ES2258970T3 - Vectores y vacunas viricas a base de adenovirus porcinos recombinados. - Google Patents
Vectores y vacunas viricas a base de adenovirus porcinos recombinados.Info
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Abstract
Un adenovirus porcino recombinante de serotipo 3 (PAV-3) que contiene al menos un ácido nucleico heterólogo que codifica al menos un inmunógeno, habiéndose insertado el ácido nucleico heterólogo en la región E3 del genoma de PAV-3, situada entre el gen que codifica la proteína pVIII y el que codifica la fibra, siendo capaz el adenovirus recombinante de replicarse in vivo y de expresar el inmunógeno, eligiéndose el inmunógeno del grupo que consiste en inmunógeno del circovirus porcino tipo 2, gB del virus de la enfermedad de Aujeszky, gC del virus de la enfermedad de Aujeszky, inmunógeno del virus de la gripe porcina, VP2 del virus de la parvovirosis, ORF3 del virus de la enfermedad misteriosa del cerdo (síndrome respiratorio y reproductivo porcino), ORF4 del virus de la enfermedad misteriosa del cerdo, ORF6 del virus de la enfermedad misteriosa del cerdo, ORF7 del virus de la enfermedad misteriosa del cerdo, E0 del virus de la peste porcina clásica, E1 del virus de la peste porcina clásicae inmunógeno de Actinobacillus pleuropneumoniae.
Description
Vectores y vacunas víricas a base de adenovirus
porcinos recombinados.
La presente invención se refiere a adenovirus
porcinos de serotipos 3 y 5 recombinantes por inserción de
secuencias nucleotídicas heterólogas, siendo capaces estos
adenovirus de replicarse in vivo de manera autónoma y de
expresar esas secuencias heterólogas. La invención se refiere
también a las vacunas porcinas obtenidas, a los métodos de
inmunización de los cerdos utilizándolas, a vectores de adenovirus
con deleciones y replicantes, y a los procedimientos para la
obtención de esos adenovirus, vacunas y vectores.
Los documentos que se citan en la descripción,
así como los que se citan en esos documentos, se incorporan a la
presente por referencia.
Los adenovirus son virus de molécula de ADN de
doble hebra lineal, con secuencias terminales invertidas y
repetidas en cada extremo. Los adenovirus forman parte de la familia
de los Adenoviridae, responsables de enfermedades que afectan a un
gran número de especies, como por ejemplo a las especies de simios,
a la bovina, ovina, porcina, equina, murina, canina y a las
aviarias. Las infecciones con adenovirus se pueden caracterizar,
según las especies y según los tipos de adenovirus, por signos de
encefalitis, de neumonías, de lesiones renales, de diarreas y
de
hepatitis.
hepatitis.
El genoma de los adenovirus varía de una especie
a otra [(T. Adrian et al., Arch. Virol. 1986, 91,
277-290), (J. Hamelin et al., J. Clin.
Microbiol. 1988, 26, 31-33), (R. Assaf et
al., Can. J. Comp. Med. 1983, 47, 460-463), (T.
Kurokawa et al., J. Virol. 1978, 28,
212-218), (S.-L. Hu et al., J. Virol. 1984,
51, 880-883), (L. Zsak et al., Intervirology
1984, 22, 110-114)]. Los adenovirus de los animales,
al contrario que los adenovirus humanos, tienen un espectro de
huésped muy limitado y a menudo solamente infectan a los animales
pertenecientes a su especie de origen.
El primer adenovirus porcino (en inglés:
"Porcine AdenoVirus" o PAV) fue aislado en 1964 (D. Haig et
al., J. Comp. Pathol., 1964, 74, 81-84). Desde
esa fecha se han identificado y descrito 5 serotipos de adenovirus
porcinos (Hirahara et al., J. Vet. Sci. 1990, 52,
407-409). Los adenovirus de los serotipos 1 y 2
están asociados a diarreas; los adenovirus del serotipo 4 están
asociados a síntomas de neumonía y de encefalitis. Otros adenovirus
porcinos han sido clasificados en un quinto serotipo basándose en el
hecho de su ausencia de neutralización cruzada con antisueros
específicos de los PAV de los serotipos 1 a 4. Se ha analizado el
genoma de PAV-5 y se ha establecido un mapa de
restricción (Tuboly et al., Virus Res. 1995, 37,
49-54). Ese análisis mostró la ausencia de
similitudes entre los mapas de restricción de los
PAV-5 y los de los PAV de los otros serotipos:
PAV-1 y PAV-2 (Reddy et al.,
Arch. Virol. 1995, 140, 195-200),
PAV-3 (Reddy et al., Intervirology 1993, 36,
161-168), y PAV-4 (Kleiboeker et
al., Arch. Virol. 1993, 133, 357-368). Entre los
serotipos 3 y 5 existen cepas naturalmente no patógenas para el
cerdo.
Los PAV tienen un genoma de un tamaño de entre
aproximadamente 32 y aproximadamente 34 kbp. Recientemente se ha
establecido la secuencia completa del virus PAV-3 y
se ha depositado en el banco de datos GenBank con el número
AF083132 (P. S. Reddy et al., Virol. 1998, 251,
414-426); su tamaño es de 34094 pares de bases (pb).
El genoma de PAV-4 tiene un tamaño de
aproximadamente 32 kpb, y el de PAV-5 tiene un
tamaño de aproximadamente 33,2 kpb. No se ha secuenciado ni
publicado el genoma completo de PAV-5, y en
particular la región E3.
La principal aplicación que se pretende para los
adenovirus se encuentra en el dominio de la terapia génica en el
hombre, y se ha propuesto un gran número de construcciones y de
sistemas. Los adenovirus han sido propuestos asimismo como vectores
recombinantes en composiciones vacunales para la protección de los
humanos y de los animales contra numerosos virus patógenos.
Hasta la fecha se han desarrollado dos
estrategias de construcción de vectores de adenovirus recombinantes
(M. Eloit & M. Adam, J. Gen. Virol. 1995, 76,
1583-1589).
La primera estrategia consiste en la inserción
de casetes de expresión en regiones indispensables para la
replicación de adenovirus; de ahí la necesidad de desarrollar de
forma paralela sistemas de transcomplementación para poder asegurar
la replicación de los virus. Para los adenovirus porcinos se ha
propuesto la región E1 como sitio de inserción (P. S. Reddy et
al., Virus Res. 1998, 58, 97-106). Los vectores
recombinantes construidos de esta manera son llamados "no
replicantes", pues no se pueden replicar en el huésped al que se
le han administrado.
Como variante de esta primera estrategia se
puede utilizar un virus no replicante en el animal de destino. Ya
se ha insertado en particular el casete de expresión PRV gD en el
sitio E1A del adenovirus humano de serotipo 5, no replicante en el
cerdo (M. Monteil et al., J. Gen Virol. 1997, 78,
3303-3310; A. Ambriovic et al., Virol. 1997,
238, 327-335).
La segunda estrategia consiste en la inserción
de casetes de expresión a la altura de regiones del genoma viral
que no son esenciales para la replicación del adenovirus. La
dificultad de determinar regiones no esenciales en los adenovirus y
la presencia de una cápside rígida hacen difícil de poner en
práctica esta segunda estrategia.
Una de las características esenciales de los
adenovirus, en efecto, es que tienen una cápside rígida que limita
estrictamente el tamaño de la molécula de ADN que se puede
encapsidar en ella. De manera general se considera que es posible
encapsidar una molécula de ADN correspondiente a entre 105 y 114%
del tamaño del genoma, lo que corresponde, según el tamaño de los
genomas, a inserciones de entre aproximadamente 1,7 y
aproximadamente 3,9 kpb. En el caso de tamaños excesivos se pueden
producir en el seno del genoma recombinante deleciones y/o
reordenaciones no deseadas.
La región E3 no se conserva, ni en tamaño ni en
organización genética, de un adenovirus de una especie dada a un
adenovirus de otra especie, ni entre los adenovirus porcinos de
diferentes serotipos (S. Kleiboeker, Virus Res. 1994, 31,
17-25).
La región E3 del virus PAV-3
tiene un tamaño de 1179 pares de bases. Se trata de una región
compleja que codifica al menos 3 Marcos de Lectura Abiertos (MLA).
Estos MLA se superponen entre ellos, y el primer MLA se superpone
también parcialmente al gen que codifica la proteína pVIII (P. S.
Reddy et al., Virus Res. 1995, 36, 97-106),
que es una proteína esencial.
La presencia de estos MLA que se superponen en
la región E3 supone una dificultad importante para determinar los
sitios de las inserciones y/o los límites de las deleciones, de
manera que los adenovirus recombinantes siguen siendo replicantes
en los porcinos.
La secuencia de ácidos aminados codificada por
el segundo MLA de la región E3 no muestra ninguna homología entre
los adenovirus PAV-3 y HAV-2
(humano, de serotipo 2), ni con ninguna proteína de adenovirus
conocida actualmente (P. S. Reddy et al., Virus Res. 1995,
36, 97-106). Las secuencias de ácidos aminados
predichas según la secuencia nucleotídica del primer MLA de la
región E3 en el PAV-3 solamente son idénticas en un
33,3% a la del adenovirus canino de serotipo 2
(CAV-2). No solamente no son homólogas las proteínas
codificadas por regiones E3 de diferentes adenovirus, sino que
tampoco las codificadas por los MLA de la región E3 muestran
ninguna homología entre los adenovirus PAV-3 y
PAV-4 (S. B. Kleiboeker, Virus Res. 1994, 31,
17-25).
La región E3 tiene un tamaño de 1162 pb en
PAV-1 (con 5 MLA); es de 1222 pb en
PAV-2 (con 5 MLA) (P. S. Reddy et al., Virus
Res. 1996, 43, 99-109), y de 1879 pb en
PAV-4 (con 6 MLA). Solamente el cuarto MLA de la
región E3 del virus PAV-4 (correspondiente a una
proteína de 13,2 kDa) presenta una homología con otro MLA conocido
de la región 3, que codifica la proteína 14,7 kDa del adenovirus
humano de tipo 5 (en inglés Human AdenoVirus 4 o
HAV-5). La región E3 de PAV-4 no
presenta ninguna homología de secuencia con las regiones E3 de los
otros adenovirus porcinos, en particular con las de
PAV-3 y de PAV-5.
Además de la dificultad de definir sus límites
para conservar el carácter replicante in vivo, las deleciones
en la región E3 tampoco están libres de riesgos. Las deleciones en
la región E3, en efecto, pueden tener consecuencias sobre la
patogenicidad de los adenovirus recombinantes. Se ha observado, por
ejemplo, que una deleción en la región E3 del virus
HAV-5 aumentaba la patogenicidad pulmonar de ese
virus en el modelo experimental de infección de la rata del algodón
(Ginsberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 86,
3823-3827).
Esto demuestra que las consecuencias de las
deleciones en la región E3 de un adenovirus deben considerarse caso
por caso, y no por simple trasposición de las observaciones hechas
en un adenovirus concreto a otro. La organización genética de la
región E3 de PAV-3 es única, y también lo es la de
la región E3 de PAV-5.
La localización precisa de un sitio de inserción
en la región E3 se complica aún más debido al hecho de la presencia
de zonas de empalme y de poliadenilación complejas, zonas
características de los adenovirus (imperiale et al., Curr.
Top. Microbiol. Immunol. 1995, 199, 139-171). Las
zonas de empalme localizadas en la región E3 son importantes para
la maduración de numerosos ARN mensajeros esenciales codificados por
las secuencias localizadas fuera de la región E3. La misma región
E3 se encuentra situada en una parte del genoma viral de elevada
actividad transcripcional (P. Sharp, 1984, in The Adenovirus, Ed. H.
S. Ginsberg, Plenun Press, New York and London,
173-204); la inserción de una secuencia nucleotídica
heteróloga en la región E3 puede tener un impacto negativo sobre la
actividad biológica del virus recombinante. Además de eso, la región
E3 se encuentra localizada más abajo del promotor tardío mayor
(major late promoter, MLP), región en la que se ha demostrado la
existencia de interferencias entre la transcripción de la inserción
y la iniciada por el promotor MLP (Xu et al.; J. Gen. Virol.
1995, 76, 1971-1980).
Los resultados obtenidos con adenovirus
provenientes de otras especies (humana, bovina, ovina...) no se
pueden transponer, por lo tanto, a los adenovirus porcinos. Hasta
la fecha no se ha producido, así pues, ningún vector recombinante
replicante a partir de un adenovirus porcino.
La depositaria se ha propuesto el objetivo de
hacer accesible la inserción de genes heterólogos en el genoma de
los virus PAV-3 y PAV-5 sin que se
modifique por ello de manera sustancial su capacidad de replicación
in vivo.
Otro objetivo de la invención es el de proponer
regiones de inserción susceptibles de sufrir una deleción sin poner
en cuestión esa capacidad de replicación, con el fin de incrementar
la capacidad de inserción en el virus.
Otro objetivo más de la invención es el de
proponer virus PAV-3 recombinantes que conserven una
capacidad de replicación in vivo y que permitan su
utilización como vacunas vivas recombinantes, incluyendo vacunas
administradas por vía mucosa y/o en presencia de anticuerpos de
origen materno.
La depositaria ha conseguido modificar la región
E3 de PAV-3 y de PAV-5 conservando
la capacidad de replicación in vivo. Ha podido demostrar
asimismo la expresión in vivo de un gen insertado en esa
región. Hace accesible, por lo tanto, la utilización de
PAV-3 y de PAV-5 como vectores de
expresión replicantes.
La presente invención, por consiguiente, tiene
como objeto un adenovirus porcino de serotipo 3 que comprende al
menos una secuencia nucleotídica heteróloga insertada en el genoma
de PAV-3 en condiciones que permiten que los virus
recombinantes obtenidos se repliquen in vivo en los porcinos,
y que expresen la secuencia insertada. Estos virus modificados
presentan importantes ventajas en materia de vacunación, y sobre
todo: son eficaces incluso en presencia de anticuerpos maternos y
se pueden entonces utilizar de manera eficaz por vía mucosa.
Preferentemente se inserta una secuencia
heteróloga en una zona no esencial del genoma, principalmente de la
región E3, con una deleción de esta zona de inserción. Por deleción
de una zona se entiende una deleción total o parcial,
preferentemente total, de la zona de inserción. En otras palabras,
la secuencia heteróloga se inserta en el lugar de toda la zona de
inserción o de parte de ella, preferentemente en el lugar de la
totalidad de esa zona.
Para el PAV-3 la zona de
inserción preferida en E3 es una zona que comprende la totalidad o
parte de los nucleótidos 706 a 1624 de la secuencia publicada por
P. S. Reddy et al., Virus Research 1995, 36,
97-106, lo que corresponde a las posiciones 27794 a
28712 de la secuencia publicada en GenBank AN # U10433. En otras
palabras, esta zona de inserción y su eventual deleción pueden
comprender la totalidad o solamente una parte de la secuencia 706 a
1624 y/o extenderse en E3 más allá del límite 706 y/o del límite
1624, y eventualmente comprender E3 por completo. Preferentemente
esta zona está formada por, o comprende, E3, los nucleótidos 1002 a
1624, o también la totalidad o parte de la secuencia 706 a 1002.
Principalmente comprende al menos la secuencia 1002 a 1624.
Para el PAV-5, E3 se define por
la secuencia de nucleótidos 2382 a 4042 en la SEQ ID Nº: 5. la zona
de inserción y su eventual deleción incluye E3 y comprende la
totalidad o parte de los nucleótidos 2064 a 4083, por ejemplo la
totalidad o parte de los nucleótidos 2389 a 3861, de la SEQ ID Nº: 5
(figura 13). En otras palabras, esta zona de inserción y su
eventual deleción pueden comprender una parte solamente de la
secuencia 2389 a 3861 y/o extenderse en E3 más allá del límite 2389
y/o del límite 3861 y eventualmente comprender E3 por entero.
Cuando se produce una deleción hasta el nucleótido 4083 inclusive se
prefiere insertar en el lugar del nucleótido 4083 un sitio aceptor
de empalmes. Preferentemente esta zona de inserción está formada
esencialmente por los nucleótidos 2389 a 3861.
Naturalmente, se pretende aplicar también la
invención a la inserción en las zonas correspondientes de las otras
cepas de PAV-3 cuyas secuencias difieren de las de
las cepas de referencia conforme a la invención.
La presente invención tiene asimismo como objeto
un virus PAV-3 que tenga una capacidad de inserción
superior en tamaño, permaneciendo al mismo tiempo replicante en los
cerdos. Se busca mantener la propiedad de replicación en el huésped
con el fin de obtener una eficacia de protección óptima, en
particular utilizando una composición vacunal por vía mucosa y/o en
presencia de anticuerpos de origen materno.
El aumento de la capacidad de inserción se
consigue por medio de una deleción, por ejemplo de la totalidad o
parte de la región E3, hallándose situada la parte de E3 que puede
sufrir la deleción entre el gen que codifica la proteína pVIII y el
que codifica la fibra. La presente invención describe principalmente
las deleciones de 622 pb y de 919 pb que se pueden realizar en la
región E3 del virus PAV-3, conservando al mismo
tiempo el carácter replicante de los virus recombinantes (ver
ejemplos 6 a 10). Se encuentra descrita una deleción de 1472 pb en
la región E3 del virus PAV-5 que conduce a las
mismas características fenotípicas del virus recombinante (ver
ejemplos 14 a 17).
El adenovirus PAV-3 recombinante
obtenido según la invención puede servir ventajosamente para una
inserción de un tamaño máximo de aproximadamente 3,0 kpb para el
virus PAV-3, y para su expresión en el cerdo.
Así pues, la invención tiene también como objeto
el vector PAV-3 que ha sufrido una deleción,
principalmente en la región E3, permaneciendo al mismo tiempo
replicante, una deleción en particular en las zonas antes
mencionadas, es decir, una deleción de la totalidad o parte de la
zona considerada, preferentemente de la totalidad de esa zona.
Las secuencia nucleotídicas heterólogas que se
pueden insertar son secuencias que codifican inmunógenos o
fragmentos, por ejemplo epítopes, inmunológicamente activos de
inmunógenos, y en particular genes o fragmentos de genes (por ej.
epítopes) que codifican inmunógenos de patógenos porcinos.
En el marco de la presente invención se puede
insertar, naturalmente, más de una secuencia heteróloga en el mismo
virus. En particular se pueden insertar secuencias heterólogas
provenientes de un mismo virus o de virus diferentes.
Según una modalidad particular es posible
insertar secuencias artificiales que agrupen varios fragmentos o
epítopes provenientes de un mismo patógeno o de patógenos
diferentes, y las llamadas "secuencias multiepítopes". En este
último caso la secuencia multiepítope se coloca bajo la dependencia
de un promotor único.
Se pueden asimismo insertar secuencias que
codifiquen inmunomoduladores, en particular citocinas,
preferentemente citocinas de cerdo como el
"Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating
Factor" porcino (poGM-CSF), la interleucina
porcina 4 (poiL-4), la IL-12 porcina
o la IL-18 porcina.
La expresión de varios genes heterólogos
insertados en el locus de inserción se puede hacer también posible
mediante la inserción de una secuencia llamada "IRES" (Internal
Ribosome Entry Site) proveniente principalmente de un picomavirus
como el virus de la enfermedad vesicular del cerdo (swine vesicular
disease virus, SVDV; B.-F. Chen et al., J. Virology, 1993.
67, 2142-2148), el virus de la encefalomiocarditis
(EMCV; R. J. Kaufman et al., Nucleic Acids Research, 1991.
19, 4485-4490), el virus de la fiebre aftosa (FMVD;
N. Luz y E. Beck, J. Virology, 1991. 65,
6486-6494), o también de otro origen. El
especialista se podrá referir al contenido de los 3 artículos
citados. El casete de expresión de dos genes tendría, así pues, la
estructura mínima siguiente: promotor (opcional) -gen
1-IRES-gen 2- señal de
poliadenilación. La vacuna viva recombinante según la invención,
por lo tanto, podrá comprender, insertada en el locus de inserción,
un casete de expresión que comprenda, sucesivamente, un promotor,
dos o varios genes separados dos a dos por un IRES, y una señal de
poliadenilación.
Los patógenos porcinos son virus, bacterias o
parásitos, elegidos principalmente entre los del grupo que consiste
en virus de la enfermedad de Aujeszky (virus PRV o pseudorabia),
virus de la gripe porcina (virus de la influenza porcina, SIV),
virus de la enfermedad misteriosa del cerdo (virus PRRS), virus de
la parvovirosis (virus PPV), virus de la peste porcina clásica
(virus HCV o Hog Cholera Virus), circovirus porcino, principalmente
de tipo 2(Porcine CircoVirus type 2, PCV2 o virus del
síndrome de desmedro multisistémico postdestete del lechón),
Actinobacillus pleuropneumoniae,
Mycoplasmahyopneumoniae.
En lo que se refiere a la valencia Aujeszky se
pueden utilizar los genes gB (Robbins A. K. et al.. J. Virol.
1987. 61. 2691-2701 GenBank An # M17321), gC
(Ishikawa K. et al. Vet. Microbiol. 1996. 49.
267-272 GenBank AN # D49435) y/o gD (Rivière M.
et al. J. Virol. 1992. 66. 3424-3434 y Hong
W. Z. et al. GenBank AN # AF086702), en sus formas nativa o
secretadas.
En lo que se refiere a la valencia gripe porcina
se prefiere utilizar los genes HA
(WO-A-98/03658 ejemplos 10 y 12)
(formas nativa o secretada), NA (Nerome K. et al. J. Virol.
1995. 76. 613-624 GenBank AN # D21194) (formas
nativa o secretada) y/o NP
(WO-A-98/03658 ejemplos 11 y
13).
En lo que se refiere a la valencia PRRS se
prefiere utilizar los genes ORF4, ORF3 (formas nativa o secretada),
ORF5 (formas nativa o secretada), ORF6 y/o ORF7 de cepas europeas
(Meulenberg J. et al. Virology. 1993. 192.
62-772) y de cepas americanas (Mardassi H. et
al. Arch. Virol. 1995. 140. 1405-1418).
En lo que se refiere a la valencia peste porcina
clásica se prefiere utilizar los genes E0, E1 (formas nativa o
secretada) y/o E2 (formas nativa o secretada) (Meyers G. et
al. Virology. 1989. 171. 18-27).
En lo que se refiere a la valencia parvovirosis
se prefiere utilizar el gen de cápside VP2 (Vasudevacharya J. et
al. Virology. 1990. 178. 611-616).
En lo que se refiere a la valencia PCV2 se
prefiere utilizar los genes ORF1 y/o ORF2, pero preferentemente
ORF1 y ORF2 (Meehan B. et al. J. Gen. Virol. 1998. 79.
2171-2179).
Las secuencias heterólogas se insertan en
dependencia de señales reguladoras de la transcripción, y en
particular de un promotor, aportadas preferentemente durante la
recombinación. No se excluye, sin embargo, la posibilidad de hacer
que esas secuencias heterólogas se expresen bajo el control de
señales propias del adenovirus que sirve de vector.
Entre los promotores útiles se prefiere la
utilización de promotores eucariotas fuertes, tales como el LTR del
virus del sarcoma de Rous y, preferentemente, del promotor precoz
del citomegalovirus o CMV-IE (CytoMegaloVirus
Immediate Early), principalmente de origen murino
(MCMV-IE) o humano (HCMV-IE), o
también de los de otros orígenes, por ejemplo del cerdo, del mono,
de la rata o de la cobaya.
De forma particularmente ventajosa se pueden
utilizar los promotores CMV-IE con una parte
activadora (en inglés "enhancer")
(US-A-5.168.062,
US-A-4.968.615,
US-A-4.963.481). Puede ser ventajoso
el recurso a fragmentos de esos promotores conservando la actividad
promotora, preferentemente con la parte activadora, por ejemplo los
promotores CMV-IE truncados según
WO-A-98/00166. El especialista se
podrá referir, en busca de más detalles, a la solicitud de patente
WO-A-98/00166, y en particular a su
ejemplo 12.
La presente invención tiene también como objeto
las preparaciones inmunógenas o inmunológicas y las vacunas
porcinas que comprenden un adenovirus recombinante conforme a la
invención en un vehículo o excipiente aceptable desde un punto de
vista veterinario, y en su caso un adyuvante. Por definición, una
preparación inmunógena o inmunológica induce al menos una respuesta
inmunitaria (celular y/o humoral) en el animal después de la
administración. Una vacuna induce una respuesta protectora.
Los adyuvantes se eligen preferentemente entre
los polímeros del ácido acrílico o metacrílico y los copolímeros de
anhídrido maleico y de derivado alquenilo.
Los compuestos preferidos son los polímeros del
ácido acrílico o metacrílico reticulados, principalmente por éteres
polialquenílicos de azúcares o de polialcoholes. Estos compuestos se
conocen con el término carbómero (Pharmeuropa vol. 8 nº 2, junio
1996). El especialista se puede referir también al documento
US-A-2909462, que describe
polímeros acrílicos de ese tipo reticulados por un compuesto
polihidroxilado que tiene al menos 3 grupos hidróxilo,
preferentemente no más de 8, hallándose sustituidos los átomos de
hidrógeno de al menos tres hidróxilos por radicales alifáticos
insaturados que tienen al menos 2 átomos de carbono. Los radicales
preferidos son los que contienen de 2 a 4 átomos de carbono, por
ejemplo vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados.
Los radicales insaturados pueden contener ellos mismos otros
sustituyentes, como el metilo. Los productos vendidos con la
denominación Carbopol® (BF Goodrich, Ohio, USA) son particularmente
apropiados. Están reticulados por una alilsacarosa o por
alilpentaeritritol. Entre ellos se pueden citar los Carbopol® 974P,
934P y 971P.
Entre los copolímeros de anhídrido maleico y de
derivado alquenilo se prefieren los EMA® (Monsanto), que son
copolímeros de anhídrido maleico y de etileno, lineales o
reticulados, por ejemplo reticulados por el diviniléter. Se puede
buscar referencia en J. Fields et al., Nature, 186:
778-780, 4 junio 1960.
Desde el punto de vista de su estructura, los
polímeros de ácidos acrílico o metacrílico y los EMA® están
formados preferentemente por motivos de base con la siguiente
fórmula:
--- --- ---
\melm{\delm{\para}{\hskip-0.5cm
COOH}}{C}{\uelm{\para}{R _{1} }} --- (CH_{2})_{x}
--- \melm{\delm{\para}{\hskip-0.5cm
COOH}}{C}{\uelm{\para}{R _{2} }} --- (CH_{2})_{y}
--- ---
---
en la
que:
- R_{1} y R_{2}, idénticos o diferentes,
representan H o CH_{3}
- x = 0 ó 1, preferentemente x = 1
- y = 1 ó 2, con x + y = 2
Para los EMA®, x = 0 e y = 2. Para los
carbómeros, x = y = 1.
La disolución de estos polímeros en agua conduce
a una solución ácida que se neutralizará, preferentemente hasta el
pH fisiológico, para dar la solución adyuvante a la que se
incorporará la vacuna propiamente dicha. Los grupos carboxílicos
del polímero, entonces, tienen en parte la forma COO-.
Preferentemente se lleva a cabo una solución de
adyuvante según la invención, principalmente de carbómero, en agua
destilada, preferentemente en presencia de cloruro de sodio, siendo
de pH ácido la solución obtenida. Se diluye esta solución madre
añadiendo en la cantidad necesaria (para obtener la concentración
final deseada), o una parte importante de ella, agua cargada con
NaCl, preferentemente agua fisiológica (NaCl 6 g/l), en una o en
varias veces con neutralización concomitante o subsiguiente (pH de
7,3 a 7,4), preferentemente por NaOH. Esta solución de pH
fisiológico se utilizará tal cual para recibir la vacuna,
principalmente conservada en forma liofilizada.
La concentración de polímero en la composición
vacunal final será de entre 0,01% y 2% P/V, más particularmente de
entre 0,06% y 1% P/V, preferentemente de entre 0,1% y 0,6% P/V.
Las preparaciones inmunógenas y vacunas según la
invención pueden comprender varios adenovirus recombinantes
conforme a la invención, que comprendan secuencias nucleotídicas
heterólogas diferentes, provenientes de patógenos idénticos y/o
diferentes.
La presente invención tiene también como objeto
los métodos de inmunización y de vacunación de los cerdos contra
uno o varios patógenos porcinos, comprendida la administración de
dosis eficaces de las preparaciones inmunógenas y vacunas antes
mencionadas. Las dosis serán, por ejemplo, de entre 10^{4} y
10^{7} DICC50.
Está concebida principalmente para la
administración de esas preparaciones inmunógenas y vacunas por vía
mucosa, por ejemplo oral, nasal, ocular, y/o a animales jóvenes que
presentan anticuerpos maternos. Se pueden utilizar también las
otras vías empleadas de forma clásica para la vacunación de los
cerdos (intramuscular en particular, intradérmica...).
La presente invención tiene asimismo como objeto
métodos para la obtención de vectores recombinantes
PAV-3, preparaciones inmunógenas y vacunas que las
incorporan.
Tiene también como objeto la utilización de esos
vectores para la fabricación de las preparaciones inmunógenas y de
las vacunas según la invención, principalmente destinadas a una
administración por vía mucosa y/o a jóvenes animales que presentan
anticuerpos maternos y/o a una administración por las vías
clásicas.
Se describirá ahora la invención de manera más
detallada con la ayuda de formas de realización a título de
ejemplos no limitativos y haciendo referencia a los dibujos, en los
cuales:
Figura 1: Esquema de los plásmidos
pKS-Derecho lTR3, pPoliII-Derecho
lTR3 y plTRsPAV3.
Figura 2: Esquema de los plásmidos pE3PAV3,
pE3dl622CMV-EGFP y
pE3dl622CMV-gD
Figura 3: Mapa de restricción de los plásmidos
pE3PAV3 y pE3dl919
Figura 4: Esquema de los plásmidos
pCMV-EGFP, pCMV-gD y pgD
Figura 5: Mapa de restricción de los plásmidos
pCMV-EGFP, pgD, pE3dl919CMV-EGFP y
pE3dl919CMV-gD
Figura 6: Mapa de restricción de los plásmidos
pE3dl622EGFP y pE3dl919EGFP
Figura 7: Mapa de restricción de los plásmidos
pE3dl622gD y pE3dl919CMV-gD
Figura 8: Mapa de restricción de los plásmidos
pCR-Derecho lTR5, pPoliII-Derecho
lTR5 y plTR-PAV5
Figura 9: Mapa de restricción del plásmido
pE3PAV5
Figura 10: Mapa de restricción de los plásmidos
pE3dl1472CMV-EGFP y
pE3dl1472CMV-gD
Figura 11: Mapa de restricción de los plásmidos
pE3dl1472EGFP y pE3dl1472gD
Figura 12: Mapa físico de PAV-5,
digestión por BamHI
Figura 13: Secuencia de 5614 pares de bases
(región E3 y secuencias adyacentes del virus
PAV-5)
SEQ ID Nº 1: Oligonucleótido ITRPAV3
SEQ ID Nº 2: Oligonucleótido T3
SEQ ID Nº 3: Oligonucleótido T7
SEQ ID Nº 4: Oligonucleótido ITRPAV5
SEQ ID Nº 5: Secuencia de la región E3 del
virus PAV-5
Los medios de cultivo de células y los reactivos
fueron proporcionados por Gibco BRL. A los medios (Dulbecco's MEM
con Glutamax-1 Cat # 61965-026) se
les añadió 1 mM de piruvato de sodio (Cat #
11360-039), de gentamicina (50 \mug/ml, Cat #
15710-031) y de 10% de suero fetal bovino (Cat #
10270-106 lote 40Q5774K).
Se utilizaron las células PK-15
(Nº ATCC CCL33) y ST (Nº ATCC CRL 1756) para el cultivo de
virus.
El virus salvaje adenovirus porcino de tipo 3
(=PAV-3), no patógeno en el cerdo, se obtuvo del
laboratorio del Dr. Eva Nagy (Universidad de Guelph, Servicio de
Patobiología, 50 Stone Road Guelph, ONTARIO, Canadá, NIG 2W1)
(Reddy P. et al. Virus Res. 1996. 43.
99-109).
Condiciones de cultivo y de pasajes: dos veces
por semana se tripsinan las células (solución de tripsina al 2,5%
(Sigma Cat # 044-5075) diluida 50 veces en solución
salina equilibrada de Earle (Gibco-BRL Cat #
14155-030)) y se resuspenden en medio de cultivo
(dilución 1:6). Las células se cultivan a +37° C en presencia de 5%
de CO_{2} antes de volver a ponerlas en cultivo.
Las enzimas de restricción, la Taq polimerasa
para las reacciones de amplificación en cadena, y las otras enzimas
necesarias para diferentes modificaciones de los ADN, fueron
proporcionadas, respectivamente, por New England Biolabs Inc.,
Roche Diagnostics y Gibco-BRL.
Todas esas enzimas fueron utilizadas siguiendo
las recomendaciones de los proveedores. SE pusieron en práctica las
técnicas estándar de biología molecular tal como se describen en
"Molecular Biology: A Laboratory Manual". 2nd edition.
(Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory, New York.
1989).
Las bacterias competentes BJ5183 (Hanahan D. J.
Mol. Biol. 1983. 166. 557-580) fueron preparadas de
la siguiente manera:
Se prepararon 60 ml de un cultivo de esas
bacterias en fase exponencial conforme a la técnica del cloruro de
calcio (Sambrook et al. 1989). Se recolectaron en un volumen
final de 2 ml de CaCl_{2} 50 mM. Se mezclaron 300 \mul de esta
suspensión de bacterias con los diferentes ADN compañeros de
recombinación homóloga contenidos en un volumen de 100 \mul de
Tris-HCl 100 mM de pH 7,4, se dejaron en contacto
durante 30 minutos sobre hielo fundente, después se trataron las
bacterias por un choque térmico a +45° C durante 2 minutos, se
dejaron en reposo sobre hielo fundente durante 10 minutos, y
finalmente se extendieron sobre un medio selectivo.
Se cultivan y amplifican los virus en frascos
Falcon de 10 cm^{2} según las condiciones del ejemplo 1. Cuando
el ECP es completo, se recolectan las células, se lisan por medio de
tres ciclos de congelación/descongelación, y después se clarifica
la suspensión viral por centrifugación a baja velocidad. Los virus
PAV-3 y PAV-5 se purifican en
gradiente de cloruro de cesio (1,34 g/ml) y la banda viral se
recolecta y se purifica, después se obtienen los ADN virales
después de tratamiento con la proteinasa K y de extracción con
fenol-cloroformo (Sambrook et al. 1989).
Estos ADN se utilizaron a continuación para las diferentes etapas de
clonación o de amplificación por polimerasa (ACP).
El ADN genómico del virus PAV-3,
preparado según el ejemplo 3, fue digerido por EcoRI y el fragmento
EcoRI D de 245 pb fue aislado después de electroforesis en gel de
agarosa. A continuación se ligó este fragmento con el plásmido
pBlueScript KS (pBS-KS) (Stratagene Inc. La Jolla,
CA) (GenBank # X52327), previamente digerido por EcoRI y
desfosforilado, para dar el plásmido identificado como
"pKS-EcoDPAV3".
Se llevó a cabo una reacción de ACP con la
matriz del plásmido pKS-EcoDPAV3 y con los
siguientes oligonucleótidos:
ITRPAV3 (SEQ ID Nº 1) (50 mer):
5'
CCTTAATTAAGGTAGGGATAACAGGGTAATCATCATCAATAATATACCGC
3'
y T3 (SEQ ID Nº 2) (20
mer):
5' ATTAACCCTCACTAAAGGGA
3'
El producto de amplificación (367 pb) se trató
con la ADN polimerasa T4 para convertirlo en "extremos libres",
después fue digerido con la enzima ClaI y ligado con el plásmido
pBS-KS, previamente digerido por ClaI y EcoRV, para
dar el plásmido identificado como "pKS-Derecho
ITR3" (figura 1).
El fragmento EcoRI D se liberó entonces del
plásmido pKS-Derecho ITR3 por digestión con las
enzimas BamHI y KpnI, y el fragmento de restricción
BamHI-KpnI de 353 pb se ligó con el plásmido pPolyII
(Lathe R. et al. Gene. 1987. 57. 193-201)
(GenBank # G209113), previamente digerido por BamHI y KpnI, para
generar el plásmido identificado como
"pPolyII-Derecho ITR3" (figura 1).
El ADN genómico del virus PAV-3,
preparado según el ejemplo 3, fue digerido por KpnI para aislar,
después de electroforesis en gel de agarosa, el fragmento terminal
KpnI F de 939 pb. Se ligó este fragmento con el plásmido
pBS-KS, previamente digerido por KpnI y
desfosforilado, para dar el plásmido identificado como
"pKS-KpnFPAV3".
Se realizó a continuación una reacción de ACP
con la matriz del plásmido pKS-KpnFPAV3 y con los
siguientes oligonucleótidos:
ITRPAV3 (SEQ ID Nº 1) (50 mer):
5'
CCTTAATTAAGGTAGGGATAACAGGGTAATCATCATCAATAATATACCGC
3'
y T7 (SEQ IN Nº
3):
5' TAATACGACTCACTATAGGG
3'
El producto de amplificación (1086 pb) fue
tratado con la ADN polimerasa T4 para convertirlo en "extremos
libres", después fue digerido por la enzima XhoI, y ligado con el
plásmido pPolyII-Derecho ITR3, previamente digerido
por BgIII, tratado con la ADN polimerasa T4, después digerido por
XhoI, para generar el plásmido identificado como "plTRsPAV3"
(figura 1).
El plásmido plTRsPAV3 (ejemplo 4) se linealizó
por medio de digestión con ClaI, después se
co-transformó en bacterias competentes BJ5183 con
el ADN genómico del virus PAV-3 preparado según el
ejemplo 2. Esta co-transformación permitió la
generación, por recombinación homóloga en Escherichia coli
(Chartier C. et al. J. Virol. 1996. 70.
4805-4810), de un plásmido que contenía el genoma
completo clonado de PAV-3. Este plásmido se designó
como "pPAV3".
El plásmido pNEB193 (New England BioLabs Cat #
305-1) fue digerido por PacI, tratado con la ADN
polimerasa T4, y después religado sobre sí mismo para generar el
plásmido "pNEBPac-".
El plásmido pPAV3 (ejemplo 5) fue digerido por
KpnI y BamHI para aislar el fragmento KpnI-BamHI de
4344 pb que contenía la región E3 (Reddy et al. Virology.
1998. 251. 414-426). Este fragmento se ligó con el
plásmido pNEBPac-, previamente digerido por KpnI y BamHI para dar
el plásmido "pE3PAV3" (figura 2). Se verificó la secuencia del
fragmento KpnI-BamHI y se encontró que era idéntica
a la secuencia publicada por Reddy P. et al. (Virus
Research. 1995. 36. 97-106 y Virology. 1998. 251.
414-426) (GenBank AN # U10433 y AN # AF083132). El
especialista podrá remitirse a esas referencias.
El plásmido pEGFP-F (Chalfie M.
et al. Science. 1994. 263. 802-805; Clontech
Cat # 6074-1) se modificó para eliminar
completamente el poliligador. Se consiguió esta deleción por medio
de una digestión por BamHI, seguida de un tratamiento con la ADN
polimerasa T4. La religadura sobre sí mismo del vector modificado de
esa manera generó el plásmido pCMV-EGFP. El
plásmido pCMV-EGFP fue digerido a continuación por
las enzimas AsnI y MluI, y después tratado con la ADN polimerasa
T4, para aislar el fragmento AsnI (extremo
libre)-MluI (extremo libre) de 1,6 kpb (= casete de
expresión CMV-EGFP). Este fragmento se ligó con el
plásmido pE3PAV3, previamente digerido por BsrGI y SnaBI y tratado
con la ADN polimerasa T4, para generar el plásmido
pE3dl622CMV-EGFP (figura 2). La deleción creada
entre los sitios SsrGI y SnaBI de la región E3 del virus
PAV-3 tiene un tamaño de 622 pares de bases. Esta
deleción se extiende del nucleótido 1002 al 1624 de la secuencia
publicada por P. Reddy et al. (Virus Research. 1995. 36.
97-106) (GenBank AN # U10433).
El plásmido pCMV-gD (Ambriovic
A. et al. Virology. 1997. 238. 327-335) fue
digerido por SnaBI y ClaI para aislar el fragmento
SnaBI-ClaI de 1,8 kpb (que contiene la parte 3' del
promotor CMV y el gen PRV gD). Este fragmento fue tratado a
continuación con la ADN polimerasa T4 para convertirlo en extremos
libres, y después fue ligado con el plásmido
pE3dl622CMV-EGFP, previamente digerido por SnaBI y
HpaI, para generar el plásmido pE3dl622CMV-gD
(figura 2).
El plásmido pE3PAV3 (véase parte 6.1
supra) fue digerido por SgrAI y SacI para aislar el fragmento
SgrAI-SacI de 644 pb. Este fragmento fue tratado
con la ADN polimerasa T4 para convertirlo en extremos libres, y
después fue ligado con el plásmido pNEBPac- (6.1 supra),
previamente digerido con EcoRI, tratado con la ADN polimerasa T4, y
después digerido con SacI, para generar el plásmido
pSgrAI-SacI.
El plásmido pE3PAV3 fue digerido por SnaBI y
HindIII para aislar el fragmento SnaBI-HindIII de
2,4 kpb. Este fragmento se ligó con el plásmido
pSgrAI-SacI, previamente digerido con PmeI y
HindIII, para generar el plásmido pE3dl919 (figura 3). La deleción
creada entre los sitios SacI y SnaBI de la región E3 del virus
PAV-3 tiene un tamaño de 919 pares de bases. Esta
deleción se extiende del nucleótido 706 al 1624 de la secuencia
publicada por P. Reddy et al. (Virus Research. 1995. 36.
97-106) (GenBank AN # U10433).
El plásmido pCMV-gD (ejemplo
6.1) fue digerido por SnaBI y ClaI para aislar el fragmento
SnaBI-ClaI de 1,8 kpb. Este fragmento fue tratado
entonces con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa para
convertirlo en extremos libres, después se ligó con el plásmido
pCMV-EGFP (ejemplo 6.1), previamente digerido por
SnaBI y HpaI y después desfosforilado, para generar el plásmido pgD
(figura 4).
El plásmido pCMV-EGFP (ejemplo
6.1) fue digerido por AsnI y MluI para aislar el fragmento
AsnI-MluI de 1,8 kpb (casete
CMV-EGFP). Este fragmento fue tratado con el
fragmento Klenow de la ADN polimerasa para convertirlo en extremos
libres, después fue ligado con el plásmido pE3dl919, previamente
digerido con AscI, tratado con el fragmento Klenow de la ADN
polimerasa para convertirlo en extremos libres, y después
desfosforilado, para generar el plásmido
pE3dl919CMV-EGFP (figura 5).
El plásmido pgD (supra) fue digerido por
AsnI y MluI para aislar el fragmento AsnI-MluI de
2,3 kpb. Este fragmento fue tratado con la ADN polimerasa T4 para
convertirlo en extremos libres, después fue ligado con el plásmido
pE3dl919, previamente digerido por AsnI y tratado con el fragmento
Klenow de la ADN polimerasa para convertirlo en extremos libres, y
después desfosforilado, para generar el plásmido
pE3dl919CMV-gD (figura 5).
El plásmido pE3dl622CMV-EGFP
(ejemplo 6.1) fue digerido por KpnI y BamHI para aislar el fragmento
KpnI-BamHI de 5,5 kpb. Este fragmento fue
co-transformado en bacterias competentes BJ5183 con
el plásmido pPAV3 (ejemplo 5) linealizado por medio de digestión
por la enzima SnaBI. Esta co-transformación condujo
a la generación, por recombinación homóloga en Escherichia
coli, del plásmido pPAV3dl622CMV-EGFP.
El plásmido pE3CMVgD (ejemplo 6.1) fue digerido
por EcoRI y PmeI para aislar el fragmento EcoRI-PmeI
de 6,0 kpb. Este fragmento fue co-transformado en
bacterias competentes BJ5183 con el plásmido pPAV3 (ejemplo 5)
linealizado por medio de digestión por la enzima SnaBI. Esta
co-transformación condujo a la generación, por
recombinación homóloga en Escherichia coli, del plásmido
pPAV3dl622CMVgD.
El plásmido pE3dl919CMV-EGFP
(ejemplo 6.2) fue linealizado por medio de HindIII, y después
co-transformado en bacterias competentes BJ5183 con
el plásmido pPAV3 (ejemplo 5) linealizado por medio de digestión por
la enzima SnaBI. Esta co-transformación condujo a
la generación, por recombinación homóloga en Escherichia
coli, del plásmido pPAV3dl919CMV-EGFP.
El plásmido pE3dl919CMV-gD
(ejemplo 6.2) fue linealizado por medio de HindIII, y después
co-transformado en bacterias competentes BJ5183 con
el plásmido pPAV3 (ejemplo 5) linealizado por medio de digestión por
la enzima SnaBI. Esta co-transformación condujo a
la generación, por recombinación homóloga en Escherichia
coli, del plásmido pPAV3dl919CMV-gD.
El plásmido pCMV-EGFP (ejemplo
6.1) fue digerido por NheI y MluI para aislar el fragmento
NheI-MluI de 1,0 kpb. Este fragmento fue tratado
con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa para convertirlo en
extremos libres, después ligado con el plásmido pE3PAV3 (ejemplo
6.1), previamente digerido por BsrGI, tratado con el fragmento
Klenow de la ADN polimerasa, y finalmente digerido por SnaBI, para
generar el plásmido pE3dl622EGFP
(figura 6).
(figura 6).
El plásmido pCMV-EGFP fue
digerido por NheI y MluI para aislar el fragmento
NheI-MluI de 1,0 kpb. Este fragmento fue tratado
con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa, y después
desfosforilado, para generar el plásmido pE3dl919EGFP (figura
6).
El plásmido pgD (ejemplo 6.2) fue digerido por
XhoI y ClaI para aislar el fragmento XhoI-ClaI de
1,5 kpb. Este fragmento fue tratado con el fragmento Klenow de la
ADN polimerasa para convertirlo en extremos libres, después fue
ligado con el plásmido pE3PAV3 (ejemplo 6.1), previamente digerido
por BsrGI, tratado con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa,
después digerido por SnaBI, para generar el plásmido pE3dl622gD
(figura 7).
El plásmido pgD (ejemplo 6.2) fue digerido por
XhoI y ClaI para aislar el fragmento XhoI-ClaI de
1,5 kpb. Este fragmento fue tratado con el fragmento Klenow de la
ADN polimerasa para convertirlo en extremos libres, después fue
ligado con el plásmido pE3dl919 (ejemplo 6.2), previamente digerido
por AscI, tratado con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa, y
finalmente desfosforilado, para generar el plásmido pE3dl919gD
(figura 7).
El plásmido pE3dl622EGFP (ejemplo 9.1) fue
digerido por KpnI y BamHI, y después co-transformado
en bacterias competentes BJ5183 con el plásmido pPAV3 (ejemplo 5),
previamente linealizado por medio de digestión por SnaBI. Esta
co-transformación permitió generar, por
recombinación homóloga en Escherichia coli, el plásmido
pPAV3dl622EGFP.
El plásmido pE3dl622gD (ejemplo 9.2) fue
digerido por EcoRI y PmeI, y después co-transformado
en bacterias competentes BJ5183 con el plásmido pPAV3 (ejemplo 5),
previamente linealizado por medio de digestión por SnaBI. Esta
co-transformación permitió generar, por
recombinación homóloga en Escherichia coli, el plásmido
pPAV3dl622gD.
El plásmido pE3dl919EGFP (ejemplo 9.1) fue
linealizado por digestión con HindIII, y después
co-transformado en bacterias competentes BJ5183 con
el plásmido pPAV3 (ejemplo 3), previamente linealizado por medio de
digestión por SnaBI. Esta co-transformación
permitió generar, por recombinación homóloga en Escherichia
coli, el plásmido pPAV3dl919EGFP.
El plásmido pE3dl919gD (ejemplo 9.2) fue
linealizado por digestión con HindIII, y después
co-transformado en bacterias competentes BJ5183 con
el plásmido pPAV3 (ejemplo 5), previamente linealizado por medio de
digestión por SnaBI. Esta co-transformación
permitió generar, por recombinación homóloga en Escherichia
coli, el plásmido pPAV3dl919gD.
Las células PK-15 o ST (véase
ejemplo 1) se transfectan en placa de 6 pozos a una densidad de
confluencia de 60-80% con 2 \mug de ADN genómico
de PAV-3 recombinante, previamente digerido por
PacI, diluido en presencia de 4 a 12 \mul de LipofectAMINA
(Gibbo-BRL Cat # 18324-012) según la
línea celular.
Después de la transfección según las condiciones
recomendadas por el proveedor, se dejaron las células en cultivo
durante algunos días hasta la aparición de un ECP viral. Se llevó a
cabo entonces un nuevo pasaje en cultivo de células para amplificar
el virus recombinante obtenido.
La transfección realizada con el plásmido
pPAV3dl622CMV-EGFP (ejemplo 7) generó el virus
recombinante vPAV3-1.
La transfección realizada con el plásmido
pPAV3dl622CMV-gD (ejemplo 7) generó el virus
recombinante vPAV3-2.
La transfección realizada con el plásmido
pPAV3dl919CMV-EGFP (ejemplo 8) generó el virus
recombinante vPAV3-3.
La transfección realizada con el plásmido
pPAV3dl919CMV-gD (ejemplo 8) generó el virus
recombinante vPAV3-4.
La transfección realizada con el plásmido
pPAV3dl622EGFP (ejemplo 9.3) generó el virus recombinante
vPAV3-5.
La transfección realizada con el plásmido
pPAV3dl622gD (ejemplo 9.3) generó el virus recombinante
vPAV3-6.
La transfección realizada con el plásmido
pPAV3dl919EGFP (ejemplo 9.3) generó el virus recombinante
vPAV3-7.
La transfección realizada con el plásmido
pPAV3dl919gD (ejemplo 9.3) generó el virus recombinante
vPAV3-8.
El ADN genómico del virus PAV-5,
preparado según el ejemplo 3, fue digerido por EcoRI y el fragmento
terminal derecho EcoRI I de 0,9 kpb fue aislado después de
electroforesis en gel de agarosa. Este fragmento fue ligado con el
plásmido pBS-KS, previamente digerido por EcoRI y
desfosforilado, para generar el plásmido
"pKS-Derecho ITR5".
Se llevó a cabo entonces una reacción de ACP con
la matriz del plásmido pKS-Derecho ITR5 y con los
siguientes oligonucleótidos:
ITRPAV5 (SEQ ID Nº 4) (50 mer):
5'
CCTTAATTAAGGTAGGGATAACAGGGTAATCATCATCAATAATATACGGA
3'
y T3 (SEQ ID Nº 2) (20
mer):
5' ATTAACCCTCACTAAAGGGA
3'
\vskip1.000000\baselineskip
para producir un fragmento de 1,0
kpb. Este fragmento fue ligado con el plásmido pCRII (InVitrogen
Original TA Cloning Kit Cat # K2000-01) para dar el
plásmido "pCR-Derecho ITR5" (figura
8).
El ADN genómico del virus PAV-5,
preparado según el ejemplo 3, fue digerido por HindIII, y el
fragmento terminal izquierdo HindIII de 1,2 kpb fue aislado después
de electroforesis en gel de agarosa. Este fragmento fue ligado con
el plásmido pBS-KS, previamente digerido por HindIII
y desfosforilado, para generar el plásmido
"pKS-Izquierdo ITR5".
Se llevó a cabo entonces una reacción de ACP con
la matriz del plásmido pKS-Izquierdo ITR5 y con los
siguientes oligonucleótidos:
ITRPAV5 (SEQ ID Nº 4):
5'
CCTTAATTAAGGTAGGGATAACAGGGTAATCATCATCAATAATATACGGA
3'
y T7 (SEQ ID Nº 3) (20
mer):
5' TAATACGACTCACTATAGGG
3'
\vskip1.000000\baselineskip
para producir un fragmento de 1,3
kpb. Este fragmento fue ligado con el plásmido pCRII para dar el
plásmido "pCR-Izquierdo ITR5" (figura
8).
El plásmido pCR-Derecho ITR5
(ejemplo 11.1) fue digerido por BamHI y HindIII para aislar el
fragmento BamHI-HindIII de 1,0 kpb. Este fragmento
fue ligado a continuación con el plásmido pPolyII (véase ejemplo 4),
previamente digerido por BamHI y HindIII, para generar el plásmido
"pPolyII-Derecho ITR5" (figura 8).
El plásmido pCR-Izquierdo ITR5
(ejemplo 11.2) fue digerido por BamHI y HindIII para aislar el
fragmento BamHI-HindIII de 1,3 kpb. Este fragmento
se ligó a continuación con el plásmido
pPolyII-Derecho ITR5, previamente digerido por
BgIII y HindIII, para generar el plásmido "pITRs PAV5" (figura
8).
El plásmido pITRsPAV5 fue linealizado por medio
de digestión por HindIII. Entonces se co-transformó
el fragmento obtenido en bacterias competentes BJ5183 con el ADN
genómico del virus PAV-5 preparado según el ejemplo
3. Esta co-transformación permitió generar por
recombinación homóloga un plásmido que contenía la totalidad del
genoma del virus PAV-5. Este plásmido fue designado
"pPAV5".
El plásmido pPAV5 (ejemplo 12) fue digerido por
SacI y MluI para aislar el fragmento SacI-MluI de
4372 que contenía la región E3. Este fragmento se ligó con el
plásmido pNEB193 (ejemplo 6.1), previamente digerido por SmaI y
AscI, para dar el plásmido "pE3PAV5" (figura 9).
El fragmento SacI-MluI clonado
en el plásmido pE3PAV5 fue secuenciado y analizado por completo. El
análisis de esta secuencia y de las secuencias adyacentes presentes
en el plásmido pPAV5 confirmó que el fragmento clonado representaba
bien la región E3 del virus PAV-5. La secuencia de
esta región (5614 pares de bases) (SEQ ID Nº 5) se presenta en la
figura 13.
El plásmido pCMV-EGFP (ejemplo
6.1) fue digerido por las enzimas AsnI y MluI, y después tratado con
la ADN polimerasa T4 para aislar el fragmento AsnI (extremo
libre)-MjuI (extremo libre) de 1,6 kpb. Este
fragmento fue ligado con el plásmido pE3PAV5 (ejemplo 13.1),
previamente digerido por PvuII y BgII, y tratado con la ADN
polimerasa T4 para generar el plásmido
pE3dl1472CMV-EGFP (figura 10). La deleción
introducida entre los sitios PvuII y BgII tiene un tamaño de 1472
pb. Esta deleción se encuentra comprendida entre los nucleótidos
2389 y 3861 de la secuencia presentada en la figura 13 (SEQ ID Nº
5).
El plásmido pgD (ejemplo 6.1) fue digerido por
las enzimas AsnI y MluI para aislar el fragmento
AsnI-MluI de 2,3 kpb. Este fragmento fue tratado a
continuación con la ADN polimerasa T4 para convertirlo en extremos
libres, y después fue ligado con el plásmido pE3PAV5, previamente
digerido por PvuII y BgII y tratado con la ADN polimerasa T4, para
generar el plásmido pE3dl1472CMVgD (figura 10).
El plásmido pCMV-EGFP fue
digerido por NheI y MluI para aislar el fragmento de 1,0 kpb. Este
fragmento fue tratado con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa
para convertirlo en extremos libres, y después ligado con el
plásmido pE3PAV5, previamente digerido por PvuII y BgII, tratado con
la ADN polimerasa T4, para generar el plásmido pE3dl1472EGFP
(figura 11).
El plásmido pCMVgD (ejemplo 6.1) fue digerido
por XhoI y ClaI para aislar el fragmento XhoI-ClaI
de 1,5 kpb. Este fragmento fue tratado con el fragmento Klenow de
la ADN polimerasa para convertirlo en extremos libres, y después
fue ligado con el plásmido pE3PAV5, previamente digerido por PvuII y
BgII, tratado con la ADN polimerasa T4, para generar el plásmido
pE3dl1472gD (figura 12).
El plásmido pE3dl1472CMV-EGFP
(ejemplo 13.2) fue linealizado por medio de PmeI, y después
co-transformado en bacterias competentes BJ5183 con
el plásmido pPAV5 (ejemplo 12) linealizado por medio de digestión
parcial por la enzima BamHI (sitio de empalme de los subfragmentos
de restricción BamHI A-BamHI D, figura 12). Esta
co-transformación condujo a la generación, por
recombinación homóloga en Escherichia coli, del plásmido
pPAV5dl1472CMV-EGFP.
El plásmido pE3dl1472CMVgD (ejemplo 13.2) fue
linealizado por PmeI, y después co-transformado en
bacterias competentes BJ5183 con el plásmido pPAV5 (ejemplo 12)
linealizado por medio de digestión parcial por la enzima BamHI
(sitio de empalme de los subfragmentos de restricción BamHI
A-BamHI D, figura 12). Esta
co-transformación condujo a la generación, por
recombinación homóloga en Escherichia coli, del plásmido
pPAV5dl1472CMV-
gD.
gD.
El plásmido pE3dl1472EGFP (ejemplo 13.2) fue
linealizado por medio de PmeI, y después
co-transformado en bacterias competentes BJ5183 con
el plásmido pPAV5 (ejemplo 12) linealizado por medio de digestión
parcial por la enzima BamHI (sitio de empalme de los subfragmentos
de restricción BamHI A-BamHI D, figura 12). Esta
co-transformación condujo a la generación, por
recombinación homóloga en Escherichia coli, del plásmido
pPAV5dl1472EGFP.
El plásmido pE3dl1472gD (ejemplo 13.2) fue
linealizado por medio de PmeI, y después
co-transformado en bacterias competentes BJJ5183
con el plásmido pPAV5 (ejemplo 12) linealizado por medio de
digestión parcial por la enzima BamHI (sitio de empalme de los
subfragmentos de restricción BamHI A-BamHI D, figura
12). Esta co-transformación condujo a la
generación, por recombinación homóloga en Escherichia coli,
del plásmido pPAV5dl1472gD.
\newpage
Las células PK-15 o ST (véase
ejemplo 1) se transfectan en placa de 6 pozos a una densidad de
confluencia de 60-80% con 2 \mug de ADN genómico
de PAV-5 recombinante, previamente digerido por
PacI, diluido en presencia de 4 a 12 \mul de LipofectAMINA
(Gibbo-BRL Cat # 18324-012) según
las líneas celulares.
Después de la transfección según las condiciones
recomendadas por el proveedor, se dejaron las células en cultivo
durante algunos días hasta la aparición de un ECP viral. Se llevó a
cabo entonces un pasaje para amplificar el virus recombinante
obtenido.
La transfección realizada con el plásmido
pPAV5dl1472CMV-EGFP (ejemplo 14) generó el virus
recombinante vPAV5-1.
La transfección realizada con el plásmido
pPAV5dl1472CMV-gD (ejemplo 14) generó el virus
recombinante vPAV5-2.
La transfección realizada con el plásmido
pPAV5dl1472EGFP (ejemplo 15) generó el virus recombinante
\hbox{vPAV5-3.}
La transfección realizada con el plásmido
pPAV5dl1472gD (ejemplo 15) generó el virus recombinante
vPAV5-4.
Los virus recombinantes obtenidos según la
invención se cultivan y amplifican en cultivo de células
PK-15. Se recolectan los sobrenadantes después de
observar un efecto citopatógeno completo. Después de una
clarificación por centrifugación a baja velocidad para eliminar los
restos celulares, y luego centrifugación para concentrar los
viriones y el lavado del sedimento viral, se recoge el sedimento con
una solución de medio de cultivo. Se mide el título viral de estas
suspensiones. Entonces se ajusta por dilución el título viral, si es
necesario, con el fin de conseguir un título viral comprendido
entre 10^{4} dosis infectantes 50% en cultivo de células (DICC50)
y 10^{7} DICC50/ml.
Las suspensiones virales pueden ser, o bien
congeladas, o bien preferentemente liofilizadas en presencia de un
sustrato de liofilización.
Después de la descongelación, o después de
recoger las dosis liofilizadas en agua para preparaciones
inyectables, y en su caso la adición de un adyuvante, se vacunan
los cerdos con dosis de entre 10^{4} y 10^{7} DICC50 de cada
virus recombinante. Las vacunas comprenden uno o varios virus PAV
recombinantes, cada uno de los cuales expresa inmunógenos
diferentes.
Las vacunas se administran, o bien por inyección
con aguja (vía intramuscular) con un volumen de 2 ml, o bien por
vía mucosa (vía intranasal o instilación ocular) (volúmenes
adaptados a cada vía).
Se pueden llevar a cabo asimismo inyecciones por
vía intradérmica por medio de un inyector sin aguja, como por
ejemplo el aparato PIGJET (Societé Endoscoptic, Laon, Francia).
Se puso en práctica un protocolo de
vacunación/ensayo para evaluar la eficacia de una vacuna constituida
por una suspensión del virus recombinante vPAV3-2
no adyuvado (ejemplo 10 de la presente invención).
Se formaron grupos de 6 lechones de 8 a 10
semanas de edad, nacidos de cerdas que habían sido vacunadas contra
el virus de la enfermedad de Aujeszky (PRV) al comienzo de la
gestación. Todos los lechones tenían bastantes anticuerpos maternos
anti-PRV en el día D0 de la vacunación. Los lechones
de los grupos 1 y 2 fueron vacunados el D0 por vía intranasal con 1
mililitro (ml) de una suspensión del virus recombinante
vPAV3-2 (PAV-3/PRV gD) con un
título de 10^{7} DICC50/ml (0,5 ml por orificio nasal). El grupo 2
fue vacunado de la misma manera, pero recibió asimismo una segunda
administración el D12. El grupo 3 recibió el D0 por vía
intramuscular 1 ml de una suspensión viral de
PAV-3/gD con un título de 10^{7} DICC50/ml. El
grupo 4 fue vacunado de la misma manera que el grupo 3, pero
recibió una segunda inyección de suspensión viral el D21. El grupo 5
no fue vacunado y sirvió de grupo testigo negativo para el
ensayo.
Se realizó el ensayo en todos los grupos el D35
mediante la administración de 2 ml (1 ml por orificio nasal) de una
suspensión de la cepa PRV NIA3 con un título de como mínimo
10^{7,3} pfu/ml.
Después del ensayo se realizó un seguimiento de
los cerdos sobre criterios de evolución ponderal (delta G7)
(Stellmann C. et al. J. Biol. Standard. 1989. 17.
1-11) (D0 a D7 después del ensayo), de nivel de
excreción viral a la altura de las mucosas nasales, y sobre los
títulos de anticuerpos ELISA y seroneutralizantes
anti-PRV.
Tiene que entenderse, por supuesto, que la
invención definida por las reivindicaciones del anexo no se limita
a las formas de realización particulares indicadas en la anterior
descripción.
<110> MERIAL Ecole Nationale Vétérinaire
de Maisons ALFORT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Vacunas y vectores virales basados
en adenovirus porcinos recombinantes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PAV EP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 00/903750
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2000-02-08
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR 99/01813
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-02-11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccttaattaa ggtagggata acagggtaat catcatcaat aatataccgc
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattaaccctc actaaaggga
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaatacgact cactataggg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccttaattaa ggtagggata acagggtaat catcatcaat aatatacgga
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5614
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus porcino 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 623
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus porcino 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (13)
1. Un adenovirus porcino recombinante de
serotipo 3 (PAV-3) que contiene al menos un ácido
nucleico heterólogo que codifica al menos un inmunógeno, habiéndose
insertado el ácido nucleico heterólogo en la región E3 del genoma
de PAV-3, situada entre el gen que codifica la
proteína pVIII y el que codifica la fibra, siendo capaz el
adenovirus recombinante de replicarse in vivo y de expresar
el inmunógeno, eligiéndose el inmunógeno del grupo que consiste en:
inmunógeno del circovirus porcino tipo 2, gB del virus de la
enfermedad de Aujeszky, gC del virus de la enfermedad de Aujeszky,
inmunógeno del virus de la gripe porcina, VP2 del virus de la
parvovirosis, ORF3 del virus de la enfermedad misteriosa del cerdo
(síndrome respiratorio y reproductivo porcino), ORF4 del virus de
la enfermedad misteriosa del cerdo, ORF6 del virus de la enfermedad
misteriosa del cerdo, ORF7 del virus de la enfermedad misteriosa
del cerdo, E0 del virus de la peste porcina clásica, E1 del virus de
la peste porcina clásica e inmunógeno de Actinobacillus
pleuropneumoniae.
2. Adenovirus según la reivindicación 1, en el
que el ácido nucleico heterólogo se ha insertado en la región E3
del genoma de PAV-3, en una zona de inserción que en
la cepa 6618 tiene la secuencia representada por SEQ ID Nº: 6.
3. Adenovirus según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en el que la zona de inserción presenta una
deleción.
4. Adenovirus según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el ácido nucleico heterólogo
codifica al menos un inmunógeno del circovirus porcino tipo 2.
5. Adenovirus según la reivindicación 4, en el
que el ácido nucleico heterólogo codifica ORF1, ORF2 o ORF1 y ORF2
del circovirus porcino tipo 2.
6. Adenovirus según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el ácido nucleico heterólogo
codifica HA, NA y/o NP del virus de la gripe porcina.
7. Adenovirus porcino según una de las
reivindicaciones 1 a 6, que comprende una secuencia nucleotídica
heteróloga que codifica una citocina porcina.
8. Adenovirus según la reivindicación 7, en el
que la citocina porcina se elige del grupo que consiste en
GM-CSF, IL-4, IL-12
e IL-18.
9. Vacuna porcina recombinante que comprende un
adenovirus porcino PAV-3 recombinante según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y un vehículo o
excipiente aceptable desde un punto de vista veterinario.
10. Vacuna porcina recombinante según la
reivindicación 9 que comprende varios adenovirus porcinos
recombinantes PAV-3 según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, los cuales comprenden secuencias
nucleotídicas heterólogas diferentes.
11. Vacuna porcina recombinante según las
reivindicaciones 9 ó 10 que comprende un adyuvante.
12. Vacuna porcina recombinante según la
reivindicación 11 en la el adyuvante se elige de entre los polímeros
de los ácidos acrílico o metacrílico y los copolímeros de anhídrido
maleico y de derivado alquenilo.
13. Vacuna porcina recombinante según la
reivindicación 12 en la que el adyuvante es un carbómero.
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