PL205524B1 - Rekombinowany świński adenowirus oraz zawierająca go szczepionka - Google Patents

Rekombinowany świński adenowirus oraz zawierająca go szczepionka

Info

Publication number
PL205524B1
PL205524B1 PL350182A PL35018200A PL205524B1 PL 205524 B1 PL205524 B1 PL 205524B1 PL 350182 A PL350182 A PL 350182A PL 35018200 A PL35018200 A PL 35018200A PL 205524 B1 PL205524 B1 PL 205524B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
pav
plasmid
virus
porcine
region
Prior art date
Application number
PL350182A
Other languages
English (en)
Other versions
PL350182A1 (en
Inventor
Marc Eloit
Bernard Georges Klonjkowski
Original Assignee
Envt Toulouse
Merial Sas
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Envt Toulouse, Merial Sas filed Critical Envt Toulouse
Publication of PL350182A1 publication Critical patent/PL350182A1/xx
Publication of PL205524B1 publication Critical patent/PL205524B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16734—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy rekombinowanego świńskiego adenowirusa oraz zawierającej go szczepionki.
Dokumenty cytowane w opisie jak i dokumenty cytowane w tych dokumentach zostały zamieszczone jako odnośniki literaturowe.
Adenowirusy są wirusami o liniowym dwuniciowym DNA z powtórzonymi odwróconymi sekwencjami końcowymi na każdym końcu. Adenowirusy należą do rodziny wirusów Adenoviridae, odpowiedzialnych za choroby dotyczące wielkiej liczby gatunków, takich jak gatunki małp, bydło, owce, świnie, konie, myszy, psy i ptaki. Zakażenia adenowirusem mogą charakteryzować się, w zależności od gatunku i typu adenowirusa, objawami zapalenia opon mózgowych, zapalenia płuc, uszkodzeń nerek, biegunek i zapalenia wątroby.
Genom wirusa jest różny u różnych gatunków [(T. Adrian i wsp., Arch. Virol. 1986, 91, 277-290), (J. Hamelin i wsp., J. Clin. Micriobiol. 1988, 26, 31-33), (R. Assaf i wsp., Can. J. Comp. Med. 1983, 47, 460-463), (T. Kurokawa i wsp., J. Virol. 1978, 28, 212-218), (S.-L. Hu i wsp., J. Virol. 1984, 51, 880883), (L. Zsak i wsp., Intervirology 1984, 22, 110-114)]. Adenowirusy zwierzęce, w przeciwieństwie do adenowirusów ludzkich, mają bardzo wąski zakres gospodarza i często zakażają tylko zwierzęta należące do ich gatunku wyjściowego.
Pierwszy świński adenowirus (po angielsku „Porcine Adenovirus lub PAV) został wyizolowany w 1964 roku (D. Haig i wsp., J. Comp. Pathol. 1964, 74, 81-84). Od tej daty zidentyfikowano i opisano 5 serotypów świńskich adenowirusów (Hirahara i wsp., J. Vet. Sci. 1990, 52, 407-409). Adenowirusy serotypów 1 i 2 są związane z biegunkami; adenowirusy serotypu 4 są związane z objawami zapalenia płuc i zapalenia opon mózgowych. Adenowirusy świni zostały sklasyfikowane w piątym serotypie ze względu na ich brak neutralizacji krzyżowej z surowicami odpornościowymi na PAV serotypów 1 do 4. Genom PAV-5 analizowano i ustalono mapę restrykcyjną (Tuboly i wsp., Virus Res. 1995, 37, 49-54). Ta analiza wykazała brak podobieństwa między mapami restrykcyjnymi PAV-5 i innych serotypów: PAV-1 i PAV-2 (Reddy i wsp., Arch. Virol. 1995, 140, 195-200), PAV-3 (Reddy i wsp., Intervirology 1993, 36, 161-168) i PAV-4 (Kleiboeker i wsp., Arch. Virol. 1993, 133, 357-368). Wśród serotypów 3 i 5 istnieją szczepy, które nie są naturalnie patogenne dla ś wini.
PAV mają genom wielkości około 32 do około 34 kbp. Genom PAV-1 ma wielkość około 33,5 kbp. Genom PAV-2 ma wielkość około 33,3 kbp. Niedawno ustalono całkowitą sekwencję PAV-3 i został a ona zdeponowana w bazie danych GenBank, pod numerem AF083132 (P. S. Reddy i wsp., Virol. 1998, 251, 414-426); jego wielkość wynosi 34094 par zasad (bp). Genom PAV-4 ma wielkość około 32 kbp, a PAV-5 ma wielkość około 33,2 kbp. Całkowity genom PAV-5 i w szczególności region E3 nie był sekwencjonowany i opublikowany.
Podstawowe zastosowanie rozważane dla adenowirusów dotyczy obszaru terapii genowej u czł owieka w odniesieniu do czego zaproponowano znaczą liczbę konstruktów i systemów. Adenowirusy były także proponowane jako zrekombinowane wektory w kompozycjach szczepionek dla ochrony ludzi i zwierząt przed licznymi wirusami patogennymi.
Dotychczas opracowano dwie strategie konstrukcji wektorów adenowirusowych (M. Eloit & M. Adam, J. Gen. Virol. 1995, 76, 1583-1589).
Pierwsza strategia polega na wstawieniu kaset ekspresyjnych w regiony niezbędne do replikacji adenowirusa, stąd konieczne jest równoległe opracowywanie systemów transkomplementacji, pozwalające na zapewnienie replikacji wirusa. Dla adenowirusów świni jako miejsce insercji zaproponowano region E1 (P. S. Reddy i wsp., Virus Res. 1998, 58, 97-106). Tak skonstruowane zrekombinowane wirusy są określane jako „niereplikacyjne” jako, że nie mogą ulegać replikacji w gospodarzu, któremu są podawane.
Jako wariant tej pierwszej strategii można stosować u zwierzęcia docelowego wirusy niereplikacyjne. Kasetę ekspresyjną PRV gD wstawiono już w obszar E1A niereplikacyjnego u świni ludzkiego adenowirusa o serotypie 5 (M. Monteil i wsp., J. Gen. Virol. 1997, 78, 3303-3310; A. Ambriovic i wsp., Virol. 1997, 238, 327-355).
Druga strategia polega na wstawieniu kaset ekspresyjnych w obszarach genomu wirusa, które nie są zasadne dla replikacji adenowirusa. Trudność określenia niezasadnych regionów adenowirusów i obecność sztywnego kapsydu powodują, że ta druga strategia jest trudna do prowadzenia.
W istocie jedną z istotnych cech adenowirusów jest to, że mają sztywny kapsyd, który ś ciśle ogranicza wielkość cząsteczki DNA, która może być nim otoczona. Ogólnie szacuje się, że jest możliPL 205 524 B1 we umieszczenie w kapsydzie cząsteczki DNA odpowiadającej od 105 do 114% wielkości genomu, co odpowiada, w zależności od wielkości genomu, wstawkom około 1,7 do około 3,9 kbp. W przypadku większych rozmiarów w zrekombinowanym genomie mogą wystąpić niepożądane delecje i/lub rearanżacje. Region E3 nie jest konserwowany ani pod względem wielkości, ani organizacji genetycznej od adenowirusa danego gatunku do adenowirusa innego gatunku, ani pomiędzy adenowirusami świni o róż nych serotypach (S. Kleiboeker, Virus Res. 1994, 31, 17-25).
Region E3 wirusa PAV-3 ma wielkość 1179 par zasad. Jest to region złożony, który koduje przynajmniej 3 otwarte ramki odczytu (ORF). Te ORF zachodzą na siebie i pierwszy ORF zachodzi także na część genu kodującego białko pVIII (P. S. Reddy i wsp., Virus Res. 1995, 36, 97-106), które jest białkiem niezbędnym.
Obecność tych zachodzących na siebie ORF w regionie E3 stanowi poważną trudność dla określenia w nim miejsca insercji i/lub granice delecji tak, by zrekombinowane wirusy pozostały zdolne do replikacji u świń.
Sekwencja aminokwasów kodowana przez drugi ORF w regionie E3 nie wykazuje jakiejkolwiek homologii między adenowirusami PAV-3 i HAV-2 (ludzki, serotyp 2), ani z żadnym znanym obecnie białkiem adenowirusa (P. S. Reddy i wsp., Virus Res. 1995, 36, 97-106). Sekwencje aminokwasów przewidywane na podstawie sekwencji nukleotydów pierwszego ORF regionu E3 u PAV-3 mają zaledwie 33,3% identyczności z odpowiednią sekwencją adenowirusa psa o serotypie 2 (CAV-2). Nie tylko białka kodowane przez regiony E3 różnych adenowirusów nie są homologiczne, ale także te kodowane przez ORF regionu E3 nie wykazują żadnej homologii między adenowirusami PAV-3 i PAV-4 (S. B. Kleiboeker, Virus Res. 1994, 31, 17-25).
Region E3 ma wielkość 1162 bp u PAV-1 (z 5 ORF); ma 1222 bp u PAV-2 (z 5 ORF) (P. S. Reddy i wsp., Virus Res. 1996, 43, 99-109), 1879 bp u PAV-4 (z 6 ORF). Tylko czwarty ORF regionu E3 wirusa PAV-4 (odpowiadający białku 13,2 kDa) przedstawia homologię z innym znanym ORF regionu E3, kodującym białko 14,7 kDa adenowirusa ludzkiego typu 5 (po angielsku Human AdenoVirus 5 lub HAV-5). Region E3 PAV-4 nie ma ż adnych homologii sekwencji z regionami E3 innych adenowirusów świni, a w szczególności z odpowiednimi sekwencjami PAV-3 i PAV-5.
Poza trudnością określania ich granic dla zachowania charakteru replikacyjnego in vivo, także nie są bez ryzyka delecje w regionie E3. Delecje w regionie E3 mogą w efekcie nieść konsekwencje dla patogenności zrekombinowanych wirusów. Tak więc zaobserwowano, że delecja w regionie E3 wirusa HAV-5 zwiększa patogenność tego wirusa dla płuc w modelu eksperymentalnym infekcji szczura bawełnianego (Ginsberg i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 86, 3823-3827).
Pokazuje to, że konsekwencje delecji w regionie E3 adenowirusa muszą być rozważane oddzielnie dla każdego przypadku a nie poprzez prostą adaptację obserwacji dokonanych na jednym adenowirusie do innych adenowirusów. Organizacja genetyczna regionu E3 PAV-3 jest bowiem wyjątkowa, podobnie jak i organizacja regionu E3 PAV-5.
Dokładna lokalizacja miejsca insercji w regionie E3 jest dodatkowo komplikowana obecnością złożonych miejsc składania i poliadenylacji, obszarów charakterystycznych dla adenowirusa (Imperiale i wsp., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1995, 199, 139-171). Miejsca składania zlokalizowane w regionie E3 są istotne dla dojrzewania licznych niezbędnych RNA informacyjnych kodowanych przez sekwencje zlokalizowane poza regionem E3. Region E3 jest sam zlokalizowany w części genomu wirusa o wysokiej aktywności transkrypcyjnej (P. Sharp, 1984, w The Adenovirus, red. S. Ginsberg, Plenun Press, Nowy Jork i Londyn, 173-204), wstawienie heterologicznej sekwencji nukleotydów w regionie E3 może mieć negatywny wpływ na aktywność biologiczną zrekombinowanego wirusa. Dodatkowo region E3 jest zlokalizowany powyżej głównego późnego promotora (major late promoter, MLP), regionu, w którym wykazano interferencję między transkrypcją wstawki i transkrypcją inicjowaną przez MLP (Xu i wsp., J. Gen. Virol. 1995, 76, 1971-1980).
Wyniki uzyskane z adenowirusami pochodzącymi z innych gatunków (ludzkie, bydlęce, owcy itp.) nie mogą więc być adaptowane do adenowirusów świni. Dotychczas nie otrzymano jakiegokolwiek replikacyjnego zrekombinowanego wektora opartego na adenowirusie świni.
Twórcy wynalazku mieli na uwadze udostępnienie insercji genów heterologicznych do genomu wirusów PAV-3 i PAV-5 bez zasadniczej modyfikacji ich zdolności do replikacji in vivo.
Jako istotne uznali zaproponowanie regionów insercji, które można wydeletować bez naruszenia tej zdolności do replikacji tak, aby zwiększyć możliwą wielkość insercji do wirusa.
Ponadto ich zdaniem równie ważnym było zaproponowanie zrekombinowanych wirusów PAV-3 i PAV-5 zachowują cych zdolność do replikacji in vivo i pozwalających na ich zastosowanie jako ż y4
PL 205 524 B1 wych rekombinowanych szczepionek, w tym szczepionek podawanych poprzez śluzówki i/lub w obecności przeciwciał pochodzenia matczynego.
Zgłaszający zmodyfikowali region E3 PAV-3 i PAV-5 zachowując zdolność do replikacji in vivo. Wykazali również ekspresję in vivo genu wstawionego do tego regionu. Umożliwia to stosowanie PAV3 i PAV-5 jako replikacyjnych wektorów ekspresyjnych.
Rekombinowany świński adenowirus serotypu 3 (PAV3) lub serotypu 5 (PAV5) według wynalazku zawiera co najmniej jeden kwas nukleinowy kodujący co najmniej jeden immunogen, przy czym heterologiczny kwas nukleinowy jest wstawiony w region E3 genomu PAV-3 lub PAV5 zdolnego do replikacji in vivo i wyrażającego immunogen, który to immunogen jest wybrany z grupy składającej się z: immunogenu świńskiego cirkowirusa typu 2, gB wirusa pseudowścieklizny, gC wirusa pseudowścieklizny, immunogenu wirusa świńskiej grypy, VP2 wirusa parwowirozy, ORF3 wirusa zespołu rozrodczego i oddechowego świń, ORF4 wirusa zespołu rozrodczego i oddechowego świń, ORF6 wirusa zespołu rozrodczego i oddechowego świń, ORF7 wirusa zespołu rozrodczego i oddechowego świń, wirusa klasycznego pomoru świń EO, wirusa klasycznego pomoru świń E1 oraz immunogenu Actinobacillus pleuropneumoniae. Taki zmodyfikowany wirus posiada istotne podczas szczepienia zalety, a mianowicie: jest skuteczny nawet w obecnoś ci przeciwciał matczynych i moż e być skutecznie stosowany przezśluzówkowo.
Korzystnie heterologiczny kwas nukleinowy jest wstawiony w region E3 genomu PAV-3, w obszar insercji, który w szczepie PAV-3 ma sekwencję przedstawiona przez SEK NR ID.: 6 lub w region E3 genomu PAV-5, w obszar insercji, który w szczepie PAV-5 obejmuje nukleotydy 2389 do 3861 SEK NR ID.: 5.
Korzystniej obszar insercji obejmuje delecję.
Przez delecję obszaru można rozumieć delecję całkowitą lub częściową, w szczególności całkowitą, obszaru insercji. Inaczej mówiąc sekwencja heterologiczna wstawiana jest na miejsce całego lub części obszaru insercji, zwłaszcza na miejsce całości tego obszaru.
Dla PAV-3 obszarem insercji w E3 może być obszar zawierający całość lub część nukleotydów 706 do 1624 sekwencji opublikowanej przez P. S. Reddy i wsp., Virus Research 1995, 36, 97-106, co odpowiada pozycjom 27794 do 28712 sekwencji opublikowanej w GenBank AN # U10433. Inaczej mówiąc, ten obszar insercji i jego ewentualna delecja może obejmować całość lub tylko część sekwencji 706 do 1624 i/lub rozciągać się w E3 dalej od granicy 706 i/lub granicy 1624 i ewentualnie obejmować cały E3. Korzystnie obszar ten składa się z, lub zawiera, E3, nukleotydy 706 do 1624, nukleotydy 1002 do 1624 lub całość lub część sekwencji 706 do 1002. Obejmuje on mianowicie co najmniej sekwencję 1002 do 1624.
Dla PAV-5 E3 jest definiowany przez sekwencję nukleotydów 2382 do 4042 SEK NR ID.: 5. Obszar insercji i jego ewentualna delecja obejmuje E3 i zawiera wszystkie lub część nukleotydów 2064 do 4083, na przykład, całość lub część nukleotydów 2389 do 3861 SEK NR ID.: 5 (Fig. 13). Inaczej mówiąc, ten obszar insercji i jego ewentualna delecja może obejmować tylko część sekwencji 2389 do 3861 i/lub rozciągać się w E3 poza granicę 2389 i/lub granicę 3861 i ewentualnie obejmować cały E3. Gdy deletuje się włącznie do nukleotydu 4083, korzystne jest wstawienie na miejscu nukleotydu 4083 miejsca akceptorowego składania. Korzystnie ten obszar insercji składa się zasadniczo z nukleotydów 2389 do 3861.
Możliwe są również insercje w odpowiednich obszarach innych szczepów niż PAV-3 i PAV-5, których sekwencje różnią się od sekwencji szczepów referencyjnych według wynalazku.
Wirus PAV-3 lub PAV-5 według wynalazku ma zdolność do przenoszenia insercji znacznej wielkości i zachowuje zarazem zdolność replikacyjną in vivo u świni. Zachowanie zdolności do replikacji u gospodarza jest pożądane, ze wzglę du na potrzebę uzyskania optymalnej skuteczno ś ci ochrony, w szczególności podczas stosowania kompozycji szczepionki drogą przezśluzówkową i/lub w obecności przeciwciał matczynych.
Zwiększenie pojemności insercji uzyskuje się poprzez delecję, na przykład, całości lub części regionu E3, część E3 mogąca ulec delecji jest usytuowana pomiędzy genem kodującym białko pVIII i genem kodującym włókno. W szczególności, niniejszy wynalazek opisuje delecje 622 bp i 919 bp, które mogą być przeprowadzone w regionie E3 wirusa PAV-3, z jednoczesnym zachowaniem replikacyjnego charakteru zrekombinowanych wirusów (patrz przykłady 6 do 10). Niniejszy wynalazek opisuje dodatkowo delecję 1472 bp w regionie E3 zrekombinowanego wirusa (patrz przykłady 14 do 17).
Zrekombinowany adenowirus PAV-3 lub PAV-5 można wykorzystywać do insercji o maksymalnej wielkości 3,0 kbp dla wirusa PAV-3 i około 3,5 kbp dla wirusa PAV-5 oraz jej ekspresji u świni.
PL 205 524 B1
Niniejszym opisane zostały również wektory PAV-3 i PAV-5 z delecją, w szczególności w regionie E3, pozostające nadal replikacyjnymi, w szczególności wydeletowane w wymienionych powyżej obszarach, to znaczy z delecją całości lub części rozważanego obszaru, korzystnie całości tego obszaru.
Heterologiczne sekwencje nukleotydowe, które mogą być wstawione są sekwencjami kodującymi immunogeny lub fragmenty, na przykład, epitopy, immunologicznie czynne elementy immunogenów, a zwłaszcza geny lub fragmenty genów (na przykład, epitopy) kodujące immunogeny patogenów świni.
W ramach niniejszego wynalazku moż na wstawiać wię cej niż jedną sekwencję heterologiczną do tego samego wirusa. Można zwłaszcza wstawiać do niego sekwencje heterologiczne pochodzące od tego samego wirusa lub od różnych wirusów.
Możliwe jest wstawienie sekwencji sztucznych regrupujących kilka fragmentów lub epitopów pochodzących od tego samego patogenu lub różnych patogenów, i zwanych „sekwencjami poliepitopów”. W tym ostatnim przypadku sekwencja poli-epitopów jest umieszczona pod kontrolą pojedynczego promotora.
Korzystnie heterologiczny kwas nukleinowy rekombinowanego świńskiego adenowirusa według wynalazku koduje co najmniej jeden immunogen świńskiego cirkowirusa typu 2. Szczególnie korzystnie heterologiczny kwas nukleinowy koduje ORF1, ORF2 lub ORF1 i ORF2 świńskiego cirkowirusa typu 2.
Również korzystnie heterologiczny kwas nukleinowy koduje HA, NA i/lub NP wirusa świńskiej grypy.
Można także wstawiać sekwencje kodujące immunomodulatory, w szczególności cytokiny, a zwłaszcza cytokiny świni takie jak czynnik stymulujący kolonie granulocytów-makrofagów świni (poGM-CSF), interleukinę 4 świni (poIL-4), IL-12 świni lub IL-18 świni.
Przedmiotem wynalazku jest korzystnie adenowirus obejmujący sekwencję heterologicznego kwasu nukleinowego kodującą świńską cytokinę, korzystnie wybraną z grupy składającej się z GMCSF, IL-4, IL-12 i IL-18.
Ekspresja wielu genów heterologicznych wstawionych w miejsce insercji może też być umożliwiona przez wstawienie sekwencji „IRES” (Internal Ribosome Entry Site - wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu) pochodzącej w szczególności od pikornawirusa takiego jak wirus zapalenia pęcherzykowego świni (swine vesicular disease virus, SVDV; B.-F. Chen i wsp., J. Virology, 1993, 67, 21422148), wirusa zapalenia opon mózgowych i mięśnia sercowego (EMCV; R. J. Kaufman i wsp., Nucleic Acids Research, 1991, 19, 4485-4490), wirus zapalenia aftowego (FMDV; N. Luz i E. Beck, J. Virology, 1991, 65, 6486-6494) lub jeszcze z innego źródła. Kaseta ekspresyjna dwóch genów miałaby więc następującą minimalną strukturę: promotor (opcjonalny) - gen 1 - IRES - gen 2 - sygnał poliadenylacji. Zrekombinowana żywa szczepionka według wynalazku może więc zawierać wstawioną w miejsce insercji kasetę ekspresyjną zawierają c ą kolejno promotor, dwa lub kilka genów rozdzielonych po dwa przez IRES, i sygnał poliadenylacji.
Patogeny świni są wirusami, bakteriami, pasożytami, w szczególności wybranymi wśród tych z grupy składającej się z wirusa choroby Aujeszky'ego (wirus PRV lub pseudowścieklizny), wirusa grypy świń (SIV), wirusa tajemniczej choroby świń (wirus PRRS), wirusa parwowirozy (wirus PPV), wirusa klasycznego pomoru świń (wirus HCV lub Hog Cholera Virus), cyrkowirusa świń, w szczególności typu 2 (Porcine CircoVirus type 2, PCV2 lub wirusa ogólnego niedomagania prosiaków), Actinobacillus pleuropneumoniae, Mycoplasma hyopneumoniae.
W odniesieniu do choroby Aujeszky'ego, moż na uży ć geny gB (Robbins, A. K. i wsp. J. Virol.
1987, 61, 2691-2701, GenBank AN # Ml7321), gC (Ishikawa K. i wsp. Vet. Microbiol. 1996, 49, 267272 GenBank AN # D49435) i/lub gD (Riviere, M. i wsp., J. Virol. 1992, 66, 3424-3434 i Hong W. Z. i wsp., GenBank AN # AF086702) w swoich postaciach natywnych lub wydzielanych.
W odniesieniu do choroby grypy świń, korzystne jest użycie genów HA (WO-A-98/03658, przykłady 10 i 12) (forma natywna lub wydzielana), NA (Nerome K. i wsp., J. Gen. Virol. 1995, 76, 613-624 GenBank AN # D21194 (forma natywna lub wydzielana) i/lub NP (WO-A-98/03658, przykłady 11 i 13).
W odniesieniu do PRRS, korzystne jest stosowanie genu ORF4, ORF3 (forma natywna lub wydzielana), ORF5 (forma natywna lub wydzielana), ORF6 i/lub ORF7 szczepów europejskich (Meulenberg J. i wsp., Virology, 1993, 192, 62-72) i szczepów amerykańskich (Mardassi H. i wsp., Arch. Virol.
1995, 140, 1405-1418).
PL 205 524 B1
W odniesieniu do wirusa klasycznego pomoru ś wiń , korzystne jest stosowanie genów E0, E1 (forma natywna lub wydzielana) i/lub E2 (forma natywna lub wydzielana) (Meyers G. i wsp.. Virology, 1989, 171, 18-27).
W odniesieniu do wirusa parwowirozy, korzystne jest stosowanie genu kapsydu VP2 (Vasudevacharya J. i wsp., Virology, 1990, 178, 611-616).
W odniesieniu do szczepu PCV2, korzystne jest stosowanie genów ORF1 i/lub ORF2, a korzystniej ORF1 i ORF2 (Meehan B. i wsp., J. Gen. Virol. 1998, 79, 2171-2179).
Sekwencje heterologiczne są wstawiane pod kontrolą sygnałów regulatorowych transkrypcji, a w szczególności promotora, a zwłaszcza wstawionego przy rekombinacji. Nie jest jednak wykluczona ekspresja sekwencji heterologicznych pod kontrolą własnych sygnałów adenowirusa służącego jako wektor.
Wśród użytecznych promotorów pożądane jest stosowanie silnych promotorów eukariotycznych, takich jak LTR wirusa mięsaka Rousa a zwłaszcza promotora bezpośrednio-wczesnego wirusa cytomegalii bądź CMV-IE (CytoMegaloVirus Immediate Early), szczególnie pochodzącego z myszy (MCMV-IE) lub ludzkiego (HCMV-IE) albo też o innym pochodzeniu na przykład, świni, małpy, szczura lub świnki morskiej.
W szczególności można stosować promotory CMV-IE z częścią aktywującą (po angielsku, „enhancer” (tłm. polskie „wzmacniacz) (US-A-5,168,062, US-A-4,968,615, US-A-4,963,481). Może być pożądane stosowanie fragmentów tych promotorów, zachowujących aktywność promotora, korzystnie z częścią aktywującą na przykład, promotor CMV-IE skrócony według WO-A-98/00166. Specjalista może odnieść się w celu uzyskania dalszych szczegółów do WO-A-98/00166, a szczególnie do jego przykładu 12.
Przedmiotem wynalazku jest również rekombinowana świńska szczepionka zawierająca rekombinowany świński wirus PAV-3 i/lub PAV-5 według wynalazku i dopuszczalne weterynaryjnie nośnik lub zaróbkę. Korzystnie rekombinowana świńska szczepionka według wynalazku zawiera wiele rekombinowanych świńskich adenowirusów PAV-3 i/lub PAV-5 według wynalazku obejmujących różne sekwencje heterologiczne. Korzystniej szczepionka według wynalazku zawiera adiuwant wybrany najkorzystniej spośród polimerów kwasu akrylowego lub kwasu metakrylowego i z kopolimerów kwasu maleinowego i pochodnej alkenylowej. Szczególnie korzystnym adiuwantem jest karbomer.
Niniejszym opisano również preparaty immunogenne lub immunologiczne dla świń zawierające zrekombinowany adenowirus według wynalazku, w nośniku (lub zaróbce) dopuszczalnym pod względem weterynaryjnym i ewentualnie adiuwant. Według definicji preparat immunogenny lub immunologiczny indukuje przynajmniej jedną odpowiedź immunologiczną (komórkową i/lub humoralną) po podaniu zwierzęciu. Szczepionka indukuje odpowiedź ochronną.
Użyteczne w praktycznej realizacji wynalazku związki stanowią polimery usieciowanego kwasu akrylowego lub metakrylowego, w szczególności poprzez etery polialkenylowe cukrów lub polialkoholi. Związki te są znane pod nazwą karbomerów (Pharmeuropa tom 8, nr 2, czerwiec 1996). Specjalista może też odnieść się do opisu patentowego US-A-2,909,462 opisującego takie polimery akrylowe usieciowane przez związek polihydroksylowy mający przynajmniej 3 grupy hydroksylowe, korzystnie nie więcej niż 8 grup hydroksylowych, przy czym atomy wodoru przynajmniej trzech grup hydroksylowych są zastąpione przez nienasycone rodniki alifatyczne mające przynajmniej 2 atomy węgla. Pożądanymi rodnikami są te, które zawierają od 2 do 4 atomów węgla, na przykład, winyle, allile i inne grupy etylenowe nienasycone. Rodniki nienasycone mogą same zawierać inne podstawniki, takie jak metyl. Produkty sprzedawane pod nazwą Carbopol® (BF Goodrich, Ohio, USA) są szczególnie odpowiednie. Są one usieciowane przez allilosacharozę lub przez allilopentaerytritol. Wśród nich można wymienić Carbopol® 974P, 934P i 971P.
Wśród kopolimerów bezwodnika maleinowego i pochodnej alkenylowej, szczególnie użyteczne są EMA® (Monsanto), które są kopolimerami bezwodnika maleinowego i etylenu, liniowe lub usieciowane, na przykład, usieciowane przez diwinyloeter, zgodnie z publikacją J. Fields i wsp., Nature, 186: 778-780, 4 czerwca 1960.
®
Pod względem ich struktury polimery kwasu akrylowego lub metakrylowego i EMA® są tworzone z jednostek podstawowych o nastę pują cym wzorze:
PL 205 524 B1
Rl R-2
---c-(CH2)x-C-(CH2)y--COOH COOH w którym:
- R1 i R2, są identyczne lub różne i oznaczają H lub CH3
- X = 0 lub 1, korzystnie x = 1
- Y = 1 lub 2, przy czym x + y = 2
Dla EMA® x = 0 i y = 2. Dla karbomerów x = y = 1.
Rozpuszczenie tych polimerów w wodzie prowadzi do otrzymania kwaśnego roztworu, który jest zobojętniany, korzystnie do fizjologicznego pH, z wytworzeniem roztworu adiuwantu, do którego będzie wprowadzana sama szczepionka. Grupy karboksylowe polimerów występują wówczas częściowo w postaci COO-.
Roztwór adiuwantu zgodnie z wynalazkiem, a zwłaszcza karbomeru przygotowuje się w szczególności, w wodzie destylowanej, zwłaszcza w obecności chlorku sodu, przy czym otrzymany roztwór ma kwaśne pH. Ten roztwór podstawowy rozcieńcza się (dla zapewnienia pożądanego końcowego stężenia) jeden lub więcej razy z równoczesnym lub następującym potem zobojętnieniem (pH 7,3 do 7,4) korzystnie za pomocą NaOH dodając w ilościach potrzebnych, lub w znacznej części, wodę zawierającą NaCl, a zwłaszcza roztwór fizjologiczny (NaCl 6 g/l). Roztwór ten o pH fizjologicznym może być stosowany w tej postaci do zawieszenia szczepionki, w szczególności szczepionki przechowywanej w postaci zliofilizowanej.
Stężenie polimeru w końcowej kompozycji szczepionki może wynosić od 0,01% do 2% masa/obj., w szczególności od 0,06% do 1% masa/obj., a zwłaszcza od 0,1% do 0,6% masa/obj.
Preparaty immunogenne i szczepionki według wynalazku mogą zawierać szereg zrekombinowanych adenowirusów według wynalazku, obejmujących różne heterologiczne sekwencje nukleotydów pochodzące od tych samych i/lub innych patogenów.
W niniejszym wynalazku opisano także sposoby immunizacji i szczepienia ś wiń przeciwko jednemu lub kilku patogenom świni, obejmujące podawanie skutecznych dawek preparatów immunogennych i szczepionek. Dawki wynoszą przykładowo od 104 do 107 DICC50.
Zgodnie z opisem podawanie tych preparatów immunogennych i szczepionek może być prowadzone przykładowo drogą przezśluzówkową, na przykład, doustnie, donosowo, do oka i/lub młodym zwierzętom posiadającym przeciwciała matczyne. Mogą również być stosowane inne standardowe sposoby szczepienia świń (w szczególności domięśniowa, śródskórna itp.).
W opisie ujawniono także sposoby uzyskiwania rekombinowanych wektorów PAV-3 i PAV-5, oraz zawierające je preparaty immunogenne i szczepionki.
Wektory te mogą być stosowane do wytwarzania preparatów immunogennych i szczepionek według wynalazku, w szczególności przeznaczonych do podawania przezśluzówkowo i/lub młodym zwierzętom posiadającym przeciwciała matczyne i/lub przeznaczone do podawania drogami konwencjonalnymi.
Ujawniono również fragment DNA PAV-5, który zawiera E3, i który w konkretnym szczepie tu stosowanym ma sekwencję nukleotydów podaną w SEK NR ID.: 5. Tym samym ujawniono także inne fragmenty tej sekwencji, a w szczególności każdy fragment zachowujący specyficzność PAV-5. Odnosi się to w szczególności do sekwencji 2064 do 4083 oraz jej fragmentów, a zwłaszcza sekwencji E3 PAV-5, która w odniesieniu do konkretnego stosowanego szczepu, jest określona przez nukleotydy 2382 do 4042, jak i jej fragmenty, w szczególności całość lub część sekwencji od 2389 do 3861 SEK NR ID.: 5. Jest oczywiste, że wynalazek ujawnia automatycznie sekwencje ekwiwalentne, to znaczy sekwencje niezmieniające funkcjonalności ani specyficzności szczepu PAV-5 opisanej sekwencji ani polipeptydów kodowanych przez tę sekwencję Oczywiście dotyczy to także sekwencji, które różnią się na skutek degeneracji kodu.
W opisie ujawniono także specyficzne sekwencje PAV-5, które są ekwiwalentne w takim znaczeniu, że są zdolne do hybrydyzacji do sekwencji podanej powyżej w warunkach wysokiej ostrości i/lub wykazują znaczną homologię do szczepów według wynalazku, w szczególności homologię wyższą lub równą 85%, w szczególności 90%, a zwłaszcza do 95%.
PL 205 524 B1
Wynalazek opisano poniżej bardziej szczegółowo za pomocą konkretnych sposobów jego realizacji, zamieszczonych jako nieograniczające go przykłady, oraz na załączonym Rysunku, na którym:
Opis Rysunku:
Fig. 1 przedstawia schemat plazmidów pKS-Prawy ITR3, pPolyll-Prawy ITR3 i pITRsPAV3,
Fig. 2 przedstawia schemat plazmidów pE3PAV3, pE3dl622CMV-EGFP i pE3dl622CMV-gD,
Fig. 3 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidów pE3PAV3 i pE3dl919,
Fig. 4 przedstawia schemat plazmidów pCMV-EGFP, pCMV-gD i pgD,
Fig. 5 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidów pCMV-EGFP, pgD, pE3dl919CMV-EGFP i pE3dl919CMV-gD,
Fig. 6 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidów pE3dl622EGFP i pE3dl919EGFP,
Fig. 7 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidów pE3dl622gD i pE3dl919CMV-gD,
Fig. 8 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidów pCR-Prawy ITR5, pCR-Lewy ITR5, pPolyllPrawy ITR5 i pITR-PAV5,
Fig. 9 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidu pE3PAV5,
Fig. 10 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidów pE3dl1472CMV-EGFP i pE3dl1472CMV-gD,
Fig. 11 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidów pE3dl1472EGFP i pE3dl1472gD,
Fig. 12 przedstawia mapę fizyczną PAV-5, trawienie BamHI, a
Fig. 13 przedstawia sekwencję 5614 par zasad (region E3 i przylegające sekwencje wirusa PAV-5).
Lista sekwencji:
SEK NR ID. 1: Oligonukleotyd ITRPAV3
SEK NR ID. 2: Oligonukleotyd T3
SEK NR ID. 3: Oligonukleotyd T7
SEK NR ID. 4: Oligonukleotyd ITRPAV5
SEK NR ID. 5: Sekwencja regionu E3 wirusa PAV-5
Przykłady
P r z y k ł a d 1: Komórki i wirusy
Podłoża hodowlane komórek i odczynniki były dostarczone przez Gibco BRL. Do podłoży (MEM
Dulbecco z Glutamax Kat. # 61965-026) dodawano 1 mM pirogronianu sodu (Kat # 11360-039), gentamycynę (50 μg/ml, Kat. # 15710-031) i 10% płodową surowicę cielęcą (Kat. # 10270-106 partia 40Q5774K).
Komórki PK-15 (nr ATCC CCL33) i ST (nr ATCC CRL 1756) były stosowane do hodowli wirusów. Dziki wirus adenowirus świni typu 3 (= PAV-3) niepatogenny u świni uzyskano z laboratorium Dr. Eva Nagy (Uniwersytet Guelph, Służba Patobiologii, 50 Stone Road Guelph, ONTARIO, Kanada, NIG 2W1) (Reddy P. i wsp., Virus Res. 1996, 43, 99-109).
Dziki wirus adenowirus świni typu 5 (= PAV-5) niepatogenny u świni uzyskano z laboratorium Dr. Tadashi Hirahara (Kyoto Biken Laboratories Inc., Dział Mikrobiologii Weterynaryjnej, 24-16 Makishima-cho, Ujishi, KYOTO, 611 Japonia) (Hirahara T. i wsp., J. Vet. Sci., 1990, 52, 407-409).
Warunki hodowli i pasaży: dwa razy w tygodniu komórki trypsynizuje się (roztwór 2,5% trypsyny (Sigma Kat. # 044-5075) rozcieńczony 50 razy w roztworze soli zrównoważonej Earle'a (Gibco BRL Kat. # 14155-030) i zawiesza ponownie w podłożu hodowlanym (rozcieńczenie 1:6). Komórki hoduje się w +37°C w obecności 5% CO2 przed ponownym umieszczeniem w hodowli.
P r z y k ł a d 2: Enzymy, bakterie, plazmidy i techniki biologii molekularnej
Enzymy restrykcyjne, polimeraza Taq do reakcji łańcuchowej polimerazy i inne enzymy potrzebne do różnych modyfikacji DNA były dostarczone, odpowiednio, przez New England BioLabs Inc., Roche Diagnostics i Gibco-BRL.
Wszystkie te enzymy były stosowane zgodnie z zaleceniami dostawców. Stosowano standardowe techniki biologii molekularnej, takie jak opisane w „Molecular Biology: A Laboratory Manual”, wydanie 2 (Sambrook i wsp., Cold Spring Harbor Laboratory, Nowy Jork, 1989).
Bakterie kompetentne BJ5183 (Hanahan D. J. Mol. Biol. 1983, 166, 557-580) były przygotowane w sposób następujący:
ml hodowli tych bakterii w fazie wzrostu wykładniczego przygotowano techniką chlorku wapnia (Sambrook i wsp. 1989). Zbierano je do końcowej objętości 2 ml 50 mM CaCl2. 300 μl tej zawiesiny bakterii mieszano z różnymi DNA odpowiednimi do rekombinacji homologicznej zawartymi w objętości 100 μl 100 mM Tris-HCl pH 7,4, pozostawiano w kontakcie przez 30 minut na topiącym się lodzie, a następnie bakterie poddawano szokowi termicznemu w temperaturze +45°C przez 2 minuty, po czym pozostawiano na topiącym się lodzie przez 10 minut, a następnie rozsiewano na podłożu selekcyjnym.
PL 205 524 B1
P r z y k ł a d 3: Ekstrakcja wirusowych DNA PAV-3 i PAV-5
Wirusy hodowano i namnażano w butelkach Falcon 10 cm2 w warunkach opisanych w Przykładzie 1. Gdy zakończono ECP, komórki zbierano, poddawano lizie poprzez 3 cykle zamrażania/rozmrażania a następnie klarowano zawiesinę wirusów przez wirowanie z niską prędkością. Wirusy PAV-3 i PAV-5 oczyszczano na gradiencie chlorku cezu (1,34 g/ml) i prążek wirusowy zbierano, oczyszczano, z otrzymaniem DNA wirusów po działaniu proteinazą K i ekstrakcji fenolem/chloroformem (Sambrook i wsp., 1989). Te DNA stosowano następnie do różnych etapów klonowania lub reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).
P r z y k ł a d 4: Konstrukcja plazmidu „PITRs PAV3”
Genomowy DNA wirusa PAV-3 przygotowany według Przykładu 3 strawiono EcoRI i fragment EcoRI o wielkości 245 bp wyizolowano po elektroforezie w żelu agarozowym. Fragment ten następnie zligowano z plazmidem pBlueScript KS (pBS-KS) (Stratagene Inc. La Jolla, CA) (GenBank # X52327), uprzednio strawiony EcoRI i defosforylowany, z wytworzeniem plazmidu określanego jako „pKSEcoDPAV3”.
Przeprowadzono reakcję PCR na matrycy plazmidu pKS-EcoDPAV3 z następującymi oligonukleotydami:
ITRPAV3 (SEK NR ID.: 1) (50 mer):
5' CCTTAATTAAGGTAGGGATAACAGGGTAATCATCATCAATAATATACCGC 3' I T3 (SEK NR ID.: 2) (20 mer):
5' ATTAACCCTCACTAAAGGGA 3'.
Produkt amplifikacji (367 bp) poddano działaniu polimerazy DNA T4 dla uzyskania „tępych końców”, a następnie strawiono ClaI, i zligowano z plazmidem pBS-KS, uprzednio strawionym ClaI i EcoRV, z wytworzeniem plazmidu okreś lanego jako „pKS-Prawy ITR3 (Fig. 1).
Następnie fragment EcoRI D wycięto z plazmidu pKS-Prawy ITR3 za pomocą trawienia enzymami BamHI i KpnI, i fragment restrykcyjny BamHI-KpnI 353 bp zligowano z plazmidem pPolyll (Lathe R. i wsp., Gene. 1987, 57, 193-201) (GenBank # G209113), uprzednio strawionym BamHI i KpnI, z wytworzeniem plazmidu okreś lanego jako „pPolyll-Prawy ITR3” (Fig. 1).
Genomowy DNA wirusa PAV-3 przygotowany według Przykładu 3 dla wyizolowania strawiono KpnI, po elektroforezie w żelu agarozowym, fragmentu końcowego KpnI F o wielkości 939 bp. Fragment ten zligowano z plazmidem pBS-KS, uprzednio strawionym KpnI i defosforylowanym, z wytworzeniem plazmidu określanego jako „pKS-KpnFPAV3”.
Następnie przeprowadzono reakcję PCR z matrycą plazmidu pKS-KpnFPAV3 i następującymi oligonukleotydami:
ITRPAV3 (SEK NR ID.: 1) (50 mer):
5' CCTTAATTAAGGTAGGGATAACAGGGTAATCATCATCAATAATATACCGC 3' i T7 (SEK NR ID.: 3):
5' TAATACGACTCACTATAGGG 3'.
Produkt amplifikacji (1086 bp) poddano działaniu polimerazy DNA T4 dla uzyskania „tępych końców”, a następnie strawiono enzymem XhoI i zligowano z plazmidem pPolyll-Prawy ITR3, uprzednio strawionym Bglll, poddanym działaniu polimerazy DNA T4, a następnie strawionym XhoI, z wytworzeniem plazmidu określanego jako „pITRsPAV3” (Fig. 1).
P r z y k ł a d 5: Konstrukcja plazmidu pPAV3
Plazmid pITRsPAV3 (Przykład 4) zlinearyzowano przez trawienie ClaI, a następnie kotransformowano do bakterii kompetentnych BJ5183 z genomowym DNA wirusa PAV-3 przygotowanym jak w przykładzie 2. Ta kotransformacja pozwoliła na uzyskanie, poprzez rekombinację homologiczną w Escherichia coli (Chartier C. i wsp., J. Virol. 1996, 70, 4805-4810) plazmidu zawierającego całkowity sklonowany genom PAV-3. Plazmid ten określono jako „pPAV3”.
P r z y k ł a d 6: Konstrukcja plazmidów wahadłowych PAV-3
6.1. Konstrukcja plazmidu z delecją 622 par zasad (mała delecja) w regionie E3.
Plazmid pNEB193 (New England BioLabs Kat. # 305-1) strawiono PacI, poddano działaniu polimerazy DNA T4 a następnie religowano sam ze sobą z wytworzeniem plazmidu „pNEBPac-”.
Plazmid pPAV3 (Przykład 5), dla wyizolowania fragmentu KpnI-BamHI o wielkości 4344 bp zawierający region E3 (Reddy i wsp., Virology. 1998, 251, 414-426) strawiono KpnI i BamHI. Fragment ten zligowano z plazmidem pNEBPac- (Fig. 2). Sekwencję fragmentu KpnI-BamHI sprawdzono i stwierdzono, ż e jest identyczna z sekwencją opublikowaną przez Reddy P. i wsp. (Virus Research.
PL 205 524 B1
1995, 36, 97-106 i Virology. 1998, 251, 414-426) (GenBank AN # U10433 i AN # AF083132). Specjalista może odnieść się do tych publikacji.
Plazmid pEGFP-F (Charlie M. i wsp., Science. 1994, 263, 802-805; Clontech Kat. # 6074-1) zmodyfikowano, dla całkowitego usunięcia polilinkera. Tę delecję uzyskano poprzez trawienie BamHI, a następnie działanie polimerazą DNA T4. Religacja tak zmodyfikowanego wektora samego ze sobą dała plazmid pCMV-EGFP. Następnie, dla wyizolowania fragmentu AsnI (tępy koniec) - Mlul (tępy koniec) o wielkości 1,6 kbp (= kaseta ekspresyjna CMV-EGFP) plazmid pCMV-EGFP strawiono enzymami AsnI i Mlul, i kolejno poddano działaniu polimerazy DNA T4. Fragment ten zligowano z plazmidem pE3PAV3 uprzednio strawionym BsrGI i SnaBI i poddanym działaniu polimerazy T4, z wytworzeniem plazmidu pE3dl622CMV-EGFP (Fig. 2). Delecja powstała pomiędzy miejscami BsrGI i SnaBI regionu E3 wirusa PAV-3 ma wielkość 622 par zasad. Ta delecja rozciąga się od nukleotydu 1002 do 1624 sekwencji opublikowanej przez P. Reddy i wsp. (Virus Research. 36, 97-106) (GenBank AN # U10433).
Plazmid pCMV-gD (Ambriovic i wsp., Virology. 1997, 238, 327-335) strawiono SnaBI i ClaI dla izolacji fragmentu SnaBI-Clal o wielkości 1,8 kbp (zawierającego część 3' promotora genu CMV i gen PRV gD). Następnie fragment ten poddano działaniu polimerazy DNA T4 dla uzyskania tępych końców, a następnie zligowano z plazmidem pE3dl622CMV-EGFP uprzednio strawionym SnaBI i Hpal, z wytworzeniem plazmidu pE3dl622CMV-gD (Fig. 2).
6.2. Konstrukcja plazmidu z delecją 919 par zasad (duża delecja) w regionie E3.
Plazmid pE3PAV3 (patrz część 6.1. powyżej) strawiono SgrAI i SacI dla wyizolowania fragmentu SgrAI-SacI o wielkości 644 bp. Fragment ten poddano działaniu polimerazy DNA T4 w celu uzyskania tępych końców, a następnie zligowano z plazmidem pNEBPac- (6.1. powyżej) uprzednio strawionym EcoRI, poddanym działaniu polimerazy DNA T4, a kolejno strawionym SacI, z wytworzeniem plazmidu pSgrAI-SacI.
Plazmid pE3PAV3 strawiono SnaBI i Hindlll dla wyizolowania fragmentu SnaBI-Hindlll o wielkości 2,4 kbp. Fragment ten zligowano z plazmidem pSgrAI-SacI uprzednio strawionym Pmel i Hindlll, z wytworzeniem plazmidu pE3dl919 (Fig. 3). Delecja powstała między miejscami SacI i SnaBI regionu E3 wirusa PAV-3 ma wielkość 919 par zasad. Ta delecja obejmuje nukleotydy od 706 do 1624 sekwencji opublikowanej przez P. Reddy i wsp. (Virus Research. 36, 97-106) (GenBank AN # U10433).
Plazmid pCMV-gD (Przykład 6.1) strawiono SnaBI i ClaI, dla wyizolowania fragmentu SnaBIClal o wielkości 1,8 kbp. Fragment ten następnie poddano działaniu fragmentu Klenowa polimerazy DNA, aby uzyskać tępe końce, a następnie zligowano z plazmidem pCMV-EGFP (Przykład 6.1) uprzednio strawionym SnaBI i Hpal, a kolejno defosforylowanym, z wytworzeniem plazmidu pgD (Fig. 4).
Plazmid pCMV-EGFP (Przykład 6.1) strawiono AsnI i Mlul dla wyizolowania fragmentu AsnIMluI o wielkości 1,8 kbp (kaseta CMV-EGFP). Fragment ten poddano działaniu fragmentu Klenowa polimerazy DNA, aby uzyskać tępe końce, a następnie zligowano z plazmidem pE3dl919 uprzednio strawionym AscI i poddanym działaniu fragmentu Klenowa polimerazy DNA, aby uzyskać tępe końce, a następnie defosforylowanym, z wytworzeniem plazmidu pE3dl919CMV-EGFP (Fig. 5).
Plazmid pgD (powyżej) strawiono AsnI i Mlul dla wyizolowania fragmentu AsnI-MluI o wielkości 2,3 kbp. Fragment ten poddano działaniu polimerazy DNA T4, aby uzyskać tępe końce, a następnie zligowano z plazmidem pE3dl919 uprzednio strawionym AscI i poddanym działaniu fragmentu Klenowa polimerazy DNA, aby uzyskać tępe końce, a następnie defosforylowanym, z wytworzeniem plazmidu pE3dl919CMV-gD (Fig. 5).
P r z y k ł a d 7: Konstrukcja zrekombinowanych genomów pPAV3dl622CMV-EGFP i pPAV3dl622CMV-gD
Plazmid pE3dl622CMV-EGFP (Przykład 6.1) strawiono KpnI i BamHI, dla wyizolowania fragmentu KpnI-BamHI o wielkości 5,5 kbp. Fragment ten kotransformowano do bakterii kompetentnych BJ5183 z plazmidem pPAV3 (Przykład 5) linearyzowanym przez trawienie enzymem SnaBI. Ta kotransformacja doprowadziła do uzyskania poprzez rekombinację homologiczną w Escherichia coli plazmidu pPPAVdl622CMV-EGFP.
Plazmid pE3CMVgD (Przykład 6.1) strawiono EcoRI i Pmel, dla wyizolowania fragmentu EcoRIPmel o wielkości 0,6 kbp. Fragment ten kotransformowano do bakterii kompetentnych BJ5183 z plazmidem pPAV3 (Przykład 5) linearyzowanym przez trawienie enzymem SnaBI. Ta kotransformacja doprowadziła do uzyskania poprzez rekombinację homologiczną w Escherichia coli plazmidu pPAV3dl622CMVgD.
P r z y k ł a d 8: Konstrukcja zrekombinowanych genomów pPAV3dl919CMV-EGFP i pPAV3dl919CMV-gD
Plazmid pE3dl919CMV-EGFP (Przykład 6.2) zlinearyzowano Hindlll, a następnie kotransformowano do bakterii kompetentnych BJ5183 z plazmidem pPAV3 (Przykład 5) linearyzowanym przez
PL 205 524 B1 trawienie enzymem SnaBI. Ta kotransformacja doprowadziła do uzyskania poprzez rekombinację homologiczną w Escherichia coli plazmidu pPAV3dl919CMV-EGFP.
Plazmid pE3dl919CMV-gD (Przykład 6.2) zlinearyzowano Hindlll, a następnie kotransformowano do bakterii kompetentnych BJ5183 z plazmidem pPAV3 (Przykład 5) linearyzowanym przez trawienie enzymem SnaBI. Ta kotransformacja doprowadziła do uzyskania poprzez rekombinację homologiczną w Escherichia coli plazmidu pPAV3dl919CMV-gD.
P r z y k ł a d 9: Konstrukcja zrekombinowanych genomów pPAV3dl622EGFP, pPAV3dl622gD, pPAV3dl919EGFP i pPAV3dl919gD (wstawienie sekwencji kodujących do sekwencji promotora CMV)
9.1 Konstrukcja plazmidów pE3dl622EGFP i pE3dl919EGFP
Plazmid pCMV-EGFP (Przykład 6.1) strawiono Nhel i Mlul dla wyizolowania fragmentu NhelMlul o wielkości 1,0 kbp. Fragment ten poddano działaniu fragmentu Klenowa polimerazy DNA, aby uzyskać tępe końce, a następnie zligowano z plazmidem pE3PAV3 (Przykład 6.1) uprzednio strawionym BsrGI, poddanym działaniu fragmentu Klenowa polimerazy DNA, a kolejno strawionym SnaBI, z wytworzeniem plazmidu pE3dl622EGFP (Fig. 6).
Plazmid pCMV-EGFP strawiono Nhel i Mlul dla wyizolowania fragmentu Nhel-Mlul o wielkości 1,0 kbp. Fragment ten poddano działaniu fragmentu Klenowa polimerazy DNA, aby uzyskać tępe końce, a następnie zligowano z plazmidem pE3dl919 uprzednio strawionym AscI, poddanym działaniu fragmentu Klenowa polimerazy DNA, a kolejnym defosforylowanym, z wytworzeniem plazmidu pE3dl919EGFP (Fig. 6).
9.2 Konstrukcja plazmidów pE3dl622gD i pE3dl919gD
Plazmid pgD (Przykład 6.2) strawiono Xhol i ClaI dla wyizolowania fragmentu Xhol-Clal o wielkości 1,5 kbp. Fragment ten poddano działaniu fragmentu Klenowa polimerazy DNA, aby uzyskać tępe końce, a następnie zligowano z plazmidem pE3PAV3 (Przykład 6.1) uprzednio strawionym BsrGI, poddanym działaniu fragmentu Klenowa polimerazy DNA, a kolejno strawionym SnaBI, z wytworzeniem plazmidu pE3dl622gD (Fig. 7).
Plazmid pgD (Przykład 6.2) strawiono Xhol i ClaI dla wyizolowania fragmentu Xhol-Clal o wielkości 1,5 kbp. Fragment ten poddano działaniu fragmentu Klenowa polimerazy DNA, aby uzyskać tępe końce, a następnie zligowano z plazmidem pE3dl919 (Przykład 6.2) uprzednio strawionym Asel, poddanym działaniu fragmentu Klenowa polimerazy DNA, a następnie defosforylowanym, z wytworzeniem plazmidu pE3dl919gD (Fig. 7).
9.3. Konstrukcja plazmidów pPAV3dl622EGFP, pPAV3dl622gD, pPAV3dl919EGFP, pPAV3dl919gD
Plazmid pE3dl622EGFP (Przykład 9.1) strawiono KpnI i BamHI, a następnie kotransformowano do bakterii kompetentnych BJ5183 z plazmidem pPAV3 (Przykład 5) uprzednio linearyzowanym przez trawienie enzymem SnaBI. Ta kotransformacja doprowadziła do uzyskania poprzez rekombinację homologiczną w Escherichia coli plazmidu pPAV3dl622EGFP.
Plazmid pE3dl622gD (Przykład 9.2) strawiono EcoRI i Pmel, a następnie kotransformowano do bakterii kompetentnych BJ5183 z plazmidem pPAV3 (Przykład 5) uprzednio linearyzowanym przez trawienie enzymem SnaBI. Ta kotransformacja doprowadziła do uzyskania poprzez rekombinację homologiczną w Escherichia coli plazmidu pPAV3dl622gD.
Plazmid pE3dl919EGFP (Przykład 9.1) zlinearyzowano przez trawienie Hindlll, a następnie kotransformowano do bakterii kompetentnych BJ5183 z plazmidem pPAV3 (Przykład 5) uprzednio linearyzowanym przez trawienie enzymem SnaBI. Ta kotransformacja doprowadziła do uzyskania poprzez rekombinację homologiczną w Escherichia coli plazmidu pPAV3dl919EGFP.
Plazmid pE3dl919gD (Przykład 9.2) zlinearyzowano przez trawienie Hindlll, a następnie kotransformowano do bakterii kompetentnych BJ5183 z plazmidem pPAV3 (Przykład 5) uprzednio linearyzowanym przez trawienie enzymem SnaBI. Ta kotransformacja doprowadziła do uzyskania poprzez rekombinację homologiczną w Escherichia coli plazmidu pPAV3dl919gD.
P r z y k ł a d 10: Uzyskanie zrekombinowanych wirusów PAV3 przez transfekcję zrekombinowanymi genomami PAV3 sklonowanymi w Escherichia coli
Komórki PK-15 lub ST (patrz przykład 1) transfekowano w płytce sześciostudzienkowej z gęstością konfluencji 60-80% za pomocą 2 μg zrekombinowanego genomowego DNA PAV-3 uprzednio trawionego PacI, rozcieńczonego w obecności 4 do 12 μl LipofectAMINE (Gibco-BRL Kat. # 18324012) w zależności od linii komórkowej.
PL 205 524 B1
Po transfekcji w warunkach zalecanych przez dostawcę, komórki pozostawiono w hodowli przez kilka dni, aż do pojawienia się ECP wirusowego. Przeprowadza się wówczas nowy pasaż komórek w hodowli aby zamplifikować uzyskany zrekombinowany wirus.
Transfekcja przeprowadzona plazmidem pPAV3dl622CMV-EGFP (Przykład 7) dostarczyła zrekombinowanego wirusa vPAV3-1.
Transfekcja przeprowadzona plazmidem pPAV3dl622CMV-gD (Przykład 7) dostarczyła zrekombinowanego wirusa vPAV3-2.
Transfekcja przeprowadzona plazmidem pPAV3dl919CMV-EGFP (Przykład 8) dostarczyła zrekombinowanego wirusa vPAV3-3.
Transfekcja przeprowadzona plazmidem pPAV3dl919CMV-gD (Przykład 8) dostarczyła zrekombinowanego wirusa vPAV3-4.
Transfekcja przeprowadzona plazmidem pPAV3dl622EGFP (Przykład 9.3) dostarczyła zrekombinowanego wirusa vPAV3-5.
Transfekcja przeprowadzona plazmidem pPAV3dl622gD (Przykład 9.3) dostarczyła zrekombinowanego wirusa vPAV3-6.
Transfekcja przeprowadzona plazmidem pPAV3dl919EGFP (Przykład 9.3) dostarczyła zrekombinowanego wirusa vPAV3-7.
Transfekcja przeprowadzona plazmidem pPAV3dl919gD (Przykład 9.3) dostarczyła zrekombinowanego wirusa vPAV3-8.
P r z y k ł a d 11: Konstrukcja plazmidu pITRsPAV5
11.1 Klonowanie końcowego prawego fragmentu genomowego
Genomowy DNA wirusa PAV-5 przygotowany według Przykładu 3 strawiono EcoRI i końcowy prawy fragment EcoRI o wielkości 0,9 kbp wyizolowano po elektroforezie w żelu agarozowym. Fragment ten zligowano z plazmidem pBS-KS uprzednio strawionym EcoRI i defosforylowanym, z wytworzeniem plazmidu „pKS-Prawy-ITR5”.
Kolejno przeprowadzono reakcję PCR z matrycą plazmidu pKS-Prawy ITR5 i następującymi oligonukleotydami:
ITRPAV5 (SEK NR ID.: 4) (50 mer):
5' CCTTAATTAAGGTAGGGATAACAGGGTAATCATCATCAATAATATACGGA 3' i T3 (SEK NR ID.: 2) (20 mer):
5' ATTAACCCTCACTAAAGGGA 3', z wytworzeniem fragmentu 1,0 kbp. Fragment ten ligowano z plazmidem pCRII (InVitrogen Original TA Cloning Kit Kat. # K2000-01), z wytworzeniem plazmidu „pCR-Prawy ITR5” (Fig. 8).
11.2 Klonowanie końcowego lewego fragmentu genomowego
Genomowy DNA wirusa PAV-5 przygotowany według Przykładu 3 strawiono Hindlll i końcowy lewy fragment Hindlll o wielkości 1,2 kbp wyizolowano po elektroforezie w żelu agarozowym. Fragment ten zligowano z plazmidem pBS-KS uprzednio strawionym Hindlll i defosforylowanym, z wytworzeniem plazmidu „pKS-Lewy-ITR5”.
Następnie przeprowadzono reakcję PCR z matrycą plazmidu pKS-Lewy ITR5 i następującymi oligonukleotydami:
ITRPAV5 (SEK NR ID.: 4):
5' CCTTAATTAAGGTAGGGATAACAGGGTAATCATCATCAATAATATACGGA 3' i T7 (SEK NR ID.: 3) (20 mer):
5' TAATACGACTCACTATAGGG 3', z wytworzeniem fragmentu 1,3 kbp. Fragment ten zligowano z plazmidem pCRII, z wytworzeniem plazmidu „pCR-Lewy ITR5” (Fig. 8).
11.3 Konstrukcja plazmidu pPolyll-Prawy ITR5
Plazmid pCR-Prawy ITR5 (Przykład 11.1) strawiono BamHI i Hindlll, dla wyizolowania fragmentu BamHI-Hindlll o wielkości 1,0 kbp. Następnie fragment ten zligowano z plazmidem pPolyll (patrz przykład
4) uprzednio strawionym BamHI i Hindlll, z wytworzeniem plazmidu „pPolyll-Prawy ITR5” (Fig. 8).
11.4 Konstrukcja plazmidu pITRsPAV5
Plazmid pCR-Lewy ITR5 (Przykład 11.2) strawiono BamHI i Hindlll, dla wyizolowania fragmentu BamHI-Hindlll o wielkości 1,3 kbp. Następnie fragment ten zligowano z plazmidem pPolyll-Prawy ITR5 uprzednio strawionym Bglll i Hindlll, z wytworzeniem plazmidu „pITRs PAV5” (Fig. 8).
PL 205 524 B1
P r z y k ł a d 12: Konstrukcja plazmidu pPAV5
Plazmid pITRsPAV5 zlinearyzowano za pomocą Hindlll. Uzyskany fragment kotransformowano do bakterii kompetentnych BJ5183 z genomowym DNA wirusa PAV-5 przygotowanego według Przykładu 3. Ta kotransformacja doprowadziła do uzyskania poprzez rekombinację homologiczną plazmidu zawierającego cały genom wirusa PAV-5. Plazmid ten nazwano „pPAV5”.
P r z y k ł a d 13: Konstrukcja plazmidów wahadłowych PAV-5
13.1. Konstrukcja plazmidu wahadłowego E3 PAV-5
Plazmid pPAV5 (Przykład 12) strawiono Sad i Mlul, dla wyizolowania fragmentu Sacl-Mlul o wielkości 4372 bp zawierający region E3. Fragment ten zligowano z plazmidem pNEB193 (Przykład 6.1) uprzednio strawionym Smal i AscI, z wytworzeniem plazmidu „pE3PAV5” (Fig. 9).
Fragment Sacl-Mlul sklonowany w plazmidzie pE3PAV5 w całości zsekwencjonowano i zanalizowano. Analiza tej sekwencji i sekwencji przylegających obecnych na plazmidzie pPAV5 potwierdziła, że sklonowany fragment w istocie przedstawia region E3 wirusa pAV-5. Sekwencja tego regionu (5614 par zasad (SEK NR ID. 5) jest przedstawiona na Fig. 13.
13.2 Konstrukcja plazmidów dawców CMV-EGFP i CMV-PRV gD z delecją 1472 par zasad w regionie E3
Plazmid pCMV-EGFP (Przykład 6.1) strawiono enzymami AsnI i Mlul, a następnie poddano działaniu polimerazy T4 dla wyizolowania fragmentu AsnI (tępy koniec) - Mlul (tępy koniec) o wielkości 1,6 kbp. Następnie fragment ten zligowano z plazmidem pE3PAV5 (Przykład 13.1) uprzednio strawionym PvuII i Bglll, i poddanym działaniu polimerazy DNA T4, z wytworzeniem plazmidu pE3dl1472-CMV-EGFP (Fig. 10). Delecja jest zawarta między nukleotydami 2389 i 3861 sekwencji przedstawionej na Fig. 13 (SEK NR ID.: 5).
Plazmid pgD (Przykład 6.1) strawiono enzymami AsnI i Mlul dla wyizolowania fragmentu AsnIMluI o wielkości 2,3 kbp. Następnie fragment ten poddano działaniu polimerazy T4, aby uzyskać tępe końce i zligowano z plazmidem pE3PAV5 uprzednio strawionym PvuII i Bglll i poddanym działaniu polimerazy DNA T4, z wytworzeniem plazmidu pE3dl1472CMVgD (Fig. 10).
Plazmid pCMV-EGFP strawiono enzymami Nhel i Mlul dla wyizolowania fragmentu Nhel-Mlul o wielkości 1,0 kbp. Fragment ten poddano działaniu fragmentu Klenowa polimerazy DNA, aby uzyskać tępe końce i zligowano z plazmidem pE3PAV5 uprzednio strawionym PvuII i Bglll i poddanym działaniu polimerazy DNA T4, z wytworzeniem plazmidu pE3dl1472EGFP (Fig. 11).
Plazmid pCMVgD (Przykład 6.1) strawiono enzymami XhoI i ClaI dla wyizolowania fragmentu XhoI-ClaI o wielkości 1,5 kbp. Fragment ten poddano działaniu fragmentu Klenowa polimerazy DNA, aby uzyskać tępe końce i zligowano z plazmidem pE3PAV5 uprzednio strawionym PvuII i Bglll i poddanym działaniu polimerazy DNA T4, z wytworzeniem plazmidu pE3dl1472gD (Fig. 11).
P r z y k ł a d 14: Konstrukcja zrekombinowanych genomów pPAV5dl1472CMV-EGFP i pPAV5dl1472CMV-gD
Plazmid pE3dl1472CMV-EGFP (Przykład 13.2) zlinearyzowano przez trawienie Pmel, a następnie kotransformowano do bakterii kompetentnych BJ5183 z plazmidem pPAV5 (Przykład 12) uprzednio linearyzowanym przez częściowe trawienie enzymem BamHI (miejsce styku podfragmentów restrykcyjnych BamHI A-BamHI-D, Fig. 12). Ta kotransformacja doprowadziła do uzyskania poprzez rekombinację homologiczną w Escherichia coli plazmidu pPAV5dl1472CMV-EGFP.
Plazmid pE3dl1472CMVgD (Przykład 13.2) zlinearyzowano przez trawienie Pmel, a następnie kotransformowano do bakterii kompetentnych BJ5183 z plazmidem pPAV5 (Przykład 12) uprzednio linearyzowanym przez częściowe trawienie enzymem BamHI (miejsce styku podfragmentów restrykcyjnych BamHI A-BamHI-D, Fig. 12). Ta kotransformacja doprowadziła do uzyskania poprzez rekombinację homologiczną w Escherichia coli plazmidu pPAV5dl1472CMV-gD.
P r z y k ł a d 15: Konstrukcja genomów zrekombinowanych pPAV5dl472EGFP i pPAV5dI1472 gD (wstawienie sekwencji kodujących do sekwencji promotora CMV).
Plazmid pE3dl1472EGFP (Przykład 13.2) zlinearyzowano przez trawienie Pmel, a następnie kotransformowano do bakterii kompetentnych BJ5183 z plazmidem pPAV5 (Przykład 12) uprzednio linearyzowanym przez częściowe trawienie enzymem BamHI (miejsce styku podfragmentów restrykcyjnych BamHI A-BamHI-D, Fig. 12). Ta kotransformacja doprowadziła do uzyskania poprzez rekombinację homologiczną w Escherichia coli plazmidu pPAV5dl1472EGFP.
Plazmid pE3dl1472gD (Przykład 13.2) zlinearyzowano przez trawienie Pme-I, a następnie kotransformowano do bakterii kompetentnych BJ5183 z plazmidem pPAV5 (Przykład 12) uprzednio linearyzowanym przez częściowe trawienie enzymem BamHI (miejsce styku podfragmentów restrykcyj14
PL 205 524 B1 nych BamHI A-BamHI-D, Fig. 12). Ta kotransformacja doprowadziła do uzyskania poprzez rekombinację homologiczną w Escherichia coli plazmidu pPAV5dl1472gD.
P r z y k ł a d 16: Otrzymanie wirusów PAV-5 zrekombinowanych przez transfekcję zrekombinowanymi genomami PAV-5 klonowanymi w Escherichia coli.
Komórki PK-15 lub ST (patrz przykład 1) transfekowano w płytce sześciostudzienkowej z gęstością konfluencji 60-80% za pomocą 2 μg genomowego DNA zrekombinowanego PAV-5 uprzednio trawionego PacI, rozcieńczonego w obecności 4 do 12 μl LipofectAMINE (Gibco-BRL Kat. # 18324012) w zależności od linii komórkowej.
Po transfekcji w warunkach zalecanych przez dostawcę, komórki pozostawiono w hodowli przez kilka dni, aż do pojawienia się ECP wirusowego. Przeprowadza się wówczas nowy pasaż komórek w hodowli, aby zamplifikować uzyskany wirus zrekombinowany.
Transfekcja przeprowadzona plazmidem pPAV5dl1472CMV-EGFP (Przykład 14) dostarczyła zrekombinowanego wirusa vPAV5-1.
Transfekcja przeprowadzona plazmidem pPAV5dl1472CMV-gD (Przykład 14) dostarczyła zrekombinowanego wirusa vPAV5-2.
Transfekcja przeprowadzona plazmidem pPAV5dl1472EGFP (Przykład 15) dostarczyła zrekombinowanego wirusa vPAV5-3.
Transfekcja przeprowadzona plazmidem pPAV5dl1472gD (Przykład 15) dostarczyła zrekombinowanego wirusa vPAV5-4.
P r z y k ł a d 19: Produkcja szczepionek według wynalazku
Zrekombinowane wirusy otrzymane zgodnie z wynalazkiem hoduje się oraz namnaża w hodowli komórek PK-15. Po zaobserwowaniu całkowitego efektu cytopatogennego zbiera się supernatanty. Po klarowaniu za pomocą wirowania z niską prędkością, aby usunąć osady komórkowe, a następnie wirowaniu, aby zatężyć wiriony i płukaniu osadów wirusów, osad zawiesza się w roztworze podłoża hodowlanego. Mierzy się miano tych zawiesin. Następnie miano wirusów ewentualnie nastawia się poprzez rozcieńczenie, aby uzyskać końcowe miano zawarte pomiędzy 104 dawek zakaźnych 50% w hodowli komórek (DICC50) a 107 DICC50/ml.
Zawiesiny wirusowe mogą być albo zamrażane albo korzystnie liofilizowane w obecności substratu liofilizacji.
P r z y k ł a d 20: Szczepienie świń
Po rozmrożeniu lub po zawieszeniu dawek liofilizowanych w wodzie dla preparatów do wstrzykiwania, i ewentualne dodaniu adiuwantu, świnie szczepi się dawkami 104 do 107 DICC50 każdego zrekombinowanego wirusa. Szczepionki te zawierają jeden lub więcej zrekombinowanych wirusów PAV, z których każdy eksprymuje inne immunogeny.
Szczepionki podaje się albo poprzez iniekcję igłą (droga domięśniowa) albo przezśluzówkowo (droga donosowa albo do oka), przy czym objętości dostosowuje się każdorazowo do drogi podawania.
Podawanie szczepionek drogą domięśniową jest także możliwe za pomocą iniektora bez igły, takiego jak PIGJET (Societe Endoscoptic, Laon, Francja).
P r z y k ł a d 21: Protokół szczepienia/badanie pod kątem choroby Aujeszky'ego
Protokół szczepienia/badania wprowadzono dla oceny skuteczności szczepionki złożonej z zawiesiny zrekombinowanego wirusa vPAV3-2 bez adiuwantu (Przykład 10 niniejszego wynalazku).
Ustanowiono grupy 6 prosiaków w wieku od 8 do 10 tygodni urodzonych z macior, które szczepiono przeciwko wirusowi choroby Aujeszky'ego (PRV) na początku ciąży. Wszystkie prosiaki posiadały matczyne przeciwciała anty-PRV w 1 dniu szczepienia. Prosiaki grupy 1 i 2 zaszczepiono w dniu 0 drogą poprzez nos z 1 mililitrem (ml) zawiesiny zrekombinowanego wirusa vPAV3-2 (PAV-3/PRV gD) o mianie 107 DICC50/ml (0,5 ml/nozdrze). Grupę 2 szczepiono w ten sam sposób, ale grupa ta dostała również drugą dawkę w dniu 21. Grupa 3 otrzymała w dniu 0 drogą domięśniową 1 ml zawiesiny wirusa PAV-3/gD o mianie 107 DICC50/ml. Grupę 4 szczepiono w ten sam sposób jak grupę 3, ale grupa ta otrzymała drugi zastrzyk zawiesiny wirusowej w dniu 21. Grupa 5 nie była szczepiona i służyła jako kontrola negatywna dla doświadczenia. Wszystkie grupy badano w dniu 35 przez podanie 2 ml (1 ml na nozdrze) zawiesiny szczepu PRV NIA3 z mianem przynajmniej 107,3 pfu/ml. Po badaniu śledzono świnie pod kątem kryterium zmiany masy ciała (delta G7) (Stellman C. i wsp., J. Biol. Standard. 1989, 17, 1-11) (dzień 0 i dzień 7 po badaniu), poziomu wydzielania wirusów na poziomie śluzówek nosa oraz miana przeciwciał ELISA i odczynu seroneutralizacji anty-PRV.
PL 205 524 B1
Jest oczywistym, że zakres wynalazku określają załączone zastrzeżenia i nie jest on ograniczony do jakichkolwiek konkretnych postaci wykonania omówionych w powyższym opisie, lecz obejmuje również ich warianty, które nie wykraczają poza zdefiniowany zastrzeżeniami zakres.

Claims (14)

1. Rekombinowany świński adenowirus serotypu 3 (PAV3) lub serotypu 5 (PAV5), który zawiera co najmniej jeden kwas nukleinowy kodujący co najmniej jeden immunogen, przy czym heterologiczny kwas nukleinowy jest wstawiony w region E3 genomu PAV-3 lub PAV5 zdolnego do replikacji in vivo i wyrażającego immunogen, który to immunogen jest wybrany z grupy składającej się z: immunogenu świńskiego cirkowirusa typu 2, gB wirusa pseudowścieklizny, gC wirusa pseudowścieklizny, immunogenu wirusa świńskiej grypy, VP2 wirusa parwowirozy, ORF3 wirusa zespołu rozrodczego i oddechowego ś wiń , ORF4 wirusa zespoł u rozrodczego i oddechowego ś wiń , ORF6 wirusa zespoł u rozrodczego i oddechowego świń, ORF7 wirusa zespołu rozrodczego i oddechowego świń, wirusa klasycznego pomoru świń EO, wirusa klasycznego pomoru świń E1 oraz immunogenu Actinobacillus pleuropneumoniae.
2. Adenowirus wedł ug zastrz. 1, znamienny tym, ż e heterologiczny kwas nukleinowy jest wstawiony w region E3 genomu PAV-3, w obszar insercji, który w szczepie PAV-3 ma sekwencję przedstawioną przez SEK NR ID.: 6.
3. Adenowirus wedł ug zastrz. 1, znamienny tym, ż e heterologiczny kwas nukleinowy jest wstawiony w region E3 genomu PAV-5, w obszar insercji, który w szczepie PAV-5 obejmuje nukleotydy 2389 do 3861 SEK NR ID.: 5.
4. Adenowirus wedł ug zastrz. 1-3, znamienny tym, ż e obszar insercji obejmuje delecję .
5. Adenowirus wedł ug jednego z zastrz. 1-4, znamienny tym, ż e heterologiczny kwas nukleinowy koduje co najmniej jeden immunogen świńskiego cirkowirusa typu 2.
6. Adenowirus według zastrz. 5, znamienny tym, ż e heterologiczny kwas nukleinowy koduje ORF1, ORF2 lub ORF1 i ORF2 świńskiego cirkowirusa typu 2.
7. Adenowirus wedł ug jednego z zastrz. 1-6, znamienny tym, ż e heterologiczny kwas nukleinowy koduje HA, NA i/lub NP wirusa świńskiej grypy.
8. Adenowirus wedł ug jednego z zastrz. 1-7, znamienny tym, ż e obejmuje sekwencję heterologicznego kwasu nukleinowego kodującą świńską cytokinę.
9. Adenowirus według zastrz. 8, znamienny tym, że świńska cytokina jest wybrana z grupy składającej się z GM-CSF, IL-4, IL-12 i IL-18.
10. Rekombinowana świńska szczepionka, znamienna tym, że zawiera rekombinowany świński wirus PAV-3 i/lub PAV-5 jak określony w zastrz. 1-9 i dopuszczalne weterynaryjnie nośnik lub zaróbkę.
11. Rekombinowana świńska szczepionka według zastrz. 10, znamienna tym, że zawiera wiele rekombinowanych świńskich adenowirusów PAV-3 i/lub PAV-5 jak określone w jednym z zastrz. 1-9, obejmujących różne sekwencje heterologiczne.
12. Szczepionka według zastrz. 10 albo 11, znamienny tym, że zawiera adiuwant.
13. Szczepionka według zastrz. 12, znamienny tym, że adiuwant jest wybrany spośród polimerów kwasu akrylowego lub kwasu metakrylowego i z kopolimerów kwasu maleinowego i pochodnej alkenylowej.
14. Szczepionka według zastrz. 12, znamienny tym, że adiuwantem jest karbomer.
PL350182A 1999-02-11 2000-02-08 Rekombinowany świński adenowirus oraz zawierająca go szczepionka PL205524B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9901813A FR2789695B1 (fr) 1999-02-11 1999-02-11 Vecteurs et vaccins viraux a base d'adenovirus porcins recombines et replicatifs

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL350182A1 PL350182A1 (en) 2002-11-18
PL205524B1 true PL205524B1 (pl) 2010-04-30

Family

ID=9542037

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL350182A PL205524B1 (pl) 1999-02-11 2000-02-08 Rekombinowany świński adenowirus oraz zawierająca go szczepionka

Country Status (16)

Country Link
US (1) US7109025B1 (pl)
EP (1) EP1151121B1 (pl)
JP (1) JP2002537766A (pl)
KR (1) KR100818673B1 (pl)
CN (2) CN1869243B (pl)
AT (1) ATE316580T1 (pl)
AU (1) AU781195B2 (pl)
BR (1) BR0008205A (pl)
CA (1) CA2362454C (pl)
DE (1) DE60025701T2 (pl)
DK (1) DK1151121T3 (pl)
ES (1) ES2258970T3 (pl)
FR (1) FR2789695B1 (pl)
MX (1) MXPA01008069A (pl)
PL (1) PL205524B1 (pl)
WO (1) WO2000047756A1 (pl)

Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040224327A1 (en) * 1996-10-30 2004-11-11 Meulenberg Johanna Jacoba Maria Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
EP0839912A1 (en) * 1996-10-30 1998-05-06 Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
FR2772047B1 (fr) * 1997-12-05 2004-04-09 Ct Nat D Etudes Veterinaires E Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection
JP3961222B2 (ja) * 1999-03-08 2007-08-22 ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ ゲーエムベーハー Ｐｒｒｓｖワクチン
DK2251419T3 (da) * 1999-04-22 2012-07-02 Us Agriculture Porcint reproduktions- og respirations-syndrom-vaccine baseret på isolat JA-142
WO2001083737A2 (en) * 2000-05-03 2001-11-08 University Of Guelph Porcine adenovirus type 5 vector and vaccine
PL202951B1 (pl) 2001-03-27 2009-08-31 Univ Saskatchewan Sposoby hodowli wirusów rodzaju cirkowirus
US7906311B2 (en) 2002-03-20 2011-03-15 Merial Limited Cotton rat lung cells for virus culture
BRPI0510928A (pt) 2004-06-18 2007-11-13 Univ Minnesota identificação de organismos viralmente infectados e vacinados
US7632636B2 (en) * 2004-09-21 2009-12-15 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Porcine reproductive and respiratory syndrome isolates and methods of use
US7700285B1 (en) 2005-12-29 2010-04-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. PCV2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions
UA95602C2 (ru) 2004-12-30 2011-08-25 Берингер Ингельхейм Ветмедика, Инк. Иммуногенная композиция цвс2 и способы приготовления такой композиции
US7833707B2 (en) * 2004-12-30 2010-11-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2
ES2386973T3 (es) 2005-06-24 2012-09-10 Regents Of The University Of Minnesota Virus PRRS, clones infecciosos, mutantes de los mismos, y métodos de utilización
CN102698263B (zh) 2005-12-29 2016-07-06 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 多价pcv2免疫原性组合物和制备此类组合物的方法
ES2572736T3 (es) 2005-12-29 2016-06-02 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Uso de una composición inmunógena para atenuar síntomas clínicos en cerdos
EP2101815A4 (en) 2006-12-11 2010-10-06 Boehringer Ingelheim Vetmed EFFICIENT PROCESS FOR THE TREATMENT OF PORCINE CIRCOVIRUS AND LAWSONIA INTRACELLULARIS INFECTIONS
AU2007333857B2 (en) 2006-12-15 2014-05-15 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Treatment of pigs with PCV2 antigen
EP1941903A1 (en) 2007-01-03 2008-07-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prophylaxis and treatment of PRDC
EP1958644A1 (en) 2007-02-13 2008-08-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prevention and treatment of sub-clinical pcvd
US7829274B2 (en) 2007-09-04 2010-11-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Reduction of concomitant infections in pigs by the use of PCV2 antigen
EP2231182A4 (en) * 2007-12-31 2012-08-22 Boehringer Ingelheim Vetmed PCV2-ORF2-VIRUSELY PARTICLES WITH FREMDAMINO-ACID INSERTION
KR20100113582A (ko) 2008-01-23 2010-10-21 베링거잉겔하임베트메디카인코퍼레이티드 Ｐｃｖ2 마이코플라즈마 히오뉴모니에 면역원성 조성물 및 당해 조성물의 생산 방법
US8444989B1 (en) * 2008-04-18 2013-05-21 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh One dose vaccination against mycoplasma infections of pigs
MX2011002046A (es) * 2008-08-25 2011-04-21 Boehringer Ingelheim Vetmed Vacuna contra sindrome disgenesico y respiratorio porcino altamente patogeno (hp prrs).
AU2009100018B4 (en) * 2008-10-15 2009-09-03 Australasian Pork Research Institute Ltd A Method of vaccination
US20100150959A1 (en) * 2008-12-15 2010-06-17 Vectogen Pty Ltd. PCV 2-Based Methods and Compositions for the Treatment of Pigs
AR078253A1 (es) 2009-09-02 2011-10-26 Boehringer Ingelheim Vetmed Metodos para reducir la actividad antivirica en composiciones pcv-2 y composiciones pcv-2 con mejor inmunogenicidad
MY161198A (en) 2011-02-17 2017-04-14 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Novel european prrsv strain
UA112860C2 (uk) 2011-02-17 2016-11-10 Бьорінгер Інгельхайм Ветмедіка Гмбх Спосіб одержання prrsv у комерційному масштабі
EP2737058A1 (en) 2011-07-29 2014-06-04 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH INFECTIOUS cDNA CLONE OF EUROPEAN PRRS VIRUS AND USES THEREOF
US9187731B2 (en) 2011-07-29 2015-11-17 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh PRRS virus inducing type I interferon in susceptible cells
CN102766604B (zh) * 2012-06-19 2013-06-05 河南农业大学 一种猪流感病毒毒株及其应用
WO2014150822A2 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, compositions, vaccine and methods of use
WO2014182872A1 (en) 2013-05-08 2014-11-13 Protatek International, Inc. Vaccine for pcv2 and mycoplasma
MX2016003855A (es) 2013-09-25 2016-08-04 Zoetis Services Llc Composicion de vacuna de circovirus porcino tipo 2b divergente y procedimientos de uso.
ES2778425T3 (es) 2013-10-02 2020-08-10 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Variante de la proteína ORF2 del PCV2 y partículas similares a virus compuestas por esta
CN105273067A (zh) * 2015-03-13 2016-01-27 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 一种编码MERS-CoV棘突蛋白的重组41型腺病毒载体疫苗
WO2016183423A1 (en) 2015-05-14 2016-11-17 Merial Inc. Method for porcine circovirus production and pcv2 vaccines
CN105368796A (zh) * 2015-09-09 2016-03-02 河南农业大学 一种表达ppv vp2基因和猪il-18基因的重组猪伪狂犬病毒株
KR20240090735A (ko) * 2016-11-03 2024-06-21 베링거잉겔하임베트메디카게엠베하 돼지 파보바이러스에 대한 백신
CN116813720A (zh) * 2017-07-07 2023-09-29 浙江海隆生物科技有限公司 猪伪狂犬病毒gD蛋白的制备方法及猪伪狂犬病毒亚单位疫苗和应用
CN110038124B (zh) * 2019-05-13 2023-04-14 天康生物股份有限公司 猪瘟-猪传染性胸膜肺炎二联亚单位的疫苗及其制备方法和应用
CN112834744A (zh) * 2020-12-31 2021-05-25 天津瑞普生物技术股份有限公司 一种猪群体内腺病毒3型中和抗体阳性率的elisa试剂盒及其检测方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1154718A (zh) * 1994-07-29 1997-07-16 美国氰胺公司 与主要组织相容性复合体i类重链表达负调节有关的人巨细胞病毒基因区域的鉴定
ES2105984B1 (es) * 1995-11-30 1998-04-16 Iberica Cyanamid Adenovirus recombinantes que expresan antigenos del virus de la gastroenteritis porcina transmisible (vgpt) y su empleo en la formacion de vacunas.
AUPO856097A0 (en) * 1997-08-14 1997-09-04 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Vector
US6492343B1 (en) * 1998-04-15 2002-12-10 University Of Saskatchewan Porcine adenovirus type 3 genome

Also Published As

Publication number Publication date
CA2362454C (en) 2011-12-20
CN1869243A (zh) 2006-11-29
EP1151121B1 (fr) 2006-01-25
AU2553700A (en) 2000-08-29
DK1151121T3 (da) 2006-05-29
PL350182A1 (en) 2002-11-18
CA2362454A1 (en) 2000-08-17
ES2258970T3 (es) 2006-09-16
KR100818673B1 (ko) 2008-04-01
DE60025701T2 (de) 2006-10-19
JP2002537766A (ja) 2002-11-12
AU781195B2 (en) 2005-05-12
US7109025B1 (en) 2006-09-19
BR0008205A (pt) 2002-04-02
EP1151121A1 (fr) 2001-11-07
ATE316580T1 (de) 2006-02-15
CN1869243B (zh) 2016-01-20
KR20020013502A (ko) 2002-02-20
MXPA01008069A (es) 2003-09-10
WO2000047756A1 (fr) 2000-08-17
CN1262664C (zh) 2006-07-05
FR2789695A1 (fr) 2000-08-18
DE60025701D1 (de) 2006-04-13
CN1343257A (zh) 2002-04-03
FR2789695B1 (fr) 2003-03-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL205524B1 (pl) Rekombinowany świński adenowirus oraz zawierająca go szczepionka
ES2956050T3 (es) Vectores de adenovirus caninos
KR102132730B1 (ko) 구제역 바이러스 유사 입자 백신 및 그 제조방법
JP5506736B2 (ja) ウシアデノウイルスタイプ３ゲノム
PL196530B1 (pl) Rekombinowany psi wirus herpes (CHV), szczepionka lub kompozycja immunologiczna, poliwalentna szczepionka, ich zastosowanie oraz sposób wyrażania białka G wirusa wścieklizny
CA2746340A1 (en) Pcv 2-based methods and compositions for the treatment of pigs
US20090274724A1 (en) Novel recombinant and mutant adenoviruses
TW201823458A (zh) 新穎ehv插入位點orf70
JP7387623B2 (ja) 標的タンパク質を安定して発現できる組換えウイルス
JP2023012474A (ja) 不活性化ｕｌ１８および／またはｕｌ８を有する新しいｅｈｖ
US10106819B2 (en) Recombinant swinepox virus and vaccines
AU2006228037A1 (en) Adenovirus vectors comprising introns
AU2005201212B2 (en) Recombined porcine adenovirus based viral vaccines and vectors
Ishihara et al. Development and evaluation of the protective efficacy of novel Marek's disease virus Rispens vector vaccines against infectious bursal disease
WO2019179966A1 (en) Ehv insertion site ul43
AU2007234633A1 (en) Recombined porcine adenovirus based viral vaccines and vectors
TWI852923B (zh) 具不活化ul18及/或ul8之新穎馬阿爾發疱疹病毒(ehv)
AU4220600A (en) Recombinant and mutant adenoviruses derived of bovine adenovirus type1