CN114934020B - 猪视网膜上皮细胞系及其建立方法和应用 - Google Patents

猪视网膜上皮细胞系及其建立方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了猪视网膜上皮细胞系(WWX04‑PR)及其建立方法和应用，本发明猪视网膜上皮细胞易于培养，生长速度较快，能稳定传代，细胞活率高、纯度高且能很好保藏；通过无菌获取猪眼球组织分离获得高活力的原代猪视网膜细胞，然后导入含有猪腺病毒E1基因的真核表达质粒pCI‑neo‑E1，筛选和扩大培养，获得一株可稳定传代猪视网膜上皮细胞系；得到的细胞系能够用于生产猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒等疫苗抗原，还可用于临床野毒分离鉴定。该细胞系可作为人类视网膜相关疾病研究的细胞模型，也是研究中枢神经系统发育和功能的经典模型。

Description

猪视网膜上皮细胞系及其建立方法和应用
技术领域
本发明涉及动物细胞工程领域，具体涉及猪视网膜上皮细胞系，还涉及猪视网膜上皮细胞系(WWX04-PR)的建立方法和应用。
背景技术
猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)是迄今发现的一种最小的动物病毒。它是断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原，猪皮炎与肾病综合征、增生性坏死性肺炎、猪呼吸道疾病综合征、繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等疾病亦与PCV2感染有重要关联，给养猪业造成严重的经济损失。现已被世界各国的兽医与养猪业者公认为是继猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)之后新发现的引起猪免疫障碍的最重要传染病。然而PCV2在多数细胞上没有细胞病变，对于PCV2的分离鉴定、致病机理研究以及疫苗研制均有较大的影响，也进一步阻碍了PCV2的防治和疫病蔓延。前期研究发现PCV2可在猪视网膜细胞中高效增殖且能产生明显的细胞病变，是良好的病毒增殖载体和疫苗研制的素材，而原代细胞不但生产成本高，且操作繁琐，不利于生产应用。因此迫切需要建立猪视网膜上皮细胞系。
猪是解决各种免疫学问题的宝贵大型动物模型，猪视网膜上皮细胞系的建立，有利于各种免疫学和致病机理的研究，也可以作为药物残留检测工具，也可以开展基因表达规律和生物形状特征的研究。同时，猪和人类视网膜具有相似的结构和特征，猪神经视网膜的离体培养为研究人类视网膜损伤和退行性疾病的机制提供了一个有吸引力的模型。可用于建立和表征成年猪视网膜培养系统作为实时视网膜存活的快速筛查工具的方法。猪视网膜是研究中枢神经系统发育和功能的经典模型。
因此，现在急需对其方法进行改进，使猪视网膜细胞能够稳定传代下去，达到高细胞活率、高纯度的标准且能得到很好的保藏并延续下去。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的之一在于提供一种易于培养、操作方法简便的猪视网膜上皮细胞系；本发明的目的之二在于提供猪视网膜上皮细胞系的应用；本发明的目的之三在于提供猪视网膜上皮细胞系的建立方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、猪视网膜上皮细胞系，所述猪视网膜上皮细胞系保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC C2020112，保藏日为2020年7月27日。
