KR20100135903A

KR20100135903A - 키메라 돼지 써코바이러스 ＰＣＶ２Ｇｅｎ―１Ｒｅｐ 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20100135903A
Application number: KR1020107025591A
Authority: KR
Inventors: 니콜 엠 주한; 시앙-진 멩
Original assignee: 버지니아 테크 인터렉추얼 프라퍼티스, 인크.
Priority date: 2008-04-16
Filing date: 2009-04-08
Publication date: 2010-12-27
Also published as: JP2011519273A; RU2515901C2; RU2010146480A; EP2276507A4; NZ588639A; ZA201007401B; CN102065890B; EP2276507A1; AU2009236669A1; US20110027312A1; BRPI0911200A2; AU2009236669B2; WO2009128878A1; CO6300961A2; CN102065890A; UA106587C2; MX2010011353A; CA2721513A1

Abstract

본 발명은 돼지 써코바이러스(porcine circovirus; PCV) 타입 1(PCV1) 바이러스의 Rep 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는, PCV 2(PCV2) 바이러스를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 PCV의 신규 키메라 핵산 분자(PCV2Gen-1Rep)에 관한 것으로서, 구체적으로 상기 PCV1의 Rep 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 오픈 리딩 프레임(ORF) 유전자이고, 보다 구체적으로 ORF Rep 유전자는 ORF1 Rep 유전자이다. 특히 바람직한 키메라 핵산 분자는 PCV2의 ORF1 Rep 유전자를 PCV1의 ORF1 Rep 유전자로 치환시켜 구축한다. 또한, 본 발명은 상기 독특한 키메라 핵산 분자를 함유하는 생물학적 기능성 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 상기 플라스미드 또는 벡터로 형질감염된 적절한 숙주 세포, 상기 적절한 숙주 세포에 의해 생성된 감염성 키메라 PCV, 상기 신규 키메라 핵산 분자를 사용하여 면역원성 폴리펩티드 생성물을 제조하는 방법, 바이러스 감염 또는 PCV2에 의해 발병되는 이유자돈 전신 소모성 증후군(PMWS)으로부터 돼지를 보호하는 바이러스 백신, 독특한 키메라 핵산 분자인 PCV2Gen-1Rep를 제조하는 방법 등을 포함한다. 또한, 본 발명은 세포 배양물 중에서의 PCV2의 복제 및 역가를 개선시키는 신규 방법을 포함한다.

Description

키메라 돼지 써코바이러스 ＰＣＶ２Ｇｅｎ―１Ｒｅｐ 및 이의 용도{CHIMERIC PORCINE CIRCOVIRUS PCV2Gen-1Rep AND USES THEREOF}

본 발명은 돼지 써코바이러스(porcine circovirus; PCV) 타입 1(PCV1) 바이러스의 복제(Rep) 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 PCV 타입 2(PCV2) 바이러스의 게놈 골격 내로 삽입되어 있는 독특한 키메라 PCV(PCV2Gen-1Rep); 및 바이러스 감염으로부터 또는 PCV2에 의해 발병되는 이유자돈 전신 소모성 증후군(PMWS)으로부터 돼지를 보호하기 위한 신규 키메라 사백신 또는 신규 키메라 약독화된 백신 중의 항원으로서의 상기 PCV2Gen-1Rep의 용도에 관한 것이다.

본 명세서에서 인용된 모든 특허 및 간행물은 전체로써 본원에 참고로 도입된다.

1974년, PCV1은 PK-15 세포주 ATCC CCL-33의 잠복성 오염물질로서 최초로 단리되었다(I. Tischer et al., "Characterization of papovavirus- and picornavirus-like particles in permanent pig kidney cell lines," Zentralbl. Bakteriol. Hyg. Otg. A. 226(2): 153-167 (1974)). PCV1의 동정 이후, PCV1은 돼지에서 어떠한 질환도 발병시키지 않는 편재성 돼지 바이러스인 것으로 확인되었다(G. M. Allan et al., "Pathogenesis of porcine circovirus; experimental infections of colostrum deprived piglets and examination of pig foetal material," Vet. Microbiol. 44:49-64 (1995); G. C. Dulac and A. Afshar, "Porcine circovirus antigens in PK-15 cell line (ATCC CCL-33) and evidence of antibodies to circovirus in Canadian pigs," Can. J. Vet. Res. 53:431-433 (1989); S. Edwards and J. J. Sands, "Evidence of circovirus infection in British pigs," Vet. Rec. 134:680-681 (1994); I. Tischer et al., "Studies on epidemiology and pathogenicity of porcine circovirus," Arch. Virol. 91:271-276 (1986)). PCV1이 돼지에서 어떠한 질환도 발병시키지 않지만, PCV2는 병원성 바이러스인 것으로 추후 확인되었다. 1991년, PCV2로 명명된 PCV의 변이체 균주는 캐나다에서 돼지에서 처음 발견되었고, PMWS와 관련되어 있는 것으로 밝혀졌다(G. M. Allan et al., "Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe," J. Vet. Diagn. Invest. 10:3-10 (1998); I. Morozov et al., "Detection of a novel strain of porcine circovirus in pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome," J. Clin. Microbiol. 36:2535-2541 (1998)).

PCV1 및 PCV2는 2개의 주요 오픈 리딩 프레임(ORF)을 가진 유사한 게놈 구조를 갖고 있으며, 상기 2개의 주요 ORF 중 ORF1은 바이러스 복제에 관여하는 바이러스 Rep 단백질을 코딩하고, ORF2는 바이러스 캡시드 단백질을 코딩한다. 전체적으로, PCV1과 PCV2는 그들의 전체 게놈에 있어서 68 내지 76%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 공유하지만, 각 유전자형 내의 단리물들은 90% 초과의 동일성을 공유한다(A.K. Cheung, "The essential and nonessential transcription units for viral protein synthesis and DNA replication of porcine circovirus type 2," Virology 313:452-9 (2003)). PCV1 및 PCV2는 2개의 ORF를 가진 유사한 게놈 구조를 갖고 있다(A.K. Cheung, "Identification of the essential and non-essential transcription units for protein synthesis, DNA replication and infectious virus production of porcine circovirus type 1," Arch. Virol. 149(5):975-88 (2004); A. K. Cheung, "Transcriptional analysis of porcine circovirus type 2," Virology 305(1):168-180 (2003); A. Mankertz et al., "Identification of a protein essential for replication of porcine circovirus," J. Gen. Virol. 79(Pt 2):381-384 (1998); P. Nawagitgul et al., "Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein," J. Gen. Virol. 81:2281-2287 (2000)). 상기 두 바이러스에서, ORF1은 바이러스 복제를 담당하고 있고 2종의 주요 기능성 단백질 Rep 및 Rep'로 택일적으로 스플라이싱된다(A.K. Cheung, "Identification of the essential and non-essential transcription units for protein synthesis, DNA replication and infectious virus production of porcine circovirus type 1," Arch. Virol. 149(5):975-88 (2004); A. K. Cheung, "Transcriptional analysis of porcine circovirus type 2," Virology 305(1): 168-180 (2003); A. Mankertz and B. Hillenbrand, "Replication of porcine circovirus type 1 requires two proteins encoded by the viral rep gene," Virology 279:429-38 (2001); A. Mankertz et al., "Identification of a protein essential for replication of porcine circovirus," J. Gen. Virol. 79(Pt 2):381-384 (1998); A. Mankertz et al., "Mapping and characterization of the origin of DNA replication of porcine circovirus," J. Virol. 71:2562-6 (1997)). ORF1은 PCV1과 PCV2 사이에서 약 83%의 뉴클레오티드 서열 동일성 및 86%의 아미노산 서열 동일성을 나타내면서 고도로 보존되어 있다(I. Morozov et al., "Detection of a novel strain of porcine circovirus in pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome," J. Clin. Microbiol. 36:2535-2541 (1998)). ORF2는 상기 두 바이러스에서 면역원성 바이러스 캡시드 단백질을 코딩하고(P. Nawagitgul et al., "Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein," J. Gen. Virol. 81:2281-2287 (2000)), PCV1과 PCV2 사이에서 약 67%의 뉴클레오티드 서열 동일성 및 65%의 아미노산 서열 동일성을 나타내면서 Rep 단백질보다 더 높은 가변성을 나타낸다(I. Morozov et al., "Detection of a novel strain of porcine circovirus in pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome," J. Clin. Microbiol. 36:2535-2541 (1998)). 최근에, 제3의 ORF인 ORF3이 PCV2에서는 동정되었지만 PCV1에서는 동정되지 않았고, 상기 ORF3은 아폽토시스에 관여하는 것으로 보고되었다(J. Liu et al., "Characterization of a previously unidentified viral protein in porcine circovirus type 2-infected cells and its role in virus-induced apoptosis," J. Virol. 79:8262-74 (2005)).

종래, 미국 특허 제7,279,166 B2호, 제7,276,353 B2호, 문헌(M. Fenaux et al., "A chimeric porcine circovirus (PCV) with the immunogenic capsid gene of the pathogenic PCV type 2 (PCV2) cloned into the genomic backbone of the nonpathogenic PCV1 induces protective immunity against PCV2 infection in pigs," J. Virol. 78:6297-303 (2004)) 및 문헌(M. Fenaux et al., "Immunogenicity and pathogenicity of chimeric infectious DNA clones of pathogenic porcine circovirus type 2 (PCV2) and nonpathogenic PCV1 in weanling pigs," J. Virol. 77:11232-243 (2003))에는 PCV2의 ORF가 PCV1 게놈의 골격 내로 클로닝되어 있는 키메라 바이러스(PCV1-2 키메라 바이러스로 명명됨)의 구축이 기재되어 있다. 상기 간행물들은 PCV1의 ORF2을 PCV2로부터 유래된 유전자간 서열을 포함하는 ORF2 캡시드 유전자로 치환시키는 것을 강조하고 있고 병원성 PCV2 핵산 분자의 ORF2 유전자 대신에 비병원성 PCV1의 면역원성 ORF2 유전자를 갖는 PCV2를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 PCV2-1의 감염성 역 키메라 핵산 분자를 추가로 개시한다. PCV1-2 키메라가 천연 비병원성 특징을 제공하지만, 단지 실험 모델로서 제조된 PCV2-1의 상기 역 키메라 핵산 분자는 PCV1-2와 바이러스 특징을 비교하기 위한 연구 목적 이외에 그의 모 바이러스인 PCV2에 비해 어떠한 상업적 이점도 제공하지 않으면서 병원성을 유지하였다. 전술된 특허 또는 문헌들 중 어떠한 것도 병원성 PCV의 게놈 골격을 사용하여 임의의 다른 역 키메라 바이러스를 제조하는 것을 개시하거나 암시하지 못하였고, 확실하게는 특정된 명백한 ORF2 면역원성 캡시드 유전자를 넘어선 택일적 오픈 리딩 프레임의 교환을 암시하지 못하였다.

또한, PCV1-2 키메라 바이러스는 PK-15 세포에서 PCV2의 역가와 유사한 역가 수준으로 복제된다(M. Fenaux et al., "Immunogenicity and pathogenicity of chimeric infectious DNA clones of pathogenic porcine circovirus type 2 (PCV2) and nonpathogenic PCVl in weanling pigs," J. Virol. 77:11232-243 (2003)). 다른 한편으로, PCV1은 PK-15 세포에서 더 잘 생장하도록 적응되었고, PK-15 세포 배양에 적응된 PCV1은 PK-15 세포에서 PCV2보다 약 1-로그 더 높은 역가 수준으로 복제되면서 PCV2보다 더 잘 생장한다(M. Fenaux et al., "Two amino acid mutations in the capsid protein of type 2 porcine circovirus (PCV2) enhanced PCV2 replication in vitro and attenuated the virus in vivo," J. Virol. 78: 13440-6 (2004); M. Fenaux et al., "Immunogenicity and pathogenicity of chimeric infectious DNA clones of pathogenic porcine circovirus type 2 (PCV2) and nonpathogenic PCVl in weanling pigs," J. Virol. 77: 1 1232-243 (2003)). PK-15 세포에서의 이러한 PCV1의 증가된 복제 능력은 PCV1이 잠복성 세포 배양 오염물질로서 PK-15 세포주로부터 처음 단리되었다는 사실에 기인할 것이므로 PK-15 세포에서 생장하도록 적응된다. 그러나, 병원성 PCV2 균주는 PCV1과 동일한 복제 능력을 보유하지 않고, 이러한 성질은 PK-15 세포에서 병원체의 비교적 낮은 역가로 인한 PCV2 백신 제조와 관련된 중요한 문제점을 야기한다. 따라서, PCV2, 예컨대, 불활성화된 전체 PCV2, 천연 비병원성 키메라 PCV1-2 키메라 바이러스(PCV1로부터 유래된 게놈 골격을 기초로 한 바이러스), 재조합 PCV2 캡시드 단백질 등을 기초로 한 백신의 효율적인 제조 수준의 달성이 산업에서 백신 제조자에게 실제 과제이자 어려운 과제이다.

PCV2의 유전자간 서열이 이미 조사되었을 때, 인터페론-α(IFN-α)에 의해 자극되는 반응 요소(ISRE)-유사 서열(GAAANNGAAA)이 PCV2에서 동정되었고, 상기 ISRE-유사 서열은 당분야에 인식되어 있는 ISRE-요소의 활성과 유사하게 IFN-α에 반응하여 유전자 전사를 활성화시킬 수 있다(J.E. Darnell, Jr., et al., "Jak-STAT pathways and transcriptional activation in response to IFNs and other extracellular signaling proteins," Science 264:1415-21 (1994)). 카포시 육종-관련 헤르페스바이러스(herpesvirus)는 추가 바이러스 유전자 활성화를 담당하는 바이러스 코딩된 ISRE-유사 서열과 상호작용하는 바이러스 유전자를 발현하는 것으로 밝혀져 있다(J. Zhang, "Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus/human herpesvirus 8 replication and transcription activator regulates viral and cellular genes via interferon-stimulated response elements," J. Virol. 79:5640-52 (2005)). 최근에, 문헌(P. Meerts et al., "Enhancement of porcine circovirus 2 replication in porcine cell lines by IFN-gamma before and after treatment and by IFN-alpha after treatment," J. Interferon Cytokine Res 25(11):684-93 (November 2005))은 PCV2를 접종한 후 IFN-α로 처리한 돼지 신장 세포(PK-15) 및 돼지 단핵 세포(3D4/31)가 각각 최대 529% 및 308%까지 증가된 감염 세포수를 보였다. 흥미롭게는, PCV2를 접종하기 전 IFN-α로 처리된 PK-15 세포는 감소된 감염 세포수를 보였다(69%)(상기 문헌 참조). IFN-α 이외에, PK-15 세포 및 3D4/31 세포 둘다에서 PCV2 감염에 대한 IFN-γ의 효과도 평가되었다. PCV2 감염 후 IFN-γ를 사용한 처리는 PK-15 세포에서 감염 세포수를 691%까지 증가시켰고, PCV2 접종 전 IFN-γ의 첨가는 3D4/31 세포에서 706%까지 PCV2 항원-양성 세포의 수를 증가시켰는데, 이는 바이러스의 증가된 세포 내재화로 인한 것이다(상기 문헌 참조). IFN-γ 활성화에 반응하는 전사 인자는 PCV2 서열의 프로모터 영역에 존재할 가능성이 있는데, 이는 현재까지 추측만 될 뿐 아직 확인되지 않았다. 많은 바이러스가 IFN 반응을 피하기 위해 다수의 전사 경로에 의한 IFN 발현에 반응할 뿐만 아니라 IFN 발현을 조작한다(S. Goodbourn, "Interferons: cell signalling, immune modulation, antiviral response and virus countermeasures," J. Gen. Virol. 81:2341-64 (2000)). 더불어, 세포 배양물에서 PCV2 감염에 대한 IFN-α 및 IFN-γ의 효과, 및 IFN-α 및 IFN-γ 반응을 조절하는 데 있어서 ISRE-유사 서열의 역할은 연구되어야 할 과제로 남아 있다. 그럼에도 불구하고, PCV2의 생장을 자극하기 위한 인터페론의 첨가는 선행 연구에 의해 밝혀진 바와 같이 일관성 없는 결과를 보인다. 인터페론은 돼지에게 제공될 수 있지만, 인터페론이 간에 특히 해로운 불리한 반응 및 부작용을 초래할 수 있기 때문에 인터페론계 최종 PCV2 생성물의 투여량 수준이 관심의 대상이 된다. 돼지에게 안전하게 투여될 수 있는 천연 성분의 사용에 의한 PCV2의 복제성을 개선시키는 것이 더 바람직할 것이다.

따라서, 본 발명은 종래 달성가능한 배치(batch)보다 더 큰 배치의 키메라 백신을 제조하기 위해 바이러스의 낮은 역가 및 복제 능력을 유의하게 개선시키는 신규 PCV 키메라를 개발함으로써 당분야에 인식된 명확한 문제점, 즉 PCV2 백신의 제조 과정 동안 항원 제조의 불충분한 양으로 인한 문제점을 해결하고자 한다.

본 발명의 중요한 목적은 병원성 PCV2의 항원성 능력을 보유하여 적절한 면역 반응을 일으키면서도 PCV1의 우수한 역가 생장 성질을 보유하는 PCV1과 PCV2의 독특한 조합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가로 중요한 목적은 바이러스 감염으로부터 또는 PCV2에 의해 발병되는 PMWS로부터 돼지를 보호하기 위한, PCV2를 기초로 한 개선된 키메라 백신 생성물을 제조하는 것이고, 이때 개선된 성질은 모 바이러스인 PCV2보다 더 우수한 복제 능력을 포함한다.

본 발명의 추가 목적은 이하 상세한 설명으로부터 인식될 것이다.

상기 목적은 본 명세서에 기재된 바와 같이 PCV2의 게놈 골격 내에 PCV1 Rep 유전자를 함유하는 신규 키메라 PCV2를 제공함에 의해 달성된다.

본 발명은 PCV1의 복제 또는 Rep 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 PCV2의 게놈 골격 내로 도입되어 있는 독특한 키메라 PCV에 관한 것이다. 본 발명의 특히 바람직한 실시양태는 PCV2의 게놈 구조에서 PCV2의 ORF1 Rep 유전자가 PCV1의 ORF1 Rep 유전자로 치환되어 있는 PCV2Gen-1Rep 키메라의 구축에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 명세서에 기재된 신규 키메라 핵산 분자를 함유하는 생물학적 기능성 플라스미드, 바이러스 벡터 등, 상기 키메라 DNA를 포함하는 플라스미드 또는 벡터에 의해 형질감염된 적절한 숙주 세포, 및 키메라 구축물의 제조 방법을 포괄한다. 또한, 예를 들어, 상기 키메라 DNA, 이 키메라 DNA를 포함하는 플라스미드, 키메라 바이러스 등을 포함하는 약독화된 또는 불활성화된 백신; 및 면역학적 유효량의 상기 약독화된 또는 불활성화된 백신을 바이러스 감염으로부터의 보호 또는 PCV2에 의해 발병되는 PMWS로부터의 보호가 필요한 돼지에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 돼지를 바이러스 감염 또는 PCV2에 의해 발병되는 PMWS로부터 보호하는 방법도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 놀랍게도 유리하게는, 본 발명의 키메라 PCV는 모 바이러스인 PCV2에 비해 유의하게 개선된 복제 및 역가를 제공하므로, 본 발명의 추가 실시양태는 세포 배양물에서 PCV2의 복제 및 역가를 개선시키는 신규 방법에 관한 것이다.

본 발명의 배경 및 당분야로부터의 이의 벗어남은 첨부된 도면과 관련하여 이하에 더 기재될 것이다.
도 1은 키메라 SDM-C6 DNA 클론(PCV2 게놈의 골격 내로 클로닝된 PCV1의 Rep 유전자를 가짐)이 PK-15 세포 내로 형질감염되었을 때 감염성을 나타냄을 보여준다. 패널 A 및 a는 콘카토머화된(concatomerized) SDM-C6 키메라 게놈으로 형질감염된 PK-15 세포를 보여주고; 패널 B 및 b는 선형화된 단일 카피 SDM-C6 키메라 게놈으로 형질감염된 PK-15 세포를 보여주고; 패널 C 및 c는 음성 대조군인 형질감염 시약 및 MEM을 보여준다. 좌측 패널은 PCV2 ORF2 단일클론 항체로 염색된 IFA 결과를 제공하는 반면, 우측 패널은 IFA 결과와 중첩된 PK-15 세포 단일층을 제공한다.
도 2는 PK-15 세포에서 PCV1(■), PCV2(■) 및 키메라 SDM-C6(Δ) 바이러스의 생장 특징을 1-단계 생장 곡선으로 보여준다. 6 내지 12웰 플레이트 상의 PK-15 세포를 각각의 바이러스로 0.1 감염 다중도(multiplicity of infection; MOI)로 중복 접종하였다. 감염된 세포의 2개 중복 웰을 12시간마다 회수하여 바이러스 역가를 IFA로 측정하였다.

본 발명에 따라, 독특한 감염성 PCV 키메라 핵산 분자(PCV2Gen-1Rep), 상기 키메라 핵산 분자로부터 제조된 키메라 생바이러스, 및 바이러스 감염 또는 PCV2에 의해 발병되는 PMWS로부터 돼지를 보호하기 위한 수의학적 백신이 제공된다. 구체적으로, 본 발명은 PCV2를 코딩하는 핵산 분자가 PCV1의 Rep 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 함유하고 있는 PCV 키메라 핵산 분자(PCV2Gen-1Rep)의 구축 및 시험관내 특징규명에 관한 것이다. PCV2 핵산 분자 내로의 삽입을 위해, Rep 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 비병원성 PCV 균주의 바이러스 복제에 필수적인 1종 이상의 복제 단백질을 코딩하는 1종 이상의 기능성 뉴클레오티드 서열일 수 있다. PCV2의 게놈 골격 내로의 도입용으로는 PCV1의 Rep 단백질을 코딩하는 완전한 ORF 유전자, 바람직하게는 PCV1의 ORF1 Rep 유전자를 사용하는 것이 바람직하다. PCV2의 ORF, 특히 PCV2의 게놈 골격 내의 PCV2의 ORF1 Rep 유전자를 PCV1의 ORF1 Rep 유전자로 치환시키는 것이 최적 키메라 성질을 위해 훨씬 더 바람직하다.

본 발명의 추가 실시양태는 본 명세서에 기재된 바와 같은 키메라 핵산 분자 PCV2Gen-1Rep의 신규 제조 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 제조 방법을 포함한다:

(a) PCV1을 코딩하는 핵산 분자로부터 Rep 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 제거하는 단계;

(b) PCV1의 Rep 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 PCV2를 코딩하는 핵산 분자 내로 도입하는 단계; 및

(c) 키메라 핵산 분자를 회수하는 단계.

상기 제조 방법은 본 발명의 키메라 바이러스의 변이체를 구축하도록 편리하게 변경될 수 있고, 이때 단계 (a)는 PCV1의 Rep 단백질을 코딩하는 ORF 유전자를 포함하는 핵산 서열을 제거하는 과정, 더 구체적으로, PCV1의 ORF1 Rep 유전자를 포함하는 핵산 서열을 제거하는 과정을 포함할 수 있다. 본 발명의 대안적 실시양태로서, 단계 (b)는 PCV2의 ORF1 유전자를 제거한 후 PCV1의 ORF1 Rep 유전자를 포함하는 핵산 서열을 PCV2를 코딩하는 핵산 분자의 ORF1 유전자 위치 내로 도입하는 과정을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 신규 키메라 PCV는 우선적으로 모 바이러스인 PCV2에 비해 상당히 개선된 복제 능력 및 증가된 역가를 제공하도록 고안되어 있다. 대표적인 키메라는 하기 본 명세서의 실시예에서 구축되었고 "SDM-C6"으로 명명되었다. SDM-6 키메라 바이러스 샘플은 PK-15 세포 내로 형질감염되었을 때 시험관내에서 감염성을 나타내는데, 이는 Rep 유전자가 PCV1과 PCV2 사이에서 교환될 수 있음을 의미한다.

SDM-C6 키메라 바이러스의 개선된 생장 특징은 상기 키메라 바이러스의 생장 특징을 야생형 PCV1 및 PCV2의 생장 특징과 비교하는 1-단계 생장 곡선을 특징으로 한다. 결과는 상기 키메라 바이러스가 놀랍게도 세포 배양물에서 그의 모 바이러스인 PCV2보다 약 1-로그만큼 더 높은 역가로 더 효율적으로 복제함을 보여준다. 키메라 바이러스가 비병원성 PCV1과 유사한 역가 수준으로 복제되지만, 본 연구는 본 발명의 키메라 PCV2Gen-1Rep가 PK-15 세포의 형질감염(즉, 감염 또는 접종) 시 그의 모 바이러스인 PCV1 및 PCV2보다 예상외로 더 빠르게 복제됨을 추가로 보여준다.

산업적 규모의 적절한 백신 제조를 위한 보다 높은 역가(1-로그 역가 증가조차도 상당한 것으로 간주됨) 수준으로 PCV2를 생장시키는 것이 어렵기 때문에, 본 발명은 PCV2 백신 개발에 있어서 중요한 의미를 가진 수의학 분야에서 현저한 진보를 제공한다. 1-로그 차이가 다른 바이러스의 경우에는 의미가 없을 수 있지만, PCV2의 1-로그 역가 증가는 PCV2 백신 제조에 있어서 큰 차이를 만든다. 즉, 보다 높은 역가는 투여량 당 백신 부피를 감소시켜 최종 생성물의 효능 및 전체 제조 공정의 효율성을 증가시킬 것이다. 유리하게는, 본 발명의 신규 PCV2Gen-1Rep 키메라의 사용은 과거에 이미 달성될 수 있는 수준보다 현저히 더 높은 PCV2 백신 제조를 제공한다. 또한, PCV2Gen-1Rep 키메라는 독특하게 PCV2로부터 유래된 게놈 골격을 기초로 한 것이어서, 접종된 돼지에서 면역 반응을 일으키는 데 있어서 중요한 PCV2의 면역원성 ORF2 캡시드 유전자가 상기 키메라 구축물 내에 존재하기 때문에 바이러스 감염 또는 PCV2에 의해 발병되는 PMWS로부터 돼지를 보호하기 위한 백신에 있어서 훌륭한 항원성 물질이 된다.

미국 특허 제7,279,166 B2호 및 제7,276,353 B2호에 이미 기재되어 있는 PCV1-2 키메라 바이러스와 본 발명의 SDM-C6 키메라 바이러스를 구별시켜 주는 주요 차이점들 중 하나는 핵산 서열이다: 본 발명의 PCV2Gen-1Rep 키메라 바이러스(SDM-C6)의 게놈 서열은 병원성 PCV2로부터 유래된 것이 반면, PCV1-2 키메라 바이러스는 비병원성 PCV1로부터 유래된 것이다. 문헌에는 상기 두 바이러스(즉, PCV1 및 PCV2)의 Cap 유전자와 Rep 유전자 사이의 유전자간 서열이 PCV 복제의 조절에 있어서 중요한 역할을 수행할 수 있다고 보고되어 있다(A. K. Cheung, "Detection of rampant nucleotide reversion at the origin of DNA replication of porcine circovirus type 1," Virology 333:22-30 (2005); A. K. Cheung, "Identification of an octanucleotide motif sequence essential for viral protein, DNA, and progeny virus biosynthesis at the origin of DNA replication of porcine circovirus type 2," Virology 324:28-36 (2004); A. Mankertz et al., "New reporter gene-based replication assay reveals exchangeability of replication factors of porcine circovirus types 1 and 2," J. Virol. 77:9885-93 (2003)). 키메라 SDM-C6 바이러스를 구축하기 위한 PCV2 균주의 변경은 PCV2의 DNA 서열에서 Rep 유전자 대신에 PCV1의 Rep 유전자를 부가하는 데 있기 때문에, PCV1의 Rep 유전자가 증가된 복제 능력에 기여할 것임을 추정할 수 있다. 그러나, 이러한 추정은 상기 구축물이 실제로 제조되어 생장 연구에서 구체적으로 시험될 때까지 단순한 추측일 뿐인데, 이는 비병원성 PCV1과 병원성 PCV2가 그들의 전체 게놈에서 68 내지 76%의 뉴클레오티드 서열 상동성만을 공유한다는 사실 때문이다. PCV1의 Rep 유전자는 PCV2 게놈의 기능성 코드로 번역되지 않을 수 있거나 PCV2를 코딩하는 상이한 뉴클레오티드 서열 내에서 보다 우수한 복제 능력을 제공하지 못할 수 있다. 따라서, 키메라 SDM-C6 바이러스가 PCV1의 역가와 유사한 역가 수준으로 복제된다는 본 발명의 관찰은 놀라운 결과이다. 또 다른 예상외의 특징으로서, SDM-C6 바이러스는 모 균주인 PCV1 및 PCV2보다 더 빠르게 복제되는데, 이는 본 발명의 PCV2Gen-1Rep 키메라 바이러스의 증가된 복제 능력의 기작이 확인되어야 할 과제로 남아 있음을 의미한다.

현재까지, PCV1의 Rep 유전자를 병원성 PCV2의 게놈 골격 내로 도입하여 본 명세서에 기재된 바와 같이 두 모 균주에 비개 개선된 복제 능력을 가진 감염성 병원체를 수득하는 것에 대한 기존 보고는 없다. 따라서, 신규 PCV2Gen-1Rep 키메라 바이러스의 증가된 복제 능력에 비추어, 본 발명의 추가 실시양태는 세포 배양물에서 PCV2의 복제 및 역가를 개선시키는 신규 방법으로서, 하기 단계 (a) 내지 (d)를 포함하는 방법에 관한 것이다:

(a) PCV2의 ORF1 Rep 유전자가 PCV1의 ORF1 Rep 유전자로 치환되어 있는 PCV2Gen-1Rep 키메라 바이러스를 구축하는 단계;

(b) 적절한 세포주를 PCV2Gen-1Rep 키메라 바이러스로 접종하는 단계;

(c) 바이러스 생성을 유도하기에 충분한 시간 동안 PCV2Gen-1Rep 키메라 바이러스로 접종된 상기 세포주를 표준 조건 하에 적절한 바이러스 생장 배지에서 배양하는 단계; 및

(d) 상기 PCV2Gen-1Rep 키메라 바이러스를 회수하는 단계.

상기 방법에서, 적절한 세포주의 예는 돼지 항원을 갖지 않는 돼지 신장 세포주(PK-15 세포), 돼지 정소(ST) 세포, 및 PCV를 생장시킬 수 있거나 PCV의 생장을 위해 특별히 적응된 유사한 세포주일 것이다.

본 명세서에 기재된 신규 키메라 핵산 분자를 함유하는 생물학적 기능성 플라스미드, 바이러스 벡터 등, 상기 플라스미드 또는 벡터로 형질감염된 적절한 숙주 세포, 및 상기 숙주 세포에 의해 제조된 살아있는 키메라 PCV도 본 발명의 범위 내에 있다. 또한, 본 발명은 본 명세서에 기재된 PCV 키메라 핵산 분자(PCV2Gen-1Rep)로 형질감염된 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 적절한 배양 조건 하에 면역원성 폴리펩티드 생성물의 발현을 허용하는 방식으로 생장시키는 단계, 및 상기 키메라 핵산 분자의 발현 생성물인 원하는 폴리펩티드 생성물을 단리하는 단계를 포함하는 상기 면역원성 폴리펩티드 생성물의 제조 방법을 포괄한다.

상기 키메라 바이러스 및 DNA 분자의 적절하게 약독화된 또는 불활성화된(즉, 사멸한) 백신 및 이들의 사용 방법도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 접종받은 돼지는 심각한 바이러스 감염 및 PCV2에 의해 발병된 PMWS로부터 보호된다. 상기 신규 방법은 면역학적 유효량의 본 발명에 따른 백신, 예를 들어, PCV2Gen-1Rep를 코딩하는 키메라 DNA 서열, 클로닝된 키메라 바이러스, 상기 키메라 DNA 분자를 함유하는 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 재조합 PCV2Gen-1Rep DNA 서열 등을 면역원성 양으로 포함하는 백신을 돼지에게 투여함으로써 바이러스 감염 또는 PMWS로부터 보호할 필요가 있는 돼지를 보호한다. 다른 항원, 예컨대, 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스(PRRSV), 돼지 파보바이러스(PPV), 다른 돼지 감염성 물질 및 면역자극제를 돼지에게 동시에 투여하여 바이러스 감염으로부터의 넓은 보호 스펙트럼을 제공할 수 있다.

본 발명의 백신은 예를 들어, 생리학적으로 허용가능한 무독성 담체 및 경우에 따라 1종 이상의 표준 보조제와 함께 키메라 핵산 분자 PCV2Gen-1Rep, 적절한 플라스미드 또는 벡터, 예컨대, pSK 벡터 내에 클로닝된 키메라 게놈, 사멸된(불활성화된) 또는 약독화된 키메라 바이러스 등을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 백신은 사멸된 키메라 바이러스를 항원으로서 사용한다.

본 발명의 백신과 함께 투여될 수 있는 보조제는 상기 백신에 대한 돼지의 면역학적 반응을 증가시키는 물질이다. 보조제는 백신과 동일한 시점에서 동일한 부위에 투여될 수 있거나, 상이한 시점에서 예를 들어, 부스터(booster)로서 투여될 수 있다. 또한, 보조제는 유리하게는 백신이 투여되는 방식과 상이한 방식으로 또는 백신이 투여되는 부위와 상이한 부위에서 돼지에게 투여될 수 있다. 수의학 분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 공지된 적절한 보조제는 수산화알루미늄(백반), 면역자극 결합체(ISCOMS), 비이온성 블록 중합체 또는 공중합체, 사이토킨(예컨대, IL-1, IL-2, IL-7, IFN-α, IFN-β, IFN-γ 등), 사포닌, 모노포스포릴 지질 A(MLA), 뮤라밀 다이펩티드(MDP) 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 다른 적절한 보조제는 예를 들어, 알루미늄 포타슘 설페이트, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)로부터 단리된 열-불안정성 또는 열-안정성 내독소, 콜라레 독소 또는 이의 B 서브유니트, 디프테리아 독소, 파상풍 독소, 백일해 독소, 프로인트(Freund) 불완전 또는 완전 보조제 등을 포함한다. 독소계 보조제, 예컨대, 디프테리아 독소, 파상풍 독소 및 백일해 독소는 사용 전에 예를 들어, 포름알데하이드로 처리하여 불활성화시킬 수 있다.

백신은 본 발명의 키메라 바이러스 또는 DNA의 면역학적 활성을 촉진하기 위해 추가 항원, 예컨대, PRRSV, PPV, 다른 돼지 감염성 물질 및 면역자극제를 추가로 함유할 수 있다.

본 발명의 신규 백신은 임의의 특정 종류 또는 제조 방법으로 한정되지 않는다. 클로닝된 바이러스 백신은 감염성 DNA 백신(즉, DNA를 돼지 내로 직접 주입하는 플라스미드, 벡터 또는 다른 보편적 담체의 사용), 약독화된 백신, 불활성화된 백신(사백신), 유전적으로 개조된 백신 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 이 백신들은 당분야에 공지된 표준 방법에 의해 제조된다.

본 발명의 백신에서 항원성 물질은 병원성 PCV 균주를 기초로 한 것이기 때문에, 먼저 당분야에 인식된 적절한 방법으로 활성 물질을 약독화시키거나 불활성화시켜야 한다. 예를 들어, 불활성화된 바이러스 백신을 제조하기 위해서는, 당분야에 공지되어 있는 방법 또는 본 명세서에 기재된 방법으로 감염성 DNA 클론으로부터 바이러스를 증식시킨다. 그 다음, 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 일반적으로 공지된 프로토콜을 이용하여 일련의 바이러스 불활성화를 최적화시킨다.

불활성화된 바이러스 백신은 클로닝된 DNA로부터 유래된 키메라 바이러스를 불활성화제, 예컨대, 포르말린 또는 소수성 용매, 산 등을 사용한 처리, 자외선 또는 X-선 조사, 가열 등으로 처리하여 제조할 수 있다. 불활성화는 당분야에 공지된 방식으로 수행한다. 예를 들어, 화학적 불활성화에서, 적절한 바이러스 샘플 또는 바이러스를 함유하는 혈청 샘플을, 통상적으로 바이러스를 불활성화시키기에 충분히 높은 온도(또는 불활성화제에 따라 충분히 낮은 온도) 또는 pH에서 충분한 양 또는 농도의 불활성화제로 충분한 시간 동안 처리한다. 가열에 의한 불활성화는 전형적으로 일정한 온도에서 바이러스를 불활성화시키기에 충분한 시간 동안 수행한다. 조사에 의한 불활성화는 종종 바이러스를 불활성화시키기에 충분한 시간 동안 일정한 파장의 광 또는 다른 에너지원을 이용하여 수행한다. 일반적으로, 용어 "불활성화된", "죽은" 또는 "사멸된"은 바이러스 백신과 관련하여 불활성화된 바이러스를 함유하는 백신을 의미하도록 상호교환적으로 사용된다. 바이러스는 감염될 수 있는 세포를 감염시킬 수 없는 경우 불활성화된 것으로 간주된다.

병원성 클론으로부터 약독화된 백신을 제조하기 위해서는, 조직 배양에 적응된 살아있는 병원성 PCV2Gen-1Rep를 먼저 당분야에 공지된 방법, 전형적으로 연속적인 세포 계대 배양으로 약독화시킨다(비병원성 또는 무해한 바이러스로 만듬). 병원성 클론의 약독화는 유전자 결실 또는 바이러스-생성 유전자 돌연변이에 의해 달성될 수도 있다.

또한, 병원성의 원인이 되는 바이러스 게놈 내의 뉴클레오티드 서열을 정확히 동정하고, 예를 들어, 부위-지정 돌연변이유발을 통해 비병원성 바이러스가 되도록 바이러스를 유전적으로 개조할 수 있다. 부위-지정 돌연변이유발은 하나 이상의 뉴클레오티드를 부가하거나, 결실시키거나 변경시킬 수 있다(예를 들어, 문헌(Zoller et al., DNA 3:479-488, 1984) 참조). 원하는 돌연변이를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 합성하여 단일 가닥 바이러스 DNA의 일부에 어닐링시킨다. 이 과정으로부터 생성된 하이브리드 분자를 사용하여 박테리아를 형질전환시킨다. 이어서, 적절한 돌연변이를 함유하는 단리된 이중 가닥 DNA를 사용하여 전장 DNA의 제한 단편에 결찰시켜 전장 DNA를 제조한 후 상기 전장 DNA를 적절한 세포 배양물 내로 형질감염시킨다. 형질전환에 적합한 벡터 내로의 게놈의 결찰은 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 공지된 임의의 표준 기법을 통해 달성할 수 있다. 바이러스 자손의 제조를 위한, 숙주 세포 내로의 벡터의 형질감염은 임의의 보편적인 방법, 예컨대, 인산칼슘 또는 DEAE-덱스트란 매개된 형질감염, 전기천공, 원형질체 융합 및 다른 잘 공지된 기법을 이용하여 수행할 수 있다(예를 들어, 문헌(Sambrook et ah, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 참조). 그 후, 클로닝된 바이러스는 원하는 돌연변이를 보인다. 별법으로, 적절한 돌연변이를 함유하는 2종의 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다. 이 올리고뉴클레오티드들을 어닐링하여, 바이러스 DNA 내로 삽입되어 전장 DNA를 생성할 수 있는 이중 가닥 DNA를 형성할 수 있다.

곤충 세포주(예컨대, HI-FIVE)는 바이러스로부터 수득된 또는 바이러스의 면역우성 단백질들 중 1종 이상의 면역우성 단백질을 코딩하는 바이러스 게놈으로부터 복사된 핵산 분자를 함유하는 전달 벡터로 형질전환시킬 수 있다. 전달 벡터는 예를 들어, 선형화된 바큘로바이러스 DNA, 및 면역원성 폴리뉴클레오티드를 함유하는 플라스미드를 포함한다. 재조합 바큘로바이러스를 제조하기 위해 숙주 세포주를 선형화된 바큘로바이러스 DNA 및 플라스미드로 동시-형질감염시킬 수 있다. 별법으로, 생벡터, 예컨대, 폭스바이러스 또는 아데노바이러스를 본 발명의 키메라 분자와 함께 백신으로서 사용할 수 있다.

면역학적 유효량의 본 발명의 백신은 바이러스 감염 또는 PMWS로부터의 보호가 필요한 돼지에게 투여된다. 돼지에게 접종되는 면역학적 유효량 또는 면역원성 양은 관용적인 시험에 의해 용이하게 결정될 수 있거나 용이하게 적정될 수 있다. 유효량은 PMWS를 발병시키는 바이러스에 노출된 돼지를 보호하는 데 충분한, 백신에 대한 면역학적 반응이 달성되는 양이다. 바람직하게는, 돼지는 바이러스 질환의 불리한 생리학적 증상 또는 효과 중 하나 내지 전부가 유의하게 감소되거나 완화되거나 전체적으로 예방되는 정도로 보호된다.

백신은 단회 투여분 또는 반복 투여분으로 투여될 수 있다. 투여량은 예를 들어, 약 1 내지 약 1,000 ㎍의 감염성 키메라 DNA 게놈 함유 플라스미드(이 투여량은 백신의 면역활성 성분의 농도에 의해 좌우됨), 바람직하게는 100 내지 200 ㎍의 키메라 PCV2Gen-1Rep DNA 클론일 수 있다. 돼지의 체중, 항원의 농도 및 다른 전형적인 인자들을 기초로 하여 최소 유효량을 찾기 위해 활성 항원성 물질의 적절한 투여량을 측정하거나 적정하는 방법은 당분야에 공지되어 있다.

바람직하게는, 백신은 PCV 바이러스에 아직 노출되지 않은 돼지에게 투여된다. 항원성 물질을 함유하는 백신은 비강내, 경피(즉, 전신 흡수를 위해 피부 표면에 도포됨), 비경구 등의 경로로 편리하게 투여된다. 비경구 투여 경로는 근육내, 정맥내, 복강내, 피내(즉, 주사되거나 피부 밑에 달리 배치됨), 경피 경로 등을 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 근육내 접종 경로 및 피내 접종 경로가 바이러스 감염성 DNA 클론을 사용한 다른 연구에서 성공적인 결과를 제공하였기 때문에(E. E. Sparger et al., "Infection of cats by injection with DNA of feline immunodeficiency virus molecular clone," Virology 238:157-160 (1997); L. Willems et al., "In vivo transfection of bovine leukemia provirus into sheep," Virology 189:775-777 (1992)), 실용적인 비강내 투여 경로 이외에 상기 두 경로들이 가장 바람직하다. 덜 편리하기는 하지만, 백신을 림프구내 접종을 통해 돼지에게 투여하는 것도 고려된다.

지질로서 투여된 경우, 본 발명의 백신은 수용액, 시럽, 엘릭시르, 팅크제 등의 형태로 제조될 수 있다. 이러한 제제는 당분야에 공지되어 있고 항원 및 다른 전형적인 첨가제를 적절한 담체 또는 용매 시스템에 용해시켜 제조한다. 적절한 담체 또는 용매는 물, 식염수, 에탄올, 에틸렌 글리콜, 글리세롤 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 전형적인 첨가제는 예를 들어, 인증 안료, 풍미제, 감미제 및 항생 방부제, 예컨대, 티메로살(나트륨 에틸머큐리티오살리실레이트)이다. 이러한 용액은 예를 들어, 부분 가수분해된 젤라틴, 소르비톨 또는 세포 배양 배지를 첨가함에 의해 안정화될 수 있고 당분야에 공지된 시약, 예컨대, 인산수소나트륨, 인산이수소나트륨, 인산수소칼륨, 인산이수소칼륨, 이들의 혼합물 등을 사용하여 보편적인 방법으로 완충시킬 수 있다.

액체 제제는 다른 표준 보조-제제화제와 함께 현탁화제 또는 에멀젼화제를 함유하는 현탁액 및 에멀젼을 포함할 수 있다. 이러한 종류의 액체 제제는 보편적인 방법으로 제조할 수 있다. 현탁액은 예를 들어, 콜로이드성 분쇄기를 이용하여 제조할 수 있다. 에멀젼은 예를 들어, 균질화기를 이용하여 제조할 수 있다.

체액 시스템 내로 주입되도록 디자인된 비경구 제제는 적절한 등장성 및 돼지 체액의 상응하는 수준까지의 pH 완충을 필요로 한다. 등장성은 염화나트륨 및 필요에 따라 다른 염으로 적절하게 조절할 수 있다. 적절한 용매, 예컨대, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜을 사용하여 제제 중의 성분들의 가용성 및 액체 제제의 안정성을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 백신에서 사용될 수 있는 추가 첨가제는 덱스트로스, 보편적인 항산화제 및 보편적인 킬레이팅제, 예컨대, 에틸렌다이아민 테트라아세트산(EDTA)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 비경구용 제제는 사용 전에 멸균되어야 한다.

하기 실시예는 본 발명의 일부 양태를 설명한다. 그러나, 이 실시예들은 설명을 위한 것일 뿐, 본 발명의 조건 및 범위를 전체적으로 한정하는 것으로 해석되어서는 안 됨을 이해할 것이다. 전형적인 반응 조건(예를 들어, 온도, 반응 시간 등)이 주어진 경우, 특정된 범위를 벗어나는 조건도 비록 덜 편리하더라도 이용될 수 있음을 인식해야 한다. 본 실시예는 실온(약 23℃ 내지 약 28℃) 및 대기압에서 수행된다. 달리 명시하지 않은 한, 본원에 기재된 모든 부 및 %는 중량을 기준으로 한 것이고, 모든 온도는 섭씨 온도로 표시된다.

본 발명은 하기 비-제한적 실시예에 의해 더 이해될 수 있다.

[실시예]

실시예 1

키메라 PCV2Gen-1Rep의 구축

하기 시험관내 실험 전체에서 PCV-무함유 PK-15 세포를 사용하였다. 이 세포는 종말점 희석에 의해 종래 유도된 세포이다(M. Fenaux et al., "Cloned genomic DNA of type 2 porcine circovirus is infectious when injected directly into the liver and lymph nodes of pigs: characterization of clinical disease, virus distribution, and pathologic lesions," J. Virol. 76:541-51 (2002)). PCV2 및 PCV1 단일 카피, 및 이량체화된 탠덤 반복부(tandem repeat) 감염성 DNA 클론의 구축은 이미 상기 문헌에 기재되어 있다.

PCV2 게놈(이의 유전자간 서열을 포함함)의 골격에서 PCV2의 ORF1 Rep 유전자가 PCV1의 ORF1 Rep 유전자로 치환되어 있는 키메라 PCV2Gen-1Rep를 구축하기 위해, pBluescript II SK+ 벡터 내의 PCV1 감염성 DNA 클론의 단일 카피 게놈을 프라이머 PCV1REPF(5'-CAACTGGCCAAGCAAGAAAAG-3'(서열번호 1에 상응함)) 및 PCV1REPR(5'-AACCATTACGATGTGATCAAAAAGACTCAGTAATTTATTTTATATGGGAAAAGGG-3'(서열번호 2에 상응함))을 사용하여 PCR로 증폭함으로써 한 말단에서 개조된 제한효소 부위 BalI을 생성하고 다른 한 말단에서 개조된 제한효소 부위 BclI을 생성하였다. 상기 PCR 반응물은 45 ㎕의 플라티늄 PCR 수퍼믹스 하이 피델리티(Platinum PCR SuperMix High Fidelity)(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재), 20 pM의 프라이머 PCV1REPR, 20 pM의 프라이머 PCV1REPF 및 1 ㎕의 단일 카피 PCV1 감염성 DNA 클론으로 구성되었다. 써모사이클러(thermocycler) 반응은 94℃에서 2분 동안의 초기 변성; 94℃에서 30초 동안의 변성, 55℃에서 30초 동안의 어닐링(annealing) 및 68℃에서 30초 동안의 연장으로 구성된 35 주기; 및 68℃에서 7분 동안의 최종 항온처리로 구성되었다. PCV1 Rep 단편을 1% 아가로스 겔로 분리하고 진클린(Geneclean) II 키트(큐바이오진(Qbiogene), 미국 캘리포니아주 어빈 소재)를 사용하여 정제하였다. 이어서, PCV1 Rep 단편을 BalI 및 BclI로 따로 분해하고, 생성된 분해 단편을 1% 아가로스 겔에서 분리하고 진클린 II 키트를 사용하여 정제하였다.

Rep 유전자가 결실된 PCV2 게놈 골격 단편을, 프라이머 PCV2GENF(5'-CTTTTTGATCACTTCGTAATGGTTTTTA-3'(서열번호 3에 상응함)) 및 PCV2GENR(5'-GCTTACCATGTTGCTGCTGAGGT-3'(서열번호 4에 상응함))을 사용한 PCR로 pBluescript 벡터 내의 단일 카피 PCV2 감염성 DNA 클론으로부터 증폭하였다. BfrBI 제한효소 부위를 상기 단편의 한 말단에 도입하고, BclI 제한효소 부위를 상기 단편의 다른 한 말단에 도입하였다. PCR 반응액은 20 pM의 프라이머 PCV2GENF, 20 pM의 프라이머 PCV2GENR, 40 mM dNTP(피셔 사이언티픽(Fisher Scientific), 미국 펜실베니아주 피츠버그 소재), 200 mM MgCl₂, 10 ㎕의 10X PCR 완충제, 72 ㎕의 dH₂O, 5 유니트의 앰플리택(AmpliTaq)(어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems), 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재), 및 1 ㎕의 단일 카피 PCV2 감염성 DNA 클론으로 구성되었다. 써모사이클러 반응은 94℃에서 10분 동안의 초기 변성; 94℃에서 1분 동안의 변성, 50℃에서 1분 동안의 어닐링(annealing) 및 72℃에서 45초 동안의 연장으로 구성된 38 주기; 및 72℃에서 7분 동안의 최종 연장으로 구성되었다. Rep 유전자가 결실된 PCV2 게놈 골격 단편을 1% 아가로스 겔로 분리하고 진클린 II 키트를 사용하여 정제하였다. 이어서, PCV2Gen 단편을 BfrBI 및 BclI로 따로 분해하고 1% 아가로스 겔로 분리하고 진클린 II 키트를 사용하여 정제하였다.

키메라 PCV 감염성 DNA 클론을 발생시키기 위해, PCV1 Rep와 PCV2Gen 단편의 밤샘 라이게이션(ligation)을 스트라타진(Stratagene) DNA 라이게이션 키트(미국 캘리포니아주 라졸라 소재)를 사용하여 수행하였다. 라이게이션 혼합물을 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 TOP10 세포(인비트로겐)를 형질전환시켰다. 백색 콜로니를 선택하여 밤새 배양하고, 진일루트(GenElute) 플라스미드 미니프렙 키트(시그마, 미국 미조리주 세인트 루이스 소재)를 사용하여 플라스미드를 추출하였다. 상기 플라스미드를 제한효소 KpnI로 분해하고 1% 아가로스 겔로 분리하여 약 1.7 kb(PCV2Gen-1Rep)의 밴드 및 2.9 kb(pBluescript II SK+ 벡터)의 밴드를 보이는 진정 플라스미드를 확인하였다.

실시예 2

PCV2Gen-1Rep DNA 클론의 생존능력 시험

키메라 PCV2Gen-1Rep DNA 클론의 생존능력 시험은 PK-15 세포의 형질감염으로 수행하였다. 제한효소 KpnI을 사용하여 pBluescript II SK+ 플라스미드 벡터로부터 키메라 PCV2Gen-1Rep 게놈을 절단하였다. 키메라 PCV2Gen-1Rep 게놈을 1% 아가로스 겔로 분리하고 진클린 II 키트를 사용하여 정제한 후 본질적으로 이미 공지된 보편적인 기법(상기 문헌((M. Fenaux et al., 2002))을 이용하여 T4 DNA 라이게이즈(ligase)로 콘카토머화하였다. 랩-텍(Lab-Tek) 챔버 슬라이드 상에서 약 70% 전면생장률로 생장하는 PK-15 세포를, 리포펙타민(Lipofectamine) 및 플러스 시약을 제조자(인비트로겐)의 프로토콜에 따라 사용하여 콘카토머화된 PCV2Gen-1Rep 게놈 DNA로 형질감염시켰다. 형질감염으로부터 3일 후, PCV2 ORF2-특이적 다중클론 항체를 사용한 간접적인 면역형광 분석(IFA)을 이미 공지된 바와 같이(상기 문헌) 수행하여 감염성을 측정하였다. PCV2Gen-1Rep 키메라 게놈의 감염성을 더 평가하기 위해, T-25 플라스크 내에서 70% 전면생장률로 생장하는 PK-15 세포를 이미 공지된 바와 같이(상기 문헌) 플라스크 당 약 12 ㎍의 콘카토머화된 키메라 게놈으로 형질감염시켰다. 형질감염으로부터 3일 후 바이러스 원액(stock)을 수거하고 이미 공지된 바와 같이(상기 문헌) PCV2 ORF2-특이적 폴리클로날 항체를 사용한 IFA로 적정하였다.

실시예 3

키메라 게놈을 확인하기 위한 DNA 서열 분석

프라이머 Rep830F(5'-GGTGTCTTCTTCTGCGGTAACG-3'(서열번호 5에 상응함)) 및 Rep830R(5'-GTTCTACCCTCTTCCAAACCTTCC-3'(서열번호 6에 상응함))을 사용하여 PCV2Gen 단편의 3'과 PCV1 Rep 단편의 5' 사이의 연접 영역을 증폭시켰다. 프라이머 Rep10F(5'-GGAAGACTGCTGGAGAACAATCC-3'(서열번호 7에 상응함)) 및 Rep10R(5'-CGTTACTTCACACCCAAACCTG-3'(서열번호 8에 상응함))을 사용하여 PCV1 Rep 단편의 5'과 PCV2Gen 단편의 3' 사이의 연접 영역을 증폭시켰다. 증폭된 PCR 생성물의 양쪽 가닥의 서열을 분석하였다.

실시예 4

부위-지정 돌연변이유발

초기 키메라 PCV2Gen-1Rep DNA 클론은 PK-15 세포 내로 형질감염되었을 때 감염성을 나타내지 않았다. 키메라 게놈의 서열을 분석한 후, 6개 뉴클레오티드(GTAAGC) 삽입체가 PCV1 ORF1 Rep 유전자의 ATG 개시 코돈 다음에 확인되었다. 이 오류를 보정하고 PCR 및 클로닝 단계를 통해 도입된 원치 않는 삽입을 보정하기 위해, 프라이머 MVTF(5'-CTCAGCAGCAACATGCCAAGCAAGAAAAGCGG-3'(서열번호 9에 상응함)) 및 MVTR(5'-CCGCTTTTCTTGCTTGGCATGTTGCTGCTGAG-3'(서열번호 10에 상응함))을 퀵체인지 II 부위-지정 돌연변이유발 키트(QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit)(스트라타진)와 함께 사용하여 상기 6개 뉴클레오티드 삽입체를 결실시켰다. TOP10 세포를 제조자의 프로토콜(인비트로겐)에 따라 돌연변이체 생성물로 형질전환시켰다. 백색 콜로니를 선택하여 밤새 배양하였다. 클론 SDM-C6을 앰피실린이 함유된 LB 아가 플레이트 상에 스트리킹하고 37℃에서 밤새 생장시켰다. 4개의 콜로니를 선택하여 밤새 배양하였다. 상기 콜로니의 플라스미드를 추출하고 프라이머 Rep830F 및 Rep830R을 사용하여 상기 플라스미드의 서열을 분석함으로써 도입된 6개 뉴클레오티드가 상기 키메라 게놈으로부터 제거되었음을 확인하였다.

상기 6개 뉴클레오티드(GTAAGC) 삽입체는 키메라 클론이 비-감염성을 나타내게 하고, 원치 않는 삽입체는 부위-지정 돌연변이유발에 의해 성공적으로 제거됨을 발견하였다. 신규 키메라 클론 SDM-C6은 PK-15 세포 내로의 후속 형질감염 시 감염성을 나타내는 것으로 확인되었다.

실시예 5

키메라 바이러스의 시험관내 특징규명을 위한 바이러스 원액의 제조

이미 공지된 보편적인 기법(상기 문헌(M. Fenaux et al., 2002))에 따라 PK-15 세포의 형질감염을 통해 PCV1 감염성 DNA 클론 및 PCV2 감염성 DNA 클론으로부터 PCV1 원액 및 PCV2 원액을 각각 제조하였다. 바이러스 원액 각각의 감염성 역가를 PCV2 ORF2-특이적 항체를 사용한 IFA로 측정하였다(상기 문헌).

PCV2 게놈의 골격 내에 PCV1 Rep 유전자를 함유하는 SDM-C6 키메라 게놈을 제한효소 KpnI을 사용하여 pBluescript II SK+ 플라스미드로부터 절단하고 진클린 II 키트를 사용하여 정제하였다. 약 40 ㎍의 SDM-C6 키메라 게놈을 T4 DNA 라이게이즈로 콘카토머화하고, 약 70% 전면생장률로 생장하는 PK-15 세포를 함유하는 4개의 플라스크를 이미 공지된 바와 같이(상기 문헌) 리포펙타민 및 플러스 시약을 사용하여 상기 콘카토머화된 SDM-C6 키메라 게놈으로 형질감염시켰다(플라스크 당 10 ㎍). 형질감염으로부터 3일 후, 형질감염된 세포에 대해 동결 및 해동을 3회 수행하여 SDM-C6 키메라 바이러스를 수거하고, 키메라 SDM-C6 바이러스 원액의 감염성 역가를, 인산염-완충 식염수(PBS)(10X, pH 7.4)(인비트로겐) 중에 1:1000으로 희석된 PCV2 ORF2 단일클론 항체(루랄 테크놀로지스 인코포레이티드(Rural Technologies Inc.), 미국 사우쓰 달코타주 브룩킹스 소재)를 사용한 IFA로 측정하였다. SDM-C6 바이러스 원액은 0.5 x 10^5.5 TCID₅₀/㎖의 매우 우수한 바이러스 감염성 역가를 보였다. 콘카토머화된 SDM-C6 게놈 및 선형화된 SDM-C6 게놈 둘다로 형질감염된 PK-15 세포는 IFA의 수행 시 강한 양성을 보였는데(도 1), 이는 PCV2 게놈의 골격 내에 클로닝된 PCV1 Rep 유전자를 가진 SDM-C6 키메라 게놈이 시험관내에서 감염성을 나타낸다는 사실을 확립시켜 준다.

실시예 6

1-단계 생장 곡선

키메라 바이러스의 생장 특징을 규명하고 상기 생장 특징을 야생형 PCV1의 생장 특징 및 야생형 PCV2의 생장 특징과 비교하기 위해, 1-단계 생장 곡선을 수행하였다. PK-15 세포를 6개의 12-웰 플레이트의 8개 웰에서 배양하였다. 약 70% 전면생장률에서 웰을 2 ㎖의 MEM으로 각각 세척하였다. 중복 플레이트에서 8개의 웰을 PCV1, PCV2 및 SDM-C6으로 0.1 MOI로 각각 접종하였다. 1시간 동안 항온처리한 후, 접종물을 제거하였다. 이어서, 세포 단일층을 2 ㎖의 PBS로 각각 3회 세척하여 임의의 과량의 바이러스 접종물을 제거하였다. 2% FBS 및 1X 항생제-항진균제가 함유된 2 ㎖의 MEM을 웰 각각에 첨가하고, 플레이트를 5% CO₂ 하에 37℃에서 계속 항온처리하였다. 접종 후 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 및 96시간에서, 중복 플레이트 각각의 1개 웰 내에 존재하는 세포를 상청액 내로 긁어서 수거하였다. 수거된 세포에 대한 동결 및 해동을 3회 수행하고 상기 세포를 적정할 때까지 -80℃에 저장하였다. 상기 접종 후 시간 각각에서의 감염성 역가는 연속적으로 희석된 접종물을 사용한 후 스페어만-카버(Spearman-Karber) 방법(상기 문헌((M. Fenaux et al., 2002)을 이용하여 PCV2 ORF2 단일클론 항체로 IFA를 수행함으로써 8-웰 랩-텍 II 챔버 슬라이드(날지 넌크 인터네이셔날(Nalge Nunc International), 미국 뉴욕주 로체스터 소재)에서 측정하였다.

데이터는 PCV1뿐만 아니라 SDM-C6 키메라 바이러스도 접종 후 96시간에서 2.20 x 10^4.0 TCID₅₀/㎖의 역가까지 생장하는 반면, PCV2는 접종 후 96시간에서 2.20 x 10^3.0 TCID₅₀/㎖의 역가까지만 생장함을 보여준다. 접종 후 12시간에서, 키메라 SDM-C6 바이러스는 6.95 x 10^2.0 TCID₅₀/㎖의 역가까지 생장하는 반면, PCV1 및 PCV2는 검출불가능한 역가를 보였는데, 이 결과로부터 상기 키메라 바이러스가 모 바이러스보다 더 빨리 복제된다는 결론을 도출할 수 있다. PCV1은 접종 후 24시간에서 8.70 x 10^2.0 TCID₅₀/㎖의 검출가능한 바이러스 역가를 보인 반면, PCV2는 접종 후 48시간(7.91 x 10^1.0 TCID₅₀/㎖의 역가)까지 검출가능한 역가를 보이지 못하였다. 따라서, 키메라 SDM-C6 및 PCV1은 유사한 역가(모 바이러스인 PCV2의 역가보다 약 1-로그 더 높은 역가)까지 생장함이 관찰되었다.

지금까지 본 발명을 한정하기 위한 목적이 아니라 본 발명을 설명하기 위한 목적으로 본 발명의 구체적인 실시양태들의 상세한 설명이 제시되었다. 본 개시내용에 의거할 때 당업자에게 자명한 모든 다른 변경물, 분지물 및 등가물이 본 발명의 특허청구범위 내에 포함됨을 이해할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. <120> CHIMERIC PORCINE CIRCOVIRUS PCV2Gen-1Rep AND USES THEREOF <130> AM103062 PCT <140> PCT/US2009/002189 <141> 2009-04-08 <150> US 61/124,383 <151> 2008-04-16 <160> 10 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 1 caactggcca agcaagaaaa g 21 <210> 2 <211> 55 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 2 aaccattacg atgtgatcaa aaagactcag taatttattt tatatgggaa aaggg 55 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 3 ctttttgatc acttcgtaat ggttttta 28 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 4 gcttaccatg ttgctgctga ggt 23 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 5 ggtgtcttct tctgcggtaa cg 22 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 6 gttctaccct cttccaaacc ttcc 24 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 7 ggaagactgc tggagaacaa tcc 23 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 8 cgttacttca cacccaaacc tg 22 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 9 ctcagcagca acatgccaag caagaaaagc gg 32 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 10 ccgcttttct tgcttggcat gttgctgctg ag 32

Claims

돼지 써코바이러스(porcine circovirus; PCV) 타입 1(PCV1)의 복제(Rep) 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는, PCV 타입 2(PCV2)를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 PCV의 키메라 핵산 분자(PCV2Gen-1Rep).
제1항에 있어서,
PCV1의 Rep 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 오픈 리딩 프레임(ORF) 유전자인, PCV2Gen-1Rep.
제2항에 있어서,
ORF Rep 유전자가 ORF1 Rep 유전자인, PCV2Gen-1Rep.
제3항에 있어서,
PCV2의 ORF1 Rep 유전자가 PCV1의 ORF1 Rep 유전자로 치환되어 있는, PCV2Gen-1Rep.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 PCV2Gen-1Rep를 함유하는 생물학적 기능성 플라스미드 또는 바이러스 벡터.
제5항에 따른 생물학적 기능성 플라스미드 또는 바이러스 벡터로 형질감염된 적절한 숙주 세포.
제6항에 따른 숙주 세포에 의해 생성된 감염성 키메라 PCV.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 PCV2Gen-1Rep로 형질감염된 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 적절한 영양 조건 하에 면역원성 폴리펩티드 생성물의 발현을 허용하는 방식으로 생장시키는 단계; 및 PCV2Gen-1Rep의 발현 생성물인 원하는 폴리펩티드 생성물을 단리하는 단계를 포함하는, 상기 면역원성 폴리펩티드 생성물의 제조 방법.
바이러스 감염 또는 PCV2에 의해 발병되는 이유자돈 전신 소모성 증후군(PMWS)으로부터 돼지를 보호하는 바이러스 백신으로서, 생리학적으로 허용가능한 무독성 담체를 포함하고, 하기 (a) 내지 (c)로 구성된 군으로부터 선택된, 적절하게 약독화된 또는 불활성화된 물질을 면역원성 양으로 포함하는 바이러스 백신:
(a) PCV1의 Rep 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는, PCV2를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 PCV2Gen-1Rep;
(b) PCV1의 Rep 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는, PCV2를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 PCV2Gen-1Rep를 함유하는 생물학적 기능성 플라스미드 또는 바이러스 벡터; 및
(c) PCV1의 Rep 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는, PCV2를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 PCV2Gen-1Rep로부터 제조된 감염성 키메라 PCV.
제9항에 있어서,
PCV2Gen-1Rep가 ORF 유전자를 포함하는, PCV1의 Rep 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는, 바이러스 백신.
제10항에 있어서,
PCV2Gen-1Rep가 PCV1의 ORF1 Rep 유전자를 함유하는, 바이러스 백신.
제11항에 있어서,
PCV2Gen-1Rep가 PCV2의 ORF1 Rep 유전자 대신에 PCV1의 ORF1 Rep 유전자를 함유하는, 바이러스 백신.
바이러스 감염 또는 PCV2에 의해 발병되는 PMWS로부터 돼지를 보호하는 방법으로서, 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 백신을 면역학적 유효량으로 상기 보호가 필요한 돼지에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제13항에 있어서,
바이러스 백신을 돼지에게 비경구, 비강내, 피내 또는 경피 경로로 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 따른 PCV2Gen-1Rep의 제조 방법으로서, 하기 단계 (a) 내지 (c)를 포함하는 제조 방법:
(a) PCV1을 코딩하는 핵산 분자로부터 Rep 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 제거하는 단계;
(b) PCV1의 Rep 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 PCV2를 코딩하는 핵산 분자 내로 도입하는 단계; 및
(c) PCV2Gen-1Rep를 회수하는 단계.
제15항에 있어서,
단계 (a)가 PCV1의 Rep 단백질을 코딩하는 ORF 유전자를 포함하는 핵산 서열을 제거하는 과정을 포함하는, 제조 방법.
제16항에 있어서,
단계 (a)가 PCV1의 ORF1 Rep 유전자를 포함하는 핵산 서열을 제거하는 과정을 포함하는, 제조 방법.
제17항에 있어서,
단계 (b)가 PCV2의 ORF1 유전자를 제거한 후 PCV1의 ORF1 Rep 유전자를 포함하는 핵산 서열을 PCV2를 코딩하는 핵산 분자의 ORF1 유전자 위치 내로 도입하는 과정을 추가로 포함하는, 제조 방법.
세포 배양물 중에서의 PCV2의 복제 및 역가를 개선시키는 방법으로서, 하기 단계 (a) 내지 (d)를 포함하는 방법:
(a) PCV2의 ORF1 Rep 유전자가 PCV1의 ORF1 Rep 유전자로 치환되어 있는 PCV2Gen-1Rep 키메라 바이러스를 구축하는 단계;
(b) 적절한 세포주를 PCV2Gen-1Rep 키메라 바이러스로 접종시키는 단계;
(c) 표준 조건 하에 적절한 바이러스 생장 배지 중에서 PCV2Gen-1Rep 키메라 바이러스로 접종된 상기 세포주를, 바이러스 생성을 유도하기에 충분한 시간 동안 배양하는 단계; 및
(d) PCV2Gen-1Rep 키메라 바이러스를 수거하는 단계.
제19항에 있어서,
적절한 세포주가 돼지 항원이 결여된 돼지 신장 세포주(PK-15 세포) 또는 돼지 정소(ST) 세포주인, 방법.