PL202951B1 - Sposoby hodowli wirusów rodzaju cirkowirus - Google Patents
Sposoby hodowli wirusów rodzaju cirkowirusInfo
- Publication number
- PL202951B1 PL202951B1 PL364077A PL36407702A PL202951B1 PL 202951 B1 PL202951 B1 PL 202951B1 PL 364077 A PL364077 A PL 364077A PL 36407702 A PL36407702 A PL 36407702A PL 202951 B1 PL202951 B1 PL 202951B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- mammalian
- adenovirus
- porcine
- cell
- circovirus
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 98
- 241001533384 Circovirus Species 0.000 title claims abstract description 45
- 241000202347 Porcine circovirus Species 0.000 claims abstract description 65
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 60
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims abstract description 34
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 78
- 241001673669 Porcine circovirus 2 Species 0.000 claims description 58
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 42
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 41
- 101150029662 E1 gene Proteins 0.000 claims description 24
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 24
- 241000928435 Porcine circovirus 1 Species 0.000 claims description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 16
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 15
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 claims description 14
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 claims description 11
- 241000188845 Porcine adenovirus Species 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 108010057360 Adenovirus E1 Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 28
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 14
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 11
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 9
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 9
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 9
- 101150075174 E1B gene Proteins 0.000 description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 8
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 6
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 6
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 5
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N beta-D-glucosamine Chemical compound N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N 0.000 description 5
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 5
- 208000028489 postweaning multisystemic wasting syndrome Diseases 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 241001533399 Circoviridae Species 0.000 description 4
- 101710185720 Putative ethidium bromide resistance protein Proteins 0.000 description 4
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GPKUGWDQUVWHIC-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine tetrahydrochloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.Cl.NNC1=CC=C(C=C1)C1=CC=C(NN)C=C1 GPKUGWDQUVWHIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 241001302800 Beak and feather disease virus Species 0.000 description 2
- 241000701106 Bovine adenovirus 3 Species 0.000 description 2
- 101710167800 Capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 description 2
- 241000725585 Chicken anemia virus Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000833492 Homo sapiens Jouberin Proteins 0.000 description 2
- 101000651236 Homo sapiens NCK-interacting protein with SH3 domain Proteins 0.000 description 2
- 102100024407 Jouberin Human genes 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 101710113540 ORF2 protein Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 241001135902 Peanut clump virus Species 0.000 description 2
- 101710159752 Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase subunit PhaE Proteins 0.000 description 2
- 101100382437 Porcine circovirus 2 Cap gene Proteins 0.000 description 2
- 101710130262 Probable Vpr-like protein Proteins 0.000 description 2
- 101710090523 Putative movement protein Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- AJDIZQLSFPQPEY-UHFFFAOYSA-N 1,1,2-Trichlorotrifluoroethane Chemical compound FC(F)(Cl)C(F)(Cl)Cl AJDIZQLSFPQPEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IDOQDZANRZQBTP-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=CC=C1OCCO IDOQDZANRZQBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KJDSORYAHBAGPP-UHFFFAOYSA-N 4-(3,4-diaminophenyl)benzene-1,2-diamine;hydron;tetrachloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.Cl.C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 KJDSORYAHBAGPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701242 Adenoviridae Species 0.000 description 1
- 108010024878 Adenovirus E1A Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 101000977023 Azospirillum brasilense Uncharacterized 17.8 kDa protein in nodG 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000961984 Bacillus thuringiensis Uncharacterized 30.3 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 235000005979 Citrus limon Nutrition 0.000 description 1
- 244000131522 Citrus pyriformis Species 0.000 description 1
- 241000724252 Cucumber mosaic virus Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 101000644901 Drosophila melanogaster Putative 115 kDa protein in type-1 retrotransposable element R1DM Proteins 0.000 description 1
- 101710199711 Early E1A protein Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 101000747702 Enterobacteria phage N4 Uncharacterized protein Gp2 Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101000758599 Escherichia coli Uncharacterized 14.7 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 101000768930 Lactococcus lactis subsp. cremoris Uncharacterized protein in pepC 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000976302 Leptospira interrogans Uncharacterized protein in sph 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000778886 Leptospira interrogans serogroup Icterohaemorrhagiae serovar Lai (strain 56601) Uncharacterized protein LA_2151 Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108091027974 Mature messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241001661006 Pepper cryptic virus 2 Species 0.000 description 1
- 241000745220 Pigeon circovirus Species 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 101000933967 Pseudomonas phage KPP25 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 101001121571 Rice tungro bacilliform virus (isolate Philippines) Protein P2 Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 101000818098 Spirochaeta aurantia Uncharacterized protein in trpE 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101001026590 Streptomyces cinnamonensis Putative polyketide beta-ketoacyl synthase 2 Proteins 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 101000750896 Synechococcus elongatus (strain PCC 7942 / FACHB-805) Uncharacterized protein Synpcc7942_2318 Proteins 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 229920004929 Triton X-114 Polymers 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 101000916321 Xenopus laevis Transposon TX1 uncharacterized 149 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000760088 Zymomonas mobilis subsp. mobilis (strain ATCC 10988 / DSM 424 / LMG 404 / NCIMB 8938 / NRRL B-806 / ZM1) 20.9 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- ZVQOOHYFBIDMTQ-UHFFFAOYSA-N [methyl(oxido){1-[6-(trifluoromethyl)pyridin-3-yl]ethyl}-lambda(6)-sulfanylidene]cyanamide Chemical compound N#CN=S(C)(=O)C(C)C1=CC=C(C(F)(F)F)N=C1 ZVQOOHYFBIDMTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 108700010877 adenoviridae proteins Proteins 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 238000010370 cell cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000030944 contact inhibition Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000001739 intranuclear inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/10011—Circoviridae
- C12N2750/10021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/10011—Circoviridae
- C12N2750/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/10011—Circoviridae
- C12N2750/10051—Methods of production or purification of viral material
- C12N2750/10052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
Description
DZIEDZINA WYNALAZKU
Wynalazek dotyczy cirkowirusów (rodzaj: Circovirus) i dostarcza kompozycji i sposobów hodowli cirkowirusów, a w szczególności cirkowirusa świń (gatunek: porcine circovirus). Przedmiotem wynalazku są zwłaszcza sposoby hodowli cirkowirusa świń w komórkach ssaków, wywołującego ekspresję genowego białka funkcjonalnego adenowirusa ssaków E1.
STAN TECHNIKI
Rodzina wirusów zwana Circoviridae, powszechnie określanych jako cirkowirusy, którą można odnaleźć w wielu gatunkach roślin i zwierząt, jest opisywana jako okrągłe, bezotoczkowe winiony o ś redniej średnicy od 17 do 23,5 nm, zawierają ce pierś cieniowy jednoniciowy kwas DNA (ang. single strain DNA - ssDNA). Genomowy ssDNA cirkowirusów odpowiada najmniejszym znanym replikonom wirusowego DNA. Jak ujawniono w publikacji WO 99/45956 przynajmniej sześć wirusów zidentyfikowano jako członków tej rodziny zgodnie z szóstym raportem Międzynarodowego Komitetu Taksonomii Wirusów (Lukert, P.D. et al. 1995, The Circoviridae, strony 166-168. W F.A. Murphy, et al. (red.) Virus Taxonomy, Sixth Report of the International Comittee for the Taxonomy of Viruses, Arch. Virol. 10 Suppl.).
Zwierzęcymi wirusami należącymi do tej rodziny są: wirus anemii kurczaków (ang. chicken anemia virus - CAV); wirus choroby dzioba i opierzenia (ang. beak and feather disease virus - BFDV); cirkowirus świń (ang. porcine circovirus - PCV) oraz cirkowirus gołębi (ang. pigeon circovirus). PCV był oryginalnie wyizolowany z hodowli komórek świńskiej nerki. PCV ulega replikacji w jądrze komórkowym i wytwarza ogromne wewnątrzjądrowe ciałka inkluzyjne. Patrz Murphy et al. (1999, Circoviridae strony 357-361, Veterinary Virology, Edycja 3, Academic Press, San Diego). Obecnie znane są dwa typy PCV, PCV typu 1 (PCV1) i PCV typu 2 (PCV2). PCV1 wyizolowany jako stałe zanieczyszczenie ciągłej linii świńskich komórek nerkowych PK-15 (ATCC CCL31), nie wywołuje wykrywalnych cytopatologicznych efektów w hodowli komórkowej i nie powoduje choroby u świń po doświadczalnym zakażeniu (patrz Allan, G., 1995, Vet. Microbiol. 44: 49-64; Tischer, I. et al. 1982, Nature 295: 64-66; oraz Tischer, I. et al., 1986, Arch. Virol. 91: 271-276). PCV2, w przeciwieństwie do PCV1, jest blisko związany z wieloukładowym syndromem wyniszczenia po odstawieniu od mleka matki (ang. post weaning multisystemic wasting syndrome - PMWS) występującym u świń odstawionych od mleka matki (patrz Allan G. et al., 1998, Europe J. Vet. Diagn. Investig. 10: 3-10; Ellis, J. et al., 1998, Can. Vel J. 39: 44-51 oraz Morozov, I. et al., 1998, J. Clin. Microbiol. 36: 2535-2541). Sekwencje nukleotydowe dla PCV1 ujawnili Mankertz, A., et al. (1997, J. Virol. 71: 2562-2566) oraz Meehan, B.M., et al. (1997, J. Gen. Virol. 78: 221-227) a sekwencje nukleotydowe dla PCV2 ujawnili Hamel, A.L. et al. (1998, J. Virol. 72: 5262-5267); Mankertz, A. et al. (2000, Virus Res. 66: 65-77) oraz Meehan, B.M. et al. (1998, J. Gen. Virol. 79: 2171-2179). Szczepy PCV2 są ujawnione w opisie patentowym WO 00/01409 i został y zdeponowane w European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbilogy & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Wielka Brytania i obejmują: akcesję No. V97100219; akcesję No. N/9700218; akcesję No. V97100217; akcesję No. V98011608; oraz akcesję No. V98011609. PCV2 ujawniono także w opisie patentowym WO 00/77216.
W opublikowanych dotą d badaniach nad PCV2 stosowano albo homogenaty tkankowe albo hodowane wirusy pochodzące z izolatów ciała komórkowego. Tischer et al. (1987, Arch Virol. 96: 39-57) odnotowali, że komórki nerki świni są pobudzane do wejścia w fazę S w cyklu komórkowym przez potraktowanie D-glukozaminą. Jednakże reakcja taka musi być przeprowadzona z zachowaniem ostrożności, ponieważ D-glukozamina jest toksyczna dla hodowli komórkowych (patrz Allan et al., (2000) J. Vet. Diagn. lnvestigation. 12: 3-14). Istnieje zatem zapotrzebowanie na sposoby hodowli cirkowirusów, takich jak na przykład PCV1 i PCV2 i innych, w taki sposób, aby otrzymać cirkowirusy czyste. Takie sposoby mogłyby mieć przewagę w szczególności w przygotowywaniu antygenów PCV2 jako szczepionek przeciwko PMWS. Celem wynalazku jest sprostanie tej potrzebie.
Wszystkie opisy patentowe i publikacje są niniejszym włączone do opisu w całości.
ISTOTA WYNALAZKU
Istotą wynalazku są sposoby hodowli cirkowirusów ssaków obejmujące: a) otrzymanie komórek ssaków wywołujących ekspresję białka funkcjonalnego adenowirusa ssaków E1, przy czym rzeczone komórki pozwalają na przeprowadzenie replikacji cirkowirusa ssaków; b) wprowadzenie genomu rzeczonego cirkowirusa ssaków albo jego fragmentu zdolnego do replikacji do rzeczonych komórek ssaków; oraz c) hodowlę rzeczonych komórek ssaków w warunkach odpowiednich do replikacji rzeczoPL 202 951 B1 nego cirkowirusa ssaków. W przypadku niektórych realizacji, sposób ponadto obejmuje odzyskiwanie rzeczonych cirkowirusów z rzeczonych komórek hodowanych.
W niektórych realizacjach wynalazku, cirkowirusem ssaków jest cirkowirus świń, taki jak na przykład cirkowirus świń typu 1 (PCV1) albo cirkowirus świń typu 2 (PCV2). W jeszcze innych realizacjach cirkowirus świń składa się z chimerycznej sekwencji nukleotydowej. W innych realizacjach, komórki ssaków pochodzą od świni. W kolejnych realizacjach, tymi komórkami ssaków są komórki siatkówki świni.
W pewnych realizacjach wynalazku białkiem funkcjonalnym adenowirusa E1 ssaków jest białko funkcjonalne ludzkiego adenowirusa E1. W jeszcze innych realizacjach białkiem funkcjonalnym adenowirusa E1 ssaków jest białko funkcjonalne adenowirusa świń E1. W kolejnych realizacjach białkiem funkcjonalnym E1 jest białko funkcjonalne E1A i/lub E1B. W kolejnych realizacjach komórka ssaków wywołująca ekspresję białka funkcjonalnego E1 ssaków ulega stabilnej transformacji z zastosowaniem sekwencji genowych E1 ssaków. W innych realizacjach, sekwencja genowa E1 ssaków jest heterologiczna względem rzeczonej komórki ssaków.
Istotą wynalazku są także rekombinowane komórki ssaków o aktywności adenowirusa E1 ssaków i zawierające genom cirkowirusa ssaków lub jego fragment zdolny do replikacji, przy czym rzeczone komórki są zdolne do replikacji rzeczonego cirkowirusa ssaków. W niektórych realizacjach cirkowirus ssaków jest cirkowirusem świń, takim jak na przykład cirkowirus świń typu 1 (PCV1) albo cirkowirus świń typu 2 (PCV2). W kolejnych dodatkowych realizacjach, cirkowirus świń posiada chimeryczną sekwencję nukleotydową. W niektórych realizacjach białko funkcjonalne adenowirusa E1 jest białkiem funkcjonalnym ludzkiego adenowirusa E1. W innych realizacjach białkiem funkcjonalnym E1 jest białko funkcjonalne adenowirusa świń E1. W innych realizacjach komórką ssaków pochodzi od świni. W kolejnych realizacjach komórką ssaków jest świńska komórka siatkówki. W innych kolejnych realizacjach komórka ssaków wywołująca ekspresję białka funkcjonalnego E1 ssaków ulega stabilnej transformacji z zastosowaniem sekwencji genowych adenowirusa E1 ssaków. W innych realizacjach sekwencja genowa E1 ssaków jest heterologiczna względem rzeczonych komórek ssaków.
Istotą wynalazku są także sposoby otrzymywania rekombinowanych komórek ssaków posiadających właściwości adenowirusa E1 ssaków i zawierających genom cirkowirusa ssaków, obejmujące etapy: a) otrzymania komórki ssaków posiadającej właściwości adenowirusa E1 ssaków; oraz b) wprowadzenia genomu rzeczonego cirkowirusa ssaków albo jego fragmentu zdolnego do replikacji, do rzeczonej komórki ssaków. W dodatkowych realizacjach sposób ten obejmuje dodatkowy etap hodowania tej rekombinowanej komórki ssaków w warunkach odpowiednich do replikacji rzeczonych cirkowirusów ssaków. W kolejnych realizacjach sposób ten obejmuje odzyskanie rzeczonego cirkowirusa z rzeczonych hodowanych komórek. W niektórych realizacjach cirkowirus ssaków jest cirkowirusem świń, takim jak na przykład cirkowirus świń typu 1 (PCV1) albo cirkowirus świń typu 2 (PCV2). W kolejnych dodatkowych realizacjach, cirkowirus świń posiada chimeryczną sekwencję nukleotydową. W innych realizacjach komórka ssaków pochodzi od świni. W kolejnych realizacjach komórką ssaków jest świńska komórka siatkówki. W niektórych realizacjach aktywność adenowirusa E1 jest aktywnością ludzkiego adenowirusa E1 albo adenowirusa świń E1. W innych kolejnych realizacjach komórką ssaków posiadającą właściwości adenowirusa E1 ssaków jest trwale transformowana z zastosowaniem sekwencji genowych adenowirusa E1 ssaków. W innych realizacjach sekwencja genowa E1 ssaków jest heterologiczna względem rzeczonych komórek ssaków.