2、上述猪视网膜上皮细胞系可用于猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒等病毒的分离以及鉴定，并为相关猪圆环病、猪伪狂犬病、流行性腹泻病等相关疫苗抗原制备提供体外培养载体，还可用于病毒如猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒、流行性腹泻病毒在猪视网膜上皮细胞增殖特性、复制感染及致病机理等方面的研究；还可以作为解决各种免疫学问题的动物模型，也可以作为药物残留检测工具，甚至可以作为人中枢神经系统发育和功能的经典模型。
3、所述猪视网膜上皮细胞系的建立方法，具体包括如下步骤：
(1)原代培养：采集初生仔猪的眼球组织，无菌分离出猪视网膜组织，采用组织块法分离，置于37℃，5％CO2条件下培养约7天，获得高活力的原代猪视网膜细胞；
(2)真核表达质粒pCI-neo-E1的构建
1)pCI-neo质粒的提取
①取转化pCI-neo的菌液10μL，加入到含有氨苄西林钠(100μg/mL)的50mL LB中，放入的37℃摇床8h。
②吸取5mL菌液，加入10mL离心管，12000r/min离心1min，弃上清。加入已经添加了RNase A的P1溶液250μL，重悬菌液。加入250μL P2溶液，缓慢地晃动离心管，使液体混合均匀。
③添加350μL P3溶液，立即晃动离心管，使液体混匀，此时液体中出现白色絮状沉淀，12000r/min离心10min。
④收集上清液转移到CP3吸附柱中(吸附柱提前用平衡液BL平衡)，12000r/min离心1min，弃去收集管的废液之后再将吸附柱重新放回到收集管。
⑤吸取漂洗液PW(提前加好无水乙醇)600μL加入到吸附柱CP3中，12000r/min离心1min。弃去收集管的废液之后再将吸附柱重新放回到收集管，此步骤再重复一次。12000r/min离心2min，弃去CP3吸附柱中的残留的液体，以防漂洗液PW中的无水乙醇影响后续实验。
⑥将吸附柱CP3转移至干净的1.5mL高压除菌的离心管中，向吸附柱中加入50～100μL洗脱液EB，常温静置5～6min，12000r/min离心2min，质粒回收到离心管中。
⑦使用核酸分光光度仪测量至所提质粒浓度和纯度。
2)猪腺病毒E1基因的合成：参考NCBI上猪E1基因序列(序列号：NM_001244300)，两端分别加NheⅠ和EcoRⅠ酶切位点后送上海生工生物有限公司合成。
3)将pCI-neo和E1分别用NheⅠ和EcoRⅠ进行双酶切反应，具体体系如下：
用漩涡振荡器充分混合均匀反应体系，放置37℃恒温箱中酶切2h。加10μL 6×loading buffer到酶切产物中，点样至1％的琼脂糖凝胶进行凝胶电泳。将目的条带切下按OMEGA胶回收试剂盒说明书进行回收并测定回收产物浓度分别为pCI-neo为32ng/μL，E1为102ng/μL。
4)将回收的pCI-neo和E1按NEB连接酶进行连接反应，具体体系如下：
用漩涡振荡器充分混合后16℃孵育过夜，转化DH5α大肠杆菌感受态中。
5)按步骤1)中的方法提取质粒pCI-neo-E1并进行双酶切鉴定，鉴定正确的质粒送上海生工测序。测序结果与NCBI上的序列同源性100％，未发现突变，将质粒置于-20℃保存备用。
(3)G418最小浓度筛选：将G418在100～800μg/mL范围，按每100μg为一个梯度用培养液配置成不同的筛选浓度；取分离的原代猪视网膜细胞接种到96孔培养板，过夜培养后更换不同浓度的G418的培养基，每个浓度做3个重复，37℃，5％CO2培养箱内培养7天，根据细胞死亡情况确定G418筛选的最小浓度为200μg/mL。
(4)转染：将含有猪腺病毒E1基因的真核表达质粒pCI-neo-E1导入步骤(1)的原代猪视网膜细胞进行转染；
(5)筛选和扩大培养：细胞转染真核表达质粒pCI-neo-E1后待细胞汇合至80％时，使用胰酶消化后按1:1传代处理，然后G418筛选直到阳性克隆细胞可见，然后将细胞稀释后按每孔数量≤2个接种，传至另一个24孔培养板中，48h后，用G418筛选液进行G418筛选；待对照孔的细胞全部死亡后，将G418筛选液的浓度降低维持G418筛选，将G418筛选阳性的克隆细胞接种到96孔培养板中，然后消化传代至24孔培养板扩大培养，继续进行G418筛选，得抗G418的阳性细胞。
(5)将抗G418的阳性细胞于37℃，5％CO2培养箱内培养，细胞呈卵圆形或短梭状，单层贴壁生长，细胞间存在接触抑制，培养超过60代，即获得的猪视网膜上皮细胞系。所述体外连续传代培养采用消化法。
本发明中，还包括细胞冻存步骤，该步骤按顺序如下：
更换的猪视网膜上皮细胞系培养瓶内的培养基，继续培养；用胰酶消化培养细胞，然后加入培养基终止反应；计数；离心，去上清液，加入冻存液，混匀，使细胞重悬，将培养的细胞分装入冻存管封口；
预冻：4℃预冻冻存管30～60min，-20℃预冻1～2h，-70℃预冻6～12h；
冻存：将-70℃预冻的冻存管迅速投入液氮柜中；
所述的冻存液的各成分所占体积百分比为：10％DMSO、60％胎牛血清和30％DMEM。本发明中，步骤(1)所述的培养是指高活力的猪视网膜细胞培养于完全的DMEM培养基中；所述完全的DMEM培养基为向液态DMEM培养基中加入体积比为10％的胎牛血清的DMEM培养基；
所述的液态DMEM培养基可以使用直接购买的该液体培养基，也可以是使用购买的DMEM培养基干粉配制而成。
本发明中，所述转染包括如下步骤：
(1)转染前24h，将猪视网膜细胞用消化成单个细胞，接种到24孔板内，使细胞在转染当天能达到60％～70％的融合；
(2)转染前4h，将完全的DMEM培养基更换成液态DMEM培养基；
(3)用液态DMEM培养基将三份5μL的pCI-neo-E1质粒均稀释至50μL，得稀释的质粒DNA；
(4)用液态DMEM培养基分别稀释6μL、9μL、12μL的Lipofectamine2000到50μL，得到稀释的Lipofectamine2000；
(5)分别混合步骤(3)的稀释的质粒DNA和步骤(4)的稀释的Lipofectamine2000，得混合物；
(6)吸出步骤(1)的24孔板中的培养基，用D-Hank’s清洗，加入900μL液态DMEM培养基；
(7)加入步骤(5)的混合物到不同孔中，混匀；同时设立空白对照；
(8)于体积分数为5％CO2饱和湿度培养箱中孵育，弃去培养基，加入完全的DMEM培养基；
(9)观察细胞，并及时换液。
本发明猪视网膜上皮细胞系具有以下特征：细胞生长状态良好，形态均一。细胞纯度在99.9％以上，细胞活率不小于93.6％。本发明猪视网膜上皮细胞系的生物学特性检测各项指标均达到美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，ATCC)细胞系鉴定标准。
本发明猪视网膜上皮细胞系的建立方法中，步骤(1)中所述的初生猪视网膜组织效果最佳。
本发明猪视网膜上皮细胞系的建立方法中，胰酶消化的具体步骤是：向培养瓶内加入2.5g/L胰酶1.5～2.5mL，倒置培养瓶于温箱中预热至37℃后翻转消化30～60S。
本发明猪视网膜上皮细胞系的建立方法中，根据实际需要可以将冻存的细胞进行复苏，具体步骤为：将冻存管从液氮中取出置入38℃水浴中，晃动1分种后，将细胞移入加有完全的DMEM培养基的培养瓶中吹打均匀，放置含37℃，5％CO2的CO2培养箱中继续培养48h后即可继续传代培养。
本发明的有益效果在于：本发明对于贴壁培养方法及采用细胞单克隆的方法，可以使培养出的猪视网膜上皮细胞活力高、无其他杂质细胞，细胞纯度与现有技术相比有大幅提高；对于冻存条件的改进使复苏的细胞与冻存前相比，细胞形态和生长速度没有发生变化，冻存细胞质量稳定，且细胞冻存后的细胞活率可达到93.6％～96.2％之间，且细胞传代生长稳定，与现有细胞培养技术培养的细胞相比有显著提高，适合大规模培养，还可以使成本大幅降低。本发明方法弥补了现有猪视网膜上皮细胞系缺乏的现状，猪视网膜上皮细胞系存活率及纯度的提升也使猪圆环病、猪流行性腹泻、猪伪狂犬及相关疾病研究和疫苗抗原等生物制剂研制提供手段；同时还可用于外源基因转染、细胞凋亡及细胞融合研究之用。
本发明猪视网膜上皮细胞系不仅能够生产猪圆环疫苗，还能够研究病毒在猪视网膜细胞中增值的基本特性和规律，为疫苗生产中猪圆环病毒产量的提高提供新的思路。同时，猪视网膜细胞还能生产其他病毒疫苗。
本发明方法易于培养，生长速度较快，操作方法简便，获得细胞纯度高、存活率高且传代生长稳定，便于推广应用。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为原代猪视网膜细胞显微镜图(200×)；
图2为转染后阳性猪视网膜上皮细胞克隆(200×)；
图3为猪视网膜上皮细胞系第30代细胞显微镜图(200×)；
图4为猪视网膜上皮细胞系第50代细胞显微镜图(200×)；
图5为猪视网膜上皮细胞系核型观察结果(1000×)；
图6为猪视网膜上皮细胞系上皮细胞特异性表型标记物CK18 IFA鉴定(A：DEEC；B：PR；C：阴性)；
图7为猪视网膜上皮细胞系上皮细胞特异性表型标记物CK19 IFA鉴定(A：DEEC；B：PR；C：阴性)；
图8为PCV2病毒在猪视网膜上皮细胞系上的增殖(A：接种PCV2 24小时的PR细胞；B：接种PCV2 48小时的PR细胞；C：接种PCV2 60小时的PR细胞；D：未接种病毒的PR细胞)；
图9为猪伪狂犬病毒在猪视网膜上皮细胞系上的增殖(A：接毒24小时的PR细胞；B：未接毒的PR细胞；C：接毒24小时的BHK-21细胞；D:未接毒的BHK-21细胞)。
图10为猪视网膜上皮细胞系转染E1基因重组质粒的PCR鉴定(M.DL2000 DNAmarker；1.转染后阳性猪视网膜细胞；2.猪视网膜原代细胞)。
生物保藏
本发明猪视网膜上皮细胞系送到保藏在中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，保藏入册登入册编号为CCTCC NO:C2020112，保藏单位地址为：湖北省武汉市武汉大学，保藏日：2020年6月18日，分类命名为猪视网膜上皮细胞系。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
G418是一种氨基糖苷类抗生素，在分子遗传试验中，是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。
本发明实验材料的来源：
生物材料：胎牛血清商购于胎牛血清是Gibco公司，货号：10099-141。
含有猪腺病毒E1基因的真核表达质粒pCI-neo-E1。申请人声明，以上生物材料均在申请人实验室有保存，自申请日起二十年内可向公众发放用于验证试验。
试剂的来源及规格如下：
DMSO商购于Sigma，Dimethyl sulfoxide，cat.D8418，规格100mL；
G418商购于Invitrogen，Cat no.11811023，规格：1g；
DMEM培养基干粉购于Dulbecco’s Modified Eagle Medium，Gibco公司，规格：10×1L；培养基为粉末状powder，low glucose低糖；货号：Cat.no.31600-034,LotNo.843267；
完全的DMEM培养基为在上述自行配制的液态DMEM培养基中加入体积比为10％的Gibco胎牛血清；
G418筛选液为在上述自行配制的液态DMEM培养基中加入G418而得；
D-Hank’s，即D-Hank'S液：NaCl 8g，KCl 0.4g，Na2HPO4·H2O 0.06g，KH2PO4 0.06g，NaHCO3 0.35g溶于1000m1双蒸水，调节pH值至7.2-7.4，高压灭菌，4℃下保存备用。
试剂均为分析纯；
胰酶，购于胰酶Invitrogen，货号：27250-018，10g，2.5g/L；
Lipofectamine2000Reagent，商购于invitrogen公司，中文名称为脂质体2000，Cat.no.11668-027；
