CN105648118B - 一种TaqMan荧光定量PCR检测嵌合型猪圆环病毒1-2的方法 - Google Patents

一种TaqMan荧光定量PCR检测嵌合型猪圆环病毒1-2的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种TaqMan荧光定量PCR检测嵌合型猪圆环病毒1‑2的方法。该发明包括引物的设计、PCV1‑2TaqMan实时荧光定量PCR反应体系及反应条件的优化。本发明建立的方法可快速、准确、高效地对PCV1‑2进行检测和定量，节省人力、物力、财力。

Description

一种TaqMan荧光定量PCR检测嵌合型猪圆环病毒1-2的方法
技术领域
本发明涉及一种TaqMan荧光定量PCR检测嵌合型猪圆环病毒1-2的方法，属于实验室技术领域。
背景技术
猪圆环病毒病(PCVD)是由猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)引起的一类猪病的总称，主要包括断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征、猪呼吸道疾病综合征和母猪的繁殖障碍症。PCVD现已在全世界范围内发生和流行，其发病率可达60％，死亡率3％-10％，发病严重地区猪场在暴发本病时死淘率达到40％左右，给世界养猪业带来了巨大的损失。为控制猪圆环病毒的流行传播，目前，商品化的全病毒灭活疫苗和亚单位疫苗已在世界各地养猪场应用，并取得较好的效果。但是这些疫苗接种成本较高，并不能完全阻断PCV2的传播。
Fenaux等(0022-538X(2003)20-11232-12)用PCV2的ORF2基因替换PCV1的ORF2基因成功构建出对猪无致病性但有感染力的嵌合型猪圆环病毒1-2，并能诱导猪体产生针对PCV2的特异性抗体。研究表明嵌合型PCV1-2疫苗免疫猪群，能快速产生细胞免疫和体液免疫应答，有效抵御PCV2各种亚型的混合感染，并且可作为PCV2疫苗的候选毒株。
目前，国内外无市售检测PCV1-2的试剂盒，又因PCV1-2与亲本PCV1和PCV2高度同源，传统PCR方法和荧光定量方法很难将三者区分开，只能通过测序鉴定。Opriessnig等(0264-410X(2010)37-5960-7)建立了PCV1-2的TaqMan荧光定量PCR检测方法，其使用CALFluor Orange 560作为5′端报告基团，但是国内这种荧光染料标记探针需要进口，价格高达万元，且合成的探针难以获得常规实验室现有荧光定量PCR仪支持。所以，在国内针对该病毒的鉴定面临费时、费力、费用高等问题，不能快速定量该病毒。
发明内容
本发明的目的是提供一种TaqMan荧光定量PCR检测嵌合型猪圆环病毒1-2的方法。本发明通过对定量检测PCV1-2的TaqMan荧光定量PCR检测方法进一步的探索，设计了针对PCV1-2的特异性引物和探针，建立了PCV1-2TaqMan荧光定量PCR检测方法。该方法对于PCV1-2的检测特异性、灵敏度很高，与猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪其它常见病毒核酸模板不发生交叉反应。
实现本发明目的的技术解决方案是：
设计一对嵌合型PCV1-2的特异性引物，横跨PCV1的ORF1和PCV2的ORF2，特异性的扩增PCV1-2基因291bp的条带，同时，在此区域PCV1的ORF1中设计一条以6-FAM荧光染料作为5′端报告基团的TaqMan探针，并构建重组质粒T easy-PCV1-2-P，优化qPCR的反应条件和反应体系，建立嵌合型猪圆环病毒1-2TaqMan荧光定量PCR检测方法。具体方法如下：
一种TaqMan荧光定量PCR检测嵌合型猪圆环病毒1-2的方法，包括以下步骤：
(1)引物设计：设计一对引物横跨PCV1的ORF1和PCV2的ORF2区，并设计TaqMan探针；
(2)PCV1-2病毒DNA的提取；
(3)重组质粒Teasy-PCV1-2-P的构建：将步骤(2)中获得的病毒DNA使用步骤(1)设计的引物进行扩增，然后将得到的目的片段连入pGEM-TEasy载体，获得重组Teasy-PCV1-2-P质粒；
(4)优化PCV1-2TaqMan实时荧光定量PCR反应条件及反应体系：通过比较探针浓度、引物浓度及循环条件对反应的扩增效率的影响，优化荧光定量PCR反应条件及反应体系；
(5)建立定量PCR的标准曲线：将步骤(3)获得的重组质粒DNA作为定量PCR阳性模板，用超纯水以10倍稀释度进行倍比稀释，将其作为模板，用步骤(4)优化后的反应条件和体系进行TaqMan实时荧光定量PCR；
(6)荧光定量PCR特异性的检测：以步骤(3)获得的重组质粒作为阳性对照，同时以其它非靶病毒DNA或cDNA为模板，超纯水作为阴性对照，用步骤(4)优化后的反应条件和体系进行TaqMan实时荧光定量PCR，观察是否有非特异性扩增；
(7)荧光定量PCR敏感性的检测：将Teasy-PCV1-2-P重组质粒106-100个拷贝数/μl为模板，以超纯水作为阴性对照，用步骤(4)优化后的反应条件和体系进行TaqMan实时荧光定量PCR，检测其灵敏度；
(8)荧光定量PCR重复性的检测：将Teasy-PCV1-2-P重组质粒稀释至104拷贝数/μl进行8次重复，用步骤(4)优化后的反应条件和体系进行TaqMan实时荧光定量PCR，间隔1个月后再将重组质粒稀释至104拷贝数/μl重复一次试验，计算2次试验Ct值的变异系数。
其中，步骤(1)中所述上下游引物P1、P2和探针序列：
P1：5′-GGCGTTCTGACTGTGGTTTT-3′
P2：5′-TTTCTTGCTTGGCATTTTCA-3′
探针序列：6FAM-CGCACTTCTTTCACTTTTATAGGATGACG-TAMRA
该对引物能扩增出PCV1-2基因组中大小为291bp的DNA片段。
步骤(4)中通过调整探针浓度、引物浓度及循环条件对反应的扩增效率进行优化，具体过程为：以108个拷贝/μl步骤(3)获得的标准品为模板，将探针和引物分别配制成30、20、15、10、5μmol/l，采用矩阵法筛选最佳探针和引物浓度。为了获得较稳定和较高的扩增效率，对TaqMan实时荧光定量PCR进行双温循环和三温循环筛选，同时将退火温度从53℃递增到60℃，对退火温度进行筛选。
有益效果：
本发明利用设计的针对PCV1-2的引物，可特异地扩增PCV1-2的基因序列，仅仅进行一个qPCR反应便可检测样本中的PCV1-2及其拷贝数，可节省传统测序鉴定方法所需的大量时间和费用。同时，我们使用的6-FAM作为探针荧光染料，与CAL Fluor Orange 560荧光染料相比其价格低廉，合成价格不足千元，并可为常规实验室现有荧光定量PCR仪支持。所以，该方法的建立可对PCV1-2的进行快速高效的定量，节省大量时间和费用，且不受特定荧光定量PCR仪的限制，应用性极强，为PCV1-2提供了可靠的定量方法。
附图说明
图1是重组Teasy-PCV1-2-P质粒PCR扩增鉴定图。
图2是TaqMan荧光定量PCR检测方法的标准曲线。
图3是TaqMan荧光定量PCR检测方法的扩增曲线。
图4是TaqMan荧光定量PCR检测方法的特异性。
图5是TaqMan荧光定量PCR检测方法的敏感性。
具体实施方式
本发明的具体技术方案如下：
(1)引物的设计
根据PCV1-2基因序列，设计上下游引物P1、P2和探针序列：
P1：5′-GGCGTTCTGACTGTGGTTTT-3′
P2：5′-TTTCTTGCTTGGCATTTTCA-3′
探针序列：6FAM-CGCACTTCTTTCACTTTTATAGGATGACG-TAMRA
该对引物能扩增出PCV1-2基因组中大小为291bp的DNA片段。
(2)PCV1-2病毒DNA的提取
取培养离心后的细胞培养液上清或反复冻融后的组织研磨液上清100μl于1.5ml指形管中，依次加入400μl超纯水、92μl 10％SDS溶液和8μl蛋白酶K(20mg/ml)，涡旋混匀后置55℃金属浴30min。再加入体积比为1:1的苯酚:氯仿600μl，剧烈震荡混匀，12000r/min离心15min，吸取上清400μl，加入-20℃预冷的无水乙醇800μl，反复颠倒数次，-20℃静置10min以上，12000r/min离心9min。弃上清，加入70％乙醇800μl洗涤，12000r/min离心5min，弃上清，瞬离，吸取残液并晾干，加入30μl RTE，37℃作用30min，立刻使用或-20℃保存备用。
(3)构建重组质粒Teasy-PCV1-2-P
①病毒DNA的扩增
在PCR管中分别加入下列试剂，建立25μl的扩增反应体系：灭菌超纯水17.25μl，10×Reaction buffer(Mg2+Free)2.5μl，MgCl2(25mmol/l)1.5μl，dNTPs(10mmol/μl)0.5μl，上下游引物P1、P2(20μmol/μl)各0.5μl，DNA模板2μl，Taq DNA聚合酶0.25μl。
PCR扩增参数：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。将扩增的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳检测，结果如图1所示(M:200bp DNA ladder；1-2:PCR product of sample；3:Negative control)。
②DNA片段的纯化回收
PCR产物电泳鉴定正确后，切下目的条带于1.5ml指形管中，用Agarose gel DNAextraction kit(Axygen公司产品)按产品说明书回收目的片段，最后用15μl超纯水或缓冲液洗脱并测定核酸浓度，-20℃保存。
③回收产物连接pGEM-TEasy载体
10μl的连接体系：5μl超纯水，1μl 10×Rapid ligation buffer，2μl胶回收DNA片段，1μl载体，1μl T4DNA连接酶，混匀后4℃连接过夜。
④重组质粒转化
用CaCl2法制备感受态大肠杆菌DH5α，冰浴4h后供转化试验用。将200μl感受态细胞与连接产物轻轻吹匀，冰浴30min，42℃热休克不超过90s，立即冰浴3min，补加37℃预热的LB培养基至1ml，上下缓慢颠倒数次，置于37℃摇床上110rpm培养45min，5000rpm离心3min，弃去800μl培养基，用剩余的200μl培养基重悬菌体并均匀涂布在AIX板，37℃CO2培养箱中过夜。
⑤质粒DNA少量制备
于AIX板上无菌挑取单个白色菌落，接种于Amp/LB液体培养基并置于37℃摇床上220rpm，培养16h左右。用碱裂解法小提质粒，取1ml培养物，12000rpm离心1min，去上清，加入100μl预冷的溶液Ⅰ重悬细菌沉淀，加入200μl现配的溶液Ⅱ，上下颠倒数次混匀后冰浴不超过5min，再加入150μl预冷的溶液Ⅲ，上下颠倒混匀冰浴3-5min。12000rpm离心10min，取400μl上清，用等体积的酚:氯仿(1:1)抽提一次，取上清，加入2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，上下轻柔颠倒数次后-20℃静置15min，12000rpm离心10min，弃上清，用70％的乙醇洗涤一次，离心弃上清，瞬离，吸干。待乙醇挥发干净后，加入30μl含RNaseA(20μg/ml)的TEbuffer(pH8.0)，37℃水浴30min，溶解DNA沉淀，-20℃冻存备用。
按照步骤①的方法，取步骤⑤提取的质粒进行PCR扩增经1％的琼脂糖凝胶电泳，出现与目的片段大小一致的重组质粒如图1，视为阳性质粒，并取阳性质粒用上下游引物进行测序。测序结果证实PCV1-2-P片段已成功克隆到pGEM-T Easy载体中。
⑦质粒DNA的大量制备
取阳性菌液，接种于500ml Amp/LB液体培养基置于37℃摇床上220rpm，培养16h左右，按照碱裂解法大量提取质粒DNA，用聚乙二醇沉淀法纯化质粒DNA，测定质粒DNA浓度及纯度后分装，-70℃保存备用。大量制备的质粒OD260/OD280为1.85，平均浓度为6547ng/μl，该质粒的纯度和浓度符合标准品质粒的要求。
(4)优化PCV1-2TaqMan实时荧光定量PCR反应体系及反应条件
与普通PCR相比，qPCR要求较高，必须对反应体系和条件进行优化，通过调整探针浓度、引物浓度及循环条件对反应的扩增效率进行优化后，确定引物、探针浓度均为10μmol/μl，退火温度为55℃，进行三温循环可获得最佳检测结果，PCR反应总体积为20μl，反应条件为：
反应程序为：95℃预变性10min，95℃变性30s，55℃退火30s，60℃延伸1min，40个循环。
(5)定量标准品制备
根据公式：DNA拷贝数(拷贝/μl)＝(质粒浓度/平均分子量)×6.02×1023，计算步骤(3)④所提重组质粒拷贝数为1.81×1012个拷贝/μl，并将其作为定量PCR阳性模板，用超纯水以10倍稀释度进行倍比稀释，分别稀释至1011、1010、109……100个拷贝/μl，取103-108个拷贝/μl作为标准品置于4℃备用。
(6)建立定量PCR的标准曲线
以10倍倍比稀释标准品，以103-108个拷贝/μl建立标准曲线。扩增效率(E)和相关系数(R2)是判断标准曲线优劣的两个重要指标，理想R2值应大于0.98，E值应在0.8-1.2之间。图2和图3分别为标准曲线和扩增曲线，其扩增效率为0.94％，相关系数为0.9995，均符合标准曲线制作要求，可以用于嵌合型PCV1-2样品拷贝数的检测。
(7)特异性试验
以103、104个拷贝/μl的Teasy-PCV1-2-P重组质粒作为阳性对照，同时以PCV1、PCV2、PPV、PRV的DNA以及CSFV、PRRSV的反转录cDNA为模板，以超纯水作为阴性对照，用优化后的反应体系和程序进行TaqMan实时荧光定量PCR，由图4可知，2个浓度的阳性质粒均有信号，而其他非靶DNA、cDNA以及阴性对照孔均无扩增曲线出现，表明建立的嵌合型PCV1-2TaqMan实时荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性。
(8)敏感性试验
将T easy-PCV1-2-P重组质粒进行10倍倍比稀释以106-100个拷贝数/μl为模板，以超纯水作为阴性对照，用优化后的反应体系和程序进行TaqMan实时荧光定量PCR，由图5可知，106-101个拷贝数/μl均有扩增曲线，且相关性和扩增效率均达到荧光定量PCR要求。表明该检测方法最低检测限度可达10个拷贝数/μl。
(9)重复性试验
将Teasy-PCV1-2-P重组质粒稀释至104拷贝数/μl进行8次重复，用步骤(4)优化后的反应体系和程序进行TaqMan实时荧光定量PCR，间隔1个月后再将重组质粒稀释至104拷贝数/μl重复一次试验，计算两次试验Ct值的变异系数。
两次试验所得的Ct值平均值相近，Ct值标准差非常小，计算得出的变异系数分别为0.40％和0.45％，Ct值误差不到0.5，表明建立的嵌合型PCV1-2TaqMan荧光定量PCR检测方法具有良好的重复性，结果见表1。
表1TaqMan荧光定量PCR检测方法的重复性
Table 1.Repeatablity of TaqMan real-time fluorescent quantitative PCRdetecting method

Claims (2)

1.一种TaqMan荧光定量PCR检测嵌合型猪圆环病毒1-2的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)引物设计：设计一对引物横跨PCV1的ORF1和PCV2的ORF2区，并设计TaqMan 探针；所述上下游引物P1、P2和 探针序列：
P1：5′-GGCGTTCTGACTGTGGTTTT-3′
P2：5′-TTTCTTGCTTGGCATTTTCA-3′
探针序列：6FAM-CGCACTTCTTTCACTTTTATAGGATGACG-TAMRA
该对引物能扩增出PCV1-2基因组中大小为291bp的DNA片段；
(2)PCV1-2病毒DNA的提取；
(3)重组质粒Teasy-PCV1-2-P的构建：将步骤(2)中获得的病毒DNA使用步骤(1)设计的引物进行扩增，然后将得到的目的片段连入pGEM-TEasy载体，获得重组 Teasy-PCV1-2-P质粒；
(4)优化PCV1-2 TaqMan实时荧光定量PCR反应条件及反应体系：通过比较探针浓度、引物浓度及循环条件对反应的扩增效率的影响，优化荧光定量PCR反应条件及反应体系；
(5)建立荧光定量PCR的标准曲线：将步骤(3)获得的重组质粒DNA作为定量PCR阳性模板，用超纯水以10倍稀释度进行倍比稀释，将其作为模板，用步骤(4)优化后的反应条件和体系进行TaqMan实时荧光定量PCR；
(6)荧光定量PCR特异性的检测：以步骤(3)获得的重组质粒作为阳性对照，同时以其它非靶病毒DNA或cDNA为模板，超纯水作为阴性对照，用步骤(4)优化后的反应条件和体系进行TaqMan实时荧光定量PCR，观察是否有非特异性扩增；
(7)荧光定量PCR敏感性的检测：将Teasy-PCV1-2-P重组质粒106-100个拷贝数/μl为模板，以超纯水作为阴性对照，用步骤(4)优化后的反应条件和体系进行TaqMan实时荧光定量PCR，检测其灵敏度；
(8)荧光定量PCR重复性的检测：将Teasy-PCV1-2-P重组质粒稀释至104拷贝数/μl 进行8次重复，用步骤(4)优化后的反应条件和体系进行TaqMan实时荧光定量PCR，间隔1个月后再将重组质粒稀释至104拷贝数/μl重复一次试验，计算2次试验Ct值的变异系数。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中通过调整探针浓度、引物浓度及循环条件对反应的扩增效率进行优化，具体过程为：以108个拷贝/μl步骤(3)获得的标准品为模板，将探针和引物分别配制成30、20、15、10、5μmol/l，采用矩阵法筛选最佳探针和引物浓度；为了获得较稳定和较高的扩增效率，对TaqMan实时荧光定量PCR进行双温循环和三温循环筛选，同时将退火温度从53℃递增到60℃，对退火温度进行筛选。
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Comparison of commercial and experimental porcine circovirus type 2 (PCV2) Vaccines using a triple challenge with PCV2, porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), and porcine parvovirus (PPV);Shen HG et al.;《Vaccine》;20100715;第28卷(第37期);材料和方法，2.8 PCV1-2 PCR，表1
Immunogenicity and Pathogenicity of Chimeric Infectious DNA Clones of Pathogenic Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) and Nonpathogenic PCV1 in Weanling Pigs;Fenaux M et al.;《Journal of virology》;20031031;第77卷(第20期);第11232-11243页

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