MXPA98002999A - Vectores del virus del herpes y sus usos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un proceso para tratar una célula animal humana o no humana para introducir un material genético heterólogo en la célula y para expresar el material en la célula, que comprende (a) proporcionar un vector herpesviral recombinante el cual es un herpesvirus mutante atenuado o defectuoso en la replicación y no transformante, y el cual lleva un material genético heterólogo, y (b) transducir las células animales humanas o no humanas seleccionadas de:las células hematopoyéticas, las células malignas relacionadas con las células sanguíneas, y las células Cd34+ malignas o no malignas;poniendo en contacto las células con el vector del virus para transducir las células y expresar el material genético. Entre las aplicaciones de la técnica estála modificación de las células hematopoyéticas por la transferencia de los genes, por ejemplo para generar inmunógenos del tumor a partir de las células malignas.

Description

. VECTORES DEL VIRUS DEL HERPES Y SUS USOS Campo de la Invención Esta invención se refiere a vectores virales y a métodos para su uso, especialmente por ejemplo para transducir células, por ejemplo células malignas de linaje hematopoyético, y para inducir la expresión del material genético extraño en tales células. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas a base de tales vectores virales, a la producción de células infectadas con tales vectores virales, a preparaciones farmacéuticas basadas en tales células, a su uso para la administración a seres humanos y a animales no humanos, para expresar el material genético extraño in vivo, y al uso de materiales como se describe aqui para la fabricación de preparaciones para tratamiento y otras aplicaciones como se mencionó aqui. Los métodos de acuerdo con la invención pueden ser utilizados por ejemplo en inmunoterapia del cáncer.

Antecedentes de la Invención Los vectores virales recombinantes están entre los diversos agentes conocidos para la introducción de Rßf .027286 genes extraños en las células de modo que los mismos puedan ser expresados como proteina. Un elemento central es el propio gen de blanco u objetivo bajo el control de una secuencia promotora adecuada que puede funcionar en el célula que va a ser transducida. Las técnicas conocidas incluyen métodos no virales, tales como la adición simple de la construcción del gen de blanco u objetivo como ADN libre; la incubación con complejos del ADN de blanco u objetivo y proteínas especificas diseñadas para la absorción del ADN en la célula de blanco u objetivo; y la incubación con el ADN de blanco u objetivo encapsulado por ejemplo en liposomas u otros agentes de transfección a base de lipidos. Una opción adicional es el uso de vectores de virus recombinantes diseñados para contener el gen de blanco u objetivo requerido, y capaces de infectar las células de blanco u objetivo y por consiguiente para llevar dentro de la célula el gen de blanco u objetivo en una forma que puede ser expresada. Varios virus diferentes han sido utilizados para este propósito incluyendo los retrovirus, los adenovirus, y los virus adeno-asociados . La especificación de patente EP 0 176 170 (Institut Merleux: B Roizman) describe genes extraños insertados en el genoma viral del herpes simplex bajo el control de las regiones reguladoras del promotor del genoma, proporcionando por consiguiente un vector para la expresión del gen extraño. Se describen las construcciones del ADN, los vectores del plásmido que contienen las construcciones útiles para la expresión del gen extraño, los virus recombinantes producidos con el vector, y los métodos asociados. La especificación EP 0 448 650 (General Hospital Corporation: Al Geller, XO Breakefield) describe vectores de expresión del tipo 1 del virus del herpes simplex capaces de infectar y ser propagados en una célula no mitótica, y para su uso en el tratamiento de enfermedades neurológicas, y para producir modelos animales e in vitro de tales enfermedades. Los virus recombinantes ya se conocen en particular para su uso en la terapia del gen (por ejemplo correctiva) aplicada en las condiciones de deficiencia del gen. Los ejemplos de los genes utilizados o propuestos para ser utilizados en la terapia correctiva del gen incluyen: la adenosina desaminasa humana (ADA), como se mencionó por ejemplo en WO 92/10564 (KW Culver et al: US Secretary for Commerce & Célico Ine), y WO 89/12109 & EP 0 420 911 (IH Pastan et al): el gen de la fibrosis cistica y las variantes descritas en WO 91/02796 (L-C Tsui et al: HSC Research & University of Michigan), en WO 92/05273 ( FS Collins & JM Wilson: University of Michigan) y en WO 94/12649 (RJ Gregory et al: Genzyme Corp. ) . La técnica previa del tratamiento de los tumores malignos incluye estudios que han realzado el potencial de la vacunación terapéutica contra los tumores utilizando el material autólogo derivado de un tumor del propio paciente. La teoria general debajo de este enfoque es que las células tumorigenas pueden expresar una o más proteínas u otras macromoléculas biológicas que son distintas de las células sanas normales, y que podrían ser utilizadas por lo tanto para ubicar como blanco u objetivo una respuesta inmune para reconocer y destruir las células tumorigenas. Estas células tumorigenas pueden estar presentes ubicuamente en tumores de un cierto tipo. Un buen ejemplo de esto es en el cáncer cervical, en donde la gran mayoría de los tumores expresan las proteínas del papilomavirus E6 y E7 humano. En este caso el blanco u objetivo del tumor no es la propia proteina, y por consiguiente su potencial como un marcador especifico para el tumor, único, para la inmunoterapia del cáncer, es claro. Existe una evidencia creciente de que ciertas autoproteinas también pueden ser utilizadas como antigenos de blanco u objetivo para el tumor. Esto es en base a la observación de que las mismas son expresadas consistentemente en las células tumorigenas, pero no en las células sanas normales. Los ejemplos de estas incluyen la familia MAGE de las proteínas. Se espera que más autoproteinas útiles como agentes tumorigenos estén por identificarse. Los antigenos asociados con el tumor y su papel en la inmunobiologia de ciertos cánceres se describen por ejemplo en P van der Bruggen et al, en Current Opinión in Inmunology, 4(5) (1992) 608-612. Otros de tales antigenos, de la serie MAGE, son identificados en T. Boon, Adv Cáncer Res 58 (1992) pp 177-210, y MZ2-E y otros antigenos del tumor relacionados son identificados en P. van der Bruggen et al, Science 254 (1991) 1643-1647; los mucinos asociados con el tumor son mencionados en PO Livingston, en Current Opinión in Immunology 4 (5) (1992) pp. 624-629; por ejemplo MUC1 como se mencionó en J. Burchell et al, Int J Cáncer 44 (1989) pp. 691-696. Aunque algunos marcadores específicos para el tumor potencialmente útiles ya han sido identificados y caracterizados, la búsqueda de nuevos marcadores y que quizás sean más específicos, es laboriosa y consume mucho tiempo. Un melanoma de murino intracraneal experimental se ha descrito como el tratado como el mutante 1716 del HSV1 neuroatenuado (BP Randazzo et al, Virology 211 (1995) pp. 94-101), en donde la replicación del mutante pareció que va a estar restringido a las células tumorigenas y no ocurre sobre el tejido del cerebro circundante. La administración a los mamíferos de las citocinas como tales (es decir como proteina) ha sido intentada, pero frecuentemente es tolerada de manera pobre por el huésped y frecuentemente está asociada con varios efectos laterales incluyendo la náusea, el dolor de huesos y la fiebre. (A Mire-Sluir, TIBTech vol. 11 (1993); MS Moore, in Ann Rev Immunol 9 (1991) 159-91). Estos problemas son agravados por los niveles estrechos requeridos frecuentemente para mantener las concentraciones efectivas del plasma. Ya se conoce la modificación de los vectores de virus vivos que contengan genes que codifican una citocina o un antigeno del tumor. Los vectores de virus han sido propuestos para su uso en la inmunoterapia del cáncer para proporcionar un medio para mejorar la capacidad de inmunorespuesta del tumor. La especificación WO 86/07610 (Transgene: MP Kieny et al) describe la expresión del IL-2 humano en las células de mamífero por medio del poxvirus recombinante que comprende la totalidad o parte de una secuencia de ADN que codifica para una proteina de IL-2 humana. La especificación EP 0 259 212 (Transgene SA: R Lathe et al) describe vectores virales de los tipos pox, adeno o herpes, para controlar los tumores, que contienen una secuencia de ADN heteróloga que codifica para al menos las regiones esenciales de una proteina especifica para el tumor. La especificación WO 88/00971 (CSIRO, Australian National University: Ramshaw et al) describe una vacuna recombinante que comprende un vector de vacuna de virus pox, herpes o adeno, especialmente vaccinia, incluyendo una secuencia de nucleótido que expresa al menos parte de un polipéptido antigénico y una segunda secuencia que expresa al menos parte de una linfocina (interleucina 1, 2, 3 o 4, o gamma interferona) lo cual incrementa la respuesta inmune al polipéptido antigénico; y la especificación WO 94/16716 (E Paoletti et al: Virogenetics Corp.) describe virus de vaccinia recombinantes atenuados que contienen el ADN que codifica para una citocina o un antigeno de tumor, por ejemplo para su uso en la terapia del cáncer. Se ha propuesto utilizar las células tumorigenas transducidas de GMCSF como una vacuna terapéutica contra el cáncer renal. Los protocolos para los ensayos correspondientes involucran la remoción del material tumorigeno de los pacientes, y luego la transducción con el gen inmunomodulador apropiado. Las células diseñadas van a ser reintroducidas entonces en el paciente para estimular una respuesta inmune benéfica.

Los vectores a base del herpesvirus saimiri, un virus de los primates no humanos, se ha descrito que conduce a la expresión del gen en las células linfoides humanas (B Flecknstein & R Grass ann, Gene 102(2) (1991), pp. 265-9) . Sin embargo, se ha considerado indeseable utilizar tales vectores en el medio ambiente clínico. Aunque ya se conoce por lo tanto la introducción inmunomodulatoria y de otros genes en las células tales como ciertas clases de células tumorigenas, los métodos existentes para lograr esto se considera por los presentes inventores que tienen limitaciones, si las dificultades se deben a cantidad cuantitativas bajas de la transducción, a la complejidad, o a efectos laterales indeseables de los sistemas empleados. Los presentes inventores consideran que ha sido dificil hasta ahora introducir genes en varias clases de células, por ejemplo las células tumorigenas del linaje hematopoyético, tales como leucemias, o para hacer esto de manera eficiente, por ejemplo para propósitos de terapia correctiva del gen o inmunoterapia del cáncer. Para la transferencia de los genes a tales células como las células progenitoras hematopoyéticas, los vectores retrovirales han sido los vectores ensayados más ampliamente hasta el presente. Sin embargo, parece que estos vectores no se integran y no son expresados en células no divisoras, y esto limita su valor por ejemplo, cuando son utilizados en algunos casos en células del tallo hematopoyético (HSCs) o células primarias de las malignidades hematopoyéticas humanas como blancos u objetivos para la transferencia y expresión del gen. Para superar esta limitación, el cultivo de las células de blanco u objetivo, por ejemplo, HSCs, con los factores de crecimiento hematopoyético tales como las citosinas ya han sido intentados, con el objeto de inducir el HSCs en el ciclo e incrementar la eficiente de la transferencia del gen mediado por el retrovirus a estas células de blanco u objetivo, pero desafortunadamente las citocinas en el medio de cultivo parece que tienen inducida la diferenciación con la pérdida de la capacidad de antorenovación deseada de las células. Por consiguiente, los vectores virales adenoasociados han sido propuestos para su uso en lugar de vectores retrovirales, pero parece que la eficiencia de integración de tales vectores es baja. También, los presentes inventores consideran, con base en la experiencia reciente con los vectores adenovirales, que estos tienen limitaciones. Por consiguiente, aunque los mismos puedan infectar aproximadamente 50% de las células hematopoyéticas bajo ciertas condiciones, con frecuencia la expresión del gen es retardada durante varios dias. También se ha encontrado en ciertas pruebas que la transducción de un gen heterólogo en las células de leucemia aguda por un vector de adenovirus recombinante o un vector de retrovirus conduce ya sea a un rendimiento despreciable de la transducción o en el mejor de los casos a un rendimiento de la transducción de aproximadamente 3%, y que puede existir por consiguiente un problema en la eficiencia del rendimiento de la transducción con tales vectores .

La Presente Invención: Los presentes inventores consideran que la técnica previa todavia deja mucho que desear para proporcionar vectores virales y procesos para su uso en la transformación de células humanas y de animales. En particular, subsiste como una característica deseable proporcionar materiales y métodos para producir la transferencia del gen a las células humanas y no humanas con una velocidad adecuada. También es deseable proporcionar materiales y métodos para producir la transferencia del gen con una eficiencia adecuada. También es deseable la provisión de materiales y métodos para producir la transferencia del gen con aplicabilidad a un intervalo de utilidad de los tipos de las células de blanco u objetivo, incluyendo de manera completamente útil por ejemplo las células que no se dividen.

De acuerdo con un aspecto de la invención descrita aqui, las células de blanco u objetivo para la transducción por los vectores herpesvirales pueden ser elegidos por ejemplo de entre las células de los linajes hematopoyéticos; de las células linfoides o mieloides, de las células de Stern o de las células de CD34+, por ejemplo las preparaciones celulares que contienen tales células, como por ejemplo las obtenidas o preparadas con relación al trasplante de la médula ósea; o las células de origen neuroectodérmico, especialmente las malignas de tales células, y transducidas con los vectores virales como se describió aqui. En este uso, se ha encontrado que ciertos métodos y procedimientos de acuerdo con los ejemplos de la invención pueden conducir a una eficiencia de transducción sorprendentemente elevada. En un aspecto la presente invención busca proporcionar materiales y métodos para facilitar el uso de células tumorigenas como inmunógenos y vacunas. En un aspecto adicional la invención busca facilitar la transducción de las células del linaje hematopoyético y proporcionar composiciones útiles y procedimientos basados en las mismas. La presente invención también busca proporcionar medios para crear inmunógenos y vacunas terapéuticas que pueden ser utilizadas para inducir las respuestas inmune contra los antigenos específicos del tumor, por ejemplo en pacientes con tumores preexistentes . La invención es aplicable particularmente por ejemplo para la transferencia de los genes en las células hematopoyéticas tales como las células linfoides, que son no permisibles para la expresión de los genes Uticos finales del herpesvirus tales como el virus herpes simplex. De acuerdo con un aspecto de la invención se proporciona un proceso para tratar a una célula de un animal humano o no humano, para introducir el material genético heterólogo, por ejemplo el material que comprende un gen heterólogo, en la célula, por ejemplo para expresar el material genético en la célula, que comprende los pasos de (a) proporcionar un vector herpesviral recombinante el cual es un herpesvirus mutante atenuado o defectuoso en la replicación y no transformante, y el cual lleva el material genético heterólogo, por ejemplo un gen que codifica una proteina heteróloga, y (b) transducir las células animales humanas o no humanas seleccionadas de: las células hematopoyéticas, las células malignas relacionadas con las células de la sangre, y las células CD34+ malignas o no malignas; poniendo en contacto las células con el vector del virus para transducir las células. En las modalidades de la invención descritas posteriormente el material genético es expresado entonces en la célula. La transducción se lleva a cabo por la infección de la célula viva de blanco u objetivo por el vector viral de la manera conocida per se. Tal proceso comprende por ejemplo tratar una célula animal humana o no humana para introducir el material genético heterólogo en la célula para hacer a la célula más altamente inmunogénica, que comprende los pasos de: (a) proporcionar un vector herpesviral recombinante el cual es un herpesvirus mutante atenuado o defectuoso en la replicación y no transformante, y el cual lleva por ejemplo un gen que codifica una proteina inmunomodulatoria heteróloga seleccionada de las citocinas y de las moléculas coestimulantes inmunológicas y quimio-atrayentes, y (b) transducir las células animales humanas o no humanas malignas o no malignas, las cuales pueden ser seleccionadas por ejemplo de: las células malignas relacionadas con las células de la sangre, las células hematopoyéticas, las células CD34+ malignas o no malignas, poniendo en contacto las células con el vector del virus para transducir las células y hacer a las células más altamente inmunogénicas. Las preparaciones farmacéuticas provistas y utilizadas de acuerdo con ciertas modalidades de la invención, para su uso en la transducción de las células animales humanas o no humanas desde: las células hematopoyéticas; las células malignas relacionadas con las células de la sangre; y las células CD34+ malignas o no malignas; pueden comprender un vector de herpesvirus recombinante el cual es un herpesvirus mutante atenuado o defectuoso en la replicación y no transformantes, y los cuales llevan el material genético heterólogo, por ejemplo un gen que codifica una proteina heteróloga. Las preparaciones farmacéuticas provistas y utilizadas de acuerdo con ciertas modalidades de la invención pueden comprender células animales humanas o no humanas seleccionadas de: células hematopoyéticas; células malignas relacionadas con las células de la sangre; y células CD34+ malignas o no malignas; las células que han sido infectadas con un vector herpesviral recombinante el cual es un herpesvirus mutante atenuado o defectuoso en la replicación y no transformante, y el cual lleva por ejemplo un gen que codifica una proteina heteróloga. También está dentro de la invención un proceso de tratamiento de un sujeto o paciente el cual es un sujeto humano o un sujeto animal no humano para lograr la expresión de un gen extraño in vivo, que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica de las clases mencionadas anteriormente y descritas aqui; y un proceso para tratar un sujero el cual es un sujeto humano o un sujeto animal no humano para ocasionar una respuesta inmune, el cual comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica de las clases mencionadas anteriormente y descritas aqui. Un aspecto de la invención se refiere a la provisión y uso de un vector de herpesvirus, basado por ejemplo en un herpesvirus no transformante, que lleva un gen que codifica una proteina, por ejemplo una proteina in unomoduladora, o una proteina útil para la expresión con relación a la terapia del gen; también está provisto por la invención su uso en la transducción de células para hacerlas más altamente inmunogénicas; entre las células que pueden ser tratadas útilmente de esta manera están por ejemplo las células malignas de los animales humanos y no humanos, especialmente por ejemplo las células malignas relacionadas con las células de la sangre, por ejemplo las células leucémicas, o las células hematopoyéticas, incluyendo las células CD34+, ya sea malignas o no malignas. Por consiguiente, las células adecuadas para el tratamiento incluyen por ejemplo las células progenitoras hematopoyéticas tales como las células CD34+ sanas, las cuales cuando se transducen con los vectores del herpesvirus que llevan un gen heterólogo que se desea expresar en la célula tratada, puede llevar un número elevado de copias del gen heterólogo, haciendo posible la recombinación homologa con el genoma de la célula tratada sin la necesidad de una integrasa.

Entre las aplicaciones de las modalidades de la presente invención está la modificación de las células hematopoyéticas malignas por la transferencia de los genes para generar inmunógenos del tumor. Entre las substancias que pueden ser generadas de manera útil en una célula modificada para funcionar como un inmunógeno del tumor están el GM-CSF y la interleucina 2. Por ejemplo, se ha reportado que la producción de la interleucina 2 por la función auxiliadora de los derivaciones T de las células del tumor en la generación de una respuesta antitumor (ER Fearon et al, Cell 60 (1990) pp. 397 y sig. ) , y se ha reportado en el caso del GM-CSF de murino (G Dranoff et al, Proc Nat Acad Sci USA 90 (1993) pp. 3539 y sig.) que la vacunación con las células tumorigenas irradiadas diseñadas para secretar la GM-CSF estimula la inmunidad antitumorigena potente, especifica y a largo plazo. Por consiguiente, de acuerdo con las modalidades de la invención, un herpesvirus recombinante, por ejemplo un HSV recombinante, puede ser utilizado como un vector para la transducción de (por ejemplo) las células de la leucemia para producir la expresión del material genético insertado, por ejemplo un gen que codifica una proteina inmunomodulatoria u otra proteina relevante para la inmunoterapia del cáncer o la terapia del gen, en tales células. En particular los ejemplos de la invención, un virus herpes simplex recombinante, ya sea de HSV1 o de HSV2, diseñadas para contener un gen heterólogo como parte de su genoma, pueden ser utilizadas para suministrar el gen con buena eficiencia a las células de la leucemia, para evocar la expresión efectiva del gen heterólogo dentro de las células tumorigenas, y las células transducidas pueden ser utilizadas entonces para los ejemplos como un inmunógeno celular tal como una vacuna para la inmunoterapia del cáncer, y por medio de esto, entre otros efectos, a los efectos inmune mediados sobre las células tumorigenas diferentes de las células infectadas con el vector del virus. Por consiguiente la invención también proporciona métodos útiles para la transducción del gen de las células de la leucemia entre otras. También se proporcionan de acuerdo con ciertas modalidades de la invención, métodos para utilizar un herpesvirus recombinante tal como un HSV, por ejemplo un herpesvirus defectuoso en la replicación tal como un HSV defectuoso en la replicación, ya sea de HSV1 o HSV2, para la transducción de varios tipos de células basadas en las células de linaje hematopoyético, y otros tipos de células, por ejemplo neuroblastomas, por ejemplo para introducir los genes inmunomoduladores, u otros genes con el propósito de la terapia del gen o la inmunoterapia del cáncer, en tales células.

También se ha encontrado que la transducción en las células de la leucemia utilizando un ejemplo de un vector recombinante a base de HSV puede ser logrado exitosamente utilizando células tumorigenas frescas. Asi, las células tumorigenas, las cuales pueden ser células que (previo a la transducción) ninguna ha sido incubada en su totalidad bajo las condiciones del cultivo de las células, o que tampoco han sido incubadas durante más de algunas horas (por ejemplo, no más de aproximadamente 2 hasta 4 horas, o no incubadas ya durante toda la noche) , por ejemplo las células tumorigenas muestreadas recientemente, pueden ser expuestas a un vector de herpesvirus recombinante como se mencionó aqui llevando el material genético adecuado. Este puede ser un material genético que no está expresado, o que no está expresado substancialmente, por las células tumorigenas, por ejemplo el material genético que codifica una proteina inmunomodulatoria tal como por ejemplo GM-CSF, por lo cual se infectan las células con el vector de herpesvirus recombinante, y las células infectadas resultantes pueden ser utilizadas por ejemplo ya sea para reinfusión en el sujeto a partir de quien las células de origen fueron obtenidas, o para la reacción con los leucocitos in vitro. Por ejemplo, las células de la leucemia humana muestreadas recientemente pueden ser expuestas a un vector de virus que lleva un gen que codifica un GM-CSF humano o inter alia una de las otras proteínas inmunomoduladoras mencionadas aqui, y reinfusionadas en el paciente como una preparación de célula inmunogénica, por ejemplo utilizando algunos o la totalidad de los pasos del procedimiento mencionado posteriormente, con una extensión útil de la transducción de las células. En contraste, previamente, utilizando un vector de retrovirus, se ha probado que es necesario cultivar las células del tumor in vitro durante algunos dias antes de que los mismos puedan ser transducidos de manera útil; por ejemplo para activar a las células en la división celular y para hacerlas susceptibles a la transducción retroviral. Esto puede ser una ventaja útil de los vectores de herpesvirus recombinantes como se describió aqui, puesto que esto reduce la necesidad de la manipulación de laboratorio de las células tumorigenas, puede ser más rápido, con una transducción de las células más eficiente, y pueden presentar una opción de tratamiento clínico más viable. Las células T citotóxicas pueden ser activadas y/o expandidas, por ejemplo in vitro, por ejemplo para propósitos de inmunoterapia del cáncer, por el uso de células de blanco u objetivo o que se presentan transducidas viralmente, por ejemplo especialmente las células de blanco u objetivo del linaje hematopoyético, las células CD34+, en donde el virus utilizado para la transducción es un vector como se describió aqui, que lleva un gen que codifica un antigeno relevante para la terapia desea, por ejemplo un antigeno codificado por EBV o HPV, y además, si se desea, que codifica una proteina inmunomoduladora como se mencionó aqui. Un ejemplo de tal uso es el caso de los tumores de células donadoras en los pacientes de trasplante en donde las células del tumor expresan los antigenos de EBV o de HPV: los linfocitos T del donador pueden ser activos y expandidos con relación a las células de blanco u objetivo, por ejemplo de los tipos mencionados anteriormente, que expresan los antigenos de EBV o HPV como un resultado de la transducción por los vectores virales como se describió aqui que llevan los genes heterólogos correspondientes, por ejemplo los genes E6 o E7 de HPV. Los herpervirus recombinantes como se mencionó aqui, también pueden transducir otros tipos de células tumorigenas, tales como las células de neuroblastoma, con buena eficiencia. El herpesvirus recombinante utilizado como un vector de acuerdo con esta invención puede contener un gen que codifica una proteina inmunomodulatoria, u otra proteina relevante para la inmunoterapia del cáncer o terapia del gen.

Los genes que codifican cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras pueden ser utilizados de esta manera para hacer a las células tumorigenas inmunogénicas, en los animales humanos y no humanos. Las respuestas inmune resultantes pueden ser utilizadas en la prevención y el tratamiento del crecimiento de los tumores . Los inmunomoduladores son moléculas que pueden mejorar o reprimir las respuestas inmunológicas. Los mismos incluyen las citocinas (glicoproteinas solubles las -cuales inician o mejoran la activación, el crecimiento y la diferenciación de las células del sistema inmune) , las moléculas coestimulatorias (estructuras presentes sobre la superficie de las células dentro del cuerpo que interactúan con las células inmune para ayudar a estimular las respuestas inmune) y las moléculas quimio-atrayentes (inmunológicas) las cuales sirven para atraer a las células inmune a los sitios de actividad inmune o inflamatoria, por ejemplo en las cuales los antigenos pueden estar presentes. La proteina de "inmunomodulación" o "inmunomodulatoria", como es referida aqui, incluye una o más proteínas las cuales pueden mejorar una respuesta inmune del huésped, por ejemplo a un virus mutante, o a un antigeno tal como un inmunógeno de un patógeno o una fuente exógena al virus, o a un antigeno asociado al tumor, el cual puede ser producido por ejemplo por el virus mutante. Las proteínas de inmunomodulación no son aquellas utilizadas actualmente como inmunógenos por si mismas. Las proteínas inmunomoduladoras para las cuales las secuencias de nucleótidos codificantes son llevadas expresamente por los virus como se describió aqui, pueden tener de una manera útil secuencias naturales para las especies las cuales van a recibir la vacunación por los virus recombinantes, o los cuales de otra manera reciben las células transducidas con los virus recombinantes, por ejemplo se recomienda utilizar una proteina inmunomoduladora de una secuencia substancialmente humana para transducir una preparación de células que va a ser utilizada como un inmunógeno humano o vacuna, o va a ser utilizada de otra manera con relación a los seres humanos . Cualquier riesgo asociado con la expresión de tales proteínas en el virus de replicación completa, es eliminado en donde el virus es un mutante defectuoso en la replicación. En ciertas modalidades, las proteínas pueden ser seleccionadas para mejorar el efecto del virus mutante como un inmunógeno o vacuna en el contexto en el cual el mismo es empleado. Los ejemplos de las proteínas inmunomoduladoras útiles incluyen citocinas, por ejemplo las interleucinas 1 a 15 (IL1 a IL15), las interferonas alfa, beta o gamma, el factor de necrosis del tumor (TNF) , el factor estimulante de la colonia de macrófagos-granulocitos (GMCSF) , el factor estimulante de la colonia de macrófagos (M-CSF) , el factor estimulante de la colonia de granulocitos (G-CSF) , las quimiocinas tales como la proteina de activación de los neutrófilos (NAP) , el factor quimioatrayente y de activación de los macrófagos (MCAF) , RANTES, los péptidos inflamatorios de los macrófagos MIP-1 y MlP-lb, los componentes complementarios y sus receptores, las moléculas accesorias tales como una de la familia B7 de los coestimuladores de la célula T tales como B7.1 o B7.2, ICAM-1, 2 o 3, el ligando OX40 y los receptores de la citocina. En donde las secuencias de nucleótidos que codifican más ' de una proteina inmunomodulatoria son insertados, las mismas pueden comprender más de una citocina o pueden ser una combinación de citocina (s) y molécula (s) accesorias. Muchas clases adicionales de proteínas y genes inmunomoduladores pueden ser útiles en esta invención. Los ejemplos de las proteínas inmunomoduladoras particularmente útiles incluyen GMCSF; IL2; IL4; IL7; IL12; B7.1; TNF-alfa; interferona gamma; CD40L; y linfotactina. El material genético que codifica una proteina inmunomoduladora puede ser llevada en el genoma viral mutante como un marco de lectura abierta expresable que codifica una proteina híbrida o de fusión la cual comprende una región de polipéptido que tiene homología con y la funcionalidad de una proteina inmunomoduladora, enlazada o relacionada con una región de polipéptido que tiene otra homología y opcionalmente otra funcionalidad. Por ejemplo, la proteina inmunomodulatoria puede ser, comprender, o corresponder en funcionalidad con la proteina gp34 identificada como un compañero de unión para la OX-40 humana (véase W Godfrey et al, J Exp Med 180(2) 1994 pp. 757-762, y las referencias citadas alli, incluyendo S Miura et al, Mol Cell Biol 11(3) 1991, pp. 1313-1325) . La versión de esta funcionalidad de la proteina que puede ser codificada en el genoma viral mutante puede corresponder a la propia secuencia de gp34 natural, o a un fragmento de la misma, o a un producto de expresión híbrido, por ejemplo a base del dominio extracelular (de unión) (C-terminal) del gp34 fusionado a otra proteina, por ejemplo a la región constante de una cadena pesada de inmunoglubolina tal como la IgGl humana, por ejemplo con el dominio extracelular de la gp34 (una proteina de membrana del tipo 2) fusionada en su N-terminal al C-terminal del dominio constante de la inmunoglobulina . Otras de las proteínas inmunomoduladoras también pueden ser llevadas y expresadas en las formas correspondientes u otras formas híbridas y derivadas. También se sobreentiende que las mutaciones de las secuencias de aminoácidos de tales proteínas inmunomoduladoras pueden ser incorporadas. Están incluidas aqui las proteínas que tienen secuencias mutadas de tal modo que las mismas permanezcan homologas, por ejemplo en la secuencia, en la función, y el carácter antigénico, con una proteina que tiene la secuencia original correspondiente. Tales mutaciones pueden ser preferiblemente por ejemplo mutaciones que involucran cambios de aminoácidos conservadores, por ejemplo cambios entre los aminoácidos de propiedades moleculares ampliamente similares. Por ejemplo, los intercambios dentro del grupo alifático de alanina, valina, leucina e isoleucina se pueden considerar como conservadores. Algunas veces la substitución de uno de estos también puede ser considerado como conservador, los intercambios dentro del grupo alifático del aspartato y el glutamato también pueden ser considerados como conservadores. Los intercambios dentro del grupo alifático de asparagina y glutamina también pueden ser considerados como conservadores. Los intercambios dentro del grupo de hidroxi de la serina y treonina también pueden ser considerados como conservadores. Los intercambios dentro del grupo aromático de la fenilalamina, tirosina y triptófano, también pueden ser considerados como conservadores. Los intercambios dentro del grupo básico de la Usina, arginina e histidina, también pueden ser considerados como conservadores. Los intercambios dentro del grupo básico de la metionina y la cisteina, también pueden ser considerados como conservadores. Algunas veces la substitución dentro del grupo de metionina y leucina también pueden ser considerada como conservadora. Los grupos de substitución conservadores preferidos son el aspartato-glutamato; asparagina-glutamina; valina-leucina-isoleucina; alanina-valina; fenilalanina-tirosina; y lisina-arginina. En otros aspectos, las secuencias mutadas pueden comprender la inserción y/o las deleciones. Los ejemplos útiles de las formas híbridas y derivadas incluyen proteínas con secuencias que tienen delecionada a partir de las mismas cualquiera de: un segmento de la transmembrana, una porción de secuencia intracelular, una secuencia N-terminal o C-terminal, por ejemplo una secuencia desde 1-5 aminoácidos hacia arriba; y/o las secuencias que tienen agregadas a las mismas cualquiera de por ejemplo una secuencia N-terminal o C-terminal, por ejemplo una secuencia desde 1-5 aminoácidos hacia arriba, o una secuencia funcional adicional por ejemplo como se describió anteriormente. Adecuadamente la proteina inmunomoduladora puede comprender una citocina, por ejemplo el factor estimulante de la colonia de macrófagos-granulocitos (GMCSF) . El gen de GM-CSF de murino, por ejemplo, codifica un polipéptido de 141 aminoácidos, la glicoproteina secretada madura que tiene un peso molecular de entre 14k-30k daltons dependiendo del grado de la glicosilación. El GM-CSF es un elemento de la familia del factor de crecimiento hematopoyético y se definió e identificó en primer lugar por su capacidad para estimular la formación de la colonia in vitro en los progenitores hematopoyéticos. La GM-CSF es un activador potente de la función de los monocitos de los neutrófilos, eosinófilos y el macrófago, el mejoramiento de la migración, la fagocitosis, la expresión del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) , y que inicia una cascada de moléculas bioactivas las cuales estimulan además el sistema inmune. La GM-CSF humana está siendo evaluada habitualmente en la clínica para el tratamiento de la neutropenia siguiente a la quimioterapia y como un adyuvante en la terapia del cáncer. La secuencia de nucleótidos heteróloga empleada puede comprender un gen heterólogo, el fragmento del gen o la combinación de los genes. La invención también es aplicable a la terapia del gen correctiva, para mejorar la utilidad o viabilidad de la célula de blanco u objetivo. Por ejemplo, las células de CD34+ normales pueden ser transducidas con el vector viral como se describió aqui, que codifican una enzima de reparación del ADN tal como la 06-metilguanina ADN metiltransferasa (MGMT) , para la protección de las células de blanco u objetivo, por ejemplo durante la quimioterapia por ejemplo con nitrosourea, véase T Moritz et al, Cáncer Res 55(12) (1995) pp. 2608-2614; R Maze et al, Proc Nat Acad Sci USA 93(1) 1996 206-210; o contra el daño por radiación. Otros genes para la terapia correctiva del gen, de las clases mencionadas anteriormente, también pueden ser transducidos como se transfirieron a las células de blanco u objetivo. El ADN heterólogo, por ejemplo el ADN adicional, puede ser introducido de manera útil en el vector del virus para otros propósitos, por ejemplo para codificar expresablemente una integrasa tal como una que se sabe que va a ser capaz de actuar para integrar el ADN del vector viral en el genoma del huésped de modo que el ADN del vector llegue a ser propagado cuando ocurra la mitosis de la célula huésped; y para otros propósitos. Además, de acuerdo con las modalidades de la invención, se proporcionan materiales y métodos para insertar material genético correctivo o letal para destruir o modular las células del blasto malignas. Esto se hace por ejemplo por la expresión en la célula de blanco u objetivo, por medio de los métodos del vector herpesviral descrito aqui, del ARN antisentido o de las secuencias del ribozima que corresponden al material genético codificado por el vector; por ejemplo como se indicó en D Marcóla et al, "Antisense Approaches to Cáncer Gene Therapy", Cáncer Gene Ther 2 (1995) pp. 47 y siguientes. Las técnicas para el uso de los polinucleótidos antisentido ya se conocen per se, y son fácilmente adaptables a la especificidad necesaria para la presente solicitud utilizando las secuencias de nucleótidos adecuadas, por ejemplo de al menos aproximadamente 12 nuecleótidos complementarios en la secuencia con respecto a la secuencia de un blanco u objetivo elegido; eligiendo de entre los promotores conocidos adecuados para el medio ambiente celular en el cual los mismos van a ser efectivos, y otras mediciones bien conocidas per se. Por ejemplo, las técnicas para el uso del ARN antisentido para alterar o interrumpir la expresión de un gen de blanco u objetivo están indicados (con relación al gen de sialidasa) en la especificación WO 94/26908 (Genentech: TG Warner et al) . Las técnicas para utilizar los oligonucleótidos antisentido capaces de unirse específicamente a las moléculas de ARNm también están indicadas en la especificación WO 94/29342 (La Jolla Cáncer Research Foundation and the Reagents of the University of Michigan: R Sawada et al) (con relación particular a los polipéptidos derivados de lamp que codifican el ARNm) . Las técnicas para los oligonucleótidos antisentido complementarios para el ARN de blanco u objetivo están indicadas en la especificación WO 94/29444 (Departament of Health and Human Services; B Ensoli y R Gallo) (como se aplicó al ARN del factor de crecimiento del fibroblasto básico) . Las técnicas para utilizar los oligonucleótidos antisentido que tienen una secuencia substancialmente complementaria con respecto a un ARNm el cual es a su vez complementario con un ácido nucleico de blanco u objetivo, para inhibir la función o expresión del blanco u objetivo, están indicadas en WO 94/24864 (General Hospital Corporation: HE Blum et al), (como se aplicó a la inhibición de la replicación viral de la hepatitis B) . Una revisión de las técnicas antisentido se da por D Mercóla y JS Cohén, cap. 7, pp. 77-89 en RE Sobol y K J Scanion (eds.) "Internet Book of Gene Therapy: Cáncer Therapeutics" (Appleton & Lange, Stamford, Connecticut, 1995) . Las aplicaciones para otras especificidades de blanco u objetivo son fácilmente accesibles por adaptación. Las técnicas para utilizar las ribozimas para alterar o romper la expresión de los genes también son conocidas per se. Por ejemplo, las técnicas para fabricar y administrar las ribozimas (u oligonucleótidos antisentido) para desdoblar un ARNm de blanco u objetivo o alterar de otra manera la expresión de un gen de blanco u objetivo, están indicadas en la especificación WO 94/13793 (Apollon; CJ Pachuck et al) (como se aplicó a los ribozimas ubicando como blanco u objetivo ciertos ARNms relevantes para las leucemias) . Una revisión de las técnicas de ribozimas se dan en M Kashani-Saber y K J Scanion, cap. 8 pp. 91-101 en RE Sobol y KJ Scanion (eds.) "Internet Book of Gene Therapy: Cáncer Therapeutics" (Appleton & Lange, Stamford, Connecticut, 1995) . También aqui, las aplicaciones a otras especificidades de blanco u objetivo son fácilmente accesibles por adaptación. Un gen letal también puede ser insertado en el vector para destruir la célula transducida; por ejemplo un gen que es letal con relación a una substancia farmacéutica administrada, como se describe por ejemplo en la especificación WO 95/14100 (Wellcome Foundation; C Richards et al), que ejemplifica un gen que codifica la citosina desaminasa (CDA) bajo el control de un promotor de CEA, el cual cuando se introduce en una célula es letal con relación de la administración de la 5-fluorocitosina, transformada por el CDA en el 5-fluorouracilo tóxico. El herpesvirus recombinante utilizado para llevar un gen que codifica una proteina inmunomodulatoria u otro material genético como se describe aqui, es preferiblemente un herpesvirus atenuado o defectuoso en la replicación. El herpesvirus mutante puede ser de manera útil un mutante o cualquier herpesvirus adecuado; por ejemplo un mutante no transformante de un herpesvirus de mamífero; por ejemplo un mutante de un herpesvirus humano no transformante, especialmente por ejemplo un herpesvirus mutante recubierto o envuelto. Los ejemplos de los herpesvirus de los cuales los mutantes son provistos y que pueden ser utilizados como vectores de acuerdo con las modalidades de la invención incluyen el virus herpes simplex del tipo 1 (HSV-1) o del tipo 2 (HSV-2), un citomegalovirus humano o de animal (CMV), por ejemplo el citomegalovirus humano (HCMV) , el virus de la varicella zoster (VZV) , y/o los herpesvirus humanos 6 y 7, el EBV es menos deseable, excepto en la forma de un mutante no transformante, a causa de sus propiedades transformantes normalmente. Los virus de animales de los cuales se proporcionan los mutantes de acuerdo con las modalidades de la invención incluyen el virus de la pseudorabia (PRV), los herpesvirus equino y bovino incluyendo los tipos EHV y BHV tales como IBRV, y el virus de la enfermedad de Marek (MDV) y los virus relacionados. La nomenclatura de los genes de los herpesvirus y sus muchos homólogos correspondientes es diversa, y en donde lo admita el contexto, la mención del gen con relación a un herpesvirus incluye la referencia, con relación a otros herpesvirus que poseen un homólogo de este gen, al homólogo correspondiente. los herpesvirus adecuados para ser utilizados como una base para la recombinación, para producir un vector adecuado para su uso de acuerdo con la presente invención incluyen los herpesvirus defectuosos que se adaptan a las direcciones o reglas generales o especificas en la especificación WO 92/05263 (Inglis et al; Immunology Limited) (la descripción de la cual es incorporada aqui para referencia, la cual describe por ejemplo el uso como un inmunógeno o vacuna de un virus mutante cuyo genoma es defectuoso con respecto a un gen esencial para la producción de un virus infeccioso, de tal modo que el virus pueda infectar las células huésped normales y padecer la replicación y la expresión de los genes del antigeno viral en tales células pero no pueden producir el virus infeccioso. La patente WO 92/05263 describe particularmente un virus de HSV el cual sea inhabilitado por la deleción de un gen que codifica la glicoproteina H esencial (gH) la cual es requerida para la infectividad del virus (A Forrester et al, J Virol 66 (1992) 341-348). En la ausencia de la expresión de la proteina gH, se producen partículas de virus no infecciosas que proporcionan casi el repertorio completo de las proteínas virales. Estas partículas de la progenie, sin embargo, no son capaces de infectar las células huésped y la difusión o dispersión del virus dentro del huésped es prevenida. Tal virus se ha mostrado que va a ser una vacuna e inmunógeno efectivo en los sistemas de modelo animal (Farrel et al, J Virol 68 (1994) 927-932; McLean et al. J Infect Dis, 170 (1994) 1100-9) . Tales virus mutantes pueden ser cultivados en una linea celular que expresa el producto del gen con respecto al cual el virus mutante es defectuoso. La literatura también describe las lineas celulares que expresan las proteínas del virus de herpes simplex; la glicoproteina gB (Cai et al, en J Virol 61 (1987) 714-721), la glicoproteina gD (Ligas y Johnson, en J Virol 62 (1988) 1486) y la proteina ICP4 de Inicio Inmediato (Deluca et al, en J Virol 56 (1985) 558). Estas también se ha mostrado que son capaces de soportar la replicación de los virus inactivados con respecto a los genes correspondientes. Los datos de la secuencia substanciales o completos se han publicado para varios virus tales como el citomegalovirus humano CMV (Weston y Barrell en J Mol Biol 192 (1986) 177-208), el virus de varicella zoster VZV (AJ Davison y Scott, en J Gen Virol 67 (1986) 759-816) y el virus de herpes simplex HSV (McGeoch et al, en J. Gen. Virol. 60 (1988) 1531-1574 y las referencias adicionales citadas posteriormente) . La glicoproteina gH se sabe que tiene homólogos en CMV y VZV (Desai et al, en J Gen Virol 69 (1988) 1147). Los ejemplos adecuados de tales genes son los genes para las glicoproteinas virales esenciales, por ejemplo, las glicoproteinas virales esenciales (finales) tales como el gH, gL, gD, y/o gB, y otros genes esenciales. Los genes esenciales y otros genes del herpesvirus humano son identificables de DJ McGeoch, "The Genomes of the Human Herpesviruses", en Ann Rev Microbiol 43 (1989) pp. 235-265; DJ McGeoch et al, Nucí Acids Res 14 (1986) 1727-1745; DJ McGeoch et al, J Mol Biol 181 (1985) 1-13, para los datos y referencias citados alli. También se hace referencia a los datos para los homólogos de la glicoproteina gH por ejemplo en CMV y VZV, publicados por ejemplo en Desai et al, J Gen Virol 69 (1988) 1147). También son útiles como vectores de virus en la presente invención por ejemplo los mutantes tales como el mutante de HSV-1 (en 1814) incapaz de transducir inmediatamente la expresión del gen inicial, y esencialmente avirulento cuando se inyecta en ratones, descrito por Cl Ace et al, J Virol 63(5) 1989 pp. 2260-2269. La especificación WO 91/02788 (CM Preston & Cl Ace; University of Glasgow) describe mutantes de HSV1 útiles incluidos en 1814, capaces de establecer una infección latente en una célula huésped neuronal y de provocar la expresión de un gen terapéutico insertado. Los ejemplos adicionales de los vectores del virus útiles en la invención están basados en una mutación en un gen inicial inmediato del herpesvirus, por ejemplo un gen que corresponde a ICPO, ICP4, ICP22 e ICP27. Las mutaciones pueden ser utilizadas en combinación, por ejemplo como se describe en WO 96/04395 (P Speck: Lynxvale), incorporada para referencia. También son adecuados como los vectores del virus para su uso en la presente invención como tales mutantes de HSV1 neuroatenuados, el mutante 1716 (BP Randazzo et al, Virology 211 (1995) pp. 94-101). Para el herpesvirus se hace referencia adicional a los datos publicados por ejemplo con respecto al ciromegalovirus humano CMV (Weston y Barrell en J Mol Biol 192 (1986) 177-208), y el virus de la varicella zoster VZV (AJ Davison et al, en J Gen Virol 67 (1986) 759-816) . De acuerdo con ciertos ejemplos de la presente invención como se describen con detalle adicional posteriormente, un inmunógeno de virus inactivado genéticamente tal como una vacuna proporciona un portador útil para los genes que codifican las proteínas inmunomoduladoras. La vacuna del virus puede infectar las células del huésped vacunado que conduce a la síntesis intracelular de las proteínas inmunomoduladoras. Si la vacuna inactiva genéticamente también está actuando como un vector para el suministro de los antigenos extraños, entonces la respuesta inmune contra el antigeno extraño puede ser mejorada o alterada. Puesto que estos virus defectuosos en la replicación pueden padecer solamente un solo ciclo de replicación en las células del huésped vacunado, y falla en la producción de nuevas partículas de virus infecciosas, la producción de las proteínas inmunomoduladoras está limitada al sitio de la vacunación, en contraste con la situación con el virus competente en la replicación, en donde la infección puede ser difundida. Además, las cantidades completas de la proteina inmunomodulatoria producida, aunque localmente suficientes para estimular una respuesta inmune vigorosa, serán menores que aquellas producidas por un virus competente en la replicación, y menos probablemente producirán respuestas sistemáticas adversas. En tal modalidad preferida, la secuencia de nucleótidos heteróloga, que comprende usualmente un gen que codifica una proteina inmunomoduladora u otra proteina, es insertada en el genoma del virus mutante en el sitio del gen esencial delecionado, y más preferiblemente, la secuencia de nucleótidos heteróloga reemplaza completamente el gen el cual es delecionado en su totalidad. De esta manera, aún si se lleva a cabo cualquier evento recombinante no deseado, y conduce a la reinserción del gen delecionado desde una fuente silvestre en el virus mutante, podria ser más probable eliminar la secuencia de nucleótidos heteróloga insertada. Esto podria evitar la posibilidad de que un portador viral competente en la replicación para la secuencia de nucleótidos heteróloga pueda ser producido. Tal evento recombinante podria ser extremadamente raro, pero en esta modalidad, los efectos perjudiciales de tal suceso ocasional podrían ser minimizados. Los materiales y métodos de acuerdo con la invención pueden ser utilizados para evocar los mecanismos de efectos inmunológicos activados por los inmunoagentes celulares tales como las vacunas terapéuticas, en particular para evocar los linfocitos citotóxicos T específicos (CTLs) dirigidos contra los antigenos de blanco u objetivo. Tales CTLs pueden ejercer un efecto benéfico que tiende a reconocer y destruir las células tumorigenas, y también puede ser utilizado exvivo en una variedad de métodos terapéuticos y/o de diagnóstico. En donde existan diferencias antigénicas entre las células del tumor y las células normales, las mismas pueden ser reconocidas por el sistema inmune, siempre que los antigenos específicos para el tumor estén disponibles en la forma correcta para estimular una respuesta inmune. Esto evita la necesidad de identificar los marcadores específicos del tumor. Los CTLs destruyen las células con base en el reconocimiento del antigeno en conjunción con los antigenos del complejo de la histocompatibilidad mayor del huésped (MHC) ; los péptidos generados del blanco u objetivo antigénico dentro del citoplasma de la célula huésped forman un complejo con las moléculas de MHC del huésped y son transportadas a la superficie de la célula, en donde los mismas pueden ser reconocidas por los receptores sobre la superficie de los CTLs. Un método de utilización de los vectores, provisto por esta invención, es por lo tanto preparar un inmunógeno celular tal como una vacuna del material del tumor derivado de uno o más individuos y administrar este como un inmunógeno o vacuna para el tratamiento de otros sujetos, por ejemplo pacientes. Si se desea una respuesta de CTL contra las células tumorigenas, sin embargo, por las razones descritas anteriormente, los antígenos de blanco u objetivo deben ser presentados en el contexto de las moléculas de MHC correctas. Un inmunógeno o vacuna preparada a partir de un tumor de un individuo podría no ser siempre apropiada para otro individuo con un tipo de MHC diferente. Puesto que las moléculas de MHC varían de individuo a individuo, generalmente es necesario, para activar las respuestas de CTL contra los antigenos de blanco u objetivo, presentar el antigeno de blanco u objetivo relativamente para el sistema inmune en el contexto de MHC correcto. Por consiguiente, para su uso como un inmunógeno tal como una vacuna terapéutica, en general se considera que el antígeno de blanco u objetivo seleccionado sea mejor introducido en las propias células del sujeto o paciente para generar una respuesta de CTL apropiada. Por lo tanto puede ser especialmente útil con base en la vacuna o inmunógeno del tumor sobre las células tumorigenas del propio paciente, un procedimiento conocido como vacunación autóloga. Una ventaja principal adicional de esta forma de uso es que puede aprovechar la ventaja de los blancos u objetivos antigénicos que pueden ser únicos para un tumor particular; se considera que el control del ciclo de la célula desregulada que es la base del crecimiento del tumor, durante un período de tiempo, puede conducir a la acumulación de cambios genéticos manifestados como nuevas determinantes antigénicas. Con relación a esto, las modalidades mencionadas al último de la presente invención pueden evitar o resolver el problema del procedimiento de vacunación autólogo, especialmente que las células del tumor autólogo son problemente inmunogénicas.

Los procedimientos de acuerdo con los ejemplos de la invención pueden involucrar la introducción de un gen de blanco u objetivo en las células tumorigenas removidas de un sujeto, por procedimientos de laboratorio después de los cuales las células asi tratadas son reintroducidas en un sujeto que va a ser tratado (tratamiento ex-vivo) . Un procedimiento alternativo de acuerdo con ciertos ejemplos de la invención es introducir el gen de blanco u objetivo directamente en las células tumorigenas del paciente (tratamiento in vivo) . La ventaja de un procedimiento in-vivo es que no se requiere ninguna manipulación de laboratorio de las células tumorígenas del paciente. Una desventaja puede ser que la transducción efectiva del gen puede ser más difícil de lograr in vivo, o más difícil de lograr hasta un grado deseado. Otras células, diferentes de las tumorigenas, también pueden ser transfectadas de manera útil con los vectores del virus. En un ejemplo particular, el herpesvirus recombinante está basado en una forma inhabilitada del virus de herpes simplex que lleva una deleción en el gen de la glicoproteina H (gH) , una proteina presente en la superficie de la partícula del virus que está involucrada en la entrada del virus en las células susceptibles. Este virus solamente puede ser replicado en una linea de células productoras que complementa la función esencial errónea en el genoma viral; un ejemplo útil de una linea celular complementaria recombinante es una la cual ha sido diseñada para expresar establemente el mismo gen HSV gH que fue delecionado del vector del virus. El virus generado de la línea celular productora adquiere el producto del gen gH codificado por la célula como una parte de su estructura y es infeccioso. Esta preparación del virus puede infectar las células normales de la misma manera que el virus del tipo silvestre. Una vez en la célula, el genoma del virus puede ser replicado intracelularmente, y los genes llevados por el genoma pueden ser expresados como una proteina. Sin embargo, la ausencia de una proteina gH funcional cuando el virus defectuoso infecta una célula normal conduce a una falla para generar nuevas partículas del virus infeccioso. El virus delecionado de gH se considera que va a ser seguro de administrar como una vacuna o un vehiculo de suministro del gen. Es preferible que un vector tal como un vector de HSV para la inmunoterapia del cáncer sea incapacitado totalmente e incapaz de difundirse dentro del huésped tratado. Un vector útil, sin embargo, puede estar basado en cualquier virus de HSV que sea considerado suficientemente seguro para ser utilizado en un medio ambiente clínico. También es preferible que los genes heterólogos incorporados en tal genoma de HSV delecionado de gH, sean insertados en el sitio a partir del cual el gen de gH fue removido, para minimizar el riesgo de la transferencia del gen heterólogo por la recombinación homologa al HSV del tipo silvestre que podría coexistir en el individuo tratado. El gen heterólogo puede ser insertado en lugar de esto en cualquier sitio dentro del genoma del virus. Una adaptación adicional del método dentro del alcance de la invención es suministrar el material genético apropiado, por ejemplo un gen que codifica una proteina inmunomodulatoria, en la forma de los amplicones herpesvirales empacados dentro de las partículas herpesvirales . El ADN del amplicón es el ADN que contiene un origen de replicación de un genoma herpesviral junto con las secuencias de ADN que pueden dirigir el empacamiento de este ADN en las partículas del virus. En donde tales amplicones están presentes en las células en compañía del herpesvirus correspondiente (virus auxiliador) , la expresión del ADN del amplicón puede ocurrir en compañía de la expresión del ADN herpesviral. Los genes extraños pueden ser clonados en tales amplicones y por consiguiente expresados en células infectadas con los amplicones así como con el herpesvirus. Las partículas que contienen los amplicones empacados pueden ser fenotipicamente equivalentes al virus auxiliador correspondiente y por consiguiente capaces de infectar la misma célula huésped y son considerados aqui como entre el herpesvirus mutante defectuoso adecuado como los vectores para su uso en la práctica de la invención. Por consiguiente, los amplicones empacados viralmente también pueden ser utilizados para suministrar el ADN seleccionado a las células deseadas. Los amplicones y los procesos para su preparación que pueden ser utilizados o que están adaptados . fácilmente para su uso en los ejemplos de funcionamiento de esta invención, en compañía de los detalles adicionales, se describen con detalle adicional en WO 96/29421 (Efstathiou et al: Cantab Pharmaceuticals Research Ltd y Cambridge University Technical Services Ltd) . Es preferible que el virus auxiliador de HSV utilizado para el empaque de los amplicones, por si mismo, no sea perjudicial para el huésped, y asi un virus inhabilitado con un gen esencial delecionado, tal como el virus delecionado de gH descrito anteriormente, proporciona un virus auxiliador ideal como se describió en WO 92/05263 y otras referencias relacionadas citadas aquí. Otros virus auxiliadores útiles, sin embargo, pueden estar basados en herpesvirus lo suficientemente atenuados o inhabilitados para ser utilizados en un medio ambiente clínico, no necesariamente uno que sea completamente defectuoso en la replicación.

La invención descrita aquí puede ser utilizada para suministrar el material genético, por ejemplo el ADN que codifica una proteína elegida tal como una proteína inmunomodulatoria, a las células tumorígenas para los propósitos de terapia. La gama de genes que puede ser suministrada con el propósito de estimular una respuesta inmune incluye los genes para las citocinas, inmunoestimuladores, linfotactina, CD40, OX40, el ligando de OX40, y otro material genético mencionado aquí, el cual puede ser incluido en el vector como los genes sencillos o genes múltiples, o copias múltiples de uno o más genes. En las modalidades de la presente invención, por ejemplo que utilizan los vectores y células de blanco u objetivo como se describe aqui posteriormente de manera particular, las células progenitoras hemotapoyéticas humanas normales y malignas pueden ser transducidas rápidamente con eficiencias que varian desde 60% hasta 100%; los niveles de la transducción y la expresión del gen que han sido logrados, se considera que representan una eficiencia elevada, particularmente para estos blancos u objetivos. Las modalidades de la presente invención también pueden producir la rapidez de expresión útil de un gen transferido. Por ejemplo bajo las condiciones que se describieron específicamente aqui, la positividad para la expresión del gen transferido ha sido obtenida en 80% a 100% de las células CD34+ así como los blastos AML y ALL en el intervalo de 24 horas después de la exposición al vector. Se ha encontrado también que las modalidades de la invención pueden proporcionar una preparación de células transducidas que producen, y por ejemplo liberan, el producto del gen transferido durante al menos 7 dias a un nivel proporcional al MOI (multiplicidad de la infección, usualmente calculado o considerado en las unidades que forman la placa (pfu) /célula) , por ejemplo en MOI en el intervalo de 0.05-20, por ejemplo en el caso del GM-CSF producido en las células leucémicas primarias humanas por la expresión del gen correspondiente transferido por un vector herpesviral delecionante de gH. En consecuencia, se observa que las modalidades de la presente invención hacen posible la producción de inmunógenos, por ejemplo inmunógenos de la leucemia humana, en los casos en donde la producción de los inmunógenos correspondientes ha presentado problemas logísticos hasta ahora. (Aunque en el caso de los blastos leucémicos, por ejemplo, podría ser o llegar a ser posible obtener niveles elevados de producción de citocina con vectores retrovirales o adenovirales en ciertos ejemplos susceptibles de las células, las modalidades de la presente invención se ha encontrado que hacen posible lograr de manera consistente y útil proporciones elevadas de blastos leucémicos para ser transducidos de todos los pacientes que van a ser probados, presentando por consiguiente una ventaja de utilidad en el trabajo clínico) . La presente invención es descrita posteriormente de manera adicional por medio de la ayuda de los ejemplos de los procedimientos y productos y de las partes de los procedimiento y productos dados a manera de ejemplo solamente y no de limitación. La construcción de vectores adecuados es ilustrada de manera no limitativa por la referencia a los ' dibujos que se anexan, en los cuales: las figuras 1 a 6 son diagramas que ilustran la construcción de los plásmidos pIMMB45, pIMMB56, pIMMB46, pIMC14, pIMRl y pIMR3, respectivamente. Estos vectores son referidos en la descripción posterior; las figuras 7 y 8 muestran los resultados de la transducción de las células, de acuerdo con las modalidades particulares de la invención, con los herpesvirus inhabilitados genéticamente construidos como se describe posteriormente. La descripción de los vectores y su construcción, dadas posteriormente, son a manera de ejemplo solamente. La construcción y propiedades del virus defectuoso de gH y las lineas celulares complementarias adecuadas están indicados en las especificaciones WO 92/05263 y WO 94/21807 (Cantab Pharmaceuticals Research Limited: SC Inglis et al) (incorporada por la presente para referencia), en Forrester et al, 1992 J. Virol. 66, pp. 341 y sig., y en CS McLean et al, J Infect Dis 170 (1994) pp. 1100 y sig. Además, todos los procedimientos de manipulación genética pueden ser llevados a cabo de acuerdo con los métodos estándares que se describen en "Molecular Cloning" A Laboratory Manual, eds. Sambrook, Fritsch y Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989. El suministro de los vectores en las células tales como las células de los tallos hematopoyéticos, y el injerto de los células en un paciente que va a ser tratado con los mismos, se pueden llevar a cabo por una fácil adaptación de las técnicas bien conocidas per se en el campo. Por ejemplo, los métodos que se indicaron en MK Brenner et al, Cold Spring Harbor Symposia en Cuantitative Biology, vol. LIX (1994), pp. 691-697, o en las referencias citadas allí, o en MK Brenner et al, Lancet 342 (6 Nov 1993) pp. 1134-1137, o en las referencias citadas allí, pueden ser aplicadas y adaptadas fácilmente.

Construcción del HSV1 delecionado en gH y HSV2 deleccionado en gH que expresan el GM-CSE El virus de HSV1 delecionado en gH y el virus de HSV2 delecionado en gH son propagados en las lineas celulares complementarias. Estas lineas celulares han sido diseñadas para expresar el gen de HSV-1 gH o el gen de HSV-2 gH respectivamente. Tales líneas celulares pueden ser construidas como se describió en WO94/05207 y WO94/21807 y las referencias citadas allí. La siguiente sección proporciona una descripción adicional de la construcción de lineas celulares adecuadas, y empieza con la construcción de ciertos plásmidos.

Fuente del ADN del virus; En donde se requiere el ADN viral del HSV, el mismo se puede hacer por ejemplo (en el caso del HSV2) de la cepa HG52 por el método de Walboomers y Ter Schegget (1976) Virology 74, 256-258, o por adaptaciones adecuadas de este método. Una material en almacenamiento seleccionado de la cepa HG52 es mantenido en el Institute of Virology, MRC Virology Unit, Church Street, Glasgow, Scotland, UK. El ADN de otras cepas de HSV-2 es probable que sea muy similar en esta región, y las cepas G y MS por ejemplo pueden ser obtenidas del ATCC, Rockville, Maryland, EUA.

Construcción del plásmido pIMC05 Un fragmento Sst-1 de 4.3 kb que codifica el gen HSV-1 (HFEM) gH y el promotor HSV-1 gD corriente arriba (- 392 a + 11) fue escindido del plásmido pgDBrgH (Forrester et al., op. cit.), y clonado en pUC119 (Vieira & Messing, 1987) para producir el plásmido pUC119gH. Un sitio Not 1 se introdujo en el plásmido pUC119gH por la mutagénesis dirigida al sitio, 87 pb corriente abajo del codón de parada de gH. El plásmido resultante, pIMC03, se utilizó para generar un fragmento Not 1-Sst 1 el cual se restituyó y se ligó o unió en el vector de expresión eucariótico pRc/CMV (Invitrogen Corporation), prediferido con Not 1 y Nru 1 para remover el promotor CMV IE. El plásmido resultante, pIMC05, contiene el gen HSV-1 gH bajo el control transcripcional del virus inducible por el promotor de gD y BGH (Hormona del Crecimiento del Bovino) poly A. El mismo también contiene el gen de resistencia a la neomicina para la selección de las líneas celulares estables resistentes a G418.

Construcción del HSV-1 delecionado en gH que complementa la línea celular El plásmido pIMC05 se transfectó en células Vero (ATTC no. 88020401) utilizando la técnica del fosfato de calcio (Sambrook, Fritsch & Maniatis, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989) . Las células fueron seleccionadas por la dilución de la clonación en la presencia de G418 y una línea celular clonal fue aislada. A continuación de la expansión y enfriamiento, las células fueron sembradas en placas de 24 cavidades y se probaron para verificar su capacidad para soportar el crecimiento del virus negativo de gH, por la infección con SC16 (del)gH (Forraster et al, op. cit) a 0.1 pfu/célula. Las placas de los virus se observaron 3 días posinfección confirmando la expresión del gen gH.

Construcción de la linea celular BHK TK- Estas células fueron producidas por la transfección del plásmido pIMC05 en las células de BHK de la timidina cinasa negativa (TK-) (ECACC No. 85011423) de la misma manera que aquella descrita para las células complementarias de HSV-1 delecionada de gH y HSV-2 delecionada de gH.

Construcción del plásmido PIMC08 El plásmido pIMMB24 que contiene el gen de HSV-2 gH es construido a partir de dos fragmentos de BamHl adyacentes de la cepa 25766 del HSV-2. Los plásmidos están designados como pTW49, que contiene el fragmento BamHl R de 3484 pares base aproximadamente, y pTW54, que contiene el fragmento de BamHl S de 3311 pares base aproximadamente, ambos clonados en el sitio BamHl de pBR322. Los plásmidos equivalentes pueden ser clonados fácilmente de muchas cepas disponibles o materiales aislados clínicos del HSV-2. El extremo 5' del gen de HSV-2 se escindió de pTW54 utilizando BamHl y Kpni, para producir un fragmento de 2620 pares base el cual es purificado con un gel. El extremo 3' del gen de HSV-2 es escindido de pTW49 utilizando BamHl y Salí, para producir un fragmento de 870 pares base el cual también es purificado con un gel. Los dos fragmentos se clonaron en el pUC119 el cual ha sido digerido con SalHI y Kpni. Este plásmido contiene ahora el gen de HSV-2 gH completo. El plásmido pIMC08 que contiene el gen de HSV-2 (cepa 25766) gH se construyó como sigue. El plásmido pIMMB24 se digerió con Ncol y BstXI y el fragmento que contiene la porción central del gen gH se purificó a partir de un gel de agarosa. El extremo 5' del gen se reconstruyó a partir de dos oligonucleótidos CE39 y CE40 los cuales forman un secuencia de enlace unida por los sitios HindIII y Ncol. El extremo 3' del gen se reconstruyó a partir de dos oligonucleótidos CE37 y CE38 los cuales forman una secuencia de enlace unida por los sitios BstXI y Notl.

CE39 5' AGCTTAGTACTGACGAC 3' CE40 5' CATGGTCGTCAGTACTA 3' CE37 5' GTGGAGACGCGAATAATCGCGAGC 3' CCEE3388 55'' GGCCGCTCGCGATTATTCGCGTCTCCACAAAA 3' Los dos enlazadores de oligonucleótidos y el fragmento Ncol-BstXI purificado fueron clonados en una unión triple en el pIMC05 digerido por HindIII-Notl, reemplazando por consiguiente el gen de HSV-1 gH por el gen de HSV-2 gH. El plásmido resultante se designó pIMC08.

Construcción de la linea celular complementaria de HSV-2 delecionada por gH (CR2) El plásmido pIMC08, contiene el gen HSV-2 gH bajo el control transcripcional del promotor de gD inducible por el virus y la BGH (Hormona del Crecimiento del Bovino) poly A. El mismo también contiene el gen de resistencia a la neomicina para la selección de las lineas celulares estables resistentes a G418. El plásmido pIMC08 se transfectó en células Vero (ATCC no. 88020401) utilizando la técnica del fosfato de calcio (Sambrook, Fritsch & Maniatis, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pres, 1989) . Las células fueron seleccionadas por la dilución de la clonación en la presencia de G418 y se aisló una linea celular clonal. A continuación de la expansión y enfriamiento, estas células, designadas como células CR2, fueron sembradas en placas de 24 cavidades, y se infectaron con el HSV-1 delecionado de gH (SC16 (del)gH) a 0.1 pfu/célula. Las placas de los virus fueron observadas 3 días posinfección confirmando la expresión del gen gH.

Construcción de los plásmidos de recombinación a) pIMMB56+ El pIMMB56+ es un vector con un cásete lacZ flanqueado por las secuencias de HSV-2 de cualquier lado del gen gH. Esto se hace como sigue: los dos fragmentos de PCR hechos por los oligos MB97-MB96 y por los oligos MB57-MB58 son digeridos con las enzimas de restricción apropiadas para los sitios que han sido incluidos en los oligonucleótidos de PCR. El fragmento de MB97-MB96 es digerido con HindIII y Hpal. El fragmento de MB57-MB58 es digerido con Hpal y EcoRl. Estos fragmentos son ligados entonces en el vector pUC119 los cuales han sido digeridos con HindIII y EcoRl. El plásmido resultante es llamado pIMMB845 (Figura 1) . Los oligonuclétidos utilizados para PCR son mostrados enseguida: HindIII MB97: 5' TCGAAGCTTCAGGGAGTGGCGCAGC 3' Hpal MB96: 5' TCAGTTAACGGACAGCATGGCCAGGTCAAG 3' Hpal MB57: 5' TCAGTTAACGCCTCTGTTCCTTTCCCTTC 3' EcoRI MB58: 5' TCAGAATTCGAGCAGCTCCTCTGTTCGAC 3' Para permitir una detección facilitada de los recombinantes de la primera etapa, el gen de beta-galactosidasa del E. coli, bajo el control de un promotor de SV40, es insertado en pIMMB45. El promotor de SV40 más el gen de la beta-galactosidasa son escindidos del plásmido pCHUO (Pharmacia) utilizando BamHl y Tth III 1. Los extremos son llenados utilizando un fragmento de Klenow de la polimerasa del ADN. El fragmento es purificado con un gel. El plásmido pIMMB45 es digerido con Hpal, fosfatado con Fosfatasa Alcalina Intestinal de Ternero (CIAP) para abolir la autounión o autoligación, y se purifica por medio de un gel. Los fragmentos purificados con el gel son ligados entonces conjuntamente para producir el plásmido pIMMB56+ (véase la Figura 2) . b) pIMMB46 El pIMMB46 contiene las secuencias que flanquean el gen de HSV-2 gH, con un sitio Hpal único central. Cualquier gen clonado en este sitio puede ser insertado por la recombinación en el genoma HSV-2 en el sitio gH. Si el virus es un virus TK-negativo gH-negativo (por ejemplo hecho utilizando el plásmido pIMMB56+ descrito anteriormente) entonces el plásmido reemplazará el extremo 3' del gen TK, restableciendo por consiguiente la actividad TK y permitiendo la selección del virus TK-positivo. Los dos fragmentos de PCR hechos por los oligos MB94-MB109 y por los oligos MB57-MB108 son digeridos con las enzimas de restricción apropiadas para los sitios que han sido incluidos en los oligonucleótidos de PCR. El fragmento de MB94-MB109 es digerido con HindIII y Hpal. El fragmento MB57-MB108 es digerido con Hpal y EcoRI . Estos fragmentos son ligados entonces en el vector pUC119 el cual ha sido digerido con HindIII y EcoRI . El plásmido resultante es llamado pIMMB46 (véase la figura 3) . Los oligonucleótidos utilizados son como sigue: Hpal MB57: 5' TCAGTTAACGCCTCTGTGTTCCTTTCCCTTC 3' EcoRI MBl08: 5' TCAGAATTCGTTCCGGGAGCAGGCGTGGA 3' HindIII MB94: 5' TCAAAGCTTATGGCTTCTCACGCCGGCCAA 3' Hpal MB109: 5' TCAGTTAACTGCACTAGTTTTAATTAATACGTATG 3' c) pIMC14 El plásmido pRc/CMV (Invitrogen Corporation) se digerió con las enzimas de restricción NruI, Pvull y Bsml y un fragmento de Nrul-Pvull de 1065 pares base se aisló a partir de un gel de agarosa. El fragmento se clonó en el pIMMB46 digerido con Hpal (véase la Figura 4). El vector resultante es llamado pIMC14. El fragmento pRc/CMV contiene el promotor inicial inmediato principal del citomegalovirus (promotor CMV-IE) y el sitio de adición de la hormona del crecimiento del bovino (BGH) poly A. Este plásmido, pIMC14, es un plásmido recombinante general con los sitios únicos para la inserción de los genes extraños los cuales pueden ser recombinados entonces en el vector DISC delecionado de gH de HSV-2. d) pIMRl El plásmido pIMRl es un vector de recombinación para la inserción del gen de GM-CSF de murino, bajo el control del promotor CMV-IE, en un vector de DI?C HSV-2. El pIMC14 se digerió con Xbal, fosfatado con CIAP, se purificó con un gel y los extremos sobrecolgantes se colocaron nivelados con la polimerasa de Klenow. El gen de GM-CSF de murino es escindido del plásmido pGM 3.2FF (referido como pGM3.2 en Gough et al. EMBO Journal 4, 645-653, 1985) (o a partir del plásmido equivalente construido como se describió anteriormente), por un procedimiento de dos etapas. En primer lugar el pGM 3.2FF es digerido con EcoRI y un fragmento de 1048 pares base es purificado con un gel. Este fragmento es digerido entonces con Hinfl y Stul. El fragmento de 495 pares base es purificado con un gel y los extremos se repararon o restituyeron con la polimerasa de Klenow. Este fragmento es clonado entonces en el sitio de multiclonación del pIMC14, preparado como se describió anteriormente. El plásmido resultante está designado como pIMRl (véase la Figura 5) . Un plásmido alternativo equivalente a pGM3.2, puede ser construido como sigue. Una biblioteca de los clones de ADNc es construida a partir de una línea de linfocitos T clonados (a partir de una cepa BALB/c del ratón) , tal como LB3 (Kelso et al, J Immunol. 132, 2932, 1984) en el cual la síntesis de GM-CSF es inducible por concanavalina A. La biblioteca es investigada por hibridación de la colonia con una secuencia específica para el gen de GM-CSF de murino (Véase Gough et al, EMBO J, 4, 645, 1985 para la secuencia) . Un ejemplo de un oligonucleótido utilizado en este caso es 5' TGGATGACATGCCTGTCACATTGAATGAAGAGGTAGAAGT 3' . Los clones arriba de lkb son seleccionados y secuenciados para verificar que los mismos sean GM-CSF. Estas operaciones se pueden llevar a cabo como se describió en "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", por Sambrook, Fritsch y Maniatis, Cold Spring Harbor. Tal operación conduce a un clon que contiene la secuencia de GM-CSF completa la cual puede ser retirada con Hinfl y Stul como se describió para pGM3.2. pIMR3 En el plásmido pIMRl el marco de lectura abierta para el gen GM-CSF está precedido por un marco de lectura abierta (ORF) corto de 15 pares base. A causa de que es posible que esto podria interferir con la expresión del GM-CSF, el plásmido pIMRl se alteró de modo que este marco de lectura pequeño fuera removido. El pIMRl se digerió con Notl y PpuMI . El vector digerido se fosfató con la fosfatasa alcalina intestinal del ternero (CIAP) y se purificó con un gel. Las secuencias entre los dos sitios de la enzima de la restricción se reemplazaron por una pieza corta de ADN de doble hebra, generado por el recocido de dos oligonucleótidos CE55 y CE56: CE55 GGCCGCTCGAACATGGCCCACGAGAGAAAGGCTAG CE56 GACCTTAGCCTTTCTCTCGTGGGCCATGTTCGAGC Los oligonucleótidos son construidos para tener extremos sobrecolgantes con los extremos de Notl y PpuMI generados por la digestión del pIMRl. Los dos oligonucleótidos son recocidos, fosforilados, y ligados al pIMRl digerido con Notl-PpuMI. El vector resultante se designó como pIMR3. Las secuencias en la región relevante son mostradas enseguida: pIMRl TTAATACGAC TCACTATAGG GAGACCGGAA GCTTGGTACC GAGCTCGGAT CCACTAGTAA CGGCCGCCAG TGTGCTGGAA TTCTGCAGAT ATCCATCACA CTGGCGGCCG CTCGAGCATG CATCTAGCCT TTTGACTACA ATGGCCCACG Notl ORF Corto Inicio de GM-CSF AGA GAAAGGCTAA GGTCCTG PpuMI pIMR3 TTAATACGAC TCACTATAGG GAGACCGGAA GCTTGGTACC GAGCTCGGAT CCACTAGTAA CGGCCGCCAG TGTGCTGGAA TTCTGCAGAT ATCCATCACA CTGGCGGCCG CTCGAACATG GCCCACGAGA GAAAGGCTAA GGTCCTG Not I Inicio PpuMI Para hacer un virus de HSV-1 DISC que exprese la proteína de GM-CSF, se fabrica un conjunto diferente de los plásmidos: pIMMB34 Este es un vector de recombinación que contiene secuencias que flanquean el gen HSV-1 gH. Las secuencias de flanqueo del lado izquierdo inactivan el gen TK el cual radica adyacente al gen gH. Los dos fragmentos de PCR hechos por los oligos MB97-MB100 y por los oligos MB61-MB58 son digeridos con las enzimas de restricción apropiadas para los sitios que han sido incluidos en los oligonucleótidos de PCR. El fragmento de MB97-MB100 es digerido con HindIII y Hpal. El fragmento MB61-MB58 es digerido con Hpal y EcoRl. Estos fragmentos son ligados entonces en el vector pUC119 el cual ha sido digerido con HindIII y EcoRI . El plásmido resultante es llamado pIMMB34. Los oligonucleótidos utilizados son como sigue: HindIII MB97: 5' TCGAAGCTTCAGGGAGTGGCGCAGC 3' Hpal MBl00: 5' TCAGTTAACGGCCAGCATAGCCAGGTCAAG 3' Hpal MB61: 5' TCAGTTAACAGCCCCTCTTTGCTTTCCCTC 3' EcoRI MB58: 5' TCAGAATTCGAGCAGCTCCTCATGTTCGAC 3' g) pIMMB55+ Para permitir la detección facilitada de los recombinantes de la primera etapa, la beta-galactosidasa del E. coli, bajo el control de un promotor SV40, es insertada en el pIMMB34. El promotor SV40 más el gen de la beta-galactosidasa es escindido del plásmido pCHUO (Pharmacia) utilizando BamHl y Tth III 1. Los extremos son llenados utilizando el fragmento de Klenow de la polimerasa del ADN. El fragmento es purificado por medio de un gel. El plásmido pIMMB34 es digerido con Hpal, fosfatado con Fosfatasa Alcalina Intestinal de Ternero (CIAP) para abolir la autoligación o autounión, y se purifica por medio de un gel. Los fragmentos purificados por el gel son ligados entonces conjuntamente para producir el plásmido pIMMB55+. h) pIMMB63: El pIMMB63 se hace a partir del ADN de la cepa K05 (m) del HSV-1. El pIMMB63 contiene las secuencias que flanquean el gen de HSV-1 gH, con un sitio de Hpal único, central. Cualquier gen clonado en este sitio puede ser insertado por la recombinación en el genoma de HSV-1 en el sitio gH. Si el virus es un virus TK-negativo (hecho utilizando por ejemplo el plásmido pIMMB55+ descrito anteriormente) entonces el plásmido reemplazará el extremo 3' del gen TK, restableciendo por consiguiente la actividad de TK y permitiendo la selección para el virus TK-positivo. Los dos fragmentos de PCR hechos por los oligos MB98-MB63 y por los oligos MB61-MB58 son digeridos con las enzimas de restricción apropiadas para los sitios que han sido incluidos en los oligonucleótidos de PCR. El fragmento de MB98-MB63 es digerido con HindIII y Hpal. El fragmento de MB61-MB58 es digerido con Hpal y EcoRI . Estos fragmentos son ligados o unidos entonces en el vector pUC119 el cual ha sido digerido con HindIII y EcoRl. El plásmido resultante es llamado pIMMB63. Los oligonucleótidos utilizados son como sigue: HindIII MB98: 5' TCAAAGCTTATGGCTTCGTACCCCTGCCAT 3' Hpal MB63: 5' TCAGTTAACGGACCCCGTCCCTAACCCACG 3' Hpal MB61: 5' TCAGTTAACAGCCCCTCTTTGCTTTCCCTC 3' EcoRI MB58: 5' TCAGAATTCGAGCAGCTCCTCATGTTCGAC 3' i) pIMXl.O Este plásmido es un plásmido de recombinación general con sitios únicos para la inserción de los genes extraños los cuales pueden ser recombinados en un vector DISC delecionado de gH del HSV-1. El plásmido pRc/CMV se digiere con NruI y PvuII y un fragmento de 1066 pb, el cual contiene el promotor CMV IE y una señal poly A, se desafiló en los extremos con la polimerasa de Klenow y se insertó en el sitio Hpal único del plásmido pIMMB63. Este plásmido es llamado pIMXl.O. El sitio de clonación múltiple contenido entre el promotor de CMV IE y la señal polyA es ideal para la clonación de otros genes en el plásmido y su introducción subsiguiente en DISC HSV-1. j) pIMX3.0 El plásmido pIMX3.0 es un vector de recombinación para la inserción del GM-CSF de murino, bajo el control del promotor CMV IE, en la región de gH delecionada de DISC HSV del tipo I. Este plásmido se construyó insertando el GM-CSF de murino el cual se retiró por escisión del plásmido pGM3.2FF (op.cit.) con Smal y Dral, en el sitio BsaBI único del pIMXl.O. Este plásmido, pIMX3.0, es el equivalente de HSV-1 de pIMR3.

Construcción del virus recombinante El virus recombinante que expresa el GM-CSF se hizo en dos etapas. En la primera etapa el gen gH, y parte del gen TK son reemplazados por un "cásete de lacZ", que consiste del promotor de SV40 que activa o impulsa el gen de lacZ del E.coli. Este virus tiene un fenotipo TK negativo y también proporciona placas azules cuando crecen bajo una capa o cubierta que contiene el X-gal del substrato colorigénico. Este virus recombinante puede ser ahora utilizado convenientemente para la inserción de los genes extraños en el sitio gH. Los genes son insertados en conjunción con la parte errónea o faltante del gen TK. Al mismo tiempo se remueve el cásete de lacZ. Estos virus pueden ser seleccionados con base en el fenotipo TK-positivo, y un color blanco bajo X-gal. a) Construcción de la primera etapa recombinante con el gH que reemplaza el cásete de SV40-lacZ.

El virus recombinante se reconstruyó por la transfección del ADN viral con el plásmido pIMMB56+ (para el HSV-2) o pIMMB55+ (para HSV-1). El ADN viral es purificado sobre un gradiente de yoduro de sodio como se describió en Walboomers & Ter Schegget (1976) Virology 74, 256-258.

La recombinación se lleva a cabo como sigue: Primera etapa Una mezcla de transfección es preparada mezclando 5µg del ADN viral, 0.5µg del ADN del plásmido linearizado (linearizado por la digestión con la enzima de restricción Scal) en 1 ml de solución amortiguadora de HEBS (137mM NaCl, 5mM KCl, 0.7 mM Na2HP0, 5.5mM glucosa, 20mM Hepes, pH 7.05). 70 µl de CaCl2 2M son agregados por goteo, y se mezcla suavemente. El medio es removido de un plato de 5cm subconfluente de las células de CRl o de CR2 (células Vero que expresan el gH) y 500µl de la mezcla de transfección son agregadas a cada uno de los dos platos o discos. Las células son incubadas a 37 °C durante 40 minutos, cuando 4 ml del medio de crecimiento que contiene 5% de suero de bovino fetal (FCS) son agregados. 4 Horas después de agregar la mezcla de transfección, el medio es removido y las células son lavadas con un medio libre del suero. Las células son "colocadas en choque" entonces con 500µl por plato o disco de glicerol al 15% durante 2 minutos. El glicerol es removido, las células lavadas dos veces con un medio libre de suero y se agrega el medio de crecimiento que contiene 5% de FCS. Después de 4-7 dias, cuando se observa un efecto citopático viral completo (CPE) las células son rascadas del medio, se centrifugan a 2500 rpm durante 5 minutos a 4 °C, y se vuelven a suspender en 120 µl de medio esencial minimo de Eagles (EMEM) . Este es ahora un material en almacenamiento del virus crudo que contiene el virus recombinante y del tipo silvestre. El material en almacenamiento es congelado, descongelado y sometido a la acción del sonido y se tamiza o selecciona para los recombinantes sobre las células CRl en una gama de diluciones. El medio contiene 10 µg/ml de acyclovir, para seleccionar el virus TK-negativo. Después de la adición de las diluciones del virus, las células son recubiertas con un medio que contiene 1% de agarosa a una temperatura de gelificación baja. Después que aparecen placas virales aproximadamente a los 3 días, se agrega una segunda capa o baño de agarosa que contiene 330 µg/ml de Xgal asi como lOµg/ml de aciclovir. Las placas azules son colectadas, en el transcurso de 48 horas, y transferidas a platos o placas de 24 cavidades (1 cm2 por cavidad) que contiene las células CRl. A las placas se les permite crecer hasta el CPE completo y se colectan rascando el medio. Rondas o ciclos múltiples de purificación de la placa se llevan a cabo hasta que se obtiene un material en almacenamiento puro del virus. La estructura de la primera etapa recombinante es confirmada como sigue. El ADN viral purificado con yoduro de sodio es preparado como anteriormente, y se digiere con BamHl. Esta digestión es separada sobre un gel de agarosa y transferida a una membrana de nilón. Esta es sondeada con un fragmento de ADN radioetiquetado homólogo a las secuencias de ambos lados del gen gH. b) Segunda etapa, La recombinación se lleva a cabo como anteriormente utilizando el ADN viral del recombinante de la primera etapa, y el plásmido pIMR3 (para el HSV-2) o pIMX3.0 (para el HSV-1). Después de la colección inicial del virus, los virus TK-positivos son seleccionados por el crecimiento sobre las células TK-negativas gH-positivas de BHK, en la presencia de 0.6µM de metotrexato, 1.5µM de Timidina, 9.5µM de Glicina, 4.75µM de Adenosina y 4.75µM de Guanosina. Tres rondas o ciclos de esta selección se llevan a cabo en discos o platos de 6 cavidades (10 cm2 por cavidad) . En cada etapa las células infectadas son colectadas por el rascado del medio, centrifugación y resuspensión en 200µl de EMEM. Después de someterlas a la acción del sonido, 50µl de estas son agregadas a las células TK-negativas gH-positivas de BHK, y se continúa la selección. Después de la selección final, las células infectadas por el virus son colectadas como anteriormente y son seleccionadas sobre las células complementarias de HSV1 delecionadas de gH. Se agregan capas o cubiertas como anteriormente y las placas blancas son seleccionadas en la presencia de Xgal. Las placas son colectadas como anteriormente y se purifican en la placa tres veces sobre las células complementarias de HSV1 delecionadas de gH. La estructura del ADN viral es analizada como anteriormente.

Ensayo de GM-CSF Las células Cos 1 (ECACC No. 88031701) son transfectadas con el ADN del plásmido utilizando el dextrano de DEAE como se describió en Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Michael Kriegler. Los sobrenadantes fueron transfectados de las células Cos 1 o las células CR2 infectadas fueron seleccionadas para verificar la actividad de GM-CSF por bioensayo. Una linea celular hematopoyética de murino de respuesta al IL-3/GM-CSF designada como C2GM, se obtuvo del Dr. E. Spooncer, Paterson Institute for Cáncer Research, Christie Hospital, UK. La linea celular CGM es mantenida en el medio de Fischers con 20% de suero de caballo, 1% de glutamina y 10% de medio celular acondicionado. El medio celular acondicionado es obtenido de cultivos que crecen exponencialmente de las células Wehi 3b (ECACC No. 86013003) los cuales secretan el IL-3 del murino en el medio. Las células Wehi 3b son mantenidas en el medio de RPMI 1640, 10% de FCS y 1% de glutamina. La descripción anterior hace posible particularmente la construcción de los mutantes HSV-1 y HSV-2 los cuales son gH-negativos y los cuales expresan el GM-CSF, etc. La persona experta puede adaptar fácilmente la presente enseñanza a la preparación de otros virus mutantes los cuales son defectuosos con respecto al primer gen esencial para la producción del virus infeccioso, de tal modo que el virus pueda infectar las células normales y padecer la replicación y la expresión del antígeno viral en estas células pero no pueda producir los virus infecciosos nombrados y los cuales también expresen una secuencia de nucleótidos heteróloga la cual codifica una proteina inmunomoduladora u otro material genético como se mencionó aquí. Muchos otros virus mutantes se pueden hacer con base en la deleción u otra inactivación (por ejemplo) de los siguientes genes esenciales en los siguiente virus y tipos de virus :- En los virus del herpes simplex, los genes esenciales tales como gB, gD, gL, ICP4, ICP8 y/o ICP27 pueden ser delecionados o inactivados de otra manera asi como o en lugar del gen gH utilizado en los ejemplos anteriores. En otros herpesvirus, los genes esenciales conocidos, tales como cualesquiera homólogos esenciales conocidos para los genes de gB, gD, gL, gH, ICP4, ICP8 y/o ICP27 de HSV, pueden ser seleccionados para la deleción u otra inactivación. El citomegalovirus puede ser por ejemplo inhabilitado genéticamente delecionando o inactivando de otra manera los genes responsables de las mutaciones sensibles a la temperatura, por ejemplo como las identificables de Dion et al, Virology 158 (1987) 228-230.

Uso de los vectores para la transducción de las células.

Un procedimiento el cual puede ser adaptado a la producción de varios ejemplos útiles de acuerdo con la presente invención es como sigue. Un virus de HSV-2 recombinante con una deleción en el gen gH, y que lleva en el sitio del gen delecionado una copia funcional del gen elegido, construido como se describió anteriormente, es cultivado como se describió y los materiales en almacenamiento son preparados con una concentración de aproximadamente 10"8 pfu/ml. Para llevar a cabo el procedimiento de la transducción sobre las células de la leucemia, las muestras de la sangre son obtenidas de los pacientes de la leucemia y las células son aisladas de la misma por la centrifugación con gradiente de densidad. En las modalidades alternativas, las líneas celulares pueden ser derivadas de los pacientes con cáncer por la biopsia o de otra manera, y pueden ser utilizadas directamente o a continuación del cultivo in vitro. Las células de los pacientes con los tumores sólidos pueden ser obtenidas a continuación de la remoción quirúrgica del tumor o de la metástasis, o del material de la biopsia del tumor o la metástasis. Las biopsias del tumor o el material reseccionado pueden ser utilizados para preparar las suspensiones celulares únicas ya sea por desagregación mecánica o enzimática o por otros métodos bien conocidos. La infección/transducción de las células tumorígenas o de las líneas celulares con el vector de HSV defectuoso recombinante que lleva un gen de elección (por ejemplo GM-CSF) se puede llevar a cabo dispersando las alicuotas de una suspensión de células única en los recipientes de cultivo del tejido adecuados tales como los recipientes o placas de 24 cavidades. Una concentración de células adecuada puede ser de 0.5 a 2.0xl0"6 células/cavidad en 1 o 2 ml del medio. Los virus pueden ser agregados entonces en una multiplicidad de sitios de infección por ejemplo en el intervalo de 0.01-20, por ejemplo 0.05 a 0.1 pfu/célula, o hasta 1 o hasta aproximadamente 5 pfu/célula, y el cultivo es incubado durante 2 h para permitir que el virus se introduzca a la célula. El virus en exceso es lavado entonces aparte de manera estándar. Las células pueden ser utilizadas para propósitos inmunoterapéuticos y para otros propósitos como se mencionó aquí ya sea directamente o después del cultivo en un medio fresco durante periodos de tiempo variables, por ejemplo de hasta 1 a 7 días. Para los propósitos de prueba, como en los experimentos de prueba descritos posteriormente, el cultivo se llevó a cabo durante 1 a 7 dias.

Las muestras de las células infectadas por el vector del virus pueden ser examinadas para la expresión del gen heterólogo llevado dentro del vector del virus. Por ejemplo, las células infectadas con un vector de HSV defectuoso recombinante que contiene el gen lac Z pueden ser probadas para verificar la presencia de la actividad de la ß-galactosidasa ya sea utilizando una preparación de anticuerpo o antisuero dirigida contra la ß-galactosidasa, o utilizando un substrato de galactosidasa (por ejemplo Fluoreporter (TMI)) el cual durante el desdoblamiento por la ß-galactosidasa, proporciona un producto fluorescente. El producto fluorescente o anticuerpo puede ser detectado entonces por microscopía de fluorescencia o por citometria de flujo. La proporción (%) de las células que muestran la fluorescencia, indican la proporción que expresa el producto del gen y puede ser calculada de los resultados del paso de la detección.

Transducción y expresión de lacz en las células normales y malignas: Un sistema de prueba adecuado para probar e ilustrar la efectividad de la transducción de acuerdo con la presente invención, utilizando un vector de virus recombinante, es como sigue, y puede ser adaptado a otros ejemplos de vector de herpesvirus. El vector utilizado en la prueba descrita aquí contiene un gen reportero lacz: generalmente un vector diferente que tiene un gen que codifica una proteina inmunomodulatoria u otra proteina, u otro material genético como se mencionó aquí, en lugar del gen reportero (o además del mismo) es utilizado en la práctica de la invención. Un mutante de HSV delecionado de gH de lacz se construyó como se describió aquí anteriormente, con referencia al virus mutante de la "primera etapa". Esta primera etapa en la producción del vector que contiene el gen para la proteina inmunomodulatoria es un vector de prueba adecuado utilizado en el procedimiento de prueba descrito posteriormente. Alternativamente, tales mutantes también pueden ser construidos como se describió en la especificación WO 94/21807, correspondiente con el recombinante de la "primera etapa" mencionado en WO 94/21807, la construcción del cual se describe en la página 28 linea 28 hasta la página 29 línea 26 con la descripción asociada (incorporada aqui para referencia) . El gen lacZ es utilizado aquí como un gen marcador y de prueba. Utilizando las técnicas descritas aquí y en las especificaciones mencionadas, otros genes útiles pueden ser incorporados fácilmente en el lugar del lacz o también como el gen lacz. La capacidad del vector del virus HSV defectuoso recombinante HSV-lac Z, para inducir la expresión del gen marcador de ß galactosidasa ha sido estudiada por medio del ejemplo en los siguientes diferentes tipos de células tumorígenas :- A: Dos líneas celulares independientes derivadas de las leucemias linfoblásticas agudas (ALL) ; (lineas celulares pre-B-leucémicas AD y RS establecidas en el St Jude Children' s Research Hospital, Memphis, TN de las muestras clínicas y cultivadas en RPMI 1640 (Biowhittaker) su- plementado con 10% FCS (Biowhitakker, Walkersville, MD) , lOOIU/ml penicilina y 100 mu-g/ml de estreptomicina (Biowhittaker), y 2 mmoles/I de L-glutamina) ) ; B: Tres lineas celulares independientes derivadas del neuroblastoma (NB) ; C: Células primarias aisladas recientemente de cuatro pacientes con ALL; D: Células primarias derivadas de tres pacientes con leucemia mieloide aguda (AML) ; y E: Células primarias derivadas de dos pacientes con NB.

Las células del blasto leucémicas fueron aisladas de los pacientes con >80% de células del blasto por sedimentación de Ficoll de las células mononucleares de la sangre periférica o de la médula ósea. Los mieloblastos pueden ser mantenidos en el cultivo liquido en el RPMI suplementado como anteriormente (Biowhitakker) . Los linfoblastos pueden ser mantenidos en cultivo liquido o en donde sea apropiado sobre los fibroblastos de la piel alogénicos como soporte estromal. Las lineas celulares o las células aisladas recientemente, fueron colocadas en placas como suspensiones celulares únicas en placas de 24 cavidades a x 10*5 hasta 2 x 10"5 células/cavidad en 1 o 2 ml del medio. El vector del virus de HSV defectuoso recombinante HSV-lac Z fue agregado en una multiplicidad de 0.05 a 0.1 pfu/célula y los cultivos fueron incubados a 37 °C durante 2 horas. El virus en exceso fue removido, el medio fresco agregado y los cultivos incubados a 37 °C durante períodos de tiempo variables. La transfección exitosa se determinó por citometria de flujo, y las mediciones se hicieron en los días 2 y 7 después de la infección. Las células infectadas fueron teñidas (xgal y fluorocromo estándar) y se verificaron para la producción de lacz. Se obtuvieron los siguientes resultados: para ambas de las lineas celulares ALL, la eficiencia de la transducción para el gen de la ß-galactosidasa llevada por el vector fue del 100% en ambos dias 2 y 7. De las muestras celulares ALL primarias, dos fueron 100% positivas para la expresión de la ß-galactosidasa y las otras dos mostraron más del 80% de la eficiencia de la transducción en el dia 2. (Estas células no sobreviven en el cultivo en la ausencia del estroma, y por consiguiente las mismas no podrían ser probadas en el día 7) . Dos de las tres muestras del AML primario mostraron eficiencias de la transducción de más del 80%; esta cifra se incrementó adicionalmente por el dia 7. La tercera muestra mostró una eficiencia algo menor (42% el día 2 y 54% el día 7). El día 2, las tres líneas celulares NB dieron 25%, 72% y 74% de las eficiencias de transducción respectivamente, mientras que las dos muestras celulares NB primarias mostraron 65% y 100% de la transducción. Estos resultados demuestran una capacidad elevada del vector de HSV defectuoso recombinante para la transducción del gen heterólogo en las células las cuales previamente probaron que son difíciles de transducir por otros medios. Para ALL y AML, la transducción de los retrovirus requiere la generación de líneas celulares, y aún entonces, la eficiencia de la transferencia del gen se ha encontrado generalmente que va a ser muy baja (<5%) . Las células o las lineas celulares frescas de ALL y AML se considera que van a ser esencialmente resistentes a la transducción del adenovirus.

El vector de HSV defectuoso recombinante también ha mostrado una capacidad sorprendentemente elevada para la transducción de las células de NB y las lineas celulares de NB frescas. La eficiencia de la transducción para dos de las tres lineas celulares de NB fue >70%, y para el material aislado fresco la misma fue del 65% y del 100% respectivamente. Estos resultados se resumen como sigue :- Dia 2 Dia 7 Tipo de Célula %positiva Idisponible positiva %disponible Linea Celular ALL - AD 100 30 100 56 Linea Celular ALL - RS 100 31 . 100 53 ALL Fresca - Ll 100 77 ALL Fresca - SP 100 81 ALL Fresca - BR 91 87 ALL Fresca - RU 85 100 AML Fresca - RE 80 50 95 40 AML Fresca - BA 86 62 86 91 AML Fresca - TE 42 90 54 20 Línea Celular NB - MC 72 100 Línea Celular NB - JF 74 100 Línea Celular NB - NH 25 100 NB Fresco - RE 65 100 NB Fresco - Hl 100 ND La transducción y la expresión del lac en las células de la médula ósea primaria se llevó a cabo como sigue: La médula ósea se obtuvo de dos donadores normales. La fracción mononuclear (por sedimentación de Ficoll) se hizo pasar descendentemente en una columna anti-CD34 (Cellpro, Seattle, WA) para enriquecer la población de células progenitoras CD34+. Estas células fueron expuestas entonces al herpesvirus inhabilitado que codifica lacz descrito anteriomente en varias multiplicidades diferentes de la infección (MOI), que varían desde 0.05-20 (pfu/célula). Después de 2 horas de exposición, las células fueron divididas en dos porciones y podrían ser mantenidas ya sea en los cultivos de soporte estromales o en cultivo con citocinas como se menciona posteriormente. Los cultivos de soporte estromal con 8xl0"5 cm cuadrado del área superficial fueron establecidos en el medio de Fisher (Life Technologies, Grand Island, NY) , con 15% de suero de caballo y 5% de suero de bovino fetal (FCS: Summit Biotechnology, Ft Collins, CO) , lxl0"-6 moles/1 de hidrocortisona (Abbott, Chicago, 111.), 10"-4 moles/1 de mercaptoetanol (Sigma, St Louis, MO) y 400 mu-I/ml (Life Tecnologies) . Las células fueron cultivadas en frascos de cultivo del tejido de 25 ml (Nunc. Roskilde, DK) a 37 °C. Cada 2 semanas la mitad del medio gastado se reemplazó por medio fresco hasta que la capa estromal fue restablecida completamente. Las células estromales fueron empleadas entonces como capas alimentadoras y se resembraron con las células de CD34+ transducidas como se describió anteriormente. Un método de cultivo alternativo para una porción de las células transducidas es hacerlas crecer en un medio liquido suplementado con el suero de bovino fetal, IL3 y el factor celular de Stern. Las otras de las porciones se mezclaron en metilcelulosa y se hicieron crecer en platos o discos de cultivo del tejido a una densidad de 10"5/ml. Después de 2, 7 y 14 días, las células del cultivo fueron analizadas por citometría de flujo (utilizando el sistema Fluoreporter) , mientras que las células de las placas de metilcelulosa se examinaron por teñido de x-gal de las colonias individuales y por citometria de flujo de fluorescencia. En los estudios de la fluorescencia, todas las células fueron teñidas doblemente con el reactivo Fluoreporter y con el anticuerpo anti-CD34 fluorescente. Los resultados mostraron que 30-100% de las células CD34+ fueron positivas para el gen marcador, con la proporción de las células positivas que se incrementa cuando el MOI se incrementó. Por el día 14, una proporción más pequeña de las células y las colonias fueron positivas (2-50%), lo que implica que la expresión del gen transferido fue transiente o temporal en algunas células. Puesto que las células y las colonias individuales en los cultivos semisólidos (metilcelulosa) también fueron positivos, aunque la metilcelulosa por si misma es negativa en la fluorescencia, la señal detectada no se debe al intercambio de la proteina desde las células transducidas hasta las células no transducidas, sino que representa la transducción altamente eficiente de las células progenitoras hematopoyéticas normales, en la ausencia de cualesquiera señales estimuladoras del crecimiento. En las pruebas adicionales, se encontró que la eficiencia elevada de la expresión fue obtenible por ejemplo a las 48 horas después de la transducción, alcanzando un pico o valor máximo en aproximadamente 24 a 48 horas. Los métodos descritos anteriormente para la transducción y la expresión de lacz son fácilmente adaptables a la expresión de otras proteínas y material genético deseados por el uso de vectores de virus alternativos que llevan otro material genético en lugar de lacz como se describió anteriormente.

Expresión de GM-CSF por el ALL humano transformado por el vector y otras células: Se han obtenido datos que muestran que un ejemplo de un vector herpesviral inhabilitado que lleva un gen que codifica una citocina (GM-CSF) (vector de HSV delecionante de gH que codifica el GM-CSF) , construido como anteriormente, puede inducir la producción de la citocina codificada en las células transducidas de la leucemia linfocitica aguda humana (ALL) , asi como la leucemia linfoblástica de murino (MLL) y las líneas celulares del neuroblastoma humano. Las líneas celulares fueron transducidas de una manera estándar, y en los días 1, 3 y 7 después de la transducción, las mismas fueron probadas para la secreción de GM-CSF por un inmunoensayo disponible comercialmente (Endogen) . La Figura 7 muestra los diagramas de barras que expresan los resultados de las pruebas para la secreción de GM-CSF por las diferentes lineas celulares transducidas en diferentes MOI (multiplicidad de la infección: relación del pfu viral con respecto al conteo de las células) . Las barras contiguas en cada conjunto de tres se refieren a la producción en los dias 1, 3 y 7 respectivamente bajo un conjunto indicado dado de las condiciones (tipo de célula, MOI) . El eje vertical indica la escala de la producción de GM-CSF por 5xl0"5 células por 24 horas. La secreción se ha observado que ocurre durante al menos 7 días, y los resultados parece que no van a ser debidos principalmente a la persistencia de la proteina expresada inicialmente. Las multiplicidades bajas de la infección (por, ejemplo en el intervalo desde aproximadamente 0.05 hasta aproximadamente 1, 5 o 10) pueden ser efectivas por consiguiente para las células tumorigenas humanas. Las células tumorigenas del ratón, utilizadas para la comparación, fueron de aproximadamente 20 veces transducidas menos fácilmente que las células humanas.

Expresión de GM-CSF por las células de la médula ósea primarias de CD34+: La figura 8 es una gráfica de FACS que muestra el resultado de una transducción exitosa de las células de la médula ósea primarias de CD34+ (células progenitoras hematopoyéticas) desde una fuente humana adulta normal. Las células de la médula ósea fueron transformadas utilizando el vector herpesviral inhabilitado que lleva un gen que codifica una citocina (GM-CSF) (vector de HSV delecionante de gH que codifica el GM-CSF) . Las células fueron purificadas de una manera estándar por la selección de CD34 y teñidas de una manera estándar para el antígeno de CD34. De una manera similar, otras células de CD34+, por ejemplo aquellas que muestran propiedades malignas, pueden ser transducidas y después de esto utilizadas, por ejemplo reinfusionadas como una vacuna terapéutica inmunogénica en el paciente de quien se derivaron las células parenterales, o utilizadas in vitro/ex vivo para cebar o estimular a los linfocitos. Los ejemplos y las modalidades descritas aquí son para ilustración y no para limitación: las variaciones y modificaciones serán evidentes a la luz de esta descripción para las personas expertas en el campo, y están incluidas dentro del alcance de la invención. Esta descripción e invención se extiende a las combinaciones y subcombinaciones de las caracteristicas mencionadas, y la presente descripción incluye los documentos citados aqui, los cuales son incorporados por la presente para referencia.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos a que la misma se refiere.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes 15 20 25

Claims (20)

REIVINDICACIONES

1. El uso de un vector herpesviral recombinante el cual es un herpesvirus mutante atenuado o defectuoso en la replicación y no transformante, y el cual lleva un material genético heterólogo, en la fabricación de una preparación para transducir las células animales humanas o no humanas seleccionadas de: las células hematopoyéticas, las células malignas relacionadas con las células sanguíneas, y las células CD34+ malignas o no malignas.

2. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el material genético heteróloga comprende un gen que codifica una proteína inmunomoduladora u otro producto del gen útil en la terapia del tumor, la inmunoterapia o terapia del gen.

3. El uso de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, en donde las células animales humanas o no humanas son seleccionadas de: las células que (previo a la transducción) no han sido incubadas en su totalidad bajo las condiciones del cultivo celular, las células que no han sido incubadas asi durante más de aproximadamente 2 horas, las células que no han sido incubadas asi durante más de aproximadamente 4 horas, y las células que no han sido incubadas así durante toda la noche, por ejemplo las células tumorígenas muestreadas recientemente .

4. El uso de conformidad con las reivindicaciones 1, 2 o 3, en donde las células transducidas resultantes son sometidas a un paso adicional seleccionado de (a) la reinfusión de las células en el sujeto a partir del cual se obtuvieron las células de origen, y (b) la reacción de las células con los leucocitos in vitro.

5. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde las células animales humanas o no humanas son tratadas ex-vivo y en donde la transducción es llevada a cabo con una eficiencia de al menos 42%.

6. El uso de conformidad con la reivindicación 5, en donde las células animales humanas o no humanas son tratadas ex-vivo y en donde la transducción se lleva a cabo con una eficiencia de al menos 65%.

7. El uso de conformidad con la reivindicación 6, en donde las células animales humanas o no humanas son tratadas ex-vivo y en donde la transducción se lleva a cabo con una eficiencia de más del 80%.

8. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde las células animales humanas o no humanas son tratadas ex-vivo y el paso de la transducción (b) se lleva a cabo en una multiplicidad de sitios de infección (MOI) desde 0.05 a 20.

9. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el virus mutante defectuoso en la replicación es un virus mutante cuyo genoma es defectuoso con respecto a un gen esencial para la producción del virus infeccioso, de tal modo que el gen ha sido delecionado y el virus puede infectar las células huésped normales y padecen la replicación y la expresión de los genes virales en tales células pero no pueden producir virus infecciosos.

10. El uso de conformidad con la reivindicación 9, en donde el gen que es esencial para la producción del virus infeccioso ha sido delecionado y el gen que codifica una proteína heteróloga es insertado en el genoma del virus mutante en el sitio del gen esencial delecionado.

11. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el vector viral es un mutante de HSV.

12. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, de un vector herpesviral recombinante el cual es un herpesvirus mutante atenuado o defectuoso en la replicación y no transformante, y el cual lleva un material genético heterólogo que comprende un gen que codifica una proteina inmunomoduladora seleccionada de las citocinas y de las moléculas coestimuladoras inmunológicas y de los quimioatrayentes, en la fabricación de una preparación para la transducción de las células animales humanas o no humanas seleccionadas de: las células hematopoyéticas, las células malignas relacionadas con las células sanguíneas, y las células CD34+ malignas o no malignas, de origen animal humano o no humano, para introducir un gen heterólogo en las células para hacer a las células más altamente inmunogénicas.

13. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el vector viral codifica un gen que codifica una proteína inmunomoduladora heteróloga seleccionada de las citocinas, las moléculas coestimuladoras inmunológicas, y los quimioatrayentes inmunológicos.

14. El uso de conformidad con la reivindicación 13, en donde el vector viral utilizado para transducir las células es un vector que codifica una citocina seleccionada de GMCSF, IL2, IL12, CD40L, B7.1 y linfotactina.

15. El uso de las células las cuales han sido transducidas por un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para activar o expander las células T citotóxicas exponiendo las células T a las células transducidas.

16. El uso de conformidad con la reivindicación 15, en donde las células transducidas son células malignas, y/o células CD34+.

17. Una composición farmacéutica para su uso en la transducción de las células animales humanas o no humanas, seleccionadas de: células hematopoyéticas; células malignas relacionadas con las células de la sangre; y células CD34+ malignas o no malignas; que comprende un vector de herpesviral recombinante el cual es un herpesvirus mutante atenuado o defectuoso en la replicación y no transformante, y el cual lleva el material genético heterólogo, por ejemplo un gen que codifica una proteina heteróloga.

18. Una preparación farmacéutica, caracterizada porque comprende las células animales humanas o no humanas seleccionadas de: las células hematopoyéticas; las células malignas relacionadas con las células de la sangre; y las células CD34+ malignas o no malignas; las células han sido infectadas con un vector herpesviral recombinante el cual es un herpesvirus mutante atenuado o defectuoso en la replicación y no transformante, y el cual lleva un material genético heterólogo, por ejemplo un gen que codifica una proteina heteróloga.

19. El uso de una composición de conformidad con la reivindicación 17 o la reivindicación 18, en la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de un sujeto el cual es un sujeto humano o un sujeto animal no humano para lograr la expresión de un gen extraño in vivo.

20. El uso de una composición de conformidad con la reivindicación 18, en la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de un sujeto el cual es un sujeto humano o un sujeto animal no humano para producir una respuesta inmune.