ES2258970T3 - Vectores y vacunas viricas a base de adenovirus porcinos recombinados. - Google Patents

Vectores y vacunas viricas a base de adenovirus porcinos recombinados.

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Abstract

Un adenovirus porcino recombinante de serotipo 3 (PAV-3) que contiene al menos un ácido nucleico heterólogo que codifica al menos un inmunógeno, habiéndose insertado el ácido nucleico heterólogo en la región E3 del genoma de PAV-3, situada entre el gen que codifica la proteína pVIII y el que codifica la fibra, siendo capaz el adenovirus recombinante de replicarse in vivo y de expresar el inmunógeno, eligiéndose el inmunógeno del grupo que consiste en inmunógeno del circovirus porcino tipo 2, gB del virus de la enfermedad de Aujeszky, gC del virus de la enfermedad de Aujeszky, inmunógeno del virus de la gripe porcina, VP2 del virus de la parvovirosis, ORF3 del virus de la enfermedad misteriosa del cerdo (síndrome respiratorio y reproductivo porcino), ORF4 del virus de la enfermedad misteriosa del cerdo, ORF6 del virus de la enfermedad misteriosa del cerdo, ORF7 del virus de la enfermedad misteriosa del cerdo, E0 del virus de la peste porcina clásica, E1 del virus de la peste porcina clásicae inmunógeno de Actinobacillus pleuropneumoniae.

Description

Vectores y vacunas víricas a base de adenovirus porcinos recombinados.
La presente invención se refiere a adenovirus porcinos de serotipos 3 y 5 recombinantes por inserción de secuencias nucleotídicas heterólogas, siendo capaces estos adenovirus de replicarse in vivo de manera autónoma y de expresar esas secuencias heterólogas. La invención se refiere también a las vacunas porcinas obtenidas, a los métodos de inmunización de los cerdos utilizándolas, a vectores de adenovirus con deleciones y replicantes, y a los procedimientos para la obtención de esos adenovirus, vacunas y vectores.
Los documentos que se citan en la descripción, así como los que se citan en esos documentos, se incorporan a la presente por referencia.
Los adenovirus son virus de molécula de ADN de doble hebra lineal, con secuencias terminales invertidas y repetidas en cada extremo. Los adenovirus forman parte de la familia de los Adenoviridae, responsables de enfermedades que afectan a un gran número de especies, como por ejemplo a las especies de simios, a la bovina, ovina, porcina, equina, murina, canina y a las aviarias. Las infecciones con adenovirus se pueden caracterizar, según las especies y según los tipos de adenovirus, por signos de encefalitis, de neumonías, de lesiones renales, de diarreas y de
hepatitis.
El genoma de los adenovirus varía de una especie a otra [(T. Adrian et al., Arch. Virol. 1986, 91, 277-290), (J. Hamelin et al., J. Clin. Microbiol. 1988, 26, 31-33), (R. Assaf et al., Can. J. Comp. Med. 1983, 47, 460-463), (T. Kurokawa et al., J. Virol. 1978, 28, 212-218), (S.-L. Hu et al., J. Virol. 1984, 51, 880-883), (L. Zsak et al., Intervirology 1984, 22, 110-114)]. Los adenovirus de los animales, al contrario que los adenovirus humanos, tienen un espectro de huésped muy limitado y a menudo solamente infectan a los animales pertenecientes a su especie de origen.
El primer adenovirus porcino (en inglés: "Porcine AdenoVirus" o PAV) fue aislado en 1964 (D. Haig et al., J. Comp. Pathol., 1964, 74, 81-84). Desde esa fecha se han identificado y descrito 5 serotipos de adenovirus porcinos (Hirahara et al., J. Vet. Sci. 1990, 52, 407-409). Los adenovirus de los serotipos 1 y 2 están asociados a diarreas; los adenovirus del serotipo 4 están asociados a síntomas de neumonía y de encefalitis. Otros adenovirus porcinos han sido clasificados en un quinto serotipo basándose en el hecho de su ausencia de neutralización cruzada con antisueros específicos de los PAV de los serotipos 1 a 4. Se ha analizado el genoma de PAV-5 y se ha establecido un mapa de restricción (Tuboly et al., Virus Res. 1995, 37, 49-54). Ese análisis mostró la ausencia de similitudes entre los mapas de restricción de los PAV-5 y los de los PAV de los otros serotipos: PAV-1 y PAV-2 (Reddy et al., Arch. Virol. 1995, 140, 195-200), PAV-3 (Reddy et al., Intervirology 1993, 36, 161-168), y PAV-4 (Kleiboeker et al., Arch. Virol. 1993, 133, 357-368). Entre los serotipos 3 y 5 existen cepas naturalmente no patógenas para el cerdo.
Los PAV tienen un genoma de un tamaño de entre aproximadamente 32 y aproximadamente 34 kbp. Recientemente se ha establecido la secuencia completa del virus PAV-3 y se ha depositado en el banco de datos GenBank con el número AF083132 (P. S. Reddy et al., Virol. 1998, 251, 414-426); su tamaño es de 34094 pares de bases (pb). El genoma de PAV-4 tiene un tamaño de aproximadamente 32 kpb, y el de PAV-5 tiene un tamaño de aproximadamente 33,2 kpb. No se ha secuenciado ni publicado el genoma completo de PAV-5, y en particular la región E3.
La principal aplicación que se pretende para los adenovirus se encuentra en el dominio de la terapia génica en el hombre, y se ha propuesto un gran número de construcciones y de sistemas. Los adenovirus han sido propuestos asimismo como vectores recombinantes en composiciones vacunales para la protección de los humanos y de los animales contra numerosos virus patógenos.
Hasta la fecha se han desarrollado dos estrategias de construcción de vectores de adenovirus recombinantes (M. Eloit & M. Adam, J. Gen. Virol. 1995, 76, 1583-1589).
La primera estrategia consiste en la inserción de casetes de expresión en regiones indispensables para la replicación de adenovirus; de ahí la necesidad de desarrollar de forma paralela sistemas de transcomplementación para poder asegurar la replicación de los virus. Para los adenovirus porcinos se ha propuesto la región E1 como sitio de inserción (P. S. Reddy et al., Virus Res. 1998, 58, 97-106). Los vectores recombinantes construidos de esta manera son llamados "no replicantes", pues no se pueden replicar en el huésped al que se le han administrado.
Como variante de esta primera estrategia se puede utilizar un virus no replicante en el animal de destino. Ya se ha insertado en particular el casete de expresión PRV gD en el sitio E1A del adenovirus humano de serotipo 5, no replicante en el cerdo (M. Monteil et al., J. Gen Virol. 1997, 78, 3303-3310; A. Ambriovic et al., Virol. 1997, 238, 327-335).
La segunda estrategia consiste en la inserción de casetes de expresión a la altura de regiones del genoma viral que no son esenciales para la replicación del adenovirus. La dificultad de determinar regiones no esenciales en los adenovirus y la presencia de una cápside rígida hacen difícil de poner en práctica esta segunda estrategia.
Una de las características esenciales de los adenovirus, en efecto, es que tienen una cápside rígida que limita estrictamente el tamaño de la molécula de ADN que se puede encapsidar en ella. De manera general se considera que es posible encapsidar una molécula de ADN correspondiente a entre 105 y 114% del tamaño del genoma, lo que corresponde, según el tamaño de los genomas, a inserciones de entre aproximadamente 1,7 y aproximadamente 3,9 kpb. En el caso de tamaños excesivos se pueden producir en el seno del genoma recombinante deleciones y/o reordenaciones no deseadas.
La región E3 no se conserva, ni en tamaño ni en organización genética, de un adenovirus de una especie dada a un adenovirus de otra especie, ni entre los adenovirus porcinos de diferentes serotipos (S. Kleiboeker, Virus Res. 1994, 31, 17-25).
La región E3 del virus PAV-3 tiene un tamaño de 1179 pares de bases. Se trata de una región compleja que codifica al menos 3 Marcos de Lectura Abiertos (MLA). Estos MLA se superponen entre ellos, y el primer MLA se superpone también parcialmente al gen que codifica la proteína pVIII (P. S. Reddy et al., Virus Res. 1995, 36, 97-106), que es una proteína esencial.
La presencia de estos MLA que se superponen en la región E3 supone una dificultad importante para determinar los sitios de las inserciones y/o los límites de las deleciones, de manera que los adenovirus recombinantes siguen siendo replicantes en los porcinos.
La secuencia de ácidos aminados codificada por el segundo MLA de la región E3 no muestra ninguna homología entre los adenovirus PAV-3 y HAV-2 (humano, de serotipo 2), ni con ninguna proteína de adenovirus conocida actualmente (P. S. Reddy et al., Virus Res. 1995, 36, 97-106). Las secuencias de ácidos aminados predichas según la secuencia nucleotídica del primer MLA de la región E3 en el PAV-3 solamente son idénticas en un 33,3% a la del adenovirus canino de serotipo 2 (CAV-2). No solamente no son homólogas las proteínas codificadas por regiones E3 de diferentes adenovirus, sino que tampoco las codificadas por los MLA de la región E3 muestran ninguna homología entre los adenovirus PAV-3 y PAV-4 (S. B. Kleiboeker, Virus Res. 1994, 31, 17-25).
La región E3 tiene un tamaño de 1162 pb en PAV-1 (con 5 MLA); es de 1222 pb en PAV-2 (con 5 MLA) (P. S. Reddy et al., Virus Res. 1996, 43, 99-109), y de 1879 pb en PAV-4 (con 6 MLA). Solamente el cuarto MLA de la región E3 del virus PAV-4 (correspondiente a una proteína de 13,2 kDa) presenta una homología con otro MLA conocido de la región 3, que codifica la proteína 14,7 kDa del adenovirus humano de tipo 5 (en inglés Human AdenoVirus 4 o HAV-5). La región E3 de PAV-4 no presenta ninguna homología de secuencia con las regiones E3 de los otros adenovirus porcinos, en particular con las de PAV-3 y de PAV-5.
Además de la dificultad de definir sus límites para conservar el carácter replicante in vivo, las deleciones en la región E3 tampoco están libres de riesgos. Las deleciones en la región E3, en efecto, pueden tener consecuencias sobre la patogenicidad de los adenovirus recombinantes. Se ha observado, por ejemplo, que una deleción en la región E3 del virus HAV-5 aumentaba la patogenicidad pulmonar de ese virus en el modelo experimental de infección de la rata del algodón (Ginsberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 86, 3823-3827).
Esto demuestra que las consecuencias de las deleciones en la región E3 de un adenovirus deben considerarse caso por caso, y no por simple trasposición de las observaciones hechas en un adenovirus concreto a otro. La organización genética de la región E3 de PAV-3 es única, y también lo es la de la región E3 de PAV-5.
La localización precisa de un sitio de inserción en la región E3 se complica aún más debido al hecho de la presencia de zonas de empalme y de poliadenilación complejas, zonas características de los adenovirus (imperiale et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1995, 199, 139-171). Las zonas de empalme localizadas en la región E3 son importantes para la maduración de numerosos ARN mensajeros esenciales codificados por las secuencias localizadas fuera de la región E3. La misma región E3 se encuentra situada en una parte del genoma viral de elevada actividad transcripcional (P. Sharp, 1984, in The Adenovirus, Ed. H. S. Ginsberg, Plenun Press, New York and London, 173-204); la inserción de una secuencia nucleotídica heteróloga en la región E3 puede tener un impacto negativo sobre la actividad biológica del virus recombinante. Además de eso, la región E3 se encuentra localizada más abajo del promotor tardío mayor (major late promoter, MLP), región en la que se ha demostrado la existencia de interferencias entre la transcripción de la inserción y la iniciada por el promotor MLP (Xu et al.; J. Gen. Virol. 1995, 76, 1971-1980).
Los resultados obtenidos con adenovirus provenientes de otras especies (humana, bovina, ovina...) no se pueden transponer, por lo tanto, a los adenovirus porcinos. Hasta la fecha no se ha producido, así pues, ningún vector recombinante replicante a partir de un adenovirus porcino.
La depositaria se ha propuesto el objetivo de hacer accesible la inserción de genes heterólogos en el genoma de los virus PAV-3 y PAV-5 sin que se modifique por ello de manera sustancial su capacidad de replicación in vivo.
Otro objetivo de la invención es el de proponer regiones de inserción susceptibles de sufrir una deleción sin poner en cuestión esa capacidad de replicación, con el fin de incrementar la capacidad de inserción en el virus.
Otro objetivo más de la invención es el de proponer virus PAV-3 recombinantes que conserven una capacidad de replicación in vivo y que permitan su utilización como vacunas vivas recombinantes, incluyendo vacunas administradas por vía mucosa y/o en presencia de anticuerpos de origen materno.
La depositaria ha conseguido modificar la región E3 de PAV-3 y de PAV-5 conservando la capacidad de replicación in vivo. Ha podido demostrar asimismo la expresión in vivo de un gen insertado en esa región. Hace accesible, por lo tanto, la utilización de PAV-3 y de PAV-5 como vectores de expresión replicantes.
La presente invención, por consiguiente, tiene como objeto un adenovirus porcino de serotipo 3 que comprende al menos una secuencia nucleotídica heteróloga insertada en el genoma de PAV-3 en condiciones que permiten que los virus recombinantes obtenidos se repliquen in vivo en los porcinos, y que expresen la secuencia insertada. Estos virus modificados presentan importantes ventajas en materia de vacunación, y sobre todo: son eficaces incluso en presencia de anticuerpos maternos y se pueden entonces utilizar de manera eficaz por vía mucosa.
Preferentemente se inserta una secuencia heteróloga en una zona no esencial del genoma, principalmente de la región E3, con una deleción de esta zona de inserción. Por deleción de una zona se entiende una deleción total o parcial, preferentemente total, de la zona de inserción. En otras palabras, la secuencia heteróloga se inserta en el lugar de toda la zona de inserción o de parte de ella, preferentemente en el lugar de la totalidad de esa zona.
Para el PAV-3 la zona de inserción preferida en E3 es una zona que comprende la totalidad o parte de los nucleótidos 706 a 1624 de la secuencia publicada por P. S. Reddy et al., Virus Research 1995, 36, 97-106, lo que corresponde a las posiciones 27794 a 28712 de la secuencia publicada en GenBank AN # U10433. En otras palabras, esta zona de inserción y su eventual deleción pueden comprender la totalidad o solamente una parte de la secuencia 706 a 1624 y/o extenderse en E3 más allá del límite 706 y/o del límite 1624, y eventualmente comprender E3 por completo. Preferentemente esta zona está formada por, o comprende, E3, los nucleótidos 1002 a 1624, o también la totalidad o parte de la secuencia 706 a 1002. Principalmente comprende al menos la secuencia 1002 a 1624.
Para el PAV-5, E3 se define por la secuencia de nucleótidos 2382 a 4042 en la SEQ ID Nº: 5. la zona de inserción y su eventual deleción incluye E3 y comprende la totalidad o parte de los nucleótidos 2064 a 4083, por ejemplo la totalidad o parte de los nucleótidos 2389 a 3861, de la SEQ ID Nº: 5 (figura 13). En otras palabras, esta zona de inserción y su eventual deleción pueden comprender una parte solamente de la secuencia 2389 a 3861 y/o extenderse en E3 más allá del límite 2389 y/o del límite 3861 y eventualmente comprender E3 por entero. Cuando se produce una deleción hasta el nucleótido 4083 inclusive se prefiere insertar en el lugar del nucleótido 4083 un sitio aceptor de empalmes. Preferentemente esta zona de inserción está formada esencialmente por los nucleótidos 2389 a 3861.
Naturalmente, se pretende aplicar también la invención a la inserción en las zonas correspondientes de las otras cepas de PAV-3 cuyas secuencias difieren de las de las cepas de referencia conforme a la invención.
La presente invención tiene asimismo como objeto un virus PAV-3 que tenga una capacidad de inserción superior en tamaño, permaneciendo al mismo tiempo replicante en los cerdos. Se busca mantener la propiedad de replicación en el huésped con el fin de obtener una eficacia de protección óptima, en particular utilizando una composición vacunal por vía mucosa y/o en presencia de anticuerpos de origen materno.
El aumento de la capacidad de inserción se consigue por medio de una deleción, por ejemplo de la totalidad o parte de la región E3, hallándose situada la parte de E3 que puede sufrir la deleción entre el gen que codifica la proteína pVIII y el que codifica la fibra. La presente invención describe principalmente las deleciones de 622 pb y de 919 pb que se pueden realizar en la región E3 del virus PAV-3, conservando al mismo tiempo el carácter replicante de los virus recombinantes (ver ejemplos 6 a 10). Se encuentra descrita una deleción de 1472 pb en la región E3 del virus PAV-5 que conduce a las mismas características fenotípicas del virus recombinante (ver ejemplos 14 a 17).
El adenovirus PAV-3 recombinante obtenido según la invención puede servir ventajosamente para una inserción de un tamaño máximo de aproximadamente 3,0 kpb para el virus PAV-3, y para su expresión en el cerdo.
Así pues, la invención tiene también como objeto el vector PAV-3 que ha sufrido una deleción, principalmente en la región E3, permaneciendo al mismo tiempo replicante, una deleción en particular en las zonas antes mencionadas, es decir, una deleción de la totalidad o parte de la zona considerada, preferentemente de la totalidad de esa zona.
Las secuencia nucleotídicas heterólogas que se pueden insertar son secuencias que codifican inmunógenos o fragmentos, por ejemplo epítopes, inmunológicamente activos de inmunógenos, y en particular genes o fragmentos de genes (por ej. epítopes) que codifican inmunógenos de patógenos porcinos.
En el marco de la presente invención se puede insertar, naturalmente, más de una secuencia heteróloga en el mismo virus. En particular se pueden insertar secuencias heterólogas provenientes de un mismo virus o de virus diferentes.
Según una modalidad particular es posible insertar secuencias artificiales que agrupen varios fragmentos o epítopes provenientes de un mismo patógeno o de patógenos diferentes, y las llamadas "secuencias multiepítopes". En este último caso la secuencia multiepítope se coloca bajo la dependencia de un promotor único.
Se pueden asimismo insertar secuencias que codifiquen inmunomoduladores, en particular citocinas, preferentemente citocinas de cerdo como el "Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor" porcino (poGM-CSF), la interleucina porcina 4 (poiL-4), la IL-12 porcina o la IL-18 porcina.
La expresión de varios genes heterólogos insertados en el locus de inserción se puede hacer también posible mediante la inserción de una secuencia llamada "IRES" (Internal Ribosome Entry Site) proveniente principalmente de un picomavirus como el virus de la enfermedad vesicular del cerdo (swine vesicular disease virus, SVDV; B.-F. Chen et al., J. Virology, 1993. 67, 2142-2148), el virus de la encefalomiocarditis (EMCV; R. J. Kaufman et al., Nucleic Acids Research, 1991. 19, 4485-4490), el virus de la fiebre aftosa (FMVD; N. Luz y E. Beck, J. Virology, 1991. 65, 6486-6494), o también de otro origen. El especialista se podrá referir al contenido de los 3 artículos citados. El casete de expresión de dos genes tendría, así pues, la estructura mínima siguiente: promotor (opcional) -gen 1-IRES-gen 2- señal de poliadenilación. La vacuna viva recombinante según la invención, por lo tanto, podrá comprender, insertada en el locus de inserción, un casete de expresión que comprenda, sucesivamente, un promotor, dos o varios genes separados dos a dos por un IRES, y una señal de poliadenilación.
Los patógenos porcinos son virus, bacterias o parásitos, elegidos principalmente entre los del grupo que consiste en virus de la enfermedad de Aujeszky (virus PRV o pseudorabia), virus de la gripe porcina (virus de la influenza porcina, SIV), virus de la enfermedad misteriosa del cerdo (virus PRRS), virus de la parvovirosis (virus PPV), virus de la peste porcina clásica (virus HCV o Hog Cholera Virus), circovirus porcino, principalmente de tipo 2(Porcine CircoVirus type 2, PCV2 o virus del síndrome de desmedro multisistémico postdestete del lechón), Actinobacillus pleuropneumoniae, Mycoplasmahyopneumoniae.
En lo que se refiere a la valencia Aujeszky se pueden utilizar los genes gB (Robbins A. K. et al.. J. Virol. 1987. 61. 2691-2701 GenBank An # M17321), gC (Ishikawa K. et al. Vet. Microbiol. 1996. 49. 267-272 GenBank AN # D49435) y/o gD (Rivière M. et al. J. Virol. 1992. 66. 3424-3434 y Hong W. Z. et al. GenBank AN # AF086702), en sus formas nativa o secretadas.
En lo que se refiere a la valencia gripe porcina se prefiere utilizar los genes HA (WO-A-98/03658 ejemplos 10 y 12) (formas nativa o secretada), NA (Nerome K. et al. J. Virol. 1995. 76. 613-624 GenBank AN # D21194) (formas nativa o secretada) y/o NP (WO-A-98/03658 ejemplos 11 y 13).
En lo que se refiere a la valencia PRRS se prefiere utilizar los genes ORF4, ORF3 (formas nativa o secretada), ORF5 (formas nativa o secretada), ORF6 y/o ORF7 de cepas europeas (Meulenberg J. et al. Virology. 1993. 192. 62-772) y de cepas americanas (Mardassi H. et al. Arch. Virol. 1995. 140. 1405-1418).
En lo que se refiere a la valencia peste porcina clásica se prefiere utilizar los genes E0, E1 (formas nativa o secretada) y/o E2 (formas nativa o secretada) (Meyers G. et al. Virology. 1989. 171. 18-27).
En lo que se refiere a la valencia parvovirosis se prefiere utilizar el gen de cápside VP2 (Vasudevacharya J. et al. Virology. 1990. 178. 611-616).
En lo que se refiere a la valencia PCV2 se prefiere utilizar los genes ORF1 y/o ORF2, pero preferentemente ORF1 y ORF2 (Meehan B. et al. J. Gen. Virol. 1998. 79. 2171-2179).
Las secuencias heterólogas se insertan en dependencia de señales reguladoras de la transcripción, y en particular de un promotor, aportadas preferentemente durante la recombinación. No se excluye, sin embargo, la posibilidad de hacer que esas secuencias heterólogas se expresen bajo el control de señales propias del adenovirus que sirve de vector.
Entre los promotores útiles se prefiere la utilización de promotores eucariotas fuertes, tales como el LTR del virus del sarcoma de Rous y, preferentemente, del promotor precoz del citomegalovirus o CMV-IE (CytoMegaloVirus Immediate Early), principalmente de origen murino (MCMV-IE) o humano (HCMV-IE), o también de los de otros orígenes, por ejemplo del cerdo, del mono, de la rata o de la cobaya.
De forma particularmente ventajosa se pueden utilizar los promotores CMV-IE con una parte activadora (en inglés "enhancer") (US-A-5.168.062, US-A-4.968.615, US-A-4.963.481). Puede ser ventajoso el recurso a fragmentos de esos promotores conservando la actividad promotora, preferentemente con la parte activadora, por ejemplo los promotores CMV-IE truncados según WO-A-98/00166. El especialista se podrá referir, en busca de más detalles, a la solicitud de patente WO-A-98/00166, y en particular a su ejemplo 12.
La presente invención tiene también como objeto las preparaciones inmunógenas o inmunológicas y las vacunas porcinas que comprenden un adenovirus recombinante conforme a la invención en un vehículo o excipiente aceptable desde un punto de vista veterinario, y en su caso un adyuvante. Por definición, una preparación inmunógena o inmunológica induce al menos una respuesta inmunitaria (celular y/o humoral) en el animal después de la administración. Una vacuna induce una respuesta protectora.
Los adyuvantes se eligen preferentemente entre los polímeros del ácido acrílico o metacrílico y los copolímeros de anhídrido maleico y de derivado alquenilo.
Los compuestos preferidos son los polímeros del ácido acrílico o metacrílico reticulados, principalmente por éteres polialquenílicos de azúcares o de polialcoholes. Estos compuestos se conocen con el término carbómero (Pharmeuropa vol. 8 nº 2, junio 1996). El especialista se puede referir también al documento US-A-2909462, que describe polímeros acrílicos de ese tipo reticulados por un compuesto polihidroxilado que tiene al menos 3 grupos hidróxilo, preferentemente no más de 8, hallándose sustituidos los átomos de hidrógeno de al menos tres hidróxilos por radicales alifáticos insaturados que tienen al menos 2 átomos de carbono. Los radicales preferidos son los que contienen de 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los radicales insaturados pueden contener ellos mismos otros sustituyentes, como el metilo. Los productos vendidos con la denominación Carbopol® (BF Goodrich, Ohio, USA) son particularmente apropiados. Están reticulados por una alilsacarosa o por alilpentaeritritol. Entre ellos se pueden citar los Carbopol® 974P, 934P y 971P.
Entre los copolímeros de anhídrido maleico y de derivado alquenilo se prefieren los EMA® (Monsanto), que son copolímeros de anhídrido maleico y de etileno, lineales o reticulados, por ejemplo reticulados por el diviniléter. Se puede buscar referencia en J. Fields et al., Nature, 186: 778-780, 4 junio 1960.
Desde el punto de vista de su estructura, los polímeros de ácidos acrílico o metacrílico y los EMA® están formados preferentemente por motivos de base con la siguiente fórmula:
--- --- ---
\melm{\delm{\para}{\hskip-0.5cm
COOH}}{C}{\uelm{\para}{R _{1} }}
--- (CH_{2})_{x} ---
\melm{\delm{\para}{\hskip-0.5cm
COOH}}{C}{\uelm{\para}{R _{2} }}
--- (CH_{2})_{y} --- --- ---
en la que:
- R_{1} y R_{2}, idénticos o diferentes, representan H o CH_{3}
- x = 0 ó 1, preferentemente x = 1
- y = 1 ó 2, con x + y = 2
Para los EMA®, x = 0 e y = 2. Para los carbómeros, x = y = 1.
La disolución de estos polímeros en agua conduce a una solución ácida que se neutralizará, preferentemente hasta el pH fisiológico, para dar la solución adyuvante a la que se incorporará la vacuna propiamente dicha. Los grupos carboxílicos del polímero, entonces, tienen en parte la forma COO-.
Preferentemente se lleva a cabo una solución de adyuvante según la invención, principalmente de carbómero, en agua destilada, preferentemente en presencia de cloruro de sodio, siendo de pH ácido la solución obtenida. Se diluye esta solución madre añadiendo en la cantidad necesaria (para obtener la concentración final deseada), o una parte importante de ella, agua cargada con NaCl, preferentemente agua fisiológica (NaCl 6 g/l), en una o en varias veces con neutralización concomitante o subsiguiente (pH de 7,3 a 7,4), preferentemente por NaOH. Esta solución de pH fisiológico se utilizará tal cual para recibir la vacuna, principalmente conservada en forma liofilizada.
La concentración de polímero en la composición vacunal final será de entre 0,01% y 2% P/V, más particularmente de entre 0,06% y 1% P/V, preferentemente de entre 0,1% y 0,6% P/V.
Las preparaciones inmunógenas y vacunas según la invención pueden comprender varios adenovirus recombinantes conforme a la invención, que comprendan secuencias nucleotídicas heterólogas diferentes, provenientes de patógenos idénticos y/o diferentes.
La presente invención tiene también como objeto los métodos de inmunización y de vacunación de los cerdos contra uno o varios patógenos porcinos, comprendida la administración de dosis eficaces de las preparaciones inmunógenas y vacunas antes mencionadas. Las dosis serán, por ejemplo, de entre 10^{4} y 10^{7} DICC50.
Está concebida principalmente para la administración de esas preparaciones inmunógenas y vacunas por vía mucosa, por ejemplo oral, nasal, ocular, y/o a animales jóvenes que presentan anticuerpos maternos. Se pueden utilizar también las otras vías empleadas de forma clásica para la vacunación de los cerdos (intramuscular en particular, intradérmica...).
La presente invención tiene asimismo como objeto métodos para la obtención de vectores recombinantes PAV-3, preparaciones inmunógenas y vacunas que las incorporan.
Tiene también como objeto la utilización de esos vectores para la fabricación de las preparaciones inmunógenas y de las vacunas según la invención, principalmente destinadas a una administración por vía mucosa y/o a jóvenes animales que presentan anticuerpos maternos y/o a una administración por las vías clásicas.
Se describirá ahora la invención de manera más detallada con la ayuda de formas de realización a título de ejemplos no limitativos y haciendo referencia a los dibujos, en los cuales:
Lista de las figuras
Figura 1: Esquema de los plásmidos pKS-Derecho lTR3, pPoliII-Derecho lTR3 y plTRsPAV3.
Figura 2: Esquema de los plásmidos pE3PAV3, pE3dl622CMV-EGFP y pE3dl622CMV-gD
Figura 3: Mapa de restricción de los plásmidos pE3PAV3 y pE3dl919
Figura 4: Esquema de los plásmidos pCMV-EGFP, pCMV-gD y pgD
Figura 5: Mapa de restricción de los plásmidos pCMV-EGFP, pgD, pE3dl919CMV-EGFP y pE3dl919CMV-gD
Figura 6: Mapa de restricción de los plásmidos pE3dl622EGFP y pE3dl919EGFP
Figura 7: Mapa de restricción de los plásmidos pE3dl622gD y pE3dl919CMV-gD
Figura 8: Mapa de restricción de los plásmidos pCR-Derecho lTR5, pPoliII-Derecho lTR5 y plTR-PAV5
Figura 9: Mapa de restricción del plásmido pE3PAV5
Figura 10: Mapa de restricción de los plásmidos pE3dl1472CMV-EGFP y pE3dl1472CMV-gD
Figura 11: Mapa de restricción de los plásmidos pE3dl1472EGFP y pE3dl1472gD
Figura 12: Mapa físico de PAV-5, digestión por BamHI
Figura 13: Secuencia de 5614 pares de bases (región E3 y secuencias adyacentes del virus PAV-5)
Lista de las secuencias
SEQ ID Nº 1: Oligonucleótido ITRPAV3
SEQ ID Nº 2: Oligonucleótido T3
SEQ ID Nº 3: Oligonucleótido T7
SEQ ID Nº 4: Oligonucleótido ITRPAV5
SEQ ID Nº 5: Secuencia de la región E3 del virus PAV-5
Ejemplos Ejemplo 1 Células y virus
Los medios de cultivo de células y los reactivos fueron proporcionados por Gibco BRL. A los medios (Dulbecco's MEM con Glutamax-1 Cat # 61965-026) se les añadió 1 mM de piruvato de sodio (Cat # 11360-039), de gentamicina (50 \mug/ml, Cat # 15710-031) y de 10% de suero fetal bovino (Cat # 10270-106 lote 40Q5774K).
Se utilizaron las células PK-15 (Nº ATCC CCL33) y ST (Nº ATCC CRL 1756) para el cultivo de virus.
El virus salvaje adenovirus porcino de tipo 3 (=PAV-3), no patógeno en el cerdo, se obtuvo del laboratorio del Dr. Eva Nagy (Universidad de Guelph, Servicio de Patobiología, 50 Stone Road Guelph, ONTARIO, Canadá, NIG 2W1) (Reddy P. et al. Virus Res. 1996. 43. 99-109).
Condiciones de cultivo y de pasajes: dos veces por semana se tripsinan las células (solución de tripsina al 2,5% (Sigma Cat # 044-5075) diluida 50 veces en solución salina equilibrada de Earle (Gibco-BRL Cat # 14155-030)) y se resuspenden en medio de cultivo (dilución 1:6). Las células se cultivan a +37° C en presencia de 5% de CO_{2} antes de volver a ponerlas en cultivo.
Ejemplo 2 Enzimas, bacterias, plásmidos y técnicas de biología molecular
Las enzimas de restricción, la Taq polimerasa para las reacciones de amplificación en cadena, y las otras enzimas necesarias para diferentes modificaciones de los ADN, fueron proporcionadas, respectivamente, por New England Biolabs Inc., Roche Diagnostics y Gibco-BRL.
Todas esas enzimas fueron utilizadas siguiendo las recomendaciones de los proveedores. SE pusieron en práctica las técnicas estándar de biología molecular tal como se describen en "Molecular Biology: A Laboratory Manual". 2nd edition. (Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory, New York. 1989).
Las bacterias competentes BJ5183 (Hanahan D. J. Mol. Biol. 1983. 166. 557-580) fueron preparadas de la siguiente manera:
Se prepararon 60 ml de un cultivo de esas bacterias en fase exponencial conforme a la técnica del cloruro de calcio (Sambrook et al. 1989). Se recolectaron en un volumen final de 2 ml de CaCl_{2} 50 mM. Se mezclaron 300 \mul de esta suspensión de bacterias con los diferentes ADN compañeros de recombinación homóloga contenidos en un volumen de 100 \mul de Tris-HCl 100 mM de pH 7,4, se dejaron en contacto durante 30 minutos sobre hielo fundente, después se trataron las bacterias por un choque térmico a +45° C durante 2 minutos, se dejaron en reposo sobre hielo fundente durante 10 minutos, y finalmente se extendieron sobre un medio selectivo.
Ejemplo 3 Extracción de los ADN virales de PAV-3 y PAV-5
Se cultivan y amplifican los virus en frascos Falcon de 10 cm^{2} según las condiciones del ejemplo 1. Cuando el ECP es completo, se recolectan las células, se lisan por medio de tres ciclos de congelación/descongelación, y después se clarifica la suspensión viral por centrifugación a baja velocidad. Los virus PAV-3 y PAV-5 se purifican en gradiente de cloruro de cesio (1,34 g/ml) y la banda viral se recolecta y se purifica, después se obtienen los ADN virales después de tratamiento con la proteinasa K y de extracción con fenol-cloroformo (Sambrook et al. 1989). Estos ADN se utilizaron a continuación para las diferentes etapas de clonación o de amplificación por polimerasa (ACP).
Ejemplo 4 Construcción del plásmido "plTRs PAV3"
El ADN genómico del virus PAV-3, preparado según el ejemplo 3, fue digerido por EcoRI y el fragmento EcoRI D de 245 pb fue aislado después de electroforesis en gel de agarosa. A continuación se ligó este fragmento con el plásmido pBlueScript KS (pBS-KS) (Stratagene Inc. La Jolla, CA) (GenBank # X52327), previamente digerido por EcoRI y desfosforilado, para dar el plásmido identificado como "pKS-EcoDPAV3".
Se llevó a cabo una reacción de ACP con la matriz del plásmido pKS-EcoDPAV3 y con los siguientes oligonucleótidos:
ITRPAV3 (SEQ ID Nº 1) (50 mer):
5' CCTTAATTAAGGTAGGGATAACAGGGTAATCATCATCAATAATATACCGC 3'
y T3 (SEQ ID Nº 2) (20 mer):
5' ATTAACCCTCACTAAAGGGA 3'
El producto de amplificación (367 pb) se trató con la ADN polimerasa T4 para convertirlo en "extremos libres", después fue digerido con la enzima ClaI y ligado con el plásmido pBS-KS, previamente digerido por ClaI y EcoRV, para dar el plásmido identificado como "pKS-Derecho ITR3" (figura 1).
El fragmento EcoRI D se liberó entonces del plásmido pKS-Derecho ITR3 por digestión con las enzimas BamHI y KpnI, y el fragmento de restricción BamHI-KpnI de 353 pb se ligó con el plásmido pPolyII (Lathe R. et al. Gene. 1987. 57. 193-201) (GenBank # G209113), previamente digerido por BamHI y KpnI, para generar el plásmido identificado como "pPolyII-Derecho ITR3" (figura 1).
El ADN genómico del virus PAV-3, preparado según el ejemplo 3, fue digerido por KpnI para aislar, después de electroforesis en gel de agarosa, el fragmento terminal KpnI F de 939 pb. Se ligó este fragmento con el plásmido pBS-KS, previamente digerido por KpnI y desfosforilado, para dar el plásmido identificado como "pKS-KpnFPAV3".
Se realizó a continuación una reacción de ACP con la matriz del plásmido pKS-KpnFPAV3 y con los siguientes oligonucleótidos:
ITRPAV3 (SEQ ID Nº 1) (50 mer):
5' CCTTAATTAAGGTAGGGATAACAGGGTAATCATCATCAATAATATACCGC 3'
y T7 (SEQ IN Nº 3):
5' TAATACGACTCACTATAGGG 3'
El producto de amplificación (1086 pb) fue tratado con la ADN polimerasa T4 para convertirlo en "extremos libres", después fue digerido por la enzima XhoI, y ligado con el plásmido pPolyII-Derecho ITR3, previamente digerido por BgIII, tratado con la ADN polimerasa T4, después digerido por XhoI, para generar el plásmido identificado como "plTRsPAV3" (figura 1).
Ejemplo 5 Construcción del plásmido pPAV3
El plásmido plTRsPAV3 (ejemplo 4) se linealizó por medio de digestión con ClaI, después se co-transformó en bacterias competentes BJ5183 con el ADN genómico del virus PAV-3 preparado según el ejemplo 2. Esta co-transformación permitió la generación, por recombinación homóloga en Escherichia coli (Chartier C. et al. J. Virol. 1996. 70. 4805-4810), de un plásmido que contenía el genoma completo clonado de PAV-3. Este plásmido se designó como "pPAV3".
Ejemplo 6 Construcción de los plásmidos lanzadera PAV-3 6.1. Construcción del plásmido con una deleción de 622 pares de bases (pequeña deleción) en la región E3
El plásmido pNEB193 (New England BioLabs Cat # 305-1) fue digerido por PacI, tratado con la ADN polimerasa T4, y después religado sobre sí mismo para generar el plásmido "pNEBPac-".
El plásmido pPAV3 (ejemplo 5) fue digerido por KpnI y BamHI para aislar el fragmento KpnI-BamHI de 4344 pb que contenía la región E3 (Reddy et al. Virology. 1998. 251. 414-426). Este fragmento se ligó con el plásmido pNEBPac-, previamente digerido por KpnI y BamHI para dar el plásmido "pE3PAV3" (figura 2). Se verificó la secuencia del fragmento KpnI-BamHI y se encontró que era idéntica a la secuencia publicada por Reddy P. et al. (Virus Research. 1995. 36. 97-106 y Virology. 1998. 251. 414-426) (GenBank AN # U10433 y AN # AF083132). El especialista podrá remitirse a esas referencias.
El plásmido pEGFP-F (Chalfie M. et al. Science. 1994. 263. 802-805; Clontech Cat # 6074-1) se modificó para eliminar completamente el poliligador. Se consiguió esta deleción por medio de una digestión por BamHI, seguida de un tratamiento con la ADN polimerasa T4. La religadura sobre sí mismo del vector modificado de esa manera generó el plásmido pCMV-EGFP. El plásmido pCMV-EGFP fue digerido a continuación por las enzimas AsnI y MluI, y después tratado con la ADN polimerasa T4, para aislar el fragmento AsnI (extremo libre)-MluI (extremo libre) de 1,6 kpb (= casete de expresión CMV-EGFP). Este fragmento se ligó con el plásmido pE3PAV3, previamente digerido por BsrGI y SnaBI y tratado con la ADN polimerasa T4, para generar el plásmido pE3dl622CMV-EGFP (figura 2). La deleción creada entre los sitios SsrGI y SnaBI de la región E3 del virus PAV-3 tiene un tamaño de 622 pares de bases. Esta deleción se extiende del nucleótido 1002 al 1624 de la secuencia publicada por P. Reddy et al. (Virus Research. 1995. 36. 97-106) (GenBank AN # U10433).
El plásmido pCMV-gD (Ambriovic A. et al. Virology. 1997. 238. 327-335) fue digerido por SnaBI y ClaI para aislar el fragmento SnaBI-ClaI de 1,8 kpb (que contiene la parte 3' del promotor CMV y el gen PRV gD). Este fragmento fue tratado a continuación con la ADN polimerasa T4 para convertirlo en extremos libres, y después fue ligado con el plásmido pE3dl622CMV-EGFP, previamente digerido por SnaBI y HpaI, para generar el plásmido pE3dl622CMV-gD (figura 2).
6.2 Construcción del plásmido con una deleción de 919 pares de bases (gran deleción) en la región E3
El plásmido pE3PAV3 (véase parte 6.1 supra) fue digerido por SgrAI y SacI para aislar el fragmento SgrAI-SacI de 644 pb. Este fragmento fue tratado con la ADN polimerasa T4 para convertirlo en extremos libres, y después fue ligado con el plásmido pNEBPac- (6.1 supra), previamente digerido con EcoRI, tratado con la ADN polimerasa T4, y después digerido con SacI, para generar el plásmido pSgrAI-SacI.
El plásmido pE3PAV3 fue digerido por SnaBI y HindIII para aislar el fragmento SnaBI-HindIII de 2,4 kpb. Este fragmento se ligó con el plásmido pSgrAI-SacI, previamente digerido con PmeI y HindIII, para generar el plásmido pE3dl919 (figura 3). La deleción creada entre los sitios SacI y SnaBI de la región E3 del virus PAV-3 tiene un tamaño de 919 pares de bases. Esta deleción se extiende del nucleótido 706 al 1624 de la secuencia publicada por P. Reddy et al. (Virus Research. 1995. 36. 97-106) (GenBank AN # U10433).
El plásmido pCMV-gD (ejemplo 6.1) fue digerido por SnaBI y ClaI para aislar el fragmento SnaBI-ClaI de 1,8 kpb. Este fragmento fue tratado entonces con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa para convertirlo en extremos libres, después se ligó con el plásmido pCMV-EGFP (ejemplo 6.1), previamente digerido por SnaBI y HpaI y después desfosforilado, para generar el plásmido pgD (figura 4).
El plásmido pCMV-EGFP (ejemplo 6.1) fue digerido por AsnI y MluI para aislar el fragmento AsnI-MluI de 1,8 kpb (casete CMV-EGFP). Este fragmento fue tratado con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa para convertirlo en extremos libres, después fue ligado con el plásmido pE3dl919, previamente digerido con AscI, tratado con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa para convertirlo en extremos libres, y después desfosforilado, para generar el plásmido pE3dl919CMV-EGFP (figura 5).
El plásmido pgD (supra) fue digerido por AsnI y MluI para aislar el fragmento AsnI-MluI de 2,3 kpb. Este fragmento fue tratado con la ADN polimerasa T4 para convertirlo en extremos libres, después fue ligado con el plásmido pE3dl919, previamente digerido por AsnI y tratado con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa para convertirlo en extremos libres, y después desfosforilado, para generar el plásmido pE3dl919CMV-gD (figura 5).
Ejemplo 7 Construcción de los genomas recombinantes pPAV3dl622CMV-EGFP y pPAV3dl622CMV-gD
El plásmido pE3dl622CMV-EGFP (ejemplo 6.1) fue digerido por KpnI y BamHI para aislar el fragmento KpnI-BamHI de 5,5 kpb. Este fragmento fue co-transformado en bacterias competentes BJ5183 con el plásmido pPAV3 (ejemplo 5) linealizado por medio de digestión por la enzima SnaBI. Esta co-transformación condujo a la generación, por recombinación homóloga en Escherichia coli, del plásmido pPAV3dl622CMV-EGFP.
El plásmido pE3CMVgD (ejemplo 6.1) fue digerido por EcoRI y PmeI para aislar el fragmento EcoRI-PmeI de 6,0 kpb. Este fragmento fue co-transformado en bacterias competentes BJ5183 con el plásmido pPAV3 (ejemplo 5) linealizado por medio de digestión por la enzima SnaBI. Esta co-transformación condujo a la generación, por recombinación homóloga en Escherichia coli, del plásmido pPAV3dl622CMVgD.
Ejemplo 8 Construcción de los genomas recombinantes pPAV3dl919CMV-EGFP y pPAV3dl919CMV-gD
El plásmido pE3dl919CMV-EGFP (ejemplo 6.2) fue linealizado por medio de HindIII, y después co-transformado en bacterias competentes BJ5183 con el plásmido pPAV3 (ejemplo 5) linealizado por medio de digestión por la enzima SnaBI. Esta co-transformación condujo a la generación, por recombinación homóloga en Escherichia coli, del plásmido pPAV3dl919CMV-EGFP.
El plásmido pE3dl919CMV-gD (ejemplo 6.2) fue linealizado por medio de HindIII, y después co-transformado en bacterias competentes BJ5183 con el plásmido pPAV3 (ejemplo 5) linealizado por medio de digestión por la enzima SnaBI. Esta co-transformación condujo a la generación, por recombinación homóloga en Escherichia coli, del plásmido pPAV3dl919CMV-gD.
Ejemplo 9 Construcción de los genomas recombinantes pPAV3dl622EGFP, pPAV3dl622gD, pPAV3dl919EGFP y pPAV3dl919gD (inserción de las secuencias codificantes sin las secuencias del promotor CMMV) 9.1 Construcción de los plásmidos pE3dl622EGFP y pE3dl919EGFP
El plásmido pCMV-EGFP (ejemplo 6.1) fue digerido por NheI y MluI para aislar el fragmento NheI-MluI de 1,0 kpb. Este fragmento fue tratado con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa para convertirlo en extremos libres, después ligado con el plásmido pE3PAV3 (ejemplo 6.1), previamente digerido por BsrGI, tratado con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa, y finalmente digerido por SnaBI, para generar el plásmido pE3dl622EGFP
(figura 6).
El plásmido pCMV-EGFP fue digerido por NheI y MluI para aislar el fragmento NheI-MluI de 1,0 kpb. Este fragmento fue tratado con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa, y después desfosforilado, para generar el plásmido pE3dl919EGFP (figura 6).
9.2 Construcción de los plásmidos pE3dl622gD y pE3dl919gD
El plásmido pgD (ejemplo 6.2) fue digerido por XhoI y ClaI para aislar el fragmento XhoI-ClaI de 1,5 kpb. Este fragmento fue tratado con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa para convertirlo en extremos libres, después fue ligado con el plásmido pE3PAV3 (ejemplo 6.1), previamente digerido por BsrGI, tratado con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa, después digerido por SnaBI, para generar el plásmido pE3dl622gD (figura 7).
El plásmido pgD (ejemplo 6.2) fue digerido por XhoI y ClaI para aislar el fragmento XhoI-ClaI de 1,5 kpb. Este fragmento fue tratado con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa para convertirlo en extremos libres, después fue ligado con el plásmido pE3dl919 (ejemplo 6.2), previamente digerido por AscI, tratado con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa, y finalmente desfosforilado, para generar el plásmido pE3dl919gD (figura 7).
9.3 Construcción de los plásmidos pPAV3dl622EGFP, pPAV3dl622gD, pPAV3dl919EGFP y pPAV3dl919gD
El plásmido pE3dl622EGFP (ejemplo 9.1) fue digerido por KpnI y BamHI, y después co-transformado en bacterias competentes BJ5183 con el plásmido pPAV3 (ejemplo 5), previamente linealizado por medio de digestión por SnaBI. Esta co-transformación permitió generar, por recombinación homóloga en Escherichia coli, el plásmido pPAV3dl622EGFP.
El plásmido pE3dl622gD (ejemplo 9.2) fue digerido por EcoRI y PmeI, y después co-transformado en bacterias competentes BJ5183 con el plásmido pPAV3 (ejemplo 5), previamente linealizado por medio de digestión por SnaBI. Esta co-transformación permitió generar, por recombinación homóloga en Escherichia coli, el plásmido pPAV3dl622gD.
El plásmido pE3dl919EGFP (ejemplo 9.1) fue linealizado por digestión con HindIII, y después co-transformado en bacterias competentes BJ5183 con el plásmido pPAV3 (ejemplo 3), previamente linealizado por medio de digestión por SnaBI. Esta co-transformación permitió generar, por recombinación homóloga en Escherichia coli, el plásmido pPAV3dl919EGFP.
El plásmido pE3dl919gD (ejemplo 9.2) fue linealizado por digestión con HindIII, y después co-transformado en bacterias competentes BJ5183 con el plásmido pPAV3 (ejemplo 5), previamente linealizado por medio de digestión por SnaBI. Esta co-transformación permitió generar, por recombinación homóloga en Escherichia coli, el plásmido pPAV3dl919gD.
Ejemplo 10 Obtención de los virus PAV3 recombinantes por transfección con los genomas PAV3 recombinantes clonados en Escherichia coli
Las células PK-15 o ST (véase ejemplo 1) se transfectan en placa de 6 pozos a una densidad de confluencia de 60-80% con 2 \mug de ADN genómico de PAV-3 recombinante, previamente digerido por PacI, diluido en presencia de 4 a 12 \mul de LipofectAMINA (Gibbo-BRL Cat # 18324-012) según la línea celular.
Después de la transfección según las condiciones recomendadas por el proveedor, se dejaron las células en cultivo durante algunos días hasta la aparición de un ECP viral. Se llevó a cabo entonces un nuevo pasaje en cultivo de células para amplificar el virus recombinante obtenido.
La transfección realizada con el plásmido pPAV3dl622CMV-EGFP (ejemplo 7) generó el virus recombinante vPAV3-1.
La transfección realizada con el plásmido pPAV3dl622CMV-gD (ejemplo 7) generó el virus recombinante vPAV3-2.
La transfección realizada con el plásmido pPAV3dl919CMV-EGFP (ejemplo 8) generó el virus recombinante vPAV3-3.
La transfección realizada con el plásmido pPAV3dl919CMV-gD (ejemplo 8) generó el virus recombinante vPAV3-4.
La transfección realizada con el plásmido pPAV3dl622EGFP (ejemplo 9.3) generó el virus recombinante vPAV3-5.
La transfección realizada con el plásmido pPAV3dl622gD (ejemplo 9.3) generó el virus recombinante vPAV3-6.
La transfección realizada con el plásmido pPAV3dl919EGFP (ejemplo 9.3) generó el virus recombinante vPAV3-7.
La transfección realizada con el plásmido pPAV3dl919gD (ejemplo 9.3) generó el virus recombinante vPAV3-8.
Ejemplo 11 Construcción del plásmido pITRsPAV5 11.1 Clonación del fragmento genómico terminal derecho
El ADN genómico del virus PAV-5, preparado según el ejemplo 3, fue digerido por EcoRI y el fragmento terminal derecho EcoRI I de 0,9 kpb fue aislado después de electroforesis en gel de agarosa. Este fragmento fue ligado con el plásmido pBS-KS, previamente digerido por EcoRI y desfosforilado, para generar el plásmido "pKS-Derecho ITR5".
Se llevó a cabo entonces una reacción de ACP con la matriz del plásmido pKS-Derecho ITR5 y con los siguientes oligonucleótidos:
ITRPAV5 (SEQ ID Nº 4) (50 mer):
5' CCTTAATTAAGGTAGGGATAACAGGGTAATCATCATCAATAATATACGGA 3'
y T3 (SEQ ID Nº 2) (20 mer):
5' ATTAACCCTCACTAAAGGGA 3'
\vskip1.000000\baselineskip
para producir un fragmento de 1,0 kpb. Este fragmento fue ligado con el plásmido pCRII (InVitrogen Original TA Cloning Kit Cat # K2000-01) para dar el plásmido "pCR-Derecho ITR5" (figura 8).
11.2 Clonamiento del fragmento genómico terminal izquierdo
El ADN genómico del virus PAV-5, preparado según el ejemplo 3, fue digerido por HindIII, y el fragmento terminal izquierdo HindIII de 1,2 kpb fue aislado después de electroforesis en gel de agarosa. Este fragmento fue ligado con el plásmido pBS-KS, previamente digerido por HindIII y desfosforilado, para generar el plásmido "pKS-Izquierdo ITR5".
Se llevó a cabo entonces una reacción de ACP con la matriz del plásmido pKS-Izquierdo ITR5 y con los siguientes oligonucleótidos:
ITRPAV5 (SEQ ID Nº 4):
5' CCTTAATTAAGGTAGGGATAACAGGGTAATCATCATCAATAATATACGGA 3'
y T7 (SEQ ID Nº 3) (20 mer):
5' TAATACGACTCACTATAGGG 3'
\vskip1.000000\baselineskip
para producir un fragmento de 1,3 kpb. Este fragmento fue ligado con el plásmido pCRII para dar el plásmido "pCR-Izquierdo ITR5" (figura 8).
11.3 Construcción del plásmido pPolyII-Derecho ITR5
El plásmido pCR-Derecho ITR5 (ejemplo 11.1) fue digerido por BamHI y HindIII para aislar el fragmento BamHI-HindIII de 1,0 kpb. Este fragmento fue ligado a continuación con el plásmido pPolyII (véase ejemplo 4), previamente digerido por BamHI y HindIII, para generar el plásmido "pPolyII-Derecho ITR5" (figura 8).
11.4 Construcción del plásmido pITRsPAV5
El plásmido pCR-Izquierdo ITR5 (ejemplo 11.2) fue digerido por BamHI y HindIII para aislar el fragmento BamHI-HindIII de 1,3 kpb. Este fragmento se ligó a continuación con el plásmido pPolyII-Derecho ITR5, previamente digerido por BgIII y HindIII, para generar el plásmido "pITRs PAV5" (figura 8).
Ejemplo 12 Construcción del plásmido pPAV5
El plásmido pITRsPAV5 fue linealizado por medio de digestión por HindIII. Entonces se co-transformó el fragmento obtenido en bacterias competentes BJ5183 con el ADN genómico del virus PAV-5 preparado según el ejemplo 3. Esta co-transformación permitió generar por recombinación homóloga un plásmido que contenía la totalidad del genoma del virus PAV-5. Este plásmido fue designado "pPAV5".
Ejemplo 13 Construcción de los plásmidos Lanzadera PAV-5 13.1. Construcción del plásmido Lanzadera E3 PAV-5
El plásmido pPAV5 (ejemplo 12) fue digerido por SacI y MluI para aislar el fragmento SacI-MluI de 4372 que contenía la región E3. Este fragmento se ligó con el plásmido pNEB193 (ejemplo 6.1), previamente digerido por SmaI y AscI, para dar el plásmido "pE3PAV5" (figura 9).
El fragmento SacI-MluI clonado en el plásmido pE3PAV5 fue secuenciado y analizado por completo. El análisis de esta secuencia y de las secuencias adyacentes presentes en el plásmido pPAV5 confirmó que el fragmento clonado representaba bien la región E3 del virus PAV-5. La secuencia de esta región (5614 pares de bases) (SEQ ID Nº 5) se presenta en la figura 13.
13.2 Construcción de los plásmidos donantes CMV-EGFP y CMV-PRV gD con una deleción de 1472 pares de bases en la región E3
El plásmido pCMV-EGFP (ejemplo 6.1) fue digerido por las enzimas AsnI y MluI, y después tratado con la ADN polimerasa T4 para aislar el fragmento AsnI (extremo libre)-MjuI (extremo libre) de 1,6 kpb. Este fragmento fue ligado con el plásmido pE3PAV5 (ejemplo 13.1), previamente digerido por PvuII y BgII, y tratado con la ADN polimerasa T4 para generar el plásmido pE3dl1472CMV-EGFP (figura 10). La deleción introducida entre los sitios PvuII y BgII tiene un tamaño de 1472 pb. Esta deleción se encuentra comprendida entre los nucleótidos 2389 y 3861 de la secuencia presentada en la figura 13 (SEQ ID Nº 5).
El plásmido pgD (ejemplo 6.1) fue digerido por las enzimas AsnI y MluI para aislar el fragmento AsnI-MluI de 2,3 kpb. Este fragmento fue tratado a continuación con la ADN polimerasa T4 para convertirlo en extremos libres, y después fue ligado con el plásmido pE3PAV5, previamente digerido por PvuII y BgII y tratado con la ADN polimerasa T4, para generar el plásmido pE3dl1472CMVgD (figura 10).
El plásmido pCMV-EGFP fue digerido por NheI y MluI para aislar el fragmento de 1,0 kpb. Este fragmento fue tratado con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa para convertirlo en extremos libres, y después ligado con el plásmido pE3PAV5, previamente digerido por PvuII y BgII, tratado con la ADN polimerasa T4, para generar el plásmido pE3dl1472EGFP (figura 11).
El plásmido pCMVgD (ejemplo 6.1) fue digerido por XhoI y ClaI para aislar el fragmento XhoI-ClaI de 1,5 kpb. Este fragmento fue tratado con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa para convertirlo en extremos libres, y después fue ligado con el plásmido pE3PAV5, previamente digerido por PvuII y BgII, tratado con la ADN polimerasa T4, para generar el plásmido pE3dl1472gD (figura 12).
Ejemplo 14 Construcción de los genomas recombinantes pPAV5dl1472CMV-EGFP y pPAV5dl1472CMV-gD
El plásmido pE3dl1472CMV-EGFP (ejemplo 13.2) fue linealizado por medio de PmeI, y después co-transformado en bacterias competentes BJ5183 con el plásmido pPAV5 (ejemplo 12) linealizado por medio de digestión parcial por la enzima BamHI (sitio de empalme de los subfragmentos de restricción BamHI A-BamHI D, figura 12). Esta co-transformación condujo a la generación, por recombinación homóloga en Escherichia coli, del plásmido pPAV5dl1472CMV-EGFP.
El plásmido pE3dl1472CMVgD (ejemplo 13.2) fue linealizado por PmeI, y después co-transformado en bacterias competentes BJ5183 con el plásmido pPAV5 (ejemplo 12) linealizado por medio de digestión parcial por la enzima BamHI (sitio de empalme de los subfragmentos de restricción BamHI A-BamHI D, figura 12). Esta co-transformación condujo a la generación, por recombinación homóloga en Escherichia coli, del plásmido pPAV5dl1472CMV-
gD.
Ejemplo 15 Construcción de los genomas recombinantes pPAV5dl1472EGFP y pPAV5dl1472 gD (inserción de las secuencias codificantes sin las secuencias del promotor CMV)
El plásmido pE3dl1472EGFP (ejemplo 13.2) fue linealizado por medio de PmeI, y después co-transformado en bacterias competentes BJ5183 con el plásmido pPAV5 (ejemplo 12) linealizado por medio de digestión parcial por la enzima BamHI (sitio de empalme de los subfragmentos de restricción BamHI A-BamHI D, figura 12). Esta co-transformación condujo a la generación, por recombinación homóloga en Escherichia coli, del plásmido pPAV5dl1472EGFP.
El plásmido pE3dl1472gD (ejemplo 13.2) fue linealizado por medio de PmeI, y después co-transformado en bacterias competentes BJJ5183 con el plásmido pPAV5 (ejemplo 12) linealizado por medio de digestión parcial por la enzima BamHI (sitio de empalme de los subfragmentos de restricción BamHI A-BamHI D, figura 12). Esta co-transformación condujo a la generación, por recombinación homóloga en Escherichia coli, del plásmido pPAV5dl1472gD.
\newpage
Ejemplo 16 Obtención de los virus PAV-5 recombinantes por transfección con los genomas de PAV-5 recombinantes clonados en Escherichia coli
Las células PK-15 o ST (véase ejemplo 1) se transfectan en placa de 6 pozos a una densidad de confluencia de 60-80% con 2 \mug de ADN genómico de PAV-5 recombinante, previamente digerido por PacI, diluido en presencia de 4 a 12 \mul de LipofectAMINA (Gibbo-BRL Cat # 18324-012) según las líneas celulares.
Después de la transfección según las condiciones recomendadas por el proveedor, se dejaron las células en cultivo durante algunos días hasta la aparición de un ECP viral. Se llevó a cabo entonces un pasaje para amplificar el virus recombinante obtenido.
La transfección realizada con el plásmido pPAV5dl1472CMV-EGFP (ejemplo 14) generó el virus recombinante vPAV5-1.
La transfección realizada con el plásmido pPAV5dl1472CMV-gD (ejemplo 14) generó el virus recombinante vPAV5-2.
La transfección realizada con el plásmido pPAV5dl1472EGFP (ejemplo 15) generó el virus recombinante
\hbox{vPAV5-3.}
La transfección realizada con el plásmido pPAV5dl1472gD (ejemplo 15) generó el virus recombinante vPAV5-4.
Ejemplo 19 Fabricación de las vacunas según la invención
Los virus recombinantes obtenidos según la invención se cultivan y amplifican en cultivo de células PK-15. Se recolectan los sobrenadantes después de observar un efecto citopatógeno completo. Después de una clarificación por centrifugación a baja velocidad para eliminar los restos celulares, y luego centrifugación para concentrar los viriones y el lavado del sedimento viral, se recoge el sedimento con una solución de medio de cultivo. Se mide el título viral de estas suspensiones. Entonces se ajusta por dilución el título viral, si es necesario, con el fin de conseguir un título viral comprendido entre 10^{4} dosis infectantes 50% en cultivo de células (DICC50) y 10^{7} DICC50/ml.
Las suspensiones virales pueden ser, o bien congeladas, o bien preferentemente liofilizadas en presencia de un sustrato de liofilización.
Ejemplo 20 Vacunación de los cerdos
Después de la descongelación, o después de recoger las dosis liofilizadas en agua para preparaciones inyectables, y en su caso la adición de un adyuvante, se vacunan los cerdos con dosis de entre 10^{4} y 10^{7} DICC50 de cada virus recombinante. Las vacunas comprenden uno o varios virus PAV recombinantes, cada uno de los cuales expresa inmunógenos diferentes.
Las vacunas se administran, o bien por inyección con aguja (vía intramuscular) con un volumen de 2 ml, o bien por vía mucosa (vía intranasal o instilación ocular) (volúmenes adaptados a cada vía).
Se pueden llevar a cabo asimismo inyecciones por vía intradérmica por medio de un inyector sin aguja, como por ejemplo el aparato PIGJET (Societé Endoscoptic, Laon, Francia).
Ejemplo 21 Protocolo de vacunación/ensayo enfermedad de Aujeszky
Se puso en práctica un protocolo de vacunación/ensayo para evaluar la eficacia de una vacuna constituida por una suspensión del virus recombinante vPAV3-2 no adyuvado (ejemplo 10 de la presente invención).
Se formaron grupos de 6 lechones de 8 a 10 semanas de edad, nacidos de cerdas que habían sido vacunadas contra el virus de la enfermedad de Aujeszky (PRV) al comienzo de la gestación. Todos los lechones tenían bastantes anticuerpos maternos anti-PRV en el día D0 de la vacunación. Los lechones de los grupos 1 y 2 fueron vacunados el D0 por vía intranasal con 1 mililitro (ml) de una suspensión del virus recombinante vPAV3-2 (PAV-3/PRV gD) con un título de 10^{7} DICC50/ml (0,5 ml por orificio nasal). El grupo 2 fue vacunado de la misma manera, pero recibió asimismo una segunda administración el D12. El grupo 3 recibió el D0 por vía intramuscular 1 ml de una suspensión viral de PAV-3/gD con un título de 10^{7} DICC50/ml. El grupo 4 fue vacunado de la misma manera que el grupo 3, pero recibió una segunda inyección de suspensión viral el D21. El grupo 5 no fue vacunado y sirvió de grupo testigo negativo para el ensayo.
Se realizó el ensayo en todos los grupos el D35 mediante la administración de 2 ml (1 ml por orificio nasal) de una suspensión de la cepa PRV NIA3 con un título de como mínimo 10^{7,3} pfu/ml.
Después del ensayo se realizó un seguimiento de los cerdos sobre criterios de evolución ponderal (delta G7) (Stellmann C. et al. J. Biol. Standard. 1989. 17. 1-11) (D0 a D7 después del ensayo), de nivel de excreción viral a la altura de las mucosas nasales, y sobre los títulos de anticuerpos ELISA y seroneutralizantes anti-PRV.
Tiene que entenderse, por supuesto, que la invención definida por las reivindicaciones del anexo no se limita a las formas de realización particulares indicadas en la anterior descripción.
<110> MERIAL Ecole Nationale Vétérinaire de Maisons ALFORT
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Vacunas y vectores virales basados en adenovirus porcinos recombinantes
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> PAV EP
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\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 00/903750
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 2000-02-08
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR 99/01813
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1999-02-11
\vskip1.000000\baselineskip
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<160> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.2
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<210> 1
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<211> 50
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> oligonucleótido
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskip
ccttaattaa ggtagggata acagggtaat catcatcaat aatataccgc
\hfill
50
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<210> 2
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> oligonucleótido
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskip
attaaccctc actaaaggga
\hfill
20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> oligonucleótido
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskip
taatacgact cactataggg
\hfill
20
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<210> 4
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<211> 50
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> oligonucleótido
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<400> 4
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ccttaattaa ggtagggata acagggtaat catcatcaat aatatacgga
\hfill
50
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<210> 5
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<211> 5614
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus porcino 5
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<400> 5
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1
2
3
4
5
6
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<210> 6
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<211> 623
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<212> ADN
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<213> Adenovirus porcino 3
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<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
7
8

Claims (13)

1. Un adenovirus porcino recombinante de serotipo 3 (PAV-3) que contiene al menos un ácido nucleico heterólogo que codifica al menos un inmunógeno, habiéndose insertado el ácido nucleico heterólogo en la región E3 del genoma de PAV-3, situada entre el gen que codifica la proteína pVIII y el que codifica la fibra, siendo capaz el adenovirus recombinante de replicarse in vivo y de expresar el inmunógeno, eligiéndose el inmunógeno del grupo que consiste en: inmunógeno del circovirus porcino tipo 2, gB del virus de la enfermedad de Aujeszky, gC del virus de la enfermedad de Aujeszky, inmunógeno del virus de la gripe porcina, VP2 del virus de la parvovirosis, ORF3 del virus de la enfermedad misteriosa del cerdo (síndrome respiratorio y reproductivo porcino), ORF4 del virus de la enfermedad misteriosa del cerdo, ORF6 del virus de la enfermedad misteriosa del cerdo, ORF7 del virus de la enfermedad misteriosa del cerdo, E0 del virus de la peste porcina clásica, E1 del virus de la peste porcina clásica e inmunógeno de Actinobacillus pleuropneumoniae.
2. Adenovirus según la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico heterólogo se ha insertado en la región E3 del genoma de PAV-3, en una zona de inserción que en la cepa 6618 tiene la secuencia representada por SEQ ID Nº: 6.
3. Adenovirus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la zona de inserción presenta una deleción.
4. Adenovirus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el ácido nucleico heterólogo codifica al menos un inmunógeno del circovirus porcino tipo 2.
5. Adenovirus según la reivindicación 4, en el que el ácido nucleico heterólogo codifica ORF1, ORF2 o ORF1 y ORF2 del circovirus porcino tipo 2.
6. Adenovirus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el ácido nucleico heterólogo codifica HA, NA y/o NP del virus de la gripe porcina.
7. Adenovirus porcino según una de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende una secuencia nucleotídica heteróloga que codifica una citocina porcina.
8. Adenovirus según la reivindicación 7, en el que la citocina porcina se elige del grupo que consiste en GM-CSF, IL-4, IL-12 e IL-18.
9. Vacuna porcina recombinante que comprende un adenovirus porcino PAV-3 recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y un vehículo o excipiente aceptable desde un punto de vista veterinario.
10. Vacuna porcina recombinante según la reivindicación 9 que comprende varios adenovirus porcinos recombinantes PAV-3 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, los cuales comprenden secuencias nucleotídicas heterólogas diferentes.
11. Vacuna porcina recombinante según las reivindicaciones 9 ó 10 que comprende un adyuvante.
12. Vacuna porcina recombinante según la reivindicación 11 en la el adyuvante se elige de entre los polímeros de los ácidos acrílico o metacrílico y los copolímeros de anhídrido maleico y de derivado alquenilo.
13. Vacuna porcina recombinante según la reivindicación 12 en la que el adyuvante es un carbómero.
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Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0839912A1 (en) * 1996-10-30 1998-05-06 Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
US20040224327A1 (en) * 1996-10-30 2004-11-11 Meulenberg Johanna Jacoba Maria Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
FR2772047B1 (fr) * 1997-12-05 2004-04-09 Ct Nat D Etudes Veterinaires E Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection
EP1157121B1 (en) * 1999-03-08 2013-04-24 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH Prrsv replicon
MXPA01010681A (es) * 1999-04-22 2003-08-20 Us Agriculture Vacuna de sindrome respiratorio y reproductiva porcina a base de ja-142 aislado.
CA2413265A1 (en) * 2000-05-03 2001-11-08 University Of Guelph Porcine adenovirus type 5 vector and vaccine
UA82647C2 (uk) 2001-03-27 2008-05-12 Юниверсити Оф Саскачеван Спосіб культивування цирковірусу ссавця
US7906311B2 (en) 2002-03-20 2011-03-15 Merial Limited Cotton rat lung cells for virus culture
AR049924A1 (es) 2004-06-18 2006-09-13 Univ Minnesota Identificacion de organismos viralmente infectados y vacunados
US7632636B2 (en) * 2004-09-21 2009-12-15 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Porcine reproductive and respiratory syndrome isolates and methods of use
US7833707B2 (en) * 2004-12-30 2010-11-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2
US7700285B1 (en) 2005-12-29 2010-04-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. PCV2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions
UA95602C2 (ru) 2004-12-30 2011-08-25 Берингер Ингельхейм Ветмедика, Инк. Иммуногенная композиция цвс2 и способы приготовления такой композиции
CA2894069C (en) 2005-06-24 2019-02-26 Regents Of The University Of Minnesota Prrs viruses, infectious clones, mutants thereof, and methods of use
EP1968630B1 (en) 2005-12-29 2018-01-24 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Multivalent pcv2 immunogenic compositions
DK3127551T3 (da) 2005-12-29 2020-10-12 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Pcv2-immunogen-sammensætning til at mindske kliniske symptomer i grise
US20100129397A1 (en) * 2006-12-11 2010-05-27 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Effective method of treatment of porcine circovirus and lawsonia intracellularis infections
PT2481420T (pt) 2006-12-15 2019-05-31 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Vacina para porcos anti-pcv2 de dose única
EP1941903A1 (en) * 2007-01-03 2008-07-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prophylaxis and treatment of PRDC
EP1958644A1 (en) 2007-02-13 2008-08-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prevention and treatment of sub-clinical pcvd
US7829274B2 (en) 2007-09-04 2010-11-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Reduction of concomitant infections in pigs by the use of PCV2 antigen
JP2011508595A (ja) * 2007-12-31 2011-03-17 ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ インコーポレイテッド 外来性アミノ酸の挿入を含むpcv2orf2ウイルス様粒子
US20090317423A1 (en) * 2008-01-23 2009-12-24 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Pcv2 mycoplasma hyopneumoniae immunogenic compositions and methods of producing such compositions
US8444989B1 (en) * 2008-04-18 2013-05-21 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh One dose vaccination against mycoplasma infections of pigs
WO2010025109A1 (en) * 2008-08-25 2010-03-04 Boehringer Ingelheim Vetmedia, Inc. Vaccine against highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome (hp prrs)
AU2009100018B4 (en) * 2008-10-15 2009-09-03 Australasian Pork Research Institute Ltd A Method of vaccination
US20100150959A1 (en) * 2008-12-15 2010-06-17 Vectogen Pty Ltd. PCV 2-Based Methods and Compositions for the Treatment of Pigs
TWI627281B (zh) 2009-09-02 2018-06-21 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 降低pcv-2組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之pcv-2組合物
PL2675475T3 (pl) 2011-02-17 2015-12-31 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Nowy europejski szczep prrs
US9944902B2 (en) 2011-02-17 2018-04-17 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Commercial scale process for production of PRRSV
US9187731B2 (en) 2011-07-29 2015-11-17 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh PRRS virus inducing type I interferon in susceptible cells
US9315781B2 (en) 2011-07-29 2016-04-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Infectious CDNA clone of european PRRS virus and uses thereof
CN102766604B (zh) * 2012-06-19 2013-06-05 河南农业大学 一种猪流感病毒毒株及其应用
EP2968513A2 (en) 2013-03-15 2016-01-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, compositions, vaccine and methods of use
EP2994162B1 (en) 2013-05-08 2021-04-07 Pharmgate Biologics Inc. Vaccine for pcv2 and mycoplasma
JP6821429B2 (ja) 2013-09-25 2021-01-27 ゾエティス・サービシーズ・エルエルシー Pcv2b分岐ワクチン組成物及び使用方法
US9505808B2 (en) 2013-10-02 2016-11-29 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. PCV2 ORF2 protein variant and virus like particles composed thereof
CN105273067A (zh) * 2015-03-13 2016-01-27 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 一种编码MERS-CoV棘突蛋白的重组41型腺病毒载体疫苗
WO2016183423A1 (en) 2015-05-14 2016-11-17 Merial Inc. Method for porcine circovirus production and pcv2 vaccines
CN105368796A (zh) * 2015-09-09 2016-03-02 河南农业大学 一种表达ppv vp2基因和猪il-18基因的重组猪伪狂犬病毒株
MX2019005137A (es) * 2016-11-03 2019-06-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Vacuna contra parvovirus porcino.
CN116813720A (zh) * 2017-07-07 2023-09-29 浙江海隆生物科技有限公司 猪伪狂犬病毒gD蛋白的制备方法及猪伪狂犬病毒亚单位疫苗和应用
CN110038124B (zh) * 2019-05-13 2023-04-14 天康生物股份有限公司 猪瘟-猪传染性胸膜肺炎二联亚单位的疫苗及其制备方法和应用
CN112834744A (zh) * 2020-12-31 2021-05-25 天津瑞普生物技术股份有限公司 一种猪群体内腺病毒3型中和抗体阳性率的elisa试剂盒及其检测方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1154718A (zh) * 1994-07-29 1997-07-16 美国氰胺公司 与主要组织相容性复合体i类重链表达负调节有关的人巨细胞病毒基因区域的鉴定
ES2105984B1 (es) * 1995-11-30 1998-04-16 Iberica Cyanamid Adenovirus recombinantes que expresan antigenos del virus de la gastroenteritis porcina transmisible (vgpt) y su empleo en la formacion de vacunas.
AUPO856097A0 (en) * 1997-08-14 1997-09-04 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Vector
US6492343B1 (en) * 1998-04-15 2002-12-10 University Of Saskatchewan Porcine adenovirus type 3 genome

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