CN1693455A - 嵌合型猪圆环病毒pcv1－2及其构建方法、用途 - Google Patents
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Abstract
嵌合型猪圆环病毒PCV1－2及其构建方法、用途，涉及畜牧兽医技术领域。以猪圆环病毒PCV2的PCV2－ORF2替代猪圆环病毒PCV1的PCV1－ORF2，构建由一段缺失PCV1－ORF2的基因组(pSK－PCV1ΔORF2)及一段PCV2－ORF2基因组连接构成的长度为1767bp的嵌合型猪圆环病毒PCV1－2。将嵌合型猪圆环病毒PCV1－2感染性免疫剖腹产并剥夺初乳仔猪，用于防治断奶仔猪多系统衰竭综合症。
Description
技术领域
本发明涉及畜牧兽医技术领域。
背景技术
断奶仔猪多系统衰竭综合症(Post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)，它是一种新的传染病。目前世界上许多国家和地区都有该病的报道，给养猪业造成严重的经济损失。该病多发于5～12周龄的仔猪。临床症状以进行性消瘦，行动迟缓，呼吸困难，黄疸，皮肤苍白为特症，有的猪有腹泻症状。致死率和死亡率随饲养条件、爆发的阶段不同而不同，总体上来说，致死率可达10-30％。断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)在我国多数省市已成蔓延之势。目前，该病的控制主要依靠生物安全措施，尚无疫苗可供使用。
猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)具有PCV1和PCV2两种基因型。已经研究表明，猪圆环病毒PCV1对猪无致病性，但能产生血清抗体，并且在调查的猪群中普遍存在。而猪圆环病毒PCV2对猪只具有较强的易感性，可经口腔、呼吸道途径感染不同年龄的猪。现有证据表明，怀孕母猪感染猪圆环病毒PCV2后，可经胎盘垂直传播感染仔猪。猪圆环病毒PCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的主要病原。PCV有7个开放阅读框(ORF)，其中ORF2编码病毒的Cap蛋白，构成病毒的核衣壳。PCV两种血清型的Cap蛋白上存在共同的抗原决定簇，但两者没有抗原交叉性。
发明内容
本发明目的是构建一种既无致病性，又能表达保护性抗原的嵌合型猪圆环病毒PCV1-2。
本发明的嵌合猪圆环病毒PCV1-2由一段缺失PCV1-ORF2的基因组(pSK-PCV1△ORF2)及一段PCV2-ORF2基因组连接构成，其长度为1767bp，DNA序列为：
accagcgcac ttcggcagcg gcagcacctc ggcagcgtca gtgaaaatgc caagcaagaa 60
aagcggcccg caaccccata agaggtgggt gttcaccctt aataatcctt ccgaggagga 120
gaaaaacaaa atacgggagc ttccaatctc cctttttgat tattttgttt gcggagagga 180
aggtttggaa gagggtagaa ctcctcacct ccaggggttt gcgaattttg ctaagaagca 240
gacttttaac aaggtgaagt ggtattttgg tgcccgctgc cacatcgaga aagcgaaagg 300
aaccgaccac cggaataaag aatactgcag taaagaaggc cacatactta tcgagtgtgg 360
agctccgcgg aaccagggga agcgcagcga cctgtctact gctgtgagta cccttttgga 420
gacggggtct ttggtgactg tagccgagca gttccctgta acgtatgtga gaaatttccg 480
cgggctggct gaactttaga aagtgagcgg gaagatgcag cagcgtgatt ggaagacagc 540
tgtacacgtc atagtgggcc cgcccggttg tgggaagagc cagtgggccc gtaattttgc 600
tgagcctagc gacacctact ggaagcctag tagaaataag tggtgggatg gatatcatgg 660
agaagaagtt gttgttttgg atgattttta tggctggtta ccttgggatg atctactgag 720
actgtgtgac cggtatccat tgactgtaga gactaaaggc ggtactgttc cttttttggc 780
ccgcagtatt ttgattacca gcaatcaggc cccccaggaa tggtactcct caactgctgt 840
cccagctgta gaagctctct atcggaggat tactactttg caattttgga agactgctgg 900
agaacaatcc acggaggtac ccgaaggccg atttgaagca gtggacccac cctgtgccct 960
tttcccatat aaaataaatt actgagtctt ttttgttatc acatcgtaat ggtttttatt 1020
tttattcatt tagggtttaa gtggggggtc tttaagatta aattctctga attgtacata 1080
catggttaca cggatattgt attcctggtc gtatatactg ttttcgaacg cagtgccgag 1140
gcctacgtgg tctacatttc cagcagtttg tagtctcagc cacagctgat ttcttttgtt 1200
gtttggttgg aagtaatcta tagtggaatc taggacaggt ttgggggtaa agtagcggga 1260
gtggtaggag aagggctggg ttatggtatg gcgggaggag tagtttacat aggggtcata 1320
ggtgagggct gtggcctttg ttacaaagtt atcatctaga ataacagcac tggagcccac 1380
tcccctgtca ccctgggtaa tcggggagca gggccagaat tcaaccttaa cttttcttat 1440
tctgtagtat tcaaagggca cagagcgggg gtttgagccc cctcctgggg gaagaaagtc 1500
attaatattg aatcgcatca tgtccaccgc ccaggagggc gttttgactg tggttcgctt 1560
gatagtatat ccgaaggtgc gggagaggcg ggtgttgaag atgccatttt tccttctcca 1620
gcggtaacgg tggcgggggt ggacgagcca ggggcggcgg cggaggatct ggccaagatg 1680
gctgcggggg cggtgtcttc ttctgcggta acgcctcctt ggatacgtca tcctataaaa 1740
gtgaaagaag tgcgctgctg tagtatt。
本发明还为上述嵌合型猪圆环病毒PCV1-2提供了一种构建方法：以猪圆环病毒PCV2的PCV2-ORF2替代猪圆环病毒PCV1的PCV1-ORF2，构建嵌合型猪圆环病毒PCV1-2。
通过以下步骤实现：
1)以PCR方法分别扩增猪圆环病毒PCV2的PCV2-ORF2基因组、猪圆环病毒PCV1全基因组；
2)用分子生物学方法将猪圆环病毒PCV2的PCV2-ORF2克隆入缺失PCV1-ORF2的基因组pSK-PCV1△ORF2中，将所得基因串联入pSK载体。
其中，扩增猪圆环病毒PCV2的PCV2-ORF2基因组的引物为：
5’-AGGTTATAAGTGGTGGGGGGTCTTTAAGATTAA-3’
5’-GGAAACGTTACCGCAGAAGAAGACACC-3’。
扩增猪圆环病毒PCV1全基因组的引物为：
5’-TTTGGTACCCGAAGGCCGATT-3’
5’-ATTGGTACCTCCGTGGATTGTTCT-3’。
扩增缺失PCV1ORF2的基因组(pSK-PCV1△ORF2)的引物为：
5’-GAAGTTAACCCTAAATGAATAAAAATAAAAACCATTACG-3’
5’-GGTGGCGCCTCCTTGGATACGTCATCCTATAAAAGTG-3’。
将PCV1全基因组克隆入pSK载体，即pSK-PCV1；以pSK-PCV1质粒为模板，采用PCR方法，扩增缺失PCV1-ORF2的基因组(pSK-PCV1△ORF2)；将猪圆环病毒PCV2的PCV2-ORF2基因组和猪圆环病毒PCV1全基因组的PCR产物分别克隆入转移载体，用特定的限制性内切酶(Hpa I和Nar I、Psi I和Acl I)进行酶切后，用T4DNA连接酶连接两段基因组，得到pSK-sPCV1-2DNA克隆；最后从pSK-sPCV1-2DNA克隆中用Kpn I限制性内切酶切下整个PCV1△ORF2-PCV2-ORF2基因组，经T4DNA连接酶连接形成串联二聚体，得到pSK-dPCV1-2。
本发明还为嵌合型猪圆环病毒PCV1-2提供一种用途：将嵌合型猪圆环病毒PCV1-2感染性DNA克隆免疫剖腹产并剥夺初乳仔猪，用于防治断奶仔猪多系统衰竭综合症。
本发明以致病性PCV2的ORF2替代PCV1的ORF2，构建PCV1-2感染性DNA克隆。分别转染Dulac细胞，验证其在细胞中的复制能力。PCV1-2感染性DNA克隆免疫剖腹产并剥夺初乳仔猪，测定其针对PCV2的体液免疫应答。
附图说明
图1为pSK-dPCV1-2的图谱；
图2为嵌合型猪圆环病毒PCV1-2的技术构建路线图谱；
图3为pSK-sPCV1-2、pSK-dPCV1-2DNA克隆酶切鉴定图谱；
图4为Dulac细胞的荧光图；
图5为接种PCV2的Dulac细胞荧光图；
图6为转染PCV1-2的Dulac细胞荧光图。
具体实施例
主要材料
病毒：猪圆环病毒1型(PCV1)，PK15细胞中分离鉴定，由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室保存。
载体和菌株：pBluescript SK质粒载体(简称pSK载体)和宿主菌E.coli DH5α均由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室保存。(pSK载体可由美国Stratagene公司购得)
一、构建嵌合型猪圆环病毒PCV1-2质粒：
1、根据GeneBank中猪圆环病毒PCV2的基因序列，设计含特异酶切位点(Psi I、Acl I)的引物，采用PCR方法扩增长度为700bp的PCV2-ORF2基因组。
其中，扩增猪圆环病毒PCV2的PCV2-ORF2基因组的引物为：
5’-AGGTTATAAGTGGTGGGGGGTCTTTAAGATTAA-3’
5’-GGAAACGTTACCGCAGAAGAAGACACC-3’
2、根据GeneBank中PCV1的基因序列，设计含特异酶切位点(Kpn I)的引物，采用PCR方法扩增长度为4700bp的PCV1全基因组。
扩增猪圆环病毒PCV1全基因组的引物为：
5’-TTTGGTACCCGAAGGCCGATT-3’
5’-ATTGGTACCTCCGTGGATTGTTCT-3’
3、将扩增的猪圆环病毒PCV1全基因组克隆入pSK载体，形成长度为4700bp的pSK-PCV1。
4、以pSK-PCV1质粒为模板，采用PCR方法，扩增缺失PCV1-ORF2的基因组(pSK-PCV1△ORF2)。扩增缺失PCV1-ORF2的基因组(pSK-PCV1△ORF2)的引物含特异酶切位点(Hpa I、Nar I)，为：
5’-GAAGTTAACCCTAAATGAATAAAAATAAAAACCATTACG-3’
5’-GGTGGCGCCTCCTTGGATACGTCATCCTATAAAAGTG-3’
5、将PCV2-ORF2基因组和PCV1全基因组的PCR产物分别克隆入转移载体，分别用特定的限制性内切酶Psi I和Acl I、Hpa I和Nar I进行酶切后，连接两段基因组，得到长度为4700bp的pSK-sPCV1-2DNA克隆。
6、从pSK-sPCV1-2DNA克隆中用Kpn I限制性内切酶切下整个PCV1△ORF2-PCV2-ORF2基因组，经T4DNA连接酶连接形成串联二聚体，即pSK-dPCV1-2，PCV1-2感染性克隆构建完成，长度为6400bp。
由图3表明：通过以上步骤，已成功地完成整个构建过程。
在图3中：1为pSK-dPCV1-2Sac I酶切
2为pSK-dPCV1-2Kpn I酶切
3为Hind III+EcoR I Marker
4为pSK-sPCV1-2Sac I酶切
5为pSK-sPCV1-2Kpn I酶切
二、PCV1-2感染性DNA克隆在Dulac细胞中的表达
1、材料
细胞：Dulac细胞(无PCV1污染)，由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室保存。
实验动物：9周龄的剖腹产并剥夺初乳仔猪12头
猪抗PCV2阳性血清：由浙江大学周继勇教授惠赠。
转染试剂：Lipofectamine 2000，购自Life Technologies公司。
兔抗猪FITC标记的荧光二抗，购自Sigma公司。
2、方法
2.1DNA在Dulac细胞中转染
2.2间接免疫荧光试验
DNA转染后的Dulac细胞进行固定，做间接免疫荧光试验。未转染的Dulac细胞和接种PCV2的Dulac细胞分别作为阴性和阳性对照。
3、结果
如图4，在Dulac细胞的荧光图片中无荧光。
如图5，在接种PCV2的Dulac细胞荧光图片中可见细胞内荧光。
如图6，在转染PCV1-2的Dulac细胞荧光图片中同样可见典型的细胞内荧光。
4、免疫效力试验应用：
在剖腹产并剥夺初乳仔猪体内进行免疫效力试验(见下表)，证明所研制的嵌合型PCV1-2感染性DNA克隆可以有效地刺激机体产生免疫应答并提供免疫保护。
剖腹产并剥夺初乳仔猪免疫嵌合型PCV1-2DNA克隆后
血清中产生针对PCV2抗体的检测结果
| 组别 | 免疫原 | 仔猪血清阳性数(dpv) | ||||||
| -1 | 7 | 14 | 21 | 28 | 35 | 42 | ||
| 1 | PBSPCV1-2 | 0/2 | 0/2 | 0/2 | 0/2 | 0/2 | 0/2 | 0/2 |
| 2 | DNA | 0/10 | 0/10 | 1/10 | 2/10 | 2/10 | 2/10 | 7/10 |
*dpv：免疫后天数(days post-vaccination，dpv)
Claims (11)
1、嵌合型猪圆环病毒PCV1-2，其特症在于：由一段缺失PCV1-ORF2的基因组(pSK-PCV1ΔORF2)及一段PCV2-ORF2基因组连接构成，其长度为1767bp，DNA序列为：
accagcgcac ttcggcagcg gcagcacctc ggcagcgtca gtgaaaatgc caagcaagaa 60
aagcggcccg caaccccata agaggtgggt gttcaccctt aataatcctt ccgaggagga 120
gaaaaacaaa atacgggagc ttccaatctc cctttttgat tattttgttt gcggagagga 180
aggtttggaa gagggtagaa ctcctcacct ccaggggttt gcgaattttg ctaagaagca 240
gacttttaac aaggtgaagt ggtattttgg tgcccgctgc cacatcgaga aagcgaaagg 300
aaccgaccac cggaataaag aatactgcag taaagaaggc cacatactta tcgagtgtgg 360
agctccgcgg aaccagggga agcgcagcga cctgtctact gctgtgagta cccttttgga 420
gacggggtct ttggtgactg tagccgagca gttccctgta acgtatgtga gaaatttccg 480
cgggctggct gaactttaga aagtgagcgg gaagatgcag cagcgtgatt ggaagacagc 540
tgtacacgtc atagtgggcc cgcccggttg tgggaagagc cagtgggccc gtaattttgc 600
tgagcctagc gacacctact ggaagcctag tagaaataag tggtgggatg gatatcatgg 660
agaagaagtt gttgttttgg atgattttta tggctggtta ccttgggatg atctactgag 720
actgtgtgac cggtatccat tgactgtaga gactaaaggc ggtactgttc cttttttggc 780
ccgcagtatt ttgattacca gcaatcaggc cccccaggaa tggtactcct caactgctgt 840
cccagctgta gaagctctct atcggaggat tactactttg caattttgga agactgctgg 900
agaacaatcc acggaggtac ccgaaggccg atttgaagca gtggacccac cctgtgccct 960
tttcccatat aaaataaatt actgagtctt ttttgttatc acatcgtaat ggtttttatt 1020
tttattcatt tagggtttaa gtggggggtc tttaagatta aattctctga attgtacata 1080
catggttaca cggatattgt attcctggtc gtatatactg ttttcgaacg cagtgccgag 1140
gcctacgtgg tctacatttc cagcagtttg tagtctcagc cacagctgat ttcttttgtt 1200
gtttggttgg aagtaatcta tagtggaatc taggacaggt ttgggggtaa agtagcggga 1260
gtggtaggag aagggctggg ttatggtatg gcgggaggag tagtttacat aggggtcata 1320
ggtgagggct gtggcctttg ttacaaagtt atcatctaga ataacagcac tggagcccac 1380
tcccctgtca ccctgggtaa tcggggagca gggccagaat tcaaccttaa cttttcttat 1440
tctgtagtat tcaaagggca cagagcgggg gtttgagccc cctcctgggg gaagaaagtc 1500
attaatattg aatcgcatca tgtccaccgc ccaggagggc gttttgactg tggttcgctt 1560
gatagtatat ccgaaggtgc gggagaggcg ggtgttgaag atgccatttt tccttctcca 1620
gcggtaacgg tggcgggggt ggacgagcca ggggcggcgg cggaggatct ggccaagatg 1680
gctgcggggg cggtgtcttc ttctgcggta acgcctcctt ggatacgtca tcctataaaa 1740
gtgaaagaag tgcgctgctg tagtatt。
2、嵌合型猪圆环病毒PCV1-2的构建方法，其特症在于以猪圆环病毒PCV2的PCV2-ORF2替代猪圆环病毒PCV1的PCV1-ORF2，构建嵌合型猪圆环病毒PCV1-2。
3、根据权利要求2所述嵌合型猪圆环病毒PCV1-2的构建方法，其特症在于通过以下步骤实现：
1)以PCR方法分别扩增猪圆环病毒PCV2的PCV2-ORF2基因组、猪圆环病毒PCV1全基因组；
2)用分子生物学方法将猪圆环病毒PCV2的ORF2克隆入缺失PCV1-ORF2的基因组pSK-PCV1ΔORF2中，将所得基因串联入pSK载体。
4、根据权利要求3所述嵌合型猪圆环病毒PCV1-2的构建方法，其特症在于：扩增猪圆环病毒PCV2的ORF2基因组的引物为：
5，-AGGTTATAAGTGGTGGGGGGTCTTTAAGATTAA-3，
5，-GGAAACGTTACCGCAGAAGAAGACACC-3，。
5、根据权利要求3所述嵌合型猪圆环病毒PCV1-2的构建方法，其特症在于：扩增猪圆环病毒PCV1全基因组的引物为：
5，-TTTGGTACCCGAAGGCCGATT-3，
5，-ATTGGTACCTCCGTGGATTGTTCT-3，。
6、根据权利要求3所述嵌合型猪圆环病毒PCV1-2的构建方法，其特症在于：扩增缺失PCV1-ORF2的基因组(pSK-PCV1ΔORF2)的引物为：
5，-GAAGTTAACCCTAAATGAATAAAAATAAAAACCATTACG-3，
5，-GGTGGCGCCTCCTTGGATACGTCATCCTATAAAAGTG-3，。
7、根据权利要求3所述嵌合型猪圆环病毒PCV1-2的构建方法，其特症在于：先将PCV1全基因组克隆入pSK载体，得到pSK-PCV1；再将猪圆环病毒PCV2的PCV2-ORF2基因组和猪圆环病毒PCV1全基因组的PCR产物分别克隆入转移载体，用特定的限制性内切酶进行酶切后，用T4DNA连接酶连接两段基因组，得到pSK-sPCV1-2 DNA克隆；最后从pSK-sPCV1-2 DNA克隆中用Kpn I限制性内切酶切下整个PCV1ΔORF2-PCV2-ORF2基因组，经T4DNA连接酶连接形成串联二聚体，得到pSK-dPCV1-2。
8、根据权利要求7所述嵌合型猪圆环病毒PCV1-2的构建方法，其特症在于：所述特定的限制性内切酶为Hpa I和Nar I、Psi I和Acl I。
9、嵌合型猪圆环病毒PCV1-2的用途，其特症在于将嵌合型猪圆环病毒PCV1-2感染性免疫剖腹产并剥夺初乳仔猪，用于防治断奶仔猪多系统衰竭综合症。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |