-Genregion und der frühen E1-Genregion umfaßt; und (b) Gewinnen des hergestellten replikationsdefekten Adenovirus.
  23. In-vitro-Verfahren zum Exprimieren eines Transgens in einer Säugerzielzelle, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: (a) Infizieren der Zielzelle mit dem replikationsdefekten Adenovirus nach Anspruch 18, 19 oder 20; und (b) Exprimieren des Transgens in der Zielzelle.
  24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Transgen ein Cytokin-Gen, Suizid-Gen, Tumorsuppressor-Gen, Schutz-Gen oder virales Protein codiert.
  25. Säugerzielzelle, infiziert mit einem replikationsdefekten Adenovirus nach Anspruch 23.
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