CN112834744A - 一种猪群体内腺病毒3型中和抗体阳性率的elisa试剂盒及其检测方法 - Google Patents
一种猪群体内腺病毒3型中和抗体阳性率的elisa试剂盒及其检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112834744A CN112834744A CN202011634577.XA CN202011634577A CN112834744A CN 112834744 A CN112834744 A CN 112834744A CN 202011634577 A CN202011634577 A CN 202011634577A CN 112834744 A CN112834744 A CN 112834744A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hvr
- detection method
- positive
- hexon
- pig
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 title claims abstract description 21
- 241000193096 Human adenovirus B3 Species 0.000 title claims abstract description 9
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 title abstract description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 28
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims abstract description 21
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 20
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims description 19
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 15
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 15
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 13
- 238000007605 air drying Methods 0.000 claims description 12
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 12
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 12
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 8
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 7
- 244000144980 herd Species 0.000 claims description 7
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 7
- 101000832631 Homo sapiens Small ubiquitin-related modifier 3 Proteins 0.000 claims description 6
- 102100024534 Small ubiquitin-related modifier 3 Human genes 0.000 claims description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 241000282887 Suidae Species 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 17
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 7
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 4
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241001492389 Porcine adenovirus 3 Species 0.000 description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 3,3-bis(chloromethyl)oxetane Chemical compound ClCC1(CCl)COC1 CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710094396 Hexon protein Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 101710173835 Penton protein Proteins 0.000 description 2
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 description 2
- NOIIUHRQUVNIDD-UHFFFAOYSA-N 3-[[oxo(pyridin-4-yl)methyl]hydrazo]-N-(phenylmethyl)propanamide Chemical compound C=1C=CC=CC=1CNC(=O)CCNNC(=O)C1=CC=NC=C1 NOIIUHRQUVNIDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701242 Adenoviridae Species 0.000 description 1
- 208000010370 Adenoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010060931 Adenovirus infection Diseases 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 101710145505 Fiber protein Proteins 0.000 description 1
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 1
- 101000628899 Homo sapiens Small ubiquitin-related modifier 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010060860 Neurological symptom Diseases 0.000 description 1
- 241000188845 Porcine adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001673669 Porcine circovirus 2 Species 0.000 description 1
- 241001135989 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 102100026940 Small ubiquitin-related modifier 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 208000011589 adenoviridae infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 108700010877 adenoviridae proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000014670 detection of bacterium Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/01—DNA viruses
- G01N2333/075—Adenoviridae
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明创造提供了一种猪群体内腺病毒3型中和抗体阳性率的ELISA试剂盒及其检测方法，试剂盒中的包被抗原为重组蛋白SUMO3‑Hexon‑HVR1‑6。本发明创造所述的ELISA检测方法对临床常见的几种猪病毒阳性血清进行检测，并无交叉反应；当血清样品稀释到1:320时仍能检测出阳性血清；批内重复的变异系数为1.0％～3.9％之间，批间重复变异系数在0.5％～8.3％之间；本间接ELISA检测方法与PCR核酸检测的阳性符合率为88％。
Description
技术领域
本发明创造属于生物检测技术领域，尤其是涉及猪群体内腺病毒 3型中和抗体阳性率的ELISA试剂盒及其检测方法。
背景技术
猪腺病毒3型(porcine adenovirus serotype 3,PADV-3)属于腺病毒科，哺乳动物腺病毒属。动物感染腺病毒之后会出现水样腹泻症状，有可能会出现呼吸道症状或者神经症状，但是症状比较轻微[1]。而且经常与其他可以引起猪群腹泻的病毒混合感染[2-4]。所以在猪群中出现腹泻病猪时，大家往往会把病因归结于这些常见的引起猪腹泻的病毒上，从而忽视了PADV-3在其中扮演的重要角色。腺病毒有非常严格的宿主选择性，猪是猪腺病毒的唯一宿主，不感染其他动物[5]。
PADV-3是一个无囊膜的DNA双链病毒，。病毒外形是一个十二面体，病毒衣壳主要由252个蛋白衣壳粒子，其中有240个六邻体 (Hexon)，12个五邻体蛋白(penton)[6-7]。腺病毒的中和抗体IgG 主要是识别腺病毒的衣壳蛋白[8]，腺病毒的主要中和表位都集中在Hexon的高变区(hypervariable region,HVR),其次是penton蛋白和 fiber蛋白[9-10]。每个Hexon都是有三个Hexon分子形成的聚合体分子，这个三聚体由一个五面体的基底和三角形的塔尖构成，基底部分是P1和P2两个结构域。顶部塔区部分由四个环组成，Loop1、Loop2、Loop3、Loop4[11]。根据相关报道发现，Hexon的P1区和P2区是非常保守的，不同血清型的HVRs的氨基酸的变化主要集中在Loop1和 Loop2上[12]。这两个环上包含了7个超变区HVR1、HVR2、HVR3、 HVR4、HVR5、HVR6、HVR7，其中HVR1-6是在比较复杂的Loop1区域上，HVR7在Loop2区域。这些超变区的长度根据病毒血清型的不同有所变化。其中HVR1、HVR2、HVR4、HVR5、HVR7包含了大量中和抗原决定簇，这五个高变区涵盖了Hexon蛋白约99％的型特异性氨基酸残基[13]。所以Hexon常被作为PADV-3检测的主要关注点。
目前已有学者尝试将Hexon基因全长在原核系统中进行了表达 [14]，但是可能与培养的条件或者基因中包含大量的稀有密码子有关系，导致表达的蛋白都是以包涵体的形式存在。另外，现在关于 PADV-3的检测方法主要有普通的PCR和荧光定量PCR方法，血清学方面的相关研究比较少[15]。
发明内容
为了方便有效的检测猪群中PADV-3的中和抗体的阳性率，本发明通过将原核表达的重组Hexon蛋白作为包被抗原建立了间接 ELISA检测方法，并对该方法的敏感性和特异性进行了评价。提供了一种使用有效的检测猪群PADV-3中和抗体阳性率的方法，PADV-3 作为一种优良的疫苗载体被广泛应用[16]，但是动物体内预存的中和抗体却会对此载体疫苗的效果造成较大的影响，所以了解猪群体内 PADV-3中和抗体的阳性率可以为PADV-3载体疫苗的开发提供材料。
有鉴于此，本发明创造旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种猪群体内腺病毒3型中和抗体阳性率的ELISA试剂盒及其检测方法。
为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：
一种猪群体内腺病毒3型中和抗体阳性率的ELISA检测方法，包括如下步骤：
a、包被抗原：将SUMO3-Hexon-HVR1-6重组蛋白稀释后包被至 ELISA酶标板中，4℃过夜包被；
b、洗涤：弃去包被液并用PBST洗涤3次，每次摇床震荡30s；晾干后加入200μL封闭液封闭，PBST清洗3次，每次摇床震荡30s；
c、孵育一抗：晾干后加入稀释的血清样品100μL/孔，孵育， PBST清洗3次，每次摇床震荡30s；
d、孵育二抗：晾干后加入HRP标记的羊抗猪的二抗100μL/ 孔，孵育，PBST清洗3次，每次摇床震荡30s；e、显色与读值：晾干后按照100μL/孔的量加入TMB显色液，避光显色10min，最后加入浓度为2mol/L的硫酸溶液50μL/孔终止显色；在酶标仪上读取每孔OD450nm的值，根据临界值判定阴阳性；
其中，步骤a中所述SUMO3-Hexon-HVR1-6重组蛋白为在Hexon 的高变基因区HVR1-6的N端添加猪源SUMO3标签，所述PADV-3 的Hexon高变基因区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述步骤a中包被抗原的包被浓度为6μg/mL。
优选的，所述步骤b中的封闭液为2％的BSA溶液，封闭条件为 37℃封闭1h。
优选的，所述步骤c中血清样品的稀释度为1:80，孵育条件分别为37℃孵育1h。
优选的，所述HRP标记的羊抗猪的二抗的稀释度为原液浓度，孵育条件37℃孵育1h。
优选的，所述临界值判定阴阳性的标准为：当OD450nm值大于 0.362时是阳性，小于0.362时是阴性。
本发明还提供上述方法在制备猪群体内腺病毒3型中和抗体阳性率的检测试剂盒中的应用。
相对于现有技术，本发明创造具有以下优势：
(1)本发明首先扩增出了Hexon的高变区基因HVR1-6，并在其 N端分别添加酵母来源的SUMO标签以及猪源的SUMO1、SUMO3标签，来对比不同SUMO标签的促溶效果。挑选促溶效果最好的猪源SUMO3 标签来进行后续的实验，并且大量表达纯化得到重组蛋白 SUMO3-Hexon-HVR1-6。
(2)本发明选取了Hexon的高变区基因来降低Hexon全长基表达时出现的问题，实现Hexon基因的可溶性表达；而且高变区基因包含猪腺病毒型特异性区域，所以选取此区域作为包被抗原可以最大限度的降低腺病毒不同血清型对PADV-3中和抗体阳性率的影响。
(3)利用本发明的ELISA检测方法对临床常见的几种猪病毒阳性血清进行检测，并无交叉反应；当血清样品稀释到1:320时仍能检测出阳性血清；批内重复的变异系数为1.0％～3.9％之间，批间重复变异系数在0.5％～8.3％之间；本间接ELISA检测方法与PCR核酸检测的阳性符合率为88％。
(4)利用本发明建立的间接ELISA检测方法对不同猪场采集的 241份血清样品进行检测，检测出阳性血清48份，阳性率为19.9％。
(5)本发明建立的间接ELISA检测方法方便、快捷、灵敏、有效，可用于PADV-3的检测以及流行病学的调查。
附图说明
图1为重组质粒的PCR验证图；图中的5泳道为质粒28a-HVR1-6 的PCR结果，6、7、8泳道分别为28a-S1-HVR1-6、28a-S3-HVR1-6、 28a-S-HVR1-6。
