ES2264136T3 - Preparaciones virales, vectores, inmunogenos y sus vacunas. - Google Patents

Abstract

UN VIRUS MUTANTE GENETICAMENTE DESACTIVADO QUE POSEE UN GENOMA QUE ES DEFECTUOSO EN UN GEN SELECCIONADO ESENCIAL PARA LA PRODUCCION DE NUEVAS PARTICULAS VIRICAS INFECCIOSAS, Y QUE ES PORTADOR DE MATERIAL GENETICO HETEROLOGO QUE CODIFICA UNA PROTEINA INMUNOMODULADORA TAL COMO GM DO QUE EL VIRUS MUTANTE PUEDE INFECTAR CELULAS HOSPEDADORAS NORMALES Y CAUSAR LA EXPRESION DE UNA PROTEINA INMUNOMODULADORA, PERO EL VIRUS MUTANTE NO PUEDE CAUSAR LA PRODUCCION DE NUEVAS PARTICULAS VIRICAS INFECCIOSAS EXCEPTO CUANDO INFECTA CELULAS HOSPEDADORAS COMPLEMENTADORAS RECOMBINANTES QUE EXPRESAN UN GEN QUE PROPORCIONA LA FUNCION DEL GEN VIRICO ESENCIAL; EL SITIO DE INSERCION DEL MATERIAL GENETICO HETEROLOGO QUE CODIFICA LA PROTEINA INMUNOMODULADORA SE ENCUENTRA PREFERENTEMENTE EN EL SITIO DEL DEFECTO EN EL GEN VIRICO ESENCIAL SELECCIONADO. LOS USOS INCLUYEN EL USO TERAPEUTICO Y PROFILACTICO EN LA GENERACION DE UNA RESPUESTA INMUNITARIA EN UN SUJETO TRATADO CON EL MISMO; EL USO EN LA PREPARACION DE UN INMUNOGENO TAL COMO UNA VACUNA PARA SER UTILIZADA EN TERAPIA TUMORAL; EL USO EN LA EXPANSION IN VITRO (POR EJEMPLO ESPECIFICAS DE VIRUS) DE CELULAS T CITOTOXICAS; Y EL USO TERAPEUTICO O PROFILACTICO EN TERAPIA GENICA CORRECTORA.

Description

Preparaciones virales, vectores, inmunógenos y sus vacunas.

La presente invención se refiere a preparaciones virales, inmunógenos, vacunas y agentes inmunoterapéuticos, y en particular a virus mutantes, a su cultivo, a vacunas y a la preparación y utilización de los mismos, por ejemplo, como vectores para la inducción de respuestas inmunes o para la terapia génica correctora.

Antecedentes y la técnica anterior

Los virus vivos atenuados, incluyendo los recombinantes diseñados genéticamente, son conocidos como vectores de vacuna útiles. El genoma del virus vivo puede diseñarse para que incluya genes que codifican antígenos heterólogos contra los que se desean respuestas inmunológicas, de tal manera que la capacidad de replicación del virus vivo se conserva, y el gen heterólogo se expresa en las células infectadas por el virus recombinante. De esta manera, los antígenos expresados se encuentran disponibles para provocar una respuesta inmune útil. Los antígenos heterólogos pueden originarse a partir de un patógeno infeccioso, con el fin de que pueda montarse una respuesta inmune protectora o terapéutica contra el agente infeccioso, aunque alternativamente pueden representar antígenos específicos de una célula tumoral o antígenos asociados a un tumor; en la presente invención el objetivo es inducir una respuesta inmune contra las células tumorales, con el fin de inducir el rechazo o regresión del tumor.

Más generalmente, los vectores virales recombinantes se encuentran entre varios agentes conocidos para la introducción de genes foráneos en las células de manera que puedan expresarse en forma de proteína. Un elemento central es el propio gen diana bajo el control de una secuencia promotora adecuada que puede funcionar en la célula que va a transducirse. Entre las técnicas conocidas se incluyen los procedimientos no virales, tales como la simple adición del constructo de gen diana en forma de ADN libre; la incubación con complejos del ADN diana y proteínas específicas diseñadas para la incorporación del ADN en la célula diana; y la incubación con ADN diana encapsulado, por ejemplo, en liposomas, u otros agentes de transfección basados en lípidos.

Una opción adicional es la utilización de vectores virales recombinantes diseñados para que contengan el gen diana requerido, y capaces de infectar las células diana y, por lo tanto, de transportar en la célula el gen diana en una forma que pueda expresarse. Se ha utilizado una serie de virus diferentes para este fin, incluyendo retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados.

El documento de patente EP 0 176 170 (Institut Merieux: B., Roizman) describe genes foráneos insertados en un genoma de virus del herpes simplex bajo el control de regiones promotoras-reguladoras del genoma, permitiendo de esta manera la expresión del gen foráneo. Se dan a conocer constructos de ADN, vectores plásmido que contienen los constructos útiles para la expresión del gen foráneo, virus recombinantes producidos con el vector, y procedimientos asociados.

El documento de patente EP 0 448 650 (General Hospital Corporation: A.I. Geller, X.O. Breakefield) describe vectores de expresión de virus herpes simplex de tipo 1 capaces de infectar y de propagarse en una célula no mitótica, y para la utilización en el tratamiento de enfermedades neurológicas, y para producir modelos animales e in vitro de estas enfermedades.

Son conocidos virus recombinantes en particular para la utilización en terapia génica aplicada a condiciones de deficiencia génica.

Entre los ejemplos de genes utilizados o propuestos para su utilización en la terapia génica se incluyen: el gen de la adenosina desaminasa humana (ADA), tal como se menciona, por ejemplo, en WO 92/10564 (K.W. Culver et al., U.S. Secretary for Commerce and Cellco Inc.), WO 89/12109 y EP 0 420 911 (I.H. Pastan et al.); el gen de la fibrosis quística y sus variantes, descrito en WO 91/02796 (L-C, Tsui et al., HSC Research y University of Michigan), en WO 92/05273 (F.S. Collins y J.M. Wilson, University of Michigan) y WO 94/12649 (R.J. Gregory et al., Genzyme Corp.).

La técnica anterior del tratamiento de los tumores malignos incluye estudios que han subrayado el potencial de la vacunación terapéutica contra tumores utilizando material autólogo derivado del tumor del propio paciente. La teoría general en la que se basa este enfoque es que las células tumorales pueden expresar una o más proteínas u otras macromoléculas biológicas que son diferentes de las de las células sanas normales, y por lo tanto podrían utilizarse para dirigir una respuesta inmune para que reconozca y destruya las células tumorales.

Estas dianas tumorales pueden encontrarse presentes ubicuamente en tumores de un tipo determinado. Un buen ejemplo de esto es el cáncer cervical, en el que la gran mayoría de tumores expresan las proteínas E6 y E7 del papilomavirus humano. En este caso, la diana tumoral no es una autoproteína y, por lo tanto, su potencial como marcador específico de tumor único en la inmunoterapia del cáncer resulta claro.

Existe la evidencia creciente de que determinadas autoproteínas también podrían utilizarse como antígenos tumorales diana. Esto se basa en la observación de que se expresan consistentemente en las células tumorales, pero no en las células sanas normales. Entre los ejemplos de éstas se incluyen la familia MAGE de proteínas. Se considera que quedan por identificar más autoproteínas útiles como dianas tumorales.

Los antígenos asociados a tumores y su papel en la inmunobiología de determinados cánceres se comenta, por ejemplo, en P. van der Bruggen et al., Current Opinion in Immunology 4(5):608-612, 1992. Otros antígenos similares, de la serie MAGE, se identifican en T. Boon, Adv. Cancer Res. 58:177-210, 1992, y MZ2-E y otros antígenos tumorales relacionados se identifican en P. van der Bruggen et al., Science 254:1643-1647, 1991; las mucinas asociadas a tumores se mencionan en P.O. Livingston, Current Opinion in Immunology 4(5):624-629, 1992, por ejemplo MUC1, mencionada en J. Burchell et al., Int. J. Cancer 44:691-696, 1989.

De esta manera, aunque se han identificado y caracterizado algunos marcadores específicos de tumores potencialmente útiles, la búsqueda de marcadores nuevos y quizás más específicos es laboriosa y larga, y sin garantía de éxito.

Se ha probado la administración a mamíferos de citoquinas como tales, pero con frecuencia resultan mal toleradas por el huésped y con frecuencia se asocian a diversos efectos secundarios, entre ellos náuseas, dolor óseo y fiebre (A. Mire-Sluis, TIBTech vol. 11, 1993; M.S. Moore, en Ann. Rev. Immunol. 9:159-91, 1991). Estos problemas se ven exacerbados por los niveles de dosis que con frecuencia resultan necesarios para mantener concentraciones plasmáticas eficaces.

Se han propuesto vectores de virus para la utilización en la inmunoterapia del cáncer para proporcionar un medio para potenciar la respuesta inmunológica frente al tumor.

Es conocida la modificación de vectores de virus vivos para que contengan genes que codifican una citoquina o un antígeno tumoral: ver el documento WO 94/16716 (E. Paoletti et al., Virogenetics Corp.) y las referenciadas citadas en la misma, WO 94/16716 describe, para la utilización en la terapia del cáncer, virus vaccinia recombinantes atenuados que contienen ADN que codifica una citoquina o un antígeno tumoral. Las citoquinas son ejemplos de proteínas inmunomoduladoras. Las proteínas inmunoduladoras que potencian la respuesta inmunológica, tales como las citoquinas, la interleuquina 1, la interleuquina 2 y el factor estimulante de las colonia de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) (ver, por ejemplo, A.W. Heath et al., Vaccine 10(7), 1992, y Tao Mi-Hua et al., Nature 362, 1993, pueden ser adyuvantes de vacuna eficaces.

Se ha propuesto utilizar células tumorales transducidas con GMCSF como vacuna terapéutica contra el cáncer renal. Los protocolos para los ensayos correspondientes implican la extracción de material tumoral de los pacientes, y posteriormente la transducción con el gen inmunomodulador apropiado. Las células diseñadas seguidamente se reintroducen en el paciente para estimular una respuesta inmune beneficiosa.

Aunque se ha propuesto introducir genes inmunomoduladores en determinados tipos de células tumorales, se considera que los procedimientos existentes presentan limitaciones, tanto si las dificultades son debidas a cantidades cuantitativas bajas de transducción, a la complejidad, o a los efectos secundarios no deseables de los sistemas utilizados.

Recientemente, se ha descrito un melanoma murino intracraneal experimental tratado con el mutante 1716 neuroatenuado de HSV1 (B.P. Randazzo et al., Virology 211:94-101, 1995), del que la replicación aparentemente se encontraba limitada a las células tumorales y no se producía en el tejido cerebral circundante.

Además, los vectores basados en el virus herpes saimiri, un virus de primates no humanos, se ha descrito que conduce a la expresión génica en células linfoides humanas (B. Fleckenstein y R. Grassmann, Gene 102(2):265-9, 1991). Sin embargo, se considera no deseable utilizar estos vectores en un contexto clínico.

En la técnica anterior se incluye el documento WO 92/05263 (Inglis et al., Immunology Limited) (el contenido del cual se incorpora en la presente memoria como referencia), que describe, por ejemplo, la utilización como vacuna de un virus mutante cuyo genoma es defectuoso con respecto a un gen esencial para la producción de virus infeccioso, de manera que el virus puede infectar células huésped normales y llevar a cabo la replicación y expresión de los genes de antígeno viral en estas células, pero no puede producir virus infecciosos. El documento WO 92/05263 describe particularmente un virus HSV que se incapacita mediante la deleción de un gen que codifica la glucoproteína esencial H (gH), que resulta necesaria para la infectividad del virus (A. Forrester et al., J. Virol. 66:341-348, 1992). En ausencia de expresión de proteína gH, se producen partículas del virus no infecciosas que proporcionan prácticamente el repertorio completo de proteínas virales. Estos virus de progenie, sin embargo, no son capaces de infectar las células huésped, evitándose la expansión del virus dentro del huésped. Este virus se ha demostrado que constituye una vacuna efectiva en sistemas modelo animales (Farrell et al., J. Virol. 68:927-932, 1994; McLean et al., J. Infect. Dis. 170:1100-9, 1994). Estos virus mutantes pueden cultivarse en una línea celular que expresa el producto génico con respecto al cual el virus mutante es defectuoso. Las líneas celulares que resultan adecuadas para el cultivo de determinados virus de este tipo se han descrito en la literatura: por ejemplo en las referencias proporcionadas en el documento citado WO 92/05263.

Los datos completos o sustancialmente completos de secuencia se han publicado para varios virus, tales como el virus de Epstein-Barr (EBV) (Baer et al., Nature 310:207, 1984), el citomegalovirus humano (CMV) (Weston y Barrell, J. Mol. Biol. 192:177-208, 1986), el virus de la varicela-zóster (VZV) (Davison y Scott, J. Gen. Virol. 67:759-816, 1986) y el virus herpes simplex (HSV) (McGeoch et al., J. Gen. Virol. 69:1531-1574, 1988). La glucoproteína H es conocido que presenta homólogos en los virus EBV, CMV y VZV (Desai et al., J. Gen Virol. 69:1147, 1988).

Los vectores de virus proporcionan una oportunidad para la administración intracelular de ADN y de proteína para la inmunización y la terapia génica, por ejemplo la terapia génica correctora, así como para la utilización en, por ejemplo, la inmunoterapia del cáncer, aunque para la técnica anterior todavía resulta deseable proporcionar vectores virales y procedimientos adicionales útiles para la transformación de células animales humanas y no humanas y la expresión de proteínas en las mismas.

Descripción resumida y detallada de la invención

De acuerdo con la presente invención, tal como se describe en más detalle posteriormente, una vacuna de virus herpes mutante inactivada genéticamente (incapacitada genéticamente) proporciona un portador útil para los genes codificantes de proteínas inmunomoduladoras, y de esta manera puede utilizarse como vector viral. La vacuna de virus herpes puede infectar células, por ejemplo de un sujeto vacunado, conduciendo a la síntesis intracelular de antígenos virales, así como de las proteínas inmunomoduladoras. De esta manera, la respuesta inmune frente al virus puede, en determinados ejemplos de la invención, potenciarse, se prepare contra los antígenos codificados por el virus o en respuesta a la proteína inmunomoduladora codificada por el virus. Si la vacuna inactivada genéticamente también actúa como vector para la liberación de antígenos foráneos, la respuesta inmune contra el antígeno foráneo también puede potenciarse.

Sin embargo, debido a que el virus de la vacuna puede experimentar únicamente un ciclo de replicación en las células del huésped vacunado, la producción de las proteínas inmunomoduladoras se encuentra confinada al sitio de vacunación, al contrario de la situación de un virus de replicación competente, en el que la infección puede extenderse por todo el cuerpo. Además, las cantidades globales producidas, aunque localmente suficientes para estimular una respuesta inmune vigorosa, serán considerablemente menores que las producidas por un virus de replicación competente, y de esta manera resulta mucho menos probable que se produzcan respuestas sistémicas adversas.

Se considera una ventaja proporcionar a una vacuna para el herpes o a un sistema de vectores, la ventaja inmunológica de un virus o de un vector de virus vivo conjuntamente con la ventaja de la producción local de proteína inmunomoduladora, y que minimiza el riesgo potencial para el sujeto vacunado de padecer una patología no prevista, evitando también el potencial riesgo ambiental de permitir la extensión de un patógeno replicante nuevo y potencialmente perjudicial.

La administración de citoquina como tal con frecuencia resulta mal tolerada por el huésped y con frecuencia se asocia con varios efectos secundarios, entre ellos náuseas, dolor óseo y fiebre (A. Mire-Sluis, TIBTech vol. 11, 1993; M.S. Moore, Ann. Rev. Immunol. 9:159-91, 1991). Estos problemas se ven exacerbados por los niveles de dosis requeridos con frecuencia para mantener concentraciones plasmáticas efectivas. Para reducir la toxicidad sistémica, se propone una administración más dirigida de citoquina activa, tal como se describe en la presente memoria.

Un enfoque anterior para resolver este problema ha sido fusionar antígeno y genes de citoquina para crear un solo polipéptido bifuncional (M. Hazama et al., Vaccine 11:6, 1993).

Un enfoque alternativo es incorporar una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína inmunomoduladora en una vacuna de virus vivos. El documento WO 94/16716 (E. Paoletti et al., Virogenetics Corp.) describe un virus vaccinia recombinante atenuado que contiene ADN que codifica citoquinas o antígenos tumorales para la utilización en la terapia del cáncer.

Los vectores virales han encontrado aplicación en la inmunoterapia del cáncer mediante la disposición de un medio para potenciar la respuesta inmunológica frente a los tumores.

Sin embargo, los presentes inventores consideran que la utilización de virus vivos para transportar genes inmunomoduladores puede comportar un riesgo para la comunidad, además de para los individuos vacunados. Un virus de vacuna que sea incapaz de extenderse de célula a célula, tal como la proporcionada por la invención descrita en la presente memoria, proporciona una considerable ventaja de seguridad, debido a que, en circunstancias normales, las vacunas no pueden transmitirse a otros individuos.

Una circunstancia no habitual en la que podría surgir un riesgo de transmisión, sin embargo, es que, si la recombinación se produce entre el virus genéticamente inactivado y un virus de tipo salvaje de origen natural presente dentro del vacunado, podría producirse la transferencia del gen inmunomodulador al genoma del virus natural, o la reconstitución de la competencia de replicación por el virus de la vacuna a través de la adquisición del gen ausente. Es bien conocido que la recombinación homóloga entre virus estrechamente relacionados puede producirse a frecuencias relativamente elevadas cuando las células resultan simultáneamente infectadas por ambos virus. Sin embargo, esta potencial capacidad puede evitarse garantizando, tal como resulta preferente de acuerdo con la presente descripción, que el gen inmunomodulador se inserte en el punto del genoma del virus de la vacuna donde se ha eliminado el gen esencial. La consecuencia de este modo de construcción es que la recombinación homóloga con un virus de tipo salvaje, si en efecto se produjese dentro del huésped vacunado, no puede dar lugar a la producción de un nuevo virus que sea tanto de replicación competente como portador del gen inmunomodulador (figura 7 de los dibujos adjuntos). Esto es debido a que la transferencia del gen eliminado de vuelta al virus de la vacuna conduciría a la pérdida de las secuencias heterólogas insertadas en ese sitio. De la misma manera, la transferencia de las secuencias heterólogas al virus de tipo salvaje daría lugar a la pérdida de un gen esencial.

De acuerdo con la presente invención, por lo tanto, se proporciona un virus herpes mutante que presenta un genoma que es defectuoso con respecto a un primer gen esencial para la producción de virus infeccioso, y que incluye una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una proteína inmunomoduladora. Además, en determinadas realizaciones el virus también puede codificar un antígeno heterólogo, por ejemplo un antígeno viral o no viral, por ejemplo un antígeno tumoral.

Los virus herpes mutantes pueden estar basados, por ejemplo, en HSV1, HSV2, VZV, CMV, EBV, HHV6, HHV7 o en virus herpes animales no humanos, tales como PRV, IBRV/BHV, MD, EHV y otros.

El genoma del virus herpes mutante es defectivo con respecto a un gen seleccionado esencial para la producción de virus infeccioso por parte de las células huésped infectadas, de manera que el virus puede infectar células huésped normales (es decir, células diferentes de aquéllas que se han mutado de manera que expresen el producto del gen esencial para el que es defectivo el virus) y provocar la replicación vírica y la expresión de genes de antígeno vírico en aquellas células, pero no puede causar la producción de virus infecciosos normales. En este virus mutante, el defecto genético puede ser tal (por ejemplo la deleción de gH o gD de virus herpes) que permita la producción y liberación de partículas víricas no infecciosas cuando el virus mutante infecta células huésped diferentes a dichas células huésped complementarias recombinantes.

De esta manera, la presente invención proporciona un virus herpes mutante cuyo genoma es defectivo con respecto a un gen esencial para la producción de virus infeccioso, de manera que el virus puede infectar células normales y replicarse en las mismas para dar lugar a la producción y liberación de las células de partículas víricas no infecciosas, y contiene por lo menos una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica por lo menos una proteína inmunomoduladora. Un solo vector vírico puede transportar una pluralidad de secuencias heterólogas, codificantes si se desea de una pluralidad de proteínas inmunomoduladoras. Alternativamente, pueden utilizarse las mezclas de vectores que contienen, cada una, una secuencia heteróloga respectiva de ácidos nucleicos codificante de una proteína inmunomoduladora.

La presente invención también proporciona un virus herpes mutante cuyo genoma es defectivo con respecto a un gen esencial para la producción de virus infeccioso y que transporta material genético codificante de un inmunógeno o de una pluralidad de inmunógenos de un patógeno exógeno al virus, de manera que el virus puede infectar células normales y experimentar cierto nivel de replicación y de expresión del material genético codificante del inmunógeno, pero no puede producir partículas víricas infecciosas, y contiene una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una proteína inmunomoduladora.

Tal como se utiliza en la presente invención, la expresión "proteína inmunomoduladora" y términos relacionados incluyen una o más proteínas que potencia o que suprime la respuesta inmunológica del huésped frente a un virus mutante o proteína codificada en el mismo, o frente a un antígeno, de manera que las proteínas inmunomoduladoras no son normalmente aquellas proteínas utilizadas actualmente como inmunógenos (antígenos) en sí mismos. Una proteína inmunomoduladora puede ser un elemento natural de un sistema inmunológico humano o animal no humano, por ejemplo de un sistema inmunológico de mamífero, con una capacidad de unión funcional con otro constituyente natural de dicho sistema inmunológico. Alternativamente, una proteína inmunomoduladora puede ser una proteína codificada por un patógeno, que presenta una capacidad de unión funcional con un constituye natural de dicho sistema inmunológico. Alternativamente, una proteína inmunomoduladora puede ser una proteína artificial, por ejemplo un fragmento de una proteína inmunomoduladora natural, o una muteína de dicha proteína o fragmento, o una proteína de fusión que incorpora cualquiera de ellas. Muchas proteínas inmunomoduladoras, y materiales genéticos que las codifican, y sus secuencias de nucleótidos y de aminoácidos son conocidas de la literatura en la materia, y se encuentran disponibles en bases de datos de secuencias genéticas, tales como la base de datos EMBL, y varias se encuentran disponibles comercialmente en la forma de material genético de ingeniería genética para la clonación y otras manipulaciones.

Las proteínas inmunomoduladoras para las que las secuencias de nucleótidos codificantes son transportadas expresablemente por vectores virus herpes mutantes, tal como se describen en la presente memoria, por ejemplo pueden ser útilmente de secuencias que son nativas respecto a la especie que debe recibir la vacunación con los virus recombinantes, por ejemplo una proteína inmunomoduladora de tipo humano para el tratamiento de un sujeto humano.

La proteína o proteínas pueden seleccionarse en determinados ejemplos de la invención para potenciar el efecto del virus herpes mutante como inmunógeno, por ejemplo como vacuna. Los potenciales riesgos asociados a la expresión de estas proteínas en un virus completamente replicante pueden evitarse con el carácter defectivo del vector utilizado, tal como se describe en la presente invención.

Entre los ejemplos de proteínas inmunomoduladoras útiles se incluyen citoquinas, quimoquinas, componentes del complemento, moléculas de adhesión y accesorias del sistema inmunológico y sus receptores, de especificidad humana o animal no humana. Entre los ejemplos útiles se incluyen GM-CSF, IL-2, IL-12, OX40, OX40L (gp34), linfotactina, CD40 y CD40L. Entre los ejemplos útiles adicionales se incluyen interleuquinas, por ejemplo las interleuquinas 1 a 15, los interferones alfa, beta o gamma, el factor de necrosis tumoral, el factor estimulante de las colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), el factor estimulante de las colonias de granulocitos (G-CSF), quimoquinas, tales como la proteína activadora de neutrófilos (NAP), el factor quimoatrayente y activador de macrófagos (MCAF). Son ejemplos útiles adicionales de proteínas inmunomoduladoras, RANTES, los péptidos inflamatorios de macrófagos MIP-1a y MIP-1b, componentes del complemento y sus receptores, o una molécula accesoria, tal como B7.1, B7.2, ICAM-1, 2 ó 3, y receptores de citoquina, OX40 y ligando de OX40 (gp34). Las proteínas inmunomoduladoras pueden ser, para diversos propósitos, de especificidad humana o animal no humana y pueden representarse para los presentes propósitos, según el caso y según resulte conveniente, como dominios extracelulares y otros fragmentos con actividad de unión de las proteínas de origen natural y las muteínas de las mismas, y sus proteínas de fusión con otras secuencias polipeptídicas, por ejemplo con dominios constantes de cadena pesada de inmunoglobulina. Donde se insertan secuencias de nucleótidos codificantes de más de una proteína inmunomoduladora, pueden comprender, por ejemplo, más de una citoquina o una combinación de una o más citoquinas y una o más moléculas accesorias/de adhesión.

La respuesta inmunológica inducida mediante la utilización de estos vectores codificantes de dichos productos pueden incluir respuestas inmunológicas de una diversidad de tipos que pueden resultar estimuladas por el virus, por ejemplo una respuesta contra una proteína codificada víricamente y/o una respuesta contra un antígeno del huésped, siendo una respuesta estimulada por el vector vírico o por la expresión del gen heterólogo codificado en el mismo. Entre los usos de los vectores virus mutantes, tales como los descritos en la presente memoria, se encuentra, por ejemplo, proteger a un sujeto de una especie susceptible frente a la infección por un virus de tipo salvaje correspondiente cuando el sujeto se trata con el mismo, por ejemplo se infecta con el mismo, por ejemplo mediante inmunización directa.

El material genético codificante de una proteína inmunomoduladora puede transportarse en el genoma vírico mutante en forma de marco de lectura abierto expresable codificante de una proteína híbrida o de fusión que comprende una región polipeptídica que presenta homología con, y funcionalidad de, una proteína inmunomoduladora, ligada a una región polipeptídica que presenta otra homología, y opcionalmente otra funcionalidad. Por ejemplo, la proteína inmunomoduladora puede ser, comprender o corresponder en funcionalidad, a la proteína gp4 identificada como pareja de unión de la OX-40 humana (ver W. Godfrey et al., J. Exp. Med. 180(2):757-762, 1994, y referencias citadas en la misma, incluyendo S. Miura et al., Mol. Cell Biol. 11(3):1313-1325, 1991). La versión de esta funcionalidad de proteína que puede encontrarse codificada en el genoma vírico mutante puede corresponder a la secuencia de la gp34 natural misma, o de un fragmento de ella, o a un producto de expresión híbrida, por ejemplo basado en el dominio (de unión) extracelular C-terminal de gp34 fusionado a otra proteína, por ejemplo a la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina, tal como la IgG1 humana, por ejemplo con el dominio extracelular de gp34 (una proteína membranal de tipo 2) fusionada en su extremo N-terminal con el extremo C-terminal del dominio constante de inmunoglobulina.

Otras de las proteínas inmunomoduladoras también pueden ser transportadas y expresadas en dichas formas derivadas e híbridas. Asimismo, se entiende que pueden incorporarse las secuencias de aminoácidos de dichas proteínas inmunomoduladoras. En la presente invención se incluyen proteínas que presentan secuencias mutadas de manera que siguen siendo homólogas, por ejemplo en secuencia, función y carácter antigénico, con una proteína que presenta la secuencia parental correspondiente. Estas mutaciones pueden ser preferentemente, por ejemplo, mutaciones que implican cambios conservativos de aminoácidos, por ejemplo cambios entre aminoácidos de propiedades moleculares generalmente similares. Por ejemplo, los intercambios dentro del grupo alifático de alanina, valina, leucina e isoleucina pueden considerarse conservativos. En ocasiones, la sustitución de glicina por una de estos también puede considerarse conservativa. Los intercambios dentro del grupos alifático de aspartato y glutamato también pueden considerarse conservativos. Los intercambios dentro del grupo amida de asparagina y glutamina también pueden considerarse conservativos. Los intercambios dentro del grupo hidroxi de serina y treonina también pueden considerarse conservativos. Los intercambios dentro del grupo aromático de fenilalanina, tirosina y triptófano también pueden considerarse conservativos. Los intercambios dentro del grupo básico de lisina, arginina e histidina también pueden considerarse conservativos. Los intercambios dentro dl grupo que contiene azufre de metionina y cisteína también pueden considerarse conservativos. En ocasiones, la sustitución dentro del grupo metionina y leucina también puede considerarse conservativo. Los grupos de sustitución conservativa preferentes son aspartato-glutamato, asparagina-glutamina, valina-leucina-isoleucina, alanina-valina, fenilalanina-tirosina y lisina-arginina. En otros aspectos, las secuencias mutadas pueden comprender inserciones y/o deleciones.

En determinados ejemplos, la proteína inmunomoduladora puede comprender una citoquina, preferentemente un factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), por ejemplo murina o preferentemente GM-CSF humana.

Los GM-CSFs murinos y humanos son conocidos: el gen de GM-CSF murino codifica un polipéptido de 141 aminoácidos, la glucoproteína secretada madura presenta un peso molecular comprendido entre 14 y 30 kdaltons dependiendo del grado de glucosilación. GM-CSF genéricamente es un miembro de la familia de los factores de crecimiento hematopoyéticos y se definió e identificó por primera vez por su capacidad de estimular la formación de colonias in vitro en progenitores hematopoyéticos. GM-CSF es un activador potente de neutrófilos, eosinófilos y función de macrófagos-monocitos, potenciando la migración, la fagocitosis, la expresión del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) e iniciando una cascada de moléculas bioactivas que estimula adicionalmente el sistema inmunológico. GM-CSF actualmente se está evaluando clínicamente para el tratamiento de la neutropenia secundaria a quimioterapia y como adyuvante en la terapia del cáncer.

La secuencia de nucleótidos heteróloga utilizada puede comprender un gen heterólogo, un fragmento génico o una combinación de genes con la condición de que codifique una proteína inmunomoduladora tal como se ha definido anteriormente.

De acuerdo con los ejemplos de la invención, pueden codificarse combinaciones de dos o más proteínas inmunomoduladoras para los fines indicados en la presente memoria dentro de un vector virus, o de una mezcla de dos o más vectores, conteniendo cada uno de ellos por lo menos un gen codificante de un producto inmunomodulador diferente. En ejemplos particulares, proporcionados únicamente a título ilustrativos y no limitativo, las combinaciones que implican IL2, GMCSF, linfotactina y/o CD40L pueden utilizarse en combinaciones de ellos y con otras de las proteínas inmunomoduladoras indicadas anteriormente. Cada una de las otras combinaciones binarias de las proteínas inmunomoduladoras indicadas anteriormente también se proporcionan en la presente exposición, y dentro del alcance de la misma.

Los ejemplos de virus herpes mutante tal como se proporcionan en la presente memoria pueden ser capaces de proteger una especie susceptible, inmunizada con el mismo, frente a la infección por el virus de tipo salvaje correspondiente. El virus mutante también puede incluir una mutación que permite que provoque la expresión en células huésped del antígeno, por ejemplo correspondiente a otro patógeno, por ejemplo de un patógeno bacteriano o vírico, y de esta manera ser capaz de proporcionar inmunidad frente a este otro patógeno al huésped de una especie susceptible inmunizada con este virus mutante.

Son ejemplos de dichos antígenos las proteínas L1 y L2 del virus del papiloma, las proteínas de VIH, gag, pol, env y nef, antígenos de clamidia (tales como la proteína principal de membrana exterior MOMP de clamidia) y las proteínas de choque térmico de clamidia.

Alternativamente, el antígeno puede ser un antígeno asociado a tumor con el que se potencia la actividad antitumoral de los CTLs asociados con la reducción de las células tumorales. Se ha descubierto que citoquinas específicas, tales como el factor \alpha de necrosis tumoral, el interferón gamma, la interleuquina 2, la interleuquina 4 y la interleuquina 7 resultan particularmente útiles en este aspecto. Los antígenos asociados a tumores y su papel en la inmunobiología de determinados cánceres se comenta, por ejemplo, en P. van der Bruggen et al., Current Opinion in Immunology 4(5):608-612, 1992. Son ejemplos particulares de estos antígenos que se contemplan para la utilización en el contexto de la presente solicitud los antígenos E6 y E7 del papilomavirus humano (especialmente, por ejemplo, de los tipos 6, 11, 16, 18, etc.); las proteínas derivadas del virus de Epstein-Barr, por ejemplo aquéllas identificadas en las referencias 24 y 25 en Pl. van der Bruggen et al., citadas anteriormente; los antígenos de la serie MAGE, tales como los identificados en T. Boon, Adv. Cancer Res. 58:177-210, 1992 y/o MZ2-E y otros antígenos, tales como los identificados en P. van der Bruggen et al., Science 254:1643-1647 1991, las proteínas del melanoma, por ejemplo la tirosinasa humana, y mucinas, tales como aquéllas identificadas en P.O. Livingston, Current Opinion in Immunology 4(5):624-629, 1992, por ejemplo MUC1 tal como se identifica en J. Burchell et al., Int. J. Cancer 44:691-696, 1989.

En general, los virus mutantes pueden basarse en un virus herpes, tal como un virus herpes simplex. El primer gen, al que se ha hecho referencia anteriormente, puede ser el gen de la glucoproteína gH.

Los defectos en el primer gen pueden comprender la deleción o la inactivación completa o parcial. El gen puede inactivarse, por ejemplo, mediante cualquier mutación que bloquee la expresión, por ejemplo mutaciones puntuales o de promotor o mutaciones por inserción inactivantes. Preferentemente, el primer gen se deleciona en su totalidad.

Las secuencias de nucleótidos heterólogas insertadas en el genoma de determinados ejemplos del virus herpes mutante pueden expresarse en células infectadas, por ejemplo en el sitio de inoculación, y pueden expresarse durante la latencia en las neuronas infectadas. La expresión de las secuencias de nucleótidos heterólogas puede regularse a dos niveles, mediante selección de un promotor adecuado, y mediante las limitaciones inherentes del virus mutante mismo. La secuencia heteróloga puede situarse bajo el control de cualquiera de entre una amplia diversidad de promotores víricos conocidos, por ejemplo un promotor IE de CMV, o bajo el control de un promotor conocido específico de tejido de mamífero, por ejemplo un promotor específico de tejido. La expansión del virus mutante dentro del huésped es autolimitante y por lo tanto la expresión de la secuencia de nucleótidos heteróloga en estos casos se encuentra restringida a la duración de la expresión intracelular en el sitio de inoculación. Puede seleccionarse un promotor adecuado, inducible o constitutivo, de origen vírico o celular, para permitir la regulación más precisa de la expresión génica y la concentración de proteínas. La secuencia génica puede ser nativa o modificada para permitir la localización de la proteína dentro de un compartimiento celular especificado.

En una realización preferente, la secuencia de nucleótidos heteróloga codificante de una proteína inmunomoduladora se inserta en el genoma del virus herpes mutante en el sitio del primer gen: más preferentemente, sustituye completamente dicho primer gen, que se deleciona en su totalidad. De esta manera, incluso si tiene lugar cualquier suceso de recombinación no deseada, que resulte en la reinserción del primer gen procedente de una fuente de tipo salvaje en el virus mutante, resultaría más probable eliminar la secuencia de nucleótidos heteróloga insertada. Esto evitaría la posibilidad de que se produjese un portador vírico de replicación competente. Este suceso de recombinación resultaría extremadamente raro, pero en la presente realización, resultarían minimizados los efectos perjudiciales de este suceso.

Una ventaja de los ejemplos inmunogénicos de la invención es proporcionar el direccionamiento de antígenos intracelulares que pueden estimular la inmunidad mediada tanto por anticuerpos como por células, y la producción de concentraciones localizadas eficaces de citoquinas en presencia de antígenos sin inducir toxicidad sistémica. Por ejemplo, la expresión de GM-CSF en un animal vacunado con este vector vírico, en células del animal tratado que se han infectado con el vector, producida como resultado de la presencia de un gen codificante de GM-CSF en el vector vírico infectivo, puede potenciar útilmente el nivel de respuesta específica y/o neutralizadora de anticuerpos por el animal vacunado frente a los antígenos víricos o tumorales.

La combinación de citoquinas y antígenos puede potenciar la respuesta del huésped frente al antígeno asociado. A su vez, esto puede incrementar la inmunogenicidad de proteínas pobremente inmunogénicas, y puede permitir una reducción de dosis con antígenos más efectivos.

Pueden utilizarse ejemplos de virus herpes mutantes proporcionados en la presente invención como inmunógenos, por ejemplo para la utilización profiláctica o terapéutica en la producción de una respuesta inmunológica en un sujeto tratado con los mismos. Las realizaciones de la invención también permiten la utilización de un virus mutante tal como se proporciona en la presente memoria proporcionado en la preparación de un inmunógeno, tal como una vacuna para la utilización terapéutica o profiláctica. Una aplicación particular es en el campo de la terapia tumoral tal como se ha comentado anteriormente, en el que, tal como se indica por ejemplo, el papel del inmunógeno puede ser de estimulación de la respuesta inmunológica dirigida contra los antígenos tumorales endógenos.

La presente invención también proporciona un inmunógeno, tal como una vacuna que comprende un virus herpes mutante tal como se proporciona en la presente invención, por ejemplo una preparación inmunogénica, tal como una vacuna que comprende este virus mutante conjuntamente con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como se utiliza en la preparación de vacunas vivas, y opcionalmente puede incluir adyuvante.

El virus mutante puede, por ejemplo, formularse en una preparación inmunogénica o de vacuna en una dosis que contiene, por ejemplo, hasta aproximadamente 5 x 10^{7} pfu del virus mutante, por ejemplo hasta aproximadamente 5 x 10^{6} pfu o hasta aproximadamente 5 x 10^{5} pfu.

El virus herpes mutantes tal como se proporciona en la presente invención puede prepararse mediante un procedimiento que implica el cultivo de células que se han infectado con el virus mutante, expresando asimismo las células un gen que complementa el primer gen vírico defectivo de manera que resulta posible la producción de partículas víricas infectivas que contienen el genoma defectivo y la recuperación del virus mutante del cultivo.

En los ejemplos inmunogénicos de los virus herpes dados a conocer en la presente invención, puede inactivarse un segundo gen vírico que funciona normalmente regulando negativamente una respuesta inmunológica del huésped contra un virus que transporta este segundo gen, por ejemplo delecionarse, y utilizarse el virus mutante resultante como vector seguro para la administración de una proteína al sistema inmunológico de un huésped infectado, tal como una proteína o antígeno inmunoestimulante normalmente foráneo al virus: esto puede conseguirse mediante la inserción en el genoma del virus, de secuencias de ácidos nucleicos codificantes de dicha proteína, de manera que causen su expresión durante la infección de las células huésped por el virus. Por ejemplo, puede insertarse un gen codificante de un antígeno foráneo deseado de una manera eficaz mediante la clonación del gen deseado junto al promotor vírico, para obtener un casete de ADN que contiene el gen y el promotor, la clonación del casete en un plásmido adecuado, y la cotransfección del plásmido en una línea celular complementaria conjuntamente con ADN purificado procedente del virus mutante con el defecto presente en un gen cuyo producto es producido por la línea celular; y el cribado para virus recombinantes. Un ejemplo de la aplicación de una técnica en cierta manera análoga se describe, por ejemplo, con respecto a un gen codificante del antígeno gp120 de SIV, en la patente nº WO 92/05263 (Immunology Ltd, Inglis et al.).

Dichos ejemplos de vectores virus herpes genéticamente incapacitados pueden utilizarse en procedimientos para proporcionar un inmunoestímulo a un ser humano o sujeto animal no humano sometido a tratamiento, por ejemplo con fines de inmunoterapia del cáncer. La utilización de los vectores puede ser directa, por ejemplo mediante administración al sujeto, por ejemplo en el sitio de un tumor sólido, o puede ser indirecta. Por ejemplo, la utilización del vector puede comprender:

(i) puesta en contacto de un vector virus defectivo ex vivo con una preparación de células capaces tras la infección con el vector, de proporcionar un inmunoestímulo a un sujeto a tratar; y

(ii) utilización de las células infectadas para administrar un estímulo inmunológico al sujeto que debe tratarse, por ejemplo:

(a)

mediante administración directa de las células infectadas en forma de vacuna, por ejemplo tras la inactivación antes de la administración, por ejemplo tras la irradiación, o

(b)

mediante la utilización indirecta de las células para iniciar o estimular las células inmunocompetentes ex vivo, tales como las células del sistema inmunológico del sujeto que debe tratarse, seguido de la readministración de las células inmunocompetentes, por ejemplo sin la administración concurrente de virus o de células infectadas por virus. Cualquier célula no deseada a este respecto puede, por ejemplo, eliminarse mediante un procedimiento de purificación que comprende la reducción negativa, por ejemplo mediante extracción selectiva de las células del tipo no deseado, por ejemplo con anticuerpos correspondientes u otros agentes de unión.

\newpage

Las células infectadas ex vivo con el vector virus herpes pueden ser células autólogas o células heterólogas, por ejemplo células heterólogas obtenidas de un sujeto o de una pluralidad de sujetos con una condición similar a la que debe tratarse. Las células pueden ser de un solo tipo celular o de una mezcla de tipos celulares, por ejemplo pueden comprender células de una línea celular o de una pluralidad de líneas celulares establecidas a partir de muestras clínicas de tumor. De esta manera, por ejemplo, en el caso en el que deba administrarse un estímulo inmunológico, dirigida contra las células de melanoma, las células heterólogas pueden ser células de melanoma de uno o más sujetos con melanoma, diferentes del sujeto que debe tratarse, o incluyendo el sujeto que debe tratarse. Pueden realizarse ajustes correspondientes para otras especificidades del estímulo inmunológico.

Las células infectadas para la administración con el fin de proporcionar un estímulo inmunológico preferentemente pueden inactivarse, por ejemplo mediante irradiación, antes de la administración. Preferentemente pueden incubarse durante un tiempo suficiente antes de la inactivación para permitir que expresen el gen heterólogo transportado por el vector vírico.

De acuerdo con los ejemplos de la invención también se proporciona una preparación dosificada o calibrada de células infectadas por un vector opcionalmente inactivadas, para la administración a un sujeto que debe tratarse con un estímulo inmunológico, cuya dosis se ha calibrado, por ejemplo por referencia al número o concentración de células infectadas que contiene, o por referencia a la cantidad de producto génico heterólogo que expresa.

Alternativamente, los vectores de virus herpes incapacitados genéticamente pueden utilizarse en la administración in vivo de una cantidad o concentración del vector virus para la puesta en contacto y de esta manera infectar células tumorales in vivo, por ejemplo células de un tumor sólido, tal como, por ejemplo, un melanoma.

Entre las células que pueden tratarse útilmente de esta manera son, por ejemplo, células malignas de seres humanos o animales no humanos, especialmente, por ejemplo, células malignas relacionadas con glóbulos rojos, por ejemplo células leucémicas, por ejemplo células CD34+ (células hematopoyéticas) (ver, por ejemplo, los tipos celulares indicados en R. Jurecic et al., capítulo 2, páginas 7 a 30 en "Somatic Gene Therapy", CRC Press, editor P.L Chang, 1995).

El tratamiento inmunológico de tumores utilizando citoquinas lo revisa H. Tahara et al., capítulo 15, páginas 263 a 285 en "Somatic Gene Therapy", CRC Press, editor P.L. Chang, 1995). Los vectores indicados en la presente invención pueden aplicarse a aplicaciones inmunológicas de las citoquinas y procedimientos de tratamiento revistados en la revisión citada, por H. Tahara et al., utilizando adaptaciones y modificaciones apropiadas tal como resultará fácilmente evidente para los expertos en la materia.

La invención también encuentra aplicación adicional in vitro, por ejemplo en el tratamiento in vitro, tal como la expansión de las células T, tales como las células T citotóxicas específicas para virus. Las dos complicaciones de muchos tratamientos inmunosupresores o citotóxicos son la viremia generalizada secundaria a las infecciones por virus y la expansión de células transformadas por virus como resultado de la reactivación por virus latente. Esto se debe al hecho de que el mecanismo normal para controlar estas infecciones se encuentra alterado como resultado del tratamiento. Una solución posible para este problema es producir in vitro las células T citotóxicas apropiadas que son capaces de controlar las células infectadas por virus. Esto puede llevarse a cabo mediante el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica o de linfocitos o de células T previamente al tratamiento del paciente y estimulando estas células in vitro con una preparación de virus vivo. Resulta necesario utilizar virus vivos debido a que las células T citotóxicas generalmente se dirigen contra péptidos derivados de proteínas foráneas que se sintetizan dentro de la célula presentadora de antígeno: los virus inactivados o proteínas individuales inducen las respuestas de células T citotóxicas a un nivel muy bajo. Las células activadas seguidamente se expanden en cultivo a lo largo de un periodo de algunas semanas con reestimulación adicional con antígeno y un factor de crecimiento, tal como la interleuquina 2. Sin embargo, existe el problema de la posible presencia de virus vivo residual en el cultivo celular cuando las CTLs se reinfusionan en el paciente. La utilización de un virus herpes incapacitado capaz de inducir actividad de CTL pero incapaz de expandirse dentro del paciente, si se proporciona inadvertidamente junto con las células expandidas in vitro puede proporcionar, por lo tanto, una ventaja sobre un sistema que utilice un virus de replicación competente.

Por lo tanto, la invención proporciona adicionalmente un procedimiento para la producción de células T citotóxicas específicas de virus, procedimiento que comprende:

(a) el aislamiento de una muestra de células sanguíneas mononucleares, linfocitos o células T de un paciente;

(b) el cultivo de dicha muestra in vitro en presencia de un virus herpes mutante que es defectivo con respecto a un primer gen esencial para la producción de virus infeccioso, y que opcionalmente incluye una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una proteína inmunomoduladora; y

(c) la reinfusión de las células cultivadas en el paciente.

Determinados vectores virus herpes proporcionados por la presente invención también pueden aplicarse a la terapia génica, por ejemplo la terapia génica correctora. En esta aplicación, el vector puede codificar adicionalmente un gen que debe administrarse por medio de terapia génica correctora, por ejemplo un gen codificante ADA u otro gen que debe administrarse con este propósito, por ejemplo tal como se ha indicado anteriormente. Un vector tal como se describe en la presente memoria codificante de la proteína inmunomoduladora de proteína TGF beta puede resultar particularmente adecuado como vector para la terapia génica correctora, de regulación negativa de la respuesta del sujeto tratado, que habitualmente se trata directamente con un vector proporcionado en la invención o con células vivas, autólogas o heterólogas, tras su infección con el vector. Los efectos inmunomoduladores negativos pueden proporcionarse con dicha proteína u otra selección adecuada de proteínas inmunomoduladoras. Una selección adicional de proteínas inmunomoduladoras para esta aplicación pueden ser, por ejemplo, la siguiente: inhibición de efectos de Th1 pueden conseguirse con vectores codificantes de citoquinas Th2 o viceversa, por ejemplo un vector codificante de IL10 contra los efectos de Th1 y un vector codificante de IFN-gamma contra los efectos de Th2. La respuesta inmunológica puede regularse negativamente de manera adicional mediante la utilización de un vector que codifica, por ejemplo, un gen de regulación negativa de la inmunidad de origen vírico o de otro origen patogénico, por ejemplo un vector codificante del gen ICP47 de herpes (de HSV1 o HSV2) o adicionalmente codificante de otro gen conocido de regulación negativa de la inmunidad, por ejemplo E3-gp19k de adenovirus (ver G. Fejer et al., J. Virol. 68:5871-81, 1994). Los procedimientos de terapia génica en la literatura, por ejemplo la patente nº US 5.399.346 (W.F. Anderson et al.), pueden adaptarse mediante la utilización de los vectores proporcionados en la invención.

Alternativamente, los sistemas dados a conocer en la presente invención pueden utilizarse para expresar proteínas inmunomoduladoras, particularmente las proteínas de mamífero auténticas. Se encuentran disponibles muchos sistemas de expresión para la preparación de proteínas clínicamente relevantes. El sistema de expresión seleccionado y en particular el organismo utilizado presentarán una profunda influencia sobre el carácter final de la proteína, con probables influencias sobre el peso molecular y el grado de glucosilación, inmunogenicidad, toxicidad y potencia. GH-CSF se ha preparado con éxito en E. coli (Libby, R.T. et al., DNA, 6 de junio de 1987), en levadura (Price, V. et al., Gene 55(2-3), 1987) y en sistemas de cultivo de células de mamífero, sin embargo se observan considerables diferencias de rendimiento, de potencia del producto y, por lo tanto, de coste, toxicidad y tasas de eliminación in vivo (Dorr, R.T., Clin. Ther., enero-15 de febrero de 1993, D. Hovgaard, Eur. J. Hematology 50, enero de 1993). Estos parámetros, a su vez, pueden afectar a la viabilidad económica y técnica del tratamiento de una enfermedad particular con un producto proteico.

Con el fin de ilustrar la presente invención más completamente, se describe realizaciones a título de ejemplo únicamente y no de manera limitativa. La construcción y propiedades de un virus defectivo en gH se describe en Forrester et al., J. Virol. 6:341, 1992, en la patente nº WO 94/21807. Además, todos los procedimientos de manipulación genética pueden llevarse a cabo de acuerdo a procedimientos estándar, tal como se describen en "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", editores Sambrook, Fritsch y Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

Los ejemplos se ilustran no limitativamente por referencia a los dibujos adjuntos, en los que las figuras 1 a 6 son diagramas que ilustran la construcción de los plásmidos pIMMB45, pIMMB56, pIMMB46, pIMC14, pIMR1 y pIMR3, respectivamente. La figura 7 es un diagrama de recombinación que ilustra la descripción introductoria de la invención.

La descripción a continuación incluye particularmente:

La construcción de HSV1 y HSV2 con deleción de gH que codifican GM-CSF (murino) en el sitio de deleción del gen de gH y capaces de provocar la expresión de GM-CSF en una célula infectada:

Ensayo del efecto de dicho vector como inmunógeno (vacuna):

Construcción de HSV2 con deleción de gH codificante de GM-CSF humana en el sitio de deleción del gen de gH y capaz de provocar la expresión de GM-CSF en una célula infectada; y

Construcción de HSV2 con deleción de gH codificante de IL-2 humana en el sitio de deleción del gen de gH y capaz de provocar la expresión de IL-2 en una célula infectada.

Construcción de HSV1 con deleción de gH y HSV2 con deleción de gH que expresan GM-CSF

El virus HSV1 con deleción de gH y el virus HSV2 con deleción de gH se propagaron en las líneas celulares complementarias. Estas líneas celulares se habían manipulado para expresar el gen gH de HSV1 o el gen gH de HSV2, respectivamente. Estas líneas celulares pueden construirse tal como se describe en las patentes nº WO 94/05207 y nº WO 94/21807 y en las referencias citadas en las mismas. La sección siguiente proporciona una descripción adicional de la construcción de líneas celulares adecuadas, y se inicia con la construcción de determinados plásmidos.

Fuente de ADN vírico

En el caso de que se requiera ADN de virus HSV, puede prepararse, por ejemplo (en el caso de HSV2) a partir de la cepa HG52 mediante el procedimiento de Walboomers y Ter Schegget, Virology 74:256-258, 1976, o mediante adaptaciones adecuadas de este procedimiento. Un stock de élite de la cepa HG52 se mantiene en el Institute of Virology, MRC Virology Unit, Church Street, Glasgow, Escocia, UK. El ADN de otras cepas de HSV-2 es probable que sea muy similar en esta región, y las cepas G y MS, por ejemplo, pueden obtenerse de ATCC, Rockville, Maryland, USA.

Construcción de plásmido pIMC05

Se extrajo del plásmido pgDBrgH (Forrester et al., op. cit.) un fragmento Sst-1 de 4,3 kb codificante del gen gH del HSV-1 (HFEM) y del promotor situado corriente arriba de gD del HSV-1 (-392 hasta +11) y se clonó en pUC119 (Vieira y Messing, 1987) para producir el plásmido pUC119gH. Se introdujo un sitio Not 1 en el plásmido pUC119gH mediante mutagénesis sitio-dirigida, 87 pb corriente arriba del codón de parada de gH. El plásmido resultante, pIMC03, se utilizó para generar un fragmento Not1-Sst1 que se reparó y se ligó en el vector de expresión eucariótico pRc/CMV (Invitrogen Corporation), predigerido con Not1 y con Nru1 para eliminar promotor IE del CMV. El plásmido resultante, pIMC05, contiene el gen gH del HSV-1 bajo el control transcripcional del promotor vírico inducible de gD y la poliA de la BGH (hormona del crecimiento bovina). También contiene el gen de resistencia a la neomicina para la selección de las líneas celulares estables resistentes a G418.

Construcción de línea celular complementaria de HSV-1 con deleción de gH

El plásmido pIMC05 se transfectó en células Vero (ATCC nº 88020401) utilizando la técnica de CaPO_{4} (Sambrook, Fritsch y Maniatis, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Las células se seleccionaron mediante clonación por dilución en presencia de G418 y se aisló una línea celular clonal. Tras la expansión y la congelación, las células se sembraron en placas de 24 pocillos y se sometieron a ensayo para su capacidad para dar soporte el crecimiento de virus negativo para gH, mediante infección con SC16\DeltagH (Forrester et al., op. cit.) a 0,1 pfu/célula. Se observaron placas de virus 3 días después de la infección, confirmando la expresión del gen gH.

Construcción de la línea celular TK de BHK

Estas células se produjeron mediante transfección del plásmido pIMC05 en células BHK negativas para timidina quinasa (TK^{-}) (ECACC nº 85011425) de la misma manera que la descrita para células complementarias de HSV-1 con deleción de gH y de HSV-2 con deleción de gH.

Construcción de plásmido pIMC08

El plásmido pIMMB24 que contiene el gen gH del HSV-2 se construye a partir de dos fragmentos BamHI contiguos de la cepa 25766 de HSV-2. Los plásmidos se denominan pTW49, que contiene el fragmento R BamHI de aproximadamente 3.484 pares de bases, y pTW54, que contiene el fragmento S BamHI de aproximadamente 3.311 pares de bases, ambos clonados en el sitio BamHI de pBR322. Pueden clonarse fácilmente plásmidos equivalentes a partir de muchas cepas o aislados clínicos disponibles de HSV-2. El extremo 5' del gen HSV-2 se extrae de pTW54 utilizando BamHI y KpnI, produciendo un fragmento de 2.620 pares de bases que se purifica en gel. El extremo 3' del gen gH de HSV-2 se extrae de pTW49 utilizando BamHI y SalI, produciendo un fragmento de 870 pares de bases que se purifica en gel. Los dos fragmentos se clonan en pUC119 que ha sido digerido con SalHI y KpnI. Este plásmido contiene ahora el gen gH de HSV-2 completo.

El plásmido pIMC08 que contiene el gen gH de HSV-2 (cepa 25766) se construyó de la manera siguiente. Se digirió el plásmido pIMMB24 con NcoI y BstI y el fragmento que contenía la parte central del gen gH se purificó en un gel de agarosa. El extremo 5' del gen se reconstruyó a partir de dos oligonucléotidos, CE39 y CE40, que forman una secuencia de unión limitada por los sitios HindIII y NcoI.

El extremo 3' del gen se reconstruyó a partir de dos oligonucleótidos, CE37 y CE38, que forman una secuencia de unión limitada por los sitios BstXI y NotI.

1

Los dos oligonucleótidos línkers y el fragmento NcoI-BstXI de gH purificado se clonaron en una ligación triple en pIMCOS digerido con HindIII-NotI, sustituyendo de esta manera el gen gH de HSV-1 por el gen gH de HSV-2. El plásmido resultante se denominó pIMC08.

Construcción de la línea celular complementaria de HSV-2 con deleción de gH

El plásmido pIMC08, que contiene el gen gH de HSV-2 bajo el control transcripcional del promotor gD vírico inducible y la secuencia poliA de la BGH (hormona de crecimiento bovina). También contiene el gen de resistencia a la neomicina para la selección de las líneas celulares estables resistentes a G418. El plásmido pIMC08 se transfectó en células Vero (ATCC nº 88020401) utilizando la técnica de CaPO_{4} (Sambrook, Fritsch y Maniatis, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Las células se seleccionaron mediante clonación por dilución en presencia de G418 y se aisló una línea celular clonal. Tras la expansión y congelación, estas células, denominadas células CR2, se sembraron en placas de 24 pocillos, y se infectaron con HSV-1 con deleción de gH (gH de SC16) a una concentración de 0,1 pf/célula. Las placas víricas se observaron 3 días después de la infección, confirmando la expresión del gen gH.

Construcción de plásmidos de recombinación a) pIMMB56+

pIMMB56+ es un vector con un casete lacZ flanqueado por secuencias de HSV-2 de cada uno de los lados del gen gH. Se preparó de la manera siguiente: los dos fragmentos PCR preparados a partir de los oligos MB97-MB96 y de los oligos MB57-B58 se digirieron con los enzimas de restricción apropiados para los sitios incluidos en los oligonucleótidos de PCR. El fragmento MB97-MB96 se digirió con HindIII y con HapI. El fragmento MB57-MB58 se digirió con HpaI y con EcoRI. Estos fragmentos seguidamente se ligaron en el vector pUC119 que se había digerido con HindIII y con EcoRI. El plásmido resultante se denominó pIMMB45 (fig. 1).

Los oligonucleótidos utilizados para el PCR se muestran a continuación:

2

Para permitir la fácil detección de los recombinantes de primera etapa, se insertó en pIMMB45 el gen beta-galactosidasa de E. coli, bajo el control de un promotor de SV40. El promotor de SV40 más el gen de beta-galactosidasa se extrajo del plásmido pCH110 (Pharmacia) utilizando BamHI y TthIII. Los extremos se rellenaron utilizando el fragmento Klenow de la ADN polimerasa. El fragmento se purificó en gel. El plásmido pIMMB45 se digirió con HpaI, se fosfató con fosfatasa alcalina intestinal bovina (CIAP) para eliminar la autoligación y se purificó en gel. Los fragmentos purificados en gel seguidamente se ligaron juntos para producir el plásmido pIMMB56+ (ver la fig. 2).

b) pIMMB46

pIMMB46 contiene secuencias flanqueantes el gen gH de HSV-2, con un sitio HpaI único central. Cualquier gen clonado en este sitio puede insertarse mediante recombinación en el genoma de HSV-2 en el locus de gH. Si el virus en un virus negativo para TK y negativo para gH (preparado, por ejemplo, utilizando el plásmido pIMMB56+ descrito anteriormente), entonces el plásmido sustituirá el extremo 3' del gen TK, restituyendo de esta manera la actividad de TK y permitiendo la selección para virus positivos para TK.

Los dos fragmentos PCR preparados a partir de los oligos MB94-MB109 y de los oligos MB57-MB108 se digirieron con los enzimas de restricción apropiados para los sitios que se habían incluido en los oligonucleótidos para PCR. El fragmento MB94-M8109 se digirió con HindIII y con HpaI. El fragmento MB57-MB108 se digirió con HpaI y con EcoRI. Estos fragmentos seguidamente se ligaron en el vector pUC119 que había sido digerido con HindIII y con EcoRI. El plásmido resultante se denominó pIMMB46 (ver la fig. 3). Los oligonucleótidos utilizados eran los siguientes:

3

c) pIMC14

El plásmido pRc/CMV (Invitrogen Corporation) se digirió con los enzimas de restricción NruI, PvuII y BsmI y se aisló un fragmento NruI-PvuII de 1.066 pares de bases a partir de un gel de agarosa. El fragmento se clonó en pIMMB46 digerido con HpaI (ver la fig. 4). Lo resultante se denominó pIMC14.

El fragmento pRc/CMV contenía el promotor temprano inmediato principal de citomegalovirus (promotor IE de CMV) y el sitio de adición de poliA de la hormona de crecimiento bovina (BGH). Este plásmido, pIMC14, es un plásmido recombinante general con sitios únicos para la inserción de genes foráneos que después pueden recombinarse en un vector DISC con deleción de gH del HSV-2.

d) pIMR1

El plásmido pIMR1 es un vector de recombinación para la inserción del gen GM-CSF murino, bajo el control del promotor IE de CMV, en un vector DISC HSV-2. Se digirió el plásmido pIMC14 con XbaI, se fosfató con CIAP, se purificó en gel y los extremos colgantes se rellenaron con polimerasa Klenow. El gen GM-CSF murino se extrajo del plásmido pGM 3.2FF (denominado pGM3.2 en Gough et al., EMBO Journal 4:645-653, 1985) (o del plásmido equivalente construido tal como se describe posteriormente) mediante un procedimiento en dos etapas. En primer lugar, se digirió el plásmido pGM 3.2FF con EcoRI y se purificó en gel un fragmento de 1.048 pares de bases. A continuación, este fragmento se digirió con HinfI y StuI. El fragmento de 495 pares de bases se purificó en gel y los extremos se repararon con la polimerasa Klenow. A continuación, este fragmento se clonó en un sitio múltiple de clonación de p1MC14, preparado tal como se ha descrito anteriormente. El plásmido resultante se denominó pIMR1 (ver la fig. 5).

Un plásmido alternativo a pgM3.2 puede construirse de la manera siguiente.

Se construyó una biblioteca de clones de ADNc a partir de una línea de linfocitos T clonados (de una cepa BALB/c de ratón), tal como LB3 (Kelso et al., J. Immunol. 132:2932, 1984), en la que la síntesis de GM-CSF es inducible con concanavalina A. Se realizó una búsqueda en la biblioteca mediante hibridación de colonias con una secuencia específica para el gen GM-CSF murino (ver Gough et al., EMBO J. 4:645, 1985 para ver la secuencia). Un ejemplo de un oligonucleótido utilizable en este caso es 5' TGGATGACAT GCCTGTCACA TTGAATGAAG AGGTAGAAGT 3'. Se recogieron los clones de más de 1 kb y se secuenciaron para comprobar que eran GM-CSF. Estas operaciones se llevaron a cabo tal como se describe en "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", editores Sambrook, Fritsch y Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Esta operación resulta en un clon que contiene la secuencia GM-CSF completa, que puede extraerse con HinfI y StuI, tal como se describe para pGM3.2.

e) pIMR3

En el plásmido pIHR1, el marco de lectura abierto para el gen GM-CSF se ve precedido por un marco de lectura abierto (ORF) corto, de 15 pares de bases. Debido a que se consideró que resultaba posible que esto podría interferir con la expresión de GM-CSF, el plásmido pIMR1 se alteró de manera que este pequeño marco de lectura resultase eliminado, digiriendo el plásmido pIMR1 con NotI y PpuMI. El vector digerido se fosfató con fosfatasa alcalina intestinal bovina (CIAP) y se purificó en gel. Las secuencias entre los dos sitios de enzima de restricción se sustituyeron por un
segmento corto de ADN de doble cadena generado mediante la hibridación de los dos oligonucleótidos CE55 y CE56:

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Los oligonucleótidos se construyeron de manera que presentasen extremos salientes compatibles con los extremos NotI y PpuMI generados mediante la digestión de pIMR1. Los dos oligonucleótidos se hibridaron, se fosforilaron y se ligaron al plásmido pIMR1 digerido con NotI-PpuHI. El vector resultante se denominó pIMR3. Las secuencias en la región relevante se muestran a continuación:

5

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Para preparar un virus DISC HSV-1 expresante de la proteína GM-CSF, se preparó un conjunto diferente de plásmidos:

f) pIMMB34

Éste es un vector de recombinación que contiene secuencias flanqueantes del gen gH de HSV-1. Las secuencias flanqueantes del lado izquierdo inactivan el gen TK, que se encuentra situado contiguamente al gen gH. Los dos fragmentos PCR preparados a partir de los oligos MB97-B100 y de los oligos MB61-MB58 se digirieron con los enzimas de restricción apropiados a los sitios incluidos en los oligonucleótidos PCR. El fragmento MB97-MB100 se digirió con HindIII y con HpaI. El fragmento MB61-MB58 se digirió con HpaI y con EcoRI. Estos fragmentos seguidamente se ligaron en el vector pUC119 que había sido digerido con HIndIII y con EcoRI. El plásmido resultante se denominó pIMMB34. Los oligonucleótidos utilizados eran los siguientes:

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g) pIMMB55+

Con el fin de permitir la fácil detección de los recombinantes de primera etapa, el gen de la beta-galactosidasa de E. coli, bajo el control de un promotor de SV40, se insertó en el plásmido pIMMB34. El promotor de SV40 más el gen de la beta-galactosidasa se extrajo del plásmido pCHII0 (Pharmacia) utilizando BamHI y TthIII. Los extremos se rellenaron utilizando el fragmento Klenow de la ADN polimerasa. El fragmento se purificó en gel. El plásmido pIMMB34 se digirió con HpaI, se fosfató con fosfatasa alcalina intestinal bovina (CIAP) para eliminar la autoligación, y se purificó en gel. Los fragmentos purificados en gel seguidamente se ligaron entre sí para producir el plásmido pIMMB55+.

h) pIMMB63

Se preparó el plásmido pIMMB63 a partir de la cepa KOS (m) de HSV-1. El plásmido pIMMB63 contiene secuencias flanqueantes del gen gH de HSV-1 con un sitio HpaI central único. Cualquier gen clonado en este sitio puede insertarse mediante recombinación en el genoma de HSV-1 en el locus de gH. Si el virus es un virus negativo para TK (por ejemplo preparado utilizando el plásmido pIMMB55+ descrito anteriormente), el plásmido sustituye el extremo 3' del gen TK, restituyendo de esta manera la actividad de TK y permitiendo la selección para virus positivo para TK.

Los dos fragmentos PCR preparados a partir de los oligos MB98-MB643 y de los oligos MB61-MB58 se digirieron con los enzimas de restricción apropiados para los sitios incluidos en los oligonucleótidos de PCR. El fragmento MB98-MB63 se digirió con HindIII y con HpaI. El fragmento MB61-MB58 se digirió con HpaI y con EcoRI. A continuación, estos fragmentos se ligaron en el vector pUC119 que había sido digerido con HindIII y con EcoRI. El plásmido resultante se denominó pIMMB63. Los oligonucleótidos utilizados eran los siguientes:

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i) pIMX1.0

Este plásmido es un plásmido de recombinación general con sitios únicos para la inserción de genes foráneos que seguidamente pueden recombinarse en un vector HSV-1 DISC con deleción de gH. El plásmido pRc/CMV se digirió con nruI y con PvuII y un fragmento de 1.066 pb, que contenía el promotor IE de CMV y una señal poliA, y se crearon extremos romos con la polimerasa Klenow y se insertaron en el sitio único HpaI del plásmido pIMMB63. El plásmido se denominó pIMX1.0. El sitio de clonación múltiple contenido entre el promotor IE de CMV y la señal poliA resulta ideal para la clonación de otros genes en el plásmido y su posterior introducción en HSV-1 DISC.

j) pIMX3.0

El plásmido pIMX3.0 es un vector de recombinación para la inserción de GM-CSF murino, bajo el control del promotor IE de CMV, en la región gH delecionado de HSV DISC de tipo I. Este plásmido se construyó mediante la inserción de GM-CSF murino que se había extraído del plásmido pGM3.2FF (op. cit.) con SmaI y DraI, en el sitio BsaBI único de pIMX1.0. Este plásmido, pIMX3.0, es el equivalente HSV-1 de pIMR3.

Construcción de un virus recombinante

Se preparó un virus recombinante que expresaba GM-CSF en dos etapas. En la primera etapa, el gen gH, y parte del gen TK, se sustituyeron por un "casete lacZ" consistente en el promotor de SV40 controlador del gen lacZ de E. coli. Este virus presenta un fenotipo TK menos y también proporciona placas azules cuando se cultiva bajo una capa superior que contiene el sustrato colorigénico X-gal. Este virus recombinante ahora puede utilizarse convenientemente para la inserción de genes foráneos en el locus gH. Los genes se insertaron conjuntamente con la parte faltante del gen TK. Simultáneamente se eliminó el casete lacZ. Estos virus pueden seleccionarse a partir de un fenotipo TK-positivo, y un color blanco bajo X-gal.

a) Construcción de un recombinante de primera etapa con el casete SV40-lacZ en sustitución de gH

Se construyó virus recombinante mediante transfección de ADN vírico con el plásmido pIMMB56+ (para HSV-2) o el plásmido pIMMB55+ (para HSV-1). El ADN vírico se purifica en un gradiente de yoduro sódico, tal como se describe en Walboomers y Ter Schegget, Virology 74:256-258, 1976.

La recombinación se lleva a cabo de la manera siguiente:

a) Primera etapa

Se prepara una mezcla de transfección mediante la mezcla de 5 \mug de ADN vírico, 0,5 \mug de plásmido ADN linearizado (linearizado mediante digestión con el enzima de restricción ScaI) en1 ml de tampón HEBS (NaCl 137 mM, KCl 5 mM, Na_{2}HPO_{4} 0,7 mM, glucosa 5,5 mM, Hepes 20 mM, pH 7,05). Se añaden gota a gota 70 \mul de CaCl_{2} M y se mezcla suavemente. Se extrae el medio de una placa subconfluyente de 5 cm de células CR1 o CR2 y se añaden 500 \mul de la mezcla de transfección a cada una de las dos placas. Las células se incuban a 37ºC durante 40 minutos, tras lo cual se añaden 4 ml de medio de crecimiento que contenía suero de feto bovino (FCS) al 5%. 4 horas después de añadir la mezcla de transfección, se extrajo el medio y las células se lavaron con medio libre de suero. A continuación, las células se sometieron a "choque" con 500 \mul por placa de glicerol al 15% durante 2 minutos. Se extrajo el glicerol, las células se lavaron dos veces con medio libre de suero y se añadió medio de crecimiento que contenía FCS al 5%.

Tras 4 a 7 días, al observar un efecto citopático completo (CPE), las células se rasparon en el medio, se centrifugaron a 2.500 rpm durante 5 minutos a 4ºC, y se resuspendieron en 120 \mul de medio esencial mínimo de Eagle (EMEM). Esto dio lugar a un stock vírico crudo que contenía virus de tipo salvaje y virus recombinante. Se congeló el stock, se descongeló y se sonicó y se cribó para recombinantes en células CR1 a un abanico de diluciones. El medio contenía 10 \mug/ml de aciclovir, para seleccionar los virus TK-menos. Tras la adición de las diluciones de virus, las células se superpusieron a un medio que contenía agarosa al 1% de baja temperatura de gelificación. Tras la aparición de placas víricas aproximadamente a los 3 días, se añadió una segunda capa superior de agarosa que contenía 330 \mug/ml de Xgal, así como 10 \mug/ml de aciclovir. Se recolectaron las placas azules, dentro de las 48 horas, y se transfirieron a placas de 24 pocillos (1 cm^{2} por pocillo) que contenían células CR1. Las placas se dejaron crecer hasta el CPE total y se recolectaron mediante raspado introduciéndolos en el medio. Se llevaron a cabo múltiples rondas de purificación de placas hasta obtener un stock puro de virus.

Se confirmó la estructura del recombinante de primera etapa de la manera siguiente. Se preparó ADN vírico con yoduro sódico tal como anteriormente, y se digirió con BamHI. Este digerido se separó en un gel de agarosa y se transfirió a una membrana de nilón. Ésta se sondeó con un fragmento de ADN marcado radioactivamente homólogo de las secuencias situadas en ambos lados del gen gH.

b) Segunda etapa

La recombinación se llevó a cabo tal como anteriormente utilizando ADN vírico del recombinante de primera etapa, y el plásmido pIMR3 (para HSV-2) o pIMX3.0 (para HSV-1). Tras la recolección inicial de virus, se seleccionaron los virus recombinantes TK-positivos mediante cultivo en células BHK TK-negativas gH-positivas en presencia de metotrexato 0,6 \muM, timidina 15 \muM, glicina 9,5 \muM, adenosina 4,75 \muM y guanosina 4,75 \muM. Se llevaron a cabo tres rondas de esta selección en placas de 6 pocillos (10 cm^{2} por pocillo). En cada etapa, se recolectaron las células infectadas mediante raspado introduciéndolas en el medio, centrifugándolas y resuspendiéndolas en 200 \mul de EMEM. Tras la sonicación, 50 \mul de lo anterior se añadió a células BHK TK-negativas gH-positivas frescas, y se continuó con la selección.

Tras la selección final, se recolectaron las células infectadas por virus tal como anteriormente y se cribaron en células complementarias HSV1 con deleción de gH. Las capas superiores se añadieron tal como anteriormente y se seleccionaron placas blancas en presencia de Xgal. Las placas se recolectaron tal como anteriormente y se purificaron en placas tres veces en dichas células complementarias HSV1 con deleción de gH.

La estructura del ADN vírico se analizó tal como anteriormente.

Ensayo del potencial de vacuna de virus mutantes expresantes de GM-CSF con deleción de gH

El virus mutante expresante de GM-CSF con deleción de gH puede someterse a ensayo para su eficacia como vacuna mediante la utilización de un sistema modelo de ratón, tal como se describe en Farrell et al., J. Virol. 68:927-32, 1994. Se vacunaron grupos de ratones mediante escarificación de los pabellones auditivos con dosis variables comprendidas entre 10^{2} y 10^{6} unidades formadoras de placa (pfu) de virus mutante con deleción de gH, virus expresante de GM-CSF, virus mutante expresante de GM-CSF y con deleción de gH, y el revertante de gH. Se vacunó el grupo de control con PBS. Tras 3 semanas, se retaron ratones en el pabellón de la oreja contraria con 10' pfu de HSV-1 de tipo salvaje (cepa SC16). Cinco días después del reto, los ratones se sacrificaron, se extirparon las orejas retadas y se congelaron a -70ºC. Las orejas se homogeneizaron y se determinó mediante titración de las placas la cantidad de virus retante infeccioso en cada oreja. La reducción de títulos víricos en los grupos vacunados de ratones en comparación con los controles tratados con PBS es una medida de la protección proporcionada por la vacuna vírica. Es conocido que el virus con deleción de gH puede eliminar por completo la presencia de virus infecciosos a una dosis de vacunación de 5 x 10^{5} pfu, mientras que incluso 5 x 10^{4} pfu se observa una reducción de 1.000 veces. El hecho de que el mutante expresante de GM-CSF con deleción de gH puede proporcionar un nivel incrementado de protección puede someterse a ensayo mediante la observación de protección completa de cualquier virus infeccioso a dosis de reto más bajas que en los ratones vacunados con virus mutante con deleción de gH, y una reducción mayor de los títulos víricos infecciosos en comparación con los controles vacunados con PBS. El virus portador de GM-CSF con deleción de gH puede proporcionar un nivel incrementado de respuesta de anticuerpos en comparación con un virus con deleción de gH pero que no transporta el gen de GM-CSF.

Ensayo de GM-CSF

Se transfectaron células Cos 1 (ECACC nº 88031701) con plásmido ADN utilizando DEAE dextrano tal como se describen en Gene Transfer and Expression, A laboratory Manual, Michael Kriegler. Se cribaron los sobrenadantes de células Cos 1 transfectadas o células CR2 infectadas, para actividad de GM-CSF mediante bioensayo. Se obtuvo del Dr. E. Spponcer, Paterson Institute for Cancer Research, Christie Hospital, UK, una línea celular hematopoyética murina que responde a IL-1/GM-CSF. La línea celular C2GM se mantuvo en medio Fischers con suero de caballo al 20%, glutamina al 1% y medio celular condicionado al 10%. El medio celular condicionado se obtuvo a partir de cultivos de crecimiento exponencial de células Wehi 3b (ECACC nº 86013003) que secreta IL-3 murina hacia el medio. Las células Wehi 3b se mantuvieron en medio RPMI 1640, FCS al 10% y glutamina
al 1%.

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Los ejemplos anteriores se refieren a la creación de mutantes de HSV-1 y de HSV-2 que son negativos para gH y que expresan GM-CSF.

La descripción anterior puede adaptarse fácilmente a la construcción de vectores que expresan diversas proteínas inmunomoduladoras, por ejemplo de la manera siguiente:

Construcción de vectores HSV2 con deleción de gH que expresan GM-CSF humana

Se describen GMCSF humana y su gen en M. Cantrell et al., PNAS 82:6250-6254, 1985; F. Lee et al., PNAS 82:4360-4364, 1985; G. Wong et al., Science 228:810-815, 1985.

El ADN para la clonación puede obtenerse mediante la utilización de PCR y oligonucleótidos de la manera estándar, y se encuentra disponible comercialmente una versión de ingeniería genética del gen, de R&D Systems Europe Ltd., Abingdon, OX14 3YS, UK.

El gen puede prepararse para su clonación mediante manipulación de los extremos del ADN para garantizar que se encuentran presentes en el extremo 5' una secuencia líder natural y una señal de inicio para la expresión en un sistema de mamífero y, para los presentes propósitos, mediante la adición de extremos complementarios que se correspondan (en el extremo 5') con un sitio HindIII y (en el extremo 3') un sitio EcoRI.

A continuación, el gen preparado puede ligarse en un vector de clonación pcDNA3 (Invitrogen Corporation) entre los sitios HindIII y EcoRI, y clonarse. El vector resultante se denomina pcDNA3-hGMSCF. Éste puede digerirse con EcoRI, y después con HindIII, crearse extremos romos, y clonarse en el vector pIMC14 tal como se ha descrito anteriormente (en lugar del gen murino tal como se utiliza en el ejemplo descrito anteriormente).

El vector de clonación resultante con hGMCSF seguidamente puede utilizarse en adaptaciones de los procedimientos restantes ya descritos en la presente memoria, por ejemplo para preparar un vector virus HSV2 defectivo con deleción de gH codificante de GMCSF humana en el sitio de deleción del gen gH.

Construcción de vectores HSV2 con deleción de gH expresante de IL-2 humana

La IL-2 humana y su gen se describen en T. Taniguchi et al., Nature 302(5906):305-310, 1983, y en la secuencia HSIL02 de EMBL (ARNm codificante de IL-2); ver también R. Devos et al., Nucl. Acids Res. 11(13):4307-4323, 1983 (con referencia a la expresión bacteriana).

El ADN para la clonación puede obtenerse, por ejemplo, de células T mediante la utilización de PCR y oligonucleótidos de la manera estándar, y una versión de ingeniería genética también se encuentra disponible comercialmente de R&D Systems Europe Ltd., Abingdon, OX14 3YS, UK.

El gen puede prepararse para la clonación mediante ingeniería genética de los extremos del ADN para garantizar que se encuentran presentes en el extremo 5' una secuencia líder natural y una señal de inicio para la expresión en un sistema de mamífero y, para los presentes propósitos, mediante la adición de extremos complementarios correspondientes (en el extremo 5') a un sitio HindIII y (en el extremo 3') un sitio EcoRI.

A continuación, el gen preparado puede ligarse en un vector de clonación pcDNA3 (Invitrogen Corporation) entre los sitios HindIII y EcoRI, y clonarse. El vector resultante se denomina pcDNA3-hIL02. Éste puede digerirse con EcoRI, y después con HindIII, crearse extremo romos, y clonarse en el vector pIMC14 tal como se ha descrito anteriormente (en lugar del gen de GMCSF murino tal como se utiliza en el ejemplo ya descrito).

El vector de clonación resultante con IL-2 humana seguidamente puede utilizarse en adaptaciones de los procedimientos restantes ya descritos en la presente memoria, por ejemplo para preparar un virus HSV2 defectivo con deleción de gH codificante de IL-2 humana en el sitio de deleción del gen gH.

Las técnicas pueden adaptarse fácilmente para otras interleuquinas, citoquinas, quimoquinas, por ejemplo IL-12, linfotactina, y CD40L, entre muchos otros.

De esta manera, utilizando por ejemplo los vectores víricos particularmente descritos en la presente memoria, puede inmunizarse un paciente con fines profilácticos o terapéuticos, tales como aquellos indicados en la presente memoria mediante la administración de un inmunógeno o vacuna que comprenden un virus mutante que presenta un genoma defectivo con respecto a un gen seleccionado esencial para la producción de virus infecciosos, de manera que el virus puede infectar células normales y experimentar replicación y la expresión de genes de antígeno vírico en aquellas células pero no puede producir virus infecciosos normales, asimismo presentando el genoma una secuencia de nucleótidos heteróloga que funciona para expresar una proteína inmunomoduladora, preferentemente codificada en el locus del gen esencial defectivo.

El experto en la materia puede adaptar fácilmente esta enseñanza para la preparación de otros virus mutantes que son defectivos con respecto a un primer gen esencial para la producción de virus infecciosos, de manera que el virus puede infectar células normales y experimentar replicación y la expresión de antígeno vírico en estas células, pero no puede producir los virus infecciosos indicados y que también expresa una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una proteína inmunomoduladora.

Muchos otros virus mutantes pueden prepararse a partir de la deleción u otro tipo de inactivación (por ejemplo) de los genes esenciales siguientes en los virus y tipos víricos siguientes:

En los virus herpes simplex, pueden delecionarse o inactivarse de otra manera genes esenciales tales como gB, gD, gL, ICP4, ICP8 y/o ICP27, así como, o en lugar de, el gen gH utilizado en los ejemplos anteriores. En otros virus herpes, pueden seleccionarse para la deleción u otro tipo de inactivación, genes esenciales conocidos, tales como cualquier homólogo esencial conocido de los genes de HSV gB, gD, gL, gH, ICP4, ICP8 y/o ICP27. El citomegalovirus puede, por ejemplo, incapacitarse genéticamente mediante deleción o, de otra manera, activando los genes responsables de las mutaciones sensibles a la temperatura, por ejemplo las identificables en Dion et al., Virology 158:228-230, 1987.

En los poxvirus, tales como el virus vaccinia, pueden prepararse virus genéticamente incapacitados mediante deleción u otro tipo de inactivación de un gen, tal como uno de aquellos identificados como esenciales o que dan lugar a mutantes condicionalmente letales sensibles a la temperatura, por ejemplo en Goebel et al., Virology 179:249 et seq., 1990.

El virus SV40 genéticamente incapacitado puede prepararse mediante deleción, u otro tipo de inactivación, por ejemplo de la región codificante del antígeno T.

El adenovirus de tipo 5 puede, por ejemplo, incapacitarse genéticamente mediante deleción, u otro tipo de inactivación, de genes esenciales, tales como aquellos identificados en las referenciadas citadas anteriormente en la introducción.

Estos ejemplos también pueden aplicarse a usos tales como los indicados en la presente memoria.

Claims (16)

1. Virus herpes mutante que presenta un genoma que es defectuoso con respecto a un gen seleccionado que es esencial para la producción de partículas de virus nuevas infecciosas, y que transporta material genético heterólogo codificante de una proteína inmunomoduladora, de manera que el virus mutante puede infectar células huésped normales y causar la expresión en las mismas del material genético heterólogo codificante de una proteína inmunomoduladora, aunque el virus mutante no puede provocar la producción de nuevas partículas de virus infecciosas excepto cuando el virus infecta células huésped complementarias recombinantes que se han manipulado para transportar y pueden expresar un gen que proporciona la función del gen viral esencial; el sitio de inserción del material genético heterólogo codificante de la proteína inmunomoduladora, estando en el sitio del defecto en el gen viral esencial seleccionado.

2. Virus mutante según la reivindicación 1, en el que el defecto se encuentra en un gen de glucoproteína viral.

3. Virus mutante según la reivindicación 1, que es un mutante del virus herpes simplex (HSV).

4. Virus mutante según las reivindicaciones 2 ó 3, en el que el defecto se encuentra en un gen de glucoproteína de virus herpes correspondiente a la glucoproteína gH, gD, gB o gL.

5. Virus mutante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el material genético heterólogo codifica una proteína seleccionada de entre citoquinas, quimoquinas, componentes del complemento, moléculas accesorias del sistema inmunológico y receptores para las mismas de especificidad humana o animal no humana.

6. Virus mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el material genético heterólogo codifica una proteína seleccionada de entre CM-CSF, IL-2, IL-12, OX40, OX40L (gp34) y CD40L.

7. Utilización de un virus mutante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, como vector viral en la preparación de un medicamento para la utilización profiláctica o terapéutica para potenciar una respuesta inmune del huésped en un sujeto tratado con el mismo.

8. Utilización según la reivindicación 7, en la que la respuesta inmune es contra un antígeno heterólogo, que no es una proteína inmunomoduladora, codificada por el virus mutante.

9. Utilización de un virus mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la preparación de una vacuna para la utilización terapéutica o profiláctica en la terapia tumoral.

10. Utilización de un virus mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la expansión in vitro de células T citotóxicas (por ejemplo específicas de virus).

11. Utilización de un virus mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la preparación de un medicamento para la terapia génica correctora terapéutica o profiláctica.

12. Virus mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para la utilización en un procedimiento para proporcionar un inmunoestímulo a un sujeto tratado humano o animal no humano, que comprende:

(i) poner en contacto el virus mutante ex vivo con una preparación de células capaz, tras la infección con el vector viral, de proporcionar un inmunoestímulo a un sujeto que debe tratarse; y

(ii) utilizar las células infectadas para administrar un estímulo inmunológico al sujeto que debe tratarse.

13. Virus mutante según la reivindicación 12, en el que las células infectadas se utilizan para administrar un estímulo inmunológico al sujeto que debe tratarse mediante la administración directa de las células infectadas como vacuna, por ejemplo, tras la inactivación previa a la administración, por ejemplo, tras la radiación.

14. Virus mutante según la reivindicación 12, en el que las células infectadas se utilizan para administrar un estímulo inmunológico al sujeto que debe tratarse mediante la utilización de las células para el cebado o la estimulación ex vivo de células inmunocompetentes, tales como células del sistema inmunológico del sujeto que debe tratarse, seguido de la readministración de las células inmunocompetentes, por ejemplo, sin la administración concurrente del virus o de células infectadas por el virus.

15. Virus mutante según la reivindicación 14, en el que las células infectadas ex vivo con el vector de virus son células autólogas.

16. Virus mutante según la reivindicación 14, en el que las células infectadas ex vivo con el vector de virus son células heterólogas, por ejemplo, que comprenden células de una línea celular tumoral.