MX2010011353A - Circovirus porcino quimerico pcv2gen-1rep y usos del mismo. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico quimérico novedoso del circovirus porcino (PCV2Gen-1 Rep) que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica el circovirus porcino de tipo 2 (PCV2), que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína Rep del circovirus porcino de tipo 1 (PCV1), particularmente en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína Rep de PCVI es un gen del marco de lectura abierto (ORF) y, más particularmente, en donde el gen Rep del ORF es ORF1; se construye una molécula de ácido nucleico quimérico muy conveniente reemplazando el gen Rep de ORF1 de PCV2 con el gen Rep de ORF1 de PCV1; la invención también abarca el plásmido o vector viral biológicamente funcional que contiene las moléculas de ácido nucleico quimérico único, células hospederas adecuadas transfectadas por el plásmido o vector, circovirus porcinos quiméricos infecciosos que son producidos por las células hospederas adecuadas, el procedimiento de producción de un producto polipeptídico inmunogénico que utiliza la quimera nueva, vacunas virales que protegen a un cerdo contra la infección viral o el síndrome del desmedro multisistémico post-destete (PMWS) causados por PCV2, métodos de protección de un cerdo contra la infección viral o el síndrome del desmedro multisistémico post-destete (PMWS) causados por PCV2, métodos de preparación de la quimera única de PCV2Gen-1Rep, etcétera; además, esta invención incluye un método nuevo para mejorar la replicación y el título de PCV2 en un cultivo celular.

Description

COVIRUS PORCINO QUIMÉRICO PCV2Gen-1Rep Y USOS DE CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un circovirus nérico único (PCV2Gen-1 Rep) en el que está insertada una secu o nucleico que codifica una proteína Rep de PCV1 en el ómico de PCV2, y su uso como antígeno en una nueva vacuna q rta o atenuada para proteger a los cerdos de infección viral o esmedro multisistémico post-destete (PMWS) causados por PCV ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Todas las patentes y publicaciones citadas ecificación se incorporan aquí como referencia en su totalidad. mination of pig foetal material", Vet Microbiol. 44:49-64 (199 c y A. Afshar, "Porcine circovirus antigens in PK-15 cell line (AT and evidence of antibodies to circovirus in Canadian pigs", Ca . 53:431-433 (1989); S. Edwards y J. J. Sands, "Evidence of ction in British pigs", Vet. Rec. 134:680-681 (1994); I. Tisch dies on epidemiology and pathogenicity of porcine circovirus", A 71-276 (1986)). Aunque el PCV1 no causa ninguna enfermed os, subsiguientemente se determinó que el circovirus porcino de geno. En 1991 fue reconocida por primer vez la cepa variante ominada circovirus porcino de tipo 2 (PCV2) en cerdos en Can ontró que estaba asociada con el síndrome del desmedro multi t-destete (PMWS) (G. M. Alian et al., "Isolation of porcine circo ses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe n. Invest. 10:3-10 (1998); I. Morozov et a/., "Detection of a novel ine circovirus in pigs with postweaning multisystemic wasting syn DNA replication of porcine circovirus type 2", Virology 313:452-9 CV1 y PCV2 tienen organización genómica similar con dos m ura abiertos (ORF) (A.K. Cheung, "Identification of the essential ntial transcription units for protein synthesis, DNA replica ctious virus production of porcine circovirus type 1 ", Arc (5):975-88 (2004); A. K. Cheung, "Transcriptional analysis of virus type 2", Virology 305(1): 168-180 (2003); A. Mankert ntification of a protein essential for replication of porcine circo ?. Virol. 79(Pt 2):381-384 (1998); P. Nawagitgul ef e/., Open readi porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein", J. G 281-2287 (2000)). En los dos virus, el ORF1 es responsa icación viral y se empalma alternativamente en 2 proteínas fu cipales, Rep y Rep' (A.K. Cheung, "Identification of the essential ntial transcription units for protein synthesis, DNA replica ctious virus production of porcine circovirus type 1", Arc aproximadamente 83% de identidad de secuencia de nucleótid dentidad de secuencia de aminoácidos (I. Morozov et a/., "Dete í strain of porcine circovirus in pigs with postweaning multi ting syndrome", J. Clin. Microbiol. 36:2535-2541 (1998)). El ORF roteína inmunogénica de la cápside viral de los dos virus (P. Naw Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a maj ein", J. Gen. Viroi 81 :2281-2287 (2000)), y es más variabl eína Rep, con aproximadamente 67% de identidad de secu leótidos y 65% de identidad de secuencia de aminoácidos entre 2 (I. Morozov et al., "Detection of a novel strain of porcine circ with postweaning multisystemic wasting syndrome", J. Clin. 535-2541 (1998)). Recientemente, se identificó un tercer ORF, CV2 pero no en PCV1 , y se informó que estaba implicado en la Liu et al., "Characterization of a previously unidentified viral p ine circovirus type 2-infected cells and its role in virus-induced a pathogenic PCV1 in weanling pigs", J. ViroL 77:1 1232-243 cribieron la construcción de un virus quimérico denominado PCV1 el ORF de PCV2 está clonado en el esqueleto del genoma de P licaciones destacan el intercambio del gen de la cápside de O ye sus secuencias intergénicas de PCV2 en lugar del ORF2 de más revelan una molécula de PCV2-1 de ácido nucleico q proco infeccioso, que comprende una molécula de ácido nucl ifica PCV2 que tiene un gen de ORF2 inmunogénico de un geno, en lugar de un gen de ORF2 de la molécula de ácido nu 2 patógeno. Aunque la quimera PCV1-2 suministró u ralmente avirulento, la molécula de ácido nucleico quimérico r 2-1 , que se preparó solamente como un modelo expe aneció virulenta sin ninguna ventaja comercial sobre el PCV2, ines de investigación para comparar las características virales co Ninguna de las patentes ni los artículos anteriormente men 1232-243 (2003)). Por otra parte, el PCV1 se ha adaptado pa r en células PK-15, y el virus PCV1 adaptado al cultivo de célul e mejor que PCV2, duplicándose a un título por lo ximadamente 1 unidad logarítmica más alto que PCV2 en célul Fenaux et a/., "Two amino acid mutations in the capsid protein ine circovirus (PCV2) enhanced PCV2 replication in vitro and at virus in vivo", J. Virol. 78:13440-6 (2004); M. Fenaux unogenicity and pathogenicity of chimeric infectious DNA c ogenic porcine circovirus type 2 (PCV2) and nonpathogenic nling pigs", J. Virol. 77:1 1232-243 (2003)). Este aumento de la c eplicación de PCV1 en las células PK-15 probablemente se debe ue PCV1 fue aislado originalmente de la línea de células PK-15 aminante persistente del cultivo celular, y por lo tanto está adapt er en células PK-15. Sin embargo, las cepas de PCV2 patóg n la misma capacidad de replicación que PCV1 , lo que repre génicas de PCV2, se identificó una secuencia del tipo de ele uesta estimulada por interferón a (ISRE) (GAAANNGAAA) en P e activar la transcripción del gen en respuesta a IFN-a, de forma tividad reconocida del elemento ISRE (J.E. Darnell, Jr., ef a/., "J ways and transcriptional activation in response to IFNs a cellular signaling proteins", Science 264:1415-21 (1994)). trado que el herpesvirus asociado con el sarcoma de Kaposi s virales que interaccionan con una secuencia viral codificada E que es responsable de activación adicional del gen viral (J osi's sarcoma-associated herpesvirus/human herpesvirus 8 r transcription activator regulates viral and cellular genes via in ulated response elements", J. Virol. 79:5640-52 (2005)). Mee traron recientemente que tanto en células de riñon porcino (PK-1 células monocíticas porcinas (3D4/31) tratadas con IFN-a des ulación con PCV2, hay un aumento del número de células in IFN-? después de infección por PCV2 resultó en un aumento de ero de células infectadas, y la adición de IFN-? antes de la inocul 2 aumentó el número de células antígeno PCV2 positivas en 706 las 3D4/31 , debido a un aumento del internamiento celular del v posible que esté presente un factor de transcripción que respo ación de IFN-? en la región de promotor de la secuencia de PC a ahora todo es conjetura y no está todavía corroborado. Mucho responden a la expresión de IFN, sino que también la iante varias rutas de transcripción para evitar la respuesta celul Goodbourn, "Interferons: cell signalling, immune modulation, onse and virus countermeasures", J. Gen. Virol. 81 :2341-64 da por estudiar, considerados juntos, el efecto de IFN-a e IFN-? cción por PCV2 en cultivos de células y la función de la secuenci E en la regulación de las respuestas de IFN-a e IFN-?. No ob ión de interferón para estimular el crecimiento de PCV2 ica debido a las cantidades insuficientes de antígeno producido d icación de vacunas de PCV2, que la presente invención rrollando una nueva quimera de circovirus porcino que ificativamente el título y la capacidad de replicación del virus par de vacuna quimérica más grandes que los obtenidos anteriorme Por lo tanto, un objetivo importante de la presente inve eer una combinación única de PCV1 y PCV2 que retiene la c génica del PCV2 patógeno para provocar respuestas inmunes ad que alcanza, innovadoramente, las propiedades superi imiento de título de PCV1.

Además, un objetivo importante de la presente inve er un producto de vacuna quimérica mejorado basado en P eger a los cerdos contra la infección viral o el síndrome del d isistémico post-destete (PMWS) causados por PCV2, en oramiento comprende una replicación mejor que el PCV2 de orige BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un circovirus érico único en el que una secuencia de ácido nucleico que c eína de repiicación o Rep del circovirus porcino de tipo 1 (PC rporada en el esqueleto genómico del circovirus porcino de tipo 2 modalidad muy conveniente de la invención se refiere a la con la quimera PCV2Gen-1 Rep en la que el gen Rep del marco d rto 1 (ORF1) de PCV1 reemplaza al gen Rep del ORF1 de PC uctura genómica de PCV2. La invención también abarca los p gicamente funcionales, vectores virales, etcétera, que conti vas moléculas de ácido nucleico quimérico que aquí se describe pederás adecuadas transfectadas por los plásmidos o vect prenden el ADN quimérico, y métodos de preparación strucciones quiméricas. Adicionalmente, el alcance de la if ¡cativamente mejorados con respecto al virus PCV2 de origen, una modalidad adicional de la invención está dirigida a un m ramiento de la replicación y título de PCV2 en un cultivo celular.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS A continuación se describirán los antecedentes de la in artida de la técnica haciendo referencia a los dibujos anexo les: Las figuras 1A-1C y las figuras 1a-1c muestran que el quimérico SDM-C6 (con el gen Rep de PCV1 clonado en el esqu oma de PCV2) es infeccioso cuando se transfecta en células PK ras 1A y 1a ilustran células PK-15 transfectadas con el genoma q -C6 concatamerizado; las figuras 1 B y 1b ilustran célula sfectadas con una sola copia del genoma quimérico SDM-C6 line pocilios duplicados de células infectadas se cosecharon cada 1 ítulos del virus se determinaron por medio de IFA.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN De acuerdo con la presente invención, se proveen as de ácido nucleico quimérico infeccioso de circovirus /2Gen-1 Rep), virus quiméricos vivos producidos por la molécula eico quimérico, y vacunas veterinarias para proteger a los cerd ción viral o el síndrome del desmedro multisistémico pos WS) causados por el circovirus porcino de tipo 2 eíficamente, la invención se refiere a la construcción y caracteri de una molécula de ácido nucleico quimérico de circovirus 2Gen-1 Rep), en la que la molécula de ácido nucleico que codifi iene una secuencia de ácido nucleico que codifica una pro 2. Para obtener propiedades óptimas de la quimera, es a rible que el gen Rep de ORF1 de PCV1 reemplace un marco d rto de PCV2, particularmente el gen Rep de ORF1 de PCV eleto genómico de PCV2.

Otra modalidad de la presente invención incluye un m aración nuevo de la molécula de ácido nucleico quimérico de P p que aquí se describe, que comprende los siguientes pasos: (a) quitar de una molécula de ácido nucleico que codific secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína Rep; (b) incorporar la secuencia de ácido nucleico que co ína Rep de PCV1 en una molécula de ácido nucleico que codific (c) recuperar la molécula de ácido nucleico quimérico.

El método se puede modificar convenientemente para ciones del virus de quimera de la presente invención en donde el El circovirus porcino quimérico novedoso de esta invenc ado preferiblemente para mejorar significativamente la capac ación y aumentar los títulos con respecto al virus PCV2 de orig emplos que se dan más abajo se construye una quimera represe denomina "SDM-C6". La muestra del virus quimérico SD iosa in vitro cuando se transfecta en células PK-15, indicando qu es intercambiable entre entre PCV1 y PCV2.

El rasgo de crecimiento mejorado del virus quimérico SD teriza por medio de una curva de crecimiento de un paso que c aracterísticas de crecimiento del virus quimérico con los virus de tipo silvestre. Los resultados muestran que el virus de qui ca sorprendentemente a un título aproximadamente 1 unidad log alto, y de forma más eficiente que su virus PCV2 de origen en cul as. Aunque el virus quimérico se duplica a un título similar al P eno, los estudios también muestran que el PCV2Gen-1 Rep quim a de PCV2. Aunque una diferencia de 1 unidad logarítmica p ignificativa para otros virus, el aumento de 1 unidad logarítmica d CV2 hace una enorme diferencia en la producción de vacunas d es, títulos más altos reducirían el volumen de vacuna po ntando así la potencia del producto final y la eficiencia de so de fabricación. Convenientemente, el uso de la quimera PC nueva de la presente invención mejora notablemente la produc acunas de PCV2 con respecto a lo que se había logrado en el ién, puesto que la quimera PCV2Gen-1 Rep se basa únicamen eleto genómico PCV2 original, es una sustancia antigénica excel vacuna para la protección de los cerdos contra la infección vi S causados por PCV2, debido a la presencia, dentro de la cons uimera, del gen ORF2 inmunogénico de la cápside de PCV2, lo rtante para provocar una respuesta inmune en los cerdos inoculad Una de las principales diferencias que distinguen ación del PCV (A. K. Cheung, "Detection of rampant nucleotide r origin of DNA replication of porcine circovirus type 1", Virology 005); A. K. Cheung, "Identification of an octanucleotide motif se tial for viral protein, DNA, and progeny virus biosynthesis at the replication of porcine circovirus type 2", Virology 324:28-36 (2 ertz et al., "New repórter gene-based replication assay ngeability of replication factors of porcine circovirus types 1 an 77:9885-93 (2003)). Puesto que la alteración de una cepa d construir el virus SDM-C6 quimérico se basa en la adición de un g V1 en lugar del gen Rep de la secuencia de ADN de PCV2, s ner que el gen Rep de PCV1 puede contribuir al increment idad de replicación. Sin embargo, tal suposición serí ulación hasta que la construcción esté realmente hecha y pro studios de crecimiento, particularmente debido al hecho de que tógeno y el PCV2 patógeno comparten solo 68-76 % de homol idad de replicación del virus quimérico PCV2Gen-1 Rep de la p ción está por ser determinado.

Hasta la fecha no se tienen reportes previos de la incorp n Rep de PCV1 dentro del esqueleto genómico del PCV2 patóge ción de un patógeno infeccioso con propiedades de rep adas sobre las dos cepas de origen, como se describe en la p sta del aumento de la capacidad de replicación del virus quiméric Gen-1 Rep, por lo tanto, una modalidad adicional de la p ción se refiere a un método novedoso para mejorar la replicación V2 en un cultivo celular, que comprende los siguientes pasos: (a) construir un virus quimérico PCV2Gen-1 Rep en el ep de ORF1 de PCV2 está reemplazado por el gen Rep de O ; (b) inocular una línea celular adecuada con la Gen-1Rep; os, o adaptadas específicamente para sostener el crecimie irus porcinos.

El alcance de la presente invención también incluye pl icamente funcionales, vectores virales, etcétera, que contie ulas novedosas de ácido nucleico quimérico descritas en la p ificación, células hospederas adecuadas transfectadas p idos o vectores, y circovirus porcino quimérico producido por las deras. Además, la invención abarca un proceso de producció cto polipeptídico inmunogénico que comprende desarrolla ciones nutrientes adecuadas células hospederas procariót ióticas transfectadas con la molécula de ácido nucleico quimé irus porcino (PCV2Gen-1 Rep), como se describe en la p ificación, de una manera que permita la expresión de dicho p ptídico, y aislar el producto polipeptídico deseado de la expresi ula quimérica. nogénica de la secuencia de ADN quimérico que codifica , el virus de quimera clonado, un plásmido o vector viral que con culas de ADN quimérico, la secuencia de ADN recombin Gen-1 Rep, etc. Se pueden dar al cerdo concurrentemen enos tales como PRRSV, PPV, otros agentes infecciosos del uladores inmunes, para proveer un espectro amplio de protecció fecciones virales.

Las vacunas comprenden, por ejemplo, la molécula d ico quimérico de PCV2Gen-1 Rep, el genoma quimérico clo idos o vectores adecuados tales como por ejemplo el vector quimérico muerto (desactivado) o atenuado, etc., en combinació ulo inocuo fisiológicamente aceptable, y opcionalmente uno vantes estándares. Preferiblemente, en la vacuna se usa como rus de quimera muerto.

El adyuvante que se puede administrar en conjunto os, citocinas (como IL-1 , IL-2, IL-7, IFN-a, IFN-ß, IFN-?, etc.), sa ofosforil lípido A (MLA), muramil dipéptidos (MDP), etcétera, vantes adecuados incluyen, por ejemplo, sulfato de potasio y rotoxina termolábil o termoestable aislada de Escherichia co//, to a o la subunidad B de la misma, toxina de la difteria, toxina del a de la tos ferina, adyuvante completo o incompleto de Freund, vantes basados en toxinas, tales como la toxina de la difteria, l étanos y la toxina de la tos ferina, se pueden desactivar antes de jemplo, por tratamiento con formaldehído.

Además, las vacunas pueden contener antígenos adi promover la actividad inmune del virus o ADN quimérico de la ción, tales como por ejemplo el virus del síndrome reprod ratorio porcino (PRRSV), parvovirus porcino (PPV), otros ciosos del cerdo, y estimuladores inmunes.

Las nuevas vacunas de esta invención no están restri tenuado o desactivado mediante cualquier método reconocido ad preparar vacunas de virus desactivado, por ejemplo, la propaga a partir del clon de ADN infeccioso se hace mediante los r cidos o descritos en la presente especificación. Después se op ctivación del virus en serie mediante los protocolos gene cidos de los expertos en la materia.

Las vacunas de virus desactivado se pueden preparar tra quimérico derivado del ADN clonado con agentes desactivado formalina o disolventes hidrofóbicos, ácidos, etc., por irradiación violeta o rayos X, por calentamiento, etc. La desactivación se ha era entendida en la técnica. Por ejemplo, en la desactivación lmente una muestra de virus adecuada o una muestra de su iene el virus se trata durante un tiempo suficiente con una ca entración suficiente de agente desactivador, a una temperatu ientemente altos (o bajos, dependiendo del agente desactivad ión.

Para preparar vacunas atenuadas de clones patógenos, tenúa (se hace no patógeno o inocuo) el PCV2Gen-1 Rep patóge tado al cultivo de tejido, por medio de los métodos co almente por medio de pases en serie a través de cultivos celular s patógenos también se pueden atenuar mediante supresiones ciones de gen de producción viral.

Además, es posible determinar con precisión las secue ótidos del genoma viral responsables de la virulencia y ticamente el virus avirulento, por ejemplo, mediante mutagénesis tio. Con la mutagénesis dirigida al sitio es posible añadir, su biar uno o más nucleótidos (véase por ejemplo Zoller et al.} DN 1984). Se sintetiza un oligonucleótido que contiene la mutación aparea con una porción de ADN viral de una sola cadena. La da que resulta de este procedimiento se utiliza para transformar b n de protoplasto y otras técnicas muy conocidas (por ejemplo, S /., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring ratory Press, 1989). El virus clonado muestra entonces la ada. Alternativamente se pueden sintetizar dos oligonucleóti enen la mutación apropiada. Estos se pueden aparear para for oble cadena que se puede insertar en el ADN viral para producir tud completa.

Una línea de células de insecto (como HI-FIVE) s formar con un vector de transferencia que contiene moléculas ico obtenidas del virus o copiadas del genoma viral, que codific de las proteínas inmunodominantes del virus. El vector de trans ye, por ejemplo, ADN linealizado de baculovirus y un plásm ene los polinucleótidos inmunogénicos. La línea de células hos uede cotransfectar con el ADN linealizado de baculovirus y un hacer un baculovirus recombinante. Alternativamente se pued iente para proteger al cerdo expuesto al virus que causa el riblemente, la protección del cerdo es hasta un grado en el qu los síntomas o efectos fisiológicos adversos de la enfermedad cen significativamente, o son atenuados o prevenidos totalmente.

La vacuna se puede administrar en una sola dosis o tidas. Las dosis pueden variar, por ejemplo, de aproximadar gramo a aproximadamente 1 ,000 microgramos del ADN plasmí ene el genoma de ADN quimérico infeccioso (dependiend entración del componente inmunoactivo de la vacuna), preferib 00 a 200 microgramos del clon de ADN quimérico PCV2Gen-1 cen métodos para determinar o titular las dosis adecuadas del énico activo, para encontrar dosis efectivas mínimas basadas en erdo, la concentración del antígeno y otros factores típicos.

Convenientemente, la vacuna se administra a un c esto todavía al virus PCV. La vacuna que contiene la s nodeficiency virus molecular clone", Virology 238:157-160 (1 ms ef a/., "In vivo transfection of bovine leukemia provirus into ogy 189:775-777 (1992)), estas vías son muy preferidas, adem ica vía de administración intranasal. Aunque menos conv ién se contempla administrar la vacuna al cerdo mediante ino linfoide.

Para administrarse como líquido, la presente vacuna s arar en forma de una solución acuosa, jarabe, elíxir, tintura, formas farmacéuticas son muy conocidas y normalmente se p isolución del antígeno y otros aditivos típicos en el vehículo o vente apropiado. Los vehículos o disolventes adecuados inclu ción, agua, solución salina, etanol, etilenglicol, glicerol, etc. Los s son, por ejemplo, colorantes certificados, saborizantes, edulco ervadores antimicrobianos tales como timerosal (etilmercuriotio odio). Tales soluciones se pueden estabilizar, por ejemplo, ag tipos de formas farmacéuticas líquidas se pueden preparar medi dos convencionales. Por ejemplo, las suspensiones se pueden do un molino coloidal. Por ejemplo, las emulsiones se pueden do un homogeneizador.

Las formas farmacéuticas parenterales, diseñadas p tadas en los sistemas fluidos del cuerpo, requieren tener la isoton decuados para los valores correspondientes de los fluidos co nos. La isotonicidad se puede ajusfar adecuadamente con cl y otras sales conforme sea necesario. Para aumentar la solubi gredientes en la forma farmacéutica líquida y la estabilidad de en usar disolventes adecuados, como etanol o propilenglicol. os que se pueden usar en la presente vacuna incluyen, sin li osa, antioxidantes convencionales y agentes quelantes convenc como ácido etilendiamonotetraacético (EDTA). Las acéuticas parenterales también se deben esterilizar antes de usar roximadamente 28 °C) y a presión atmosférica. Todas las ntajes mencionados en la presente se basan en el peso y t eraturas se expresan en grados centígrados, a menos que se esp ra manera.

Con los ejemplos no limitativos que se dan a continu e comprender más la invención.

EJEMPLO 1 Construcción del PCV2Gen-1Rep quimérico En todos los experimentos in vitro que se exp nuación se usaron células PK-15 libres de PCV. Estas cé aron previamente por dilución de punto final (M. Fenaux et ai, mic DNA of type 2 porcine circovirus is infectious when injected he liver and lymph nodes of pigs: characterization of clinical disea medio de PCR con los iniciadores PCV1 REP CTGGCCAAGCAAGAAAAG 3' (que corresponde a la SEQ ID N REPR (5' AACCATTACGATGTGATCAAAAAGACTC TTTATATGGGAAAAGGG 3' (que corresponde a la SEQ ID NO: cir el fragmento del gen PCVI Rep con los sitios de enzima de re y Sc/I en cualquier extremo. La reacción de PCR consistió en 45 ía Platinum PCR SuperMix High Fidelity (Invitrogen, Carisbad, el Iniciador PCV1 REPR, 20 pM del iniciador PCV1 REPF, y 1 µ? DN infeccioso de una sola copia de PCV1. La reacción del termo istió en una desnaturalización inicial durante 2 min a 94°C, y 35 c aturalización a 94°C durante 30 s, apareamiento a 55°C durante sión a 68eC durante 30 s, seguidos por una incubación final nte 7 min. El fragmento PCVI Rep se separó en un gel de agaros purificó usando el kit Geneclean II (Qbiogene, Irvine, CA). El fr 1 Rep se digirió entonces con Sa/I y Sc/I, separadamente, y el fr e introdujeron en cualquier extremo del fragmento. La reacción istió en 20 pM del iniciador PCV2GENF, 20 pM del iniciador PCV M de dNTP (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), 200mM de MgCI2, iguador de PCR 10X, 72 µ? de H2Od, 5 unidades de AmpliTaq stems, Foster City, CA), y 1 µ? del clon de ADN infeccioso de P sola copia. La reacción del termociclador consistió aturalización inicial a 94°C durante 10 min, y 38 ci aturalización a 94°C durante 1 min, apareamiento a 50°C durante sión a 72°C durante 45 s, seguidos por una extensión final nte 7 min. El fragmento del esqueleto genómico de PCV2 (si , PCV2Gen, se separó en un gel de agarosa al 1 % y se purificó U eneclean II. Después, el fragmento PCV2Gen se digirió con Bfr radamente, se corrió en un gel de agarosa al 1 %, y se purificó U eneclean II.

Para generar el clon de ADN infeccioso quimérico de ) y 2.9 kb (vector pBluescript II SK+).

EJEMPLO 2 ruebas de viabilidad del clon de ADN quimérico PCV2Gen-1 Se hicieron pruebas de viabilidad del clon de ADN q Gen-1 Rep por medio de transfección de células PK-15. Se a de restricción Kpn\ para cortar el genoma PCV2Gen-1 Rep q ector plasmídico pBluescript II SK+. El genoma quimérico PC se corrió en un gel de agarosa al 1 %, se purificó usando GeneCl iguientemente se concatamerizó con ADN ligasa T4, cialmente las técnicas convencionales previamente descritas (M. , 2002, supra). Células PK-15 a aproximadamente 70% de con rrolladas en un portaobjetos de cámara Lab-Tek se transfecta del genoma PCV2Gen-1 Rep concatamerizado, usando Lipofect va de virus se cosechó 3 días después de la transfección y se ti o de IFA con un anticuerpo policlonal específico de ORF2 de PC scribió anteriormente (ib.).

EJEMPLO 3 Secuenciación del ADN para confirmar el qenoma quiméric Se usaron los iniciadores Rep830F GTCTTCTTCTGCGGTAACG 3' (que corresponde a la SEQ ID 30R (5' GTTCTACCCTCTTCCAAACCTTCC 3' (que correspon ID NO:6)), para amplificar la región de unión entre el extrem iento PCV2Gen y el extremo 5' del fragmento PCVI Rep. Se us dores ReplOF (5' GGAAGACTGCTGGAGAACAATCC 3 sponde a la SEQ ID NO:7)) y ReplO ACTTCACACCCAAACCTG 3' (que corresponde a la SEQ ID EJEMPLO 4 Mutagénesis dirigida al sitio El clon de ADN quimérico PCV2Gen-1 Rep inicial cioso por transfección en células PK-15. Después de ana encia del genoma quimérico, se identificó una inserción de 6 nuc \GC) después del codón de iniciación ATG del gen Rep de O . Para corregir este error y la inserción no deseada introducid y los pasos de clonación, se usaron los iniciadores M GCAGCAACATGCCAAGCAAGAAAAGCGG 3' (que correspon ID NO:9)) y MVTR (5' CCGCTTTTCTTGCTTGGCATGTTGC TG ue corresponde a la SEQ ID NO: 10)), para suprimir la inserci ótidos, usando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikCh tagene). Células TOP10 se transformaron con el producto mu rdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen). Se selecc samente por mutagénesis dirigida al sitio. Se encontró que érico nuevo, SDM-C6, era infeccioso después de la transfec as PK-15.

EJEMPLO 5 aración de reservas de virus para la caracterización in vitro d quiméricos Se prepararon reservas de virus PCV1 y PCV2, de cí infeccioso de PCV1 y PCV2, respectivamente, por transfec as PK-15 de acuerdo con las técnicas convencionales anteri ritas (M. Fenaux et aL, 2002, supra). El título infeccioso de cada rus se determinó por medio de IFA con un anticuerpo específico d CV2 (ib.).

El genoma quimérico SDM-C6 que contiene el gen Rep d cioso de la reserva del virus quimérico SDM-C6 se determinó po A con un anticuerpo monoclonal de ORF2 de PCV2 (Rural Tech Brookings, SD), a una dilución de 1 :1000 en solución tiguadora de fosfato (10X, pH 7.4) (Invitrogen). La reserva de viru nía un título de virus infeccioso excelente de 0.5 x 105 5 TCID50/ s PK-15 transfectadas con el genoma SDM-C6 tanto concata linealizado fueron fuertemente positivas según la prueba IFA C y figuras 1a-1c), estableciendo que el genoma quimérico SDM n Rep de PCV1 clonado en el esqueleto del genoma de P ioso in vitro.

EJEMPLO 6 Curva de crecimiento de un paso Para caracterizar el crecimiento del virus quimérico y co con 2% de FBS y antibiótico-antimicótico 1X, y las placas se in nuamente a 37 °C con 5% de C02. A las 0, 12, 24, 36, 48, 60, oras después de la inoculación (hdi), las células de un pocilio duplicada se cosecharon raspándolas hacia el sobrenadant as cosechadas se congelaron y descongelaron 3 veces y se guar hasta su titulación. Se determinó el título infeccioso cada objetos de cámara Lab-Tek II de 8 pocilios (Nalge Nunc Inter ester, NY) usando inóculos diluidos en serie seguido por IFA uerpo monoclonal de ORF2 de PCV2 usando el método de Sp er (M. Fenaux et al.t 2002, supra).

Los datos mostraron que el virus quimérico SDM rrolló y también el virus PCV1 (figura 2) se desarrolló a un título d TCIDso/ml a las 96 hdi, mientras que PCV2 se desarrolló solo TCID5o/ml a las 96 hdi. Doce hdi, el virus quimérico SD rrolló hasta un título de 6.95 x 102 0 TCID50/ml, mientras que l lidades particulares de la presente invención con fines de ilustrac imitación. Se entiende que toda otra modificación, ramific alente que resulten obvios para los expertos en la materia basán revelación, están incluidos dentro del alcance de la invención reci

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Una molécula de ácido nucleico quimérico de ci no (PCV2Gen-1 Rep) que comprende una molécula de ácido nucl ica el circovirus porcino de tipo 2 (PCV2), que contiene una secu nucleico que codifica una proteína Rep del circovirus porcino d 1). 2 - La molécula de ácido nucleico quimérico de conformi ivindicación 1 , caracterizada además porque la secuencia d ico que codifica la proteína Rep de PCV1 es el gen del marco d to 1 (ORF1 ), y el gen Rep del ORF1 de PCV2 está reemplazad ep del ORF1 de PCV1. 3.- Un plásmido o vector viral biológicamente funció fectadas con la molécula de ácido nucleico quimérico de ci no de la reivindicación 1 o 2, de manera que permitan la expr producto polipeptídico, y aislar el producto polipeptídico desea sión de la molécula quimérica. 7.- Una vacuna viral que protege a un cerdo contra la i o el síndrome del desmedro multisistémico post-destete ( ados por PCV2, que comprende un vehículo inocuo fisiológi table y una cantidad inmunogénica de un miembro adecua ado o desactivado seleccionado del conjunto que consiste en: cula de ácido nucleico quimérico de circovirus porcino (PCV2Ge comprende una molécula de ácido nucleico que codifica el ci no de tipo 2 (PCV2), que contiene una secuencia de ácido nucl ica una proteína Rep del circovirus porcino de tipo 1 (PCV1); ido o vector viral biológicamente funcional que contiene una mol nucleico quimérico de circovirus porcino (PCV2Gen-1 Re terizada además porque la molécula de ácido nucleico q ene una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína 1 que comprende el gen del marco de lectura abierto 1 (ORF1), del ORF1 de PCV2 está reemplazado por el gen Rep del ORF1 d 9. - El uso de una molécula de ácido nucleico quimé irus porcino (PCV2Gen-1 Rep) de la reivindicación 1 , o un plá r viral biológicamente funcional de la reivindicación 3, o un ci no quimérico infeccioso de la reivindicación 5, en la preparación na para la protección de un cerdo contra la infección viral o el sí esmedro multisistémico post-destete (PMWS) causados por PCV 10. - El uso como el que se reclama en la reivindicació e la vacuna está adaptada para ser administrable por vía pa asal, intradérmica o transdérmica. 11. - Un método de preparación de la molécula de ácido érico de PCV2Gen-1 Rep de la reivindicación 1 , que compre ica la proteína Rep de PCV1. 13. - El método de conformidad con la reivindicac terizado además porque el paso (b) también comprende quitar el 1 de PCV2, y después incorporar la secuencia de ácido nucle rende el gen Rep del ORF1 de PCV1 en la posición del gen OR cula de ácido nucleico que codifica PCV2. 14. - Un método de mejoramiento de la replicación y el t en un cultivo celular, que comprende los siguientes pasos: (a) c rus quimérico PCV2Gen-1 Rep en el cual un gen Rep del ORF1 d reemplazado por el gen Rep del ORF1 de PCV1 ; (b) inocular u r adecuada con la quimera PCV2Gen-1 Rep; (c) cultivar la Gen-1 Rep en un medio de crecimiento de virus adecua iciones normales, durante un tiempo suficiente para inducir la pro rus; y (d) cosechar el virus de quimera. 15. - El método de conformidad con la reivindicac RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una molécula d ico quimérico novedoso del circovirus porcino (PCV2Gen-1 R rende una molécula de ácido nucleico que codifica el circovirus o 2 (PCV2), que contiene una secuencia de ácido nucleico que roteína Rep del circovirus porcino de tipo 1 (PCV1), particularm e la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína Rep d n gen del marco de lectura abierto (ORF) y, más particularme e el gen Rep del ORF es ORF1 ; se construye una molécula d ico quimérico muy conveniente reemplazando el gen Rep de O con el gen Rep de ORF1 de PCV1 ; la invención también a ido o vector viral biológicamente funcional que contiene las m ácido nucleico quimérico único, células hospederas ad fectadas por el plásmido o vector, circovirus porcinos . qui mejorar la replicacion y el título de PCV2 en un cultivo celular.