HU228065B1 - Methods to culture circovirus - Google Patents
Methods to culture circovirus Download PDFInfo
- Publication number
- HU228065B1 HU228065B1 HU0500161A HUP0500161A HU228065B1 HU 228065 B1 HU228065 B1 HU 228065B1 HU 0500161 A HU0500161 A HU 0500161A HU P0500161 A HUP0500161 A HU P0500161A HU 228065 B1 HU228065 B1 HU 228065B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- mammalian
- cells
- adenovirus
- function
- gene
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 47
- 241001533384 Circovirus Species 0.000 title claims description 40
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 85
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 56
- 101150029662 E1 gene Proteins 0.000 claims description 46
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 41
- 241000202347 Porcine circovirus Species 0.000 claims description 32
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 30
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 23
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 13
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims description 11
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 claims description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 241000282887 Suidae Species 0.000 claims description 4
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 claims 2
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 claims 1
- 241000272470 Circus Species 0.000 claims 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims 1
- 241000188845 Porcine adenovirus Species 0.000 claims 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims 1
- 241001673669 Porcine circovirus 2 Species 0.000 description 37
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 13
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 13
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 9
- 241000928435 Porcine circovirus 1 Species 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 7
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 5
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 5
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 5
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 5
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 101150075174 E1B gene Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 101710167800 Capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710113540 ORF2 protein Proteins 0.000 description 3
- 101710090523 Putative movement protein Proteins 0.000 description 3
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N beta-D-glucosamine Chemical compound N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 3
- AJDIZQLSFPQPEY-UHFFFAOYSA-N 1,1,2-Trichlorotrifluoroethane Chemical compound FC(F)(Cl)C(F)(Cl)Cl AJDIZQLSFPQPEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001302800 Beak and feather disease virus Species 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000725585 Chicken anemia virus Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 101100382437 Porcine circovirus 2 Cap gene Proteins 0.000 description 2
- 208000035873 Ventilator-induced diaphragmatic dysfunction Diseases 0.000 description 2
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 2
- MCMNRKCIXSYSNV-UHFFFAOYSA-N Zirconium dioxide Chemical compound O=[Zr]=O MCMNRKCIXSYSNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 244000105975 Antidesma platyphyllum Species 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241001533399 Circoviridae Species 0.000 description 1
- 229910017489 Cu I Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000632553 Homo sapiens Endophilin-A2 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010026749 Mania Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 101000933967 Pseudomonas phage KPP25 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 208000010399 Wasting Syndrome Diseases 0.000 description 1
- GPKUGWDQUVWHIC-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine tetrahydrochloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.Cl.NNC1=CC=C(C=C1)C1=CC=C(NN)C=C1 GPKUGWDQUVWHIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 101150064029 bi gene Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000007474 bm medium Substances 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000030944 contact inhibition Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 101150097231 eg gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000009424 haa Nutrition 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 210000001739 intranuclear inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/10011—Circoviridae
- C12N2750/10021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/10011—Circoviridae
- C12N2750/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/10011—Circoviridae
- C12N2750/10051—Methods of production or purification of viral material
- C12N2750/10052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
WTOMÖÁPÉLBÁNY
CIRKÖVÍRLSOK TENYÉSZTÉSÉRE SZOLGÁLÓ ELJÁRÁS
A jelen találmány cirkovírusokkal kapcsolatos, a találmány tárgyát cirkovlrusok -leginkább sertés-cirkovirusoktenyésztésére szolgáló készítmények és eljárások képezik. A jelen találmány tárgyát leginkább olyan eljárások képezik, amelyek arra szolgálnak, hogy sertés-cirkovírusokat tenyészsznnk olyan emlőssejtekben, amelyekben kifejeződik egy emlos-adenovirus El génjének a funkciója.
A vírusok Cireoviridae nevű családjába -amely es; számos növény- és állatfajban megtalálható, és amelynek tagjait általában eirkovírusoknak nevezik- olyan vírusok tartoznak, amelyek kerek, burok nélküli, átlagosan 17-23,5 unt átmérőjű vinonnnai rendelkeznek, ahol a várion egy cirkuláris, egy szálú dezoxirlbonukleinsavat tartalmaz, A církovírusok egyszálű. DNS-höl álló genomja a legkisebb, ismert vitális DNS-replikonok közé tartozik. Ahogy az. a WO 99/45956 számú, nemzetközi közzétételi iratban olvasható, a „The Sixth
Report of the Jnternaliona! Commlttee fór the Taxonomy of Viruses” [F.D. Lukért és mtsai. (1995); „The Cireoviridae”, 166-168. oldal, a következő műben: F.Á, Murphy és mtsai, (szerk.); Vírus Taxonomy, Síxth Report of the International Commlttee on Taxonomy of Viruses, Arch. Virol. 10 SuppLJ alapján legalább hat olyan vírust azonosítottak, amely a cir··>
Λ «X kovírus-o-k családjába tartozik,
A kővetkező állati vírusok tartoznak ebbe a családba:
csirke-anéaiia-vírus (CAV), csőr- és tollbeiegség-vírus (BFDV), sertés-eirkovirus (.PCV) és gaiamb-cirkovírus:. A PCV-t eredetileg sertésvese-sejt-tenyészetekböl izolálták. A PCV a sejtmagban repükálódík, és nagy intranukleáris zárványokat képez [lásd: Murphy és mtsai, (1999): „Circovirídae”, 357-361, oldal, a következő· műben: Veterinary Virology (3, kiadás, Aeademíe Press, San Diego)]. Jelenleg kétféle PCV-t ismerünk, az 1-es típusú PCV-έ (PCVl) és a 2-es típusú
PCV-t (PCV2). .A PCVl .....amelyet a PK-15 jelű, folytonos sertésvese-sejtvonal (ATCC ÜCL3I) állandóan jelenlévő fertőzéseként izoláltak-· sejtíenyészetekben nem okoz kimutatható ei topa ti ás hatást, ezenkívül kísérletesen előidézett fertőzést követően nem okoz klinikai betegséget sertésekben (lásd: Q, Allan:
mtsai.
mtsai,: Areh. Virol, 9J.; 271-276, (1986)], A PCV2, a -gyei ellentétben, szoros kapcsolatban van a választási colban előforduló, több szervrendszer megbetegedésével járó, választás utáni sorvadásos szindrómával (az ún. PMWS-sel)
Vet. Microbiol., 49: 49-64, (1995); I. Tíseher és Natúré, 295: 64-66, (1982); valamint 1. Tischer és 1[lásd; G. Allan és mtsaí.: Europe, J, Vet. Díagn. Investig., 10.;
3-10, (1998); J. Bilis és mtsai.: Can, Vet. 1., 39: 44-51, (1998); valamint 1. Morozov és mtsaí,: 3. Clín. Microbiol., 36: 2535-2541, (1998)}, A. PCVl genom jának nukleotíd-szekveneíáít A. Mankertz és mtsai. (J, Virol, 71: 2562-2566, (1997)], valamint B.M, Meehan és mtsai. [3. Gén, Virol., 7.8; 221-227, (1997)1, a PCV2 genomjának nnkleotid-szekvenciáit pedig A.L. Piáméi és mtsai. |'J, Virol,, 72: 5262-5267, (1998)1, A. Mankertz és mtsai. [Vírus Rés,, 66: 65-77,
Φ* ·♦·♦ ♦'*
Φ 9 X ·Χ * ♦ (2000)j, valamint Β.Μ. M'eeban és mtsai. (J. Gén. Vírol,, 79; 2171-2179, 0998)1 ismertették. A PCV2 törzseiről a WO 00/01409 számú, nemzetközi közzétételi iratban olvashatunk, és azokat a „European Coliection of Cell Cultures^-nél (Centre fór Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisfeury, Wiltshire SP4 ÓIG, Egyesült Királyság) helyezték letétbe, ezen törzsek köze tartoznak például a V971ÖÖ219, a V970Ö218, a. V97100217, a V980I1Ő08 és. a ¥98011609 nyilvántartási számú törzsek. A WO 00/77216 számú, nemzetközi közzétételi iratban szintén olvashatunk a PCV2-rol.
A PCV2-ről eddig megjelent tanulmányokban vagy szővet-homogenizáíuniokból származó vírusokról, vagy természetes forrásokból származó izolátumokból tenyésztett vírusokról olvashatunk, Tischer és mtsai. arról számoltak be [Arch. YíroL, 96: 3.9-57, (1987)]. hogy a sertésvese-sejteket. D-glükózamin kezeléssel serkentették arra, hogy belépjenek a sejtciklus S-fázisába. Ezt a kezelést azonban óvatosan kell végezni, mert a D-glükózamin mérgező a sejttenyészetre [lásd: Allan és mtsai.: J. Vet. Diagn. Investigation, Γ2: 3-14, (2ÖÖÖ)]. Továbbra is igény van olyan eljárásokra, amelyek segítségével -cirkovirusokat -mint például PCVl-et vagy PCV2~t, illetve egyéb eirkovírusokat- lehet úgy tenyészteni, hogy a cirkovirusokat tiszta formában kapjuk meg. Az ilyen eljárások különösen a PCV2-antigének előállítása szempontjából lennének hasznosak, amely antigéneket FMWS elleni oltóanyagként lehetne használni. A jelen találmány ezt az. igényt próbálja kielégíteni.
Az összes, itt idézett szabadalom és publikáció teljes egészében a jelen kitanítás részét képezi.
* ** *♦ «
ί
A jelen találmány tárgyát etnlŐs-cirkovírusok tenyésztésére szolgáló eljárások képezik, amely eljárások tartalmazzák az alábbi lépéseket: a) olyan emlőssejtek biztosítása, amelyekbe» kifejeződik egy emlos-adenovírus El génjének a funkciója, és amely sejtek permisszívek az emlős-cirkovirnsok replikációja szempontjából; b) az említett emíős-cirkovírus-genom -vagy egy replikációra alkalmas részének- a bejuttatása az -említett emlőssejtekbe; és c) az említett emlőssejtek tenyésztése olyan körülmények között, amelyek megfelelőek az említett enilős-cirkovírus replikációja szempontjából. Az eljárások néhány kiviteli forma szerint azt ís magukba foglalják, hogy az említett, tenyésztett sejtekből kinyerjük az e m 1 í t e 11 e i r k ο ν í r «sokat.
Az emlős-eirkovírus néhány kiviteli forma szerint seríés-cirkovírus, mint például 1-e.s típusú sertés-cirkovírus(PCV1) vagy 2-es típusú sertés-eírkovírus (PCV2),
A sertés-cirkovírus további kiviteli formák szerint tartalmaz egy kiméra niikíeotid-szekveneíát, További kiviteli formák szerint az emlőssejtek sertésből származnak. Még további kiviteli formák szerint az emlőssejtek sertésretina-sejtek,
Egyéb kiviteli formák szerint az emlös-adenovírus El gén funkció egy emberi adenovkus El génjének a funkciója. További kiviteli forrnák szerint az eralös-adeno-vírns El sénK-“ funkció egy sertés-adenovirus El génjének a funkciója. További kiviteli formák szerint az El génnek a funkciója az EIA és/vagy az B1B génnek a funkciója. Még további kiviteli formák szerint az emlős-adcnovírus El génjének a funkcióját kifejező emlőssejtek stabilan transzformálva vannak az em1 ő s - a d e η ο v i ni s Ε1 g é n s z e k v e n c i á i v a 1. A z e m 1Ő s - a d e η ο ν í r u s
X Φ Φ
φφ
Φ χ «
φ *
El. génjének a szekvenciája, további kiviteli formák szerint heteroiőg az említett emlőssejtekkel.
A jelen találmány tárgyát képezik olyan, rekombínáns emlőssejtek is, amelyekben kifejeződik egy emlős-adesovírus El génjének a funkciója, és amelyek tartalmaznak egy emlös-církövirus-genomot, vagy tartalmazzák annak egy repiíkációra alkalmas részét, továbbá az említett sejtek permisszívek az említett, emlős-cirkovírösok replikácíója szempontjából. Az emlos-eirkovírus néhány kiviteli torma szerint sertés-cirkovírus, mint például 1-es típusú sertés-cirkovírus (PCV1) vagy 2-es típusé sertés-cirkovírus (PCV2T A sertes-církovírus további kiviteli formák szerint tartalmaz egy kiméra nukleotid-szekvenciát. Néhány kiviteli forma szerint az adenovírus El génínnkeió egy emberi adenovírus El génjének a funkciója'.· További kiviteli fonnák szerint az erolos-adenovírus El génfunkció egv sertés-adenovírns El génjének a funkciója. További kiviteli formák szerint az emlőssejtek sertésből származnak. Még további kiviteli formák szerint az emlőssejtek sert és re ti na-sej tek. További kiviteli formák szerint az emlős-adenovírus El génjének a funkcióját kifejező emlőssejtek stabilan transzformálva vannak az emlős-adenovirus El génszekvenciái vak Az emlős-adeiiovírus El génjének a szekvenciája további kiviteli formák szerint heíerológ az említett em.lőssejtekkel,
A jelen találmány tárgyát képezik olyan, rekombínáns emlőssejtek előállítására szolgáló eljárások is, ahol az említett sejtekben kifejeződik egy emlös-adenovírus El génjének a funkciója, valamint az említett sejtek tartalmaznak egy eralős-eírkovír»s-genomoí. továbbá az említett eljárások tartalmazzák az alábbi lépéseket: a) olyan emlőssejtek biztosítása, ♦ί» amelyekben kifejeződik egy emlős-ad e no vírus El génjének a funkciója; és b) az említett emlös-cirkovírus-genom -vagy egy replikációra alkalmas részének- a bejuttatása az említett emlőssejtekbe. További kiviteli formák szerint az említett eljárások azt is magokba foglalják, hogy az említeti; rekombináns emlőssejteket olyan körülmények között, tenyésztjük, amelyek megfelelőek az említett emlős-eirkovirus replikációja szempontjából. Az eljárások további kiviteli formák szerint azt is magukba foglalják, hogy az említett, tenyésztett sejtekből kinyerjük az említett eirkovirusokat. Néhány kiviteli forma szerint az emlös-elrkovírus sertés-eirkovirus, mint például 1-es típusú settés-cirkovírus (PCV1) vagy 2~es típusú sertés- c i r k o v í rus (P C V 2).
, A sertós-eirkovirus további kiviteli formák szerint tartalmaz egy kiméra nnkleotid-szekvenmat formák szerint az emlőssejtek sertésből származnak, Még további kiviteli formák szerint az emlőssejtek sertésretina-sejTovábbi kiviteli formák szerint az adenovtrus El génfunkció egy emberi vagy egy sertés adenovírus El. génjének a funkciója. Még további kiviteli formák szerint az emlös-adenovírus El génjének a funkcióját kifejező emlőssejtek stabila® transzformálva vannak az emíős-adenovírus El génszekvéne iáivá
Az emlős-ad.enevírus El génjének a szekvenciája további kiviteli forrnák szerint heterológ az említett emlőssejtekkel.
Az LA és az 1.8 ábrán a PCV2 vírus jellemzése és tit~ ráláss látható; V1D0 Rí sejteket DNS-sel transzfektáltnnk, majd a fertőzött sejtekből a DNS-t Hírt-módszerrel vontuk ki.
Φ
φΛ
Φ
ΦΦ ♦
ΦΦ
Λ*
X Φ Λ ♦ Φ**
Φ Λ _ ÍJ5ÍX χΟΦ (A) PCR, PCV 2-spéci fikus primer ekei, valamint P€V2~vel fertőzött (1. oszlop), illetve álíeríőzötí (2, oszlop) sejtekből származó· DNS-t használva. Kontrollként egy PCV2-genomot tartalmazó plazmídot használtunk (3. oszlop). A. GIBCÖ BR.L-tői .származó DNS-létrát (I kb) az M-oszlopban futtattok. (B) A. PCV2-vel fertőzött (1., 3. és S, oszlop) és az álfertőzőtt (2., 4. és 6. oszlop) sejtekből származó vírus-DNS-t Nco.I-gyel és Stul-gyel (1. és 2. oszlop), EeoRl-gyel és Stul-gyel (3. és 4. oszlop), valamint EeoRl-gyel és EcoRV-tel (5. és ő. oszlop) emésztettük, A GIBCÖ BR.L-től származó DNS-létrát (1 kb plusz) az M-oszlopban futtattuk.
A 2.A és a 2>B ábrán a PCV2 titrálása látható, a titráláshoz immuno-peroxídázos festést használtunk. Á fertőzés után 72 órával az átfertőzött (A) és a PCV2-veí fertőzött (B) VIDD RÍ sejteket nyálban termeltetett anti~„ORF2 fehérje” pótíklonális.ellenanyaggal, majd biotioáli második ellenanyaggal' ínkubáltuk. Ezután a sejteket egy avidint és biotiuált torma-peroxidázt tartalmazó komplexszel inkubáltuk, majd az egy sejt vastagságú rétegen a színt diamino-benzidin-tetrahidrokloriddal (DA.B) hívtuk elő, Egy darab sötét sejt egy darab vírusrészeeske fertőzésének az eredménye.
A 3.Á-3.C abrakon a 2-es típusú sertés-eirkovírus (PCV2) genomjáaak nnkleotid-sz.ekvencíája (A, l-es számú szekvencia), valamint az ezen szekvencia L nyílt .leolvasási keretének (ORF1). illetve 2, nyílt leolvasási keretének (ORF2) megfelelő aminosav-szekvencia (B, 2-es számú szekvencia; illetve C, 3-as számú szekvencia) látható; az adatok a Gen.Bank-ből származnak (nyilvántartási szám: AFÖ8Ő834),
A jelen találmány tárgyát emlös-církovirnsok -légin8
Φ «ί.
sertés-církovírusok- tenyésztésére szolgáló készítmények és eljárások képezik. A jelen találmány azon a felfedezésen alapul, hogy az emberi adenovírus El génjének a funkcióját kifejező se rí és sej tek tr a ns-z fék láthatóak a PCV2 g eső injával. és a PCV2. vírusokat magas vírus-literrel kapjuk meg.. A VJDO RÍ s-ejtvonal -amely az ATCC-nél van letétbe helyezve, és amelynek ATCC nyilvántartási száma PTÁ-155- egy 5-ös típusú emberi adenovírus· (HAVS) El génjével (amelyről kimutatták.» hogy indukálja a sejtciklus S-fázisába történő belépési, és transzaktiválja a transzkripciót) transzformált sertésretina-sejtvonal [lásd: T, Sfeenk (199ő): „Adeno-viridae; the vírusos and their replicatíoh”, a „Fields Virology” című -műben (2111-2148. oldal, 3, kiadás, B.N. Fields, D.M. Knipe és P.M. Howley (szerk..), Lippincoti-Raven Publíshers, Philadelphia, New York)}. Amint a.3. Példában említjük, a VíD-O Rt sejteket egy PCV2~g.e.nommat transzfektáltuk, az elért vírustiter 2x l ö; fertőző egység/ml volt.
A jelen találmány gyakorlati alkalmazása, -hacsak mást nem említőnk- hagyományos mikrobiológiai, immunológiai, virológiái, molekuláris biológiai, valamint rekombináns DNS technikák .alkalmazását kívánja meg, amely technikák ismertek a szakemberek számára. Ezen technikák részletesen le vannak írva a szakirodalomban (lásd például az alábbi műveket; Mániát ts és mtsai.; Molecular Cloning; A Laboratory Manual (1982); DNA -Cloning. A Praetical Approaeh, I. és IL kötet,. D« Glover (szerk.); Oligonuelcotlde Synthesis, N. Gait (szerk.)» (1984); Nueleic Aeid Hybridízation, B, Hames és S. Híggíns (szerk.), (1985); Transeriptíon and Translation, B. Hames és S. Híggíns (szerk.), (1984); Animál Celi Cuíture, R. Preshney (szerk.), (1986); Perbal: A Praetical Gui.de to Mole9 cular doni ο g (1984); Ausabel és mtsai.; Current Protocols in
Molecular Biology, John Wiíey & Sons, (1987, 1988, 1989,
1990, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995, 1996); valamint Sambrook és mtsai..: Molecular Cloning; A Laboratory Manuaf 2.
kiadás, L, II. és 111. kötet, (1989)].
A vírusok Círcoviridae nevű családja -amelybe kerek, burok nélküli, átlagosan 17-23,5 nm átmérőjű virionnnal rendelkező vírusok tartoznak., ahol a virion egy cirkuláris, egyszálú DNS-t tartalmaz- a fentiekben idézett, „The Sixth Re»Γ port of the International Co rumit tcc fór the Taxonomy of Virnses”-ben van leírva. Ebbe a családba tartozik például a PCV 1 és a PCV2 nevű sertés-cirkovirus. Néhány PCV-ről Ismeri, hogy betegséget okoz, ilyen például a. PCV2, amely őszszefúggésbe hozható a PMWS-sel. A P-CV1 gen-omjának nukleotid-szekvenciáit A. Mankertz és mtsai, [J. Várói, 71: 2562-2566, (1997)], valamint B.M. Meeban és mtsai. p. Gén. Viro-L,. 78: 221-227, (1997)1, a PCV2 genomjának nukleotid-szekvenciáit pedig A.L. fiaméi és mtsai. p. Virol., 72: 5262-5267, (1998)], A. Mankertz és mtsai. [Vírus- Rés., 66: 65-77, (2000)), valamint R.M. Meehan és mtsai. (J. Gén. Virol., 79: 2171-2179, (1998)3 ismertették. A PCV2 reprezentatív törzseit a „European Colíeetion of Cell Cu I tűrés”-né í (Centre fór Applied Microbioíogy & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 ÓIG, Egyesült Királyság) helyezték letétbe, ezen törzsek közé tartoznak például a V971Ö02I9, a V970Ö218, a ¥97100217, a ¥98011608 és a ¥98011609 nyilvántartási számú törzsek, A WO 00777216 számú, nemzetközi közzétételi iratban szintén olvashatunk a PCV2~róE A PCV'2 gcnomjának a nukleoíiá-szekveneiáiról az alábbi helyeken is találunk információt: Hamel és mtsai,; J. Virol.. 72,6; 526210
-5267, (1998), (GenBank nyilvántartási szám: AF027217); Morozov és mtsai.; J. Clín. Mícrobiol., 36,9: 2535-2541, (1998); valamint az alábbi GenBank nyilvántartási számok: AFÖS6834, ÁF08683S és AF08Ó836,
A PC VI- és a PC V 2- genom ok publikált nukleotid-szekvenciáinak az összehasonlítása 80 %-osnál kisebb azonosságot mutat, bár a genom szerveződése hasonló, különösen ami a két legnagyobb nyílt leolvasási keret (OR.F) elrendezését, valamint a DNS-replikáeíő feltételezett kezdőpontjait illeti.
A jelen találmány tárgyát emlős-cirkovírusok, leginkább sertés-cirkovírusok (PCV-k), tenyésztésére szolgáló eljárások képezik. A jelen találmány tárgyát olyan PCV-k tenyésztésére szolgáló eljárások képezik, amely PCV-k tartalmazzák a PCV-genomok itt közölt, vagy a. szakmában ismert núkleotid-szekvenciát, vagy azok replikációra alkalmas nyílt leolvasási kereteit, vagy egyéb részeit, A jelen találmány tárgyát továbbá olyan PCV-k tenyésztésére szolgáló eljárások is képezik, amelv PCV-k olyan nnkieotíd-szekvenciákat tartalmaznak.
amelyek a PCV-genomok itt közölt, vagy a szakmában ismert nukleotid-szekveneíáitói, vagy ezen szekvenciák replikációra alkalmas nyílt leolvasási kereteitől, vagy egyéb részeitől anyuidban térnek el, amennyire azt a genetikai kőd degenerálísága megengedi. A jelen találmány tárgyát ezenkívül olyan PCV-k tenyésztésére szolgáló eljárások ís képezik, amely PCV-k olyan PCV nükleotid-szekveneía-variációkat tartalmaznak, amely variációk nem változtatják meg az eredeti nukleotid-szekveneia, vagy ezen szekvencia replikációra alkalmas nyílt leolvasási kereteinek, vagy egyéb részeinek a funkcionalitását vagy törzs-specifícitását. A jelen találmány tárgyát továbbá olyan PCV-k tenyésztésére szolgáló eljárások is képezik, amely PCV-k olyan PCV nukieotid-szék véne iákat tartalmaznak, amelyek közepesen szigorú vagy szigorú feltételek mellett képesek hibridizálni az itt közölt szekvenciákkal. A jelen találmány tárgyát ezenkívül olyan PCV-k tenyésztésére szolgáló eljárások is képezik, amely PCV-k az itt közölt, vagy a szakmában ismert PCV nukleotid-szekvenciák, vagy ezen szekvenciák replikációra alkalmas nyílt leolvasási kereteinek, vagy egyéb részeinek mutációit -mint például delécióií vagy pontmütáeióit- tartalmazzák. A jelen találmány tárgyát továbbá olyan PCV-k tenyésztésére szolgáló eljárások is képezik, amely PCV-k heterológ nukleotid-szekveneiákaí tartalmaznak. A jelen találmány tárgyát ezenkívül olyan PCV-k tenyésztésére szolgáló eljárások is képezik, amely P C V - k k i m e ra c í r ko v í r u s - nuk 1 e o t í cl - s z e k v e n e i á k a t tarts 1 m aznak., mint például serté-s-cirkovírusokfeól származó nnkleotid-szekvenciák és egyéb, patogén vírusok - mint például patogén sertésvírusok, beleértve a parvovírusokat- nukleotid-szekvencíáínak a fúzióját.
A „heterológ nukleotíd-szekveneia’’ kifejezés itt egy cirkovirussal vagy egy emlőssejttel kapcsolatban olyan nukleoíid-szekveneiákat jelent, amelyek normális körülmények között nincsenek kapcsolatban a eirkovirns-szekveneíákkai (a eírkovlrus-genom részeként), illetve az emlőssejt nukleotid-sxekvenciáival, A heterológ nukleotid-szekvenciák közé szintetikus szekvenciák is tartoznak.
A hibridizációs reakciókat különböző „szigorúsági” feltételek mellett végezhetjük, A .hibridizációs reakciók szigorúságát növelő körülmények jól ismertek és publikáltak a szakmában (lásd például: Sambrook és mtsai. könyvének (1989) a 7.52. oldalát). Az alkalmas körülmények közé (növekvő szi12 gorúsággal) többek között az alábbiak tartoznak: 25, 37, 50 és 68°C-os inkubálási hőmérsékletek; a kővetkező pufférkoncentrációk; IÖ X SSC, 6 X SSC, I X SSC és 0,1 X SSC (ahol az SSC 0,15 M NaCl-t tartalmazó, .15 mM koncentrációjú eiirát-puífer), vagy ezek ekvivalensei, egyéb puffer-rendszerek alkalmazása esetén; Ö, 25, 50 és 75 %-os formamid-koncentráeió·; 5 pere és .24 óra közötti inkubációs idő; 1, 2 vagy több mosási lépés; 1, 2 vagy 15 perces mosási inkubációs idő; mosó folyadék: 6 X SSC, I X. SSC, ö.l X SSC vagy ionmentes víz. Szigorú hibridizációs körülményeket jelent például a 68eC-os hőmérséklet, és 0,1 X SSC alkalmazása.
A PCV-genomok számos polipeptid-szekvenciát kódolnak, amelyek hozzávetőleges mérete 8-35 kD, Úgy gondoljuk, hogy a sertés-eirkovlrus geno-mok nyílt leolvasási kereteinek (ORF) a megtalálása standard szoftverek (ilyen szoftver például a MacVeetorQ3 (Oxford Molecular Group Inc., MD 21030)1 segítségével rutin jellegű feladat. A kétfajta PCV legnagyobb nyílt leolvasási kerete -az O.RP1- a kétfajta PCV esetén csak kismértékben tér el a egymástól, az azonosság kőzőítűk 85 %-os (a Clnstal nevű programmal meghatározva), továbbá kimutatták, hogy az O'RFl által kódolt fehérje PCV1-ben a „Rop” nevű fehérje [A.. Mankertz és mtsai.: J. Gén, Viröl,, 79; 381-384, (1998)1Anélkül, hogy ragaszkodnánk az alábbi elképzeléshez, azt gondoljuk, hogy a PCVI és a PCV2 ORF2 szekvenciáinak a nagyobb mértékű eltérése (az azonosság körülbelül 65 %-os) arra utal, hogy a PCV típus-specifikus jellemzőit a megfelelő· ö&F2-k által kódolt fehérjék határozzák meg. Számos PCV-típus-specifikus epitopot térképeztek a PCV2 ORF2 szekvenciájára (lásd: ö. Mahe és mtsai.: R. Gén. Virol., 81:
815 -18 2 4, (2000)}. δ g y m á s i k m o s t a η í t a n u 1 in án y b a n a PCV2 ORF2-je- által kódolt fehérjéről azt állapították meg, hogy az egy fő szerkezeti fehérje, amely OR.F2-t expresszálö, rekombináns hakulovírussal fertőzőit ro-varsejtekben víruskapszid-szerü részecskéket alkothat [lásd: P, Nawagltgul és mtsai.: GeM. ö.,: 84: 2281-2287, (2000)).
A jelen találmány néhány, példaként szolgáló kiviteli formája szerint egy .PCV-genomot, vagy annak egy nyílt leolvasási keretét, vagy egyéb részét -mint például egy antigén tulajdonságú régiót kódoló szekvenciát- tartalmazó rekombináns vektort állítunk ele. egy plazmid és egy PCV-genom in vitro rekombinációja által. A PCV-genom néhány kiviteli forma szerint egy PCV2-genom. Más kiviteli formák szerint ín vivő rekombináció által állítunk elő egy PCV-genomot, vagy annak egy nyílt leolvasást keretét, vagy egyéb részét -mint például egy antigén tulajdonságú régiót kódoló szekvenciáttartalmazó rekombináns vektort. Az in vivő rekombinációs eljárások ismertek a szakmában, ezen eljárások közé tartoznak például a Cbaríier és mtsai. által leírt eljárások [J. Virol., 70: 4805-4810, (1996)), A eirkovírus-genomok összeállításához használható vektorok közé tartoznak például azok a bakteriális plazmidok, amelyek lehetővé teszik, hogy a klónozott eirkovírus-nnkleotid-szekvencía több kópiában termelődjön. A piazmidot néhány kiviteli forma szerint egy rekombináció szempontjából megfelelő gazdasejtbe ko-ttanszíektáljuk, A rekombináció szempontjából megfelelő gazdasejtek közé tartozxiak bármilyen olyan sejtek, amelyekben végbemehet a rekombináció egy PCV-genom és egy PCV-szekvenciákat tartalmazó plazmid, illetve két vagy több olyan plazmid között, amelyek mindegyike tartalmaz .PCV-szekvenciákat. A. rekombínácíóhoz általában prokariőta sejteket -mint például E. coli sejteket- használunk, míg a cirkovfrusokat előnyösen olyan emlőssejtekben tenyésztjük., amelyek permis szí vek a PCV replíkációja szempontjából, ilyen, sejtek például a sertéssejtek, különösen, olyan sertéssejtek, amelyekben kí tud fejeződni egv emlős-adenovírns El génjének a funkciója.
A jelen találmány szerint bármely olyan emlős gazdasejt felhasználható, amely permisszív a církovírus-replikáeÍó, leginkább a PCV-replikáció (mint például a PCVI- és a PCV2-replíkácíő) szempontjából.. Állan és mtsai. szerint a PCV képes repiikálódni sertés- és szarvasmarha- monoeita-Zmakrofág-tenyészetekben [Vetennary Microbiology, 44: 49-64, (1995)]. Tischer és mtsai, leírják, hogy a PCV-nek a sej {tenyészetekben történő replikálódásához aktívan osztódó sejtekre van szükség [Areh, Vírol,, 96: 39-57, (1987)]. Á PCV tenyésztésére alkalmas sejtek vagy sejtvonalak közé például olyan emlőssejtek tartoznak, amelyekben kifejeződik egy adenovírus El génjének a funkciója, és amelyek permisszívek a PCV replíkációja szempontjából, Idetartoznak azok a sertéssejtek is -mint például azok a sertésmonocita-/-makrofág-sejtek, és sertésretína-sejtek -, amelyekben kifejeződik egy adenovírus El génjének a funkciója. Egy példaként szolgáló kiviteli forma azt mutatja, hogy azok a sertésretína-sejtek, amelyekben kifejeződik egy emberi adenovirus El génjének a funkciója, permisszívek a PCV2 replíkációja szempontjából, és azok alkalmazásával 2x10' fertőző egység/ml vírusiíter érhető el. A sertés-sejtvonalak nyilvánosan hozzáférhető helyekről [mint például az „American Type Tissue Collectíon”-től (ATCC)] beszerezhetők. A bakteriális sejtkultúrák tenyésztése, valamint az eukaríőta sejtek és az emlős-sejtvona15 szak em here k szálak tenyésztése és fenntartása jól ismert mára.
A jelen találmány tárgyát olyan eljárások képezik., amelyek arra szolgálnak, hogy emlős-, leginkább sertés^cirkovíru.sokat tenyésszünk olyan emlős-gazdasejtekben, amelyek em1 ős -adón ο v í ru s El g é n s ze k v e n e i á k ka 1 v annak t r a n. s z f e k t á1 v a. Néhány kiviteli fonna szerint az emlőssejtek stabilan transzformálva vannak az adenovírus El génszekvenciáival. Néhány kiviteli forma szerint az El génszekvenciák az emlőssejt genontjába vannak integrálva. Az El génszekvenciák. más kiviteli formák szerint egy replikálódő plazmidon vannak jelen. További kiviteli formák szerint az El génszekvencia heterológ az emlőssejtekkel. Egy példaként szolgáló kiviteli forma szerint egy sertéssejtet egy 5-ős típusú emberi adenovírus El génszekveneiájával transzformálunk, A jelen találmány szerint bármely olyan emlőssejt vagy emlős-sejivonal felhasználható, amelyben kifejeződik egy adenovírus El génjének a funkciója, feltéve hogy az adenovírus El génjének a funkcióját kifejező emlőssejt vagy emlős-sejívonal permisszív a cirkovírusok -leginkább a sertés-cirkovirusok, mint például az
1- es vagy a 2-es típusú sertés-cifkovkusok- replikációja szempontjából. Előnyös kiviteli formák szerint az emlőssejt sertéssejt vagy sertés-sejtvonal. A jelen találmány szerinti alkalmazás során bármilyen emlős-adene vírus El-génfnnkciő-kífejezödés szóba jöhet, feltéve, hogy az emlős-adenovírus El génjének a funkcióját kifejező emlős-gazdasejt permísszív a cirkovírusok “-leginkább a PCV, mint például az 1-es vagy a
2- es típusú sertés-cirkovirusok- replikációja szempontjából. Az emlös-adenovírus-genomok ismertek a szakmában, és azokról például az alábbi müvekből szerezhetünk információt:
φ φ
Reddy és mtsai., Journal of Virology, 72; 13-94, (1998), ez a közlemény a 3-as típusú szarvasmarha-ade-novírus (BAV3) nuki e o ti d- szek v enei áj át, geηom- s ze rv eződé sé t és t r an s z kri peiós térképét ismerteti; valamint Kieiboeker: Vírus Rés., 36; 259-268, (1995), ez a közlemény a PAV4 El-régióját ismerteti. A. jelen, találmány szerinti alkalmazás során az El génnek a funkciója a sokféle szerotipusű emberi adenovirus (mint például az Ád2, az Ad5, az Ád12 vagy az Ad40) bármelyikének az El gén funkciója lehet. Egy példaként szolgáló kiviteli forma szerint (amelyet az 1. Példában közlünk) az El gén funkciója az emberi. Adó BI génjének a funkciója. Az emberi adeno vírus EIA génje a vírusfertőzés után rögtön -(0-2 órával utána) kifejeződik, még mielőtt más vírusgének kifejeződnének (Fiint: Biochem. Bíophys. Áeta, 651; 175-2ÖS, (1982); Plini; Advances Vírus Research, 31; 169-228, (1986); valamint Grand; Biochem, J., 241; 25-38, (1987)]. Az Ad5 EIA génjének transzkripciós starthelye a vírusgénem 498. nukleotidjánál, az EIA fehérje ATG starthelye pedig a vírusgenom 560. nukleotidjánál van. Az E1B fehérje transz módon működik, és a késői raRNS-nek a magból a cítoplazmába történő szállításához szükséges. Az Ad5 E1B prom-otere egyetlen nagyaffínitásű Spl-felísmerő helyből és egy TATA-boxból áll. .Az 5-os típusú emberi adenovírus EIA és E1B génszekvenciái a ,E Ghroboezek és mtsai, által közölt nukleotid-szekvencia (Virology, 186; 280-285, (1992)] 505. és 4034. nukleotidja között helyezkednek el. Egy, a „Példák”~nál közölt, példaként szolgáló kiviteli forma szerint az emlős-gazdasejt egy 5-ös típusú emberi adenovírus EIA génszekveneiáivai t r a n s z f c k t á 11 s e r t é s - - g a z d a s ej t,
A PCV-genom vagy egy PCV-viríonokbóí izolált PCV•5 »»·» * **
-genom, vagy egy olyan PCV-gesom lehet, amely standard molekuláris biológiai és biotechnológiai eljárások segítségével egy plazmtdba van beépítve. Lia és mtsai. számolnak be arról, hogy hogyan lehet a teljes hosszúságú PCV2-genomot PCR segítségével a pölaescripí H KS (*) neve vektorba (Stratagene) klónozni (1. Clin. MierohioL, 38: 3474-3477, (2000)]. Az igy kapott plazmádból a teljes hosszúságú PCV2-genomnak megfelelő DNS Saeíl-vel történő emésztéssel vágható ki.
A cirkovirus- nuk.léotid-szekveneíák a permisszív emtös-gazdasejtekbe bármilyen, a szakmában ismert eljárással bevihetők, ilyen eljárások többek között, de nem kizárólag,, az alábbiak: transzfekcio és transzformáció, mint például mikroinjektálás, elektroporácíó, kaleium-foszfátos kicsapás, DEAE-dextrán alkalmazása, liposzőmákkal történő bevitel, géppuska alkalmazása, és igy tovább, A PCV2 uukleotid.-szekveseíáknak a VIDO RÍ sejtekbe történő transzfektálását a 3. Példában Illusztráljuk.
A prokariota sejtek -mint például a baktérium-sejtek-, valamint az eukariota sejtek -mint például az adenovírus El-génfunkciót kifejező emlős-gazdasejtek- tenyésztése a szakember számára rutin jellegi feladat.
Az alábbi példák a jelen találmány illusztrálására szolgálnak, emellett azonban nem korlátozzák annak tárgyát. Az összes, itt idézett publikáció és közzétett szabadalmi irat teljes egészében a jelen kitanítás részét képezi.
1. Példa éri adenovítus £1 .génszekvenciákkal transzfoktált sertésretiaa-sejtek (V1D0 Rl sejtek) előállítása
Sertés embrióból származó réti nasejtek primer tenyészeteit a kaíeium-foszfátos technika segítségévei lö pg pTG 4673 plazmáddal (Transgene, Strasbourg, Franciaország) iranszfekíáhnk. A pTG 4671 plazmid a HAV-5 teljes EIA és E1B szekvenciáit (505-4834. nukleotid) tartalmazza, tartalmazza továbbá a puromícín-aeíltranszferáz gént is, mint szelektálható markért. Eb-hon a plazmádban az El régiót az egér foszfoglieerát-kináz gén konstitutív promotere, a pnromícin-aeilíranszferáz géni pedig az S-V49 konstitutív korai promotere irányítja, A. transzformált sejteket úgy szelektáltuk, hogy a tenyészetet háromszor passzáltak, 7 pg/ml puromicini tartalmazó táptalajt használva; a transz formáit sejteket a megváltozott morfológiájuk alapján azonosítottuk (megszűntek a különálló gócok, azaz megszűnt a kontakt-gátlás), majd elkezdtük az egyedi sejtek klónozását. A megalapított sejtvonalat először abból a szempontból vizsgáltuk, hogy képes-e elősegíteni a HAV-5 azon deléeiós mutánsainak a szaporodását, amelyek nem tartalmazzák az El gént. Majd ezt követően a sejtvonalon az alábbi vizsgálatokat végeztük el: az El szekvenciák genomban való jelenlétének a vizsgálata PCR-rel, az .EIA és az E1B fehérjék expressziójának a vizsgálata Western-hlottal, valamint a megdupláződásí idő mérése sejttenyésztésí körülmények között. Az El szekvenciákat sikerült azonosítanunk, továbbá az EIA és az E1.B fehérjék termelődését immunprecipitáciővai igazoltuk. A megdnpiázódásí idő az
X χ« ♦t eredeti sejtvouaílal összehasonlítva rövidebb volt.
Áz El-expressziő stabilitásának a megállapítása céljából a VIDÖ Rl sejteket több mint 5ö-szer passzáhufc (a tenyészeteket hetente kétszer 3 részre osztottak)., és a sejteket vizsgáltuk abból a szempontból, hogy képesek-e elősegíteni a HÁV-5 azon deiéciós mutánsainak a szaporodását, amelyek nem tartalmazzák az El gént. Ezenkívül szabályos időközönként Western-blottal nyomon követtük az El A és az E1B fehérjék expressziőját. Az eredmények az. mutatták, hogy a VÍDO Rí sejtvonal megtartotta azon képességet, hogy elősegítse a HÁV-5 azon deiéciós' mutánsainak a szaporodását, amelyek nem tartalmazzák az El gént, továbbá ebben a sejtvonalban az El fehérjék expressziója az egész tenyésztés során (több mint 50 passzálás) közel azonos szintű volt, Á VIDO Rí sejtvonal tehát megalapozott sejívonalnak tekinthető. A VI'DO Rl .sejtvonalat az „American Type Cuíture Collectio.n”~nél helyeztük letétbe, a sejtvonal ATCC nyilvántartási száma PTÁ-155.
2. Példa
A teljes hosszúságú FCV2-genom molekuláris klónozása A FCV2 DNS-t először PCR-rel szaporítottuk föl,
PMWS-feen szenvedő malacból kivont teljes DNS-bői, kín és mtsai, eljárását használtuk arra, hogy a teljes hosszúságú RCV2~genom DNS~ét polimeráz láncreakció (PCR) segítségével a pBíuescrípi 11 KS (+) nevű vektorba (Stratagene) klónozzuk [i, Clin. MicrohioL, 3R 3474-3477, (2000)]. A PCV2-szekveueia a GenBask-nek lett benyújtva (nyilvántartási szám: AE0S6834). Az így kapott plazmádból a teljes hosszúságú PCV2-genomnak megfelelő DNS-t SacU-vel történő
Φ Φ
Az 1. Példa szerint előállított VIDÖ R Í sejtek transzfckiálása emésztéssel vágtuk ki.
3. Pé egv. a szerint előállított, PCV2-g.enomot tart a lm.ázó óddal
Anyagok és módszerek
Sej tton yészet
Az 1. Példában leírt magzati sertésretina-sejtvonaiaí, a VÍDO Rl-et, valamint a Verő sejteket (ATCC). 37 °C-on, 5 % szén-dioxídot tartalmazó atmoszférában tartottuk, Ragle-féle M.BM tápközegben, amelyet IÖ, illetve 5 %, hővel inaktíváit magzati borjűszérununal (FBS) egészítettünk ki.
Transzfekció és fertőzés .A VIÖÖ RÍ sejtek ©gy sejtréteg vastagságú tenyészetét (a sejteket egy haílyukű edényben tenyésztettük) Lipofecüni használva (a gyártó -GíBCO S'RL- útmutatását követve) a klónozott PCV'2 DNS-sel transzfektáltuk. A transzfektálás előtt a plazmáidból a teljes hosszúságú PCV2-genomot Sacll-vei történő emésztéssel vágtuk ki [Q. Liu és mtsai.; 3. €iio. Mierofe-ioL. 38: 3474-3477. (2000)]. Á fertőzéshez a transzfektáit V1ÖO Ri sejteket fagyasztottuk (~70üC), majd felolvasztottuk (37°C), a fagyasztásból és felolvasztásból álló ciklust háromszor ismételtük meg. Á lízátumot ezután centrifugálással tisztítottuk, majd a tisztított lizátummal friss V1D0 Ró sejteket fertőztünk, A szakirodalomban azt olvashatjuk, hogy a PCV2 vírus tenyésztéséhez egy PCV l-mentes sertésvese-sejtvomalat használnak. A sertésvese-sejteket minden esetben D-glükózamiu kezeléssel serkentették arra, hogy be21 * * * * lépjenek a sejtciklus S-fázisába [Tíscher és misai.: Árch. Viroi., 96: 39-57, (1 9S7)1, Ezt a kezelést azonban óvatosan kell végezni, mert a D-glükőzamin mérgező a sejttenyészetre (lásd: Állam és rntsai,: I. Vet. Diagn. Jnvesiigation, 12; 3-14, (2ÖÖÖ)]. A jelen találmány szerinti eljárást alkalmazva azonban nincs szükség a D-g 1ükézamín-kezelésre, mivel az általunk használt VIDO Rl sejtvonal a HAV-5 El génjével van transzformálva, arai képes indukálni az S-fázisba való belépést.
4, Példa
Vírastisztítás és -titrálás
A PCV2 vírusok tisztítása céljából a PCV2-vel fertőzött V1D0 Rl sejteket 37δ€~οη, 45 percig 0,5 % Triton Χ-114-et tartalmazó, foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldattal (PBS) inkubáltuk, majd az elegyet Freon 113-mal (1,1,2-triklőr-trífluor-etánnal) extraháltak. A sejttőrmeléket és a membránokat centrifugálással távolítottak el (2000 g, 15 perc). A felülüszóban található vírusokat centrifugálással ülepítettük, egy 20 %-os szacharóz-rétegen keresztül (35000 g, 3 óra). A vírusokból álló csapadékot PBS-ben szuszpcndáltuk, majd a szuszpenziót -VG^C-on tároltak.
A vírustitert „fertőző egység/ml”-bcn adtuk meg, és azt az ORF2 fehérje kvantitatív ímmuno-peroxídázos festésével határoztuk, meg. Ebből a célból a 12-lyukú lemezeken lévő, egy sejtréteg vastagságú tenyészeteket megfertőztük a vírussal, a vírusszuszpenzióbó! készült higitási sort használva. A vírusokai 1 órán keresztül hagytuk adszorbeálódni, a sejteket ezután mostuk, majd azokra 2 % FBS-t és 0.7 % agarozt tartalmazó ΜΈΜ-et rétegeztünk. Három nappal a fertőzés után
φ. φ.
Λ»* * ** eltávolitottuk az agaróz-borítást, majd a sejteket metanol és aeeton 1:1 térfogatarányú keverékével fixáltak és permeabilizáituk (20 perc, -2Ö°C). 1 %-os szarvasmarha szérum-a minnal történő blokkolás (1 óra, szobahőmérséklet) után a sejteket nyálban termeltetett anti-„ORF2 fehérje” szérummal [Li'u és mtsai.: Protein Expressíon and Purífication, 2 1; 115-120, (2001)) inkubáituk, A lemezeket 2 óra múlva PBS-sel mostuk, majd a VECTA.STAIN Elité ABC kitet (Vector Laboratories) használva tovább folytattuk az eljárást. A szint. 3,3’-diamíno-henzídin-tetrahidrokloriddal (DAB) hívtuk, elő, ezután a sejteket mikroszkóppal vizsgáltuk, A pozitívan festődóit sejteket megszámolva meghatároztak a vírustitert,. amelyet „fertőző egységé-ben adtunk meg, 1 fertőző egység egy darab pozitívan festődő sejtet jelent egy fókuszban, 3 nappal a fertőzés után.
A vírus-DNS izolálása és jellemzése
A PCV2-vel fertőzött VIDD Rl sejtekből (a sejtek tenyészete egy sejtréteg vastagságú) a vírus-DNS-t Hírt módszerével [3. Mól. Bioi., 26: 365-369, (1967)] izoláltuk. A vírus-DNS-t ezután restrikciós analízissel, valamint polimeráz láncreakcióval (FCR-rel) jellemeztük [Liu és mtsai.: j, Cli«. MierobíoL, 38; 3474-3477, (2000)1..
A PCR-rel (amelyhez terápiáiként a fertőzött sejtekből izolált DNS-t használtuk, a primerek pedig PCV2-specifikus primerek voltak.) egy helyes méretű terméket kaptunk, a. nem fertőzött .kontroll sejtekből ellenben nem tudtunk DNS-t felszaporítani. A várt restrikciós mintázatokkal összhangban a vírus-DNS Ncof-gyel és Stuf-gyel történő emésztésével egy 1291 és egy 477 bázispár hosszúságú, E.coRI-gyel és Stol23 * JÍ
-gyei történő emésztésével egy 1492 és egy 276 bázispár hosszúságú, EeoRI-gyel és EeoRV-teí történő emésztésével pedig egv 1094 és egy 674 bázispár hosszúságú fragmenst kaptunk.
Áz eredmények azt matatják, hogy PCV2 vírust kaptunk. Immunfestéses eljárást alkalmazva, majd megszámolva a pozitívan festődé sejteket azt kaptuk, hogy ezen preparátum vírustítere 2xlÖ? fertőző egység/mL
Claims (2)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás emlős-cirkovírusok tenyésztésére, azzal jellemezve, hogy tartalmazza az alábbi lépéseket; a) olyan emlőssejtek biztosítása, amelyekben kifejeződik egy emlős-adenovírus El funkció, és amely sejtek, permisszívek az emlős cirkovírusok replikációja szempontjából; b) az emlős cirkovírus-genom vagy egy replikációra alkalmas részének a bejuttatása áz. említett emlőssejtekbe; és c) az említett emlőssejtek tenyésztése olyan körülmények között, amelyek megfelelőek az említett emlős cirkovírus replikációja szempontjából.íj áras emlőso vírus repiikáoi.ójára, azzal jellemezve, hogy tartalmazza az alábbi lépéseket; olyan emlőssejtek tenyésztése, amelyek egy emlős cirkovírus genomot vagy annak replikád óra képes részét tartalmazzák, az említett emlős cirkovírus replikáciőjára alkalmas körülmények között, ahol az. emlős sejt egv emlős adenovírus El funkcióval rendelkező fehérjét expresszál. és permisszív az emlős eirko-vírusok replikációja szempontjából.Az igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy, az emíitett emlős cirkovírus egv sertés cirkovírus.4, Eljárás emlős adenovírus El funkcióval rendelkező és. egy sertés cirkovírus genomot tartalmazó rekombináns emlős sejt előállítására, azzal jellemezve, hogy tartalmazza az alábbi lépéseket; a) olyan emlőssejtek, biztosítása, amelyekben kifejeződik egy emlős adenovírus El funkció, és b) az említett sertés cirkovírus genom vagy egy replikációra alkalmas részének a bejuttatása az emlős sejtekbe.5. Eljárás rekombináns emlős sejtek előállítására, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket tartalmazza; egy emlős adenovírusΦ φEl gén régió bejuttatása egy emlős sejtbe, amely emlős sejt egy emlős cirkovírus genomot vagy annak replikáciőra képes részét tartalmazza, ahol a sejt permisszív az: emlős cirkovírusok replikáeiója szempontjából6» A 4. vagy 5, igénypont szerinti eljárás, amely továbbá az alábbi lépést tartalmazza: az. említett rekombináns emlős sejt. tenyésztése az említett sertés cirkovírns replikáé tójára alkalmas körülmények között.7. Az 1-3. vagy ő. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amely továbbá az alábbi lépést tartalmazza: az említeti cirkovírus kinyerése az említett tenyésztett sejtekből.8. A 3-7, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy, az említett sertés cirkovírus egy 2-es típusú sertés cirkovírus.A 3-7, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy, az említett sertés cirkovírus cir árus.;y 1-es típusú sertés10. Az 1-9.. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal iellemez.ve, hogy, az említett, emlőssejtek sertésből származnak.11. A lö. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy, az említett emlőssejtek sertés retina-sejtek.12, Az 1-1L igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy, az említeti emlős adenovírus El génfunkció egy emberi adenovírus· E l génjének a funkciója.
26 *: « « Φ **“: .*·. .♦· ·♦ Λ * * φ X * *..· χ.ί 13, Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti e Ijárás, azzal jellemezve, hogy, a z említ ett. emlős adenovírus El géi funkció egy sertés adenovírus El génjén; :k a funkciója. 14, Az 1-13. lsénvp ontok bármelyike szerinti e Ijárás, azzal jellemezve, hogy, az emlős adenovírus El génjének a funkciójátkifejező, emlitett em adenovírus El génsz; iőssejtek stabilan :kvéneiávak transzformálva vannak egy emlős χ. a 15, A 14, igén ypont szerinti el járás, azzal jellemezve, hogy, az említett emlős ader rovírus El génszekvencía heterolőg az említett emlőssejtekkel. 16. Az 1-15, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy, az említett El fűnk ció az El A és/vagy az E1B fűnk- ció. 17, A 3-16. igénypontok bá rmelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy, a z említett sertés clrkovírus tartalmaz egy kiméra nukl eoti d-s zekvenc iá f. 18, Rakom hím ins emlőssejtek. azzal jellemezve, hogy azokban kifejeződik egy érni ős adenovírus E 1 funkció, valamint tartalmaznak egy sertés clrkovÍri- s genomot, vagy annak egy replíkáeióra képes ré~ szét, továbbá az en ·; kitett sejtek pes misszívek az említett sertés cír- kovírus replikációja szempontjából. 19. A 18. íg; inypont szerinti, rekombináns emlőssejtek, azzal jellemezve, hogy az említett adenovírus El funkció egy emberi adenovírus El funkció. - 2ö< A 18. igénypont szerinti, rekombináns emlőssejtek, azzal jellemezve, hogy az említett adenovírus El funkció egy sertés adenovírus El funkció.21, Á 18-20, igénypontok bármelyike szerinti rekombináns emlőssejtek, azzal jellemezve, hogy az említett sejtek sertésből származnak.22. A 2L igénypont szerinti, rekombináns emlőssejtek, azzal jellemezve, hogy az említett sejtek sertés retina-sejtek.23, A 18-22. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns emlőssejtek, azzal jellemezve, hogy az emlős adenovírus E l. génjének a funkcióját kifejező emlőssejtek stabilan transzformálva vannak egy emlős adenovírus El génszekveneiával.24. A 23. igénypont szerinti, rekombináns emlőssejtek, azzal jellemezve, hogy az említett El génszekvencia egy emberi adenovírus El gétiszekvencia..25. A 23. igénypont szerinti, rekombináns emlőssejtek, azzal jellemezve, hogy az említett emlős adenovírus El génszekvencia hétéről óg az említett emlőssejtekkel.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US27917301P | 2001-03-27 | 2001-03-27 | |
| PCT/CA2002/000413 WO2002077210A2 (en) | 2001-03-27 | 2002-03-27 | Methods to culture circovirus |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0500161A2 HUP0500161A2 (hu) | 2005-05-30 |
| HUP0500161A3 HUP0500161A3 (en) | 2010-01-28 |
| HU228065B1 true HU228065B1 (en) | 2012-09-28 |
Family
ID=23067939
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0500161A HU228065B1 (en) | 2001-03-27 | 2002-03-27 | Methods to culture circovirus |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6794163B2 (hu) |
| EP (1) | EP1379671B1 (hu) |
| JP (1) | JP4038127B2 (hu) |
| KR (1) | KR100876629B1 (hu) |
| CN (2) | CN1840656B (hu) |
| AT (1) | ATE430807T1 (hu) |
| AU (1) | AU2002244584B2 (hu) |
| BR (1) | BRPI0208456B8 (hu) |
| CA (1) | CA2442135C (hu) |
| CY (1) | CY1109267T1 (hu) |
| CZ (1) | CZ304525B6 (hu) |
| DE (1) | DE60232234D1 (hu) |
| DK (1) | DK1379671T3 (hu) |
| ES (1) | ES2324466T3 (hu) |
| HU (1) | HU228065B1 (hu) |
| MX (1) | MXPA03008810A (hu) |
| MY (2) | MY148759A (hu) |
| PL (1) | PL202951B1 (hu) |
| PT (1) | PT1379671E (hu) |
| RU (2) | RU2312142C2 (hu) |
| SK (1) | SK287969B6 (hu) |
| UA (1) | UA82647C2 (hu) |
| WO (1) | WO2002077210A2 (hu) |
| ZA (1) | ZA200307517B (hu) |
Families Citing this family (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2772047B1 (fr) | 1997-12-05 | 2004-04-09 | Ct Nat D Etudes Veterinaires E | Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection |
| US20040062775A1 (en) * | 1997-12-05 | 2004-04-01 | Agence Francaise De Securite Sanitaire Des Aliments | Circovirus sequences associated with piglet weight loss disease (PWD) |
| ES2170622B1 (es) * | 1999-12-03 | 2004-05-16 | Consejo Superior De Investigaciones Cientificas | Clones y vectores infectivos derivados de coronavirus y sus aplicaciones. |
| DK1379671T3 (da) | 2001-03-27 | 2009-06-29 | Univ Saskatchewan | Fremgangsmåder til dyrkning af circovirus |
| US20030096377A1 (en) * | 2001-06-28 | 2003-05-22 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Differential PCR-RFLP assay for detecting and distinguishing between nonpathogenic PCV-1 and pathogenic PCV-2 |
| US7279166B2 (en) | 2001-12-12 | 2007-10-09 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof |
| US7276353B2 (en) | 2001-12-12 | 2007-10-02 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof |
| US7700285B1 (en) | 2005-12-29 | 2010-04-20 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | PCV2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions |
| UA95602C2 (ru) | 2004-12-30 | 2011-08-25 | Берингер Ингельхейм Ветмедика, Инк. | Иммуногенная композиция цвс2 и способы приготовления такой композиции |
| US7833707B2 (en) | 2004-12-30 | 2010-11-16 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2 |
| US8834891B2 (en) | 2005-03-14 | 2014-09-16 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Immunogenic compositions comprising Lawsonia intracellularis |
| JP5394750B2 (ja) * | 2005-12-29 | 2014-01-22 | ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ インコーポレイテッド | 多価ｐｃｖ２免疫原性組成物及び当該組成物を製造する方法 |
| MX338626B (es) | 2005-12-29 | 2016-04-26 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Uso de una composicion inmunogenica de pcv2 para producir los sintomas clinicos en cerdos. |
| WO2008073464A2 (en) | 2006-12-11 | 2008-06-19 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Effective method of treatment of porcine circovirus and lawsonia intracellularis infections |
| PL2481420T3 (pl) * | 2006-12-15 | 2019-08-30 | Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. | Jednodawkowa szczepionka anty-PCV2 dla świń |
| EP1941903A1 (en) * | 2007-01-03 | 2008-07-09 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Prophylaxis and treatment of PRDC |
| EP1958644A1 (en) | 2007-02-13 | 2008-08-20 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Prevention and treatment of sub-clinical pcvd |
| DK2155246T3 (da) * | 2007-05-11 | 2013-04-02 | Temasek Life Sciences Lab Ltd | Fremstilling af en homogen cellelinje højtolerant til porcine circovirus type 2 (pcv2)-infektion |
| WO2008151215A1 (en) * | 2007-06-04 | 2008-12-11 | Merial Limited | Production of porcine circovirus proteins in plants |
| US7829274B2 (en) * | 2007-09-04 | 2010-11-09 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Reduction of concomitant infections in pigs by the use of PCV2 antigen |
| ME01156B (me) * | 2007-12-21 | 2013-03-20 | Zoetis Services Llc | Postupci i kompozicije za imunizaciju svinja protiv svinjskog cirkovirusa |
| CN101932336B (zh) * | 2007-12-31 | 2014-07-09 | 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 | 有外来氨基酸插入的pcv2 orf2病毒样颗粒 |
| CN101980720A (zh) | 2008-01-23 | 2011-02-23 | 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 | Pcv2猪肺炎支原体致免疫组合物及其制备方法 |
| BRPI0911200A2 (pt) * | 2008-04-16 | 2016-07-05 | Virginia Tech Intelectual Properties Inc | circovírus suíno quimérico pcv2gen-1 rep e usos do mesmo |
| TWI627281B (zh) * | 2009-09-02 | 2018-06-21 | 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 | 降低ｐｃｖ－２組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之ｐｃｖ－２組合物 |
| US20120100168A1 (en) * | 2010-01-25 | 2012-04-26 | Blood Systems, Inc. | Cyclovirus and methods of use |
| BR112016006192A2 (pt) | 2013-09-25 | 2017-09-26 | Zoetis Services Llc | composição de vacina de divergente de pcv2b e métodos de uso |
| ES2778425T3 (es) | 2013-10-02 | 2020-08-10 | Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc | Variante de la proteína ORF2 del PCV2 y partículas similares a virus compuestas por esta |
| US9944904B2 (en) * | 2015-05-14 | 2018-04-17 | Merial Inc. | Method for porcine circovirus production and PCV2 vaccines |
| US10462620B2 (en) * | 2016-10-11 | 2019-10-29 | Orion Labs | Group communication forwarding to a secondary service |
| CN114934020B (zh) * | 2022-01-30 | 2024-02-13 | 山东省滨州畜牧兽医研究院 | 猪视网膜上皮细胞系及其建立方法和应用 |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100780158B1 (ko) * | 1996-10-23 | 2007-11-27 | 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 | 면역 치료법 및 개량 백신 |
| AUPO856097A0 (en) | 1997-08-14 | 1997-09-04 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Vector |
| US6517843B1 (en) * | 1999-08-31 | 2003-02-11 | Merial | Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2 |
| UA78180C2 (uk) | 1997-10-03 | 2007-03-15 | Меріаль | Кільцевий вірус свині типу ii, вакцини та діагностичні реагенти |
| US7192594B2 (en) | 1997-10-03 | 2007-03-20 | Merial Limited | Postweaning multisystemic wasting syndrome and porcine circovirus from pigs |
| US6391314B1 (en) | 1997-10-03 | 2002-05-21 | Merial | Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents |
| FR2781159B1 (fr) | 1998-07-06 | 2000-10-06 | Merial Sas | Vaccin circovirus et parvovirus porcin |
| FR2772047B1 (fr) | 1997-12-05 | 2004-04-09 | Ct Nat D Etudes Veterinaires E | Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection |
| WO1999045956A1 (en) | 1998-03-13 | 1999-09-16 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Vaccines against circovirus infections |
| US6492343B1 (en) | 1998-04-15 | 2002-12-10 | University Of Saskatchewan | Porcine adenovirus type 3 genome |
| DE69941786D1 (de) | 1998-09-08 | 2010-01-21 | Brij P Giri | Chemolumineszente 1,2-dioxetane |
| AU780822B2 (en) | 1998-11-02 | 2005-04-21 | University Of Saskatchewan | Bovine cells expressing adenovirus essential functions for propagation of recombinant adenoviral vectors |
| FR2789695B1 (fr) | 1999-02-11 | 2003-03-07 | Merial Sas | Vecteurs et vaccins viraux a base d'adenovirus porcins recombines et replicatifs |
| US6943152B1 (en) | 1999-06-10 | 2005-09-13 | Merial | DNA vaccine-PCV |
| US6497883B1 (en) | 1999-06-10 | 2002-12-24 | Merial | Porcine circovirus recombinant poxvirus vaccine |
| CA2413265A1 (en) | 2000-05-03 | 2001-11-08 | University Of Guelph | Porcine adenovirus type 5 vector and vaccine |
| DK1379671T3 (da) | 2001-03-27 | 2009-06-29 | Univ Saskatchewan | Fremgangsmåder til dyrkning af circovirus |
-
2002
- 2002-03-27 DK DK02712700T patent/DK1379671T3/da active
- 2002-03-27 CA CA002442135A patent/CA2442135C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-27 WO PCT/CA2002/000413 patent/WO2002077210A2/en active Application Filing
- 2002-03-27 HU HU0500161A patent/HU228065B1/hu unknown
- 2002-03-27 DE DE60232234T patent/DE60232234D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-27 AU AU2002244584A patent/AU2002244584B2/en not_active Expired
- 2002-03-27 CN CN2006100731464A patent/CN1840656B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-27 MY MYPI2011006359A patent/MY148759A/en unknown
- 2002-03-27 EP EP02712700A patent/EP1379671B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-27 CN CNB02809221XA patent/CN1309836C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-27 SK SK1210-2003A patent/SK287969B6/sk unknown
- 2002-03-27 AT AT02712700T patent/ATE430807T1/de active
- 2002-03-27 US US10/112,540 patent/US6794163B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-27 UA UA2003109561A patent/UA82647C2/uk unknown
- 2002-03-27 PL PL364077A patent/PL202951B1/pl unknown
- 2002-03-27 CZ CZ2003-2584A patent/CZ304525B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2002-03-27 JP JP2002576653A patent/JP4038127B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-27 PT PT02712700T patent/PT1379671E/pt unknown
- 2002-03-27 MX MXPA03008810A patent/MXPA03008810A/es active IP Right Grant
- 2002-03-27 ES ES02712700T patent/ES2324466T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-27 RU RU2003131342/13A patent/RU2312142C2/ru active
- 2002-03-27 MY MYPI20021106A patent/MY146518A/en unknown
- 2002-03-27 KR KR1020037012491A patent/KR100876629B1/ko active IP Right Grant
- 2002-03-27 BR BRPI0208456A patent/BRPI0208456B8/pt active IP Right Grant
-
2003
- 2003-09-26 ZA ZA200307517A patent/ZA200307517B/en unknown
-
2004
- 2004-05-07 US US10/840,879 patent/US7172899B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2007
- 2007-01-17 US US11/654,869 patent/US7560278B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2007-03-23 RU RU2007110808/13A patent/RU2007110808A/ru not_active Application Discontinuation
-
2009
- 2009-08-04 CY CY20091100822T patent/CY1109267T1/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU228065B1 (en) | Methods to culture circovirus | |
| RU2237492C2 (ru) | Иммуногенная композиция, вызывающая иммунный ответ против парвовируса и цирковируса свиньи, вакцина против многосистемного синдрома истощения свиней (pmws) (варианты), набор для вакцинации и способ ее осуществления | |
| JP5869658B2 (ja) | ブタサーコウイルス、ワクチンおよび診断試薬 | |
| EP2264050B1 (en) | Chimeric infectious dna clones of porcine circovirus and uses thereof | |
| AU2002244584A1 (en) | Methods to culture circovirus | |
| Prasetyoa et al. | Mutation of the first ATG ORF-3 of Chicken Anemia Virus into ACG completely abolish the apoptin production |