CN114047332A

CN114047332A - 一种犬瘟热病毒抗体检测试剂盒和编码犬瘟热病毒核蛋白的基因及其应用

Info

Publication number: CN114047332A
Application number: CN202111212505.0A
Authority: CN
Inventors: 易立; 程悦宁; 王振军; 罗国良; 冯二凯
Original assignee: Institute Special Animal and Plant Sciences CAAS
Current assignee: Institute Special Animal and Plant Sciences CAAS
Priority date: 2021-10-18
Filing date: 2021-10-18
Publication date: 2022-02-15

Abstract

本发明公开了一种犬瘟热病毒抗体检测试剂盒和编码犬瘟热病毒核蛋白的基因及其应用，属于生物技术领域。为了提供一种有效、快速检测犬瘟热病毒抗体的方法。本发明提供了一种犬瘟热病毒的抗体检测试剂盒：包括犬瘟热病毒核蛋白、犬瘟热病毒阳性血清、犬瘟热病毒阴性血清、犬瘟热病毒抗体和二抗。检测的时间为1分钟，检测的灵敏度为效价在1:8～1:16，可用于特异性的鉴定动物体内是否有犬瘟热病毒，以确定是否引发感染。

Description

一种犬瘟热病毒抗体检测试剂盒和编码犬瘟热病毒核蛋白的基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种犬瘟热病毒抗体检测试剂盒和编码犬瘟热病毒核蛋白的基因及其应用。

背景技术

犬瘟热(CD)是由犬瘟热病毒(CDV)感染引起的急性、烈性、高度接触性传染病。双相热、结膜炎、呼吸系统和消化系统疾病为该病的主要病症，发展到后期出现典型的神经症状。其高发病率和死亡率对犬养殖业和野生动物保护造成了巨大的损失，也是伴侣动物巨大的威胁。CDV属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbillivirus)。CDV和麻疹病毒(Measles virus,MV)、小反刍兽医病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)、牛瘟病毒(Rinderpest virus,RPV)同属。CDV病毒颗粒呈多形性(通常为圆形)直径约为150nm，是一种有囊膜的单股负链不分节段的RNA病毒。现在亟需一种检测动物体内是否存在犬瘟热病毒抗体的方法。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种有效、快速检测犬瘟热病毒抗体的方法。

本发明提供了一种犬瘟热病毒的抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括犬瘟热病毒核蛋白、犬瘟热病毒阳性血清、犬瘟热病毒阴性血清、犬瘟热病毒抗体和二抗。

进一步地限定，所述抗体检测试剂盒还包括PVC底板、金标垫、样品垫和吸水垫。

进一步地限定，所述犬瘟热病毒核蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步地限定，所述犬瘟热病毒核蛋白与标记胶体金混合得到混合物，所述混合物的终浓度为10μg/mL。

进一步地限定，所述胶体金的制备方法如下：

(1)1％的氯化金水溶液1mL，加入99mL超纯水，配置成0.01％的HAuCl4溶液，加热至沸腾；

(2)加入1.5mL 1％柠檬酸三钠水溶液，继续搅拌加热沸腾2～5min，金黄色的氯金酸水溶液在2min内颜色发生迅速变化，由灰色变成黑色最后变成紫红色，继续煮沸20min得到稳定的胶体金溶液。

进一步地限定，所述犬瘟热病毒核蛋白与标记胶体金混合的方法如下：

(1)用0.2mol/L K2CO3溶液调节胶体金溶液至pH8.0，加入犬瘟热病毒核蛋白，加入10％BSA，混合物的终浓度为10μg/mL；

(2)然后将犬瘟热病毒核蛋白溶液10000rpm 4℃离心15min，弃上清，用复溶液溶解浓缩沉淀，复溶液浓缩比例为125μL/mL；

(3)将浓缩后的胶体金复合物喷涂于胶体金垫内，喷涂量为15μL/cm。

进一步地限定，步骤(2)所述复溶液的成分如下：10％蔗糖、1％PVP、1％BSA、0.5％Tween-20和0.1MTrisCl，pH 8.5。

进一步地限定，犬瘟热病毒抗体的工作浓度为1.0mg/mL。

本发明提供一种编码犬瘟热病毒核蛋白的基因，所述基因的序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明提供上述的基因在检测犬瘟热病毒抗体和制备犬瘟热病毒核蛋白中的应用。

有益效果：本发明提供一种检测检测犬瘟热病毒抗体的方法，检测的时间为xx，检测的灵敏度为效价在1:8～1:16，可用于鉴定动物体内是否有犬瘟热病毒，以确定是否引发感染。

附图说明

图1为蛋白小量表达胶图，其中，M：Marker，1：未诱导对照(BL21)2-3：IPTG诱导；

图2为蛋白小量表达胶图，其中，M：Marker 1：未诱导对照(Rosetta)2-3：IPTG诱导(Rosetta)，4：未诱导对照(Condon)5-6：IPTG诱导(Condon)，7：未诱导对照(BL21plys)8-9：IPTG诱导(BL21 plys)，12％SDS-PAGE；

图3为蛋白大量表达胶图12％SDS-PAGE，其中，M：Marker，1：超声后全菌，2：超声后上清，3：超声后沉淀；

图4为蛋白大量表达纯化胶图，其中，M：Marker，1：纯化蛋白稀释5倍，2：纯化蛋白稀释10倍；

图5为蛋白大量表达纯化胶图，其中，M：Marker 1：复性后蛋白12％SDS-PAGE；

图6为蛋白质谱检测比对结果；

图7为试纸条组装模式图，其中，sample pad为样品垫，conjugated pad为结合垫，N.C.membrace为酸纤维素膜，absorption pad为吸水垫，plastic backing为塑料外壳；

图8为犬阳性血清与重组犬瘟热核蛋白免疫印迹，其中，泳道1&2：CDV毒株，泳道3：重组犬瘟热核蛋白，泳道4：Vero细胞；

图9为犬瘟热病毒血清纯化检测，其中，1是Marker，2是犬血清；

图10试纸条组装模式图；

图11为为试纸条特异性实验结果，其中，1：H2O，2：PBS，3：阴性血清，4：细小病毒阳性血清，5：水貂阿留病毒阳性血清，6：犬瘟热病毒阳性血清；

图12为犬瘟热病毒抗体检测试纸条敏感性实验结果，其中，1：CDV阳性血清(1:256)，2：CDV阳性血清(1:128)，3：CDV阳性血清(1:64)，4：CDV阳性血清(1:32)，5：CDV阳性血清(1:16)，6：CDV阳性血清(1:8)，7：CDV阳性血清(1:4)，8：CDV阳性血清(1：2)，9：PBS；

具体实施例

LB培养基:胰蛋白胨(tryptone)10g；酵母提取物(yeast extract)5g；氯化钠(NaCl)10g；固体培养基另加琼脂粉15-20g；加双蒸水至1000mL,用5mol/L NaOH(约0.2ml)调pH至7.2，121℃灭菌30min。卡那霉素浓度：100mM，细菌重悬液：10mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液。细菌感受态：感受态细胞(BL21，Condon，Rosetta，BL21 plys)。

PVC底板、金标垫、样品垫、吸水垫购自上海杰一生物公司。

划线喷膜仪和微电脑自动斩切机，购自上海金标公司。

免疫印迹实验材料：脱脂乳(5％浓度)；PBS(0.1M PH7.6)；一抗(犬血清，1:200稀释；50μL:10ml)；二抗(HRP标记抗犬抗体；1:1000稀释；10μL:10ml)；DAB显色液(北京康为试剂CW125M，DAB kit 20*)

实施例1.犬瘟热病毒核蛋白表达与纯化

1.犬瘟热N蛋白基因序列

基于CDV-PS(Canine distemper virus PS)序列，基因合成N蛋白中(1-408aa)氨基酸对应核酸序列，并按照大肠杆菌密码子进行表达优化，其合成序列如SEQ ID NO:1所示。编码N蛋白的基因序列如SEQ ID NO:2所示，优化后的编码N蛋白的基因序列如SEQ IDNO:3所示。

2.原核表达系统

采用pET30a(+)载体，其采用T7启动子，适应于大肠杆菌BL21(DE3)plysS表达T7聚合酶，加入IPTG后，可活化lac UV5促进T7聚合酶的生成，从而转录和翻译pET30a(+)载体。将pET30a(+)载体与优化后的编码N蛋白的基因连接，得到重组的pET30a(+)。

2.1细菌转化：

(1)取出－80℃保存的感受态细胞(BL21，Condon，Rosetta，BL21 plys)，放在冰上缓慢解冻。(2)将pET30a(+)加入感受态细胞中混匀，冰上放置30min。(3)42℃热激90s。(4)冰浴2min后，加入800μl无抗性的LB培养基。(5)37℃培养45min。(6)5000rpm离心3min，弃大部分上清，留约100-150μl，重悬菌体，选择有相应抗性的LB平板，涂板。(7)晾干，于37℃培养箱中倒置培养过夜。

2.2蛋白小量表达

(1)从转化的平板挑单克隆到1.5ml含相应抗性的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养。

(2)培养至OD＝0.6-0.8，IPTG(0.5mM)诱导，37℃，200rpm培养2h。

(3)取1ml诱导的菌液，12000rpm，离心1min，弃上清，沉淀用50-100μl 10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液吹散(加入缓冲液的量视菌体量而定)，加入与缓冲液等体积的2×loadingbuffer，100℃煮10min，电泳检测。

(4)使用不同大肠杆菌(BL21，Condon，Rosetta，BL21 plys)分别表达，并设立对照。

2.3大量表达

(1)接100μl活化的菌液到5ml相应抗性LB液体培养基中，37℃培养，200rpm。

(2)将培养的菌液转接到250ml相应抗性LB液体培养基中，37℃，200rpm，培养至OD＝0.6-0.8，IPTG(0.5mM)16℃诱导过夜。

(3)收菌：8000rpm，离心6min。弃上清。

(4)超声破菌：菌体用20-30ml 10mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液吹散，超声波破碎(500W,180次，每次5s，间隔5s)。

(5)电泳确定表达形式：取100μl超声后的菌悬液，12000rpm，离心10min，取50μl上清至另一EP管，上清去除干净后沉淀用50μl 10mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液吹散。电泳检测。

2.4蛋白质纯化

(1)20～30ml 10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液重悬超声离心得到的沉淀，静置10min。

(2)12000rpm，离心10min，上清转入另一管中保存。

(3)20～30ml 10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液重悬沉淀，静置10min。

(4)12000rpm，离心10min，弃上清。

(5)重复(3)、(4)一次。

(6)先加入少量的10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液重悬沉淀，再加5～10ml含8M尿素的10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液溶解蛋白。

(7)12000rpm，离心10min，收集上清，取50μl电泳。

2.5蛋白质复性

(1)用样品体积20倍的透析Buffer(1％甘氨酸、0.1％SDS、5％甘油、10mM Tris-HCl，pH 8.0，含尿素的浓度梯度分别是6M，4M，2M)，4℃透析复性。每个尿素浓度3h，最后一级过夜透析。

(2)用1％甘氨酸、10mM Tris-HCl(pH 8.0)透析2次，每次3h。

(3)12000rpm离心10min，取上清，电泳检测。

2.6蛋白质谱检测

将纯化后的蛋白进行Q-TOF检测，测定其氨基酸是否为目标序列。

结果：

1.重组菌IPTG诱导表达

如图1和图2所示，诱导后的细菌与对照细菌相比，在43kD附近有增加的蛋白条带，使用不同大肠杆菌(BL21，Condon，Rosetta，BL21 plys)分别表达，并设立对照。结果显示，Condon，和BL21 plys表达效果明显。

2.大量表达结果

如图3所示，250ml卡那霉素抗性LB液体培养基，按照小量表达条件培养，诱导后，进行离心收菌并超声破碎，结果显示，表达蛋白绝大部分在沉淀中。

3.蛋白质纯化

如图4所示，大量表达后的蛋白，进过3次离心和清洗，重悬液溶解于5～10ml含8M尿素的10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液，12％SDS-PAGE。

4.蛋白质复性

如图5所示，纯化后的蛋白质，进行透析，去除尿素，结果显示，蛋白成功复性，溶解于1％甘氨酸、10mM Tris-HCl(pH 8.0)

5.蛋白质谱检测

如图6所示，质谱肽段测序后，与CDV N 1-408aa比对，覆盖率达到84％，结果显示蛋白表达成功。

实施例2.犬瘟热病毒抗体检测试剂盒

1.犬瘟热病毒重组核蛋白免疫印迹

将蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳后将蛋白转印到NC膜上；将PVDF膜封闭：5％脱脂乳封闭过夜，或者37℃2h.一抗孵育1h，PBS洗3遍，每次5min.二抗孵育0.5h，PBS洗3遍，每次5min.配制好DAB显色液，将PVDF膜放入，避光显色5-8min。

2.胶体金的制备

1％的氯化金水溶液1mL，加入99mL超纯水，配置成0.01％的HAuCl4溶液，并置于三角烧瓶中，烧瓶口覆上保鲜膜，用电炉加热至沸腾，迅速加入1.5mL 1％柠檬酸三钠水溶液。继续搅拌加热沸腾2～5min，金黄色的氯金酸水溶液在2min内颜色发生迅速变化，由灰色变成黑色最后变成紫红色，继续煮沸20min得到稳定的胶体金溶液。待胶体金溶液冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积，在2～8℃保存。

3.重组蛋白与胶体金标记

用0.2mol/L K₂CO₃溶液调节胶体金溶液至pH8.0，加入适量的200μg/mL CDV重组核蛋白1～408aa至胶体金溶液和CDV重组核蛋白的混合物的终浓度为10μg/mL，搅拌30min；缓慢加入适量的10％BSA，使其BSA终浓度为1％，搅拌30min；然后将该溶液10000rpm 4℃离心15min，弃上清，沉淀用复溶液(10％蔗糖，1％PVP，1％BSA，0.5％Tween-20，0.1MTrisCl，pH8.5)溶解浓缩沉淀，复溶液浓缩比例为125μL/mL。用喷金划膜一体机将浓缩后的胶体金复合物喷涂于胶体金垫(AlhStorm 8964)，喷涂量为15μL/cm，自然干燥。

4.C线抗体的制备

使用纯化的CDV阳性抗体(北京华大蛋白)作为C线，12000rpm离心去除细胞及杂质，用Protein G亲和层析柱(GE公司)纯化后，超滤离心管(Millipore)6000rpm离心30min除盐，用等体积20mM pH7.0的PBS溶液复溶。

5.T线的制备

使用第一节中纯化并且复性的CDV重组核蛋白1～408aa，12000rpm离心去除细胞及杂质，超滤离心管(Millipore)6000rpm离心30min除盐，用等体积20mM pH7.0的PBS溶液复溶。

6.硝酸纤维素膜T线和C线喷涂

在硝酸纤维素膜(Sartorius CN140)表面用喷金划膜一体机喷涂检测线(T)和质控线(C)，检测线为重组犬瘟热病毒核蛋白1-408aa，工作浓度为0.5mg/mL，质控线为纯化的犬瘟热病毒阳性抗体，工作浓度为1.0mg/mL，两者划膜时喷涂量均为1μL/cm，且检测线与质控线之间距离0.5cm。

7.胶体金免疫层析试纸组装如图7所示：

(1)6cm宽的PVC底板粘面朝上，将2.5cm宽的固相硝酸纤维素膜黏附于中间；

(2)0.5cm宽的金标垫(AlhStorm 8964)粘附于硝酸纤维素膜前，与固相硝酸纤维素膜重叠；

(3)2.5cm宽的样品垫粘附于金标垫前，与金标垫重叠；

(4)1.0cm宽的吸水垫粘附于硝酸纤维素膜后，与固相硝酸纤维素膜重叠；

(5)微电脑自动斩切机切割成4.0mm宽的条带；

(6)条带装上保护性塑料外壳。

结果：

1.犬瘟热病毒重组核蛋白免疫印迹结果:

可见犬瘟热病毒重组核蛋白反应如图8所示，并在约45kD处形成条带。与CDV核蛋白大小预期一致。

2.犬瘟热病毒血清纯化制备C线

纯化结果如图9所示显示，该血清轻(30kD)/重链(55kD)明显，且无杂质，显示纯化成功。测定该蛋白浓度为1.3mg/ml。

3.试纸条的组装

试纸条组装模式见图10，使用阴性和阳性样品进行测试，结果符合预期。

利用下述实验进行效果验证：犬瘟热病毒抗体试纸条的性能测定试纸条的特异性、敏感性和稳定性进行了测试，研究结果表明，该试纸条结构稳定，方法特异并且敏感度高，适合开发成产品。

1.血清来源

质控血清：水貂犬瘟热病毒阳性质控血清10份，水貂犬瘟热病毒阳性血清是由水貂犬瘟热病毒CDV-PS株人工免疫水貂获得并标定的质控血清；根据病毒中和实验检测结果(中和效价≥1:32)。

细小病毒对照血清：水貂细小病毒性肠炎病毒(MEV)阳性血清是由水貂细小病毒性肠炎疫苗人工免疫后采血分离血清获得，HI抗体效价≥1:32。

水貂阿留申病毒阳性质控血清：水貂阿留申病毒(ADV)阳性血清是由水貂阿留申病毒人工免疫后采血并分离血清后获得，血清对流免疫电泳抗体效价≥1:8。

阴性血清：水貂自然状态采血并分离血清后获得，水貂犬瘟热病毒、细小病毒和水貂阿留申病毒检测为阴性。

2.试纸条检测方法

取出适量的试纸条，取阳性质控血清、弱阳性质控血清、阴性质控血清30ul(约1滴)于加样孔，然后滴加80ul稀释液(约3滴)，或直接滴加经稀释的血清3滴，10～15分钟内读取结果并记录。

结果：

1.犬瘟热病毒抗体试纸条特异性检测结果

水貂肠炎细小病毒(MEV)阳性质控血清2份、水貂阿留申病毒(ADV)阳性质控血清(CIEP检测)2份以及4份阴性血清对试纸条进行特异性检测，使用批号S202001重复检测5次，检测结果见表1和图11。结果显示，检测样品均呈阴性反应，对照阳性样品呈现阳性。

表1水貂犬瘟热病毒抗体胶体金检测试纸条特异性检测结果

2.犬瘟热病毒抗体试纸条敏感性检测结果

如表2和图12所示，对犬瘟热病毒阳性质控血清(中和效价1:256)进行倍比稀释，后使用试纸条进行测试其敏感性，即最低检测检测值。使用批号S202001重复检测5次，结果表明，阳性血清效价在1:8～1:16时，1分钟时间检测出来，试纸条对阳性血清的最低检出值。

表2水貂犬瘟热病毒抗体胶体金检测试纸条特异性检测结果

3.犬瘟热病毒抗体试纸条重复性检测结果

从S202002批次试纸条中各随机取50个试纸条，对强阳性样品3份，弱阳性样品3份，健康犬样品，水貂肠炎细小病毒(MEV)阳性质控血清、水貂阿留申病毒(ADV)阳性质控血清(CIEP检测)各1份进行检测，共计9份血清，重复测定5次。结果如表3所示，批内检测结果一致，表明该试纸条能进行较好的批内重复性。

表3水貂犬瘟热病毒抗体胶体金检测试纸条批内重复性检测结果

4.犬瘟热病毒抗体试纸条批间重复性检测结果

从三批试纸条S202001、S202002、S202003中各取20个试纸，对阳性样品样品3份，健康犬样品，水貂肠炎细小病毒(MEV)阳性质控血清、水貂阿留申病毒(ADV)阳性质控血清(CIEP检测)各1份进行检测，共计8份血清。结果显示批间检测结果依然一致(表4)，表明该试纸条能进行较好的批间重复试验。

表4 3个不同批次的试纸条批间重复性试验结果

注：“+”表示检测结果为阳性，“-”表示检测结果为阴性。

试纸条的组装采用经典的奈米胶体金，再接上抗原蛋白后，喷到试纸条的金标垫上，NC上包被抗原蛋白和检测C线纯化抗体。因此，NC膜上的T线形成的是抗原-抗体-抗原这种双抗原夹心模式；C线上形成的是抗体-抗原-抗体这种双抗体夹心模式。在测试试纸条性能的实验中，这种结构在敏感性、特异性和重复性上，均达到了要求。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院特产研究所

<120> 一种犬瘟热病毒抗体检测试剂盒和编码犬瘟热病毒核蛋白的基因及其应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Ala Ser Leu Leu Lys Ser Leu Thr Leu Phe Lys Arg Thr Arg Asp

1 5 10 15

Gln Pro Pro Leu Ala Ser Gly Ser Gly Gly Ala Ile Arg Gly Ile Lys

20 25 30

His Val Ile Ile Val Leu Ile Pro Gly Asp Ser Ser Ile Val Thr Arg

35 40 45

Ser Arg Leu Leu Asp Arg Leu Val Arg Leu Val Gly Asp Pro Glu Ile

50 55 60

Asn Gly Pro Lys Leu Thr Gly Ile Leu Ile Ser Ile Leu Ser Leu Phe

65 70 75 80

Val Glu Ser Pro Gly Gln Leu Ile Gln Arg Ile Ile Asp Asp Pro Asp

85 90 95

Val Ser Ile Lys Leu Val Glu Val Ile Pro Ser Ile Asn Ser Val Cys

100 105 110

Gly Leu Thr Phe Ala Ser Arg Gly Ala Ser Leu Asp Ser Glu Ala Asp

115 120 125

Glu Phe Phe Lys Ile Ala Asp Glu Gly Ser Lys Ala Gln Gly Gln Leu

130 135 140

Gly Trp Leu Glu Asn Lys Asp Ile Val Asp Ile Glu Val Asp Asp Ala

145 150 155 160

Glu Gln Phe Asn Ile Leu Leu Ala Ser Ile Leu Ala Gln Ile Trp Ile

165 170 175

Leu Leu Ala Lys Ala Val Thr Ala Pro Asp Thr Ala Ala Asp Ser Glu

180 185 190

Met Arg Arg Trp Ile Lys Tyr Thr Gln Gln Arg Arg Val Val Gly Glu

195 200 205

Phe Arg Met Asn Lys Ile Trp Leu Asp Ile Val Arg Asn Arg Ile Ala

210 215 220

Glu Asp Leu Ser Leu Arg Arg Phe Met Val Ala Leu Ile Leu Asp Ile

225 230 235 240

Lys Arg Ser Pro Gly Asn Lys Pro Arg Ile Ala Glu Met Ile Cys Asp

245 250 255

Ile Asp Asn Tyr Ile Val Glu Ala Gly Leu Ala Ser Phe Ile Leu Thr

260 265 270

Ile Lys Phe Gly Ile Glu Thr Met Tyr Pro Ala Leu Gly Leu His Glu

275 280 285

Phe Ser Gly Glu Leu Thr Thr Ile Glu Ser Leu Met Met Leu Tyr Gln

290 295 300

Gln Met Gly Glu Thr Ala Pro Tyr Met Val Ile Leu Glu Asn Ser Val

305 310 315 320

Gln Asn Lys Phe Ser Ala Gly Ser Tyr Pro Leu Leu Trp Ser Tyr Ala

325 330 335

Met Gly Val Gly Val Glu Leu Glu Asn Ser Met Gly Gly Leu Asn Phe

340 345 350

Gly Arg Ser Tyr Phe Asp Pro Ala Tyr Phe Arg Leu Gly Gln Glu Met

355 360 365

Val Arg Arg Ser Ala Gly Lys Val Ser Ser Ala Leu Ala Ala Glu Leu

370 375 380

Gly Ile Thr Lys Glu Glu Ala Gln Leu Val Ser Glu Ile Ala Ser Lys

385 390 395 400

Thr Thr Glu Asp Arg Thr Ile Arg Thr Ala

405 410

<210> 2

<211> 1224

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

atggctagtc ttttaaaatc attgacacta ttcaaacgta cgcgtgatca gcctccgctg 60

gcgagcggta gcggcggtgc aattcgtggc atcaagcatg ttatcatcgt gctgatcccg 120

ggtgatagca gcattgtgac ccgctcacgt ctgttggacc ggctggtgag actggttggc 180

gacccggaaa ttaacggtcc gaaattgact ggtatactga ttagcatcct gtctttgttt 240

gtggagagcc cgggtcagct gattcaacgc attattgacg acccagatgt ctctattaag 300

ctggtcgagg ttattccgag catcaactct gtttgtggtc tgacctttgc ctctcgtggt 360

gcgagcctgg actcggaagc ggacgagttc tttaaaatcg ctgatgaagg tagcaaggct 420

caaggtcagc tgggttggct ggagaacaaa gatattgtcg acattgaagt tgacgatgca 480

gagcagttta acattttgct tgcgtctatc ctggcgcaaa tttggattct cctggcgaaa 540

gccgttaccg ctccggatac ggcggcggac tccgagatgc gtcgttggat caaatacacc 600

cagcaacgtc gcgttgtggg cgagttccgc atgaacaaga tctggctgga cattgtgcgt 660

aatcgtattg cggaggacct gagcctgcgt cgctttatgg tagccctgat ccttgacatc 720

aagcgttcgc cgggaaacaa gccgcgtatt gccgagatga tctgcgatat cgataattat 780

atcgtggagg cgggcctggc gagttttatc ttgaccatta agttcggcat cgagacgatg 840

tatccggcat tgggccttca cgagttcagc ggtgaactga ctacgatcga aagcttaatg 900

atgctgtacc agcagatggg cgaaaccgca ccgtatatgg tgatcctcga aaactccgtg 960

cagaataagt tcagcgctgg ttcctacccg ttgctgtgga gctacgctat gggcgttggt 1020

gttgaattgg agaacagcat gggtggtctc aactttggcc gttcctactt cgatccagcg 1080

tatttccgcc tgggccaaga aatggttcgc cgcagcgcgg gcaaagtttc cagcgcgctg 1140

gcggcagagt tgggcatcac caaagaagaa gcccaattag tgagcgagat cgcttccaaa 1200

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<400> 3

atggctagcc ttctcaagag cctcacattg ttcaagagga ctcgggacca acccccactt 60

gcctcgggct ccggaggagc aataagaggg ataaagcatg tcattatagt cctaatcccg 120

ggtgattcaa gcattgttac aaggtctcga ctattggaca gacttgttag attggtcggt 180

gatccggaaa tcaacggacc taaattaacc gggattttaa tcagtatcct ctccttgttc 240

gtggaatccc ctggacagtt gatccaaagg atcatagacg accctgatgt aagcatcaag 300

ttagtagagg taatcccaag catcaactct gtttgtggtc ttacatttgc atccagagga 360

gcaagtttgg attctgaggc agatgagttc ttcaaaattg cagacgaagg gtcgaaagct 420

caaggacaat taggctggtt ggagaataag gatattgtag acatagaagt tgatgatgct 480

gagcaattca atatattgct agcttccatc ctggcccaaa tttggatcct gctcgctaaa 540

gcagtgactg ctcctgatac tgcagccgac tcggaaatga ggagatggat taagtatacc 600

caacagagac gtgtggtcgg ggaatttaga atgaacaaaa tctggcttga tattgttaga 660

aacaggattg ctgaggactt atctttgagg cgattcatgg tggcactcat cttggacatc 720

aaacgatccc cagggaacaa gcctagaatt gctgaaatga tttgtgatat agataactac 780

attgttgaag ctggattagc tagtttcatc ttaactatca aatttggcat tgaaactatg 840

tatccggctc tcgggttgca tgagttttcc ggagagttaa caactattga atcccttatg 900

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cagaacaaat ttagtgcagg atcctaccca ctgctctgga gttatgctat gggagttggt 1020

gttgaacttg aaaactccat gggagggtta aatttcggta gatcctactt tgatccggcc 1080

tatttcaggc tcgggcaaga aatggtgaga agatctgccg gcaaagtaag ctctgcactt 1140

gccgccgagc ttggcatcac caaggaagag gctcagctag tgtcagaaat agcatccaag 1200

acaacggagg accggacgat tcgcactgct 1230

Claims

1.一种犬瘟热病毒的抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括犬瘟热病毒核蛋白、犬瘟热病毒阳性血清、犬瘟热病毒阴性血清、犬瘟热病毒抗体和二抗。

2.根据权利要求1所述的抗体检测试剂盒，其特征在于，所述抗体检测试剂盒还包括PVC底板、金标垫、样品垫和吸水垫。

3.根据权利要求1所述的抗体检测试剂盒，其特征在于，所述犬瘟热病毒核蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.根据权利要求1所述的抗体检测试剂盒，其特征在于，所述犬瘟热病毒核蛋白与标记胶体金混合得到混合物，所述混合物的终浓度为10μg/mL。

5.根据权利要求4所述的抗体检测试剂盒，其特征在于，所述胶体金的制备方法如下：

(1)1％的氯化金水溶液1mL，加入99mL超纯水，配置成0.01％的HAuCl₄溶液，加热至沸腾；

6.根据权利要求4所述的抗体检测试剂盒，其特征在于，所述犬瘟热病毒核蛋白与标记胶体金混合的方法如下：

(1)用0.2mol/L K₂CO₃溶液调节胶体金溶液至pH8.0，加入犬瘟热病毒核蛋白，混合物的终浓度为10μg/mL；

7.根据权利要求6所述的抗体检测试剂盒，其特征在于，步骤(2)所述复溶液的成分如下：10％蔗糖、1％PVP、1％BSA、0.5％Tween-20和0.1MTrisCl，pH 8.5。

8.根据权利要求1所述的抗体检测试剂盒，其特征在于，犬瘟热病毒抗体的工作浓度为1.0mg/mL。

9.一种编码犬瘟热病毒核蛋白的基因，其特征在于，所述基因的序列如SEQ ID NO:2所示。

10.权利要求9所述的基因在检测犬瘟热病毒抗体和制备犬瘟热病毒核蛋白中的应用。