JP2007130022A - ウイルス調製物、ベクター、免疫原、及びワクチン - Google Patents
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Abstract
【解決手段】遺伝的に不能にされた変異ウイルスは、感染性の新しいウイルス粒子の生産のために本質的である選択された遺伝子に関して欠損しており、GM−CSF 又はIL−2等のような免疫調節蛋白質をコードする異種遺伝材料を有するゲノムを有し、ここで該変異ウイルスが、通常の宿主細胞に感染することができ、そして免疫調節蛋白質の発現を引きおこすことができるが、前記変異ウイルスは、該ウイルスが前記本質的なウイルス遺伝子の機能を供する遺伝子を発現することができる組換え補足性宿主細胞に感染する場合を除き、感染性の新しいウイルス粒子の生産を引きおこすことができず;前記免疫調節蛋白質をコードする前記異種遺伝材料の挿入の部位が、好ましくは前記選択された本質的なウイルスゲノムにおける欠損の部位である。
【選択図】なし
Description
遺伝子工学組換え体を含む弱毒化された生きたウイルスは、有用なワクチンベクターとして知られている。生きたウイルスのゲノムは、生きたウイルスの複製能力が保存され、そしてその異種遺伝子が組換えウイルスにより感染した細胞内で発現されるように、免疫学的応答が要求される異種抗原をコードする遺伝子を有するように操作することができる。これにより発現された抗原は、有用な免疫応答を誘導するのに利用できる。異種抗原は保護的又は治療的免疫応答が感染源に対して構築され得るように、感染性の病原性から得られうるが、あるいは、それらは腫瘍細胞特異的又は腫瘍関連抗原を供し得る;ここでの目的は、腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導すること、腫瘍除去又は退縮を誘導することである。
本発明によれば、以下に更に詳細に記載されるように、遺伝的に不活性化された(遺伝的に無能化された)変異ウイルスワクチンは、免疫調節蛋白質をコードする遺伝子のための有用な担体を提供し、そしてこれによりウイルスベクターとして用いることができる。ウイルスワクチンは、例えばウイルス抗原及び免疫調節蛋白質の細胞内合成を導くワクチン化対象物の細胞に感染することができる。これにより、ウイルスに対する免疫応答は、本発明の特定の実施例において、ウイルスにコードされた抗原に対して、又はウイルスによりコードされた免疫調節蛋白質に応答してのいずれかを行うことで強化される。遺伝的に不活性化されたワクチンは、外来抗原の輸送のためのベクターとしても作用し、次に外来抗原に対する免疫応答も増強され得る。
(i)治療されるべき被検体に免疫刺激を供するベクターを感染させた後に能力のある細胞の調製物に生体外で欠損ウイルスベクターを接触させ;そして
(ii)例えば
(a)例えば投与前の不活性化の後、例えば照射の後に、ワクチンとして感染した細胞を直接投与することにより、又は
(b)治療されるべき被検体の免疫系の細胞のような免疫コンピテント細胞を生体外で刺激し、次に例えばウイルス又はウイルス感染細胞の同時投与なしで、免疫−コンピテント細胞を再投与する細胞の間接的な使用により、感染した細胞を用いて、治療されるべき被検体に免疫刺激を供することを含む。本文節において不要ないずれの細胞も、例えば陰性枯渇を含む精製方法により、例えば対応する抗体又は他の結合剤での不要なタイプの細胞の選択的除去により、除去することができる。
(a)血液単核細胞、リンパ球又はT細胞のサンプルを被検体から単離し;
(b)感染性ウイルスの生産のために本質的な第1の遺伝子に関して欠損を有し、免疫調節蛋白質をコードする異種ヌクレオチド配列を必要に応じて含み得る変異ウイルスの存在下で前記サンプルを試験管内で培養し、
(c)培養した細胞を前記被検体に再注入することを含むことを特徴とする方法を更に提供する。
以下の記載が特に含まれる:
gH遺伝子の削除部位において(ネズミ)GM−CSF をコードし、感染した細胞においてGM−CSF の発現を引きおこすことができるgHが削除された HSV1及び HSV2の作製:
免疫原(ワクチン)としての上述のベクターの効果のテスト:
gH遺伝子の削除部位においてヒトGM−CSF をコードし、感染した細胞においてGM−CSF の発現を引きおこすことができるgHが削除された HSV2の作製:並びに
gH遺伝子の削除部位においてヒトIL−2をコードし、感染した細胞においてIL−2の発現を引きおこすことができるgHが削除されたHSV2の作製。
gHが削除された HSV1ウイルス及びgHが削除された HSV2ウイルスを補足性細胞系内で増殖させた。これらの細胞系を各々 HSV−1gH遺伝子又は HSV−2gH遺伝子を形現するように操作した。これらの細胞系をWO 94/05207 及びWO 94/21807 並びに本明細書に言及される引用文献に記載されるように作製することができる。以下の節は、適切な細胞系の作製の更なる記載を提供し、そして特定のプラスミドの作製から始まる。
HSV ウイルスDNA が要求される場合、それは、例えば(HSV2の場合)Walboomers及びTer Scheggt (1976) (Virology 74, 256〜258)の方法により、又はその方法の適切な調節により、株HG52から作ることができる。HG52株の選択された保存物は、Institute of Virology, MRC Virology Unit, Chwrch Street, Glasgow, Scotland, UKに維持されている。他の HSV−2株のDNA は、この領域において極めて類似しているようであり、例えば株G及びMSは、ATCC, Rockville, Maryland, USAから得ることができる。
HSV−1(HFEM) gH遺伝子及び上流の HSV−1gDプロモーター(−392 〜+11)をコードする 4.3kb Sst−1フラグメントをプラスミドpg DBrgH(Forrester ら、前掲)から切り出し、pUC119 (Vieira及びMessing, 1987)内にクローニングしてプラスミドpUC119gHを作製した。 Not1部位を部位特異的変異誘発により、プラスミドpUC119gH内に、gH停止コドンの87bp下流に導入した。結果として生ずるプラスミド pIMCO3を用いて修復され、真核生物発現ベクターpRc/CMV (Invitrogen Corporation)内に連結された Not1− Sst1フラグメントを形し、CMV IEプロモーターを除去するために Not1及び Nru1で予備消化した。結果として生ずるプラスミド、 pIMCO5は、ウイルス誘導可能gDプロモーター及びBGH(ウシ成長ホルモン)ポリAの転写制御下で HSV−1gH遺伝子を含む。それは、G418耐性の安定な細胞系の選択のためのネオマイシン耐性遺伝子も含む。
プラスミド pIMCO5をCaPO4 技術を用いてVero (ATCC番号88020401) 細胞内に移入した(Sambrook, Fritsch 及びManiatis, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press) 。細胞をG418の存在下で希釈クローニングすることにより単離し、クローン細胞系を単離した。増殖させて凍結した後、細胞を24ウェルプレート内に種つけし、gH陰性ウイルスの増殖を支持する能力についてテストした。0.1pfu/細胞におけるSC16ΔgH('Forresterら、前掲)での感染によるgH陰性ウイルスの増殖を支持するそれらの能力についてテストした。gH遺伝子の発現を確認するため、ウイルスのプラークを感染後3日間、観察した。
これらの細胞を、gH削除 HSV−1及びgH削除 HSV−2補足細胞について記載される方法と同様にチミジンキナーゼ陰性(TK−)BHK細胞(ECACC番号85011423) 内へのプラスミド pIMCO5の移入により作製した。
HSV−2gH遺伝子を含むプラスミドpIMMB24 を HSV−2株25766の2つの隣接したBamHIフラグメントから作製する。そのプラスミドをそれら両方がpBR322のBamHI部位内にクローンされた、約3484塩基対のBamHIRフラグメントを含むpTW49 と、そして約3311を塩基対BamHISフラグメントを含むpTW54 と命名する。均等なプラスミドは、多くの利用できる株又は HSV−2の臨床的単離物から容易にクローンすることができる。 HSV−2遺伝子の5’末端を、BamHI及び KpnIを用いてpTW54 から切り出し、ゲル精製した2620塩基対フラグメントを作製する。 HSV−2gH遺伝子の3’末端をBamHI及び SalIを用いてpTW49 から切り出し、ゲル精製もされる870 塩基対フラグメントを形成する。2つのフラグメントをSalHI及び KpnIで消化されているpUC119内にクローンする。このプラスミドは、なお完全な HSV−2gH遺伝子を含む。
プラスミド pIMCO5は、ウイルス誘導可能gDプロモーター及びBGH(ウシ成長ホルモン)ポリAの転写制御下に HSV−2gH遺伝子を含む。それは、G418耐性の安定な細胞系の選択のためのネオマイシン耐性遺伝子も含む。プラスミド pIMCO8を、CaPO4 技術を用いてVero (ATCC番号88020401) 細胞内に移入した(Sambrook, Fritsch 及びManiatis, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press) 。細胞を、G418の存在下で希釈クローニングすることにより選択し、クローン細胞系を単離した。増殖させ、凍結させた後、CR2細胞と命名されるこれらの細胞を24ウェルプレートに種つけし、0.1pfu/細胞においてgH削除 HSV−1(SC16gH) に感染させた。ウイルスプラークを、gH遺伝子の発現を確認するため注入後3日間、観察した。
a)pIMMB56 +
pIMMB56 +は、gH遺伝子の両側から HSV−2配列に隣接するlacZカセットを有するベクターである。それは次のように作られる:オリゴMB97−MB96により、及びオリゴMB57−MB58により作られた2つのPCR フラグメントを、PCR オリゴヌクレオチド内に含まれている部位に適した制限酵素で消化する。MB97−MB96フラグメントをHindIII 及び HpaIで消化する。MB57−MB58フラグメントを HpaI及びEcoRIで消化する。次にこれらのフラグメントを、HindIII 及びEcoRIで消化されたベクターpUC119内に連結する。結果として生ずるプラスミドをpIMMB45 と呼ぶ(図1)。
pIMM46は、中心の特有の HpaI部位と共に、 HSV−2gH遺伝子に隣接する配列を含む。この部位内にクローンされたいずれの遺伝子もgH座において HSV−2ゲノム内に組換えにより挿入することができる。ウイルスか、TK陰性gH陰性ウイルスであるなら、(例えば上述のpIMMB56 +プラスミドを用いて作られた)プラスミドは、TK遺伝子の3’末端を置き換え、これによりTK活性を復元し、TK陰性ウイルスについての選択を許容する。
プラスミドpRc/CMV (Invitrogen Corporation)を制限酵素 MruI, PvuII及び BsmIで消化し、1066塩基対 MruI− PvuIIフラグメントをアガロースゲルから単離した。そのフラグメントを HpaIで消化されたpIMMB46 内にクローンした(図4を参照のこと)。結果として生ずるものをpIMC14と呼ぶ。
プラスミドpIMR1は、 CMV−IEプロモーターの制御下でDISC HSV−2ベクター内へのネズミGM−CSF 遺伝子の挿入のための組換えベクターである。pIMC14を XbaIで消化し、CIAPでホスファターゼ処理し、ゲル精製し、そして出来たオーバーハング端をクレノウポリメラーゼで平滑化する。ネズミGM−CSF 遺伝子を2段階の手順により、(Gough ら(EMBO Journal 4, 645〜653)にpGM3.2として言及される)プラスミドpGM3.2FFから、(又は以下に記載されるように作製された均等なプラスミドから)切り出す。最初に、pGM3.2FFをEcoRIで消化し、1048塩基対フラグメントをゲル精製する。次にこのフラグメントをHinfI及び StuIで消化する。495 塩基対フラグメントをゲル精製し、その端をクレノウポリメラーゼで修復する。次にこのフラグメントを上述のように調製されるpIMC14のマルチクローニング部位内にクローンする。結果として生ずるプラスミドはpIMR1と命名する(図5を参照のこと)。
プラスミドpIMR1において、GM−CSF 遺伝子についてのオープンリーディングフレームは、15塩基対の短いオープンリーディングフレーム(ORF) より先にある。これはGM−CSF の発現を妨害することができることが可能であると考えられたので、この小さな読み枠を除去するようにプラスミドpIMR1を変える。pIMR1を NotI及びPpuMIで消化した。消化したベクターをウシ腸アルカリホスファターゼ(CIAP)でホスファターゼ処理してゲル精製した。2つの制限酵素部位の間の配列を、2つのオリゴヌクレオチドCE55及びCE56:
f)pIMMB34
これは、 HSV−1gH遺伝子に隣接する配列を含む組換えベクターである。左側に隣接する配列は、gH遺伝子に隣接して存在するTK遺伝子を不活性化する。オリゴMB97−MB100 により、及びオリゴMB61−MB58により作られた2つのPCR フラグメントをPCR オリゴヌクレオチド内に含まれている部位に適した制限酵素、で消化する。MB97−MB100 フラグメントをHindIII 及び HpaIで消化する。MB61−MB58フラグメントを HpaI及びEcoRIで消化する。次にこれらのフラグメントを、HindIII 及びEcoRIで消化されているベクターpUC119内に連結する。結果として生ずるプラスミドをpIMMB34 と呼ぶ。用いたオリゴヌクレオチドは次の通りである:
第1段階の組換えの容易な検出を許容するために、大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子をSV40プロモーターの制御下でpIMMB34 内に挿入する。SV40プロモーター+β−ガラクトシダーゼ遺伝子をBamHI及び TthIII 1を用いてプラスミドpCH110 (Pharmacia)から切り出す。端をDNA ポリメラーゼのクレノウフラグメントを用いて満たす。そのフラグメントをゲル精製する。プラスミドpIMMB34 を HpaIで消化し、自己連結を避けるためにウシ腸アルカリホスファターゼ(CIAP)でホスファターゼ処理し、ゲル精製する。次にそのゲル精製したフラグメントを一緒に連結してプラスミドpIMMB55 +を作る。
pIMMB63 を HSV−1株 KOS (m)DNA から作る。pIMMB63 は、中心の特有の HpaI部位と共に、 HSV−1gH遺伝子に隣接する配列を含む。この部位にクローンされたいずれの遺伝子も、gH座における HSV−1ゲノムへの組換えにより挿入することができる。ウイルスが(例えば上述のpIMMB55 +プラスミドを用いて作られた)TK陰性ウイルスであるなら、次にプラスミドをTK遺伝子の3’末端を置換し、これによりTK活性を復元してTK陽性ウイルスについての選択を許容する。
このプラスミドは、後に HSV−1gH削除DISCベクター内に組換えられ得る外来遺伝子の挿入のための特有の部位を有する一般的な組換えプラスミドである。プラスミドpRc/CMV を NruI及び PvuIIで消化し、CMV IEプロモーター及びポリAシグナルを含む1066bpフラグメントをクレノウポリメラーゼで平滑断端化し、プラスミドpIMM B63 の特有の HpaI部位内に挿入する。このプラスミドをpIMX1.0と命名する。CMV IEプロモーターとポリAシグナルとの間に含まれる多種クローニング部位は、プラスミド内に他の遺伝子をクローニングし、次にDISC HSV−1内に導入するのに理想的である。
プラスミドpIMX3.0 は、タイプI DISC HSV の削除されたgH領域内へのCMV IEプロモーターの制御下でのネズミGM−CSF の挿入のための組換えベクターである。このプラスミドを、 SmaI及び DraIでプラスミドpGM3.2FF(前掲)から切り出したネズミGM−CSF をpIMX1.0 の特有のBsaBI部位に挿入することにより作製した。このプラスミドpIMX3.0 はpIMR3の HSV−1均等物である。
GM−CSF を発現する組換えウイルスは、2段階で作ることができる。第1段階において、gH遺伝子及びTK遺伝子の部分は大腸菌lacZ遺伝子を駆動するSV40プロモーターからなる“lacZカセット”により置換される。このウイルスは、TK−表現型を有し、色原基質X−gal を含むオーバーレイ下で増殖する場合に青色のプラークも供する。この組換えウイルスは、gH座における外来遺伝子の挿入に便利には用いられ得る。遺伝子は、TK遺伝子の不適正部分に関連して挿入される。同時に、lacZカセットが除去される。これらのウイルスは、TK陽性表現型及びX−gal 下の白色に基づいて選択することができる。
組換えウイルスを、(HSV−2のための)プラスミドpIMMB56 +又は(HSV−1のための)pIMMB55 +のウイルスDNA への移入により作製した。ウイルスDNA をWalboomers及びTer Schegget(1976)Virology 74, 256〜258 に記載されるようなヨウ化ナトリウム勾配で精製する。
a)第1段階
移入混合物を5μgのウイルスDNA, 0.5μgの直鎖状プラスミドDNA(制限酵素 ScaIでの消化により直鎖状にされたもの)を1mlのHEBS緩衝液(137mM NaCl, 5mM KCl, 0.7mM Na2HPO4, 5.5mMグルコース、20mM Hepes, pH 7.05)中で混合することにより調製する。70μlの2M CaCl2を適下して加え、静かに混合する。その培地をCR1及びCR2のサブ密集皿から除き、 500μlの移入混合物を2つの皿の各々に加える。その細胞を、5%胎児ウシ血清(FCS)を含む増殖培地4mlを加えた場合、40分間、37℃でインキュベートする。移入混合物を加えた後4時間に、培地を除去し、その細胞を血清を含まない培地で洗浄する。その細胞を次に2分間、15%グリセロールの皿当り 500μlで‘ショックを与える(shocked)’。グリセロールを除去した後、その細胞を血清を含まない培地で2回、洗浄し、5%FCS を含む増殖培地を加える。
第1段階の組換え体からのウイルスDNA 並びに(HSV−2のために)プラスミドpIMR3又は(HSV−1のために)pIMX3.0 を用いて、先の通り組換えを行う。ウイルスの最初の収集の後、 0.6μMメトトレキセート、15μMチミジン、 9.5μMグリシン、4.75μMアデノシン及び4.75μMグアノシンの存在下でBHK gH陽性TK陰性細胞を増殖させることにより、TK陰性組換えウイルスを選択する。6ウェル皿(ウェル当り10cm2)でこの選択を3回、行う。各々の段階において、感染した細胞を培地中にこすり取ることにより収集し、遠心して沈殿させ、 200μlのEMEM中に再懸濁する。音波処理した後、この50μlを新鮮なBHK gH陽性TK陰性細胞に加え、その選択を続ける。
そのウイルスDNA の構造を先のように分析する。
gH欠損GM−CSF 発現性変異ウイルスは、Farrell ら (J. Virol. 68, 927〜32, 1994)に記載されるようにマウスモデル系を用いることにより、ワクチンとしての効能についてテストすることができる。gH欠損変異ウイルス、GM−CSF 発現性ウイルス、gH欠損GM−CSF −発現性変異ウイルス、及びgH復帰変異体の 102〜106 プラーク形成単位(pfu)の範囲の種々の投与量を、耳翼を犠牲にすることにより、マウスのグループにワクチン接種する。対照のグループをPBS でワクチン接種する。3週間後、106 pfu の野生型 HSV−1(株SC16)で反対側の耳翼にマウスを攻撃する。攻撃後5日目にマウスを殺し、攻撃した耳を除去し、−70℃に凍結する。その耳をホモジナイズし、各々の耳中の感染性攻撃ウイルスの量をプラークタイトレーションにより決定する。PBS 処理した対照と比較したマウスのワクチン接種されたグループ中のウイルスタイターの減少は、ウイルスワクチンにより供される保護の規準である。gH欠損ウイルスは、5×105 pfu のワクチン投与量で感染性ウイルスの存在を完全に捨てることができ、5×104 pfu でさえ1000倍の減少が観察される。gH欠損GM−CSF 発現性変異体が保護のレベルを増加させることができることは、gH欠損変異ウイルスワクチン接種マウスにおいてのより低い攻撃投与量でのいずれの感染性ウイルスからの完全な保護、並びにPBS ワクチン接種対照と比較した感染性ウイルスタイターのより大きな削減を観察することによりテストすることができる。gH欠損したGM−CSF 含有ウイルスは、GM−CSF 遺伝子を有さないgH欠損ウイルスと比較して抗体応答のレベルを増加させることができる。
Cosl細胞(ECACC番号88031701)に、Gene Transfer and Expression (A laboratory Manual, Michael Kriegler)に記載されるようにDEAEデキストランを用いてプラスミドDNA を移入する。移入されたCosl細胞又は感染したCR2細胞からの上清をバイオアッセイによりGM−CSF 活性についてスクリーニングする。C2GMと呼ばれるIL−3/GM−CSF 反応性ネズミ造血細胞系をDr. E. Spooner (Paterson Institure for Cancer Research, Christie Hospital, UK)から得た。細胞系C2GMを、20%ウマ血清、1%グルタミン及び10%ならし細胞培地を有するフィッシャー培地中に維持する。そのならし細胞培地を、ネズミIL−3を培地に分泌するWehi36細胞(ECACC番号86013003)の培養物を指数増殖させることから得る。Wehi36細胞をRPMI1640培地、10% FCS及び1%グルタミン中に維持する。
ヒトGMCSF 及びその遺伝子は、M. Cantrell ら (PNAS 82 (1985) 6250〜6254) ; F Lee ら (PNAS 82 (1985) 4360〜4364) ; G. Wong ら (Sience (1985) 228 : 810〜815)に記載される。
ヒトIL−2及びその遺伝子は、T. Taniguchiら(Nature 302 (1983) (5906) 305〜310)及びEMBL配列HSILO2(IL2をコードするmRNA)に記載される;(バクテリアの発現に言及する)R. Devosら (Nucl Acids Res 11 (13) (1983) 4307〜4323)も参照のこと。
Claims (1)
- 感染性の新しいウイルス粒子の生産のために本質的である選択された遺伝子に関して欠損しており、GM−CSF、IL−2、IL−12、OX40、OX40L(gp34)及びCD40Lから選択される免疫調節蛋白質をコードする異種遺伝材料を有するゲノムを有する変異ヘルペスウイルスであって、
該変異ヘルペスウイルスが、通常の宿主細胞に感染することができ、そしてその中での免疫調節蛋白質をコードする前記異種遺伝材料の発現を引きおこすことができるが、前記変異ヘルペスウイルスは、該ウイルスが前記本質的なウイルス遺伝子の機能を供する遺伝子を有するように作製されそれを発現することができる組換え補足性宿主細胞に感染する場合を除き、感染性の新しいウイルス粒子の生産を引きおこすことができないことを特徴とする、前記変異ヘルペスウイルス。
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