图2为重组质粒的双酶切鉴定；从左到右依次是重组质粒 28a-HVR1-6、28a-S1-HVR1-6、28a-S3-HVR1-6、28a-S-HVR1-6的双酶切结果。
图3为细菌破碎后的SDS-PAGE检测图；图3-A中的泳道7、8 为不带标签的28a-HVR1-6载体的细菌的上清与沉淀，图3-B中的泳道3、 4为含有28a-S1-HVR1-6载体的细菌的上清与沉淀，泳道5、6为含有 28a-S3-HVR1-6载体的细菌的上清与沉淀，泳道7、8为含有 28a-S-HVR1-6载体的细菌的上清与沉淀。
图4为融合蛋白S3-HVR1-6的Western-blot的鉴定图，图中：P 为PADV-3的阳性血清，N为PADV-3的阴性血清。
图5为融合蛋白S3-HVR1-6的纯化结果图。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明创造。
实施例 猪腺病毒3型的Hexon高变区基因的可溶性表达以及中和抗体间接ELISA方法的建立
1.1引物设计
根据pET28a、pET28a、pET28a-pigSUMO1、pET28a-pigSUMO3、 yeastSUMO和Hexon-HVR的基因序列，利用Snapgene和CE Design 软件设计出特异性引物扩增出目的片与酶切载体构建 pET28a-HVR1-6、pET28a-SUMO1-HVR1-6、pET28a-SUMO3-HVR1-6、 pET28a-yeastSUMO-HVR1-6载体(表1)，本实施例将其分别命名为 28a-HVR1-6、28a-S1-HVR1-6、28a-S3-HVR1-6、28a-S-HVR1-6。
表1构建载体所用引物
1.2构建表达载体
1.2.1扩增目的基因
用表1中的F1和R1引物扩增的HVR1-6基因与线性化的载体 pET28a重组构建28a-HVR1-6重组载体；用F2和R2引物扩增HVR1-6基因与线性化的载体pET28a-SUMO1重组构建28a-S1-HVR1-6；用F3 和R2引物扩增HVR1-6基因与线性化的载体pET28a-SUMO3重组构建28a-S3-HVR1-6；用F4和R4引物扩增HVR1-6基因与线性化的载体 28a-HVR1-6重组构建28a-S-HVR1-6。使用高保真酶进行PCR扩增，扩增出构建对应载体的特异性目的片段。PCR反应体系如表2：
表2 PCR反应体系
PCR反应条件如下：
PCR扩增结束后用将PCR产物加入1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像仪照出目的条带，用天根的凝胶回收试剂盒进行切胶回收，最后利用核酸蛋白分析仪NanoDrop2000测定回收的核酸浓度，-20℃保存备用。
1.2.2载体的双酶切
使用QuickCut HindIII和Xhol对pET28a载体进行双酶切，37℃条件下反应30min；使用QuickCut BamHI分别对pET28a-SUMO1、 pET28a-SUMO3、pET28a-yeastSUMO进行30℃酶切15min，直接在反应体系中加入HindIII在37℃条件下继续酶切15min，反应结束后少量酶切产物进行凝胶核酸电泳检验，验证无误后进行切胶回收。 HindIII和Xhol双酶切反应体系如表3：
表3 HindIII和Xhol双酶切反应体系
轻轻混匀后瞬时离心，37℃酶切30min。
BamHI和HindIII双酶切反应体系如表4：
表4 BamHI和HindIII双酶切反应体系
轻轻摇匀后瞬时离心，首先在30℃酶切15min，之后再加入1μL 的QuickCutHindIII在37℃继续酶切15min。琼脂糖凝胶电泳结束后，胶回收操作步骤参考说明书。
1.2.3构建重组质粒
参考诺唯赞重组试剂盒将PCR产物与酶切后的载体进行反应构建pET28a-HVR1-6、pET28a-SUMO1-HVR1-6、pET28a-SUMO3-HVR1-6、 pET28a-yeastS UMO-HVR1-6。重组质粒。反应体系如表5：
表5重组质粒的反应体系
1.3重组产物的转化、筛选
转化过程参考说明书进行，转化菌株用带有卡那抗性的LB平板进行筛选，37℃温箱培养，直至出现单菌落。
挑取平板上的单菌落，T7/T7ter引物进行PCR鉴定(如图1)，以及重组质粒的双酶切鉴定(如图2)。
1.4重组质粒的表达
将提取的重组质粒按照说明书转化进入BL21(DE3)感受态细胞中，经验证正确的菌株保存备用，同时接种到LB培养基中，37℃、 200转/min诱培养至OD600到0.6左右时加入0.1mM的IPTG诱导6h 后收获细菌。
1.5表达蛋白SDS-PAGE、WB验证
按照索莱宝的SDS-PAGE凝胶试剂盒配置浓缩胶和12％的分离胶备用。将表达的重组蛋白Hexon-HVR1-6、S1-HVR1-6、S3-HVR1-6、 S-HVR1-6进行SDS-PAGE验证发现猪源SUMO3的促溶效果最好(如图3)所以决定用SUMO3作为该研究的最佳促溶标签。分别用 PADV-3的阴性血清和阳性血清与重组蛋白S3-HVR1-6反应(如图4)，结果发现该蛋白特异性良好。
1.6重组蛋白S3-HVR1-6的纯化
镍柱首先用10mM的咪唑溶液进行润洗，将过滤后的细菌破碎液上清穿过镍柱，接着用20mM的咪唑溶液洗脱杂蛋白，最后用500mM 的咪唑溶液洗脱目的蛋白，纯化结果(如图5)显示洗脱效果较好，纯度较高。
2.1抗原蛋白稀释度以及血清稀释度的确定
将上述制备的重组蛋白S3-HVR1-6依次稀释成1.5μg/mL、3 μg/mL、6μg/mL、12μg/mL、24μg/mL这几个梯度，同时分别将 PADV-3的标准阳性和阴性血清稀释成1:40、1:80、1:160、1:320、1:640 几个梯度，方阵滴定法结果(表6)显示，当抗原蛋白浓度为6μg/mL 时，血清样品稀释80倍时阳性血清样品的OD450nm的值接近1，且 P/N的值最大。
表6方阵滴定法结果
2.2抗原蛋白最佳包被时间的确定
将抗原蛋白分别在4℃过夜包被、37℃包被1h、37℃包被2h三个不同的条件下进行，其他的条件不变，结果(表7)发现P/N数值在4℃的情况下最大。
表7
2.3最佳封闭液以及最佳封闭时间的确定
分别选用1％脱脂乳、2％脱脂乳、1％BSA、2％BSA溶液对吸附了抗原蛋白的96孔板进行37℃封闭1h，同时设置一组不封闭作为对照，结果(表8)表明用2％BSA的P/N最大，封闭效果最好。
设置2％BSA分别进行37℃封闭0.5h、37℃封闭1h、37℃封闭 2h；对比结果(表9)最终确定37℃封闭1h作为最佳的封闭时间。
表8
表9
2.4血清最佳孵育时间的确定
将血清样品稀释到合适的浓度分别在37℃孵育0.5h、37℃孵育1 h、37℃孵育2h进行反应，结果(表10)表明P/N的值在37℃孵育1h的条件下最大。
表10
2.5二抗最佳稀释度以及最佳孵育时间的确定
将稀释好的商品化HRP标记的二抗原液分别制备成2倍、4倍、 8倍稀释剂量，对比结果(表11)发现二抗在原液浓度下效果最佳。
对比二抗在37℃下分别孵育0.5h、1h、2h的孵育效果，结果(表 12)表明其在37℃孵育1h情况下P/N数值最大。
表11
表12
2.6PADV-3中和抗体间接ELISA检测程序的确定
经过各个环节的优化确定最佳的检测程序如下：将S3-HVR1-6重组蛋白用CBS溶液稀释到6μg/ml包被ELISA酶标版，4℃过夜包被，然后按照200μL/孔的PBST洗涤3次，每次摇床震荡30s；晾干后加入200μL的2％的BSA溶液，37℃下封闭1h，PBST清洗3次，每次摇床震荡30s；晾干后加入1:80稀释的血清100μL/孔，37℃温箱中孵育1h，PBST清洗3次，每次摇床震荡30s；晾干后加入HRP 标记的羊抗猪的二抗100μL/孔，37℃温箱中孵育1h，PBST清洗3 次，每次摇床震荡30s；晾干后按照100μL/孔的量加入TMB显色液，避光显色10min，最后加入浓度为2mol/L的硫酸溶液50μL/孔终止显色；在酶标仪上读取每孔OD450nm的值。
2.7阴性样品和阳性样品临界值的确定
选取30份PADV-3的阴性血清，用本研究建立的检测方法读取其在OD450nm的数值(表13)，计算这30血清的平均值(X)为0.236，标准差(SD)为0.042，因此PADV-3间接ELISA方法的临界值为X+3SD＝0.236+3×0.042＝0.362。
表13
2.8特异性检验
用本研究建立的检测方法分别对PCV2、PRV、FMDV、PRRSV 阳性血清进行检测，PADV-3阳性血清和阴性血清作为对照，结果(表 14)发现其它病毒阳性血清的OD450nm数值均小于0.362，而且PADV-3 阳性血清OD450nm数值达到了1.1013为阳性。
表14
2.9敏感性检验
将抗原蛋白稀释到最佳的浓度，并且按照前面介绍的最佳包被条件进行包被，之后将标准的PADV-3的阳性血清按照1:40、1:80、1:160、 1:320、1:640的梯度进行稀释，其他条件都是本试验确定的最佳条件。结果发现，当阳性血清稀释到320倍之后其吸光值仍能大于0.362。
2.10重复性检验
随机挑选6份临床血清样品进行批内、批间重复试验。首先用同一批次的重组蛋白进行包被，其他条件均是本研究确定的最佳条件，分别在0h、24h、48h对这6份样品进行测定进行批内重复检验，结果(表15)显示变异系数在1.0％～3.9％之间。选用制备的3个不同批次的重组蛋白作为包被抗原进行包被，结果(表16)显示，批间重复试验的变异系数为0.5％～8.3％之间。
表15
表16
2.11符合性检验
随机挑选30份猪血清样品，先用本研究建立的ELISA检测方法对其进行检测，此方法共检测出阳性样品17份，阴性样品13份；利用试剂盒对这30份血清按照说明书进行核酸提取，然后PCR扩增目的条带之后进行核酸凝胶电泳检测，检测出阳性样品15份，阴性样品15份。对比结果显示此两种方法的阳性符合率为88％。
2.12猪群体内中和抗体的检测
从陕西、山西地区的6个猪场随机采取了241份血清样品用本研究建立的方法进行检测，每个血清样品检测2次，最后共计检测出阳性样品48份，根据此次的检测结果至少可以得出在这些地区猪群体内的PADV-3的中和抗体阳性率为19.9％。
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种猪群体内腺病毒3型中和抗体阳性率的ELISA检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
a、包被抗原：将SUMO3-Hexon-HVR1-6重组蛋白稀释后包被至ELISA酶标板中，4℃过夜包被；
b、洗涤：弃去包被液并用PBST洗涤3次，每次摇床震荡30s；晾干后加入200μL封闭液封闭，PBST清洗3次，每次摇床震荡30s；
c、孵育一抗：晾干后加入稀释的血清样品100μL/孔，孵育，PBST清洗3次，每次摇床震荡30s；
d、孵育二抗：晾干后加入HRP标记的羊抗猪的二抗100μL/孔，孵育，PBST清洗3次，每次摇床震荡30s；e、显色与读值：晾干后按照100μL/孔的量加入TMB显色液，避光显色10min，最后加入浓度为2mol/L的硫酸溶液50μL/孔终止显色；在酶标仪上读取每孔OD450nm的值，根据临界值判定阴阳性；
其中，步骤a中所述SUMO3-Hexon-HVR1-6重组蛋白为在Hexon的高变基因区HVR1-6的N端添加猪源SUMO3标签，所述PADV-3的Hexon高变基因区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的间接ELISA检测方法，其特征在于：所述步骤a中包被抗原的包被浓度为6μg/mL。
3.根据权利要求1所述的间接ELISA检测方法，其特征在于：所述步骤b中的封闭液为2％的BSA溶液，封闭条件为37℃封闭1h。
4.根据权利要求1所述的间接ELISA检测方法，其特征在于：所述步骤c中血清样品的稀释度为1:80，孵育条件分别为37℃孵育1h。
5.根据权利要求1所述的间接ELISA检测方法，其特征在于：所述HRP标记的羊抗猪的二抗的稀释度为原液浓度，孵育条件37℃孵育1h。
6.根据权利要求1所述的间接ELISA检测方法，其特征在于：所述临界值判定阴阳性的标准为：当OD450nm值大于0.362时是阳性，小于0.362时是阴性。
7.权利要求1-6任一所述的方法在制备猪群体内腺病毒3型中和抗体阳性率的检测试剂盒中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011634577.XA CN112834744A (zh) | 2020-12-31 | 2020-12-31 | 一种猪群体内腺病毒3型中和抗体阳性率的elisa试剂盒及其检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011634577.XA CN112834744A (zh) | 2020-12-31 | 2020-12-31 | 一种猪群体内腺病毒3型中和抗体阳性率的elisa试剂盒及其检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112834744A true CN112834744A (zh) | 2021-05-25 |
Family
ID=75926415
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011634577.XA Pending CN112834744A (zh) | 2020-12-31 | 2020-12-31 | 一种猪群体内腺病毒3型中和抗体阳性率的elisa试剂盒及其检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112834744A (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1343257A (zh) * | 1999-02-11 | 2002-04-03 | 梅瑞尔公司 | 基于重组猪腺病毒的病毒载体和病毒疫苗 |
| CN102333876A (zh) * | 2008-12-15 | 2012-01-25 | 维克托根有限公司 | 基于pcv 2的用于治疗猪的方法和组合物 |
| CN103235121A (zh) * | 2013-03-18 | 2013-08-07 | 江苏省农业科学院 | 一种检测猪输血传播病毒2型抗体的间接elisa试剂盒 |
| CN103616509A (zh) * | 2013-11-28 | 2014-03-05 | 华南农业大学 | 检测猪乙型脑炎病毒的eⅲ-间接elisa抗体检测试剂盒及应用 |
| CN104777312A (zh) * | 2015-03-05 | 2015-07-15 | 江苏省农业科学院 | 一种检测猪传染性胃肠炎病毒抗体的elisa试剂盒 |
| CN107102138A (zh) * | 2017-04-14 | 2017-08-29 | 杨凌职业技术学院 | 检测ⅰ群禽腺病毒抗体的间接elisa试剂盒及其检测方法及其应用 |
| CN107586886A (zh) * | 2017-10-30 | 2018-01-16 | 嘉兴安宇生物科技有限公司 | 一种快速检测猪腺病毒的试剂以及方法 |
-
2020
- 2020-12-31 CN CN202011634577.XA patent/CN112834744A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1343257A (zh) * | 1999-02-11 | 2002-04-03 | 梅瑞尔公司 | 基于重组猪腺病毒的病毒载体和病毒疫苗 |
| CN102333876A (zh) * | 2008-12-15 | 2012-01-25 | 维克托根有限公司 | 基于pcv 2的用于治疗猪的方法和组合物 |
| CN103235121A (zh) * | 2013-03-18 | 2013-08-07 | 江苏省农业科学院 | 一种检测猪输血传播病毒2型抗体的间接elisa试剂盒 |
| CN103616509A (zh) * | 2013-11-28 | 2014-03-05 | 华南农业大学 | 检测猪乙型脑炎病毒的eⅲ-间接elisa抗体检测试剂盒及应用 |
| CN104777312A (zh) * | 2015-03-05 | 2015-07-15 | 江苏省农业科学院 | 一种检测猪传染性胃肠炎病毒抗体的elisa试剂盒 |
| CN107102138A (zh) * | 2017-04-14 | 2017-08-29 | 杨凌职业技术学院 | 检测ⅰ群禽腺病毒抗体的间接elisa试剂盒及其检测方法及其应用 |
| CN107586886A (zh) * | 2017-10-30 | 2018-01-16 | 嘉兴安宇生物科技有限公司 | 一种快速检测猪腺病毒的试剂以及方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 方和俊: "猪腺病毒3型PCR检测方法的建立及Hexon基因克隆分析", 中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑, no. 4, 15 April 2017 (2017-04-15), pages 38 - 39 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110105436B (zh) | 猪圆环病毒3型抗体的elisa检测试剂盒及其制备方法与应用 | |
| US20200055925A1 (en) | Method for preparing whole bovine-derived broadly neutralizing antibody against serotype o foot-and-mouth disease virus | |
| CN108107208B (zh) | 一种基于纤突蛋白f的检测血清8型禽腺病毒抗体的间接elisa试剂盒 | |
| CN107664697B (zh) | 表达载体及其制备方法、pedv-s1蛋白及包含该蛋白的间接elisa检测试剂盒 | |
| CN113956362A (zh) | 一种重组猫细小病毒vp2蛋白抗原及其在抗体诊断和疫苗制备中的应用 | |
| CN107759674B (zh) | 一种牛支原体免疫相关性蛋白、含有该蛋白的检测试剂盒及其在牛支原体抗体检测中的用途 | |
| CN111848749A (zh) | 猪细小病毒VLPs抗体检测试剂盒及其制备方法、应用 | |
| CN114152748A (zh) | 一种检测非洲猪瘟病毒的双抗体夹心elisa诊断试剂盒及其方法 | |
| CN112852840A (zh) | 一种牛纽布病毒重组vp1基因、重组蛋白及其应用 | |
| CN111499697A (zh) | 一种非洲猪瘟病毒p54重组蛋白的间接ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN110376388B (zh) | 一种副猪嗜血杆菌抗体检测方法及其试剂盒 | |
| CN110568189B (zh) | 犬腺病毒1型抗体elisa检测试剂盒及其应用 | |
| CN114778852B (zh) | 一种检测prrsv plp2抗体的间接elisa方法 | |
| CN116023506B (zh) | Asfv非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白及其试剂盒与应用 | |
| CN112834744A (zh) | 一种猪群体内腺病毒3型中和抗体阳性率的elisa试剂盒及其检测方法 | |
| CN112980802B (zh) | 一种分泌鸭新型呼肠孤病毒σB蛋白单抗的杂交瘤细胞、单抗及应用 | |
| CN114002426A (zh) | 猪瘟病毒e0蛋白抗体elisa检测试剂盒 | |
| CN116068192A (zh) | 一种检测非洲猪瘟病毒抗体的ELISA检测试剂盒以及protein L的应用 | |
| CN109762052B (zh) | 猪圆环病毒3型Cap重组蛋白及其编码基因和应用 | |
| CN110607282B (zh) | 牛细小病毒单克隆抗体及其在检测牛细小病毒感染中的应用 | |
| CN114047332A (zh) | 一种犬瘟热病毒抗体检测试剂盒和编码犬瘟热病毒核蛋白的基因及其应用 | |
| CN113884674A (zh) | 一种牛支原体胶体金免疫检测试纸条、制备方法及其应用 | |
| CN113341140A (zh) | 一种检测禽白血病p27的间接elisa方法 | |
| CN110554187B (zh) | 一种用于检测牛病毒性腹泻病毒抗体的表达蛋白、elisa试剂盒及其制备方法和应用 | |
| CN115894718B (zh) | 一种非洲猪瘟病毒的抗原表位肽及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |