CN114778852B - 一种检测prrsv plp2抗体的间接elisa方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测PRRSV PLP2抗体的间接ELISA方法，该方法针对PRRSV JXwn06PLP2(46～323)基因序列设计特异性引物，构建原核表达质粒pET28a(+)‑PLP2‑StrepⅡ，在E.coli BL21中实现了高效可溶性表达。经过亲和层析柱与Superdex75分子筛纯化，获得了高纯度PLP2重组蛋白，将其作为包被抗原，建立了检测PRRSV PLP2抗体的间接ELISA方法。本发明发现PLP2可作为一种新的PRRSV诊断抗原，应用其建立的抗体检测方法重复性和特异性好，能够在PRRSV感染仔猪后第3～5天检测到PLP2抗体，可用于PRRS抗体检测和早期诊断。

Description

一种检测PRRSV PLP2抗体的间接ELISA方法
技术领域
本发明属于在分子生物学检测技术的领域，具体涉及一种检测PRRSV PLP2抗体的间接ELISA方法。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV)引起的一种急性、高度接触性传染病。PRRSV流行已30年，严重危害我国及世界养猪业健康发展，迄今仍未取得实质性的有效控制。目前尚无有效疫苗或抗病毒药物，建立快速、敏感的检测方法，可为PRRS预防与控制提供物质和技术支撑。PRRSV非结构蛋白nsp2具有很强的免疫原性，在感染早期即可检测到Nsp2抗体。Nsp2氨基端编码半胱氨酸蛋白酶结构域(PLP2)，含有多个抗原表位，在基因Ⅱ型PRRSV毒株间相对保守，这提示PLP2在PRRSV早期感染的诊断中具有重要价值。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测PRRSV PLP2抗体的间接ELISA方法。
为了实现上述目的，本发明提供的一种检测PRRSV PLP2抗体的间接ELISA方法，包括以下步骤：
S1：包被PRRSV PLP2重组蛋白，利用ELISA包被液将PRRSV PLP2重组蛋白稀释，加入酶标板中，4℃包被过夜，其中ELISA包被液将PRRSV PLP2重组蛋白按照浓度1.6～0.05μg/ml倍比稀释；
S2：洗涤，甩干酶标板中的包被液，加入洗涤液，洗涤，洗涤后甩干；
S3：封闭，将2％BSA等多种封闭液加入酶标板中，4℃封闭10～12h；
S4：洗涤，甩干酶标板中的封闭液，加入洗涤液，洗涤，洗涤后甩干；
S5：血清孵育，将血清按1:25～1:400倍比稀释，加入酶标板中，37℃孵育20～60min；
S6：洗涤，甩干酶标板中的血清，加入洗涤液，洗涤，洗涤后甩干；
S7：酶标二抗孵育，将酶标二抗兔抗猪IgG-HRP抗体按照1:2500～1:10000倍比稀释，加入酶标板中，37℃孵育20～60min；
S8：洗涤，甩干酶标板中的酶标二抗，加入洗涤液，洗涤，洗涤后甩干；
S9：酶标板中加入TMB底物液，室温避光显色5～20min；
S10：终止反应，酶标板中加入50μL浓度为2mol/L的H2SO4终止反应；
S11：读取吸光值，判定检验结果为阴性或阳性，使用酶标仪读取酶标板各孔OD450nm，当血清样本OD450nm≥0.27，判定为阳性，反之血清样本OD450nm＜0.27，判定为阴性。
优选地，步骤S3中所述封闭液BSA的溶剂为0.3％PBST溶液，包被液为碳酸盐缓冲液；洗涤液为0.1％PBST溶液；血清和酶标二抗的稀释液为含0.3％PBST的2％BSA溶液。
进一步地，还包括步骤：
S0：PRRSV PLP2重组表达质粒的构建，制备PRRSV PLP2重组蛋白。
进一步地，步骤S0包括以下步骤：
S0-1：准备材料；
S0-2：设计扩增目的基因的PCR引物，以GenBank:EF641008登录的PRRSV JXwn06PLP2的序列为基础，以pET28a(+)为载体，设计引物并扩增PLP2(46～323)目的基因序列SEQID NO.1，设计得到PCR引物，PLP2(46-323)-F：SEQ ID NO.2，PLP2(46-323)-R：SEQ IDNO.3；
S0-3：PRRSV PLP2蛋白编码基因的扩增，以PRRSV JXwn06感染性cDNA克隆为模板，利用步骤S0-2得到的PCR引物，得到PCR扩增PLP2目的基因片段；
S0-4：将步骤S0-3得到的PCR扩增PLP2目的基因片段进行凝胶回收，得到纯化的PLP2目的基因；
S0-5：构建pET28a(+)-PLP2-StrepⅡ重组表达质粒，使用限制性内切酶NcoⅠ、BamHI对pET28a(+)载体进行双酶切，得到线性化pET28a(+)载体，将步骤S0-4得到的PLP2目的基因与线性化pET28a(+)载体连接，得到pET28a(+)-PLP2-StrepⅡ重组表达质粒；
S0-6：获取PRRSV PLP2重组蛋白，将步骤S0-5得到的pET28a(+)-PLP2-StrepⅡ重组表达质粒加入E.coli DH5α感受态细胞中，使用LB培养基进行培养，得到PRRSV PLP2重组蛋白；
S0-7：鉴定PRRSV PLP2重组蛋白的表达形式，SDS-PAGE鉴定PRRSV PLP2重组蛋白的表达形式，鉴定出PRRSV PLP2重组蛋白为原核可溶性表达，以及利用HiCap Streptactin亲和层析柱与Superdex75分子筛纯化，获得纯化的PLP2重组蛋白。
进一步地，步骤S0-1中所述准备材料包括
(1)准备血清，选用PRRSV JXwn06毒株感染猪血清、猪瘟病毒阳性血清、猪圆环病毒2型阳性血清、猪流行性腹泻病毒、猪α冠状病毒阳性血清和SPF猪血清；
(2)选用pET28a(+)载体；
(3)准备试剂，兔抗猪IgG-HRP、山羊抗猪IgG-HRP、山羊抗鼠IgG-FITC、山羊抗兔IgG Fab-FITC和山羊抗猪IgG-FITC，E.coli DH5α感受态细胞、E.coli BL21感受态细胞。
本发明提供的一种检测PRRSV PLP2抗体的间接ELISA方法，具有以下特点：
(1)重复性和特异性均良好，批次间与批次内试验变异系数均小于10％，与猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒和猪α冠状病毒阳性血清不发生交叉反应。
(2)利用PLP2抗体检测方法和商品化PRRSV N蛋白抗体检测方法进行比较，对PRRSV JXwn06毒株感染仔猪后血清中PLP2抗体和N蛋白抗体产生动态分析。结果表明，PLP2抗体最早检出时间为3～5dpi，N蛋白抗体检出时间为7～10dpi。间接免疫荧光抗体染色检测结果与ELISA一致，PLP2抗体检出时间早于N蛋白抗体。PLP2抗体检测方法与IDEXX公司商品化PRRSV N蛋白抗体检测方法相比，两者检测28份临床猪血清样本的符合率为85.7％。
附图说明
图1为本具体实施方式中的步骤2.3中PCR扩增PLP2目的基因的电泳图。
图2为本具体实施方式中的步骤2.6中SDS-PAGE鉴定PLP2重组蛋白的电泳图。
图3-1为本具体实施方式中的步骤2.6中Superdex75分子筛纯化PLP2蛋白的结果图。
图3-2为本具体实施方式中的步骤2.6中重组PLP2蛋白纯化后的SDS-PAGE分析与Western Blot鉴定的电泳图。
图4-1为本具体实施方式中的步骤6.2中PRRSV JXwn06毒株感染仔猪PLP2抗体产生动态变化的结果图。
图4-2为本具体实施方式中的步骤6.2中PRRSV JXwn06毒株感染仔猪N蛋白抗体产生动态变化的结果图。
图5为本具体实施方式中的步骤6.2中PRRSV JXwn06感染仔猪PLP2与N蛋白抗体产生动态变化的间接免疫荧光鉴定结果图。
具体实施方式
为了使本发明方案的目的、优点更加明白清楚，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV)是一种急性、高度接触性传染病，主要引起母猪繁殖障碍、仔猪呼吸道疾病。PRRSV非结构蛋白nsp2具有很强的免疫原性，在感染早期即可检测到Nsp2抗体。Nsp2氨基端编码半胱氨酸蛋白酶结构域(papain-like cysteine protease，PLP2)，含有多个抗原表位，在基因Ⅱ型PRRSV毒株间相对保守。本发明旨在建立检测PLP2抗体的间接ELISA方法，以期为PRRS早期诊断提供一种新的血清学检测方法，因此利用原核表达系统实现了PLP2(46～323)蛋白可容性高表达，以纯化的重组蛋白包被酶标板，建立检测PRRSV PLP2抗体的间接ELISA方法。包括以下步骤：
1、准备材料
血清：选用PRRSV JXwn06阳性血清、猪瘟病毒阳性血清、猪圆环病毒2型阳性血清、猪流行性腹泻病毒、猪α冠状病毒阳性血清和SPF猪血清。
载体：选用pET28a(+)载体和PRRSV JXwn06感染性cDNA克隆，由中国农业大学农业部动物流行病学重点实验室保存。
试剂：兔抗猪IgG-HRP(lot:bs-0903R-HRP)购自北京博奥森生物技术有限公司(Bioss)，山羊抗猪IgG-HRP(lot:SAB3700)购自Sigma生物技术有限公司，山羊抗鼠IgG-FITC、山羊抗兔IgG Fab-FITC和山羊抗猪IgG-FITC购自Jackson ImmunoResearch，E.coliDH5αCompetent Cell、E.coli BL21感受态细胞购自北京全式金生物有限公司。
2、PRRSV PLP2蛋白的表达与纯化
2.1 PCR引物设计
以GenBank:EF641008登录的PRRSV JXwn06 PLP2的序列为基础，以pET28a(+)为载体，在PLP2羧基端融合StrepⅡ标签蛋白，设计引物并扩增PLP2(46～323)目的基因序列SEQID NO.1。引物由北京擎科生物科技有限公司合成，得到引物PLP2(46～323)-F：SEQ IDNO.2(GGAGATATACCATGGATG TACTCTCCGCCTGCCGAAGGG)和PLP2(46～323)-R：SEQ ID NO.3(CTCG AATTCGGATCCTTACTTTTCGAACTGCGGGTGGCTCCAGCCCAAAGGCTC TTGAGTCACG)，具体引物序列如表1所示，F代表上游引物，R代表下游，下划线“—”为编码StrepⅡ标签蛋白的基因序列；
PRRSV JXwn06 PLP2(46～323)的目的基因序列SEQ ID NO.1：TACTCTCCGCCTGCCGAAGGGAACTGTGGTTGGCACTGCATTTCCGCCATCGCCAACCGGATGGTGAATTCCAACTTTGAGACCACCCTTCCTGAAAGAGTAAGGCCTTCAGATGACTGGGCCACTGACGAGGATCTTGTGAACACCATCCAAATCCTCAGGCTCCCTGCGGCCTTGGACAGGAACGGCGCTTGCGGTAGCGCCAAGTACGTGCTTAAACTGGAGGGTGAGCATTGGACTGTCTCTGTGATCCCTGGGATGTCCCCTACTTTGCTCCCCCTTGAATGTGTTCAGGGTTGTTGTGAGCATAAGGGCGGTCTTGTTTCCCCGGATGCGGTCGAAATTTCCGGATTTGATCCTGCCTGCCTTGACCGACTGGCTAAGGTAATGCACTTGCCTAGCAGTACCATCCCAGCCGCTCTGGCCGAATTGTCCGACGACTCCAACCGTCCGGTTTCCCCGGCCGCTACTACGTGGACTGTTTCGCAATTCTATGCTCGTCATAGAGGAGGAGATCATCATGACCAGGTGTGCTTAGGGAAAATCATCAGCCTTTGTCAAGTTATTGAGGATTGCTGCTGCCATCAGAATAAAACCAACCGGGCTACTCCGGAAGAGGTCGCGGCAAAGATTGATCAGTACCTCCGTGGCGCAACAAGTCTTGAGGAATGCTTGGCCAAACTTGAGAGAGTTTCCCCGCCGAGCGCTGCGGACACCTCCTTTGATTGGAATGTTGTGCTTCCTGGGGTTGAGGCGGCGAATCAGACAACCGAACAACCTCACGTCAACTCATGCTGCACCCTGGTCCCTCCCGTGACTCAAGAGCCTTTGGGC。
表1扩增PLP2目的基因的引物序列表
2.2、PCR扩增目的基因
以PRRSV JXwn06感染性cDNA克隆为模板，利用表1中引物，PCR扩增PLP2目的基因片段，得到PLP2-StrepⅡDNA片段。
PCR扩增反应体系如下：2×PCR buffer for KOD，25μL；dNTPs，10μL；上游引物F(10mM)和下游引物R(10mM)各1μL；模板，2μL；KOD，1μL；ddH2O，补至50μL。
PCR反应程序：94℃预变性2min，进入35个循环，98℃变性10s，58℃退火30s，68℃延伸30s，72℃终末延伸10min。
2.3、PCR产物纯化回收
按照Wizard SV Gel and PCR Clean-Up syetem胶回收试剂盒指南进行操作，具体步骤如下：
1)配制1％的琼脂糖凝胶，检测、分析扩增目的基因的条带；
2)将含有PLP2目的基因的条带的琼脂糖凝胶切下，放入1.5mL无菌离心管中，按1g/mL的比例加入Binding Buffer，置于65℃水浴锅中至琼脂糖凝胶完全溶解；
3)将上一步充分溶解的溶液转移至吸附柱内，12000rpm离心1min，弃废液，重复此步骤至溶液全部转移过柱；
4)在吸附柱中加入300μL Binding Buffer，12000rpm离心1min，弃废液；
5)在吸附柱中加入700μL SPW Wash Buffer(含乙醇)，12000rpm离心1min，弃废液，重复此步骤两遍；
6)将吸附柱12000rpm空管离心2min后，丢弃回收管，吸附柱放入新的1.5mL离心管内，开盖置于室温5min，使乙醇挥发；
7)向吸附膜中央悬空滴加40μL无RNase水，室温静置2min，12000rpm离心2min，丢弃吸附柱，将回收产物测量浓度后，放置-20℃保存，得到目的基因，如图1所示，PCR扩增目的基因，在892bp大小处存在特异性条带，符合预期大小，图1中M为DL2000 DNA Marker，1为PLP2目的基因。
2.4、pET28a(+)-PLP2-StrepⅡ重组表达质粒的构建
用限制性内切酶NcoⅠ、BamH I对pET28a(+)载体进行双酶切。酶切反应体系如下：pET28a(+)载体，2μg；NcoⅠ，2μL；BamH I，2μL；NEB Cutsmart Buffer，5μL；无菌ddH2O补至50μL。
混匀后放入37℃水浴锅中，进行酶切反应，时间为2.5h。将10μL 6×LoadingBuffer加入酶切产物中，经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，将酶切产物进行纯化回收，得到酶切产物线性化pET28a(+)载体，可以使用胶回收试剂盒进行纯化回收。
将目的基因与线性化pET28a(+)载体连接。参考Seamless cloning kit说明书，同源重组反应体系如下：PLP2基因片段，50ng；线性化pET28a(+)，108ng；2x SeamlessCloning Mix，10μL；ddH2O补至20μL。
混匀后放入50℃水浴锅中，进行连接反应，时间为25min，得到同源重组连接产物。
从-80℃冰箱取出E.coli DH5αCompetent Cell(大肠杆菌DH5α感受态细胞)，置于冰上缓慢融化；将同源重组连接产物加入E.coli DH5αCompetent Cell中，轻轻混匀后冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴2min；之后向混合溶液中加入600μL无抗LB液体培养基，置于37℃180rpm的摇床中培养1h；4500rpm离心3min，用移液枪吸走部分上清，剩余的100μL左右培养基，使用剩余培养基重悬菌体，均匀涂布在LB/Kan+固体培养基平板上，放于37℃温箱中倒置过夜培养。
用无菌的枪头挑取6个白色、表面光滑的单菌落，分别置于装有1mL LB/Kan+液体培养基的无菌离心管中，在37℃、180rpm摇床上培养4～6h，以培养的菌液为模板进行PCR鉴定，选取3个阳性样本进行测序。
2.5、pET28a(+)-PLP2-StrepⅡ阳性重组表达质粒的中量提取
取200μL测序正确的菌液接种于150mL LB/Kan+液体培养基中，在37℃、180rpm的条件下培养12～16h，使用美国Promega公司的质粒中提试剂，按其说明书进行中量提取质粒，具体步骤如下：
1)将菌液装入250mL离心管中，配平后，在4℃条件下8000rpm离心10min，弃掉上清，保留菌体；将离心管倒置，尽量用吸水纸吸干残余的上清液。
2)加入6mL重悬液，将底部菌体沉淀重悬；
3)再加入6mL裂解液，盖上离心管盖子，轻柔的翻转5～8次，静置3min；此时溶液变为清亮。
4)加入10mL中和液，颠倒混匀5～8次，此时出现白色絮状沉淀物，4℃条件下，8000rpm离心20min；
5)将吸附柱(上面蓝柱、下面白柱)安装于真空泵上，将离心所得上清液加入蓝柱，打开真空泵，检查真空泵压力，避免漏气，至液体被抽干，取下蓝柱；
6)向白柱中加入5mL Endo Removal Wash，打开真空泵，使试剂过柱；
7)然后向白柱中加入20mL Column Wash Solution，液体过完柱后再抽真空2～3min，确保洗液完全抽除，关闭真空泵，用吸水纸吸干柱底部残留液体。
8)取干净的1.5mL离心管置于白色柱子下，向吸附膜均匀滴加500μL超纯水，静置2min后，打开真空泵将吸附膜上的DNA洗脱，收集于离心管中；
9)测定并记录阳性重组制粒的浓度，-20℃保存备用。
2.6、PRRSV PLP2重组蛋白的表达与纯化
将携带PRRSV JXwn06毒株PLP2基因的重组表达质粒pET28a(+)-PLP2-StrepⅡ转化E.coli BL21感受态细胞，转化后的感受态细胞被均匀涂布在LB/Kam+固体培养基平板上，放于37℃温箱中倒置过夜培养；挑取圆形白色表面光滑的单菌落接种于装有10mL LB/Kam+液体培养基的玻璃管中，在37℃、180rpm摇床过夜培养。取7mL上述培养好的菌液，接种于700mL LB/Kam+液体培养基中，在37℃、180rpm摇床中培养。当菌液的OD600nm达到0.6～0.8时，加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，Isopropylβ-D-Thiogalactoside)使其终浓度为0.2mmol/L，在16℃、180rpm摇床中继续培养24h，以诱导PLP2重组蛋白的表达，离心收集诱导后的菌体，用30ml PBS重悬，在冰浴条件下超声裂解。条件为：超声3s，间隔5s，振幅28％，时间30min。超声后的菌液在4℃8000rpm条件下离心30min，收集上清液和沉淀，SDS-PAGE鉴定PLP2重组蛋白的表达形式，SDS-PAGE鉴定PLP2重组蛋白主要表达在上清液中，如图2所示。图2中M为蛋白Marker，1、2为pET28a(+)-PLP2-StrepⅡ诱导后上清液、沉淀，3、4为空载体诱导和未诱导。
将收集的上清液用孔径0.45μm的滤器过滤，使用HiCap Streptactin亲和层析柱与Superdex75分子筛纯化PLP2蛋白,如图3-1所示；用SDS-PAGE和Western Blot检测蛋白的纯度与特异性，试验结果显示，获得了高纯度的PLP2重组蛋白，如图3-2所示。图3-2中M为蛋白Marker，1为亲和层析纯化后的PLP2，2为分子筛纯化后的PLP2，3为纯化的PLP2与StrepⅡ标签抗体反应。3、建立检测PRRSV PLP2抗体的间接ELISA方法，包括以下步骤：
3.1包被PLP2重组蛋白
利用包被液将纯化后的PLP2重组蛋白按照不同浓度1.6μg/ml、0.8μg/ml、0.4μg/ml、0.2μg/ml、0.1μg/ml、0.05μg/ml倍比稀释，按每孔100μl加入96孔酶标板中，4℃包被过夜，包被液为碳酸盐缓冲液。碳酸盐缓冲液为称取1.59g Na2CO3和2.93g NaHCO3溶解于980mL蒸馏水，调节pH至9.6，定容到1L。将阴、阳性标准血清分别按照1:25、1:50、1:100、1:200、1:400倍比稀释，与不同浓度的蛋白组成方阵，每个组合2个重复，在预实验条件下进行ELISA试验，分析各个条件下的OD450nm值，选择阳性血清OD450nm接近1.000且阳性血清OD450nm与阴性血清OD450nm的比值最大的组合，以确定最优的包被浓度和血清稀释度。
表2 PLP2重组蛋白最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定
注：P表示阳性血清OD450nm，N表示阴性血清OD450nm，P/N表示阳性血清OD450nm与阴性血清OD450nm的比值(下同)。
表2的结果显示，随着PLP2重组蛋白包被浓度的递减、血清稀释度的递增，阴、阳性血清OD450nm值呈现降低趋势，当包被浓度为0.4μg/ml与血清稀释度为1:50时，阳性血清OD450nm接近1.000且阳性血清OD450nm与阴性血清OD450nm的比值最大，因此确定最佳包被浓度0.4μg/ml与血清稀释度为1:50。
3.2、洗涤
甩干96孔酶标板中的包被液，按每孔300μL加入洗涤液，洗涤3次，5min/次，洗涤后甩干，洗涤液为0.1％PBST溶液。
3.3封闭
以最优包被浓度的PLP2重组蛋白包被酶标板，每孔100μl。用不同浓度的BSA、FBS、多种动物血清等封闭液4℃封闭10～12h，每孔200μl，每种封闭液2个重复，其他条件不变，进行ELISA试验，以确定最佳的封闭液。同时添加不同浓度的吐温-20、蔗糖等对封闭液的溶剂优化。
具体操作为以浓度为0.4μg/ml的PLP2重组蛋白包被酶标板，每孔100μl，4℃包被过夜。用不同的封闭液4℃封闭10～12h，将血清按1：50稀释后每孔100μl，37℃孵育30min，兔抗猪IgG-HRP抗体按1:5000稀释后，每孔100μl，37℃孵育30min，TMB反应条件为室温避光显色15min，进行ELISA试验。由表3.1、表3.2和表4结果显示以0.3％PBST溶液(PBST溶液是指PBS溶液加上吐温-20)作为溶剂、BSA浓度为2％时封闭效果好。
表3.1封闭液的确定结果
表3.2封闭液的确定结果
表4封闭液成分优化
3.4洗涤
甩干96孔酶标板中的封闭液，按每孔300μL加入洗涤液，洗涤3次，5min/次，洗涤后甩干。
3.5血清孵育
以最优的包被浓度和封闭液包被、封闭酶标板，将血清在37℃孵育20min、30min、45min、60min，每个反应时间2个重复，其他条件不变，进行ELISA试验，以确定最佳的血清孵育时间。
以浓度为0.4μg/ml的PLP2重组蛋白包被酶标板，以0.3％PBST溶液作为溶剂、BSA浓度为2％时封闭，将阴、阳性血清使用稀释液按1：50稀释后每孔加入100μl，37℃孵育20min、30min、45min、60min，兔抗猪IgG-HRP抗体使用稀释液按1：5000稀释后，每孔100μl，37℃孵育30min，血清和酶标二抗兔抗猪IgG-HRP抗体的稀释液为含0.3％PBST的2％BSA溶液，TMB反应条件为室温避光显色15min，进行ELISA试验，以确定最佳的血清孵育时间。由表5结果显示血清孵育最佳条件为37℃孵育30min。
表5血清孵育时间
3.6洗涤
甩干96孔酶标板中的血清，按每孔300μL加入洗涤液，洗涤3次，5min/次，洗涤后甩干。
3.7酶标二抗孵育
在已确定的最优条件下进行ELISA试验，将Bioss兔抗猪和Sigma山羊抗猪两种酶标二抗按照1:2500、1:5000、1:8000、1:10000倍比稀释后每孔加入100μl，37℃孵育30min，每个稀释度2个重复，其他条件不变。进行ELISA试验，以确定优势酶标二抗及其最佳稀释度。在优势酶标二抗最适稀释度条件下，将酶标二抗在37℃孵育20min、30min、45min、60min，每个时间条件2个重复，其他条件不变，进行ELISA试验，以确定最佳的酶标二抗孵育时间。
在已确定的最优条件下进行ELISA试验，将两种酶标二抗倍比稀释后每孔加入100μl，37℃孵育30min，其他条件不变。由表6结果显示，优势酶标二抗为Bioss兔抗猪IgG-HRP抗体，最佳稀释度为1:5000。由表7结果显示在优势酶标二抗最适稀释度条件下，最佳的孵育条件为37℃孵育30min。
表6优势酶标二抗的选择及其浓度
表7酶标二抗最佳孵育时间
3.8洗涤
甩干96孔酶标板中的酶标二抗，按每孔300μL加入洗涤液，洗涤3次，5min/次，洗涤后甩干。
3.9加入TMB底物液，室温避光显色反应
按上述已确定的反应条件进行ELISA试验，加入TMB后分别在室温避光显色5min、10min、15min、20min后加入50μL终止液终止显色，每个时间条件2个重复。比较阴、阳性血清OD450nm及P/N值，以确定最佳显色时间。由8表结果显示最佳显色时间为15min。
表8 TMB最佳反应时间的确定
3.10、加入终止液
按每孔加入50μL 2mol/L H2SO4终止反应。
3.11确定阴、阳性临界值
将30份PRSSV核酸检测阴性和抗体阴性的猪血清样本用已建立的间接ELISA方法进行检测，每份样本重复2次，使用酶标仪读取各孔OD450nm，计算所有血清样本OD450nm的平均值和标准差(SD)。根据公式： 计算出阴阳性临界值。由表9结果显示，SD＝0.042，因此当血清样本OD450nm≥0.27，可判定为阳性(+)，反之血清样本OD450nm＜0.27，为阴性(-)。
表9阴阳性临界值的确定
4、检测PRRSV PLP2抗体的间接ELISA方法的特异性与灵敏度分析
将阳性血清样本按照1:200、1:400、1：800、1:1600、1:3200、1:6400倍比稀释，用已建立的间接ELISA方法进行检测，每个稀释度2个重复，参考已经确定阴阳性临界值确定该方法的灵敏度。由10表结果显示血清稀释1:3200时结果为阴性，因此该检测方法的灵敏度为1:1600。
表10灵敏度检验结果表
注：“+”表示血清样本检测结果为阳性，“-”表示血清样本检测结果为阴性性，下同。
将猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒和猪α冠状病毒阳性血清按1:50稀释，使用建立的抗体检测方法检测，每份血清样本2个重复，并设立阴、阳性对照，根据阴阳性临界值判断其他病原阳性血清是否发生交叉反应，以确定该方法是否具有较好的特异性。表11结果显示，该方法与4种阳性血清无交叉反应，特异性较好。
表11特异性试验结果表
5、批次内和批次间重复性试验
将8份PRRSV JXwn06毒株感染仔猪后不同时间段的血清按1:50稀释，使用建立的检测方法在同一块板内进行重复性试验，每个血清样本设置4个重复，根据统计学计算变异系数，批次内变异系数CV＝(SD/OD450nm平均值)×100％，以确定该方法是否具有较高批次内重复性。由表12结果显示变异系数均小于10％，该方法批次内重复性好。
表1批次内重复性试验表
将相同的8份PRRSV JXwn06毒株感染仔猪后不同时间段的血清按1:50稀释，使用建立的检测方法在4块不同的板内进行重复性试验，每个血清样本在同一板内设置2个重复，根据统计学计算变异系数，批次间变异系数CV＝(SD/OD450nm平均值)×100％，以确定该方法是否具有较好批次间重复性。由表13结果显示变异系数均小于10％，该方法批次内重复性好。
表13批次间重复性试验表
6、检测PRRSV PLP2抗体的间接ELISA方法的应用
6.1、检测PRRSV PLP2抗体的间接ELISA方法与商品化试剂盒N蛋白抗体检测方法的比较
将2份PRRSV感染仔猪后阳性血清样本和1份临床PRRSV阳性血清样本按照1:200、1:400、1：800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800倍比稀释，每个稀释度2个重复，比较PLP2抗体检测间接法与商品化N蛋白检测方法的灵敏度。
表14结果显示，利用两种方法检测时，3份血清不同稀释度的OD450nm差异不明显，根据两种检测方法各自的结果判定标准，PLP2抗体检测间接法检测PRRSV感染仔猪后阳性血清1和血清2时比N蛋白抗体检测方法较灵敏；检测临床PRRSV阳性血清3时两种检测方法灵敏度一致。
表14两种抗体检测方法灵敏度测验结果
注：N蛋白抗体检测方法结果判定：S/P＝(血清样本OD450nm-阴性对照OD450nm)/(阳性对照OD450nm-阴性对照OD450nm)，S/P≥0.4为阳性，反之为阴性(下同)。阳性对照OD450nm为0.830，阴性对照OD450nm为0.131。
表15显示PLP2抗体检测间接法和N蛋白抗体检测方法检测3份PRRSV感染仔猪后第28天的血清样本和5份阴性血清样本时，两者结果一致。
表15 PLP2抗体检测方法利用商品化试剂盒组分的检测结果
6.2、不同PRRSV毒株PLP2抗体和N蛋白抗体产生动态分析
利用PLP2抗体检测方法和商品化PRRSV N蛋白抗体检测方法进行比较，对PRRSVJXwn06毒株感染仔猪后血清中PLP2抗体和N蛋白抗体产生动态分析。如图4-1、图4-2所示，在接种PRRSV后PLP2抗体最早检出时间为3～5dpi，N蛋白抗体检出时间为7～10dpi。具体结果为3dpi、5dpi分别有1头猪、3头猪的PLP2抗体呈阳性，在7dpi时，所有感染猪的PLP2抗体均呈阳性；在7dpi时有1头猪的N蛋白抗呈阳性，在14dpi时，所有感染猪的N蛋白抗体均呈阳性。
将携带PRRSV JXwn06 PLP2和N蛋白基因的真核质粒pCVM-PLP2-Myc和pCVM-ORF7-Myc转染BHK21细胞，转染24h后，用PRRSV JXwn06毒株感染猪的血清按1:100稀释后作为一抗，同时设立阴、阳性血清对照和兔抗PLP2多克隆抗体及鼠源N蛋白单克隆抗体针对PLP2、N靶蛋白抗体对照，分别孵育转染两个质粒后的BHK21细胞，进行IFA。如图5结果显示，IFA结果与ELISA检测结果一致。PRRSV感染仔猪后，检测PRRSV PLP2抗体的ELISA间接法检测出PLP2抗体的时间比N蛋白检测方法检测出N蛋白抗体的时间提前2～4天。
利用原核表达的PRRSV JXwn06 PLP2成功建立了的检测PLP2抗体的间接ELISA，重复性和特异性好，可用于PRRSV PLP2抗体检测。
本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种检测PRRSV PLP2抗体的间接ELISA方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 834
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tactctccgc ctgccgaagg gaactgtggt tggcactgca tttccgccat cgccaaccgg 60
atggtgaatt ccaactttga gaccaccctt cctgaaagag taaggccttc agatgactgg 120
gccactgacg aggatcttgt gaacaccatc caaatcctca ggctccctgc ggccttggac 180
aggaacggcg cttgcggtag cgccaagtac gtgcttaaac tggagggtga gcattggact 240
gtctctgtga tccctgggat gtcccctact ttgctccccc ttgaatgtgt tcagggttgt 300
tgtgagcata agggcggtct tgtttccccg gatgcggtcg aaatttccgg atttgatcct 360
gcctgccttg accgactggc taaggtaatg cacttgccta gcagtaccat cccagccgct 420
ctggccgaat tgtccgacga ctccaaccgt ccggtttccc cggccgctac tacgtggact 480
gtttcgcaat tctatgctcg tcatagagga ggagatcatc atgaccaggt gtgcttaggg 540
aaaatcatca gcctttgtca agttattgag gattgctgct gccatcagaa taaaaccaac 600
cgggctactc cggaagaggt cgcggcaaag attgatcagt acctccgtgg cgcaacaagt 660
cttgaggaat gcttggccaa acttgagaga gtttccccgc cgagcgctgc ggacacctcc 720
tttgattgga atgttgtgct tcctggggtt gaggcggcga atcagacaac cgaacaacct 780
cacgtcaact catgctgcac cctggtccct cccgtgactc aagagccttt gggc 834
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggagatatac catggatgta ctctccgcct gccgaaggg 39
<210> 3
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctcgaattcg gatccttact tttcgaactg cgggtggctc cagcccaaag gctcttgagt 60
cacg 64

Claims (2)

1.一种非诊断目的检测PRRSV PLP2抗体的间接ELISA方法，其特征在于，包括以下步骤：
S0：构建PRRSV PLP2重组表达质粒，制备PRRSV PLP2重组蛋白；
步骤S0包括以下步骤：
S0-1：准备材料；
S0-2：设计扩增目的基因的PCR引物，以GenBank:EF641008登录的PRRSV JXwn06毒株为模式病原，以pET28a(+)为载体，在PLP2羧基端融合Strep Ⅱ标签蛋白，设计引物并扩增46~323aa PLP2目的基因序列SEQ ID NO.1，设计得到PCR引物，46~323aa PLP2的上游引物：SEQID NO.2；46~323aa PLP2的下游引物：SEQ ID NO.3；
S0-3：PRRSV PLP2蛋白编码基因的扩增，以PRRSV JXwn06感染性cDNA克隆为模板，利用步骤S0-2得到的PCR引物，PCR扩增获得PLP2目的基因片段；
S0-4：将步骤S0-3得到的PCR扩增PLP2目的基因片段进行凝胶回收，得到纯化的PLP2目的基因；
S0-5：构建pET28a(+)-PLP2-Strep Ⅱ 重组表达质粒，使用限制性内切酶Nco Ⅰ、BamH I对pET28a(+)载体进行双酶切，得到酶切产物线性化pET28a(+)载体，将步骤S0-4得到的PLP2-Strep Ⅱ DNA片段与线性化pET28a(+)载体连接，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，得到pET28a(+)-PLP2-Strep Ⅱ 重组表达质粒；
S0-6：获取PRRSV PLP2重组蛋白，将步骤S0-5得到的pET28a(+)-PLP2-Strep Ⅱ 重组表达质粒转化E.coli BL21感受态细胞，使用LB培养基进行培养和IPTG诱导表达，得到PRRSV PLP2重组蛋白；
S0-7： SDS-PAGE鉴定PRRSV PLP2重组蛋白的表达形式，鉴定出PRRSV PLP2重组蛋白为原核可溶性表达，利用HiCap Streptactin亲和层析柱与Superdex75分子筛纯化，获得纯化的PLP2重组蛋白；
S1：包被PRRSV PLP2重组蛋白，利用包被液将PRRSV PLP2重组蛋白稀释，加入酶标板中，4 ℃包被过夜，其中包被液将PRRSV PLP2重组蛋白稀释为0.4 µg/ml；
S2：洗涤，甩干酶标板中的包被液，加入洗涤液，洗涤，洗涤后甩干；
S3：封闭，将浓度为2% BSA封闭液加入酶标板中，4 ℃封闭10~12 h；
S4：洗涤，甩干酶标板中的封闭液，加入洗涤液，洗涤，洗涤后甩干；
S5：血清孵育，将猪血清样本用稀释液按1:50稀释，加入酶标板中，37 ℃孵育30 min；
S6：洗涤，甩干酶标板中的血清，加入洗涤液，洗涤，洗涤后甩干；
S7：酶标二抗孵育，将兔抗猪IgG-HRP抗体用稀释液按1:5000稀释，加入酶标板中，37℃避光孵育30 min；
S8：洗涤，甩干酶标板中的酶标二抗，加入洗涤液，洗涤，洗涤后甩干；
S9：酶标板中加入TMB底物液，室温避光15 min显色；
S10：终止反应，酶标板中加入50 μL浓度为2 mol/L的H2SO4终止反应；
S11：读取吸光值，判定检验结果为阴性或阳性，使用酶标仪读取酶标板各孔OD450nm，当血清样本OD450nm≥0.27，判定为阳性，反之血清样本OD450nm＜0.27，判定为阴性；
所述封闭液BSA的溶剂为0.3% PBST溶液；所述包被液为碳酸盐缓冲液；所述洗涤液为0.1% PBST溶液；所述血清和所述酶标二抗的稀释液为含0.3% PBST的1%BSA溶液。
2. 根据权利要求1所述的非诊断目的检测PRRSV PLP2抗体的间接ELISA方法，其特征在于，步骤S0-1中所述准备材料包括
（1）准备血清，选用PRRSV JXwn06阳性血清、猪瘟病毒阳性血清、猪圆环病毒2型阳性血清、猪流行性腹泻病毒和猪α冠状病毒阳性血清以及SPF猪血清；
（2）选用pET28a(+)载体；
（3）准备试剂，兔抗猪IgG-HRP、山羊抗猪IgG-HRP、山羊抗鼠IgG-FITC、山羊抗兔IgGFab-FITC和山羊抗猪IgG-FITC，E.coli DH5α感受态细胞、E.coli BL21感受态细胞。
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