KR20020013502A - 재조합 돼지 아데노바이러스로 이루어지는 바이러스 벡터및 바이러스 백신 - Google Patents

재조합 돼지 아데노바이러스로 이루어지는 바이러스 벡터및 바이러스 백신 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생체 내에서 복제성을 유지하며 재조합 돼지 아데노바이러스에 관한 것으로서, 상기 돼지 아데노바이러스는 돼지 아데노바이러스가 돼지의 생체 내에서 복제되고 삽입된 서열을 발현할 수 있는 조건 하에서 돼지 아데노바이러스의 게놈에 삽입된 이형 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 아데노바이러스 게놈이 혈청형 3 또는 5의 아데노바이러스(PAV-3 또는 PAV-5)로부터 기원한다. 삽입은 바람직하게는 결실을 가지는 E3 부위의 비필수적인 영역에서 이루어진다. 본 발명은 또한 이러한 돼지 아데노바이러스를 포함하는 재조합 돼지 백신 및 생체내에서 복제성을 유지하며 게놈의 비필수적인 부위가 결실된 혈청형 3 또는 5의 돼지 아데노바이러스 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 SEQ ID NO. 5로 지정된 뉴클레오타이드 서열의 전체 또는 일부를 포함하는 DNA 단편에 관한 것이다.

Description

재조합 돼지 아데노바이러스로 이루어지는 바이러스 벡터 및 바이러스 백신 {RECOMBINED PORCINE ADENOVIRUS BASED VIRAL VACCINES AND VECTORS}
본 명세서에 언급된 문헌 및 이들 문헌에서 언급된 문헌들은 본 발명에 참고로 인용된다.
아데노바이러스는 각각의 단부에 역배열 말단 반복 서열을 가지는 선형의 이중가닥 DNA 분자를 함유하는 바이러스이다. 아데노바이러스는 유인원, 소, 양, 돼지, 말, 쥐, 개 및 조류와 같은 다양한 종에 영향을 주는 질병의 원인이 되는 아데노비리데과에 속하는 바이러스이다. 아데노바이러스의 감염은 아데노바이러스의 종과 유형에 따라 뇌염, 폐렴, 신장 장애, 설사 및 간염의 징후에 의해 특정화될 수 있다.
아데노바이러스의 게놈은 종에 따라 서로 다를 수 있다((T. Adrianet al., Arch. Virol. 1986, 91, 277 290), (J. Hamelinet al., J. Clin. Microbiol. 1988, 26, 31-33), (R. Assafet al., Can. J. Comp. Med. 1983, 47, 460-463), (T. Kurokawaet al., J. Virol. 1978, 28, 212-218), (S.-L. Huet al., J. Virol, 1984, 51, 880-883), (L. Zsaket al., Intervirology 1984, 22, 110-114)]. 동물 아데노바이러스는 인간 아데노바아러스와는 달리, 극히 제한된 숙주 범위를 가지며, 흔히 그들과 기원이 같은 종에 속하는 동물에만 감염한다.
첫 번째 돼지 아데노바아러스(PAV)는 1964년에 분리되었다(D. Haiget al., J. Comp. Pathol. 1964, 74, 8184). 그때까지, 5종류의 돼지 아데노바아러스의 혈청형이 동정 및 설명되었다(Hiraharaet al., J. Vet. Sci. 1990, 52, 407-409). 혈청형 1 및 혈청형 2의 아데노바이러스는 설사와 관련 있으며; 혈청형 4의 아데노바아러스는 폐렴 및 뇌염 증후와 관련 있다. 돼지 아데노바이러스는 혈청형 1 내지 혈청형 4의 PAV에 대해 특이적인 항혈청에 의해 교차 중화(cross-neutralization)되지 않기 때문에 제5의 혈청형으로 분류된다. PAV-5의 게놈이 분석되고 제한 지도가 완성되었다(Tubolyet al., Virus Res. 1995, 37, 4954). 이러한 분석에 의해 PAV-5의 제한 지도와 다른 혈청형의 PAV의 제한 지도 사이에 유사성이 없음이 밝혀졌다: PAV-1과 PAV-2(Reddyet al., Arch. Virol. 1995, 140, 195-200), PAV-3(Reddyet al., Intervirology 1993, 36, 161-168)와 PAV-4(Kleiboekeret al., Arch. Virol. 1993, 133, 357-368). 혈청형 3과 5 중에는 돼지에 대해 자연 비병원성인 균주가 존재한다.
PAV의 크기는 대략 32 내지 대략 34 kbp이다. PAV-1 게놈의 크기는 대략 33.5 kbp이다. PAV-2 게놈의 크기는 대략 33.3 kbp이다. PAV-3 바이러스의 완전 서열은 최근에 완성되어 Genbank 데이터 은행에 AF083132 번호로 보관되었다(P. S. Reddyet al., Virol. 1998, 251, 414-426). 이 서열의 크기는 34094 염기쌍(bp)이다. PAV-4 게놈의 크기는 대략 32 kbp이고, PAV-5 게놈의 크기는 대략 33.2 kbp이다. PAV-5의 완전 게놈, 특히 E3 부위는 서열 결정되거나 발표되지 않았다.
아데노바아러스에 대해 고려되는 주요 적용분야는 인간에 대한 유전자 치료 분야이고, 매우 많은 구조체 및 시스템이 제안되었다. 아데노바아러스는 또한 많은 병원성 바이러스로부터 인간 및 동물을 보호하기 위한 면역화 조성물 내의 재조합 벡터로서 제안되었다.
현재까지, 재조합 아데노바아러스 벡터를 제작하기 위한 두 가지 방법이 개발되었다(M. Eloit & M. Adam, J. Gen. Virol. 1995, 76, 1583-1589).
첫 번째 방법은 발현 카세트를 아데노바아러스의 복제에 필수적인 부위에 삽입하는 것이기 때문에, 동시에 바이러스의 복제를 확실하게 할 수 있도록 트랜스 상보 시스템(transcomplementation system)을 개발해야 한다. 돼지 아데노바아러스의 경우에는 E1 부위가 삽입 자리로서 제안되었다(P. S. Reddyet al., Virus Res., 1998, 58, 97-106). 이렇게 제작된 재조합 벡터는 그들이 투여되는 숙주 내에서 복제할 수 없기 때문에 "비복제성"이라 부른다.
상기 첫 번째 방법의 변형으로서, 표적 동물 내에서 비복제성인 바이러스를 사용할 수 있다. 특히, PRV gD 발현 카세트는 이미 돼지 내에서 비복제성인 혈청형 5의 인간 아데노바아러스의 E1A 자리로 삽입되었다(M. Monteilet al., J. Gen. Virol. 1997, 78, 3303-3310.; A. Ambriovicet al., Virol. 1997, 238, 327-335).
두 번째 방법은 아데노바이러스의 복제에 필수적이지 않은 바이러스 게놈의 부위에 발현 카세트를 삽입하는 것이다. 이러한 두 번째 방법은 아데노바이러스 내의 비필수적인 부위 및 단단한 캡시드의 존재를 결정하는 데에 있어서의 어려움으로 인해 수행하기 어렵다.
특히, 아데노바아러스의 필수적인 특징 중 하나는 그 내부에 캡슐화될 수 있는 DNA 분자의 크기를 엄격히 제한하는 단단한 캡시드를 갖는다는 것이다. 일반적으로, 이러한 캡시드는 게놈의 크기에 따라 대략 1.7 내지 대략 3.9 kbp의 삽입체에 상응하는 게놈 크기의 105% 내지 114%에 해당하는 DNA 분자를 캡슐화할 수 있는 것으로 여겨진다. 크기가 지나치게 큰 경우에는 재조합 게놈 내에서 원치 않는 결실 및/또는 재배열이 발생할 수 있다.
E3 부위는 다양한 혈청형의 돼지 아데노바아러스 사이에서 크기 면이나 주어진 한 종의 아데노바아러스에서 다른 종의 아데노바이러스에 이르는 유전자 기구의 면에서 보존되지 않았다(S. Kleiboeker, Virus Res. 1994, 31, 17-25).
PAV-3 바이러스의 E3 부위의 크기는 1179 염기쌍이다. 이것은 적어도 3개의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 코딩하는 복합적인 부위이다. 이들 ORF는 서로 중첩되고 제1 ORF는 필수 단백질인 pVⅢ 단백질을 코딩하는 유전자와 부분적으로 중첩된다(P. S. Reddyet al., Virus Res. 1995, 36, 97-106).
E3 부위 내의 이러한 중첩 ORF의 존재는 삽입 자리 및/또는 결실이 돼지 내에서 재조합 아데노바아러스가 복제성을 유지하는 지를 제한하는 지를 결정하는 데 있어서의 큰 어려움을 의미한다.
E3 부위의 제2 ORF에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 PAV-3 아데노바아러스와 (혈청형 2의 인간 아데노바아러스인) HAV-2 아데노바아러스뿐 아니라 현재까지 알려진 그 어떤 다른 아데노바아러스 단백질 사이에 상동성이 전혀 없는 것으로 밝혀졌다(P. S. Reddyet al., Virus Res. 1995, 36, 97-106). PAV-3 내 E3 부위의 제1 ORF의 뉴클레오타이드 서열로부터 예상되는 아미노산 서열은 혈청형 2의 개 아데노바이러스(CAV-2)의 아미노산 서열과 단지 33.3%의 동일성을 갖는다. 그러나, 상동성이 없는 다양한 아데노바이러스 유래의 E3 부위에 의해 코딩되는 단백질뿐 아니라 E3 부위의 ORF에 의해 코딩되는 단백질 또한 PAV-3 및 PAV-4 아데노바아러스간에 상동성을 전혀 나타내지 않았다(S. B. Kleiboeker, Virus, Res. 1994, 31, 17-25).
E3 부위의 크기는 (5개의 ORF를 함유하는) PAV-1 내에서는 1162 bp이고; (5개의 ORF를 함유하는) PAV-2 내에서는 1222 bp이고(P. S. Reddyet al., Virus Res. 1996, 43, 99-109); (6개의 ORF를 함유하는) PAV-4 내에서는 1879 bp이다. 단지 (13.2 kDa의 단백질에 상응하는) PAV-4 바이러스의 E3 부위의 제4 ORF만이 5형의 인간 아데노바이러스(인간 아데노바이러스 5 또는 HAV-5라 알려짐)의 14.7 kDa의 단백질을 코딩하는 E3 부위의 공지된 다른 ORF와 상동성을 나타낸다. PAV-4의 E3 부위는 다른 돼지 아데노바이러스의 E3 부위, 특히 PAV-3 및 PAV-5의 E3 부위에 대해 서열 상동성을 전혀 나타내지 않는다.
생체내 복제성을 보존하기 위한 그들의 제한사항을 밝히는데 있어서의 어려움 외에도, E3 부위 내에서의 결실에는 위험이 없지 않다. 사실, E3 부위 내에서의 결실은 재조합 아데노바이러스의 병원성에 있어 중요할 수 있다. 따라서, HAV-5 바이러스의 E3 부위 내에서의 결실은 코튼 래트(cotton rat)의 감염 실험 모델 내에서 이 바이러스의 폐에 대한 병원성을 증가시키는 것으로 관찰되었다(Ginsberget al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 86, 3823-3827).
이는 아데노바이러스의 E3 부위 내에서의 결실의 중요성은 경우에 따라 특정 아데노바이러스와 다른 특정 아데노바이러스 상에서 관찰된 결과들을 단순히 전치하지 않고 고려되어야 한다. PAV-3의 E3 부위의 유전자 기구는 PAV-5의 E3 부위의 유전자 기구와 같이 독특하다.
E3 부위 내에서의 삽입 자리의 정확한 위치는 아데노바이러스의 특징인 복잡한 스플라이싱 영역 및 폴리아데닐화 영역이 존재한다는 사실에 의해 더욱 복잡해진다(Imperialset al., Curr. Top. Microbial. Immunol. 1995, 199, 139-171). E3 부위 내에 위치하는 스플라이싱 영역은 E3 부위의 외부에 위치하는 서열에 의해 코딩되는 많은 필수 전령 RNA의 성숙에 있어 중요하다. E3 부위는 그 자체가 높은 전사 활성을 나타내는 바이러스 게놈의 한 부분에 존재한다(P. Sharp, 1984, in The Adenovirus, Ed. H. S. Ginsberg, Plenun Press, New York and London, 173-204). E3 부위로의 이형 뉴클레오타이드 서열의 삽입은 재조합 바이러스의 생물학적 활성에 대해 부정적인 영향을 준다. 게다가, E3 부위는 주된 후기 프로모터(MLP)의 하류에 위치하고, 이 부위가 삽입체의 전사와 MLP 프로모터에 의해 개시되는 전사 사이의 간섭이 입증되는 부위이다(Xuet al., J. Gen. Virol. 1995, 76, 1971-1980).
따라서, 다른 종(인간, 소, 양 등)으로부터 기원하는 아데노바이러스에 의해 얻어진 결과는 돼지 아데노바이러스로 전치될 수 없다. 따라서, 지금까지 돼지 아데노바이러스로부터는 복제성 재조합 벡터가 전혀 생산되지 않았다.
본 발명은 이형 뉴클레오타이드 서열의 삽입에 의해 재조합된 혈청형 3 및 혈청형 5의 돼지 아데노바이러스에 관한 것으로서, 이들 아데노바아러스는 이러한 이형 서열을 생체 내에서 자율적으로 복제 및 발현할 수 있다. 또한, 본 발명은 얻어지는 돼지 백신, 이것을 사용하여 돼지를 면역화하는 방법, 결실된 복제성 아데노바이러스 벡터와 이러한 아데노바이러스, 백신 및 벡터를 얻는 방법에 관한 것이다.
도 1은 pKS-Right ITR3, pPolyⅡ-Right ITR3 및 pITRsPAV3 플라스미드의 모식도.
도 2는 pE3PAV3, pE3dl622CMV-EGFP 및 pE3dl622CMV-gD 플라스미드의 모식도.
도 3은 pE3PAV3 및 pE3dl919 플라스미드의 모식도.
도 4는 pCMV-EGFP, pCMV-gD 및 pgD 플라스미드의 모식도.
도 5는 pCMV-EGFP, pgD, pE3dl919CMV-EGFP 및 pE3dl919CMV-gD 플라스미드의 모식도.
도 6은 pE3dl622EGFP 및 pE3dl919EGFP 플라스미드의 모식도.
도 7은 pE3dl622gD 및 pE3dl919CMV-gD 플라스미드의 모식도.
도 8은 pCR-Right ITR5, pCR-Left ITR5, pPolyⅡ-Right ITR5 및 pITR-PAV5 플라스미드의 모식도.
도 9는 pE3PAV5 플라스미드의 제한 지도.
도 10은 pE3dl1472CMV-EGFP 및 pE3dl1472CMV-gD 플라스미드의 제한 지도.
도 11은 pE3dl1472EGFP 및 pE3dl1472gD 플라스미드의 제한 지도.
도 12는 BamHI으로 절단된 PAV-5의 물리적 지도.
도 13은 5614 염기쌍의 서열(PAV-5 바이러스의 E3 부위 및 인접 서열).
서열 목록
SEQ ID NO 1: 올리고뉴클레오타이드 ITRPAV3
SEQ ID NO 2: 올리고뉴클레오타이드 T3
SEQ ID NO 3: 올리고뉴클레오타이드 T7
SEQ ID NO 4: 올리고뉴클레오타이드 ITRPAV5
SEQ ID NO 5: pav-5 바이러스의 E3 부위의 서열
본 발명의 목적은 출원인은 생체내 복제에 대한 능력을 실질적으로 변형시키지 않고 이형 유전자를 PAV-3 및 PAV-5 바이러스의 게놈에 삽입하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 이러한 복제 능력에 대한 의심의 여지없이, 바이러스로의 삽입 능력을 증가시키기 위하여 결실될 수 있는 삽입 부위를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 생체 내에서 복제 능력을 보존하는 재조합 PAV-3 및 PAV-5 바이러스를 제공하여, 이들을 점막을 통해 및/또는 모계 기원의 항체의 존재 하에서 투여되는 백신을 포함하는 생균 재조합 백신으로서 사용할 수 있도록 하는 것이다.
본 출원인은 생체 내에서 복제 능력을 보존하는 동시에 PAV-3 및 PAV-5의 E3 부위를 변형하는 데에 성공하였다. 또한, 출원인은 상기 부위에 삽입된 유전자의 생체내 발현을 증명할 수 있다. 이로써, PAV-3 및 PAV-5를 복제성 발현 벡터로서 사용할 수 있게 되었다.
따라서, 본 발명의 대상은 얻어진 재조합 바이러스가 돼지의 생체 내에서 복제되고 삽입된 서열을 발현할 수 있는 조건 하에서, PAV-3 또는 PAV-5의 게놈에 삽입된 적어도 하나의 이형 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 혈청형 3 또는 5의 돼지 아데노바이러스이다. 이들 변형 바이러스는 백신 접종 면에서 상당한 이점을 가지며, 특히 모계 항체의 존재 하에서 더욱 효과적이기 때문에 점막을 통해 효과적으로 사용될 수 있다.
바람직하게는, 이형 서열은 삽입 영역이 결실된 게놈, 특히 E3 영역의 비필수적인 부위에 삽입된다. "영역의 결실"이란 표현은 삽입 영역의 전체적 또는 부분적 결신, 바람직하게는 전체적 결실을 의미한다. 바꾸어 말하면, 이형 서열은 삽입 영역의 전체 또는 일부 지점, 바람직하게는 삽입 영역의 전체 지점에 삽입된다.
PAV-3에 있어서, E3 삽입에 바람직한 영역은 P. S. Reddy 등에 의해 Virus Research(1995), 36-97-106에 발표된 서열의 뉴클레오타이드 706 내지 1624의 전체 또는 일부를 포함하는 영역이며, 이것은 GenBank AN # U10433에 발표된 서열의 27,794 내지 28,712 위치에 해당한다. 바꾸어 말하면, 상기 삽입 영역 및 이것의 결실 가능한 영역은 서열 706 내지 1624의 전체 또는 일부만을 포함할 수 있고/있거나, E3 내에서 한계범위 706 및/또는 한계범위 1624를 넘어 확장될 수 있고, 선택적으로 E3 전체를 포함할 수 있다. 상기 영역은 E3, 뉴클레오타이드 706 내지 1624, 뉴클레오타이드 1002 내지 1624 또는 서열 706 내지 1002의 전체 또는 일부로 이루어지거나 포함하는 것이 바람직하다. 특히, 이것은 적어도 서열 1002 내지 1624를 포함한다.
PVA-5에 있어서, E3는 SEQ ID No. 5에서 뉴클레오타이드 서열 2382 내지 4042로 한정된다. 삽입 영역 및 이것의 결실 가능한 영역은 E3를 포함하며, SEQ ID No. 5의 뉴클레오타이드 2064 내지 4083의 전체 또는 일부, 예를 들면 뉴클레오타이드 2389 내지 3861의 전체 또는 일부를 포함한다(도 13). 바꾸어 말하면, 상기 삽입 영역 및 이것의 결실 가능한 영역은 서열 2389 내지 3861의 일부만을 포함할 수 있고/있거나, E3 내에서 한계범위 2389 및/또는 한계범위 3861 밖으로 확장될 수 있고, 선택적으로 E3 전체를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드 4083을 포함하는 곳까지 결실되는 경우에는 스플라이싱 수용체 자리는 뉴클레오타이드 4083의 위치에 삽입되는 것이 바람직하다. 상기 삽입 영역은 본질적으로 뉴클레오타이드 2389 내지 3861로 이루어지는 것이 바람직하다.
물론, 본 발명은 PAV-3 및 PAV-5의 다른 균주의 뉴클레오타이드 서열, 즉 본 발명에 따른 참조 균주의 뉴클레오타이드 서열과 다른 서열에 의해 한정되는 해당 영역으로 삽입되는 것도 포함한다.
또한, 본 발명의 대상은 돼지의 생체 내에서 복제성을 유지하는 동시에, 크기 면에서 탁월한 삽입 능력을 가지는 PAV-3 또는 PAV-5 바이러스이다. 숙주 내에서 복제 특성을 유지하는 것은 특히 면역화 조성물을 점막을 통해 및/또는 모계 기원의 항체의 존재 하에서 사용하여 최적의 보호 효과를 얻는 데에 요구된다.
삽입 능력은 예를 들면 E3 부위의 전체 또는 일부의 결실에 의해 증대되며, 결실될 수 있는 E3의 부분은 pVⅢ 단백질을 코딩하는 유전자와 섬유를 코딩하는 유전자 사이에 위치한다. 특히, 본 발명은 재조합 바이러스의 복제성을 보존하는 동시에 PAV-3 바이러스의 E3 부위 내에서 이루어질 수 있는 622 bp 및 919 bp의 결실을 설명한다(실시예 6 내지 10 참조). 본 발명은 또한 재조합 바이러스의 동일한 표현형 특징으로 귀결되는 PAV-5 바이러스의 E3 부위 내에서의 1472 bp의 결실에 대해 설명한다.
본 발명에 따라 얻어지는 재조합 PAV-3 또는 PAV-5 아데노바이러스는 PAV-3 바이러스의 경우는 최대 대략 3.0 kbp 및 PAV-5 바이러스의 경우에는 대략 3.5kbp를 삽입하여 돼지 내에서 이것을 발현시키는 데에 유용하게 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 대상은 복제성을 유지하는 동시에, 특히 E3 부위가 결실된, 특히 상기 영역이 결실된, 즉 고려되는 영역의 전체 또는 일부, 바람직하게는 이 영역의 전체가 결실된 PAV-3 및 PAV-5 벡터이다.
삽입될 수 있는 이형 뉴클레오타이드 서열은 면역원 또는 면역학적으로 활성힌 면역원의 단편, 예를 들면 에피토프를 코딩하는 서열, 특히 돼지 병원체의 면역원을 코딩하는 유전자 또는 유전자의 단편(예를 들면, 에피토프)이다.
물론, 본 발명의 범위 내에서 하나 이상의 이형 서열이 동일한 바이러스로 삽입될 수 있다. 특히, 동일한 바이러스 또는 이종 바이러스로부터 기원된 이형 서열이 동일한 바이러스에 삽입될 수 있다.
하나의 특정한 방법에 따르면, 동일한 병원체 또는 "폴리에피토프 서열"이라 알려진 이종 병원체로부터 기원된 여러 종류의 단편 또는 에피토프를 조합한 인공 서열을 삽입할 수 있다. 후자의 경우, 폴리에피토프 서열은 단일 프로모터의 조절 하에 놓인다.
또한, 면역 조절인자, 특히 사이토카인, 바람직하게는 돼지의 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(poGM-CSF), 돼지의 인터루킨 4(poIL-4), 돼지의 IL-12 또는 돼지의 IL-18과 같은 돼지의 사이토카인을 코딩하는 서열을 삽입할 수 있다.
또한, 삽입 유전자 자리에 삽입된 몇몇 이형 유전자는 특히, 돼지의 소포성 질환 바이러스(SVDV; B. F Chenet al., J. Virology, 1993, 67, 2142-2148), 뇌심근염 바이러스(EMCV; R. J Kaufmanet al., Nucleic Acids Research, 1991, 19, 4485-4490) 또는 구제역 바이러스(FMDV; N. Luz and E. Beck, J. Virology, 1991, 65, 6486-6494)와 같은 피코나바이러스, 또는 다른 기원으로부터 유래되는 "IRES"(내부 리보솜 삽입 자리)라 알려진 서열을 삽입함으로써 발현될 수 있다. 당업자는 인용된 세 논문의 내용을 참조할 수 있다. 따라서, 두 유전자에 대한 발현 카세트는 프로모터(선택적)-유전자 1-IRES-유전자 2-폴리아데닐화 신호의 최소 구조를 가질 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 생균 재조합 백신은 삽입 유전자 자리에 삽입된, 프로모터, IRES에 의해 한쌍으로 분리된 둘 이상의 유전자 및 폴리아데닐화 신호를 연속적으로 포함하는 발현 카세트를 포함할 수 있다.
돼지의 병원체는 특히 Aujeszky병 바이러스(PRV 또는 가성 광견병 바이러스), 돼지의 인플루엔자 바이러스(SIV), 돼지의 생식성 및 호흡성 증후 바이러스(PRRS), 파보바이러스병 바이러스(PPV 바이러스), 사육돼지 콜레라 바이러스(HCV), 돼지 서코바이러스, 특히 2형 돼지 서코바이러스(돼지 서코바이러스 2형, PCV2 또는 새끼 돼지 전신 소모성 증후 바이러스),Actinobacillus pleuropneumoniae및Mycoplasma hyopneumoniae로 이루어지는 군으로부터 선택되는바이러스, 박테리아 및 기생충이다.
Aujeszky 결합가(valency)에 있어서는, 천연 형태 또는 분비된 형태의 gB 유전자(Robbins A.K.et al.,J. Virol. 1987, 61, 2691-2701 GenBank AN M17321), gC 유전자(Ishikawa K.et al., Vet. Microbiol. 1996, 49, 267-272 GenBank AN # D49435) 및/또는 gD 유전자(Riviere M.et al.J.Virol. 1992, 66, 3424-3434 and Hong W.Z.et al., GenBank AN AF086702)를 사용할 수 있다.
돼지의 인플루엔자 결합가에 있어서는, (천연 형태 또는 분비된 형태의) HA 유전자(WO-A98/03658, 실시예 10 및 12), (천연 형태 또는 분비된 형태의) NA 유전자(Nerome K.et al., J. Gen. Virol. 1995, 76, 613-624 GenBank,, AN # D21194) 및/또는 NP 유전자(WO-A-98/03658, 실시예 11 및 13)를 사용하는 것이 바람직하다.
PRRS 결합가에 있어서는, 유럽 인종(Meulenberg J.et al., Virology, 1993, 192, 62-72) 및 아메리카 인종(Mardassi H.et al., Arch. Virol. 1995, 140, 1405-1418) 유래의 ORF3 유전자(천연 형태 또는 분비된 형태), ORF5 유전자(천연 형태 또는 분비된 형태), ORF6 유전자 및 ORF7 유전자를 사용하는 것이 바람직하다.
새끼 돼지 콜레라 결합가에 있어서는, EO 유전자, E1 유전자(천연 형태 또는 분비된 형태) 및/또는 E2 유전자(천연 형태 또는 분비된 형태)(Meyers G.et al., Virology, 1989, 171, 18-27)를 사용하는 것이 바람직하다.
파보바이러스병 결합가에 있어서는, VP2 캡시드 유전자(Vasudevacharya J.et al., Virology, 1990, 178, 611-616)를 사용하는 것이 바람직하다.
PCV2 결합가에 있어서는, ORF1 및/또는 ORF2 유전자(Meehan B.et al., J. Gen. Virol. 1998, 79, 2171-2179)를 사용하는 것이 바람직하다.
이형 서열은 바람직하게는 재조합하는 동안 도입되는 전사 조절 신호, 특히 프로모터의 조절 하에서 삽입된다. 그러나, 벡터로 작용하는 아데노바이러스에 대해 고유한 신호의 조절 하에서 이루어지는 이들 이형 서열의 발현은 배제되지 않는다.
바람직하게 사용되는 유용한 프로모터는 로우스(Rous) 육종 바이러스 LTR과 같은 진핵생물의 강력한 프로모터, 바람직하게는 특히 쥐 기원(MCMV-IE) 또는 인간 기원(HCMV-IE)의 세포확대 바이러스 초기(cytomegalovirus immediate-early; CMV-IE) 프로모터 또는 예를 들면 돼지, 원숭이, 래트 또는 기니아 돼지와 같은 기타 기원의 세포 확대 바이러스 매개의 초기 바이러스이다.
특히 유용한 방식에서, CMV-IE 프로모터는 인핸서(enhancer)와 함께 사용될 수 있다(UA-A-5,168,062, US-A-4,969,615, US-A-4,963,481). 프로모터 활성을 보존하는 이들 프로모터의 단편을 인핸서, 예를 들면, WO-A-98/0-0166에 따른 절단된 CMV-IE 프로모터와 함께 사용하는 것이 유용할 수 있다. 보다 상세한 내용은 WO-A-98/00166, 특히 그 실시예 12를 참조할 수 있다.
본 발명의 대상은 수의학적 관점에서 허용 가능한 부형제(vehicle) 또는 보형약(exipient) 내에 본 발명에 따른 재조합 아데노바아러스 및 선택적으로 면역 보강제(adjuvant)를 포함하는 면역원성 또는 면역학적 제제 및 돼지 백신이다. 정의에 의하면, 면역원성 또는 면역학적 제제는 동물에게 투여된 후 적어도 멱역 반응(세포성 및/또는 체액성)을 유도한다. 백신은 보호 반응을 유도한다.
면역 보강제는 아크릴산 또는 메타크릴산 폴리머 및 말레산 무수물과 알케닐 유도체의 코폴리머로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
바람직한 화합물은 특히 당 또는 다가 알콜의 폴리알케닐 에테르와 교차결합된 아크릴산 또는 메타크릴산 폴리머이다. 이들 화합물은 소위 "카르보머(carbomer)"라 알려져 있다(Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996). 당업자는 적어도 3개, 바람직하게는 8개 이상의 하이드록시기를 함유하는 폴리하이드록시 화합물과 교차결합된 이러한 아크릴산 폴리머가 기재되어 있는 US-A-2 909 462를 참조할 수 있으며, 여기서 적어도 3개의 하이드록시기의 수소 원자는 적어도 2개의 탄소 원자를 함유하는 불포화 지방족 라디칼로 대체된다. 바람직한 라디칼은 2개 내지 4개의 탄소 원자를 함유하는 라디칼, 예를 들면 비닐, 알릴 및 기타 에틸렌계 불포화 기이다. 불포화 라디칼은 그 자체가 메틸과 같은 다른 치환기를 함유할 수 있다. 상품명 Carbopol(R)(BF Goodrich, Ohio, USA)의 제품이 특히 적합하다. 이것들은 알릴 수크로오스 또는 알릴펜타에리트리톨과 교차결합되어 있다. 이들 중, Carbopol(R)974P, 934P 및 971P를 예로 들 수 있다.
말레산 무수물과 알케닐 유도체의 코폴리머 중에서, 선형 또는 교차결합, 예를 들면 디비닐 에테르와 교차결합된 말레산 무수물과 에틸렌의 코폴리머인 EMAs(R)(Monsanto)가 바람직하다. J. Fields 등의 Nature, 186, 778-780(June 4, 1960)을 참조할 수 있다.
구조 면에서, 아크릴산 또는 메타크릴산 폴리머 및 EMAs(R)은 하기 화학식의 기본 단위로부터 형성되는 것이 바람직하다:
상기 식에서,
R1및 R2는 동일 또는 상이할 수 있고 H 또는 CH3를 의미하며;
x는 0 또는 1, 바람직하게는 1이고;
y는 1 또는 2이고, 이때 x + y = 2이다.
EMAs(R)의 경우, x는 0이고, y는 2이다. 카르보머의 경우, x와 y는 1이다.
물에 대한 이들 폴리머의 용해는 바람직하게는 생리 pH로 중화될 산성 용액을 제공하며, 이는 실제 백신이 혼입되는 면역 보강제 용액을 제공한다. 이어서, 폴리머의 카르복시기는 부분적으로 COO-형태가 된다.
본 발명에 따른 면역 보강제 용액, 특히 카르보머 용액은 특히 염화나트륨 존재 하의 증류수 내에서 제조되는 것이 바람직하고, 이때 얻어진 용액은 산성 pH를 갖는다. 이러한 원액(stock solution)은 바람직하게는 NaOH를 사용하여 한 단계 이상의 단계로 동시에 또는 후속하여 중화(pH 7.3 내지 7.4)되는, (원하는 최종 농도를 얻는데) 요구되는 양 또는 다량의 NaCl을 함유하는 물, 바람직하게는 생리식염수(6 g/ℓ NaCl)에 원액을 첨가하여 희석한다.
생리 pH의 상기 용액은 추가의 변형 없이 특히 동결 건조 형태로 저장된 백신을 녹이는 데 사용될 것이다.
최종 면역화 조성물 내에서의 폴리머의 농도는 0.01 w/v% 내지 2 w/v%, 보다 구체적으로는 0.06 w/v% 내지 1 w/v%, 바람직하게는 0.1 w/v% 내지 0.6 w/v%가 될 것이다.
본 발명에 따른 면역원성 제제 및 백신은 동일 및/또는 상이한 병원균으로부터 기원된 상이한 이형 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 본 발명에 따른 여러 종류의 재조합 아데노바아러스를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 대상은 하나 이상의 돼지 병원균에 대항하여 돼지를 면역화 또는 백신 접종하는 방법으로서, 상기 방법은 유효량의 상기 면역원성 제제 및 백신을 투여하는 단계를 포함한다. 투여량은 예를 들면 104내지 107CCID50일 것이다.
본 발명은 특히 이들 면역원성 제제 및 백신을 점막을 통해, 예를 들면 경구, 비강 또는 안구를 통해 투여하는 것 및/또는 모계 항체를 나타내는 어린 동물에게 투여하는 것에 관한 것이다. 또한, 돼지에게 백신 접종하기 위해 통상적으로 사용되는 그 밖의 경로(근육내, 특히 피내 등)가 사용될 수 있다.
본 발명의 대상은 또한 재조합 PAV-3 및 PAV-5 벡터와 이들을 포함하는 면역원성 제제 및 백신을 얻는 방법이다.
또한, 본 발명의 대상은 특히, 점막 투여 및/또는 모계 항체를 나타내는 어린 동물에게 투여하고/투여하거나 통상적인 경로를 통해 투여하고자 하는 목적의 본 발명에 따른 면역원성 제제 및 백신을 제조하기 위한 이들 벡터의 용도이다.
본 발명의 대상은 E3를 포함하며, 본 발명에 사용된 특정 균주 내에서 참조번호 SEQ ID NO. 5의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 PAV-5 DNA 단편이다. 본 발명은 또한 상기 서열의 임의의 단편, 특히 PAV-5 특이성을 보존하는 임의의 단편에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 대상은 본 발명 사용된 특정 균주 내에서 뉴클레오타이드 2382 내지 4042 및 그들의 단편, 특히 본 발명에사용된 특정 균주 내에서 뉴클레오타이드 2382 내지 4042로 한정된 PAV-5의 E3 서열 또는 이들의 단편, 특히 SEQ ID NO. 5의 2389 내지 3861 서열의 전체 또는 일부이다. 본 발명이 등가의 서열, 즉 PAV-5 균주의 작용성 또는 제시된 서열 특이성을 변화시키지 않는 서열이나 이들 서열에 의해 코딩되는 폴리펩타이드를 자동적으로 포함하는 것은 말할 나위 없이 당연한 사실이다. 물론, 코드의 축퇴(degeneracy)에 의해 변경된 서열도 여기에 포함된다.
본 발명은 또한 매우 엄격한 조건 하에서 서열에 혼성화할 수 있다는 점 및/또는 그들이 본 발명의 균주에 대해 큰 상동성, 특히 85% 이상, 보다 구체적으로 90%, 더욱 구체적으로 95% 이상의 상동성을 갖는다는 점에서 동등한 PAV-5에 대해 특이적인 서열을 포함한다.
본 발명은 비제한적인 실시예를 통해 주어진 구현예 및 도면을 참조하여 보다 상세히 설명된다.
실시예 1: 세포 및 바이러스
세포 배지 및 반응물은 Gibco BRL로부터 구입하였다. 배지(Glutamax-1 Cat # 61965-026을 함유하는 Dulbeco's MEM)에 1 mM의 소듐 피루베이트(Cat # 11360-039), 젠타마이신(50 ㎕/㎖, Cat # 15710-031) 및 10%의 태아 소의 혈청(Cat # 10270-106 batch 40Q5774K)을 첨가하였다.
바이러스 배양을 위해서는 PK-15 세포(ATCC No. CCL33) 및 ST 세포(ATCC No. CRL 1756)를 사용하였다.
돼지 내에서 비병원성인 정상의 3형 돼지 아데노바이러스(PAV-3)는 Eva Nagy 박사의 실험실(University of Guelph, Pathobiology Department, 50 Stone Road Guelph, Ontario, Canada, NIG 2W1)로부터 얻었다(Reddy P.et al., Virus Res. 1996, 43, 99-109).
돼지 내에서 비병원성인 정상의 5형 돼지 아데노바이러스(PAV-5)는 Tadashi Hirahara 박사의 실험실(Kyoto Biken Laboratories Inc., Division of Veterinary Microbiology 24-16 Makishima-cho, Uji-shi, Kyoto, 611 Japan)로부터 얻었다(Hirahara T.et al, J. Vet. Sci. 1990, 52, 407-409).
배지 및 배지교체 조건: 1주당 2회에 걸쳐 세포에 트립신(Earl의 균형화 염용액(Gibco-BRL Cat # 14155-030) 내에서 50배 희석된 2.5%의 트립신 용액(Sigma Cat # 044-5075))을 처리하고, 배지 내에서 재현탁한다(희석 1:6). 세포를 재배양하기 전에 5% CO2존재 하의 +37℃에서 배양한다.
실시예 2: 효소, 박테리아, 플라스미드 및 분자 생물학적 방법
제한 효소, 사슬 증폭 반응용 Tag 폴리머라아제 및 바이러스 DNA 변형에 요구되는 기타 효소는 각각 New England Biolabs Inc., Roche Diagnostics 및 Gibco-BRL로부터 구입하였다.
이들 모든 효소는 제조자의 지침에 따라 사용하였다. 표준 분자 생물학적 방법은 "Molecular Biology: A Laboratory Manual" 2판(Sambrooket al., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989)에 기재된 바에 따라 수행하였다.
BJ5183 유효 박테리아(Hanahan D., J. Mol. Biol. 1983, 166, 557-580)를 다음과 같이 제조하였다:
대수 증식기(exponential phase)의 상기 BJ5183 유효 박테리아의 배지 60 ㎖을 염화칼슘법(Sambrooket al., 1989)에 따라 제조하였다. 최종 부피 2 ㎖의 50 mM CaCl2에서 이들 박테리아 배양균을 수확하였다. 300 ㎕의 상기 박테리아 현탁액을 100 ㎕ 부피의 100 mM 트리스-HCl(pH 7.4) 내에 함유된 다양한 이형 재조합 파트너 DNA와 혼합한 뒤, 융해 얼음 상에서 접촉된 상태로 30분간 방치한 후, +45℃에서 2분간 박테리아에 열 충격을 가하고, 융해 얼음 상에 10분간 방치하고, 끝으로 선택 배지 상에 플레이팅하였다.
실시예 3: PAV-3 및 PAV-5 바이러스 DNA의 추출
실시예 1 조건 하의 10 cm2Falcon 플라스크 내에서 바이러스를 배양 및 증폭시켰다. CPE가 완성되었을 때, 세포를 수확하고, 3사이클의 냉동/해동을 반복하여 용균시킨 후, 저속 원심분리를 통해 바이러스 현탁액을 정화하였다. 염화세슘 구배(1.34 g/㎖) 상에서 PAV-3 및 PAV-5 바이러스를 정제하고, 바이러스 밴드를 수확하여 정화한 뒤, 프로테이나아제 K를 처리하고 페놀/클로로포름을 사용해 추출한 후 바이러스 DNA를 얻었다(Sambrooket al., 1989). 이어서, 상기 DNA를 다양한 클로닝 또는 폴리머라아제 사슬 증폭(PCA) 단계에 사용하였다.
실시예 4: "pITRs PAV3" 플라스미드의 제작
실시예 3에 따라 제조된 PAV-3 바이러스의 게놈 DNA를 EcoRI을 사용해 분해시키고, 아가로스 겔 전기영동 후 245 bp의 EcoRI D 단편을 분리하였다. 이어서, EcoRI로 미리 분해된 탈인산화 pBlueScript KS 플라스미드(pBS-KS)(Stratagene Inc. La Jolla, CA)(GenBank # X52327)와 결찰시켜 "pKS-EcoDPAV3"라 불리는 플라스미드를 얻었다.
pKS-EcoDPAV3 플라스미드 매트릭스와 하기의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 PCA 반응을 수행하였다:
ITRPAV3 (SEQ ID NO: 1)(50량체):
5'CCTTAATTAAGGTAGGGATAACAGGGTAATCATCATCAATAATATACCGC 3'; 및
T3 (SEQ ID NO: 2)(20량체):
5'ATTAACCCTCACTAAAGGGA 3'.
증폭 산물(367 bp)에 T4 DNA 폴리머라아제를 처리하여 말단을 두 가닥으로 만든 뒤, ClaI 효소를 사용해 분해시키고, pBS-KS 플라스미드와 결찰시킨 후, ClaI 및 EcoRV를 사용해 사전 분해시켜 "pKS-Right ITR3"라 불리는 플라스미드를 얻었다(도 1).
이이서, BamHI 및 KpnI 효소를 사용해 분해시킴으로써 pKS-Right ITR3 플라스미드로부터 EcoRI D 단편을 유리시키고, 353 bp의 BamHI-KpnI 제한 단편을 pPolyⅡ 플라스미드(Lathe R.et al., Gene, 1987, 57, 193-201)에 결찰시키고, BamHI 및 KpnI을 사용해 사전 분해시켜 "pPolyⅡ-Right ITR3"라 불리는 플라스미드를 얻었다(도 1). 아가로스 겔 전기영동 후 939 bp의 KpnI F 말단 단편을 분리하기 위하여 실시예 3에 다라 제조된 PAV-3 바이러스의 게놈 DNA를 KpnI으로 분해시켰다. 상기 단편을 pBS-KS 플라스미드에 결찰시키고, KpnI을 사용해 사전 분해시킨 뒤, 탈인산화하여 "pKS-KpnFPAV3"라 불리는 플라스미드를 얻었다.
이어서, pKS-KpnFPAV3 플라스미드 매트릭스와 하기 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 PCA 반응을 수행하였다:
ITRPAV3 (SEQ ID NO: 1)(50량체):
5'CCTTAATTAAGGTAGGGATAACAGGGTAATCATCATCAATAATATACCGC 3'; 및
T3 (SEQ ID NO: 3):
5'TAATACGACTCACTATAGGG 3'.
증폭 산물(1086 bp)에 T4 DNA 폴리머라아제를 처리하여 말단을 두 가닥으로 만든 뒤, XhoI 효소를 사용해 분해시키고 pPolyⅡ-Right ITR3 플라스미드에 결찰시킨 후, BglⅡ를 사용하여 사전 분해시키고, T4 DNA 폴리머라아제를 처리한 다음, XhoI을 사용해 분해시켜 "pITRsPAV3"라 불리는 플라스미드를 얻었다(도 1).
실시예 5: pPAV3 플라스미드의 제작
pITRsPAV3 플라스미드(실시예 4)를 ClaI을 사용해 분해시켜 선형으로 만든 뒤, 실시예 2에 따라 제조된 PAV-3 바이러스의 게놈 DNA와 함께 BJ5183 유효 박테리아 내로 공-형질전환(co-transform)시켰다. 이러한 공-형질전환을 통해Escherichia coli내에서의 상동 재조합(Chartier C.et al., J. Virol. 1996, 70, 4805-4810)에 의해 PAV-3의 완전 클로닝 게놈을 함유하는 플라스미드가 생성되었다. 이 플라스미드를 "pPAV3"라 지정하였다.
실시예 6: PAV-3 셔틀 프라스미드의 제작
6.1. E3 부위 내에 622개 염기쌍의 결실(작은 결실)을 가지는 플라스미드의 제작
pNEB193 플라스미드(New England Biolabs Cat # 305-1)를 PacI을 사용해 분해시키고, T4 DNA 폴리머라아제를 처리한 뒤, 자가 재결찰시켜 "pNEBPac 플라스미드"를 만들었다.
pPAV3 플라스미드(실시예 5)를 KpnI 및 BamHI를 사용하여 분해시켜 E3 부위를 함유하는 4344 bp의 KpnI-BamHI 단편을 분리하였다(Reddyet al., Virology, 1998, 251,414-426). 상기 단편을 pNEBPac 플라스미드에 결찰시키고, KpnI 및 BamHI를 사용해 사전 분해시켜 "pE3PAV3" 플라스미드를 얻었다(도 2). KpnI-BamHI 단편을 조사한 결과, 이들이 Reddy P 등이 발표한 서열(Virus Research, 1995, 36, 97-106 and Virology, 1998, 251, 414-426)과 동일한 것으로 관찰되었다. 당업자는 상기 문헌을 참고할 수 있을 것이다.
다중 결합자(polylinker)를 완전히 제거하기 위하여 pEGFG-F 플라스미드(Chalfie M.et al., Science, 1994, 263, 802-805; Clontech Cat # 6074-1)를 변형시켰다. 이러한 결실은 BamHI를 사용해 분해시킨 후, T4 DNA 폴리머라아제를 처리하여 달성되었다. 이렇게 변형된 벡터의 자가 재결찰을 통해 pCMV-EGFP 플라스미드를 만들었다. 이어서, pCMV-EGFP 플라스미드를 AsnI 및 MluI 효소를 사용하여 분해시킨 뒤, T4 DNA 폴리머라아제를 처리하여 1.6 kbp의 AsnI(이중가닥 말단)-MluI(이중가단 말단) 단편(CMV-EGFP 발현 카세트)을 분리하였다. 상기 단편을 pE3PAV3 플라스미드에 결찰시키고, BsrGI 및 SnaBI를 사용해 사전 분해시킨 뒤, T4 DNA 폴리머라아제를 처리하여 pE3dl622CMV-EGFP 플라스미드를 만들었다(도 2). PAV-3 바이러스의 E3 부위의 BsrGI 및 SnaBI 자리 사이에서 이루어진 결실의 크기는 622 bp이다. 이 결실은 P. Reddy 등에 의해 발표된 서열(Virus Research, 1995, 36, 97-106)(GenBank AN # U10433)의 뉴클레오타이드 1002에서1624로 확장된다.
pCMV-gD 플라스미드(Ambriovic A. et . al., Virology, 1997, 238, 327-335)를 SnaBI 및 ClaI을 사용해 분해시켜 1.8 kbp의 SnaBI-ClaI 단편(CMV 프로모터 및 PRV gD 유전자의 3' 부분 함유)을 분리하였다. 상기 단편에 T4 DNA 폴리머라아제를 처리하여 말단을 이중가닥으로 만든 뒤, pE3dl622CMV-EGFP 플라스미드에 결찰시키고, SnaBI 및 HpaI을 사용하여 사전 분해시켜 pE3dl622CMV-gD 플라스미드를 제작하였다(도 3).
6.2. E3 부위 내에 919개 염기쌍의 결실(작은 결실)을 가지는 플라스미드의 제작
pE3PAV3 플라스미드(상기 6.1 절)를 SgrAI 및 SacI를 사용해 분해시켜 644 bp의 SgrAI-SacI 단편을 분리하였다. 상기 단편에 T4 DNA 폴리머라아제를 처리하여 말단을 이중가닥으로 만든 뒤, pNEBPac 플라스미드(상기 6.1 절)에 결찰시키고, EcoRI을 사용하여 사전 분해시키고, T4 DNA 폴리머라아제를 처리한 후, SacI을 사용해 분해시켜 pSgrAI-SacI 플라스미드를 제작하였다.
pE3PAV3 플라스미드를 SnaBI 및 HindⅢ를 사용해 분해시켜 2.4 kbp의 SnaBI-HindⅢ 단편을 분리하였다. 상기 단편을 pSgrAI-SacI 플라스미드에 결찰시키고, PmeI 및 HindⅢ를 사용해 사전 분해시켜 pE3dl919 플라스미드를 제작하였다(도 3). PAV-3 바이러스의 E3 부위의 ScaI과 SnaBI 자리 사이에서 이루어진 결실의 크기는 919 bp이다. 이 결실은 P. Reddy 등에 의해 발표된 서열(Virus Research, 1995, 36, 97-106)(GenBank An # U10433)의 뉴클레오타이드 706에서 1624로 확장된다.
pCMV-gD 플라스미드(실시예 6.1.)를 SnaBI 및 ClaI을 사용해 분해시켜 1.8 kbp의 SnaBI-ClaI 단편을 분리하였다. 이어서, 상기 단편에 DNA 폴리머라아제의 Klenow 단편을 처리하여 말단을 이중가닥으로 만든 뒤, pCMV-EGFP 플라스미드(실시예 6.1.)에 결찰시키고, SnaBI 및 HpaI을 사용하여 사전 분해시킨 후, 탈인산화하여 pgD 플라스미드를 제작하였다(도 4).
pCMV-EGFP 플라스미드(실시예 6.1.)를 AsnI 및 MluI을 사용해 분해시켜 1.8 kbp의 AsnI-MluI 단편(CMV-EGFP 카세트)을 분리하였다. 상기 단편에 DNA 폴리머라아제의 Klenow 단편을 처리하여 말단을 이중가닥으로 만든 뒤, pE3dl919 플라스미드에 결찰시키고, AscI을 사용하여 사전 분해시키고, DNA 폴리머라아제의 Klenow 단편을 처리하여 말단을 이중가닥으로 만든 후, 탈인산화하여 pE3dl919CMV-EGFP 플라스미드를 제작하였다(도 5).
pgD 플라스미드(상기)를 AsnI 및 MluI을 사용해 분해시켜 2.3 kbp의 AsnI-MluI 단편을 분리하였다. 상기 단편에 T4 DNA 폴리머라아제를 처리하여 말단을 이중가닥으로 만든 뒤, pE3dl919 플라스미드에 결찰시키고, AscI을 사용하여 사전 분해시키고, DNA 폴리머라아제의 Klenow 단편을 처리하여 말단을 이중가닥으로 만든 후, 탈인산화하여 pE3dl919CMV-gD 플라스미드를 제작하였다(도 5).
실시예 7: 재조합 게놈 pPAV3dl622CMV-EGFP 및 pPAV3dl622CMV-gD의 제작
pE3dl622CMV-EGFP 플라스미드(실시예 6.1)를 KpnI 및 BamHI을 사용해 분해시켜 5.5 kbp의 KpnI-BamHI 단편을 분리하였다. 상기 단편을 SnaBI 효소 분해에 의해 미리 선형화된 pPAV3 플라스미드(실시예 5)와 함께 BJ5183 유효 박테리아 내로 공-형질전환(co-transform)시켰다. 이러한 공-형질전환을 통해Escherichia coli내에서의 상동 재조합에 의해 pPAV3dl622CMV-EGFP 플라스미드가 생성되었다.
pE3CMVgD 플라스미드(실시예 6.1)를 EcoRI 및 PmeI을 사용해 분해시켜 6.0 kbp의 EcoRI-PmeI 단편을 분리하였다. 이 단편을 SnaBI 효소 분해에 의해 미리 선형화된 pPAV3 플라스미드(실시예 5)와 함께 BJ5183 유효 박테리아 내에 공-형질전환시켰다. 이러한 공-형질전환을 통해Escherichia coli내에서의 상동 재조합에 의해 pPAV3dl622CMVgD 플라스미드가 생성되었다.
실시예 8: 재조합 게놈 pPAV3dl919CMV-EGFP 및 pPAV3dl919CMV-gD의 제작
pE3dl919CMV-EGFP 플라스미드(실시예 6.2)를 HindⅢ를 사용해 선형으로 만든 뒤, SnaBI 효소 분해에 의해 미리 선형화된 pPAV3 플라스미드(실시예 5)와 함께 BJ5183 유효 박테리아 내에 공-형질전환시켰다. 이러한 공-형질전환을 통해Escherichia coli내에서의 상동 재조합에 의해 pPAV3dl919CMV-EGFP 플라스미드가 생성되었다.
pE3dl919CMV-gD 플라스미드(실시예 6.2)를 HindⅢ를 사용해 선형으로 만든 뒤, SnaBI 효소 분해에 의해 미리 선형화된 pPAV3 플라스미드(실시예 5)와 함께 BJ5183 유효 박테리아 내에 공-형질전환시켰다. 이러한 공-형질전환을 통해Escherichia coli내에서의 상동 재조합에 의해 pPAV3dl919CMV-gD 플라스미드가 생성되었다.
실시예 9: 재조합 게놈 pPAV3dl622EGFP, pPAV3dl622gD, pPAV3dl919EGFP 및 pPAV3dl919gD의 제작(CMV 프로모터 서열을 함유하지 않는 코딩 서열의 삽입)
9.1. pE3dl622EGFP 및 pE3dl919EGFP 플라스미드의 제작
pCMV-EGFP 플라스미드(실시예 6.1.)를 NheI 및 MluI을 사용해 분해시켜 1.0 kbp의 NheI-MluI 단편을 분리하였다. 상기 단편에 DNA 폴리머라아제의 Klenow 단편을 처리하여 말단을 이중가닥으로 만든 뒤, pE3PAV3 플라스미드(실시예 6.1.)에 결찰시키고, BsrGI를 사용해 사전 분해시킨 뒤, DNA 폴리머라아제의 Klenow 단편을 처리한 후, 끝으로 SnaBI을 사용해 분해시켜 pE3dl622EGFP 플라스미드를 제작하였다(도 6).
pCMV-EGFP 플라스미드를 NheI 및 MluI을 사용해 분해시켜 1.0 kbp의 NheI-MluI 단편을 분리하였다. 상기 단편에 DNA 폴리머라아제의 Klenow 단편을 처리하여 말단을 이중가닥으로 만든 뒤, pE3dl919 플라스미드에 결찰시키고, AscI을 사용해 사전 분해시킨 뒤, DNA 폴리머라아제의 Klenow 단편을 처리한 후, 탈인산화하여 pE3dl919EGFP 플라스미드를 제작하였다(도 6).
9.2. pE3dl622gD 및 pE3dl919gD 플라스미드의 제작
pgD 플라스미드(실시예 6.2)를 XhoI 및 ClaI을 사용해 분해시켜 1.5 kbp의 XhoI-ClaI 단편을 분리하였다. 상기 단편에 DNA 폴리머라아제의 Klenow 단편을 처리하여 말단을 이중가닥으로 만든 뒤, pE3PAV3 플라스미드(실시예 6.1)에 결찰시키고, BsrGI를 사용해 사전 분해시킨 다음, DNA 폴리머라아제의 Klenow 단편을 처리한 후, 끝으로 SnaBI을 사용해 분해시켜 pE3dl622gD 플라스미드를 제작하였다(도 7).
pgD 플라스미드(실시예 6.2)를 XhoI 및 ClaI을 사용해 분해시켜 1.5 kbp의 XhoI-ClaI 단편을 분리하였다. 상기 단편에 DNA 폴리머라아제의 Klenow 단편을 처리하여 말단을 이중가닥으로 만든 뒤, pE3dl919 플라스미드(실시예 6.2)에 결찰시키고, AscI을 사용해 사전 분해시킨 뒤, DNA 폴리머라아제의 Klenow 단편을 처리한 후, 끝으로 탈인산화하여 pE3dl919gD 플라스미드를 제작하였다(도 7).
9.3. pPAV3dl622EGFP, pPAV3dl622gD, pPAV3dl919EGFP 및 pPAV3dl919gD 플라스미드의 제작
pE3dl622EGFP 플라스미드(실시예 9.1)를 KpnI 및 BamHI을 사용해 분해시킨 뒤, SnaBI 효소 분해에 의해 미리 선형화된 pPAV3 플라스미드(실시예 5)와 함께 BJ5183 유효 박테리아 내에 공-형질전환시켰다. 이러한 공-형질전환을 통해Escherichia coli내에서의 상동 재조합에 의해 pPAV3dl622EGFP 플라스미드가 생성되었다.
pE3dl622gD 플라스미드(실시예 9.2)를 EcoRI 및 PmeI을 사용해 분해시킨 뒤, SnaBI 효소 분해에 의해 미리 선형화된 pPAV3 플라스미드(실시예 5)와 함께 BJ5183 유효 박테리아 내에 공-형질전환시켰다. 이러한 공-형질전환을 통해Escherichia coli내에서의 상동 재조합에 의해 pPAV3dl622gD 플라스미드가 생성되었다.
pE3dl919EGFP 플라스미드(실시예 9.1)를 HindⅢ 분해를 통해 선형으로 만든 뒤, SnaBI 분해에 의해 미리 선형화된 pPAV3 플라스미드(실시예 5)와 함께 BJ5183유효 박테리아 내에 공-형질전환시켰다. 이러한 공-형질전환을 통해Escherichia coli내에서의 상동 재조합에 의해 pPAV3dl919EGFP 플라스미드가 생성되었다.
pE3dl919gD 플라스미드(실시예 9.2)를 HindⅢ 분해를 통해 선형을 만든 뒤, SnaBI 효소 분해에 의해 미리 선형화된 pPAV3 플라스미드(실시예 5)와 함께 BJ5183 유효 박테리아 내에 공-형질전환시켰다. 이러한 공-형질전환을 통해Escherichia coli내에서의 상동 재조합에 의해 pPAV3dl919gD 플라스미드가 생성되었다.
실시예 10: Escherichia coli 내로 클로닝된 재조합 PAV3의 트랜스펙션에 의한 재조합 PAV3 바이러스의 생산
6웰 플레이트 내에서 2 ㎍의 재조합 PAV-3의 게놈 DNA을 60-80%의 합류 밀도(confluency density)가 되도록 PK-15 또는 ST 세포(실시예 1)에 트랜스펙션시키고, PacI를 사용해 사전 분해시킨 후, 세포주에 따라 4 내지 12 ㎕의 LipofectAMINE(Gibco-BRL Cat # 18324-012)의 존재 하에서 희석하였다.
공급자의 지시 조건에 따라 트랜스펙션시킨 후, 바이러스 CPE가 나타날 때까지 세포를 며칠동안 배양하였다. 그런 다음, 다른 세포 배지로 교체하여 얻어진 재조합 바이러스를 증폭시켰다.
pPAV3dl622CMV-EGFP 플라스미드(실시시예 7)를 트랜스펙션시켜 재조합 바이러스vPAV3-1을 얻었다.
pPAV3dl622CMV-gD 플라스미드(실시시예 7)를 트랜스펙션시켜 재조합 바이러스vPAV3-2를 얻었다.
pPAV3dl919CMV-EGFP 플라스미드(실시시예 8)를 트랜스펙션시켜 재조합 바이러스vPAV3-3를 얻었다.
pPAV3dl919CMV-gD 플라스미드(실시시예 8)를 트랜스펙션시켜 재조합 바이러스vPAV3-4를 얻었다.
pPAV3dl622EGFP 플라스미드(실시시예 9.3)를 트랜스펙션시켜 재조합 바이러스vPAV3-5를 얻었다.
pPAV3dl622gD 플라스미드(실시시예 9.3)를 트랜스펙션시켜 재조합 바이러스vPAV3-6를 얻었다.
pPAV3dl919EGFP 플라스미드(실시시예 9.3)를 트랜스펙션시켜 바이러스vPAV3-7를 얻었다.
pPAV3dl919gD 플라스미드(실시시예 9.3)를 트랜스펙션시켜 재조합 바이러스vPAV3-8를 얻었다.
실시예 11: pITRsPAV5 플라스미드의 제작
11.1. 우말단 게놈 단편의 클로닝
실시예 3에 따라 제조된 PAV-5 바이러스의 게놈 DNA를 EcoRI을 사용해 분해시키고, 아가로스 겔 전기영동 후 0.9 kbp의 EcoRI 우말단(right-terminal) 단편을 분리하였다. 상기 단편을 pBS-KS 플라스미드에 결찰시키고, EcoRI을 사용해 사전 분해시킨 뒤, 탈인산화하여 "pKS-Right ITR5" 플라스미드를 만들었다.
그런 다음, pKS-Right ITR5 플라스미드 매트릭스와 하기 올리고뉴클레오타이드를 사용해 PCA 반응을 수행하여 1.0 kbp의 단편을 제조하였다:
ITRPAV3 (SEQ ID NO: 4)(50량체):
5'CCTTAATTAAGGTAGGGATAACAGGGTAATCATCATCAATAATATACGGA 3; 및
T3 (SEQ ID NO:2)(20량체):
5'ATTAACCCTCACTAAAGGGA 3'.
상기 단편을 pCRⅡ 플라스미드(Invitrogen Original TA Cloning Kit Cat # K2000-01)에 결찰시켜 "pCR-Right ITR5" 플라스미드를 만들었다(도 8).
11.2. 좌말단 게놈 단편의 클로닝
실시예 3에 따라 제조된 PAV-5 바이러스의 게놈 DNA를 HindⅢ를 사용해 분해시키고, 아가로스 겔 전기영동 후 1.2 kbp의 HindⅢ 좌말단 단편을 분리하였다. 이 단편을 pBS-KS 플라스미드에 결찰시키고, HindⅢ를 사용해 사전 분해한 뒤, 탈인산화하여 "pKS-Left ITR5" 플라스미드를 만들었다.
이어서, pKS-Left ITR5 플라스미드 매트릭스와 하기 올리고뉴클레오타이드를 사용해 PCA 반응을 수행하여 1.3 kbp의 단편을 제조하였다:
ITRPAV3 (SEQ ID NO: 4):
5'CCTTAATTAAGGTAGGGATAACAGGGTAATCATCATCAATAATATACGGA 3; 및
T7 (SEQ ID NO: 3)(20량체):
5'TAATACGACTCACTATAGGG 3'.
상기 단편을 pCRⅡ 플라스미드에 결찰시켜 "pCR-Left ITR5" 플라스미드를 만들었다(도 8).
11.3. pPolyⅡ-Right ITR5 플라스미드의 제작
pCP-Right ITR5 플라스미드(실시예 11.1)를 BamHI 및 HindⅢ를 사용해 분해시켜 1.0 kbp의 BamHI-HindⅢ 단편을 분리하였다. 이어서, 상기 단편을 pPolyⅡ 플라스미드(실시예 4)에 결찰시키고, BamHI 및 HindⅢ를 사용해 사전 분해시켜 "pPolyⅡ-Right ITR5" 플라스미드를 만들었다(도 8).
11.4. pITRsPAV5 플라스미드의 제작
pCP-Left ITR5 플라스미드(실시예 11.2)를 BamHI 및 HindⅢ를 사용해 분해시켜 1.3 kbp의 BamHI-HindⅢ 단편을 분리하였다. 이어서, 상기 단편을 pPolyⅡ-Right ITR5 플라스미드에 결찰시키고, BglⅡ 및 HindⅢ를 사용해 사전 분해시켜 "pITRs PAV5" 플라스미드를 만들었다(도 8).
실시예 12: pPAV5 플라스미드의 제작
pITRsPAV5 플라스미드를 HindⅢ를 사용해 분해시켰다. 이어서, 상기 단편을 실시예 3에 따라 제조된 PAV-5 바이러스의 게놈 DNA와 함께 BJ5183 유효 박테리아 내로 공-형질전환시켰다. 이러한 공-형질전환을 통해 상동 재조합에 의해 PAV-5 바이러스의 모든 게놈을 함유하는 플라스미드가 생성되었다. 이 플라스미드를 "pPAV5"라 지정하였다.
실시예 13: PAV-5 셔틀 플라스미드의 제작
13.1 E3 PAV-5 셔틀 플라스미드의 제작
pPAV5 플라스미드(실시예 12)를 SacI 및 MluI을 사용해 분해시켜 E3 부위를 함유하는 4372 bp의 SacI-MluI 단편을 분리하였다. 이어서, 상기 단편을 pNEB193 플라스미드(실시예 6.1)에 결찰시키고, SmaI 및 AscI을 사용해 사전 분해시켜 "pE3PAV5" 플라스미드를 만들었다(도 9).
pE3PAV5 플라스미드 내로 클로닝된 SacI-MluI 단편의 전체 서열을 결정하고 분석하였다. pPAV5 플라스미드 상에 존재하는 상기 서열 및 인접 서열을 분석한 결과, 클로닝된 단편이 PAV-5 바이러스의 E3 부위를 실제로 나타났음이 확인되었다. 이 부위의 서열(5614개의 염기쌍)(SEQ ID NO: 5)을 도 13에 나타내었다.
13.2. E3 부위 내에 1472개 염기쌍의 결실을 가지는 공여체 CMV-EGFP 및 CMV-PRV gD 플라스미드의 제작
pPMV-EGFP 플라스미드(실시예 6.1)를 AsnI 및 MluI 효소를 사용해 분해시킨 뒤, T4 DNA 폴리머라아제를 처리하여 1.6 kbp의 AsnI(이중가닥 말단)-MluI(이중가닥 말단) 단편을 분리하였다. 이 단편을 pE3PAV5 플라스미드(실시예 13.1)에 결찰시키고, PvuⅡ 및 BglI을 사용해 사전 분해시킨 뒤, T4 DNA 폴리머라아제를 처리하여 pE3dl1472CMV-EGFP 플라스미드를 만들었다(도 10). PvuⅡ와 BglI 자리 사이에 도입된 결실의 크기는 622 bp이다. 이 결실은 도 13에 나타낸 서열의 뉴클레오타이드 2389와 3861 사이에서 이루어졌다.
pgD 플라스미드(실시예 6.1)를 AsnI 및 MluI 효소를 사용해 분해시켜 2.3 kbp의 AsnI-MluI 단편을 분리하였다. 그런 다음, 상기 단편에 T4 DNA 폴리머라아제를 처리하여 말단을 이중가닥으로 만든 뒤, pE3PAV5 플라스미드에 결찰시키고,PvuⅡ 및 BglI을 사용하여 사전 분해시킨 후, T4 DNA 폴리머라아제를 처리하여 pE3dl1472CMV-gD 플라스미드를 만들었다(도 3).
pCMV-EGFP 플라스미드를 NheI 및 MluI을 사용해 분해시켜 1.0 kbp의 NheI-MluI 단편을 분리하였다. 상기 단편에 DNA 폴리머라아제의 Klenow 단편을 처리하여 말단을 이중가닥으로 만든 뒤, pE3PAV5 플라스미드에 결찰시키고, PvuⅡ 및 BglI을 사용해 사전 분해시킨 후, T4 DNA 폴리머라아제를 처리하여 pE3dl1472EGFP 플라스미드를 만들었다(도 11).
pCMVgD 플라스미드(실시예 6.1)를 XhoI 및 ClaI을 사용해 분해시켜 1.5 kbp의 XhoI-ClaI 단편을 분리하였다. 상기 단편에 DNA 폴리머라아제의 Klenow 단편을 처리하여 말단을 이중가닥으로 만든 뒤, pE3PAV5 플라스미드에 결찰시키고, PvuⅡ 및 BglI을 사용해 사전 분해시킨 후, T4 DNA 폴리머라아제를 처리하여 pE3dl1472gD 플라스미드를 만들었다(도 12).
실시예 14: 재조합 게놈 pPAV5dl1472CMV-EGFP 및 pPAV5dl1472CMV-gD의 제작
pE3dl1472CMV-EGFP 플라스미드(실시예 13.2)를 PmeI을 사용해 선형화한 뒤, BamHI 효소의 부분 분해(제한 소단편 BamHI A-BamHI D의 연결자리, 도 12)에 의해 미리 선형화된 pPAV5 플라스미드(실시예 12)와 함께 BJ5183 유효 박테리아 내로 공-형질전환시켰다. 이러한 공-형질전환을 통해Escherichia coli내에서의 상동 재조합에 의해 pPAV5dl1472CMV-EGFP 플라스미드가 생성되었다.
pE3dl1472CMV-gD 플라스미드(실시예 13.2)를 PmeI을 사용해 선형화한 뒤, BamHI 효소의 부분 분해(제한 아단편 BamHI A-BamHI D의 연결자리, 도 12)에 의해 미리 선형화된 pPAV5 플라스미드(실시예 12)와 함께 BJ5183 유효 박테리아 내로 공-형질전환시켰다. 이러한 공-형질전환을 통해Escherichia coli내에서의 상동 재조합에 의해 pPAV5dl1472CMV-gD 플라스미드가 생성되었다.
실시예 15: 재조합 게놈 pPAV5dl1472EGFP 및 pPAV5dl1472gD의 제작(CMV 프로모터 서열을 함유하지 않는 코딩 서열의 삽입)
pE3dl1472EGFP 플라스미드(실시예 13.2)를 PmeI을 사용해 선형화한 뒤, BamHI 효소의 부분 분해(제한 아단편(restriction subfragment) BamHI A-BamHI D의 연결자리, 도 12)에 의해 선형화된 pPAV5 플라스미드(실시예 12)와 함께 BJ5183 유효 박테리아 내로 공-형질전환시켰다. 이러한 공-형질전환을 통해Escherichia coli내에서의 상동 재조합에 의해 pPAV5dl1472EGFP 플라스미드가 생성되었다.
pE3dl1472gD 플라스미드(실시예 13.2)를 PmeI을 사용해 선형화한 뒤, BamHI 효소의 부분 분해(제한 아단편 BamHI A-BamHI D의 연결자리, 도 12)에 의해 선형화된 pPAV5 플라스미드(실시예 12)와 함께 BJ5183 유효 박테리아 내로 공-형질전환시켰다. 이러한 공-형질전환을 통해Escherichia coli내에서의 상동 재조합에 의해 pPAV5dl1472gD 플라스미드가 생성되었다.
실시예 16: Escherichia coli 내로 클로닝된 재조합 PAV-5 게놈의 트랜스펙션에 의한 재조합 PAV-5 바이러스의 생산
6웰 플레이트 내에서 2 ㎍의 재조합 PAV-5의 게놈 DNA을 60-80%의 합류 밀도가 되도록 PK-15 또는 ST 세포(실시예 1)에 트랜스펙션시키고, PacI를 사용해 사전 분해시킨 후, 세포주에 따라 4 내지 12 ㎕의 LipofectAMINE(Gibco-BRL Cat # 18324-012)의 존재 하에서 희석하였다.
공급자의 지시 조건에 따라 트랜스펙션시킨 후, 바이러스 CPE가 나타날 때까지 세포를 며칠동안 세포를 배양하였다. 그런 다음, 세포 배지를 교환하여 얻어진 재조합 바이러스를 증폭시켰다.
pPAV5dl1472CMV-EGFP 플라스미드(실시시예 14)를 트랜스펙션시켜 재조합 바이러스vPAV5-1를 얻었다.
pPAV5dl1472CMV-gD 플라스미드(실시시예 14)를 트랜스펙션시켜 재조합 바이러스vPAV5-2를 얻었다.
pPAV5dl1472EGFP 플라스미드(실시시예 15)를 트랜스펙션시켜 재조합 바이러스vPAV5-3을 얻었다.
pPAV5dl1472gD 플라스미드(실시시예 15)를 트랜스펙션시켜 재조합 바이러스vPAV5-4를 얻었다.
실시예 19: 본 발명에 따른 백신의 제조
본 발명에 따라 얻어진 재조합 바이러스를 PK-15 세포 배지 내에서 배양 및 증폭시켰다. 완전한 세포 병원성 효과가 관찰된 후, 현탁물을 수확하였다. 저속원심분리를 통해 세포 잔해를 제거한 뒤, 원심분리하여 비리온을 농축하고 바이러스 펠릿을 세척한 후, 펠릿을 배지 용액에 녹였다. 상기 현탁물의 바이러스 역치를 측정하였다. 그런 다음, 희석을 통해 바이러스 역치를 선택적으로 조절하여 최종 바이러스 역치를 10450% 세포 배양균 감염양(CCID50) 및 107CCID50/㎖ 사이로 조정하였다.
그런 다음, 바아러스 현탁물은 냉동되거나, 바람직하게는 동결건조 기질의 존재하에서 동결건조될 수 있다.
실시예 20: 돼지의 백신 접종
동결건조 용량을 주사 제제용 물에서 해동시키거나 녹이고, 면역 보강제를 선택적으로 첨가한 후, 각각의 재조합 바이러스를 104내지 107CCID50용량으로 돼지에 백신 접종하였다. 상기 백신은 각각 상이한 면역원을 발현시키는 하나 이상의 재조합 PAV 바이러스를 포함한다.
상기 백신은 바늘(근육내 경로)을 통해 2 ㎖ 부피로 주사되거나 점막(비강내 또는 경구 점적)을 통해 투여된다.
이 밖에도 상기 백신은 PIGJET 기구(Societe Endoscoptic, Laon, France)와 같은 바늘이 없는 주사기를 사용해 내피 주사될 있다.
실시예 21: 가성 광견병에 대한 백신접종/테스트 프로토콜
면역 보강제가 함유되지 않은 재조합 vPAV3-2 바이러스(본 발명의 실시예 10)의 현탁액으로 이루어지는 백신의 효능을 평가하기 위해 백신접종/테스트 프로토콜을 사용하였다.
임신 초기에 가성 광견병 바이러스에 대해 백신접종된 암퇘지가 낳은 8주 내지 10주된 새끼 돼지 6마리의 그룹을 설정하였다. 모든 새끼 돼지는 백신접종 당일에도 모계의 항-PRV 항체를 뚜렷하게 갖고 있었다. 접종 당일, 107CCID50/㎖(한쪽 콧구멍에 0.5 ㎖씩)의 역치를 가지는 1 ㎖의 재조합 바이러스 vPAV3-2(PAV-3/PRV gD) 현탁액을 1 그룹과 2 그룹의 새끼 돼지에게 비강내 백신접종하였다. 2 그룹은 21일 뒤에 2차 투여를 수여한 것을 제외하고는 상기와 동일한 방식으로 백신접종하였다. 접종 당일, 3 그룹에게는 107CCID50/㎖ 역치를 가지는 1 ㎖의 PAV-3/gD 바이러스 현탁액을 근육내 수여하였다. 4 그룹은 21일 뒤에 2차 투여를 수여한 것을 제외하고는 3 그룹과 동일한 방식으로 백신접종하였다. 5 그룹은 백신접종을 하지 않고 테스트용 음성 대조군으로 삼았다.
35일 뒤, 적어도 107.3pfu/㎖ 역치의 PRV NIA3 균주 현탁액 2 ㎖(한쪽 콧구멍에 1 ㎖씩)을 투여하여 모든 그룹을 테스트하였다.
테스트 후, (테스트 당일부터 7일 후까지의) 체중 변화 표준(델타 G7)(Stellmann C.et al., J. Biol. Standard, 1989, 17, 1-11) 및 비강 점막을 통한 바이러스 배설 수준의 표준과 ELISA 항체 역치 및 항-PRV 혈청중화 역치를 기준으로 돼지를 관찰하였다.
첨부된 청구의 범위에 의해 한정된 본 발명이 상기의 상세한 설명에 기재된 특정 구현예에 의해 제한되지 않으며, 본 발명의 범위와 사상을 벗어나지 않는 변형을 포함한다.

Claims (29)

  1. 생체 내에서 복제성을 유지하는 재조합 돼지 아데노바이러스에 있어서,
    돼지 아데노바이러스가 생체 내에서 복제되고 삽입된 이형 뉴클레오타이드 서열이 발현될 수 있는 조건 하에서 돼지 아데노바이러스의 게놈에 삽입된 이형 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 아데노바이러스의 게놈이 혈청형 3 또는 5의 아데노바이러스(PAV-3 또는 PAV-5)로부터 기원하는 돼지 아데노바이러스.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 이형 뉴클레오타이드 서열이 상기 돼지 아데노바이러스의 E3 부위의 비필수적인 영역 내로 삽입되는 돼지 아데노바이러스.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 이형 뉴클레오타이드 서열이 상기 돼지 아데노바이러스의 E3 부위의 결실된 비필수적인 영역에 삽입되는 돼지 아데노바이러스.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아데노바이러스 게놈은 PAV-3으로부터 기원하고, 상기 이형 뉴클레오타이드 서열은 E3 부위의 뉴클레오타이드 706 내지 1624를 포함하는 영역에 삽입되는 돼지 아데노바이러스.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 이형 뉴클레오타이드 서열이 E3 부위의 뉴클레오타이드 706 내지 1624 영역에 삽입되는 돼지 아데노바이러스.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아데노바이러스 게놈은 PAV-5로부터 기원하고, 상기 이형 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO. 5의 뉴클레오타이드 2064 내지 4083, 특히 뉴클레오타이드 2389 내지 3861의 전체 또는 일부를 포함하는 영역에 삽입되는 돼지 아데노바이러스.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 이형 뉴클레오타이드 서열이 SEQ ID NO. 5의 뉴클레오타이드 2064 내지 4083, 특히 뉴클레오타이드 2389 내지 3861 영역에 삽입되는 돼지 아데노바이러스.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이형 뉴클레오타이드 서열이 돼지 병원체의 면역원이나 돼지 병원체 면역원의 면역학적 활성 단편 또는 에피토프를 코딩하고/코딩하거나 면역 조절인자를 코딩하는 돼지 아데노바이러스.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    여러 종류의 이형 뉴클레오타이드 서열이 삽입되는 돼지 아데노바이러스.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    폴리에피토프 서열이 삽입되는 돼지 아데노바이러스.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    IRES(내부 리보솜 삽입 자리; Internal Ribosome Entry Site) 서열이 삽입되는 돼지 아데노바이러스.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 돼지 아데노바이러스가 바이러스, 박테리아 및 기생충으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 돼지 병원체로부터 기원하는 이형 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 아데노바이러스.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 돼지 아데노바이러스가 가성 광견병 바이러스, 돼지의 인플루엔자 바이러스, 돼지의 생식성 및 호흡성 증후 바이러스, 파보바이러스병 바이러스, 사육돼지 콜레라 바이러스, 2형 돼지 서코바이러스,Actinobacillus pleuropneumoniae및Mycoplasma hyopneumoniae로 이루어지는 군으로부터 선택되는 돼지의 병원체로부터기원하는 이형 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 아데노바이러스.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 이형 뉴클레오타이드 서열(들)이 가성 광견병 바이러스의 gB 유전자, gC 유전자 또는 gD 유전자, 돼지의 인플루엔자 바이러스의 HA 유전자, NA 유전자 또는 NP 유전자, 돼지의 생식성 및 호흡성 증후 바이러스의 ORF4 유전자 또는 ORF7 유전자, 사육돼지 콜레라 바이러스의 E1 유전자 또는 E2 유전자, 파보바이러스병 바이러스의 VP2 유전자, 2형 돼지 서코바이러스의 ORF1 유전자 또는 ORF2 유전자 및 이들 유전자의 면역학적 활성 단편과 에피토프로 이루어지는 군으로부터 선택되는 돼지 아데노바이러스.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 돼지 아데노바이러스가 돼지의 사이토카인을 코딩하는 이형 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지 아데노바이러스.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 돼지의 사이토카인이 GM-CSF, IL-4, IL-12 및 IL-18로 이루어지는 군으로부터 선택되는 돼지 아데노바이러스.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 돼지 아데노바이러스 및 수의학적관점에서 허용 가능한 부형제 또는 보형약을 포함하는 재조합 돼지 백신.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 재조합 돼지 백신이 상이한 이형 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 여러 종류의 돼지 아데노바이러스를 포함하는 재조합 돼지 백신.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서,
    상기 재조합 돼지 백신이 면역 보강제를 포함하는 재조합 돼지 백신.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 면역 보강제가 아크릴산 또는 메타크릴산 폴리머 및 말레산 무수물과 알케닐 유도체의 코폴리머로 이루어지는 군으로부터 선택되는 재조합 돼지 백신.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 면역 보강제가 카르보머인 재조합 돼지 백신.
  22. 생체 내에서 복제성을 유지하며 게놈의 비필수적인 부위가 결실된 혈청형 3 또는 5의 돼지 아데노바이러스 벡터.
  23. 생체 내에서 복제성을 유지하며 E3 부위가 결실된 혈청형 3 또는 5의 돼지 아데노바이러스 벡터.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 돼지 아데노바이러스 벡터가 E3 부위의 뉴클레오타이드 706 내지 1624의 결실을 포함하는 혈청형 3의 돼지 아데노바이러스를 포함하는 돼지 아데노바이러스 벡터.
  25. 제24항에 있어서,
    E3 내에서의 결실이 뉴클레오타이드 706 내지 1624의 결실을 본질적으로 포함하는 돼지 아데노바이러스 벡터.
  26. 제23항에 있어서,
    상기 돼지 아데노바이러스 벡터가 SEQ ID NO. 5의 뉴클레오타이드 2064 내지 4083, 특히 뉴클레오타이드 2389 내지 3861의 전체 또는 일부를 포함하는 영역 내의 결실을 포함하는 혈청형 5의 돼지 아데노바이러스를 포함하는 돼지 아데노바이러스 벡터.
  27. 제26항에 있어서,
    SEQ ID NO. 5의 뉴클레오타이드 2064 내지 4083, 특히 뉴클레오타이드 2389내지 3861이 결실된 돼지 아데노바이러스 벡터.
  28. E3를 포함하며 특정 PAV-5 균주 내에서 SEQ ID NO. 5로 지정된 뉴클레오타이드 서열을 가지는 PAV-5 뉴클레오타이드 서열의 전체 또는 일부를 포함하는 DNA 단편.
  29. E3에 상응하며 특정 균주 내에서 SEQ ID NO.5의 뉴클레오타이드 2382 내지 4042로 지정된 PAV-5 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 단편.
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