CN111892659A

CN111892659A - 一种嵌合型猪圆环病毒PCV1-2d疫苗及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111892659A
Application number: CN202010699266.5A
Authority: CN
Inventors: 徐高原; 张华伟; 朱娴静; 周明光; 罗修鑫; 陈波; 郝根喜; 方玉林; 汤细彪; 陈章表; 金建云
Original assignee: Wuhan Keqian Biological Co ltd
Current assignee: Wuhan Keqian Biological Co ltd
Priority date: 2020-07-20
Filing date: 2020-07-20
Publication date: 2020-11-06

Abstract

本发明涉及一种嵌合型猪圆环病毒PCV1‑2d疫苗及其制备方法和应用。本发明首先人工合成猪圆环病毒PCV2d的ORF2区替换猪圆环病毒PCV1的ORF2区得到PCV1‑2d的核苷酸序列，后将其全基因在没有载体的情况下导入PK细胞中拯救，该嵌合病毒拯救效率高，收获病毒时的病毒滴度高。为适应大规模生产，本发明通过悬浮PK细胞进行病毒传代培养，F5代后病毒滴度趋于稳定，不低于10^6.5TCID₅₀/ml。本发明进一步利用制备得到的嵌合病毒PCV1‑2d制备灭活疫苗，该灭活疫苗在免疫后未出现任何局部或全身不良反应，且免疫效力高，保护率达到80％以上，适用于大规模的生产制备。

Description

一种嵌合型猪圆环病毒PCV1-2d疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及兽医生物技术领域，尤其涉及一种嵌合型猪圆环病毒PCV1-2d疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine Circovirus，PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属，是无囊膜的单链负股环状DNA病毒，为最小的动物病毒之一。会引起仔猪增生性坏死性肺炎(proliferative and necrotizing pneumonia，PNP)、猪呼吸道疾病复合症(porcinerespiratory disease complex，PRDC)、猪皮炎肾病综合征(porcine dermatitis andnephropathy，PDNS)、断奶仔猪多系统消耗综合征(Post weaning multisystemic wastingsyndrome，PMWS)等。猪圆环病毒存在三个基因型，包括猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)。因PCV为无囊膜病毒，故其对外界环境条件有着较强的抵抗力，病毒在pH为3的酸性环境和56℃至70℃的高温下仍保持稳定，对酒精、氯已定、氯仿、碘等脂溶性消毒剂抵抗力较强，对碱性消毒剂、氧化剂、季胺类化合物、氢氧化合物等较敏感。

目前研究较多的猪圆环病毒基因组为三个主要开放阅读框ORF1、ORF2、ORF3。ORF2位于基因组互补链上，形成病毒的核衣壳蛋白(Cap)，Cap蛋白也是圆环病毒的主要免疫原性蛋白，其C端含有较多的转角结构，亲水指数和抗原指数较高，该区段存在优势抗原表位，N端包含大量碱性氨基酸序列，其与Cap蛋白的核内定位密切相关。由此可见，Cap蛋白在疾病诊断及疫苗研究中具有重要作用。

圆环病毒目前给养猪业带来了巨大的经济损失，疫苗接种是预防PCV感染的有效手段，然而疫苗免疫不能完全阻断PCV2的感染和传播，而且商品化疫苗价格普遍居高，制约着PCV2疫苗的广泛使用。因此研制安全、高效、低价的疫苗产品是今后的主要研究方向。

发明内容

为了至少解决现有技术存在的一种问题，本发明提供了一种本发明的目的是提供一种嵌合型猪圆环病毒PCV1-2d疫苗及其制备方法和应用，本发明通过将猪圆环病毒PCV1-2d的基因全长导入PK细胞制备得到安全、高效的嵌合型猪圆环病毒PCV1-2d疫苗。

第一方面，本发明提供一种嵌合蛋白质，所述嵌合蛋白质的氨基酸序列包括：

i)使用猪圆环病毒PCV-2d的ORF2取代猪圆环病毒PCV1的ORF2后得到的氨基酸序列；

ii)i)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的氨基酸序列。

进一步地，所述嵌合蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明进一步提供编码所属嵌合蛋白质的核酸，所述核酸的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明进一步提供含有所述核酸的生物材料，所述生物材料为载体、表达盒或转基因细胞。

本发明进一步提供含有所属嵌合蛋白质的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还包括所述嵌合蛋白质以及药学上可接受的载体。

第二方面，本发明提供一种嵌合型猪圆环病毒PCV1-2d疫苗，包括所述免疫原性组合物和佐剂，所述佐剂为IMS1313，所述免疫原性组合物和所述佐剂的比例为2～4:1。

第三方面，本发明提供所述嵌合型猪圆环病毒PCV1-2d疫苗的制备方法，包括：

处理权利要求3所述核酸得到环状DNA分子，通过脂质体介导法导入细胞中进行拯救，所述细胞优选为PK-15细胞。

进一步地，所述处理权利要求3所述核酸得到环状DNA分子为：

使用T4连接酶对权利要求3所述核酸进行连接得到所述环状DNA分子。

进一步地，在所述拯救后，带毒盲传2-5代后进行病毒回收。

研究表明，猪圆环病毒PCV1对猪无致病性，但能产生血清抗体，并且在猪群中普遍存在。而PCV2合PCV3对猪只具有较强的易感性，是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原。之后本发明使用基因合成手段人工合成PCV1-2d全长基因组，通过酶切连接等手段得到环状的完整基因组，并利用脂质体介导法，将全长基因组导入无PCV1污染的PK细胞，进行嵌合病毒PCV1-2d的拯救，收集到了较高病毒滴度的病毒液，且制备而成的PCV1-2d疫苗具有较高的免疫原性。

本发明进一步提供所述嵌合蛋白质、所述免疫原性组合物和所述嵌合型猪圆环病毒PCV1-2d疫苗在制备用于治疗或预防猪圆环病毒感染的药物中的应用。

本发明具备以下有益效果：

(1)本方案提供了一株嵌合病毒PCV1-2d，基因序列均来源于人工合成，减少了基因序列的突变、缺失等。

(2)本发明将人工合成的序列酶切连接得到环状DNA，通过脂质体介导法转染至PK-15细胞中得到嵌合病毒PCV1-2d，该方法转染效率高，并且在收获病毒时，病毒滴度较高。

(3)本发明进一步通过带毒传代的方式进行盲传，得到稳定的嵌合病毒PCV1-2d，并进一步提升了病毒滴度。

(4)本发明进一步将PCV1-2d灭活乳化后制备成弱毒疫苗，动物实验结果显示该疫苗具有良好的安全性和免疫原性，适用于大规模的生产制备。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的pUC-PCV1-2d质粒酶切结果图；其中，泳道1为酶切结果，泳道M为Maker；

图2为本发明实施例1提供的PCV1-2d拯救病毒的PCR鉴定结果；其中泳道M为Maker，泳道1-5为PK细胞传代1-5代收获病毒后的PCV1-2d鉴定结果；

图3为本发明实施例1提供的PK细胞传代1-5代收获病毒后通过IFA鉴定PCV1-2d的结果图；

图4为本发明实施例2提供的小鼠分毒结果图；

图5为本发明实施例2提供的仔猪分毒结果图；

图6为本发明实施例3提供的通过质粒pBSK-PCV1-2d转染细胞的酶切鉴定图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

本实施例提供一种嵌合型猪圆环病毒PCV1-2d疫苗的制备方法，包括如下步骤：

(一)、嵌合病毒PCV1-2d的拯救

1、获取目的基因PCV1-2d

参照PCV1(GenBank No.GU722334.1)和PCV2d(GenBank No.JQ002671)基因序列，人工合成1776bp的PCV1-2d基因序列，合成的基因序列见附图中序列1。合成的目的基因PCV1-2d置于质粒载体pUC-57(Invitrogen公司)上，即以pUC-PCV1-2d的形式取得。

2、获取环化全长基因组

采用常规酶切连接的方法获得全长基因组PCV1-2d：

2.1大量抽提pUC-PCV1-2d质粒：将人工合成质粒pUC-PCV1-2d转化入DH10B感受态细胞，从平板上挑取单克隆菌落，接种于10ml Amp/LB液体培养集中，37℃、220rpm摇床震荡扩大培养，大量复制质粒，采用质粒抽提试剂盒提取质粒，KpnI进行酶切鉴定，酶切鉴定结果见附图1。

表1 pUC-PCV1-2d质粒的酶切鉴定体系

2.2线性化：取50ug酶切鉴定正确的pUC-PCV1-2d质粒，10ul KpnI内切酶进行酶切，之后跑核酸胶回收目的片段。测定回收的DNA片段浓度，按以下比例加入T4连接酶，22℃连接过夜，之后按照DNA片段回收试剂盒进行回收，回收片段后应立即进行转染，不宜过夜，不宜冻存。

表2 pUC-PCV1-2d质粒的酶切线性化体系

3、转染PK细胞，拯救嵌合病毒

将处于良好生长状态的PK-15细胞经0.25％胰酶消化后，用DMEM培养基悬浮吹匀，平铺至6孔板，待细胞长满80％进行脂质体转染。将回收的DNA片段中加入250ul Opti-MEM,轻轻混匀。将10ul Lipfectamine2000用250ul Opti-MEM培养液稀释，同样轻轻混匀，静置5min后，将DNA和Lipfectamine2000液体轻轻混匀，室温静置30min。在此期间用Opti-MEM洗6孔板2次，静置完成后将混合液加入到6孔板中，并来回轻轻混匀。将6孔板细胞放置于37℃、5％CO₂培养箱中培养5h后，将培养基更换为含2％胎牛血清的DMEM培养液，过夜培养12h后。按上述方法再次进行转染，转染5h后将培养基更换为含6％胎牛血清和3mmol/l D(+)氨基葡萄糖的DMEM培养液。

转染48h后，将6孔板中的细胞上清转移到T25细胞瓶，细胞经0.25％胰酶消化后，用含2％胎牛血清和3mmol/l D(+)氨基葡萄糖的DMEM培养基悬浮吹匀，同样全部转移到T25细胞瓶。待细胞长满单层后，收取细胞上清，记为F1，同时，细胞经0.25％胰酶消化后，用含2％胎牛血清和3mmol/l D(+)氨基葡萄糖的DMEM培养基悬浮吹匀，按1：3的比例进行传代，并按培养基：病毒液＝1:1的比例接种。以此带毒传代的方式盲传细胞至F5代。

4、嵌合病毒PCV1-2d的鉴定

4.1嵌合病毒PCV1-2d的PCR鉴定

利用武汉科前生物股份有限公司的基因组提取试剂盒进行PCV1-2d病毒基因组F1、F2、F3、F4、F5代的提取，并用特异性鉴定引物F1/R1扩增ORF2片段，能够扩增到特异性目的片段。

特异性引物为：

F1:5’-CACCCACCTCTTATGGGGTTGCG-3’

R1:5’-TCCAGTAGTTTGTAGTCTCAGCCAGAGT-3’

体系如下，鉴定结果如图2。

表3嵌合病毒PCV1-2d的PCR鉴定体系

4.2嵌合病毒PCV1-2d的IFA鉴定

取F2-F5代病毒液用DMEM作10倍稀释，接种于96孔板中，做两个重复，同时设阳性和阴性对照，然后每孔再加入PK-15细胞悬液100μl，每孔细胞量为2.0×10⁴个，保证最终每孔细胞培养基中含2％新生牛血清和3mmol/LD-氨基葡萄糖。置37℃、含5％CO₂培养箱中培养3日。弃去细胞培养液，用200μl PBS洗涤3次，每次5min，弃去PBS，每孔加入预冷的80％丙酮溶液100μl，4℃固定30min。弃去固定液，用200μl PBS洗涤3次，每次5min，弃去PBS，每孔加入用PBS配制的3％BSA封闭液100μl，置37℃温箱中作用1h。弃去封闭液，用200μl PBS洗涤3次，每次5min，弃去PBS，每孔加入用PBS按1：300稀释的PCV2 Cap单克隆抗体50μl，置37℃温箱中作用1h。弃去一抗，用200μl PBS洗涤3次，每次5min，弃去PBS，每孔加入用PBS按1：200稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG50μl，置37℃温箱中作用1h。弃去二抗，用200μl PBS洗涤3次，最后加入100μl PBS，置于荧光显微镜下观察，如图3所示，PCV1-2d-F5和阳性对照够观察到特异性荧光，阴性对照无荧光，证明成功拯救到嵌合病毒PCV1-2d。

(二)、嵌合病毒PCV1-2d的稳定传代

为进一步提高PCV1-2d的病毒滴度以及方便大规模生产，本实施例通过悬浮PK-15细胞进行嵌合病毒的扩增培养。将全悬浮PK细胞0.5-1×10⁶个/ml的密度接种于摇瓶中，于37℃、5％CO₂、150rpm/min培养箱中培养，72h后用生长液将细胞密度稀释至2-3×10⁶个/ml，加入终浓度3mmol/L的D(+)氨基葡萄糖，按5％的培养体积接种嵌合病毒PCV1-2d，37℃继续培养，96h收获病毒液。利用间接免疫荧光试验进行病毒TCID50的测定，结果如下表所示。

表4嵌合型猪圆环病毒PCV1-2 F1-F10代病毒的毒价

(三)、嵌合病毒PCV1-2d灭活疫苗的制备

将病毒液原液或稀释后加入灭活罐中，加入BEI灭活，使BEI终浓度为0.005mmol/l，边加边搅拌，混合均匀后于37℃下灭活48h，在此期间每隔2-4小时搅拌一次，之后将与水佐剂IMS1313按体积3：1混合后乳化。

实施例2

本实施例提供实施例1制备得到的嵌合病毒PCV1-2d灭活疫苗的检测结果，具体如下所示：

1、嵌合病毒PCV1-2d灭活疫苗在小鼠体内评价

1.1嵌合病毒PCV1-2d灭活疫苗在小鼠体内进行安全性评价

购买6-8周雌性Balb/C小鼠10只，分为A、B两组，每组5只。A组每只小鼠皮下注射0.3ml嵌合病毒PCV1-2d灭活疫苗；B组每只小鼠注射0.3mlPBS，连续观察14天，两组小鼠状态相同且均无异常反应，此结果表明该疫苗对小鼠是安全的。

1.2嵌合病毒PCV1-2d灭活疫苗在小鼠体内进行免疫原性评价

购买6-8周龄的雌性Balb/C小鼠10只，随机分成A、B两组，每组5只。A组每只小鼠背部皮下注射0.3ml，2周后加强免疫一次，B组不免疫。加强免疫2周后，所有小鼠每只腹腔注射猪圆环病毒HB16株病毒液0.5ml(病毒含量为10^7.0TCID50/ml)。攻毒后14日，取脾脏加入1.0ml无血清DMEM培养基，充分研磨，将其反复冻融3次后12000r/min，4℃离心10min，收集上清，0.22μm滤器过滤除菌后取20ul组织悬液用IFA进行检测。结果显示，A组1/5分离到病毒，病毒B组5/5都能分离到病毒。说明嵌合病毒PCV1-2d灭活疫苗保护率可达80％。具体结果见附图4。

2、嵌合病毒PCV1-2d灭活疫苗在猪体内评价

2.1嵌合病毒PCV1-2d灭活疫苗在猪体内进行安全性评价

购买约14-21日龄猪10头，ELISA检测无PCV2、PRRSV、PPV和CSFV抗体，随机分成A、B两组，隔离饲养，每组3头。A组每头猪免疫1头份，颈部肌肉注射，3周后进行第二次免疫；B组不免疫，作为阴性对照。连续观察至第二次免疫后28日，观察期内免疫猪健康状况良好，与非免疫猪一致，未出现因疫苗注射引起的任何局部或全身不良反应，此结果表明该疫苗对本体动物猪是安全的。

2.2.嵌合病毒PCV1-2d灭活疫苗在猪体内进行有效性评价

为了进一步评价上述制备灭活疫苗对本体动物猪的免疫效力，选购约14-21日龄猪10头，ELISA检测无PCV2、PRRSV、PPV和CSFV抗体，随机分成A、B两组，隔离饲养，每组5头。A组每头猪颈部肌肉接种2.0ml，3周后以相同剂量、相同途径进行二免；B组不免疫，作为阴性对照。二免后14日，连同对照组5头，每头猪滴鼻接种猪圆环病毒2型HB16株病毒液3.0ml和颈部肌肉注射2.0ml(病毒含量为10^7.0TCID50/ml)。攻毒后14日扑杀，取肠系膜淋巴结和腹股沟淋巴结各2.0g，在无菌条件下剪碎，分别置于不同研磨器中，加入4.0ml无血清DMEM培养基，充分研磨，将其反复冻融3次后12000r/min，4℃离心10min，收集上清，0.22μm滤器过滤除菌后取20ul组织悬液用IFA进行检测，肠系膜淋巴结和腹沟股淋巴结两者任一组织分离到病毒即判为发病。结果显示，A组1/5发病，B组5/5发病，说明嵌合病毒PCV1-2d灭活疫苗保护率可达80％，具体结果见附图5。

实施例3

本试验例通过将实施例1的步骤1中合成的目的基因PCV1-2d构建至pBluescriptII SK(+)载体上，截止步骤2.2前与实施例1中相同，从2.3开始步骤为：

1、构建pBSK-PCV1-2d质粒

(1)以环化DNA为模板，用特异性引物F2/R2扩增PCV1-2d全长基因组，特异性引物为：

F2:5’-GAAAGCTTACCAGCGCACTTCGGCA-3’

R2:5’-GAACTAGTAATACTAGAGCAGCGCA-3’

体系如下：

表5 PCV1-2d全长基因组扩增体系

(2)酶切：采用HindIII、SpeI(购自TAKARA)两个酶切位点，对扩增的PCV1-2全长进行双酶切；同时用相同的内切酶对pBluescript II SK(+)进行酶切。酶切体系如下：

表6酶切体系

酶切条件：37℃，3h。酶切后用琼脂糖核酸电泳分离片段，并切胶回收。

(3)连接：

表7连接体系

片段PCV1-2d	6μl
		载体pBluescript II SK(+)	2.5μl
T4连接酶	0.5μl
		10×缓冲液	1μl

连接条件：22℃，2h。

(4)转化：将连接产物转入大肠杆菌感受态DH10B中，涂平板。

(5)提取重组质粒pBSK-PCV1-2d：从平板上挑取单克隆菌落，采用质粒抽提试剂盒提取质粒，HindIII、SpeI进行酶切鉴定，酶切鉴定结果见图6。

3、转染PK细胞

将处于良好生长状态的PK-15细胞经0.25％胰酶消化后，用DMEM培养基悬浮吹匀，平铺至6孔板，待细胞长满80％进行脂质体转染。在pBSK-PCV1-2d质粒中中加入250ulOpti-MEM,轻轻混匀。将10ul Lipfectamine2000用250ul Opti-MEM培养液稀释，同样轻轻混匀，静置5min后，将DNA和Lipfectamine2000液体轻轻混匀，室温静置30min。在此期间用Opti-MEM洗6孔板2次，静置完成后将混合液加入到6孔板中，并来回轻轻混匀。将6孔板细胞放置于37℃、5％CO2培养箱中培养5h后，将培养基更换为含2％胎牛血清的DMEM培养液，过夜培养12h后。按上述方法再次进行转染，转染5h后将培养基更换为含6％胎牛血清和3mmol/l D(+)氨基葡萄糖的DMEM培养液。

后续PCR和IFA鉴定流程和实施例1相同，鉴定质粒pBSK-PCV1-2d成功转化至PK细胞并进行了表达。

将PK细胞按照实施例1相同的方式进行传代和病毒液收集，利用间接免疫荧光试验进行病毒TCID50的测定，结果如下表所示。

表8通过质粒pBSK-PCV1-2d转染细胞的F1-F10代病毒的毒价

将表8数据和实施例2中的表4对比可以发现，本发明通过直接转染PCV1-2d基因至PK细胞，得到的病毒滴度显著要高于通过构建pBluescript II SK(+)载体再转染PK细胞的结果。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 武汉科前生物股份有限公司

<120> 一种嵌合型猪圆环病毒PCV1-2d疫苗及其制备方法和应用

<130> KHP201113248.2

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 235

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Phe Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg

1 5 10 15

Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro

20 25 30

Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg

35 40 45

Leu Ser Arg Thr Ile Gly Tyr Thr Val Lys Lys Thr Thr Val Arg Thr

50 55 60

Pro Ser Trp Asn Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu

65 70 75 80

Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Leu Thr Val Pro Phe Glu Tyr Tyr

85 90 95

Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr

100 105 110

Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn

115 120 125

Phe Val Thr Lys Ala Asn Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr

130 135 140

Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr

145 150 155 160

Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Arg Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro

165 170 175

Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Thr Gly Asn

180 185 190

Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp

195 200 205

Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Ile Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe

210 215 220

Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro Lys Glx

225 230 235

<210> 2

<211> 1776

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtacctccg tggattgttc tccagcagtc ttccaaaatt gcaaagtagt aatcctccga 60

tagagagctt ctacagctgg gacagcagtt gaggagtacc attcctgggg ggcctgattg 120

ctggtaatca aaatactgcg ggccaaaaaa ggaacagtac cgcctttagt ctctacagtc 180

aatggatacc ggtcacacag tctcagtaga tcatcccaag gtaaccagcc ataaaaatca 240

tccaaaacaa caacttcttc tccatgatat ccatcccacc acttatttct actaggcttc 300

cagtaggtgt cgctaggctc agcaaaatta cgggcccact ggctcttccc acaaccgggc 360

gggcccacta tgacgtgtac agctgtcttc caatcacgct gctgcatctt cccgctcact 420

ttctaaagtt cagccagccc gcggaaattt ctcacatacg ttacagggaa ctgctcggct 480

acagtcacca aagaccccgt ctccaaaagg gtactcacag cagtagacag gtcgctgcgc 540

ttcccctggt tccgcggagc tccacactcg ataagtatgt ggccttcttt actgcagtat 600

tctttattcc ggtggtcggt tcctttcgct ttctcgatgt ggcagcgggc accaaaatac 660

cacttcacct tgttaaaagt ctgcttctta gcaaaattcg caaacccctg gaggtgagga 720

gttctaccct cttccaaacc ttcctctccg caaacaaaat aatcaaaaag ggagattgga 780

agctcccgta ttttgttttt ctcctcctcg gaaggattat taagggtgaa cacccacctc 840

ttatggggtt gcgggccgct tttcttgctt ggcattttca ctgacgctgc cgaggtgctg 900

ccgctgccga agtgcgctgg taatactaca gcagcgcact tctttcactt ttataggatg 960

acgtatccaa ggaggcgttt ccgcagacga agacaccgcc cccgcagcca tcttggccag 1020

atcctccgcc gccgcccctg gctcgtccac ccccgccacc gttaccgctg gagaaggaaa 1080

aatggcatct tcaacacccg cctctcccgc accatcggtt atactgtcaa gaaaaccaca 1140

gtcagaacgc cctcctggaa tgtggacatg atgagattta atattaatga ttttcttccc 1200

ccaggagggg gctcaaaccc cctcactgtg ccctttgaat actacagaat aaggaaggtt 1260

aaggttgaat tctggccctg ctccccaatc acccagggtg acaggggagt gggctccact 1320

gctgttattc tagatgataa ctttgtaaca aaggccaatg ccctaaccta tgacccctat 1380

gtaaactact cctcccgcca taccataacc cagcccttct cctaccactc ccggtacttt 1440

accccgaaac ctgtccttga taggacaatc gattacttcc aacccaataa caaaagaaat 1500

caactctggc tgagactaca aactactgga aatgtagacc atgtaggcct cggcactgcg 1560

ttcgaaaaca gtatatacga ccaggactac aatatccgta taaccatgta tgtacaattc 1620

agagaattta atcttaaaga ccccccactt aaccctaagt gaatgaataa aaataaaaac 1680

cattacgatg tgataacaaa aaagactcag taatttattt tatatgggaa aagggcacag 1740

ggtgggtcca ctgcttcaaa tcggccttcg ggtacc 1776

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cacccacctc ttatggggtt gcg 23

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tccagtagtt tgtagtctca gccagagt 28

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaaagcttac cagcgcactt cggca 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaactagtaa tactagagca gcgca 25

Claims

1.一种嵌合蛋白质，其特征在于，所述嵌合蛋白质的氨基酸序列包括：

2.根据权利要求1所述的嵌合蛋白质，其特征在于，所述嵌合蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.编码权利要求2所述嵌合蛋白质的核酸，其特征在于，所述核酸的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

4.一种生物材料，其特征在于，所述生物材料包含权利要求3所述的核酸，所述生物材料为载体、表达盒或转基因细胞。

5.一种免疫原性组合物，其特征在于，所述免疫原性组合物包括权利要求2所述嵌合蛋白质以及药学上可接受的载体。

6.一种嵌合型猪圆环病毒PCV1-2d疫苗，其特征在于，包括权利要求5所述免疫原性组合物和佐剂，所述佐剂为IMS1313，所述免疫原性组合物和所述佐剂的比例为2～4:1。

7.权利要求6所述嵌合型猪圆环病毒PCV1-2d疫苗的制备方法，其特征在于，包括：

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述处理权利要求3所述核酸得到环状DNA分子为：

9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，还包括：

在所述拯救后，带毒盲传2-5代后进行病毒回收。

10.权利要求1或2所述嵌合蛋白质，或权利要求5所述免疫原性组合物，或权利要求6所述嵌合型猪圆环病毒PCV1-2d疫苗在制备用于治疗或预防猪圆环病毒感染的药物中的应用。