DE60025701T2

DE60025701T2 - Vektoren und virale impfstoffe basierend auf rekombinantem schweine-adenovirus

Info

Publication number: DE60025701T2
Application number: DE60025701T
Authority: DE
Inventors: Marc Eloit; Georges Bernard KLONJKOWSKI
Original assignee: Ecole Nationale Veterinaire De Maisons Alfort; ENVT TOULOUSE; Merial SAS; Ecole Nationale Veterinaire de Maisons-Alfort ENVA
Current assignee: Ecole Nationale Veterinaire De Maisons Alfort; ENVT TOULOUSE; Ecole Nationale Veterinaire de Maisons-Alfort ENVA; Boehringer Ingelheim Animal Health France SAS
Priority date: 1999-02-11
Filing date: 2000-02-08
Publication date: 2006-10-19
Anticipated expiration: 2020-02-09
Also published as: DK1151121T3; CN1869243B; FR2789695A1; FR2789695B1; AU2553700A; KR100818673B1; US7109025B1; BR0008205A; EP1151121B1; ATE316580T1; JP2002537766A; DE60025701D1; CA2362454A1; CN1343257A; ES2258970T3; PL205524B1; CN1262664C; WO2000047756A1; PL350182A1; AU781195B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft durch Insertion von heterologen Nucleotidsequenzen rekombinante Schweine-Adenoviren der Serotypen 3 und 5, wobei sich diese Adenoviren in vivo autonom replizieren können und diese heterologen Sequenzen exprimieren können. Die Erfindung betrifft auch erhaltene Schweineimpfstoffe, Verfahren zur Immunisierung von Schweinen, die sie verwenden, deletierte und replikative Adenovirusvektoren, Verfahren zum Gewinnen dieser Adenoviren, Impfstoffe und Vektoren.
Die in der Beschreibung zitierten Dokumente sowie die in diesen Dokumenten zitierten Dokumente sind hier durch Bezugnahme einbezogen.
Die Adenoviren sind Viren mit einem linearen doppelsträngigen DNA-Molekül, mit inversen terminalen Wiederholungssequenzen an jedem Ende. Die Adenoviren gehören zur Familie der Adenoviridae, die für Erkrankungen verantwortlich sind, die zahlreiche Spezies, wie die Spezies der Affen, Rinder, Schafe, Schweine, Pferde, Mäuse, Hunde und Vögel betreffen. Die Adenovirus-Infektionen können nach den Spezies und nach den Adenovirustypen anhand von Zeichen der Encephalitis, Lungenentzündung, Nierenläsionen, Diarrhöe und Hepatitis charakterisiert werden.
Das Genom der Adenoviren variiert von einer Spezies zur anderen [(T. Adrian et al., Arch. Virol. 1986, 91, 277–290), (J. Hamelin et al., J. Clin. Microbiol. 1988, 26, 31–33), (R. Assaf et al., Can. J. Comp. Med. 1983, 47, 460–463), (T. Kurokawa et al., J. Virol. 1978, 28, 212–218), (S.-L. Hu et al., J. Virol. 1984, 51, 880–883), (L. Zsak et al., Intervirology 1984, 22, 110–114)]. Die tierischen Adenoviren haben im Gegensatz zu den menschlichen Adenoviren ein sehr begrenztes Wirtsspektrum, und sie infizieren häufig nur die Tiere, die zu ihrer Ursprungsspezies gehören.
Das erste Schweine-Adenovirus (auf Englisch „Porcine AdenoVirus" oder PAV) wurde 1964 isoliert (D. Haig et al., J. Comp. Pathol. 1964, 74, 81–84). Seitdem wurden 5 Schweine-Adenovirus-Serotypen identifiziert und beschrieben (Hirahara et al., J. Vet. Sci. 1990, 52, 407–409). Die Adenoviren der Serotypen 1 (Hirahara et al., J. Vet. Sci. 1990, 52, 407–409). Die Adenoviren der Serotypen 1 und 2 sind mit Durchfallerkrankungen assoziiert; die Adenoviren des Serotyps 4 sind mit Symptomen der Pneumonie und Enzephalitis assoziiert. Die Schweine-Adenoviren wurden aufgrund des Fehlens der Kreuzneutralisierung mit spezifischen Antiseren der PAV der Serotypen 1 bis 4 in einen fünften Serotyp eingeordnet. Das Genom von PAV-5 wurde analysiert, und eine Restriktionskarte wurde erstellt (Tuboly et al., Virus Res. 1995, 37, 49–54). Diese Analyse zeigte das Fehlen der Ähnlichkeit zwischen den Restriktionskarten der PAV-5 und denjenigen der PAV der anderen Serotypen: PAV-1 und PAV-2 (Reddy et al., Arch. Virol. 1995, 140, 195–200), PAV-3 (Reddy et al., Intervirology 1993, 36, 161–168) und PAV-4 (Kleiboeker et al., Arch. Virol. 1993, 133, 357–368). Zwischen den Serotypen 3 und 5 gibt es natürlich Stämme, die für das Schwein nicht pathogen sind.
Die PAV besitzen ein Genom mit einer Größe von etwa 32 bis 34 kbp. Das Genom von PAV-1 besitzt eine Größe von etwa 33,5 kbp. Das von PAV-2 besitzt eine Größe von etwa 33,3 kbp. Die Gesamtsequenz des PAV-3-Virus wurde kürzlich erstellt und in der Datenbank GenBank unter der Nummer AF083132 hinterlegt (P. S. Reddy et al., Virol. 1998, 251, 414–426); ihre Größe beträgt 34094 Basenpaare (bp). Das Genom von PAV-4 besitzt eine Größe von etwa 32 kbp und das von PAV-5 besitzt eine Größe von etwa 33,2 kbp. Das Gesamtgenom von PAV-5, und insbesondere die E3-Region, wurde nicht sequenziert und veröffentlicht.
Die Hauptanwendung, die für die Adenoviren in Betracht gezogen wird, beinhaltet das Gebiet der Gentherapie beim Menschen, und es wurde eine sehr große Anzahl an Konstrukten und Systemen vorgeschlagen. Die Adenoviren wurden auch als rekombinante Vektoren in Impfstoffzusammensetzungen zum Schutz der Menschen und Tiere gegen zahlreiche pathogene Viren vorgeschlagen.
Bisher wurden zwei Strategien zur Konstruktion von rekombinanten Adenovirusvektoren entwickelt (M. Eloit & M. Adam, J. Gen. Virol. 1995, 76, 1583–1589).
Die erste Strategie beinhaltet die Insertion von Expressionskassetten in unentbehrliche Replikationsbereiche des Adenovirus, wobei die Notwendigkeit bestand, gleichzeitig Transkomplementationssysteme zu entwickeln, um die Replikation des Virus sicherstellen zu können. Für die Schweine-Adenoviren wurde die E1-Region als Insertionsort vorgeschlagen (P. S. Reddy et al., Virus Res. 1998, 58, 97–106). Die so konstruierten rekombinanten Vektoren werden als „nicht replikativ" bezeichnet, da sie sich im Wirt, in den sie verabreicht wurden, nicht replizieren können.
Als Variante dieser ersten Strategie kann man ein nicht replikatives Virus im Empfängertier verwenden. Die Expressionskassette PRV gD wurde insbesondere in die E1A-Stelle des menschlichen Adenovirus von Serotyp 5, das im Schwein nicht replikativ ist, eingebaut (M. Monteil et al., J. Gen. Virol. 1997, 78, 3303–3310; A. Ambriovic et al., Virol. 1997, 238, 327–335).
Die zweite Strategie beinhaltet die Insertion von Expressionskassetten im Bereich von viralen Genomregionen, die für die Replikation des Adenovirus nicht essentiell sind. Die Schwierigkeit, bei den Adenoviren nicht essentielle Regionen zu bestimmen und das Vorhandensein eines rigiden Kapsids erschweren die Umsetzung dieser zweiten Strategie.
Eines der essentiellen Merkmale von Adenoviren ist nämlich, dass sie ein rigides Kapsid besitzen, das die Größe des DNA-Moleküls, das dort in das Kapsid verpackt wird, streng begrenzt. Im Allgemeinen schätzt man, dass es möglich ist, ein DNA-Molekül in das Kapsid zu verpacken, das 105 bis 114% der Genomgröße entspricht, was nach der Genomgröße Insertionen zwischen etwa 1,7 bis 3,9 kbp entspricht. Im Falle von Übergrößen können Deletionen und/oder ungewollte Rearrangements im rekombinierten Genom entstehen.
Die E3-Region ist weder in der Größe noch in der genetischen Organisation eines Adenovirus von einer bestimmten Spezies zu einem Adenovirus einer anderen Spezies noch zwischen den Schweine-Adenoviren der verschiedenen Serotypen konserviert (S. Kleiboeker, Virus Res. 1994, 31, 17–25).
Die E3-Region des PAV-3-Virus besitzt eine Größe von 1179 Basenpaaren. Es handelt sich um eine komplexe Region, die mindestens 3 offene Leserahmen (ORF) codiert. Diese offenen Leserahmen überlappen einander und der erste ORF überlappt- auch zum Teil das Gen, das das Protein pVIII, das ein essentielles Protein ist, codiert (P. S. Reddy et al., Virus Res. 1995, 36, 97–106).
Das Vorliegen dieser überlappenden ORF in der E3-Region stellt eine wesentliche Schwierigkeit dar, um dort die Insertionsstellen und/oder die Grenzen der Deletion so zu bestimmen, dass die rekombinierten Adenoviren bei den Schweinen replikativ bleiben.
Die vom zweiten ORF codierten Aminosäuresequenzen der E3-Region zeigen weder eine Homologie mit den Adenoviren PAV-3 und HAV-2 (menschlich, vom Serotyp 2), noch mit einem Protein eines derzeit bekannten Adenovirus (P. S. Reddy et al., Virus Res. 1995, 36, 97–106). Die nach den Nucleotidsequenzen vorhergesagten Aminosäuresequenzen des ersten ORF der E3-Region bei PAV-3 besitzen nur 33,3% Identität mit denjenigen des Hunde-Adenovirus vom Serotyp 2 (CAV-2). Es gibt nicht nur keine Homologie bei den Proteinen, die von den E3-Regionen der verschiedenen Adenoviren codiert werden, sondern auch diejenigen, die von den ORF der E3-Region codiert werden, zeigen keine Homologie unter den Adenoviren PAV-3 und PAV-4 (S. B. Kleiboeker, Virus Res. 1994, 31, 17–25).
Die E3-Region hat eine Größe von 1162 bp bei PAV-1 (mit 5 ORF); sie hat eine Größe von 1222 bp bei PAV-2 (mit 5 ORF) (P. S. Reddy et al., Virus Res. 1996, 43, 99–109), eine Größe von 1879 bp bei PAV-4 (mit 6 ORF). Nur der vierte ORF der E3-Region des PAV-4-Virus (der einem Protein mit 13,2 kDa entspricht) zeigt eine Homologie mit einem anderen bekannten ORF der E3-Region, die das 14,7 kDa große Protein des menschlichen Adenovirus von Typ 5 (auf Englisch Human AdenoVirus 5 oder HAV-5) codiert. Die E3-Region von PAV-4 zeigt keine Sequenzhomologie mit den E3-Regionen der anderen Schweine-Adenoviren, und insbesondere mit denjenigen von PAV-3 und PAV-5.
Neben der Schwierigkeit der Definition ihrer Grenzen zur Konservierung des replikativen Charakters in vivo sind Deletionen in der E3-Region auch nicht ohne Risiko. Die Deletionen in der E3-Region können tatsächlich Konsequenzen für die Pathogenität der rekombinanten Adenoviren haben. So wurde beobachtet, dass eine Deletion in der E3-Region des HAV-5-Virus die Lungen-Pathogenität dieses Virus im Versuchsinfektionsmodell der Baumwollratte erhöht (Ginsberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 86, 3823–3827).
Dies zeigt, dass die Konsequenzen der Deletionen in der E3-Region eines Adenovirus von Fall zu Fall und nicht durch einfache Übertragung der bei einem bestimmten Adenovirus gemachten Beobachtungen gegenüber einem anderen in Betracht gezogen werden müssen. Die genetische Organisation der E3-Region von PAV-3 ist einzigartig, ebenso diejenige der E3-Region von PAV-5.
Die genaue Lokalisierung einer Isertionsstelle in der E3-Region wird noch komplizierter aufgrund der Tatsache, dass Spleißregionen und Polyadenylierungskomplexe, charakteristische Bereiche der Adenoviren, vorhanden sind (Imperiale et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1995, 199, 139–171). Die Spleißregionen, die in der E3-Region lokalisiert sind, sind für die Reifung zahlreicher essentieller mRNAs wichtig, die von den Sequenzen, die außerhalb der E3-Region lokalisiert sind, codiert werden. Die E3-Region befindet sich selbst in einem Teil des Virusgenoms mit hoher Transkriptionsaktivität (P. Sharp, 1984, in The Adenovirus, Herausg. H. S. Ginsberg; Plenun Press; New York und London, 173–204), die Insertion einer heterologen Nucleotidsequenz in die E3-Region kann negative Auswirkungen auf die biologische Aktivität des rekombinanten Virus haben. Außerdem befindet sich die E3-Region stromabwärts der späten Hauptpromotor (major late promotor, MLP)-Region oder man hat Störungen zwischen der Transkription des Inserts und derjenigen gezeigt, die durch den MLP-Promotor initiiert wird, (Xu et al., J. Gen. Virol. 1995, 76, 1971–1980).
Die mit den Adenoviren erhaltenen Ergebnisse, die von anderen Spezies (Mensch, Rind, Schaf. ...) stammen, sind nicht auf die Schweine-Adenoviren übertragbar. Daher wurde bisher kein replikativer rekombinanter Vektor ausgehend von einem Schweine-Adenovirus hergestellt.
Der Anmelder hat sich zum Ziel gesetzt, eine Insertion von heterologen Genen im Genom der Viren PAV-3 und PAV-5 zugänglich zu machen, ohne dass ihre Fähigkeit zur Replikation in vivo dadurch wesentlich verändert wird.
Ein weiteres erfindungsgemäßes Ziel besteht darin, Insertionsregionen vorzuschlagen, die zur Deletion geeignet sind, ohne dass diese Fähigkeit zur Replikation erneut in Frage gestellt wird, so dass die Fähigkeit der Insertion in das Virus zunimmt.
Ein noch weiteres erfindungsgemäßes Ziel besteht darin, rekombinante PAV-3-Viren vorzuschlagen, die eine Fähigkeit zur Replikation in vivo bewahren und ihre Verwendung in der Eigenschaft als rekombinante Lebendimpfstoffe erlauben, einschließlich Impfstoffe, die über den Schleimhautweg und/oder in Gegenwart von Antikörpern mütterlichen Ursprungs verabreicht werden.
Dem Anmelder ist es gelungen, die E3-Region von PAV-3 und PAV-5 zu modifizieren, wobei die Fähigkeit zur Replikation in vivo insgesamt bewahrt wurde. Er konnte auch die Expression eines in dieser Region eingebauten Gens in vivo zeigen. Er hat daher die Verwendung von PAV-3 und PAV-5 als replikative Expressionsvektoren zugänglich gemacht.
Die vorliegende Erfindung hat daher ein Schweine-Adenovirus vom Serotyp 3 zum Ziel, das mindestens eine heterologe Nucleinsäure enthält, die unter Bedingungen, die den erhaltenen rekombinanten Adenoviren erlauben, sich in vivo in Schweinen zu replizieren und die inserierte Sequenz zu exprimieren, in das PAV-3-Genoms inseriert wurde. Diese modifizierten Viren zeigen wichtige Vorteile bei der Impfung und sie sind insbesondere sogar in Gegenwart von mütterlichen Antikörpern wirksam und können daher wirksam über den Schleimhautweg verwendet werden.
Man baut vorzugsweise eine heterologe Sequenz in einen für das Genom nicht essentiellen Bereich, insbesondere die E3-Region, mit einer Deletion in diesem Insertionsbereich ein. Durch die Deletion eines Bereiches erwartet man eine Total- oder Teildeletion, am meisten bevorzugt eine Totaldeletion des Insertionsbereiches. Anders ausgedrückt, wird die heterologe Sequenz in einen Ort mit dem gesamten oder einem Teil des Insertionsbereiches, vorzugsweise an eine Stelle mit dem gesamten Insertionsbereich inseriert.
Bei PAV-3 ist der bevorzugte Insertionsbereich in E3 ein Bereich, der die gesamten oder einen Teil der Nucleotide von 706 bis 1624 der von P. S. Reddy et al., Virus Res. 1995, 36, 97–106 veröffentlichten Sequenz umfasst, was den Positionen 27 794 bis 28 712 der in der GenBank AN # U10433 veröffentlichten Sequenz entspricht. Anders ausgedrückt, kann dieser Insertionsbereich und dessen eventuelle Deletion die gesamte oder nur einen Teil der Sequenz von 706 bis 1624 umfassen und/oder sich in E3 jenseits der Grenze 706 und/oder der Grenze 1624 erstrecken und gegebenenfalls das gesamte E3 umfassen. Vorzugsweise besteht dieser Bereich aus oder umfasst E3, die Nucleotide von 706 bis 1624, die Nucleotide von 1002 bis 1624 oder noch die gesamte oder einen Teil der Sequenz von 706 bis 1002. Er umfasst insbesondere mindestens die Sequenz von 1002 bis 1624.
Bei PAV-5 wird E3 durch die Sequenz der Nucleotide von 2382 bis 4042 in SEQ ID NO: 5 definiert. Der Insertionsbereich und gegebenenfalls dessen Deletion schließen E3 ein und umfassen alle oder einen Teil der Nucleotide von 2064 bis 4083, beispielsweise alle oder einen Teil der Nucleotide von 2389 bis 3861 von SEQ ID NO: 5 (13). Anders ausgedrückt, kann dieser Insertionsbereich und dessen eventuelle Deletion nur einen Teil der Sequenz von 2389 bis 3861 umfassen und/oder sich in E3 jenseits der Grenze 2389 und/oder der Grenze 3861 erstrecken und gegebenenfalls das gesamte E3 umfassen. Wenn man bis einschließlich Nucleotid 4083 deletiert, wird die Insertion an der Stelle von Nucleotid 4083, eine Spleiß-Empfänger-Stelle, bevorzugt. Vorzugsweise besteht dieser Insertionsbereich im Wesentlichen aus den Nucleotiden 2389 bis 3861.
Die Erfindung umfasst natürlich auch die Insertion in entsprechenden Bereichen anderer Stämme von PAV-3, deren Sequenzen sich von denjenigen der erfindungsgemäßen Referenzstämme unterscheiden.
Die vorliegende Erfindung hat auch ein PAV-3-Virus mit einer größeren Insertionskapazität zum Ziel, das bei den Schweinen in vivo insgesamt replikativ bleibt. Die Aufrecherhaltung der Replikationseigenschaft beim Wirt wurde untersucht, um einen optimalen wirksamen Schutz zu erhalten, insbesondere bei Verwendung einer Impfstoffzusammensetzung über den Schleimhautweg und/oder in Gegenwart von Antikörpern mütterlichen Ursprungs.
Die Erhöhung der Insertionskapazität erfolgt mittels einer Deletion z.B. der ganzen oder eines Teils der E3-Region, wobei sich der Teil von E3, der deletiert wurde, zwischen dem Gen, welches das Protein pVIII codiert, und dem Gen, welches die Faser codiert, befindet. Die vorliegende Erfindung beschreibt insbesondere Deletionen von 622 bp und 919 bp, die in der E3-Region des PAV-3-Virus erfolgen können, wobei der replikative Charakter der rekombinanten Viren insgesamt erhalten bleibt (vgl. Beispiele 6 bis 10). Eine Deletion von 1472 bp in der E3-Region des PAV-5-Virus, die selbst charakteristische Phänotypen des rekombinanten Virus hervorruft (vgl. Beispiele 14 bis 17) wird beschrieben.
Das erfindungsgemäß erhaltene, rekombinante PAV-3-Adenovirus kann vorteilhafterweise als Insertion einer maximalen Größe von etwa 3,0 kbp für das PAV-3-Virus und dessen Expression im Schwein dienen.
Die Erfindung hat daher auch den Vektor PAV-3 zum Ziel, der insbesondere in der E3-Region deletiert ist, wobei er insgesamt replikativ bleibt, und insbesondere in den nachstehend erwähnten Bereichen deletiert ist, d.h. der gesamte oder ein Teil des in Betracht gezogenen Bereiches, vorzugsweise der gesamte Bereich deletiert ist.
Die heterologen Nucleinsäuresequenzen, die inseriert werden können, sind Sequenzen, die Immunogene codieren oder Fragmente z.B. Epitope, immunologisch aktive Immunogene und insbesondere Gene oder Fragmente von Genen (z.B. Epitope), die Immunogene von porzinen Pathogenen codieren.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann man natürlich mehr als eine heterologe Sequenz in dasselbe Virus einbauen. Man kann dort insbesondere heterologe Sequenzen einbauen, die von demselben Virus oder unterschiedlichen Viren stammen.
Nach einer besonderen Modalität ist es möglich, künstliche Sequenzen einzubauen, die mehrere Fragmente oder Epitope umfassen, die von demselben Krankheitserreger oder unterschiedlichen Krankheitserregern stammen, und als „Polyepitop-Sequenzen" bezeichnet werden. In diesem letzteren Fall befindet sich die Polyepitop-Sequenz unter der Abhängigkeit eines einzigen Promotors.
Man kann auch Sequenzen einbauen, die Immunmodulatoren, insbesondere Cytokine, vorzugsweise Cytokine vom Schwein wie den Schweine-„Granulocyten-Makrophagen Kolonie-stimulierenden Faktor" (poGM-CSF), das Schweine-Interleukin (poIL-4), das Schweine-IL-12 oder das Schweine-IL-18 codieren.
Die Expression mehrerer heterologer in den Insertionsort eingebauter Gene kann auch durch die Insertion einer Sequenz ermöglicht werden, die als „IRES" (Intenal Ribosome Entry Site) bezeichnet wird, die insbesondere von einem Picomavirus wie das Virus der vesikulären Schweinekrankheit (swine vesicular disease virus, SVDV; B.-F. Chen et al., J. Virology, 1993. 67, 2142–2148), das Encephalomyocarditis-Virus (EMCV; R. J. Kaufman et al., Nucleic Acids Research, 1991, 19, 4485–4490), das Virus der Maul- und Klauenseuche (FMDV; N. Luz und E. Beck, J. Virology, 1991, 65, 6486–6494) oder noch von einem anderen Ursprung stammt. Der Fachmann kann sich auf 3 zitierte Artikel beziehen. Die Expressionskassette der beiden Gene besäße daher die folgende Minimalstruktur: Promotor (fakultativ) – Gen 1 – IRES – Gen 2 – Polyadenylierungssignal. Der erfindungsgemäße rekombinante Lebendimpfstoff kann daher, eingebaut in den Insertionsort einer Expressionskassette, umfassend aufeinander folgend einen Promotor, zwei oder mehrere Gene, paarweise durch eine IRES getrennt, und ein Polyadenylierungssignal umfassen.
Die porzinen Pathogene sind Viren, Bakterien, Parasiten vor allem ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus dem Virus der Aujeszky'schen Krankheit, (PVR-Virus oder Pseudotollwut), dem Schweinegrippevirus (Schweine-Influenza-Virus, SIV), dem Virus der mysteriösen Schweinekrankheit (PRRS-Virus), dem Parvovirose-Virus (PPV-Virus), dem Virus der klassischen Schweinepest (HCV-Virus oder Schweine-Cholera-Virus), dem porzinen Circovirus, insbesondere Typ 2 (porziner CircoVirus Typ 2), PCV2 oder dem Virus des Kümmersyndroms der Absetzferkel, Actinobacillus pleuropneumoniae, Mycoplasma hyopneumoniae.
Was die Aujeszky'sche-Valenz anbelangt, kann man die Gene gB (Robbins A.K. et al. J. Virol. 1987, 61, 2691–2701 GenBank AN # M17321), gC (Ishikawa K. et al. Vet. Microbiol. 1996, 49, 267–272 GenBank AN # D49435) und/oder gD (Riviere M. et al., J. Virol. 1992, 66, 3424–3434 und Hong W.Z. et al. GenBank AN # AF086702) in ihren nativen oder sekretierten Formen einsetzen.
Was die Schweinegrippe-Valenz anbelangt, werden vorzugsweise die Gene HA (WO-A-98/03658 Beispiele 10 und 12) (native oder sekretierte Formen), NA (Nerome K. et al. J. Gen Virol. 1995, 76, 613–624 GenBank AN # D21194) (native oder sekretierte Formen) und/oder NP (WO-A-98/03658 Beispiele 11 und 13) eingesetzt.
Was die PRRS-Valenz anbelangt, werden vorzugsweise die Gene ORF4, ORF3 (native oder sekretierte Formen), ORF5 (native oder sekretierte Formen), ORF6 und/oder ORF7 von europäischen Stämmen (Meulenberg J. et al., Virology. 1993, 192, 62–72) und amerikanischen Stämmen (Mardassi H. et al. Arch. Virol. 1995, 140, 1405–1418) verwendet.
Was die klassische Schweinepest-Valenz anbelangt, werden vorzugsweise die Gene EO, E1 (native oder sekretierte Formen) und/oder E2 (native oder sekretierte Formen) (Meyers G. et al. Virology, 1989, 171, 18–27) verwendet.
Was die Parvovirose-Valenz anbelangt, wird vorzugsweise das Gen des VP2-Kapsids (Vasudevacharya J. et al. Virology, 1990, 178, 611–616) verwendet.
Was die PCV2-Valenz anbelangt, werden vorzugsweise die Gene ORF1 und/oder ORF2, jedoch vorzugsweise ORF1 und ORF2 (Meehan B, et al. J. Gen. Virol, 1998, 79, 2171–2179) verwendet.
Die heterologen Sequenzen werden unter der Abhängigkeit von Regulationssignalen der Transkription und insbesondere eines Promotors eingebaut, die vorzugsweise zur Rekombination beitragen. Es ist jedoch nicht ausgeschlossen, diese heterologen Sequenzen unter der Kontrolle von geeigneten Signalen für das Adenovirus, die dem Vektor dienen, exprimieren zu lassen.
Unter den nützlichen Promotoren bevorzugt man die Verwendung von starken eukaryontischen Promotoren wie die LTR des Rous-Sarkom-Virus und vorzugsweise des frühen Promotors des Cytomegalievirus oder CMV-IE (CytoMegaloVirus Immediate Early), insbesondere murinen Ursprungs (MCMV-IE) oder menschlichen Ursprungs (HCMV-IE), oder auch diejenigen anderen Ursprungs z.B. Schwein, Affe, Ratte oder Meerschweinchen.
Auf besonders vorteilhafte Weise kann man die CMV-IE-Promotoren mit einem Verstärkerelement (auf Englisch „Enhancer") (US-A-5.168.062, US-A-4.968.615, US-A-4.963.481) verwenden. Es kann vorteilhaft sein, auf Fragmente dieser Promotoren zurückzugreifen, die die Promotoraktivität konservieren, vorzugsweise mit dem Verstärkerelement, z.B. die verkürzten CMV-IE-Promotoren nach WO-A-98/00166. Der Fachmann kann sich für mehr Details auf WO-A-98/00166 und insbesondere auf dessen Beispiel 12 beziehen.
Die vorliegende Erfindung hat auch immunogene oder immunologische Zubereitungen und Schweine-Impfstoffe zum Ziel, die ein erfindungsgemäßes rekombinantes Adenovirus in einem Vehikel oder Excipienten, der veterinärmedizinisch verträglich ist, und gegebenenfalls ein Adjuvans umfassen. Per Definition induziert eine immunogene oder immunologische Zubereitung mindestens eine Immunreaktion (zellulär und/oder humoral) nach der Verabreichung am Tier. Ein Impfstoff induziert eine Schutzreaktion.
Die Adjuvantien werden vorzugsweise aus den Polymeren der Acryl- oder Methacrylsäure und den Copolymeren des Maleinsäureanhydrids und der Alkenylderivate ausgewählt.
Die bevorzugten Zusammensetzungen sind vernetzte Polymere der Acryl- oder Methacrylsäure, insbesondere von Polyalkylenethern von Zuckern oder Polyalkoholen. Diese Zusammensetzungen sind unter dem Begriff Carbomer bekannt (Pharmeuropa Bd. 8, Nr. 2, Juni 1996). Der Fachmann kann sich auch auf US-A-2 909 462 beziehen, das derartige Acrylpolymere beschreibt, die durch eine polyhydroxylierte Zusammensetzung vernetzt ist, die mindestes 3 Hydroxygruppen, vorzugsweise nicht mehr als 8 besitzt, wobei die Wasserstoffatome von mindestens drei Hydroxygruppen durch ungesättigte aliphatische Radikale ersetzt sind, die mindestens 2 Kohlenstoffatome besitzen. Die bevorzugten Radikale sind diejenigen, die 2 bis 4 Kohlenstoffatome, z.B. Vinyle, Allyle und andere ungesättigte Ethylengruppen enthalten. Die ungesättigten Radikale können selbst andere Substituenten wie Methyl enthalten. Die unter der Bezeichnung Carbopol^® (BF Goodrich, Ohio, USA) vertriebenen Produkte sind besonders geeignet. Sie sind durch eine Allylsaccharose oder durch Allylpentaerythritol vernetzt. Unter ihnen kann man Carbopol^® 974P, 934P und 971P zitieren.
Unter den Copolymeren der Maleinanhydride und der Alkenylderivate bevorzugt man die EMA^® (Monsanto), die Copolymere der Malein- und Ethylenanhydride sind, linear oder vernetzt, beispielsweise durch Divinylether vernetzt. Man kann sich auf J. Fields et al., Nature, 186: 778–780, 4. Juni 1960 beziehen.
Was ihre Struktur anbelangt, werden die Polymere der Acryl- oder Methacrylsäuren und die EMA^® vorzugsweise aus basischen Motiven der folgenden Formel gebildet:
wobei:

– R₁ und R₂, identisch oder unterschiedlich sind, H oder CH₃ sind
– X = 0 oder 1, vorzugsweise x = 1 ist
– Y = 1 oder 2, mit x + y = 2 ist

Für die EMA^® gilt x = 0 und y = 2. Für die Carbomere gilt x = y = 1.
Die Lösung dieser Polymere in Wasser führt zu einer sauren Lösung, die vorzugsweise bis zu einem physiologischen pH-Wert neutralisiert wird, so dass sich eine Adjuvanslösung ergibt, in der der Impfstoff eigentlich einschlossen wird. Die Carboyxlgruppen liegen daher teilweise in der Form COO^– vor.
Vorzugsweise wird eine erfindungsgemäße Adjuvanslösung, insbesondere aus Carbomeren, in destilliertem Wasser, vorzugsweise in Gegenwart von Natriumchlorid hergestellt, wobei die erhaltene Lösung einen sauren pH-Wert besitzt. Man verdünnt diese Stammlösung, indem man die erforderliche Menge zugibt (um die gewünschte Endkonzentration zu erhalten) oder einen beträchtlichen Teil davon mit Wasser, das mit NaCl vorzugsweise physiologischer Kochsalzlösung (NaCl 6 g/l) versetzt ist wobei einmal oder mehrere Male eine gleichzeitige oder anschließende Neutralisierung (pH-Wert 7,3 bis 7,4), vorzugsweise durch NaOH erfolgt. Diese Lösung mit einem physiologischen pH-Wert kann so verwendet werden, wie diejenige, um den Impfstoff aufzunehmen, der insbesondere in lyophilisierter Form konserviert wird.
Die Polymerendkonzentration in der Impfstoffzusammensetzung liegt zwischen 0,01 und 2 Gew./Vol.%, genauer gesagt zwischen 0,06 bis 1 Gew./Vol.%, vorzugsweise zwischen 0,1 bis 0,6 Gew./Vol.%.
Die erfindungsgemäßen immunogenen Zubereitungen und Impfstoffe können mehrere erfindungsgemäße rekombinante Adenoviren umfassen, die verschiedene heterologe Nucleotidsequenzen umfassen, die von identischen und/oder verschiedenen Pathogenen stammen.
Die vorliegende Erfindung hat auch Immunisierungsverfahren und die Impfung von Schweinen gegen einen oder mehrere Schweine-Krankheitserreger zum Ziel, umfassend die Verabreichung wirksamer Dosen der vorstehenden immunogenen Zubereitungen und Impfstoffe. Die Dosen liegen beispielsweise zwischen 10⁴ und 10⁷ DICC50.
Sie zielt insbesondere auf die Verabreichung dieser immunogenen Zubereitungen und Impfstoffe über den Schleimhautweg ab, z.B. oral, nasal, über die Augen und/oder an Jungtiere, die mütterliche Antikörper präsentieren. Die anderen Wege, die gewöhnlich für die Impfung der Schweine eingesetzt werden (insbesondere intramuskulär, intradermal.), können ebenfalls genutzt werden.
Die vorliegende Erfindung hat auch Verfahren zur Gewinnung rekombinanter PAV-3-Vektoren, immunogene Zubereitungen und diese einschließende Impfstoffe zum Ziel.
Sie hat auch die Verwendung dieser Vektoren zur Herstellung der erfindungsgemäßen, immunogenen Zubereitungen und Impfstoffe zum Ziel, die insbesondere für eine Verabreichung über den Schleimhautweg und/oder an Jungtieren, die mütterliche Antikörper präsentieren, und/oder für eine Verabreichung über klassische Wege bestimmt sind.
Die Erfindung wird nun mit Hilfe von Ausführungsformen anhand von nicht einschränkenden Beispielen und durch Bezug auf die Zeichnung detaillierter erklärt, wobei:
Liste der Figuren:
1: Schema der Plasmide pKS-Rechts ITR3, pPolyII-Rechts ITR3 und pITRsPAV3
2: Schema der Plasmide pE3PAV3, pE3dI622CMV-EGFP und pE3dI622CMV-gD
3: Restriktionskarte der Plasmide pE3PAV3 und pE3dI919
4: Schema der Plasmide pCMV-EGFP, pCMV-gD und pgD
5: Restriktionskarte der Plasmide pCMV-EGFP, pgD, pE3dI919CMV-EGFP und pE3dI919CMV-gD
6: Restriktionskarte der Plasmide pE3dI622EGFP und pE3dI919EGFP
7: Restriktionskarte der Plasmide pE3dI622gD und pE3dI919CMV-gD
8: Restriktionskarte der Plasmide pCR-Rechts ITR5, pCR-Links ITR5, pPolyII-Rechts ITR5 und pITR-PAV5
9: Restriktionskarte des Plasmids pE3PAV5
10: Restriktionskarte der Plasmide pE3dI1472CMV-EGFP und pE3dI1472CMV-gD
11: Restriktionskarte der Plasmide pE3dI1472EGFP und pE3dI1472gD
12: Physikalische Karte von PAV-5, BamHI-Verdau
13: Sequenz der 5614 Basenpaare (E3-Region und angrenzende Sequenzen des PAV-5-Virus)
Sequenaliste:

SEQ ID NO 1: Oligonucleotid ITRPAV3
SEQ ID NO 2: Oligonucleotid T3
SEQ ID NO 3: Oligonucleotid T7
SEQ ID NO 4: Oligonucleotid ITRPAV5
SEQ ID NO 5: Sequenz der E3-Region des PAV-5-Virus

Beispiele:
Beispiel 1: Zellen und Virus
Die Zellkulturmedien und die Reagenzien wurden von Gibco BRL bezogen. Den Medien (Dulbecco-MEM mit Glutamax-1 Kat # 61965-026) wurden 1 mM Natriumpyruvat (Kat # 11360-039), Gentamycin (50 μg/ml, Kat # 15710-031) und 10% fötales Kälberserum (Kat # 10270-106, Charge 40Q5774K) zugegeben.
Für die Virenkultur wurden die Zellen PK-15 (ATCC Nr. CCL33) und ST (ATCC Nr. CRL 1756) verwendet.
Der Wildtyp des Schweine-Adenovirus Typ 3 (=PAV-3), der für das Schwein nicht pathogen ist, wurde vom Labor von Dr. Eva Nagy (Université de Guelph, Service de Pathobiologie, 50 Stone Road Guelph, ONTARIO, Kanada, NIG 2W1) (Reddy P. et al. Virus Res. 1996, 43, 99–109) erhalten.
Der Wildtyp des Schweine-Adenovirus Typ 5 (=PAV-5), der für das Schwein nicht pathogen ist, wurde vom Labor von Dr. Tadashi Hirahara (Kyoto Biken Laboratories Inc., Division de Microbiologie Vétérinaire, 24–16 Makishima-cho, Ujishi, KYOTO, 611 Japan) (Hirahara T. et al. J. Vet. Sci. 1990, 52, 407–409) erhalten.
Die Kultur- und Passagebedingungen: zweimal wöchentlich werden die Zellen trypsiniert (Trypsinlösung zu 2,5% (Sigma Kat # 044-5075) 50-fach in mit Earle (Gibco-BRL Kat # 14155-030) äquilibrierter Salzlösung verdünnt und in Kulturmedium (Verdünnung 1:6) resuspendiert. Die Zellen werden bei +37°C in Gegenwart von 5% CO₂ vor dem Zurücksetzen in die Kultur gezüchtet.
Beispiel 2: Enzyme, Bakterien, Plasmide und molekularbiologische Verfahren
Die Restriktionsenzyme, die Taq-Polymerase für die Polymerasekettenreaktion und andere notwenige Enzyme mit verschiedenen DNA-Modifikationen wurden jeweils von New England Biolabs Inc., Roche Diagnostics und Gibco-BRL bezogen.
Alle diese Enzyme wurden nach den Empfehlungen der Hersteller verwendet. Die molekularbiologischen Standardverfahren wurden, wie in „Molecular Biology: A Laboratory Manual". 2. Ausgabe (Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory, New York. 1989) beschrieben, durchgeführt.
Die kompetenten Bakterien BJ5183 (Hanahan D. J. Mol. Biol. 1983, 166, 557–580) wurden wie folgt hergestellt:
60 ml einer Kultur dieser Bakterien in der exponentiellen Wachstumsphase wurden nach dem Calciumchlorid-Verfahren (Sambrook et al. 1989) hergestellt. Sie wurden in einem Endvolumen von 2 ml 50 mM CaCl₂ gesammelt. 300 μl dieser Bakteriensuspension wurden mit verschiedenen Partner-DNAs der homologen Rekombination gemischt, die in einem Volumen von 100 μl 100 mM Tris-HCl pH 7,4 enthalten sind, 30 min auf schmelzendes Eis gesetzt, dann wurden die Bakterien mit einem 2-minütigem Hitzeschock bei +45°C behandelt, dann 10 Minuten auf dem schmelzenden Eis stehengelassen und schließlich auf einem Selektionsmedium ausgestrichen.
Beispiel 3: Extraktion der PAV-3- und PAV-5-Virus-DNA
Die Viren werden in 10 cm²-Falcon-Röhrchen nach den Bedingungen von Beispiel 1 gezüchtet und vermehrt. Wenn der cytopathogene Effekt (CPE) vollständig ist, werden die Zellen gesammelt, durch 3 Einfrier-/Auftauzyklen lysiert, dann wird die Virussuspension durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit geklärt. Die PAV-3- und PAV-5-Viren werden über einen Cäsiumchloridgradienten (1,34 g/ml) gereinigt und die Virusbande wird gesammelt, gereinigt, dann wird die Virus-DNA nach Behandlung mit Proteinase K und Extraktion mit Phenol/Chloroform (Sambrook et al. 1989) erhalten. Diese DNA wird anschließend für die verschiedenen Clonierungs- oder Amplifikationsschritte der Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet.
Beispiel 4: Konstruktion des Plasmids „pITRs PAV3"
Die nach Beispiel 3 hergestellte genomische DNA des PAV-3-Virus, wurde mit EcoRI gespalten und das EcoRI D-Fragment mit 245 bp wurde nach der Agarosegelelektrophorese isoliert. Dieses Fragment wurde anschließend mit dem Plasmid pBlueScript KS (pBS-KS) (Stratagene Inc. La Jolla, CA) (GenBank # X52327) ligiert, das zuvor mit EcoRI gespalten und dephosphoryliert wurde, so dass sich das Plasmid mit der Bezeichnung „pKS-EcoDPAV3" ergibt.
Eine PCR-Reaktion wurde mit dem Plasmid pKS-EcoDPAV3 als Matrize und den folgenden Oligoucleotiden durchgeführt:
Das Amplifikationsprodukt (367 bp) wurde mit T4-DNA-Polymerase behandelt, um „glatte Enden" zu erzeugen, dann wurde es mit dem Enzym ClaI gespalten und mit dem Plasmid pBS-KS ligiert, das zuvor mit ClaI und EcoRV gespalten wurde, so dass sich das Plasmid mit der Bezeichnung „pKS-Rechts ITR3" (1) ergibt.
Das Fragment EcoRI D wurde anschließend aus dem Plasmid pKS-Rechts ITR3 durch Verdau mit den Enzymen BamHI und KpnI freigesetzt, und das Restriktionsfragment der BamHI-KpnI mit 353 bp wurde mit dem Plasmid pPolyII (Lathe R. et al. Gene. 1987, 57, 193–201) (GenBank # G209113) ligiert, das zuvor mit BamHI und KpnI gespalten wurde, so dass sich das Plasmid mit der Bezeichnung „pPolyII-Rechts ITR3" (1) ergibt.
Die nach Beispiel 3 hergestellte, genomische DNA des PAV-3-Virus wurde mit KpnI gespalten, um nach der Agarosegelelektrophorese das terminale Fragment KpnI F mit 939 bp zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit dem Plasmid pBS-KS ligiert, das zuvor mit KpnI gespalten und dephosphoryliert wurde, so dass sich das Plasmid mit der Bezeichnung „pKS-KpnFPAV3" ergibt.
Anschließend wurde eine PCR-Reaktion mit dem Plasmid pKS-KpnFPAV3 als Matrize und den folgenden Oligoucleotiden durchgeführt:
Das Amplifikationsprodukt (1086 bp) wurde mit T4-DNA-Polymerase behandelt, um „glatte Enden" zu erzeugen, dann wurde es mit dem Enzym XhoI gespalten und mit dem Plasmid pPolyII-Rechts ITR3 ligiert, das zuvor mit BglII gespalten wurde, mit T4-DNA-Polymerase behandelt, dann mit XhoI gespalten, so dass sich das Plasmid mit der Bezeichnung „pITRsPAV3" (1) ergibt.
Beispiel 5: Konstruktion des Plasmids pPAV3
Das Plasmid pITRsPAV3 (Beispiel 4) wurde durch Verdau mit ClaI linearisiert, dann in kompetenten BJ5183-Bakterien mit nach Beispiel 2 hergestellter genomischer DNA des PAV-3-Virus cotransformiert. Diese Cotransformation erlaubte durch homologe Rekombination in Escherichia coli (Chartier C. et al. J. 1996, 70, 4805–4810) die Herstellung eines Plasmids, das das vollständige, aus PAV-3 clonierte Genom enthält. Dieses Plasmid wurde als „pPAV3" bezeichnet.
Beispiel 6: Konstruktion der Shuttle-Vektoren PAV-3
6.1. Konstruktion des Plasmids mit einer Deletion mit 622 Basenpaaren (kleine Deletion) in der E3-Region
Das Plasmid pNEB193 (New England Biolabs Kat # 305-1) wurde mit PacI gespalten, mit T4-DNA-Polymerase behandelt, dann wieder mit sich selbst ligiert, so dass sich das Plasmid „pNEBPac-" ergibt.
Das Plasmid pPAV3 (Beispiel 5) wurde mit KpnI und BamHI gespalten, um das Fragment KpnI-BamHI mit 4344 bp, enthaltend die E3-Region, zu isolieren (Reddy et al. Virology, 1998, 251, 414–426). Dieses Fragment wurde mit dem Plasmid pNEBPac- ligiert, das zuvor mit KpnI und BamHI gespalten wurde, so dass sich das Plasmid „pE3PAV3" (2) ergibt. Die Sequenz des KpnI-BamHI-Fragments wurde überprüft und für identisch mit der von Reddy P. et al. (Virus Research, 1995, 36, 97–106 und Virology, 1998, 251, 414–426) (GenBank AN # 010433 und AN # AF083132) veröffentlichten Sequenz befunden. Der Fachmann kann sich auf diese Referenzen beziehen.
Das Plasmid pEGFP-F (Chalfie M. et al. Science, 1994, 263, 802–805; Clontech Kat # 6074-1) wurde modifiziert, um den Polylinker vollständig zu entfernen. Diese Deletion wurde durch einen Verdau mit BamHI erhalten, auf den eine Behandlung mit T4-DNA-Polymerase folgte. Die Religation des so modifizierten Vektors mit sich selbst erzeugte das Plasmid pCMV-EGFP. Das Plasmid pCMV-EGFP wurde anschließend mit den Enzymen AsnI und MluI gespalten, dann mit T4-DNA-Polymerase behandelt, um das Fragment AsnI (glatte Enden) – MluI (glatte Enden) mit 1,6 kbp (= Expressionskassette CMV-EGFP) zu erzeugen. Dieses Fragment wurde mit dem Plasmid pE3PAV3 ligiert, das zuvor mit BsrGI und SnaBI gespalten wurde und mit T4-DNA-Polymerase behandelt, so dass sich das Plasmid pE3dI622CMV-EGFP (2) ergibt. Die zwischen den Restriktionsschnittstellen BsrGI und SnaBI der E3-Region des PAV-3-Virus erzeugte Deletion besitzt eine Größe von 622 Basenpaaren. Diese Deletion erstreckt sich von den Nucleotiden 1002 bis 1624 der von Reddy P. et al. (Virus Research, 1995, 36, 97–106) (GenBank AN # 010433) veröffentlichten Sequenz.
Das Plasmid pCMV-gD (Ambriovic A. et al. Virology, 1997, 238, 327–335) wurde mit SnaBI und ClaI gespalten, um das Fragment SnaBI-ClaI mit 1,8 kbp (enthaltend den 3'-Anteil des CMV-Promotors und das PRV gD-Gen) zu isolieren. Dieses Fragment wurde anschließend mit T4-DNA-Polymerase behandelt, um glatte Enden zu erzeugen, dann wurde es mit dem Plasmid pE3dI622CMV-EGFP ligiert, das zuvor mit SnaBI und HpaI gespalten wurde, um das Plasmid pE3dI622CMV-gD (2) zu erzeugen.
6.2. Konstruktion des Plasmids mit einer Deletion mit 919 Basenpaaren (große Deletion) in der E3-Region
Das Plasmid pE3PAV3 (vgl. Teil 6.1. a.a.O.) wurde mit SgrAI und SacI gespalten, um das Fragment SgrAI-SacI mit 644 bp zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit T4-DNA-Polymerase behandelt, um glatte Enden zu erzeugen, dann wurde es mit dem Plasmid pNEBPac- (6.1. a.a.O.) ligiert, das zuvor mit EcoRI gespalten wurde, mit T4-DNA-Polymerase behandelt, um das Plasmid pSgrAI-SacI zu erzeugen.
Das Plasmid pE3PAV3 wurde mit SnaBI und HindIII gespalten, um das Fragment SnaBI-HindIII mit 2,4 kbp zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit dem pSgrAI-SacI-Plasmid ligiert, das zuvor mit PmeI und HindIII gespalten wurde, um das Plasmid pE3dI919 (3) zu erzeugen. Die zwischen den Restriktionsschnittstellen SacI und SnaBI der E3-Region des PAV-3-Virus erzeugte Deletion besitzt eine Größe von 919 Basenpaaren. Diese Deletion erstreckt sich von den Nucleotiden 706 bis 1624 der von P. Reddy et al. (Virus Research, 1995, 36, 97–106) (GenBank AN # U10433) veröffentlichten Sequenz.
Das Plasmid pCMV-gD (Beispiel 6.1.) wurde mit SnaBI und ClaI gespalten, um das Fragment SnaBI-ClaI mit 1,8 kbp zu isolieren. Dieses Fragment wurde dann mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase behandelt, um glatte Enden zu erzeugen, dann wurde es mit dem Plasmid pCMV-EGFP (Beispiel 6.1.) ligiert, das zuvor mit SnaBI und HpaI gespalten wurde, dann dephosphoryliert, um das Plasmid pgD (4) zu erzeugen.
Das Plasmid pCMV-EGFP (Beispiel 6.1.) wurde mit AsnI und MluI gespalten, um das Fragment AsnI-MluI mit 1,8 kbp (CMV-EGFP-Cassette) zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase behandelt, um glatte Enden zu erzeugen, dann wurde es mit dem pE3dI919-Plasmid ligiert, das zuvor mit AscI gespalten wurde, mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase behandelt, um glatte Ende zu erzeugen, dann dephosphoryliert, um das Plasmid pE3dI919CMV-EGFP (5) zu erzeugen.
Das Plasmid pgD (a.a.O.) wurde mit AsnI und MluI gespalten, um das Fragment AsnI-MluI mit 2,3 kbp zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit T4-DNA-Polymerase behandelt, um glatte Ende zu erzeugen, dann wurde es mit dem Plasmid pE3dI919 ligiert, das zuvor mit AscI gespalten wurde, mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase behandelt, um glatte Ende zu erzeugen, dann dephosphoryliert, um das Plasmid pE3dI919CMV-gD (5) zu erzeugen.
Beispiel 7: Konstruktion der rekombinanten Genome pPAV3dI622CMV-EGFP und pPAV3dI622CMV-gD
Das Plasmid pE3dI622CMV-EGFP (Beispiel 6.1.) wurde mit KpnI und BamHI gespalten, um das Fragment KpnI-BamHI mit 5,5 kbp zu isolieren. Dieses Fragment wurde in den kompetenten Bakterien BJ5183 mit dem durch Verdau mit dem Enzym SnaBI linearisierten Plasmid pPAV3 (Beispiel 5) cotransformiert. Diese Cotransformation führte durch homologe Rekombination in Escherichia coli zur Erzeugung des Plasmids pPAV3dI622CMV-EGFP.
Das Plasmid pE3CMVgD (Beispiel 6.1) wurde mit EcoRI und PmeI gespalten, um das Fragment EcoRI-PmeI mit 6,0 kbp zu isolieren. Dieses Fragment wurde in den kompetenten Bakterien BJ5183 mit dem durch Verdau mit dem Enzym SnaBI linearisierten Plasmid pPAV3 (Beispiel 5) cotransformiert. Diese Cotransformation führte durch homologe Rekombination in Escherichia coli zur Erzeugung des Plasmids pPAV3dI622CMVgD.
Beispiel 8: Konstruktion der rekombinanten Genome pPAV3dI919CMV-EGFP und pPAV3dI919CMV-gD
Das Plasmid pE3dI919CMV-EGFP (Beispiel 6.2.) wurde mit HindIII linearisiert, dann in den kompetenten Bakterien BJ5183 mit dem durch Verdau mit dem Enzym SnaBI linearisierten Plasmid pPAV3 (Beispiel 5) cotransformiert. Diese Cotransformation führte durch homologe Rekombination in Escherichia coli zur Erzeugung des Plasmids pPAV3dI919CMV-EGFP.
Das Plasmid pE3dI919CMV-gD (Beispiel 6.2.) wurde mit HindIII linearisiert, dann in den kompetenten Bakterien BJ5183 mit dem durch Verdau mit dem Enzym SnaBI linearisierten Plasmid pPAV3 (Beispiel 5) cotransformiert. Diese Cotransformation führte durch homologe Rekombination in Escherichia coli zur Erzeugung des Plasmids pPAV3dI919CMV-gD.
Beispiel 9: Konstruktion der rekombinanten Genome pPAV3dI622EGFP und pPAV3dI622gD, pPAV3dI919EGFP und pPAV3dI919gD (Insertion der codierenden Sequenzen ohne die Sequenzen des CMV-Promotors)
9.1. Konstruktion der Plasmide pPE3dI622EGFP und pPE3dI919EGFP
Das Plasmid pCMV-EGFP (Beispiel 6.1) wurde mit NheI und MluI gespalten, um das Fragment NheI-MluI mit 1,0 kbp zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase behandelt, um glatte Ende zu erzeugen, dann mit dem Plasmid pE3PAV3 (Beispiel 6.1) ligiert, das zuvor mit BsrGI gespalten wurde, mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase behandelt, und dann mit SnaBI gespalten, um das Plasmid pE3dI622EGFP (6) zu erzeugen.
Das Plasmid pCMV-EGFP wurde mit NheI und MluI gespalten, um das Fragment NheI-MluI mit 1,0 kbp zu isolieren. Dieses Fragment wurde dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase behandelt, um glatte Ende zu erzeugen, dann mit dem pE3dI919-Plasmid ligiert, das zuvor mit AscI gespalten wurde, mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase behandelt, dann dephosphoryliert, um das Plasmid pE3dI919EGFP (6) zu erzeugen.
9.2. Konstruktion der Plasmide pE3dI622gD und pE3dI919gD
Das Plasmid pgD (Beispiel 6.2.) wurde mit XhoI und ClaI gespalten, um das Fragment XhoI-ClaI mit 1,5 kbp zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase behandelt, um glatte Enden zu erzeugen, dann wurde es mit dem Plasmid pE3PAV3 (Beispiel 6.1.) ligiert, das zuvor mit BsrGI gespalten wurde, mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase behandelt, dann mit SnaBI gespalten, um das Plasmid pE3dI622gD (7) zu erzeugen.
Das Plasmid pgD (Beispiel 6.2.) wurde mit XhoI und ClaI gespalten, um das Fragment XhoI-ClaI mit 1,5 kbp zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase behandelt, um glatte Enden zu erzeugen, dann wurde es mit dem Plasmid pE3dI919 (Beispiel 6.2.) ligiert, das zuvor mit AscI gespalten wurde, mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase behandelt, und schließlich dephosphoryliert, um das Plasmid pE3dI919gD (7) zu erzeugen.
9.3. Konstruktion der Plasmide pPAV3dI622EGFP, pPAV3dI622gD, pPAV3dI919EGFP und pPAV3dI919gD
Das Plasmid pE3dI622EGFP (Beispiel 9.1.) wurde mit KpnI und BamHI gespalten, dann in den kompetenten Bakterien BJ5183 mit dem durch Verdau mit dem Enzym SnaBI linearisierten Plasmid pPAV3 (Beispiel 5) cotransformiert. Diese Cotransformation erlaubte durch homologe Rekombination in Escherichia coli die Erzeugung des Plasmids pPAV3dI622EGFP.
Das Plasmid pE3dI622gD (Beispiel 9.2.) wurde mit EcoRI und PmeI gespalten, dann in den kompetenten Bakterien BJ5183 mit dem durch Verdau mit dem Enzym SnaBI linearisierten Plasmid pPAV3 (Beispiel 5) cotransformiert. Diese Cotransformation erlaubte durch homologe Rekombination in Escherichia coli die Erzeugung des Plasmids pPAV3dI622gD.
Das Plasmid pE3dI919EGFP (Beispiel 9.1.) wurde durch Verdau mit HindIII linearisiert, dann in den kompetenten Bakterien BJ5183 mit dem durch Verdau mit dem Enzym SnaBI linearisierten Plasmid pPAV3 (Beispiel 5) cotransformiert. Diese Cotransformation erlaubte durch homologe Rekombination in Escherichia coli die Erzeugung des Plasmids pPAV3dI919EGFP.
Das Plasmid pE3dI919gD (Beispiel 9.2.) wurde mit HindIII linearisiert, dann in den kompetenten Bakterien BJ5183 mit dem durch Verdau mit dem Enzym SnaBI linearisierten Plasmid pPAV3 (Beispiel 5) cotransformiert. Diese Cotransformation erlaubte durch homologe Rekombination in Escherichia coli die Erzeugung des Plasmids pPAV3dI919gD.
Beispiel 10: Gewinnen von rekombinanten PAV3-Viren durch Transfektion mit den rekombinanten, in Escherichia coli clonierten PAV3-Genomen
Die Zellen PK-15 oder ST (vgl. Beispiel 1) werden auf Platten mit 6 Vertiefungen mit einer Konfluenzdichte von 60–80% mit 2 μg rekombinanter, genomischer PAV-3-DNA transfiziert, die zuvor mit PacI gespalten wurde, in Gegenwart von 4 bis 12 μl LipofectAMINE (Gibco-BRL Kat # 18324-012) gemäß der Zelllinie verdünnt.
Nach der Transfektion belässt man die Zellen nach den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen einige Tage in Kultur, bis ein viraler CPE auftritt. Dann erfolgt eine neue Passage in die Zellkultur zur Vermehrung des erhaltenen rekombinanten Virus.

Die Transfektion, die mit dem Plasmid pPAV3dI622CMV-EGFP (Beispiel 7) durchgeführt wurde, erzeugte das rekombinante Virus vPAV3-1.
Die Transfektion, die mit dem Plasmid pPAV3dI622CMV-gD (Beispiel 7) durchgeführt wurde, erzeugte das rekombinante Virus vPAV3-2.
Die Transfektion, die mit dem Plasmid pPAV3dI919CMV-EGFP (Beispiel 8) durchgeführt wurde, erzeugte das rekombinante Virus vPAV3-3.
Die Transfektion, die mit dem Plasmid pPAV3dI919CMV-gD (Beispiel 8) durchgeführt wurde, erzeugte das rekombinante Virus vPAV3-4.
Die Transfektion, die mit dem Plasmid pPAV3dI622EGFP (Beispiel 9.3) durchgeführt wurde, erzeugte das rekombinante Virus vPAV3-5.
Die Transfektion, die mit dem Plasmid pPAV3dI622gD (Beispiel 9.3) durchgeführt wurde, erzeugte das rekombinante Virus vPAV3-6.
Die Transfektion, die mit dem Plasmid pPAV3dI919EGFP (Beispiel 9.3) durchgeführt wurde, erzeugte das rekombinante Virus vPAV3-7.
Die Transfektion, die mit dem Plasmid pPAV3dI919gD (Beispiel 9.3) durchgeführt wurde, erzeugte das rekombinante Virus vPAV3-8.

Beispiel 11: Konstruktion des Plasmids pITRsPAV5
11.1. Clonierung des genomischen Fragments mit dem rechten Terminus
Die nach Beispiel 3 hergestellte genomische PAV-5-Virus-DNA wurde mit EcoRI gespalten und das EcoRI-Fragment mit dem rechten Terminus mit 0,9 kbp wurde nach der Agarosegelektrophorese isoliert. Dieses Fragment wurde mit dem pBS-KS-Plasmid ligiert, das zuvor mit EcoRI gespalten und dephosphoryliert wurde, um das Plasmid „pKS-Rechts ITR5" zu erzeugen.
Dann wurde eine PCR-Reaktion mit dem pKS-Rechts ITR5-Plasmid als Matrize und mit folgenden Oligonucleotiden durchgeführt:
um ein Fragment mit 1,0 kbp herzustellen. Dieses Fragment wurde mit dem Plasmid pCRII (inVitrogen Original TA Cloning Kit Kat # K2000-01) ligiert, so dass sich das Plasmid „pCR-Rechts ITR5" (8) ergibt.
11.2. Clonierung des genomischen Fragments mit dem linken Terminus
Die nach Beispiel 3 hergestellte genomische PAV-5-Virus-DNA wurde mit HindIII gespalten und das HindIII-Fragment am linken Terminus mit 1,2 kbp wurde nach der Agarosegelektrophorese isoliert. Dieses Fragment wurde mit dem Plasmid pBS-KS ligiert, das zuvor mit HindIII gespalten und dephosphoryliert wurde, um das Plasmid „pKS-Links ITR5" zu erzeugen.
Dann wurde eine PCR-Reaktion mit dem pKS-Links ITR5-Plasmid als Matrize und mit folgenden Oligonucleotiden durchgeführt:
um ein Fragment mit 1,3 kbp herzustellen. Dieses Fragment wurde mit dem Plasmid pCRII ligiert, so dass sich das Plasmid pCR-Links ITR5 (8) ergibt.
11.3. Konstruktion des Plasmids pPolyII-Rechts ITR5
Das Plasmid pCR-Rechts ITR5 (Beispiel 11.1.) wurde mit BamHI und HindIII gespalten, um das Fragment BamHI-HindIII mit 1,0 kbp zu isolieren. Dieses Fragment wurde dann mit dem Plasmid pPolyII (vgl. Beispiel 4) ligiert, das zuvor mit BamHI und HindIII gespalten wurde, um das Plasmid „pPolyII-Rechts ITR5" (8) zu erzeugen.
11.4. Konstruktion des Plasmids pITRsPAV5
Das Plasmid pCR-Links ITR5 (Beispiel 11.2.) wurde mit BamHI und HindIII gespalten, um das Fragment BamHI-HindIII mit 1,3 kbp zu isolieren. Dieses Fragment wurde dann mit dem pPolyII-Rechts ITR5-Plasmid ligiert, das zuvor mit BgIII und HindIII gespalten wurde, um das Plasmid „pITRsPAV5" (8) zu erzeugen.
Beispiel 12: Konstruktion des Plasmids pPAV5
Das Plasmid pITRsPAV5 wurde durch Verdau mit HindIII linearisiert. Das erhaltene Fragment wurde dann in den kompetenten Bakterien BJ5183 mit der nach Beispiel 3 hergestellten, genomischen DNA des PAV-5-Virus cotransformiert. Diese Cotransformation erlaubte durch homologe Rekombination die Erzeugung eines Plasmids, das das gesamte Genom des PAV-5-Virus enthält. Dieses Plasmid wurde als „pPAV5" bezeichnet.
Beispiel 13: Konstruktion der Shuttle-Vektoren PAV-5
13.1. Konstruktion des Shuttle-Vektors E3-PAV-5
Das Plasmid pPAV5 (Beispiel 12) wurde mit SacI und MluI gespalten, um das Fragment SacI-MluI mit 4372 bp zu isolieren, das die E3-Region enthält. Dieses Fragment wurde dann mit dem Plasmid pNEB193 (Beispiel 6.1) ligiert, das zuvor mit SmaI und AscI gespalten wurde, so dass sich das Plasmid „pE3PAV5" (9) ergibt.
Das in das Plasmid pE3PAV5 clonierte Fragment SacI-MluI wurde vollständig sequenziert und analysiert. Die Analyse dieser Sequenz und der benachbarten Sequenzen, die auf dem Plasmid pE3PAV5 vorliegen, haben bestätigt, dass das clonierte Fragment die E3-Region des PAV-5-Virus gut repräsentiert. Die Sequenz dieser Region (5614 Basenpaare) (SEQ ID NR. 5) ist in 13 dargestellt.
13.2. Konstruktion der Spenderplasmide CMV-EGFP und CMV-PRVgD mit einer Deletion mit 1472 Basenpaaren in der E3-Region.
Das Plasmid pCMV-EGFP (Beispiel 6.1) wurde mit den Enzymen AsnI und MluI gespalten, dann mit T4-DNA-Polymerase behandelt, um das Fragment AsnI (glatte Enden) – MluI (glatte Enden) mit 1,6 kbp zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit dem Plasmid pE3PAV5 (Beispiel 13.1) ligiert, das zuvor mit PvuII und BglI gespalten und mit T4-DNA-Polymerase behandelt wurde, um das Plasmid pE3dI1472CMV-EGFP (10) zu erzeugen. Die zwischen den Restriktionsschnittstellen PvuII und BglI eingeführte Deletion besitzt eine Größe von 1472 bp. Diese Deletion liegt zwischen den Nucleotiden 2389 bis 3861 der in 13 dargestellten Sequenz (SEQ ID NR. 5).
Das Plasmid pgD (Beispiel 6.1) wurde mit den Enzymen AsnI und MluI gespalten, um das Fragment AsnI mit 2,3 kbp zu isolieren. Dieses Fragment wurde anschließend mit T4-DNA-Polymerase behandelt, um glatte Enden zu erhalten, dann wurde es mit dem Plasmid pE3PAV5 ligiert, das zuvor mit PvuII und BglI gespalten und mit T4-DNA-Polymerase behandelt wurde, um das Plasmid pE3dI1472CMVgD (10) zu erzeugen.
Das Plasmid pCMV-EGFP wurde mit NheI und MluI gespalten, um das Fragment NheI-MluI mit 1,0 kbp zu isolieren. Dieses Fragment wurde dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase behandelt, um glatte Ende zu erzeugen, dann mit dem Plasmid pE3PAV5 ligiert, das zuvor mit PvuII und BglI gespalten wurde, mit T4-DNA-Polymerase behandelt, um das Plasmid pE3dI1472EGFP (11) zu erzeugen.
Das Plasmid pCMVgD (Beispiel 6.1.) wurde mit XhoI und ClaI gespalten, um das Fragment XhoI-ClaI mit 1,5 kbp zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase behandelt, um glatte Enden zu erzeugen, dann wurde es mit dem Plasmid pE3PAV5 ligiert, das zuvor mit PvuII und BglI gespalten wurde, mit T4-DNA-Polymerase behandelt, um das Plasmid pE3dI1472gD (12) zu erzeugen.
Beispiel 14: Konstruktion der rekombinanten Genome pPAV5dI1472CMV-EGFP und pPAV5dI1472gD
Das Plasmid pE3dI1472EGFP (Beispiel 13.2) wurde mit PmeI linearisiert, dann in den kompetenten Bakterien BJ5183 mit dem durch Verdau mit dem Enzym BamHI (Verbindungsstelle der Restriktionsunterfragmente BamHI A-BamHI D, 12) linearisierten Plasmid pPAV5 (Beispiel 12) cotransformiert. Diese Cotransformation führte durch homologe Rekombination in Escherichia coli zur Erzeugung des Plasmids pPAV5dI1472CMV-EGFP.
Das Plasmid pE3dI1472CMVgD (Beispiel 13.2) wurde mit PmeI linearisiert, dann in den kompetenten Bakterien BJ5183 mit dem durch partiellen Verdau mit dem Enzym BamHI (Verbindungsstelle der Restriktionsunterfragmente BamHI A-BamHI D, 12) linearisierten Plasmid pPAV5 (Beispiel 12) cotransformiert. Diese Cotransformation führte durch homologe Rekombination in Escherichia coli zur Erzeugung des Plasmids pPAV5dI1472CMV-gD.
Beispiel 15: Konstruktion der rekombinanten Genome pPAV5dI1472EGFP und pPAV5dI1472gD (Insertion von codierenden Sequenzen ohne CMV-Promotorsequenzen
Das Plasmid pE3dI1472EGFP (Beispiel 13.2) wurde mit PmeI linearisiert, dann in den kompetenten Bakterien BJ5183 mit dem durch partiellen Verdau mit dem Enzym BamHI (Verbindungsstelle der Restriktionsunterfragmente BamHI A-BamHI D, 12) linearisierten Plasmid pPAV5 (Beispiel 12) cotransformiert. Diese Cotransformation führte durch homologe Rekombination in Escherichia coli zur Erzeugung des Plasmids pPAV5dI1472EGFP.
Das Plasmid pE3dI1472gD (Beispiel 13.2) wurde mit PmeI linearisiert, dann in den kompetenten Bakterien BJ5183 mit dem durch partiellen Verdau mit dem Enzym BamHI (Verbindungsstelle der Restriktionsunterfragmente BamHI A-BamHI D, 12) linearisierten Plasmid pPAV5 (Beispiel 12) cotransformiert. Diese Cotransformation führte durch homologe Rekombination in Escherichia coli zur Erzeugung des Plasmids pPAV5dI1472gD.
Beispiel 16: Gewinnen der rekombinanten PAV5-Viren durch Transfektion mit den rekombinanten, in Escherichia coli clonierten PAV5-Genomen
Die Zellen PK-15 oder ST (vgl. Beispiel 1) werden auf Platten mit 6 Vertiefungen mit einer Konfluenzdichte von 60–80% mit 2 μg rekombinanter, genomischer PAV-3-DNA transfiziert, die zuvor mit PacI gespalten wurde, in Gegenwart von 4 bis 12 μl LipofectAMINE (Gibco-BRL Kat # 18324-012) gemäß der Zelllinie verdünnt.
Nach der Transfektion belässt man die Zellen nach den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen einige Tage in Kultur, bis ein viraler CPE auftritt. Dann erfolgt eine Passage zur Vermehrung des erhaltenen rekombinanten Virus.

Die Transfektion, die mit dem Plasmid pPAV5dI1472CMV-EGFP (Beispiel 14) durchgeführt wurde, erzeugte das rekombinante Virus vPAV5-1.
Die Transfektion, die mit dem Plasmid pPAV5dI1472CMV-gD (Beispiel 14) durchgeführt wurde, erzeugte das rekombinante Virus vPAV5-2.
Die Transfektion, die mit dem Plasmid pPAV5dI1472EGFP (Beispiel 15) durchgeführt wurde, erzeugte das rekombinante Virus vPAV5-3.
Die Transfektion, die mit dem Plasmid pPAV5dI1472gD (Beispiel 15) durchgeführt wurde, erzeugte das rekombinante Virus vPAV5-4.

Beispiel 19: Herstellung der erfindungsgemäßen Impfstoffe
Die erfindungsgemäß erhaltenen rekombinanten Viren werden in Pk-15-Zellkulturen gezüchtet und vermehrt. Die Überstände werden nach Beobachtung eines vollständigen cytopathogenen Effekts gesammelt. Nach der Klärung durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit zur Beseitigung der Zelltrümmer und anschließender Zentrifugation zur Konzentration der Virionen und zum Waschen des Virus-Pellets wird das Pellet in einer Lösung mit Kulturmedium wieder aufgenommen. Der Virus-Titer dieser Suspensionen wird gemessen. Der Virus-Titer wird dann gegebenenfalls durch Verdünnung eingestellt, so dass ein Virus-Endtiter erhalten wird, der zwischen 10⁴ Dosen, die 50% der Zellkulturen (DICC50) infizieren, und 10⁷ DICC50/ml liegt.
Die Virussuspensionen können entweder eingefroren oder vorzugsweise in Gegenwart eines Lyophilisierungssubstrats lyophilisiert werden.
Beispiel 20: Impfung der Schweine
Nach dem Auftauen oder nach der Wiederaufnahme der lyophilisierten Dosen in Wasser für Injektionszubereitungen und eventueller Zugabe eines Adjuvans werden die Schweine mit den Dosen von 10⁴ bis 10⁷ DICC50 von jedem rekombinanten Virus geimpft. Die Impfstoffe umfassen einen oder mehrere rekombinante PAV-Viren, die jeweils verschiedene Immunogene exprimieren.
Die Impfstoffe werden durch Injektion mit der Nadel (intramuskulärer Weg) in einem Volumen von 2 ml verabreicht, d.h. über den Schleimhautweg (intranasaler Weg oder Augeninstillation) (Volumen an jeden Weg angepasst).
Die Injektionen über den intradermalen Weg erfolgen auch mittels eines Injektors ohne Nadel wie dem PIGJET-Gerät (Société Endoscoptic, Laon, Frankreich).
Beispiel 21: Impfprotokoll/Test zur Aujeszky'schen Krankheit
Es gab ein Impfprotokoll/einen Test zur Aujeszky'schen Krankheit, um die Wirksamkeit eines Impfstoffes zu bewerten, der aus einer Suspension des rekombinierten vPAV3-2-Virus ohne Adjunans besteht (Beispiel 10 der vorliegenden Erfindung).
Es wurden Gruppen mit sechs 8 bis 10 Wochen alten Ferkeln gebildet, die von Mutterschweinen geboren wurden, die zu Beginn der Schwangerschaft gegen das Virus der Aujeszky'schen Krankheit (PRV) geimpft worden waren. Alle Ferkel besaßen viele mütterliche Antikörper anti-PRV an Tag T0 der Impfung. Die Ferkel der Gruppen 1 und 2 wurden an T0 über den intranasalen Weg mit 1 Milliliter (ml) einer Suspension aus rekombinantem vPAV3-2(PAV3/PRV gD) mit einem Titer von 10⁷ DICC50/ml (0,5 ml pro Nasenloch) geimpft. Die Gruppe 2 wurde auf dieselbe Weise geimpft, erhielt jedoch auch eine zweite Gabe an T21. Die Gruppe 3 erhielt an T0 über den intramuskulären Weg 1 ml einer PAV-3/gD-Virussuspension mit einem Titer von 10⁷ DICC50/ml. Die Gruppe 4 wurde auf dieselbe Weise geimpft wie die Gruppe 3, erhielt jedoch auch eine zweite Injektion der Virussuspension am T21. Die Gruppe 5 wurde nicht geimpft und diente als negative Kontrollgruppe für den Test.
Alle Gruppen wurden am T35 durch Verabreichung von 2 ml (1 ml pro Nasenloch) einer Suspension des Stammes PVR NIA3 mit einem Titer von mindestens 10^7,3 pfu/ml getestet. Nach dem Test wurden die Schweine hinsichtlich der Gewichtsentwicklungskriterien (delta G7) (Stellmann C. et al. J. Biol. Standard, 1989, 17, 1–11) (T0 bis T7 nach dem Test, der Kriterien bezüglich der Virusexkretion sowie bezüglich der Nasenschleimhäute, und hinsichtlich der ELISA-Antikörpertiter sowie der anti-PRV-Serumneutralisation weiter verfolgt.
Es sollte klar sein, dass die durch die Patentansprüche im Anhang definierte Erfindung nicht durch die besonders angegebenen Ausführungsformen in der vorstehenden Beschreibung begrenzt wird.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Rekombinantes Schweine-Adenovirus vom Serotyp 3 (PAV-3), das mindestens eine heterologe Nucleinsäure enthält, die mindestens ein Immunogen codiert, wobei die heterologe Nucleinsäure in die E3-Region des PAV-3-Genoms inseriert wurde, positioniert zwischen dem Gen, welches das Protein VIII codiert, und dem Gen, welches die Faser codiert, wobei das rekombinante Adenovirus in der Lage ist, in vivo zu replizieren und das Immunogen zu exprimieren, wobei das Immunogen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: dem Immunogen des porcinen Circovirus Typ 2, dem gB des Virus der Aujeszky'schen Krankheit, dem gC des Virus der Aujeszky'schen Krankheit, dem Immunogen des Schweinegrippevirus, dem VP2 des Parvovirose-Virus, dem ORF3 des Virus der mysteriösen Schweinekrankheit (seuchenhafter Spätabort der Schweine, MSD-Krankheit), dem ORF4 des Virus der MSD-Krankheit, dem ORF6 des Virus der MSD-Krankheit, dem ORF7 des Virus der MSD-Krankheit, dem EO des Virus der klassischen Schweinepest, dem E1 des Virus der klassischen Schweinepest und dem Immunogen von Actinobacillus pleuropneumoniae.
Adenovirus nach Anspruch 1, bei dem die heterologe Nucleinsäure in die E3-Region des PAV-3-Genoms in einem Insertionsbereich inseriert wurde, der im Stamm 6618 durch die Sequenz SEQ ID No: 6 dargestellt ist.
Adenovirus nach einem der Ansprüche 1 oder 2, bei dem der Insertionsbereich eine Deletion aufweist.
Adenovirus nach eine der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die heterologe Nucleinsäure mindestens ein Immunogen des porcinen Circovirus Typ 2 codiert.
Adenovirus nach Anspruch 4, bei dem die heterologe Nucleinsäure ORF1, ORF2 oder ORF1 und ORF2 des porcinen Circovirus Typ 2 codiert.
Adenovirus nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die heterologe Nucleinsäure HA, NA und/oder NP des Schweinegrippevirus codiert.
Schweine-Adenovirus nach einem der Ansprüche 1 bis 6, das eine heterologe Nucleotidsequenz umfasst, die ein Cytokin vom Schwein codiert.
Adenovirus nach Anspruch 7, bei dem das Cytokin vom Schwein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus GM-CSF, I1-4, IL-12 und IL-18.
Rekombinanter Schweineimpfstoff, der ein rekombinantes Schweine-Adenovirus PAV-3 nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und einen Träger oder Exzipienten umfasst, der in der Veterinärmedizin verträglich ist.
Rekombinanter Schweineimpfstoff nach Anspruch 9, der mehrere rekombinante Schweine-Adenoviren PAV-3 nach einem der Ansprüche 1 bis 8 umfasst, die unterschiedliche heterologe Nucleotidsequenzen umfassen.
Rekombinanter Schweineimpfstoff nach Anspruch 9 oder 10, der ein Adjuvans umfasst.
Rekombinanter Schweineimpfstoff nach Anspruch 11, wobei das Adjuvans ausgewählt ist aus Acrylsäure- oder Methacrylsäurepolymeren und den Copolymeren von Maleinsäureanhydrid und den Alkenylderivaten.
Rekombinanter Schweineimpfstoff nach Anspruch 12, bei dem das Adjuvans ein Carbomer ist.