OPIS FIGUR RYSUNKU
Rysunek fig. 1A-1B przedstawia charakterystykę i miareczkowanie wirusa PCV2 wytworzonego na drodze transfekcji DNA i ekstrakcji z zainfekowanych komórek VIDO R1 metodą Hirt'a. (A) przedstawia PCR z zastosowaniem primerów specyficznych dla PCV2 i DNA z komórek zainfekowanych PCV2 (linia 1) i pozornie zainfekowanych komórek (linia 2). Plazmid zawierający genom PCV2 został zastosowany jako kontrola (linia 3). Drabinka DNA 1-kb z GIBCO BRL została nałożona na linii M. (B) przedstawia wirusowy DNA z komórek zainfekowanych PCV2 (linie 1, 3 i 5) oraz komórek pozornie zainfekowanych (linie 2, 4 i 6), które były poddane trawieniu z użyciem Ncol i Stul (linie 1 i 2), EcoRI i Stul (linie 3 i 4), EcoRI i EcoRV (linie 5 i 6). Drabinka DNA 1-kb-plus z GIBCO BRL została nał o ż ona na linii M.
Rysunek fig. 2A-2B obrazuje miareczkowanie PCV2 za pomocą wybarwiania immunoperoksydazowego. W 72 h.p.l, pozornie zainfekowane (A) i zainfekowane PCV2 (B) komórki VIDO R1 były inkubowane z króliczym poliklonalnym przeciwciałem przeciwko ORF2 i drugim biotynowanym przeciwciałem. Po wprowadzeniu kompleksu awidyny i biotynowanej peroksydazy chrzanowej, pojedyncza
PL 202 951 B1 warstwa była rozwijana z zastosowaniem tetrahydrochlorku diaminobenzydyny (DAB). Jedna ciemna komórka wynikała z infekcji jednej cząsteczki wirusa.
Rysunek fig. 3A-3C przedstawia sekwencję nukleotydową oznaczoną jako (A) i sekwencję aminokwasów dla ORF1 oznaczoną jako (B) oraz ORF 2 oznaczoną jako (C) cirkowirusa świń typu 2 (PCV2) jak opisano w akcesji do Genbanku (Genetyczny bank danych Narodowego Instytutu Zdrowia USA) numer AF086834.
KORZYSTNY SPOSÓB REALIZACJI WYNALAZKU
Przedmiotem wynalazku są kompozycje i sposoby hodowli cirkowirusów ssaków, w szczególności cirkowirusa świń. Wynalazek opiera się o odkrycie, że można przeprowadzić transfekcję świńskiej komórki posiadającej właściwości ludzkiego E1 z zastosowaniem genomu wirusa PCV2 i wytworzyć wirus PCV2 o wysokim mianie tego wirusa. Linia komórkowa VIDO R1, zdeponowana z ATCC i posiadają ca numer akcesji ATCC PTA-155, jest linią ś wiń skich komórek siatkówki, w których przeprowadzono transformację z zastosowaniem ludzkiego adenowirusa-5 (HAV5) E1, w przypadku której wykazano, że pobudza fazę S cyklu komórkowego i transaktywną transkrypcję. Patrz Shenk, T.
(1996). „Adenoviridae: the viruses and their replication W Field Virology. Edycja III. B.N. Fields, D.M. Knipe i P.M. Howley (red.) Lippincott-Raven Publishers, Filadelfia, Nowy Jork, strony 2111-2148. Jak zostało to opisane w Przykładzie 3, komórki VIDO R1 poddano transfekcji stosując genom PCV2 i wytworzono wirus na poziomie 2x107 lU/ml.
Realizacja wynalazku wymaga, jeśli nie zaznaczono inaczej, konwencjonalnej mikrobiologii, immunologii, wirusologii, biologii molekularnej oraz technik rekombinacji DNA, które mieszczą się w obrębie stanu techniki. Techniki te są całkowicie omówione w literaturze. Patrz na przykład, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (red. D. Glover); Oligonucleotide Synthesis (red. N. Gait (1984)); Nucleic Acid Hybridization (red. B. Hames & S. Higgins (1985)); Transcription and Translation (red. B. Hames & S. Higgins (1984)); Animal Cell Culture (red. R. Freshney (1986)); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Ausubel et al., Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987, 1988, 1989, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995, 1996); oraz Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Druga Edycja); vol. I, II & III (1989).
Circoviridae, rodzina wirusów posiadających okrągłe nie otoczkowane wiriony o średniej średnicy od 17 do 23,5 nm zawierające pojedyncze pierścieniowe jednołańcuchowe DNA (ssDNA), jest opisana w The Sixth Report of the International Commitee for Taxonomy of Viruses, supra. Członkowie tej grupy obejmują cirkowirusy świń PCV1 i PCV2. Wiadomo, że niektóre wirusy PCV są patogenne, tak jak PCV2, skojarzone z występowaniem PMWS.
Sekwencje nukleotydowe dla PCV1 są przedstawione przez Mankertz, A., et al. 1997, J. Virol. 71: 2562-2566 oraz Meehan, B.M. et al., 1997, J. Gen. Virol. 78: 221-227. Sekwencje nukleotydowe dla PCV2 są przedstawione przez Hamel, A.L. et al., 1998, J. Virol. 72: 5262-5267; Mankertz, A. et al., 2000, Virus Res. 66: 65-67 oraz Meehan, B.M. et al., 1998, J. Gen. Virol. 79: 2171-2179. Wzorcowe szczepy PCV2 zostały zdeponowane w Europejskim Zbiorze Hodowli Komórkowych (ang. European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbilogy & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Wielka Brytania i zawarte w akcesji No. V97100219; akcesji No. V9700218; akcesji No. V97100217; akcesji No. V98011608 oraz akcesji No. V98011609. Także Opis patentowy WO 00/77216 ujawnia również PCV2. Sekwencje nukleotydowe PCV2 zostały opublikowane także przez Hamel et al., (1998), J. Virol. Vol. 72, 6: 5262-5267 (GenBank AF027217) i przez Morozov et al., (1998), J. Clinical Microb. vol. 36, 9: 2535-2541, jak również w GenBank AF086834; AF086835 oraz AF086836. Porównanie opublikowanych sekwencji nukleotydowych dla PCV1 i PCV2 ujawnia < 80% zgodności, choć organizacja genomu jest podobna, szczególnie w rozmieszczeniu dwóch największych otwartych ramek odczytu (ang. open reading frames - ORF), wynikających z procesu replikacji DNA.
Wynalazek obejmuje sposoby hodowli cirkowirusów ssaków a w szczególności cirkowirusa świń (PCV). Wynalazek obejmuje sposoby hodowli PCV zawierające sekwencję ujawnione tutaj albo znane ze stanu techniki, ich ORF albo ich fragmenty, które są zdolne do replikacji. Wynalazek obejmuje także sposoby hodowli PCV posiadających sekwencje nukleotydowe PCV różniące się pod względem degeneracji kodu genetycznego od ujawnionych tutaj albo znanych ze stanu techniki albo ich ORF, albo ich fragmentów zdolnych do replikacji. Wynalazek ponadto obejmuje sposoby hodowli PCV zawierających odmiany sekwencji nukleotydowych PCV, które nie zmieniają funkcji albo specyficzności szczepu sekwencji nukleotydowej, albo jej ORF, albo ich fragmentów zdolnych do replikacji. Wynalazek także obejmuje sposoby hodowli PCV zawierających sekwencję nukleotydową PCV zdolną do
PL 202 951 B1 hybrydyzacji do tych sekwencji ujawnionych tutaj w warunkach, w których reakcja jest umiarkowanie albo w wysokim stopniu łańcuchowa, oraz sposoby hodowli PCV zawierających mutacje sekwencji nukleotydowej ujawnionej tutaj albo znanej ze stanu techniki, takie jak delecje albo mutacje miejscowe, albo ich ORF, albo ich fragmenty zdolne do replikacji. Wynalazek obejmuje także sposoby hodowli PCV zawierających heterologiczne sekwencje nukleotydowe. Wynalazek obejmuje sposoby hodowli PCV, które zawierają sekwencje nukleotydowe chimerycznego cirkowirusa, takie jak, na przykład, sekwencje z cirkowirusa świń w połączeniu z sekwencjami nukleotydowymi pochodzącymi od innych patogennych wirusów, takich jak patogenny wirus świń, w tym parwowirus.
Według wynalazku heterologiczna sekwencja nukleotydowa, w odniesieniu do cirkowirusa albo komórki ssaków, jest taką sekwencją, która normalnie nie jest związana z sekwencjami cirkowirusa jako część genomu, albo odpowiednio, taką sekwencją, która normalnie nie jest związana z komórką ssaków. Heterologiczne sekwencje nukleotydowe obejmują syntetyczne sekwencje. Reakcje hybrydyzacji mogą być przeprowadzone w warunkach o różnym „stopniu łańcuchowości.
Warunki, które powodują, że reakcja hybrydyzacji zachodzi w większym stopniu łańcuchowo, są powszechnie znane i znane ze stanu techniki. Patrz, na przykład, Sambrook et al. (1989) na stronie 7.52. Przykłady pokrewnych warunków obejmują (w kierunku zwiększającego się stopnia przebiegu reakcji łańcuchowej): inkubację w temperaturze 25°C, 37°C, 50°C i 68°C, stężenia buforu 10 X SSC, 6 X SSC, 1 X SSC, 0,1 X SSC (gdzie SSC oznacza 0,15 M NaCI i 15 mM bufor cytrynowy) i ich odpowiedniki stosując inne układy buforujące; stężenia formamidu 0%, 25%, 50% i 75%; czasy inkubacji od 5 minut do 24 godzin; jeden, dwa lub więcej etapów płukania; czas inkubacji płukania 1, 2 albo 15 minut; oraz stężenie roztworu do płukania 6 X SSC, 1 X SSC, 0,1 X SSC, albo woda dejonizowana. Przykładowy zestaw warunków łańcuchowej hybrydyzacji jest następujący: temperatura 68°C oraz stężenie roztworu do płukania 0,1 X SSC.
Średni rozmiar genomów PCV kodujących kilka sekwencji polipeptydowych waha się od 8 do 35 kD. Rutynowo określa się otwarte ramki odczytu (ORF) dla cirkowirusa świń stosując standardowe oprogramowanie takie jak na przykład MacVector® (Oxford Molecular Group Inc., MD 21030). Największe ORF, ORF1, z dwóch typów PCV wykazuje tylko nieznaczne odchylenia pod względem zgodności 85% (zmierzonej z zastosowaniem programu „clustal) i wykazano, że jest ono białkiem Rep w PCV1 (Mankertz, A., et al., 1998, J. Gen. Virol. 79: 381-384). Bez wnikania w teorię, wyższy stopień odchylenia występujący w przypadku sekwencji ORF2 w PCV1 i PCV2 (zgodność około 65%) mógłby sugerować, cechy PCV specyficzne dla typu PCV mogą być zdeterminowane poprzez odpowiednie białko ORF2. Kilka epitopów specyficznych dla typu PCV zostało zlokalizowanych na sekwencjach ORF2 PCV2. Patrz Mahe, D. et al., 2000, J. Gen. Virol. 81 : 1815-24. W innym z ostatnich badań, zidentyfikowano ORF2 PCV2 jako główne białko strukturalne, które może tworzyć cząsteczki zbliżone do otoczki wirusowej w komórkach owadów zainfekowanych rekombinowanym baculowirusem wytwarzającym ORF2. Patrz Nawagitgul, P. et al., 2000, J. Gen. Virol. 81: 2281-2287.
W przypadku niektórych realizacji ilustrują cych wynalazek ujawnionych tutaj, wektor rekombinacji zawierający genom PCV lub jego ORF lub jego fragment, taki jak region antygenowy, został stworzony metodą rekombinacji in vitro pomiędzy plazmidem a genomem PCV. W niektórych realizacjach, genom PCV jest genomem PCV2. W innych realizacjach, wektor rekombinacji zawierający genom PCV albo jego ORF lub jego fragment, taki jak region antygenowy, został stworzony metodą rekombinacji in vivo. Sposoby rekombinacji in vivo są znane w praktyce ze stanu techniki i obejmują, na przykład sposoby ujawnione przez Chartier, et al. (1996, J. Virol. 70: 4805-4810). Wektory do opracowania genomów cirkowirusa obejmują na przykład plazmidy bakteryjne, które pozwalają wytworzyć wielokrotne kopie skolonowanej sekwencji nukleotydowej cirkowirusa. W niektórych realizacjach, plazmid jest współ-transfekowany do odpowiedniej komórki gospodarza w celu rekombinacji. Odpowiednie do rekombinacji komórki gospodarza obejmują dowolną komórkę, która będzie wspomagała proces rekombinacji pomiędzy genomem PCV a plazmidem zawierającym sekwencję PCV, albo pomiędzy dwoma lub większą ilością plazmidów, przy czym każdy zawiera sekwencję PCV. Proces rekombinacji jest ogólnie przeprowadzany w komórkach prokariotycznych, takich jak na przykład E. coli, podczas gdy wytwarzanie cirkowirusów jest korzystnie przeprowadzane w komórkach ssaków dopuszczalnych do replikacji PCV, takich jak na przykład komórki świńskie, a w szczególności komórki świńskie zdolne do wywoływania ekspresji białka funkcjonalnego adenowirusa E1 ssaków.
Wynalazek obejmuje komórki gospodarza ssaka pozwalające na przeprowadzenie replikacji cirkowirusa, a w szczególności, zdolne do replikacji PCV, takich jak PCV1 i PCV2. Allan et al. (1995, Veterinary Microbiology 44: 49-64) donoszą, że PCV ulegają replikacji w hodowlach świńskich i by6
PL 202 951 B1 czych monocytów/makrofagów. Tischer et al. (1987, Arch. Virol. 96; 39-57) donoszą, że wiadomym jest fakt, iż PCV do replikacji w hodowlach komórkowych wymagają aktywnie dzielących się komórek. Przykłady komórek albo linii komórkowych użytecznych w celu przeprowadzenia replikacji PCV obejmują komórki ssaków wywołujących ekspresję białka funkcjonalnego E1 i pozwalających na replikację PCV, w tym komórki świńskie, takie jak świńskie komórki monocytów/makrofagów i świńskie komórki siatkówki wywołujące ekspresję białka funkcjonalnego adenowirusa E1. W ujawnionej tutaj realizacji ilustrującej wynalazek, wykazano, iż świńskie komórki siatkówki o właściwościach ludzkiego adenowirusa E1 są dopuszczalne do replikacji PCV2 i wykazały poziom wytwarzania wirusa 2x107 lU/ml. Linie świńskich komórek są dostępne z powszechnych źródeł takich jak na przykład American Type Tissue Collection (ATCC). Wzrost hodowli komórek bakteryjnych, jak również hodowla i utrzymanie komórek eukariotycznych i linii komórkowych ssaka są procedurami dobrze znanymi ekspertom tej dziedziny.
Wynalazek obejmuje sposoby hodowli cirkowirusów ssaków, w szczególności cirkowirusa świń, w komórkach gospodarza ssaka, transfekowanych z zastosowaniem sekwencji genowych adenowirusa ssaków E1. W niektórych realizacjach, komórka ssaka ulega trwale transformacji z zastosowaniem sekwencji genowych adenowirusa E1. W innych realizacjach sekwencje genowe E1 są włączone do genomu komórek ssaków. W jeszcze innych realizacjach sekwencje genowe E1 występują w replikującym plazmidzie. W jeszcze innych realizacjach, sekwencja genowa E1 jest heterologiczna względem komórki ssaków. W przedstawionej tutaj przykładowej realizacji wynalazku, świńska komórka ssaków ulega transformacji z zastosowaniem sekwencji genowej ludzkiego adenowirusa E1. Wynalazek obejmuje zastosowanie komórki ssaków albo linii komórek ssaków wywołujących ekspresję białka funkcjonalnego E1, tak długo jak komórka ssaków lub linia komórek ssaków wywołująca ekspresję białka funkcjonalnego E1 jest dopuszczalna do przeprowadzenia replikacji cirkowirusów, w szczególności cirkowirusa świń, takiego jak na przykład cirkowirus świń typu 1 albo cirkowirus świń typu 2. W korzystnych realizacjach komórka ssaków oznacza komórkę świni albo linię komórkową. Wynalazek obejmuje dowolne białka funkcjonalne E1 ssaków, dopóki komórka nosiciela ssaka wywołująca ekspresję białka funkcjonalnego E1 jest dopuszczona do przeprowadzenia replikacji cirkowirusów, w szczególnoś ci PCV, takiego jak na przykł ad cirkowirusa ś wiń typu 1 albo cirkowirusa ś wiń typu 2. Genomy adenowirusów ssaków są znane ze stanu techniki i są ujawnione na przykład przez Reddy et al. (1998, Journal of Virology, 72: 1394), który ujawnił sekwencję nukleotydową, organizację genomu oraz mapę transkrypcji byczego adenowirusa 3 (BAV3); oraz przez Kleiboecker (1995, Virus Res. 36: 259-268), który ujawnił region PAV-4 E1. Wynalazek zawiera białko funkcjonalne E1 z dowolnego z róż nych serotypów ludzkiego adenowirusa, takich jak Ad2, Ad5, Ad12 oraz Ad40. W ujawnionej tutaj w przykładzie 1 realizacji, która jest ilustracją wynalazku, białko funkcjonalne E1 jest białkiem funkcjonalnym E1 w ludzkim Ad5. Ludzki gen E1A ulega ekspresji niezwłocznie po infekcji wirusowej (0-2 godz.) i przed dowolnymi innymi genami wirusowymi. Flint (1982) Biochem. Biophys. Acta 651: 175208; Flint (1986) Advances Virus Reasearch 31: 169-228; Grand (1987) Biochem. J. 241: 25-38. Miejscem inicjacji transkrypcji Ad5 E1A jest nukleotyd 498 a miejscem inicjacji ATG białka E1A jest nukleotyd 560 w genomie wirusa. Białko E1B występuje w formie trans i jest niezbędne do transportu dojrzałego mRNA z jądra do cytoplazmy. E1B promotor Ad5 składa się z pojedynczego miejsca rozpoznawania Spl o wysokim powinowactwie oraz sekwencji TATA box. W szczególności sekwencje genowe ludzkiego adenowirusa 5 E1A oraz E1B są zlokalizowane w nukleotydach od 505-4034 w sekwencji nukleotydowej przedstawionej przez Chroboezek, J. et al. (1992, Virology. 186:280-285). W realizacji wynalazku ujawnionej tutaj w przykładach, komórką ssaka gospodarza jest świńska komórka gospodarza z sekwencjami genowymi ludzkiego adenowirusa 5 E1.
Genom PCV może być izolowany z wirionów PCV, albo może obejmować genom PCV, który został wstawiony do plazmidu przy zastosowaniu standardowych technik biologii molekularnej i biotechnologii. Sklonowanie genomu PCV2 o pełnej długości do wektora pBluescript II KS(+) z Strategene metodą PCR jest opisane w Liu, et al. (2000, J. Clin. Microbiol. Vol. 38: 3474-3477). DNA genom PCV2 o pełnej długości może zostać uwolniony z otrzymanego plazmidu w wyniku trawienia Sacll.
Wprowadzenie sekwencji nukleotydowych cirkowirusa do dopuszczalnych komórek ssaka gospodarza można osiągnąć stosując dowolny sposób znany ze stanu techniki, w tym, ale nie ograniczając się tylko do niej, transfekcję oraz transformację obejmującą, ale nie ograniczając się tylko do poniższych przykładów, mikroiniekcję, elektroporację, precypitację z CaP04l DEAE-dekstran, liposomy, bombardowanie cząsteczkami itp. Przykładowy sposób transfekcji sekwencji nukleotydowych PCV2 do komórek VIDO R1 opisano w przykładzie 3.
PL 202 951 B1
Sposoby hodowania prokariotycznych komórek, takich jak komórki bakteryjne, oraz komórek eukaryotycznych, takich jak komórki nosiciela ssaka wywołujących ekspresję białka funkcjonalnego adenowirusa E1 uważane są za rutynowe przez ekspertów danej dziedziny.
Następujące przykłady przytoczono wyłącznie dla zilustrowania, a nie ograniczania zakresu wynalazku. Wszystkie odniesienia i publikacje patentowe, które zostały ujawnione tutaj, są załączone w cał o ś ci poprzez odniesienia.
PRZYKŁADY
P r z y k ł a d 1: Przygotowanie świńskich komórek siatkówki, transfekowanych z zastosowaniem sekwencji genowych ludzkiego adenowirusa E1 (komórki VIDO R1).
Pierwotnie kultury świńskich komórek siatkówki były transfekowane z użyciem 10 μg plazmidu pTG 4671 (Transgene, Strasbourg, Francja) techniką wykorzystującą fosforan wapnia. Plazmid pTG 4671 zawiera całe sekwencje E1A i E1B (nts 505-4034) z HAV-5, łącznie z genem acetylotransferazy puromycynowej jako łatwego do wyszukania markera. W plazmidzie tym region E1 znajduje się pod kontrolą wyznaczonego promotora z genu mysiej kinazy fosfoglicerynowej, a gen acetylotransferazy puromycynowej jest kontrolowany poprzez wyznaczony wczesny promotor SV40. Transformowane komórki zostały wyselekcjonowane w wyniku przeprowadzenia potrójnego pasażowania w pożywce zawierającej 7 μg/ml puromycyny, zidentyfikowane w oparciu o zmianę w ich morfologii z pojedynczych ognisk (na przykład utraty zahamowania kontaktu), oraz poddane klonowaniu pojedynczych komórek. Wybrana linia komórkowa była w pierwszej kolejności testowana na jej zdolność do wspomagania wzrostu E1 mutantów zawierających delecję HAV-5. Następnie linia komórkowa była badana na obecność sekwencji E1 w genomie metodą PCR, wytwarzanie białek E1A i E1B metodą Western blot, oraz wyznaczano czas podwojenia w warunkach hodowli komórkowej. Wykrywano sekwencje E1, a wytwarzanie białek E1A i E1B identyfikowano metodą immunoprecypitacji. Czas podwojenia był krótszy w porównaniu do wyjściowej linii komórkowej.
Aby ocenić stabilność ekspresji E1, komórki VIDO R1 były hodowane przez ponad 50 pasaży (rozdzielenie 1:3 dwa razy w tygodniu) oraz badane na ich zdolność do wspomagania replikacji HAV-5 z usuniętym E1. Ekspresja białek E1A i E1B w czasie regularnych przerw była także monitorowana przy wykorzystaniu metody Western blot. Wyniki wskazywały, że linia VIDO R1 zachowuje zdolność do wspomagania wzrostu wirusa z usuniętym E1 i wykazywała podobne poziomy białek E1 podczas ponad 50 pasaży w hodowli. Dlatego komórki VIDO R1 można uważać za stabilną linię komórkową. Linia komórkowa VIDO R1 została zdeponowana w American Type Culture collection (ATCC) i posiada numer akcesji ATCC PTA-155.
P r z y k ł a d 2
Przykład 2 przedstawia opis klonowania molekularnego genomu PCV2 o pełnej długości.
Początkowo DNA PCV2 był namnożony przy użyciu techniki PCR z całkowitego DNA ekstrahowanego z prosiąt cierpiących na PMWS. Klonowanie DNA genomu PCV2 o pełnej długości do wektora pBluescript II KS(+) (Stratagene) metodą łańcuchowej reakcji polimeryzacji (ang. polymerase chain reaction - PCR) zostało opisane przez Liu et al. (2000) J. Clin. Microbiol. 38:3474-3477). Sekwencja PCV2 została zgłoszona do GenBanku (Akcesja no. AF086834). DNA genom PCV2 o pełnej długości jest uwalniany z otrzymanego plazmidu w wyniku trawienia Sacll.
P r z y k ł a d 3
Przykład 3 przedstawia transfekcję komórek VIDO R1, jak opisano w przykładzie 1, z zastosowaniem plazmidu zawierającego genom PCV2 otrzymanego w przykładzie 2.
Materiał i sposoby
Hodowla komórkowa
Linia komórkowa świńskich komórek siatkówki płodów świni, VIDO R1, jak opisano w przykładzie 1 oraz komórki Vero (ATCC) były utrzymywane w 37°C w atmosferze 5% CO2 w nośniku MEM na bazie Eagles uzupełnionym o odpowiednio 10% albo 5% byczą surowicą płodową aktywowaną ciepłem (ang. fetal bovine serum - FBS).
Transfekcja i infekowanie
Pojedyncze warstwy komórek VIDO R1, które rosły w płytkach o sześciu studzienkach, poddano transfekcji ze sklonowanym DNA PCV2 z zastosowaniem Lipofektyny według wskazań wytwórcy (GIBCO BRL). Przed transfekcją, genom PCV2 o pełnej długości był uwalniany z plazmidu w wyniku trawienia Sacll (Liu, Q., et al., 2000, J. Clin. Microbiol. 38:2474-2477). W celu infekowania, transfekowane komórki VIDO R1 były poddane trzem cyklom wymrażania (-70°C) i odtajania (37°C). Lizat był następnie oczyszczany poprzez wirowanie i stosowany do infekowania świeżych komórek VIDO R1.
PL 202 951 B1
W opublikowanych raportach do hodowli wirusa PCV2 zastosowano linię świńskich komórek nerkowych wolnych od PCV1. W celu pobudzenia do wejścia w fazę S cyklu komórkowego, świńskie komórki nerkowe były każdorazowo zadane D-glukozaminą (patrz Tischer et al., (1987), Arch Virol. 96:39-57). Jednakże owo zadanie musi zostać przeprowadzone uważnie, ponieważ D-glukozamina jest toksyczna dla hodowli komórkowej (patrz Allan et al., (2000). J. Vet. Diagn. lnvestigation. 12:3-14). W przeciwień stwie, ponieważ linia komórkowa VIDO R1 stosowana w tych badaniach był a poddana transformacji z użyciem HAV5-E1, który może indukować fazę S, nie było konieczne przeprowadzanie procedury z D-glukozaminą.
P r z y k ł a d 4
Oczyszczanie wirusa i miareczkowanie
W celu oczyszczenia wirusa PCV2, komórki VIDO R1 zainfekowane PCV2 były inkubowane z 0,5% Tritonem X-114 w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) w temperaturze 37°C przez 45 minut a następnie ekstrahowane z zastosowaniem Freonu 113 (1,1,2-trichloro-trifluoroetanu). Szczątki komórek i błony były oczyszczane poprzez wirowanie przy 2000 g przez 15 minut. Wirusy w supernatancie były zlepiane w płaty w wyniku wirowania przy 35000 g przez 3 godziny w 20% kleiku sacharozowym. Płaty wirusa były zawieszane w PBS i przechowywane w temperaturze -70°C. Miana wirusów były określane jako jednostki infekcji (ang. infectious units - IU) poprzez ilościowe immunowybarwianie białka ORF2 z zastosowaniem peroksydazy. W tym celu pojedyncze warstwy komórek w 12-studzienkowych płytkach były poddawane infekcji z serią rozcienczeń wirusów. Po 1-godzinnej adsorpcji wirusów, komórki były płukane i powlekane MEM zawierającym 2% FBS i 0,7% agarozy. Trzeciego dnia po infekcji (p.i. = ang. post infection) usuwano powłokę z agarozy i mieszano komórki oraz nasączano mieszaniną metanol/aceton (stosunek objętościowy 1:1) przez 20 minut w temperaturze -20°C. Po zablokowaniu z użyciem 1% byczej albuminy surowiczej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, komórki były inkubowane z króliczą surowicą anty-ORF2 (Liu at al., 2001, Protein Expression and Purification. 21:115-120). Po 2 godzinach inkubacji płytki płukano przy użyciu PBS i następnie badano z użyciem zestawu VECTASTAIN Elite ABC (Vector Laboratories). Reakcja była przeprowadzona z użyciem tetrahydrochlorku 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) i śledzona pod mikroskopem. Poprzez zliczenie pozytywnie wybarwionych komórek, wyrażano miano wirusa jako IU, gdzie 1 IU był określony jako jedna pozytywnie wybarwiona komórka/ognisko w 3 d.p.i (dzień po infekcji).
Ekstrakcja wirusowego DNA i jego charakterystyka
Wirusowy DNA ekstrahowany był z pojedynczych warstw komórek VIDO R1 zainfekowanych PCV2 według metody Hirta (1967, J. Mol. Biol. 26:365-369). Wirusowy DNA był następnie charakteryzowany poprzez analizę restrykcyjną i łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) w sposób opisany przez Liu et al., (2000). J. Clin. Microbiol. 38:3474-3477).
Metodą PCR z zastosowaniem DNA ekstrahowanego z zainfekowanych komórek jako matrycy oraz primerów specyficznych dla PCV-2 powielono produkt o specyficznym rozmiarze, podczas gdy nie uzyskano powielenia DNA z kontrolnych, niezainfekowanych komórek. Zgodnie z oczekiwanymi wzorami restrykcyjnymi, trawienie wirusowego DNA z zastosowaniem Ncol i Stul prowadziło do powstania dwóch fragmentów o rozmiarze, odpowiednio, 1291 bp i 477 bp; trawienie z zastosowaniem Ecol i Stul dawało dwa fragmenty o rozmiarze, odpowiednio, 1492 bp i 276 bp; a trawienie z użyciem EcoRI i EcoRV powodowało powstawanie dwóch fragmentów o rozmiarze, odpowiednio, 1094 bp i 674 bp. Dane te wskazują, iż otrzymanym wirusem jest wirus PCV2. Stosując metodę immunobarwienia oraz zliczając pozytywnie wybarwione komórki, określono miano tej obróbki na 2x107 lU/ml.
Claims (34)
1. Sposób hodowli cirkowirusa ssaków, znamienny tym, że obejmuje etapy:
a) otrzymania komórek ssaków wywołujących ekspresję białka funkcjonalnego adenowirusa ssaków E1, przy czym rzeczone komórki pozwalają na przeprowadzenie replikacji cirkowirusa ssaków;
b) wprowadzenia genomu cirkowirusa ssaków albo jego fragmentu zdolnego do replikacji, do rzeczonych komórek ssaków; oraz
c) hodowli rzeczonych komórek ssaków w warunkach odpowiednich do replikacji rzeczonego cirkowirusa ssaków.
PL 202 951 B1
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje ponadto odzyskiwanie rzeczonego cirkowirusa z rzeczonych komórek hodowanych.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rzeczony cirkowirus ssaków jest cirkowirusem świń.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że rzeczony cirkowirus świń jest cirkowirusem świń typu 2 (PCV2).
5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że rzeczony cirkowirus świń jest cirkowirusem świń typu 1 (PCV1).
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rzeczone komórki ssaków pochodzą od świni.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rzeczone komórki ssaków są świńskimi komórkami siatkówki.
8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rzeczone białko funkcjonalne adenowirusa ssaków E1 jest białkiem funkcjonalnym ludzkiego adenowirusa E1.
9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rzeczone białko funkcjonalne adenowirusa ssaków E1 jest białkiem funkcjonalnym adenowirusa świń E1.
10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rzeczone komórki ssaków wywołujące ekspresję białka funkcjonalnego adenowirusa ssaków E1 ulegają stabilnej transformacji z zastosowaniem sekwencji genowej adenowirusa ssaków E1.
11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że rzeczona sekwencja genowa E1 jest sekwencją genową ludzkiego adenowirusa E1.
12. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że rzeczona sekwencja genowa adenowirusa ssaków E1 jest heterologiczna względem rzeczonej komórki ssaków.
13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rzeczone białko funkcjonalne E1 jest białkiem funkcjonalnym E1A i/lub E1B.
14. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że rzeczony cirkowirus świń zawiera chimeryczną sekwencję nukleotydową.
15. Rekombinowana komórka ssaków, znamienna tym, że wywołuje ekspresję białka funkcjonalnego adenowirusa ssaków E1 i ma genom cirkowirusa świń lub jego fragment zdolny do replikacji, przy czym rzeczona komórka pozwala na przeprowadzenie replikacji rzeczonego cirkowirusa świń.
16. Rekombinowana komórka ssaków według zastrz. 15, znamienna tym, że rzeczone białko funkcjonalne adenowirusa E1 jest białkiem funkcjonalnym ludzkiego adenowirusa E1.
17. Rekombinowana komórka ssaków według zastrz. 15, znamienna tym, że rzeczone białko funkcjonalne adenowirusa E1 jest białkiem funkcjonalnym adenowirusa świń E1.
18. Rekombinowana komórka ssaków według zastrz. 15, znamienna tym, że rzeczona komórka pochodzi od świni.
19. Rekombinowana komórka ssaków według zastrz. 18, znamienna tym, że rzeczona komórka jest świńską komórką siatkówki.
20. Rekombinowana komórka ssaków według zastrz. 15, znamienna tym, że komórka wywołująca ekspresję białka funkcjonalnego adenowirusa ssaków E1 ulega stabilnej transformacji z zastosowaniem sekwencji genowej adenowirusa ssaków E1.
21. Rekombinowana komórka ssaków według zastrz. 20, znamienna tym, że rzeczona sekwencja genowa E1 jest sekwencją genową ludzkiego adenowirusa E1.
22. Rekombinowana komórka ssaków według zastrz. 20, znamienna tym, że rzeczona sekwencja genowa adenowirusa ssaków E1 jest heterologiczna względem rzeczonej komórki ssaków.
23. Sposób otrzymywania rekombinowanej komórki ssaków wywołującej ekspresję białka funkcjonalnego adenowirusa ssaków E1 i zawierającej genom cirkowirusa świń, znamienny tym, że obejmuje etapy: a) otrzymania komórki ssaków wywołującej ekspresję białka funkcjonalnego adenowirusa ssaków E1; oraz b) wprowadzenia rzeczonego genomu cirkowirusa świń albo jego fragmentu zdolnego do replikacji, do tej komórki ssaków.
24. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że obejmuje ponadto etap hodowli rzeczonej rekombinowanej komórki ssaków w warunkach odpowiednich do replikacji rzeczonego cirkowirusa świń.
25. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że obejmuje ponadto odzyskiwanie rzeczonego cirkowirusa z rzeczonych komórek hodowanych.
26. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że rzeczony cirkowirus świń jest cirkowirusem świń typu 2 (PCV2).
PL 202 951 B1
27. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że rzeczony cirkowirus świń jest cirkowirusem świń typu 1 (PCV2).
28. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że rzeczone komórki ssaków pochodzą od świni.
29. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że rzeczone komórki ssaków są świńskimi komórkami siatkówki.
30. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że rzeczone białko funkcjonalne adenowirusa E1 jest białkiem funkcjonalnym ludzkiego adenowirusa E1.
31. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że rzeczone białko funkcjonalne adenowirusa E1 jest białkiem funkcjonalnym adenowirusa świń E1.
32. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że rzeczony cirkowirus świń zawiera chimeryczną sekwencję nukleotydową.
33. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że rzeczona komórka ssaków wywołująca ekspresję białka funkcjonalnego adenowirusa ssaków E1 ulega stabilnej transformacji z zastosowaniem sekwencji genowej adenowirusa ssaków E1.
34. Sposób według zastrz. 33, znamienny tym, że rzeczona sekwencja genowa adenowirusa ssaków E1 jest heterologiczna względem rzeczonej komórki ssaków.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US27917301P | 2001-03-27 | 2001-03-27 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL364077A1 PL364077A1 (pl) | 2004-12-13 |
| PL202951B1 true PL202951B1 (pl) | 2009-08-31 |
Family
ID=23067939
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL364077A PL202951B1 (pl) | 2001-03-27 | 2002-03-27 | Sposoby hodowli wirusów rodzaju cirkowirus |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6794163B2 (pl) |
| EP (1) | EP1379671B1 (pl) |
| JP (1) | JP4038127B2 (pl) |
| KR (1) | KR100876629B1 (pl) |
| CN (2) | CN1309836C (pl) |
| AT (1) | ATE430807T1 (pl) |
| AU (1) | AU2002244584B2 (pl) |
| BR (1) | BRPI0208456B8 (pl) |
| CA (1) | CA2442135C (pl) |
| CY (1) | CY1109267T1 (pl) |
| CZ (1) | CZ304525B6 (pl) |
| DE (1) | DE60232234D1 (pl) |
| DK (1) | DK1379671T3 (pl) |
| ES (1) | ES2324466T3 (pl) |
| HU (1) | HU228065B1 (pl) |
| MX (1) | MXPA03008810A (pl) |
| MY (2) | MY148759A (pl) |
| PL (1) | PL202951B1 (pl) |
| PT (1) | PT1379671E (pl) |
| RU (2) | RU2312142C2 (pl) |
| SK (1) | SK287969B6 (pl) |
| UA (1) | UA82647C2 (pl) |
| WO (1) | WO2002077210A2 (pl) |
| ZA (1) | ZA200307517B (pl) |
Families Citing this family (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2772047B1 (fr) * | 1997-12-05 | 2004-04-09 | Ct Nat D Etudes Veterinaires E | Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection |
| US20040062775A1 (en) * | 1997-12-05 | 2004-04-01 | Agence Francaise De Securite Sanitaire Des Aliments | Circovirus sequences associated with piglet weight loss disease (PWD) |
| ES2170622B1 (es) * | 1999-12-03 | 2004-05-16 | Consejo Superior De Investigaciones Cientificas | Clones y vectores infectivos derivados de coronavirus y sus aplicaciones. |
| ATE430807T1 (de) | 2001-03-27 | 2009-05-15 | Univ Saskatchewan | Verfahren zur kultivierung von circovirus |
| US20030096377A1 (en) * | 2001-06-28 | 2003-05-22 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Differential PCR-RFLP assay for detecting and distinguishing between nonpathogenic PCV-1 and pathogenic PCV-2 |
| US7279166B2 (en) * | 2001-12-12 | 2007-10-09 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof |
| US7276353B2 (en) * | 2001-12-12 | 2007-10-02 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof |
| UA95602C2 (ru) | 2004-12-30 | 2011-08-25 | Берингер Ингельхейм Ветмедика, Инк. | Иммуногенная композиция цвс2 и способы приготовления такой композиции |
| US7833707B2 (en) | 2004-12-30 | 2010-11-16 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2 |
| US7700285B1 (en) | 2005-12-29 | 2010-04-20 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | PCV2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions |
| US8834891B2 (en) | 2005-03-14 | 2014-09-16 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Immunogenic compositions comprising Lawsonia intracellularis |
| MX338626B (es) | 2005-12-29 | 2016-04-26 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Uso de una composicion inmunogenica de pcv2 para producir los sintomas clinicos en cerdos. |
| TWI528970B (zh) * | 2005-12-29 | 2016-04-11 | 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 | 多價第二型豬環狀病毒（ｐｃｖ２）免疫組合物及製備該組合物之方法 |
| US20100129397A1 (en) | 2006-12-11 | 2010-05-27 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Effective method of treatment of porcine circovirus and lawsonia intracellularis infections |
| PT2481420T (pt) * | 2006-12-15 | 2019-05-31 | Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc | Vacina para porcos anti-pcv2 de dose única |
| EP1941903A1 (en) | 2007-01-03 | 2008-07-09 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Prophylaxis and treatment of PRDC |
| EP1958644A1 (en) | 2007-02-13 | 2008-08-20 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Prevention and treatment of sub-clinical pcvd |
| WO2008140414A1 (en) * | 2007-05-11 | 2008-11-20 | Temasek Life Sciences Laboratory Limited | Production of a homogeneous cell line highly permissive to porcine circovirus type 2 (pcv2) infection |
| WO2008151215A1 (en) * | 2007-06-04 | 2008-12-11 | Merial Limited | Production of porcine circovirus proteins in plants |
| US7829274B2 (en) * | 2007-09-04 | 2010-11-09 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Reduction of concomitant infections in pigs by the use of PCV2 antigen |
| JP2011507522A (ja) * | 2007-12-21 | 2011-03-10 | ワイス・エルエルシー | 豚サーコウイルスに対してブタを免疫化するための方法および組成物 |
| WO2009088950A2 (en) * | 2007-12-31 | 2009-07-16 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Pcv2 orf2 virus like particle with foreign amino acid insertion |
| CA2712006A1 (en) * | 2008-01-23 | 2009-10-15 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Pcv2 mycoplasma hyopneumoniae immunogenic compositions and methods of producing such compositions |
| MX2010011353A (es) * | 2008-04-16 | 2011-02-23 | Virginia Tech Intell Prop | Circovirus porcino quimerico pcv2gen-1rep y usos del mismo. |
| AR078253A1 (es) * | 2009-09-02 | 2011-10-26 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Metodos para reducir la actividad antivirica en composiciones pcv-2 y composiciones pcv-2 con mejor inmunogenicidad |
| US20120100168A1 (en) * | 2010-01-25 | 2012-04-26 | Blood Systems, Inc. | Cyclovirus and methods of use |
| MX2016003855A (es) | 2013-09-25 | 2016-08-04 | Zoetis Services Llc | Composicion de vacuna de circovirus porcino tipo 2b divergente y procedimientos de uso. |
| AU2014329524B2 (en) | 2013-10-02 | 2019-01-17 | Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. | PCV2 ORF2 protein variant and virus like particles composed thereof |
| EP3294876A1 (en) * | 2015-05-14 | 2018-03-21 | Merial, Inc. | Method for porcine circovirus production and pcv2 vaccines |
| US10462620B2 (en) * | 2016-10-11 | 2019-10-29 | Orion Labs | Group communication forwarding to a secondary service |
| CN114934020B (zh) * | 2022-01-30 | 2024-02-13 | 山东省滨州畜牧兽医研究院 | 猪视网膜上皮细胞系及其建立方法和应用 |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001507216A (ja) * | 1996-10-23 | 2001-06-05 | ザ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ペンシルバニア | 免疫療法および改良ワクチン |
| AUPO856097A0 (en) | 1997-08-14 | 1997-09-04 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Vector |
| US7192594B2 (en) | 1997-10-03 | 2007-03-20 | Merial Limited | Postweaning multisystemic wasting syndrome and porcine circovirus from pigs |
| US6517843B1 (en) * | 1999-08-31 | 2003-02-11 | Merial | Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2 |
| US6391314B1 (en) | 1997-10-03 | 2002-05-21 | Merial | Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents |
| FR2781159B1 (fr) * | 1998-07-06 | 2000-10-06 | Merial Sas | Vaccin circovirus et parvovirus porcin |
| UA78180C2 (uk) | 1997-10-03 | 2007-03-15 | Меріаль | Кільцевий вірус свині типу ii, вакцини та діагностичні реагенти |
| FR2772047B1 (fr) | 1997-12-05 | 2004-04-09 | Ct Nat D Etudes Veterinaires E | Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection |
| EP1064024A4 (en) | 1998-03-13 | 2005-04-06 | Univ Georgia Res Found | VACCINES AGAINST CIRCOVIRUS INFECTIONS |
| US6492343B1 (en) | 1998-04-15 | 2002-12-10 | University Of Saskatchewan | Porcine adenovirus type 3 genome |
| DE69941786D1 (de) | 1998-09-08 | 2010-01-21 | Brij P Giri | Chemolumineszente 1,2-dioxetane |
| CA2349760C (en) | 1998-11-02 | 2012-02-21 | University Of Saskatchewan | Bovine cells expressing adeno virus essential functions for propagation of recombinant adenoviral vectors |
| FR2789695B1 (fr) | 1999-02-11 | 2003-03-07 | Merial Sas | Vecteurs et vaccins viraux a base d'adenovirus porcins recombines et replicatifs |
| US6943152B1 (en) | 1999-06-10 | 2005-09-13 | Merial | DNA vaccine-PCV |
| US6497883B1 (en) | 1999-06-10 | 2002-12-24 | Merial | Porcine circovirus recombinant poxvirus vaccine |
| CA2413265A1 (en) * | 2000-05-03 | 2001-11-08 | University Of Guelph | Porcine adenovirus type 5 vector and vaccine |
| ATE430807T1 (de) * | 2001-03-27 | 2009-05-15 | Univ Saskatchewan | Verfahren zur kultivierung von circovirus |
-
2002
- 2002-03-27 AT AT02712700T patent/ATE430807T1/de active
- 2002-03-27 US US10/112,540 patent/US6794163B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-27 DE DE60232234T patent/DE60232234D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-27 SK SK1210-2003A patent/SK287969B6/sk unknown
- 2002-03-27 AU AU2002244584A patent/AU2002244584B2/en not_active Expired
- 2002-03-27 MX MXPA03008810A patent/MXPA03008810A/es active IP Right Grant
- 2002-03-27 EP EP02712700A patent/EP1379671B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-27 CZ CZ2003-2584A patent/CZ304525B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2002-03-27 MY MYPI2011006359A patent/MY148759A/en unknown
- 2002-03-27 PT PT02712700T patent/PT1379671E/pt unknown
- 2002-03-27 DK DK02712700T patent/DK1379671T3/da active
- 2002-03-27 WO PCT/CA2002/000413 patent/WO2002077210A2/en active Application Filing
- 2002-03-27 JP JP2002576653A patent/JP4038127B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-27 UA UA2003109561A patent/UA82647C2/uk unknown
- 2002-03-27 KR KR1020037012491A patent/KR100876629B1/ko active IP Right Grant
- 2002-03-27 ES ES02712700T patent/ES2324466T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-27 PL PL364077A patent/PL202951B1/pl unknown
- 2002-03-27 CA CA002442135A patent/CA2442135C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-27 CN CNB02809221XA patent/CN1309836C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-27 HU HU0500161A patent/HU228065B1/hu unknown
- 2002-03-27 CN CN2006100731464A patent/CN1840656B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-27 MY MYPI20021106A patent/MY146518A/en unknown
- 2002-03-27 BR BRPI0208456A patent/BRPI0208456B8/pt active IP Right Grant
- 2002-03-27 RU RU2003131342/13A patent/RU2312142C2/ru active
-
2003
- 2003-09-26 ZA ZA200307517A patent/ZA200307517B/en unknown
-
2004
- 2004-05-07 US US10/840,879 patent/US7172899B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2007
- 2007-01-17 US US11/654,869 patent/US7560278B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2007-03-23 RU RU2007110808/13A patent/RU2007110808A/ru not_active Application Discontinuation
-
2009
- 2009-08-04 CY CY20091100822T patent/CY1109267T1/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7560278B2 (en) | Methods to culture circovirus | |
| AU2002244584A1 (en) | Methods to culture circovirus | |
| JP4623964B2 (ja) | キメラ感染性ｄｎａクローン、キメラブタサーコウイルスおよびそれらの使用 | |
| Fan et al. | Immunogenicity of empty capsids of porcine circovius type 2 produced in insect cells | |
| EP2155246B1 (en) | Production of a homogeneous cell line highly permissive to porcine circovirus type 2 (pcv2) infection | |
| Shuai et al. | Functional exchangeability of the nuclear localization signal (NLS) of capsid protein between PCV1 and PCV2 in vitro: Implications for the role of NLS in viral replication | |
| Zhu et al. | Isolation, genome phylogenetic analysis and in vitro rescue of a newly emerging porcine circovirus type 2 | |
| Pogranichniy et al. | Animal Circoviruses | |
| AU2012202224A1 (en) | Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof |