DE69333751T2

DE69333751T2 - Nicht-verbreitendes lebendes herpesvirusvakzin

Info

Publication number: DE69333751T2
Application number: DE1993633751
Authority: DE
Inventors: Nicolaas Visser; Alphonsus Petrus VAN WOENSEL; Christoph Thomas METTENLEITER
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Akzo Nobel NV
Priority date: 1992-07-30
Filing date: 1993-06-28
Publication date: 2005-12-29
Anticipated expiration: 2013-06-29
Also published as: WO1994003595A1; EP0606437B1; EP0606437A1; DE69333751D1; JPH07500972A; AU4560693A; ATE288483T1; US5626850A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen lebenden Herpesvirus Impfstoff.
Derzeit werden verschiedene Arten von Herpesvirus Impfstoffen eingesetzt, das heisst inaktivierte Virusimpfstoffe, Subunit-Impfstoffe und modifizierte lebende Virus (MLV) Impfstoffe.
Inaktivierte Virusimpfstoffe weisen den Vorteil auf, dass sie kein lebendes infektiöses virales Material aufweisen, was sonst die Möglichkeit einer Reversion der Viren in einen virulenten Zustand verhindert.
Aber inaktivierte Virusimpfstoffe und Subunit-Impfstoffe erfordern die Herstellung von grossen Mengen der aktiven Impfstoffkomponente und sind damit teuer in der Herstellung. Weiterhin erfordern diese Typen von Impfstoffen auch mehrere Inokulationen mit dem Impfstoff im Beisein eines Adjuvants, um eine Immunität zu erreichen, die effektiv und lang anhaltend ist.
MLV Impfstoffe haben wesentliche Vorteile darin, dass sie eine schnelle und lang anhaltende Immunantwort erreichen, sowohl humoral als auch zellulär, ohne dass die Notwendigkeit besteht, grosse Mengen von der aktiven Komponente bei fehlenden Adjuvantien herzustellen.
Dennoch beinhalten diese Impfstoffe immer noch das Risiko, dass der Impfstoffvirus durch das geimpfte Tier in die Umgebung abgegeben wird, insbesondere, wenn der lebende Impfstoff über den natürlichen Weg verabreicht wird, beispielsweise intranasal.
Obwohl sich MLV Impfstoffe als sicher und wirksam erwiesen haben, besteht das Risiko, dass die Impfstoffviren zurück in einen virulenteren Zustand übergehen, oder dass der MLV sich auf andere Tiere weiterverbreitet, die empfänglicher für den MVL Impfstoffvirus sein können.
Insbesondere, zum Zweck der Risikofeststellung durch Zulassungsbehörden in Bezug auf Impfstoffe, die auf genetisch modifizierten Organismen beruhen, insbesondere lebenden Organismen, die fremde Gene exprimieren, ist der Aspekt der möglichen Verbreitung dieser Organismen in die Umwelt sehr wesentlich.
Daher kann davon ausgegangen werden, dass Herpes-Virusimpfstoffe, die die Vorteile der lebenden Virusinokulation zeigen, die aber auf die geimpften Tiere beschränkt sind, sehr wünschenswert sind.
Die umhüllenden Glykoproteine der Herpesviren sind Hauptziele der Immunantwort auf die virale Herpesinfektion. Weiterhin sind diese Glykoproteine wesentlich für die Wechselwirkung zwischen dem Virus und seiner Wirtszelle.
Der Pseudorabies-Virus (PRV) ist ein Herpesvirus, der eine wirtschaftlich erhebliche Krankheit bei Schweinen hervorruft, die als Aujeszky's Krankheit bezeichnet wird. Es ist gut dokumentiert, dass das Glykoprotein D (gD) Homolog des PRV (Glykoprotein 50, gp50) ein Hauptimmunogen des PRV ist, welches das potenteste für die Einführung der Schutzimmunität in einem infizierten Wirtstier ist (Eloit, M. et al., Archs. Virol. 99, 45–56, 1988; Marchioli, C. et al., Am. J. Vet.res. 49, 860–864, 1988; Ishii, H. et al., J. Gen. Virol. 69, 1411–1414, 1988; Marchioli, C. C. et al., J. Virol. 61, 3977–3982, 1987; Wathen, M. W. et al., J. Virol. 51, 57–62, 1984, Mettenleiter, T. C., Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis. 14, 151–163, 1991).
Weiterhin haben Rauh, I. und Mettenleiter, T. C. (J. Virol. 65, 5348–5356, 1991), und Peeters, B. et al., (J. Virol. 66, 894–905, 1992) eine gp50-negative (gp50-) PRV-Mutante hergestellt, die phenotypisch gp50-positiv war als Ergebnis ihres Wachstums in einer Zelllinie, die gp50 exprimiert. Es ist dort geschlossen worden, dass für die in-vitro-Replikation des Virus gp50 wesentlich für das Eindringen in eine Zelle ist und für die Zellen-zu-Zellen Verbreitung des Virus nicht erforderlich ist.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, einen lebenden Herpesvirus-Impfstoff anzubieten, der sowohl wirksam ist, dass er eine Schutz-Immunantwort erzeugt, als auch dass er sicher ist, weil er ein vermindertes Niveau des Verbreitens des lebenden Virus in der Umwelt hat, womit er die Potenz eines MLV Impfstoffes und die Sicherheit eines inaktivierten Impfstoffes miteinander verbindet.
Die Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass der lebende Herpesvirus-Impfstoff lebende Herpesviren aufweist, die nicht fähig sind, ein funktionales gD Homolog zu erzeugen, wobei die besagten Herpesviren mit dem gD Homolog komplementiert sind.
Unter gD-Homolog ist hier das Glykoprotein des spezifischen Herpesvirus gemeint, welches eine signifikante Homologie mit dem wohlbekannten Glykoprotein D des Herpes-Simplex-Virus (HSV) aufweist. Verschiedene Herpesvirus gD Homologe und die Gene, die diese Homologe kodieren, sind bereits im Stand der Technik beschrieben, wie das gD Homolog des PRV, das heisst gp50 (Petrovskis, E. A. et al., J. Virol. 59, 216–223, 1986), Rinderherpesvirus-1, das heisst gIV (Tikoo, S. K. et al., J. Virol. 64, 5132–5142, 1990) und Pferdeherpesvirus-1 (Flowers, C. C. et al., Virology 180, 175–184, 1991).
Gemäss der vorliegenden Erfindung induzieren die lebenden Impfstoffe mit lebenden Herpesviren, die gemäss einem ersten Merkmal nicht fähig sind, ein funktionales gD Homolog in einem infizierten Tier zu erzeugen, überraschend eine Schutzimmunantwort in einem inokulierten Wirtstier und wird von dem geimpften Tier nicht freigesetzt.
Ein Virus, der nicht fähig ist, ein funktionales gD Homolog zu erzeugen, wie nachfolgend beschrieben: Bei der Replikation des Virus in dem Wirtstier exprimiert das gD Gen nicht ein funktionales Genprodukt.
Ein funktionales gD Genprodukt ist ein gD Genprodukt, dass es gereinigten Herpesviren ermöglicht, eine geeignete Wirtszelle zu infizieren.
Dies kann erreicht werden durch das Einführen einer Mutation in das Gen, das das gD Homolog kodiert oder in einen Bereich, der die Expression des besagten Glykoprotein steuert, vorzugsweise durch Einsatz von rekombinanten DNS Techniken.
Eine Mutation wird als ein Wechsel der genetischen Information in dem oben erwähnten Bereich in Bezug auf die genetische Information verstanden, die in diesem Bereich des Genoms von natürlich auftretenden Herpesviren vorliegen. Die Mutation ist, beispielsweise, eine Nukleinsäuresubstitution, -löschung, -einfügung oder -inversion, oder eine Kombination davon, was zu einem Herpesvirus führt, der darin versagt, ein funktionales gD Homolog zu erzeugen. Vorzugsweise ist die Mutation eine Löschung und/oder eine Einfügung.
Löschungen können beispielsweise durch Spalten des gD Homologgens erreicht werden, welches in einen Vektor durch das Mittel von einem oder mehreren geeigneten Restriktionen des gD Homologgenes eingesetzt wird, und nachfolgend das Binden der Vektor-DNS.
Alternativ dazu kann das besagte Gen an einem Ort gefolgt durch eine Exonuklease-Behandlung gespalten werden, um die Endnukleotide zu entfernen, was zu der vollständigen oder teilweisen Entfernung des Gens und der gebundenen Vektor-DNS führt. Das Ergebnis diese Prozesses ist die Modifizierung der Herpesvirus DNS, dergestalt, dass kein funktionales gD Homolog-Genprodukt mehr exprimiert werden kann auf Grund beispielsweise der Veränderung des Leserahmens oder der Entfernung der DNS-Sequenzen, die für das Kodieren eines funktionalen Genproduktes notwendig sind.
Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung wird ein lebender Herpesvirus-Impfstoff eingesetzt, der Viren umfasst, die eine Löschung in dem Genom aufweisen, die das ganze gD Homologgen umfasst.
Einfügungen von heterologer DNS in das gD Homologgen eines Herpesvirus kann auch zu einer Unfähigkeit des Virus führen, ein funktionales gD Homolog zu exprimieren.
Einfügungen von heterologer DNS kann mit wohlbekannten Verfahren erreicht werden, wie die, die doppelsträngige Verbinder einsetzen, die eine oder mehrere Restriktionsenzymorte aufweisen, oder durch das Mittel von homopolymeren Tailing-Techniken. Der Begriff "heterologe DNS" bedeutet eine DNS Sequenz, die entweder ein Polypeptid nicht kodiert oder ein Polypeptid kodiert, welches nicht das gD homologe Gen desselben Ursprungs ist wie das zu inaktivierende Gen.
Die Länge und Sequenz der nicht kodierenden heterologen DNS sind nicht kritisch und umfassen Oligonukleotide, vorzugsweise zwischen 8 und 50 Nukleotiden in der Länge. Ein geeignetes doppelsträngiges Oligonukleotid umfasst drei translationale Stopcodons in jedem der möglichen Leserahmen in beiden Richtungen, zusätzlich zu geeigneten Restrictions-Enzym-Spaltungs-Orten.
Wohlbekannte Techniken können eingesetzt werden, um die Löschungen und/oder Einfügungen in das gD homologe Gen zu erzeugen, welche nach der vorliegenden Erfindung erforderlich sind, wie beispielsweise die in vivo homologen Rekombinationstechniken (Manjarls, T. et al., in "Molecular Cloning", zweite Auflage, Cold Spring Harber Laberatory, 1989; Roizman, B. und Jenkins, F. J., Science 229, 1208, 1985; Higuchi, R. et al., Nucleic Acids Res. 16, 7351, 1988).
Kurz gesagt, ein DNS Fragment mit dem gD homologen Gen wird von der Herpesvirus genomischen DNS isoliert.
Dieses Fragment kann dann in einen Vektor geklont werden. Jeder bakterielle Plasmid- oder Bacteriophagen-Vektor mit einem auswählbaren Marker kann hierfür eingesetzt werden. Beispiele von solchen Klon-Vektoren sind Plasmid pBR322 oder Derivate davon, die verschiedenen pUC und Bluescript Plasmide und bacteriophage Lambda und M13.
Der Einsatz von rekombinanten Vektoren mit den ganzen oder einem Fragment der gD homologen Gen-Löschungen und/oder -Einfügungen der heterologen DNS darin kann wie oben beschrieben ausgeführt werden.
Die rekombinanten Vektoren mit der gewünschten Mutation können dann ausgewählt werden und in eine Hostzelle unter Einsatz von standardisierten Transformationsprozeduren übertragen werden. Jegliche Hostzelle, in die der Vektor übertragen werden kann, kann eingesetzt werden. Beispielsweise ist E. coli ein geeigneter Host für die Verbreitung von pBR322.
Danach werden geeignete Zellen, in denen der jeweilige gD homolog-negative Herpesvirus zur Replikation fähig ist, in Standard Co-Transfektion Prozeduren eingesetzt, wobei die Rekombination zwischen entsprechenden Bereichen in dem rekombinanten Vektor und dem Herpesvirus-Genom stattfindet.
Rekombinante virale Nachkommen werden danach in Zellkulturen erzeugt und können genotypisch oder phenotypisch ausgewählt werden, beispielsweise durch Hybridisierung oder durch Erfassen von Enzymaktivität oder antigenischer Aktivität, die durch ein Gen kodiert wird, das zusammen mit der Mutation in dem gD homologen Gen eingeführt wird. Der gewünschte Herpesvirus kann dann in grossem Massstab in einer geeigneten Zellkultur kultiviert werden, wonach die Viren von der Zellkultur geerntet werden können.
Ein anderer Weg, um lebende Herpesviren zu erhalten, die nicht fähig sind, ein funktionales gD Homolog in einem infizierten Tier zu erzeugen, ist das Bringen des gD homologen Genes unter die Steuerung von spezifischen Nukleotidsequenzen, die fähig sind, die Expression des gD Homologs in solch einer Art und Weise zu steuern, dass der gD Homolog in einer in vitro Zellkultur exprimiert ist, aber nicht in dem inokulierten Wirtstier exprimiert ist. Beispiele von solchen Expressionssteuersequenzen sind sogenannte Promoter und Enhancer.
Vorzugsweise ist das gD homologe Gen unter der Steuerung einer induzierbaren regulierenden Nukleotidsequenz angeordnet. Eine induzierbare regulierende Nukleotidsequenz dieses Typs ist, beispielsweise, eine regulierende Nukleotidsequenz, die nur unter Einfluss von spezifischen physikalischen oder chemischen Stimulationen, wie Hormonen, Arzneimitteln, Metallionen und ähnlichem in Wirkung tritt. Geeignete Beispiele von solchen induzierbaren regulierenden Nukleotidsequenzen sind die Metallothionin-Promoter und HSP-Promoter (Heat-Shock-Promoter).
Ein bevorzugtes zweites Merkmal der in dem Impfstoff vorliegenden lebenden Herpesviren gemäss der Erfindung ist, dass die besagten Herpesviren mit dem gD homologen Protein komplementiert sind. Solche Viren können durch Propagation der genotypischen gD-Herpesviren in eine geeignete Zelllinie erhalten werden, das heisst in einer komplementären Zelllinie, die fähig ist, das erforderliche gD Homolog zu exprimieren.
Solche komplementäre Zelllinien können durch Transformieren einer Zelllinie, die für den jeweiligen parentalen Herpesvirus empfindlich ist, mit einem Plasmid, der das gD homologe Gen umfasst, unter Einsatz von Standardtechniken wie die Transfection oder Electroporation erhalten werden.
Ein anderer Weg zum Versehen einer Zelle mit dem gD Homolog ist es, die Zelle mit einem rekombinanten Retrovirus zu induzieren, der das gD homologe Gen trägt, oder mit einem nicht-integrierenden rekombinanten Virus, beispielsweise den Vaccinia Virus, der das gD homologe Gen trägt, zu versehen.
gD homolog produzierende Zelllinien können unter anderem auch durch synchrone Infektion (das heisst Koinfektion) mit dem Virus tragenden gD homolog Gen und dem Herpesvirus, der in der gD Synthese fehlt, erzeugt werden.
Nachfolgend können Zellen für die gD homologe Expression durch das Mittel eines immunologischen Screenings gewonnen werden.
Vorzugsweise wird der Impfstoffvirus gemäss der Erfindung auf einer komplementären Zelllinie hergestellt, die nicht die Herpesvirus DNS Sequenzen enthält, die zu den DNS Sequenzen in dem mutiertem Herpesvirus Genom homolog sind, um zu vermeiden, dass die genotypischen gD^– Herpesviren durch die komplementären Zelllinien mit dem gD homologen Gen gerettet werden.
Das Wachstum eines unzulänglichen Virus bei Zellen, die ein Genprodukt komplementieren, für den das Virus unzulänglich ist, hat das potentielle Risiko des "Rettens". Rettungsmittel, die verlorene genetische Information wiedergewinnen, in diesem Fall durch den Austausch von genetischer Information zwischen der Zelle und dem Virus, spezifisch durch den Austausch zwischen der korrekten zellulären genetischen Information und dem unzulänglichen viralen Genom. Dies führt dann zu der Ausbildung von Viren, die durch die Rettung ihrer verloren gegangenen genetischen Information ihren "parentalen" Character wiedergewonnen haben. Dieser Prozess wird auch "Reversion" genannt, und Viren, die beispielsweise durch Retten verloren gegangene Information wiedergewonnen haben, werden daher "Revertanten" genannt. In diesem spezifischen Fall würden die geretteten Viren sowohl phenotypisch als auch genotypisch gD-homolog-positiv und damit vollständig infektiös sein. Dies ist natürlich eine höchst unwahrscheinliche Situation.
Der Hauptgrund der Rettung ist der Austausch von genetischer Information durch die sogenannte homologe Rekombination. Dieses Phänomen tritt auf, obwohl nur mit geringer Frequenz, wenn homologe DNS Bereiche (das heisst Bereiche mit einer identischen oder nahe verwandten DNS Sequenz), die an verschiedenen Orten (beispielsweise in zellulärer und viraler DNS) vorliegen, miteinander austauschen. Dieser Prozess ist unter anderem in "Biochemistry" (Sterner, dritte Auflage 1988, Seiten 688–693) beschrieben. Es ist klar, dass, wenn die linken und rechten Flankensequenzen des parentalen gD-Homologs in der Zelle und die Flankensequenzen des unzulänglichen gD-Homologs in dem viralen Genom beide in derselben Zelle vorliegen, dies im Prinzip zu homologer Rekombination führen könnte, und daher die Ausbildung des frei lebenden Virus begünstigen könnte. Solche Prozesse sind von Cai et al (J. of Virol.; 62/8: 2596–2604 (1988)) beschrieben worden. Ein anderes Beispiel von homologer Rekombination ist durch van Zijl et al (J. of Virol.; 62/6: 2191–2195 (1988)) beschrieben worden, der homologe Rekombination für die Wiederherstellung der Herpesviren aus Fragmenten mit überlappender Homologie eingesetzt hat.
Die Gefahr aus homologer Rekombination kann vermieden werden, falls die komplementäre Zelle keine Sequenzen enthält, die zu der viralen DNS homolog sind. Dies könnte beispielsweise durch Löschen genetischer Information für das gD-Homolog aus dem Virus erreicht werden, der ein oder mehrere Nukleotide aus den Flankensequenzen enthält, während die komplementäre Zelle mit der genetischen Information für nur das gD-Homolog ohne Flankensequenzen ausgestaltet ist.
Sehr selten und mit einer sehr geringen Frequenz, tritt eine Rekombination zwischen nicht-homologen Sequenzen auf. Dies ist beispielsweise von Meyer et al. (Nature; 341: 419 (1989)) beschrieben worden. Diese heterologe Rekombination kann niemals vollständig vermieden werden, das sie der DNS-Replikation inhärent ist. Falls jedoch nur die linke oder die rechte Flankensequenz des gD-homologen Gens entfernt wird, verbleibt die andere Seite offen für die homologe Rekombination. Falls die homologe Rekombination an diesem Ort zusammen mit einer zufälligen heterologen Rekombination an dem anderen Ort des gD-homologen Gens auftritt, dann führt das immer noch zu einem ungewollten Rettungsereignis.
Daher enthält, in einer bevorzugten Form des Impfstoffs gemäss der Erfindung, das DNS-Fragment, dass das gD-homologe Komplementär liefert, keine Sequenzen, die mit viralen DNS Sequenzen an sowohl den linken als auch den rechten Flankenbereichen homolog sind.
Alternativ, können lebende Herpesviren, die genotypisch gD sind, für die Herstellung eines Impfstoffes gemäss der Erfindung eingesetzt werden, ohne dass die Notwendigkeit der Ausbildung auf einer komplementären Zelllinie besteht, falls der Impfstoff die besagten Herpesviren in einer einer Zelle zugeordneten Form aufweist, beispielsweise als eine Suspension von infizierten Zellen.
Es ist möglich, eine replizierende Zelllinie zu behalten, die eine replikative Form des Virus aufweist, in Abwesenheit des gD Homologs. Das Mischen von Zellen dieser Zelllinie mit virusfreien Zellen derselben oder einer kompatiblen Zelllinie führt in einem Zellen-Zellen Kontakt zur Infektion von allen Zellen in dieser Kultur, und liefern daher ein Mittel der konkomitanten Verbreitung von Viren und Virus-enthaltenden Zellen, die sowohl phenotypisch als auch genotypisch frei vom gD Homolog sind.
Die Zelllinie kann einen Herpesvirus umfassen, der nicht fähig ist, ein funktionales gD Homolog als ein Ergebnis einer Löschung und/oder Einfügung in dem Gen, das das gD Homolog kodiert, zu erzeugen. Es ist klar, dass die Zelllinie auch Herpesviren um fassen kann, die mit zusätzlichen Löschungen versehen worden sind, wie beispielsweise tk^– oder gI^– und/oder heterologen Genen, wie weiter oben oder weiter unten beschrieben.
Ein lebender Herpesvirus-Impfstoff gemäss der vorliegenden Erfindung könnte aus der Gruppe abgeleitet werden, die den Pseudotollwut Virus, den Rinderherpesvirus, den felinen Herpesvirus, den Virus der Marek Krankheit und den Pferdeherpesvirus umfasst.
Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung wird ein. lebender Herpesvirus Impfstoff geliefert, in dem die Herpesviren Pseudotollwutviren bilden.
Das Gen, dass das gD Homolog des PRV (gp50) kodiert, ist lokalisiert und sequenziert worden von Petrovskis et al. (supra). Eine gp50 komplementäre Zelllinie kann aus jeder geeigneten Zelllinie beispielsweise MDBK oder BHK Zellen wie von Rauh und Mettenleiter (supra) beschrieben, gewonnen werden.
Das gD homologe Gen des BHV-1 (gpIV) ist von Tikoo, S. K. et al. (supra) beschrieben worden. BHV gpIV komplementäre Zelllinien können beispielsweise von MDBK Zellen (Fehler, F, et al., supra) abgeleitet werden.
Das gD homologe Gen des EHV-1 ist von Flowers, C. C. et al. (ibid) charakterisiert worden. EHV-1 empfindliche Zellen, von denen eine komplementäre Zelllinie abstammt, können beispielsweise aus BHK oder Vero Zellen abgeleitet werden.
Andere geeignete Zelllinien, die für die Herstellung eines Impfstoffs gemäss der vorliegenden Erfindung einzusetzen sind, sind beispielsweise CRFK Zellen (FHV) oder QT35 Zellen (MDV).
Die Herpesvirusmutanten des lebenden Herpesvirus Impfstoffes gemäss der vorliegenden Erfindung enthalten vorzugsweise zusätzliche Mutationen, die den Herpesvirus bremsen oder in der Einführung eines serologisch identifizierbaren Markers resultieren. Dies kann erreicht werden durch das Einführen von Löschungen oder Einfügungen durch das Mittel von rekombinanten DNS Techniken in ihrer Virulenz zugeordneten Genen oder in Genen, die nicht-wesentliche Glykoproteine der Herpesviren kodieren. Die Abschwächung von mehreren Herpesviren durch das Mittel des Löschens der ganzen oder eines Teiles der Thymidine-Kinase (tk) Gens ist im Stand der Technik wohlbekannt (PRV: US-Patent US 4,609,548 : BHV-1: Europäische Patentanmeldung EP 0 226 029 ; FHV: PCT-Patentanmeldung WO 90/01547; EHV-4: PCT-Patentanmeldung WO 92/01045). Die Abschwächung der Herpesvirus-Virulenz kann auch erreicht werden durch Einführen einer Löschung in dem Gen, das die Proteinkinase (PCT-Anmeldung WO 90/00119) kodiert.
Zusätzlich ist auch schon eine serologisch identifizierbare Marker-Löschung mit dem Gen für Herpesvirus-Glykoprotein beschrieben worden (PRV: gI, Europäische Patentanmeldung EP 0 141 458 ; gX, Europäische Patentanmeldung EP 0 263 207 ; BHV-1: gIII, Europäische Patentanmeldung EP 0 316 658 ).
Ein bevorzugter Impfstoff gemäss der vorliegenden Erfindung umfasst lebende PRV, die genotypisch gI^– und/oder tk^– zusätzlich zu gp50^– sind.
Die vorliegende Erfindung liefert auch einen lebenden Herpesvirus-Impfstoff, der fähig ist, eine Schutzimmunität in einem Tier gegen den besagten Herpesvirus auszubilden und verminderte Verbreitungseigenschaften wie oben beschrieben aufweist, und der zusätzlich fähig ist, ein gewünschtes Protein zu exprimieren, vorzugsweise ein Antigen eines Pathogens, das fähig ist, eine Schutzimmunantwort gegen das besagte Pathogen hervorzurufen.
In solchen Vektorimpfstoffan wird eine heterologe DNS Sequenz, die ein Polypeptid kodiert, welches nicht normalerweise in der Natur mit dem jeweiligen Herpesvirus assoziiert ist, in einen Einfügungsbereich eingeführt, das heisst einen Bereich, der genutzt werden könnte für das Einbringen der besagten heterologen DNS Sequenz ohne Unterbrechen der wesentlichen Funktionen des Herpesvirus wie diejenigen, die für eine Infektion oder Replikation notwendig sind, einschliessend das gD homologe Gen.
Die spezifische heterologe DNS Sequenz, die ein Antigen eines Pathogens kodiert, das in das Genom des Herpesvirus einzufügen ist, ist nicht kritisch und hängt von der Spezifizität der Herpesvirusmutanten ab, die oben für das Wirtstier beschrieben worden sind. Beispielsweise kann die heterologe DNS Sequenz, die in einen lebenden PRV Impfstoff gemäss der Erfindung einzufügen ist, Antigene von Schweinpathogenen wie dem klassischen Schweinepest-Virus, dem Parvovirus, dem Influenzavirus, der Pasteurella multocida, dem Actinobacillus pleuropneumoniae, dem Streptococcus suis oder der Escherichia coli kodieren.
Eine wesentliche Anforderung für die Expression der heterologen DNS Sequenz durch die oben beschriebene Herpesvirusmutante ist ein adäquater Promoter, der in operabler Weise mit der heterologen DNS Sequenz verbunden ist. Es ist für den Fachmann auf diesem Gebiet klar, dass die Wahl eines Promoters sich auf jeglichen eukaryotischen, prokaryotischen oder viralen Promoter erstrecken kann, der fähig ist, eine Gentranskription in durch die Herpesvirusmutante infizierten Zellen auszulösen, wie der SV-40 Promoter (Science 222, 524–527, 1983) oder, beispielsweise der Metallothionin Promoter (Nature 296, 39–42, 1982) oder ein HSP (Heat-Shock-Promoter) (Voellmy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4949–53, 1985) oder der menschliche Zytomegalovirus IE Promoter oder andere Promoter, die in dem Herpesvirusgenom vorliegen.
Die Herstellung von Vektorvirusimpfstoffen, die von Herpesviren abgeleitet werden, ist aus dem Stand der Technik wohlbekannt, wie es von Ackermann, M., J. Vet. Med. B. 35, 379–396 (1988); Cole, G. C. et al., J. Virol. 64, 4930–4938, 1990 und in der europäischen Patentanmeldung EP 0 389 034 beschrieben worden ist.
Zusätzlich zu einer immunogenisch effektiven Menge an den oben beschriebenen lebenden Herpesvirusmutanten kann ein Impfstoff gemäss der vorliegenden Erfindung auch einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünner umfassen.
Beispiele von pharmazeutisch verträglichen Trägern oder Verdünnern, die für die vorliegende Erfindung nützlich sind, umfassen Stabilisierer wie SPGA, Kohlenhydrate (beispielsweise Sorbitol, Mannitol, Stärke, Sucrose, Glucose, Dextran), Proteine wie Albumin oder Casein, Protein enthaltende Agentien wie Rinderserum oder Magermilch und Puffer (beispielsweise Phosphatpuffer).
Optional können eine oder mehrere Verbindungen mit einer Adjuvansaktivität zu dem Impfstoff hinzugefügt werden. Geeignete Adjuvantien sind beispielsweise Aluminiumhydroxid, -phosphat oder -oxid, Ölemulsionen (beispielsweise Bayol F^® oder Marcol 52^®), Saponin oder Vitamin-E Solubilisat.
Die nützliche zu verabreichende Dosis wird von Alter, Gewicht und dem zu impfenden Säugetier, der Art der Verabreichung und des Typs des Pathogens abhängen, gegen das die Impfung nachgesucht wird.
Eine geeignete Dosis könnte beispielsweise zwischen ungefähr 10⁴ und 10⁷ pfu/Tier liegen.
Für die Verabreichung an ein Tier kann der Impfstoff gemäss der Präsentation inter alia intranasal, intradermal, subkutan oder intramuskulär verabreicht werden.
BEISPIEL 1:
A) Herstellung von einer genotypischen gp50^–, phenotypischen gp50⁺ PRV Mutante
In den Experimenten ist der PRV Stamm NIA-3 als parentaler Stamm eingesetzt worden. Viren sind auf Madin-Darby Rinderleberzellen (MDBK) ausgebreitet worden.
Für die Konstruktion einer gp50^– exprimierenden Zelllinie ist ein Plasmid, das ein PRV genomisches BamHI-SalI DNS Fragment (BamHI-7B) enthält, mit BstXI gespalten worden, was das gp50 Gen von seinen putativen 5'-Terminalpromoterelementen trennt. Nach der klebrigen Endung mit T4 Polymerase sind BamHI Linkers (BRL, Eggenstein, Deutschland) eingefügt worden und das Plasmid ist religiert worden. Die Spaltung mit BamHI und SalI haben dann ein 552-bp Fragment freigesetzt, das den 5' Teil des gp50 Gens enthalten hat, das in pBR322 geklont worden war. Das komplette gp50 Gen ist durch Einfügen eines 3, 346-bp SalI-SphI Fragmentes in den SalI Ort zusammengesetzt worden. Nachfolgende Spaltung mit BamHI und DraI haben ein 2, 433-bp Fragment herausgelassen, das die vollständige Expressionseinheit umfasst, umfassend die Gene, die gp50 und gp63 (gp50-63) und das 3'-Terminal mRNS, das Verarbeitungssignale kodiert. Dieses Fragment ist dann hinter dem Mausmetallothionin Promoter (Brinster, R. L. et al., Cel 27, 223–231, 1981) geklont worden, um das Plasmid pMT50-63 zu erzeugen. Um stabil transformierte gp50-exprimierte Zelllinien zu erhalten, sind MDBK Zellen mit Plasmiden pMT50-63 und pSV2-neo durch Ausfällungsverfahren nach Kalziumphosphat (Graham, F. L., et al., Virology 52, 456–467, 1973; Southern, P. J. et al., J. Mol. Appl. Genet. 1, 327–341, 1982) cotransfektiert worden.
Die Auswahl für G418-resistante Kolonien ist durchgeführt worden wie in Rauh, I., et al., J. Virol. 65, 621–631, 1991 beschrieben. gp50 Expression ist durch Immunofluoreszenzanalysen nach der Induktion des Promoters mit 100 Mikrometer ZnSO4 überprüft worden. Die Zelllinie MT50-3 ist für weitere Studien ausgewählt worden.
Für die Isolation einer gp50-negativen PRV Mutante ist eine 3.5-kb SalI-BamHI Expressionskassette mit Escherichia coli β-galactosidase Gen unter der Steuerung des PRV Glykoproteins gX Promoters (Mettenleiter, T. C. et al., J. Virol. Methods 30, 55–66, 1990) in den SalI site in der Mitte des gp50 Gen eingeführt worden, um Plasmid TT133/III zu erzeugen. Transiente Expressionsassays zeigten die Fähigkeit dieses Klons, funktionale β-Galaktosidase zu exprimieren.
Das Plasmid TT133/III ist mit PRV des Wild-Typs NIA-3 DNS in MT50-3 Zellen cotransfektiert worden. Nachdem ein vollständiger zytopathischer Effect induziert worden ist, ist das Supernatant gewonnen und gereinigt worden und die Virusnachkommenschaft ist auf MT50-3 Zellen in serieller Verdünnung gegeben worden. Wenn nach 2 Tagen Plaques sichtbar geworden sind, sind die Zellen mit Agarosemedium überlegt worden, welches 300 Mikrogramm an Bluo-Gal (BRL) je Milliliter enthalten hat. Bläuliche Plaques sind ausgewählt und dreimal auf MT50-3 Zellen gereinigt worden, bis alle Plaques unter einem Bluo-Gal-Overlay blau färbten. Diese Mutante ist für weitere Experimente eingesetzt worden.
B) Impfexperiments mit Mäusen
Zur Analyse der Virulenz der verschiedenen Mutanten sind 6-Wochen-alte weibliche BALB/c Mäuse intranasal mit 10 Mikroliter der Virussuspension infiziert worden, welche 10⁴ PFU von entweder gX^– oder phenotypisch komplementierter gp50^– PRV enthielt. Für diese infektiöse Dasis ist vorab festgestellt worden, dass sie zu einer 100%igen Mortalität in gX^– PRV-infizierten Tieren führt, während sie niedrig genug war, um den Einschluss von signifikanten Mengen von gerettetem Virus in dem Inokulum zu vermeiden. Die Mäuse sind mindestens alle 8 Stunden auf Symptome der PRV Infektion untersucht worden. Kranke Tiere sind getötet worden, und Gehirnhomogenate sind auf die Präsenz von infektiösen Viren durch Titration von gII-exprimierten MT-3 Zellen untersucht worden, in denen Wildtypus und gX^– PRV, phenotypisch komplementierte gp50^– PRV, und alle putativen geretteten Virionen fähig sein sollten, um Plaques auszubilden. Zu diesem Zweck sind die Gehirne entfernt, in flüssigem Stickstoff schockgefrostet, in minimal essentiellem Medium (MEM) homogenisiert und mit 100 Mikrogramm an Gentamicin (Boehringer, Mannheim, Deutschland) per Milliliter versehen und auf MT-3 Monolayer aufgebracht worden. Nach einer Stunde Adsorption, ist der Monolayer extensiv mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und mit Methylzellulosemedium mit Gentamicin überdeckt worden. In zwei bis drei Tagen nach der Infektion (p.i.) sind die Plaques gezählt worden. Für histologische Prüfungen sind Organe von kranken Mäusen entnommen worden, die intranasal mit 10⁵ PFU in einem 50 Mikroliter Volumen infiziert worden sind, um die Zahl der infizierten Zellen für die mikroskopische Analyse zu erhöhen.
Der Einfluss von nicht-funktionalem gp50 auf die Virulenz von PRV für Mäuse.
In vitro ist phenotypisch komplementiertes gp50^– PRV nach einer primären Infektion fähig, sich direkt über eine Zelle-zu-Zelle Übertragung zu verbreiten. Um zu analysieren, wie in vitro Phenotypen sich in vivo Charakteristika übersetzen, sind Mäuse intranasal mit 10⁴ PFU von entweder gX^– PRV (welches sich wie der normale Wildtypus verhält) oder phenotypisch komplementierten gp50 Mutanten von beiden Stämmen NIA-3 und Ka infiziert worden. Es ist festgestellt worden, dass nach der phenotypischen Komplementierung die gp50^– Mutanten fähig gewesen sind, Symptome hervorzurufen und bei allen Tieren den Tod herbeizuführen, ähnlich zu den isogenischen gX^– Mutanten. Zusätzlich war das Einsetzen der Symptome und die mittlere Zeitdauer bis zum Tod zwischen dem Wildtypus und der gp50^– Mutanten-Virusinfektion nicht signifikant unterschiedlich. Nicht komplementierte gp50^– Virionen, führten, wie erwartet, nicht zu Krankheitsanzeichen, was ihre Unfähigkeit reflektiert, Targetzellen zu infizieren. Diese Ergebnisse zeigen an, dass nach einer primären Infektion gp50 für die Virulenz der PRV nach der intranasalen Infektion von Mäusen nicht notwendig ist.
Die Erfassung von freien infektiösen Viren nach der Infektion von Mäusen mit phenotypisch komplementierter gp50^– PRV.
gp50 ist erforderlich für das Eindringen von Virionen in Targetzellen in vitro. Daher werden freigesetzte Virionen nach einer primären Infektion von nicht komplementierten Zellen durch phenotypisch komplementierte Virus-Mutanten nicht infektiös. Um zu analysieren, ob ähnliche Ergebnisse in vivo beobachtet werden könnten, sind Gehirnhomogenate von todkranken gX^– oder gp50^– PRV-infizierten Mäusen, die zur selben Zeit ohne Krankheitszeichen getötet worden waren, eingesetzt worden, um den Virus auf gII-exprimierenden MT-3 Zellen (Tabelle 1) zu re-isolieren. Auf die sen Zellen sollten alle putativen infektiösen Virionen, entweder gX^– oder phenotypisch komplementiertes oder gerettetes gp50^– PRV, fähig sein, Plaques zu bilden. Wohingegen sich die Re-Isolation von Viren aller gX^– PRV-infizierten Tiere als erfolgreich zeigte, sind keine freien infektiösen Viren nach der Infektion durch phenotypisch komplementierte gp50^– PRV festgestellt worden, trotz der Tatsache, dass die Tiere todkrank waren und erhebliche Symptome zeigten. Der infektiöse Virus ist also aus den gII^– PRV-infizierten Tieren nicht gewonnen worden.
C) Impfexperimente bei Schweinen
Sechs Wochen alte Junge aus dem gleichen Wurf (drei Tiere je Gruppe) sind intranasal mit 10⁶ PFU von gX^–-βgal (gX^–) oder gp50^– βgal (gp50'), PRV-Mutanten, die vom NIA-3 Stamm abgeleitet worden sind, infiziert worden. Sie sind auf Krankheitsanzeichen wie Atemwegs- oder neurologische Symptome und Fieber beobachtet worden. Nasale Abstriche sind täglich genommen und auf MT-3 Zellen titriert worden, um das Verbreiten von jeglichen infektiösen Viren zu erfassen. Überlebende dieses Experimentes (ein gX^– PRV infiziertes Tier starb) wurden 27 Tage p.i. Blut abgenommen und es sind sowohl neutralisierende Antikörpertiter als es ist auch die Gegenwart von Anti-gp50 Antikörpern festgestellt worden. Komplement-abhängige und -unabhängige Neutralisationstiter sind mit einem Plaque-Reduktions-Assay festgestellt worden. Die Titer zeigten Serumverdünnungen mit einer 50% Plaquereduktion. Acht Wochen p.i., sind die Tiere intranasal einer Challengeinfektion mit 3·10^–8 PFU des Wildtyps Stamms NIA-3 unterzogen worden. Wieder wurden sie auf Krankheitszeichen untersucht, die Körpertemperatur ist aufgezeichnet worden, und nasale Abstriche sind auf Virus-Verbreitung untersucht werden.
Die Feststellung von gp50^– PRV Virulenz für Schweine.
Um das Verhalten der Virus-Mutanten in PRV's natürlichen Hosts zu erforschen, sind drei 6 Wochen alte Schweine intranasal mit 10⁺⁶ PFU von gX^– oder gp50^– Mutanten, abgeleitet von dem hoch virulenten NIA-3, Stamm infiziert werden. Diese sind auf Zeichen von AD beobachtet worden, und das Verbreiten von Viren ist durch das Analysieren von nasalen Abstrichen überwacht worden. Wie aus Tabelle 2 (Experiment A) zu erkennen ist, zeigten mit der gX^– Mutante infizierte Schweine schwere Atem- und neurologische Symptome. Ein krankes Tier ist getötet wurden. Alle Tiere zeigten verlängertes Fieber und Virenexkretion in nasalen Abstrichen. Im Gegensatz dazu traten nach Infektion mit phenotypisch komplementärem gp50^– PRV nur schwache, hauptsächlich Atemwegssymptome auf. Das einzige weitere Krankheitszeichen war eine geringe Schwäche in den Hinterbeinen. Die Dauer des Fiebers ist ziemlich reduziert worden, und es konnten keine infektiösen Viren aus nasalen Abstrichen abgenommen werden.
Es kann daraus geschlossen werden, dass die Löschung von gp50 aus dem Stamm NIA-3 seine Virulenz für Schweine vermindert, obwohl der Virus klar noch fähig war, respiratorirsche Gefahren und Fieber auszulösen. Seren sind von überlebenden Tieren am Tag 27 p.i. genommen worden und zeigten die Gegenwart von neutralisierenden Antikörpern in der gX^– und gp50^– PRV-infizierten Gruppe (Tabelle 2).
Es ist höchst überraschend, dass die Löschung von gp50 fast oder gar nicht die Virulenz von PRV in Mäusen (siehe Beispiel 1B) beeinflusst, wohingegen die Virulenz in Schweinen, die die natürlichen Hosts sind, stark abgenommen hat.
Die Bestimmung von Schutz gegen den Virenangriff nach der Infektion durch gp50^– PRV
Um zu analysieren, ob Tiere nach vorgängiger Infektion durch gX^– oder phenotypisch komplementärem gp50^– PRV vor dem Angriff von einem virulenten Virus geschützt sind, sind alle Schweine intranasal 8 Wochen nach der ersten Infektion mit 3 × 10⁸ PFU von dem hoch virulenten NIA-3 Stamm infiziert worden. Ergebnisse sind in der Tabelle 2 (Experiment B) dargestellt. Die gX^– PRV Überlebenden zeigten die geringste Reaktion auf die Challenge Infektion, mit nur geringem Fieber und keinem Verbreiten von Challenge-Viren. Die gp50^– PRV-infizierten Schweine zeigten lediglich geringe Symptome von AD aber nur begrenztes Fieber, obwohl einige Virusverbreitung aufgetreten ist. In der Summe zeigen die Ergebnisse, das die Infektion von Schweinen mit einer phenotypisch komplementären gp50^– PRV Mutante zu einer Induktion einer signifikanten Schutzimmunantwort geführt.
BEISPIEL 2: Herstellung einer quadruplen PRV Mutante
Um die Ausbildung von Revertanten vollständig zu unterbinden, wurde eine quadruple Mutante hergestellt. Diese Mutante hat eine Löschung in der u.s.-Region (unique-short-Region), die die gX, gp50, gp63, und die gI Gene vom PRV umfassen. Bei dieser Mutante gab es keine PRV Sequenzen, die mit der gp50 exprimierenden Zelllinie auf irgendjeder Seite des gp50 Gens überlappen. Daher ist die homologe Rekombination zwischen dem gp50 der Zelllinie und der mutierten PRV unmöglich geworden (Cai et al., J. Virol. 62, 2596–2604 [1988]; Peeters et al., J. Virol. 66, 894–905 [1992]; Peeters et al., J. Virol. 66, 3388–3892 [1992]. Von dem Punkt eines Impfstoffs aus gesehen, ist das gI Gen zu löschen, weil dieses Gen eingesetzt wird, um zwischen den Impfstoff-Viren und den Wildtyp-Viren in den Ausrottungsprogrammen zu unterscheiden. Weiterhin sollten alle diese Löschungen der quadruplen Mutante nur sehr geringe pathogenisehe Eigenschaften verschaffen und sie sollte sicher einzusetzen sein.
Das Plasmid TT-264 umfasst eine modifizierte pBR322, die den mehrfachen Klonierungsort des Plasmids pUC18 trägt, ein ungefähr 300 bp SalI/BamhI-Fragment, umfassend den Promoter für das Glykoprotein gX-Gen. In den BamHI-Ort des gX-Gens ist das β-Galactosidase (LacZ) Gen von E. Coli eingefügt worden, was in der Inaktivierung dieses BamHI-Orts resultiert (Mettenleiter und Rauh, J. Virol. Methods 30, 55–66, 1990). An dem 3'-Ort des LacZ ist ein 1.4 kb SphI/BamHI-Fragment, umfassend das 3'-Ende des PRV gI-Gens, das 11K-Gens, und das 5'-Ende des 28K Gens, in den verbliebenen BamHI-Ort eingesetzt worden. Dies wurde zuerst durch Anbinden des anhaftenden BamHI-Endes des 1.4 kb Fragmentes an den BamHI-Ort an dem 3'-Ende des LacZ Gens durchgeführt. Dann wurde nach dem Erzeugen der stumpfen Enden des verbleibenden BamHI/SphI-Endes mit Klenow/T4-Polymerase der Vektor stumpfending verbunden, was den BamHI-Ort an diesem Ort wiederherstellt. Die korrekte Orientierung ist durch Restriktionsabbau verifiziert worden. Das sich ergebende Plasmid enthält nun von dem 5'-Ort zu dem 3'-Ort den PRV gX Promoter, das β-Galactosidase Gen, den 3'-Ort des PRV gI-Gens, das PRV11K-Gen und das 5'-Ende des PRV 28K-Gens. Dieses Plasmid ist dann cotransfektiert worden mit der DNS von dem Kaplan Stamm des PRV durch das Kalziumphosphat-Ausfall-Verfahren (Graham et al. 1973. Virology 52, 456–467) in gp50, die MDBK Zellen erzeugen. Die Virusnachkommen sind dann auf das Auftreten eines blauen Plaque Phenotypes gescreent worden. Blaue Plaques sind herausgenommen, gereinigt und durch Southern Blots analysiert worden. Das Auftreten der korrekten Löschung, beginnend an dem gX Promoter und endend an dem 5'-Ort des gI-Gens, löschend das PRV, das gX, gp50, gp63 und das 5'-Teil des gI Gen, sind bestätigt worden (1). Die Virusnachkommenschaft, die auf der gp50 exprimierenden Zelllinie kultiviert worden sind, sind für weitere Impfexperimente eingesetzt worden.
BEISPIEL 3: Herstellung einer gp50 exprimierenden Zelllinie
Um die quadruple PRV Mutant phenotypisch für das gp50 Protein zu komplementieren ist eine gp50 exprimierende Zelllinie hergestellt worden.
Die Herstellung einer gp50 exprimierenden Zelllinie ist durchgeführt worden, wie von Rauh et al. 1991, J. Virology 65, 5348–5356 beschrieben. Ein Plasmid, dass ein PRV genomisches BamHI-SalI DNS Fragment enthält, ist mit BstXI gespalten worden, was das gp50 Gen von seinen putativen 5'-Terminal Promoter Elementen (Petrovskis, 1986, J. Virol. 59: 216–223) trennte. Nach dem stumpfen Enden mit T4 Polymerase, sind BamHI Verbinder (BRL) eingefügt worden und das Plasmid ist religiert worden. Die Spaltung mit BamHI und SalI gab ein 522-bp Fragment frei, welches den 5''-Teil des gp50 Gens enthalten hat, was in pBR322 geklont worden war. Das vollständige gp50 Gen ist durch Einsetzen eines 3,346-bp SalI-SphI Fragment an den SalI Ort zusammengesetzt worden. Nachfolgendes Spalten mit BamHI und DraI schnitten ein 2,433-bp Fragment heraus, das die vollständige Expressionseinheit enthielt, welches die Gene, die gp50 und gp63 kodieren, und das 3'-Terminal mRNS verarbeitende Signale umfasst. Dieses Fragment ist dann hinter dem Maus-Metallothionein Promoter (Brinster et al. 1981. Zelle 27, 223–231) geklont worden. Um stabiles transformiertes gp50 herzustellen, das Zelllinien exprimiert, ist dieses Plasmid mit dem pSV2-Neoplasmid (Southern et al. 1982. J. Mol. Appl. Genet. 1, 327–341) durch das Kalziumphosphatausfallverfahren (Graham et al. 1973. Virology 52, 456–467) in MDBK Zellen kotransfektiert worden. Die Auswahl für G418 resistente Kolonien ist durchgeführt worden und die ausgewählten Zellen sind für ihre Expression von gp50 mit einem gp50 spezifischen MAb ausgewählt worden.
BEISPIEL 4: Impfung von Schweinen mit der quadruplen PRV Mutante
In einem Experiment mit der quadruplen PRV Mutante, sind eine Gruppe von sieben 4 bis 5 Wochen alte Schweinen mit 10⁵ TCID₅₀/Tier intramuskulär geimpft worden. Drei Wochen nach der Impfung sind die 7 geimpften und 5 unbehandelten Schweine intranasal mit 10⁷ TCID₅₀ des PRV Stammes 75 V19 einem Challenge unterzogen worden. Die Tiere sind täglich auf klinische Anzeichen, Temperatur, Gewichtszunahme, und Virusexkretion überwacht worden. Nach der Impfung mit der quadruplen Mutante sind keine klinischen Zeichen oder Fieber festgestellt worden.
Nach der Challenge sind 2 der 5 Tiere aus der Kontrollgruppe gestorben, Fieber ist für 7.7 +/– 0.5 Tage, Wachstumsverzögerung ist für mehr als 11 Tage und Virusexkretion für 7 +/– 1.4 Tage beobachtet worden. Von den mit der quadruplen PRV Mutante geimpften Schweine haben alle Schweine überlebt, Fieber ist für 4.7 +/– 1.2 Tage, Wachstumsverzögerung ist für 5.5 +/– 1 Tage und Virusexkretion für 5.2 +/– 0.5 Tage beobachtet worden. Ein klarer Priming-Effekt ist im Vergleich mit der Kontrollgruppe gesehen worden, das Auftreten von neutralisierenden Antikörpern in den geimpften Schweine ist schneller aufgetreten und die Titer waren signifikant höher als in der Kontrollgruppe. Eine Kurve der mittleren Temperaturen, Virusexkretion in nasalen Abstrichen, und der relativen Grösse wird in 2, 3 beziehungsweise 4 gezeigt.
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass mit einer gX^–, gp50^–, gp63^–, und gI^– PRV Mutanten geimpfte Schweine teilweise gegen klinische Zeichen von Aujeszky's Krankheit geschützt sind.
BEISPIEL 5: zellengebundene quadruple Mutante
Um Zellen zu erhalten, die pheno- und genotypisch gp50 negative PRV exprimieren, sind 5 Mikrogramm von quadrupler DNS in Vero Zellen mit dem CaCl₂ Verfahren transfektiert worden. Um die quadruplen exprimierenden Veto Zellen zu erhalten und zu propagieren, wurden die Zellen erhalten, bis sie 70% CPE zeigten. Zellen sind dann trypsinisiert worden, bei einem Verhältnis von 1 : 5 mit uninfizierten Vero Zellen gemischt worden, und mit einer Dichte von 0.2 × 10⁶ Zellen/cm² entsamt worden. Für die Titration, sind Zellen im Medium verdünnt, mit uninfizierten Zellen verdünnt und dann plattiert worden.
BEISPIEL 6: Impfung mit der zellengebundenen quadruplen Mutante
In einem Experiment mit der zellengebundenen quadruplen PRV Mutante, sind zwei Gruppen von sieben 4 bis 5 Wochen alte Schweine intramuskulär mit 10^5.5 Pfu/Tier und 10⁴ Pfu/Tier geimpft worden. Drei Wochen nach der Impfung sind die geimpften und die fünf unbehandelten Schweine intranasal mit 10⁷ TCID50 des PRV Stammes 75 V19 einem Challenge unterworfen worden. Die Tiere sind täglich für klinische Zeichen, Temperatur und Gewichtszunahme, sowie Virusexkretion überwacht worden.
Nach der Impfung mit der zellengebundenen quadruplen Mutante sind in keiner Gruppe klinischen Zeichen oder Fieber beobachtet worden.
Bei diesem Experiment sind dieselben Kontrollen eingesetzt worden wie zum Testen der phenotypisch gp50-positiven quadruplen Mutante. Nach der Durchführung der Challenge starben zwei von fünf Tieren der Kontrollgruppe gestorben, Fieber ist für 7.7 +/– 0.5 Tagen, Wachstumsverzögerung für mehr als 11 Tage und Virusexkretion für 7 +/– 1.4 Tage beobachtet worden. Bei den mit der zellengebundenen quadruplen PRV Mutante infizierten Schweine haben alle Schweine überlebt. Bei den Schweinen, die mit 10^5.5 Pfu geimpft worden sind, ist Fieber für 6.1 +/– 1.1 Tage, Wachstums verzögerung für 8 +/– 1.5 Tage und Virusexkretion für 5.4 +/– 0.7 Tage beobachtet worden. Bei dem Challenge hatte keines der geimpften Schweine neutralisierende Antikörper für PRV. Bei den Schweinen, die mit 10⁴ Pfu geimpft worden sind, ist Fieber für 6.3 +/– 2.6 Tage, Wachstumsverzögerung für 9.2 +/– 1.2 Tage und Virusexkretion für 6.9 +/– 0.8 Tage beobachtet worden. Bei dem Challenge hatte keines der geimpften Schweine neutralisierende Antikörper für PRV. Eine Kurve der mittleren Temperaturen, Virusexkretion in nasalen Abstrichen, neutralisierenden Antikörpern und relatives Wachstum wird in 2, 3 beziehungsweise 4 dargestellt.
Nach der Impfung mit der zellengebundenen quadruplen Mutante sind beide Gruppen von Tieren teilweise geschützt gewesen. Im Vergleich mit der Kontrollgruppe sind Fieber, Virusexkretion und Wachstumsverzögerung für eine kürzere Zeitdauer beobachtet worden. Die Wirkungen auf die Wachstumsverzögerung werden am besten in 4 gezeigt. Es war nicht nur die Zeitdauer der Wachstumsverzögerung signifikant kürzer im Vergleich mit der Kontrollgruppe, sondern auch der absolute Gewichtsverlust war signifikant geringer als bei den unbehandelten Tieren. Bei diesem Experiment wird nicht nur gezeigt, dass die quadruple Mutante einen schützenden Effekt auf einen Challenge mit einer Wildtyp PRV hat, sondern es wird auch für das erste Mal gezeigt, dass der Schutz von Schweinen durch Impfung mit vollständigen Zellen, die einen zellengebundenen Virus aufgenommen haben, erreicht werden kann.
Legende der Figuren
1 Genomische Karte der U.S. Region des PRV Elternstammes, der quadruplen Mutante, und des PRV Genfragmentes, das stabil in die MDBK Zelllinie transformiert worden ist.
2 Temperaturen der Schweine, die mit der quadruplen Mutante geimpft worden sind, und der ungeimpften Schweine von 26 Tagen vor bis 11 Tage nach der Challenge. Die Impfung ist am Tag –12 durchgeführt worden und der Challenge am Tag 0.
3 Virusexkretion der Schweine, die mit der quadruplen Mutante geimpft worden sind, und die ungeimpften Schweine von einem Tag nach der Challenge bis zu 10 Tage nach der Challenge.
4 Relative Grösse der Schweine, die mit der quadruplen Mutant geimpft worden sind, und die ungeimpften Schweine von 8 Tagen vor bis 10 Tage nach dem Challenge.
TABELLE 1 Virusisolation von gX^– oder gp50^– PRV-infizierten Mäusen.

Claims

Herpesvirus-Impfstoff mit lebenden Herpesviren, die nicht fähig sind, ein funktionales gD homologes Protein in einem infizierten Tier als Ergebnis einer Mutation in dem Gen, das das gD homologe Protein kodiert, oder in einem Bereich, der die Expression des gD homologen Proteins steuert, zu erzeugen, wobei diese Herpesviren mit dem gD homologen Protein komplementiert sind, und mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünner, dadurch gekennzeichnet, dass (i) die Mutation eine Löschung des gesamtem gD homologen Gens umfasst, oder (ii) der Impfstoff zusätzlich ein Adjuvant umfasst, das aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus Aluminiumhydroxid, -phosphat oder -oxid, Ölemulsionen, Saponinen oder Vitamin-E Solubilisat besteht.
Herpesvirus-Impfstoff mit Zellen, die von einer nicht komplementären Zelllinie abgeleitet sind, die lebende Herpesviren umfasst, die nicht fähig sind, ein funktionales gD homologes Protein in einem infizierten Tier als Ergebnis einer Mutation in dem Gen, das das gD homologe Protein kodiert, oder in einem Bereich, der die Expression des gD homologen Proteins steuert, zu erzeugen, und mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünner.
Herpesvirus-Impfstoff nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Herpesviren nicht fähig sind, ein funktionales gD homologes Protein als Ergebnis einer Löschung und/oder Einfügung in dem Gen zu erzeugen, das das gD homologe Protein kodiert.
Herpesvirus-Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Herpesviren gl^– und/oder tk^– sind.
Herpesvirus-Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Genom der Herpesviren eine heterologe DNS-Sequenz aufweist, die ein Antigen eines Pathogens kodiert.
Herpesvirus-Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Herpesviren Pseudorabies-Viren (PRV) sind.
Verfahren zur Herstellung eines Herpesvirus-Impfstoffs mit lebenden Herpesviren, die nicht fähig sind, ein funktionales gD homologes Protein in einem infizierten Tier als Ergebnis einer Mutation in dem Gen, das das gD homologe Protein kodiert, oder in einem Bereich, der die Expression des gD homologen Proteins steuert, zu erzeugen, wobei diese Herpesviren mit dem gD homologen Protein komplementiert sind, wobei der Impfstoff weiterhin einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünner umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass der Impfstoffvirus auf einer komplementären Zelllinie gewachsen wird, wodurch das DNS-Fragment in den Zellen, das das gD homologe Gen liefert, keine Sequenzen sowohl an dem linken als auch an dem rechten Flankenbereich des Gens enthält, die zu viralen DNS-Sequenzen homolog sind.