其他的没有列出的化学试剂都是常规的化学试剂，分析纯级，商购途径获得，一般化学用品公司可以购买到。
试剂盒和仪器设备的来源及规格如下：
Endo-Free Plasmid Maxi Kit无内毒素质粒提取试剂盒，购于Omega公司，货号：D6926-01；当量大时，质粒提取可采用质粒大量提取试剂盒，公司：QIAGEN，货号：12163；
DNA/质粒纯化回收试剂盒，购于Omega公司，货号：D2500-01，Gel ExtractionKit；
本发明所用的培养基有两种：液态DMEM培养基和完全DMEM培养基，其中液态DMEM培养基是使用商购的DMEM培养基干粉(购于Dulbecco’s Modified Eagle Medium，Gibco公司)自行配制，而完全DMEM培养基是在液态DMEM培养基中加入体积比为10％的Gibco胎牛血清；
本发明所使用的筛选液是在液态DMEM培养基中加入了G418，所述的400μg/mLG418筛选液是指每ml G418筛选液中含有400μg G418的DMEM培养基；所述的200μg/mL G418筛选液是指每ml G418筛选液中含有200μg G418的DMEM培养基；G418是一种抗生素，此处液态DMEM培养基中加入G418即作为G418筛选液；
本发明胰酶消化所用胰酶均为质量体积比为2.5g/L的胰酶；
DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养基的基础上研制的。与MEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型(低于4500mg/L)和低糖型(低于1000mg/L)。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。
DMEM是dulbecco's modified eagle medium的缩写，所以其特点主要包括以下：
(1)氨基酸含量为依格尔培养基的2倍，且含有非必需氨基酸，如甘氨酸等；
(2)维生素含量为依格尔培养基的4倍；
(3)含有糖酵解途径中的重要物质——丙酮酸；
(4)含有微量的铁离子。
PREC全称Porcine Retinal Epithelial cells，即猪视网膜上皮细胞，本专利建立的细胞系，命名为WWX04-PR，就是通过向分离的猪视网膜上皮细胞转染人腺病毒E1基因后建成的细胞系。来源：由初生仔猪眼球组织分离，由山东省滨州畜牧兽医研究院动物房提供。
质粒DNA即为纯化的pCI-neo-E1质粒DNA，由本实验室构建保存；
实施例1、原代猪视网膜细胞的制备与培养
(1)原代细胞制备
采集1日龄初生仔猪眼球，无菌分离仔猪视网膜，用PBS漂洗3～5次以清除粘附组织，剪成0.5～2.0mm3的组织块，采用组织块贴壁法分离培养，置于37℃，5％CO2条件下培养，约7天后，有大量细胞沿组织块底部爬出，用1.0～3.0g/L胰酶消化3～5min，待细胞分散呈圆形的单个细胞，弃去消化液，获得高活力的原代猪视网膜细胞。
(2)原代细胞培养
将分离得到的高活力的原代猪视网膜细胞中加入完全的DMEM培养基，计数后按照5000个细胞/mL的浓度接种于(含有10％胎牛血清的液态DMEM培养基)24孔板中，置于37℃，5％CO2条件下培养；
所述完全的DMEM培养基为向液态DMEM培养基中加入体积比为10％的胎牛血清的DMEM培养基。
实施例2、猪视网膜细胞上皮细胞系的构建与传代培养
(1)转染和筛选：将保存在-80℃的含有pCI-neo-E1质粒的DH5а菌取出，接种在含有氨苄的LB培养基中，振荡培养10h，取菌液提取质粒，用质粒提取试剂盒进行提取(质粒提取采用质粒大量提取试剂盒，公司：QIAGEN，货号：12163)；采用DNA/质粒纯化回收试剂盒对质粒进行纯化，得含有猪腺病毒E1基因(SEQ ID NO.1)的真核表达质粒pCI-neo-E1(E1基因连入pCI-neo质粒的多克隆酶切位点)，采用脂质体转染法，将编码E1和neo基因的真核表达质粒pCI-neo-E1导入步骤实施例1(1)原代培养的猪视网膜细胞进行转染，转染的具体包括如下步骤：
A、转染前24h，将猪视网膜细胞用2.5g/L胰酶消化成单个细胞，以1×105个细胞/孔接种到24孔板内，使细胞在转染当天能达到80％～90％的融合；
B、转染前4h，将完全的DMEM培养基更换成液态DMEM培养基；
C、用液态DMEM培养基稀释5μL pCI-neo-E1质粒至体积为50μL，轻轻混匀，质粒浓度达到300ng/μL～400ng/μL室温作用5min，得稀释的质粒DNA；
D、用液态DMEM培养基分别稀释Lipofectamine2000至6μL、9μL、12μL到50μL，轻轻混匀，室温作用5min，得稀释的Lipofectamine2000；
E、混步骤C的稀释的质粒DNA和步骤D的稀释的的Lipofectamine2000，此时总体积为100μL。轻轻混匀，室温作用20min，得混合物；
F、将24孔板中的旧培养基吸出，用D-Hank’s清洗，加入900μL液态DMEM培养基；
G、逐滴加入步骤E的混合物到不同孔中，边加边前后来回摇动培养板，轻轻混匀；同时设立2孔未转染作为空白对照；
H、在37℃、体积分数比为5％CO2饱和湿度培养箱中孵育4～6h，弃去培养基，加入完全的DMEM培养基；
I、24h～48h观察细胞，并及时换液。
(2)纯化和扩大培养：待细胞转染pCI-neo-E1真核表达质粒48小时后待细胞汇合至80％时，使用2.5g/L胰酶消化，以1:1传至另一个24孔培养板中，48h后加入400μg/mLG418筛选液(液态DMEM培养基中加入G418)进行G418筛选，每三天更换一次完全的DMEM培养基，且加入同样浓度的G418筛选液进行筛选，第7天时，可用胰酶于原孔消化细胞，弃去消化液并补加G418筛选液，连续培养两周，每两天换相同浓度筛选液1次，每天观察细胞生长及死亡情况；待对照孔的细胞全部死亡后，将G418筛选液的浓度降至200μg/mL维持G418筛选；继续G418筛选细胞一个月左右，每两天换1次液，直到出现阳性克隆细胞为止；将G418筛选阳性的克隆细胞消化并计数后，将细胞进行无限稀释，按每孔数量≤2个接种到96孔细胞培养板中，标记每一个细胞的孔，待单细胞长出克隆团后，用2.5g/L胰酶进行消化，并将细胞传至24孔培养板，于37℃、5％的CO2条件下进行扩大培养，继续利用G418筛选，得到抗G418的阳性细胞；此处的，在96孔培养板中相当于在利用单克隆的方法纯化细胞。
(4)37℃条件下，采用消化法将步骤(3)所得阳性细胞于5％的CO2培养箱内进行体外连续传代培养，分选后细胞呈现细胞呈卵圆形或短梭型状排列，单层贴壁生长，细胞间存在接触抑制，培养超过60代，获得的猪视网膜上皮细胞系。
细胞在体外培养过程中，对细胞进行常规检查，观察细胞生长状态、培养基颜色变化情况以及细胞是否发生污染。图1为原代猪视网膜细胞显微镜图；图2为转染后阳性猪视网膜上皮细胞克隆；图3为猪视网膜上皮细胞系第30代细胞显微镜图；图4为猪视网膜上皮细胞系第50代细胞显微镜图。结果显示，传代培养细胞与原代细胞相比形态有明显差异，原代细胞含有多种杂细胞，大多数细胞形态为长梭状,少数为多角形和卵圆形,而建立的上皮细胞系是由细胞形状单一，细胞呈卵圆形或短梭型状排列，细胞间存在接触抑制，其纯度高于99.9％,均为上皮样细胞。
(5)细胞冻存：
A、弃除并更换培养瓶内液态DMEM培养基5～8mL，继续培养24h；
B、用胰酶消化培养细胞，然后加入液态DMEM培养基5～8mL终止反应；
C、用红细胞计数板计算冻存前细胞总数；
D、收集：1000rpm离心5～8min，去上清液，加入4℃预冷的冻存液1mL，混匀后用吸管轻轻吹打使细胞重悬；所述冻存液各成分所占体积百分比为：10％DMSO十60％胎牛血清+30％DMEM(也就是，100mL冻存液中，DMSO占总体积的10％，胎牛血清占总体积的60％，DMEM培养基占30％)；
E、将细胞培养物分装入灭菌的冻存管中封口；
F、预冻：4℃，将冻存管预冻30～60min，转移到-20℃预冻1～2h，然后转入-70℃预冻6～12h；
G、冻存：将-70℃预冻的冻存管迅速投入液氮柜中，即完成细胞冻存。
将上述所得到的猪视网膜上皮细胞系送到保藏在中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，保藏入册登入册编号为CCTCC C2020112，保藏单位地址为：湖北省武汉市武汉大学保藏中心。
保藏日：2020年6月18日，分类命名为猪视网膜上皮细胞系。
实施例3、所得猪视网膜上皮细胞系的效果验证
对实施例2培养的猪视网膜上皮细胞系进行生物学特性检查，方法及结论如下。
1)微生物检测
细菌、真菌检测方法：
(1)取冻存细胞量0.5％的冻存细胞，于8mL无抗培养基中混匀，细胞悬液以1000rpm离心20min，并重复两次，以消除抗生素的影响。再重悬于2mL无抗生素的培养基中。
(2)将细胞以0.8mL接种到胰蛋白豆胨和麦芽汁培养基中，分别置于37℃和26℃的培养箱中培养两周。
(3)设对照为：
A.阳性对照：枯草芽孢杆菌和白假丝酵母菌分别接种到胰蛋白胨和麦芽汁培养基中培养，置于37℃和26℃的培养箱中培养两周。
B.阴性对照：胰蛋白豆胨培养基和麦芽汁培养基，分别置于37℃和26℃的培养箱中培养两周。
结论：肉眼观察接种有猪视网膜上皮细胞的大豆胰蛋白胨培养基和麦芽汁培养基，均呈现清亮透明状，将试管置于显微镜下观察，细胞呈圆形的透明状亮点漂浮在培养基中，无其它异物。证明在细胞培养冻存及细胞复苏的整个过程中，细胞未被细菌、真菌污染。
实施例4、猪视网膜上皮细胞系转染质粒的PCR鉴定
2)猪视网膜上皮细胞系的鉴定
根据NCBI猪腺病毒E1基因序列，应用Primer Premier 5.0软件设计1对检测
E1-TEST-F：5′-ctggtgccgccactatgttc-3′(SEQ ID NO.2)；
E1-TEST-R：5′-catgctgcggatggtgatcg-3′(SEQ ID NO.3)；
扩增片段大小518bp。
取筛选阳性细胞传代F12和猪视网膜原代细胞提取RNA，按全式金RT-PCR一步法试剂盒步骤进行检测。
U-反应条件为45℃30min；95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃50s，35个循环；72℃10min。1％的琼脂糖凝胶电泳，结果图10所示。结果显示F12代阳性细胞有阳性条带，原代细胞未出现阳性条带。
3)细胞生长曲线绘制
(1)悬液制备
取待测30代、50代生长状态良好的细胞，增至接近汇合时，用常规方法消化细胞制成细胞悬液，并计数。
(2)接种
按1×104个/孔细胞量向24孔培养板内分别接种细胞，于37℃、5％CO2培养箱中继续培养。
(3)计数检测
从接种时间算起，每隔24h计数3孔内的细胞密度，用血球计数板计算细胞总数，算出平均值，取3孔的平均值，如此至第8组结束。
(4)绘图
以培养时间(d)为横坐标、细胞密度为纵坐标，将结果在坐标纸上绘图，即得培养细胞的生长曲线。
通过对所培养的猪视网膜上皮细胞用常规方法制备细胞悬液，计数，接种24孔培养板，每孔1mL细胞悬液，对接种于24孔培养板的细胞进行连续7d定时记数，记录各次细胞密度，绘制而成培养细胞生长曲线，接种后第2d细胞数开始增加，第3d进入对数生长期，第6d细胞生长缓慢，细胞生长期总体趋势均呈S型，细胞接种后均有24h的潜伏期，此期为细胞的适应阶段，是细胞由于接种时胰酶消化而致的损伤后的修复时期，此后细胞呈指数增殖，即指数生长期，最后进入停滞期，细胞生长缓慢，几乎停止，可见有细胞漂浮。而细胞分裂指数MI最高值(培养第2d)在进入对数生长期前出现，并在培养第2～4d时维持于一个较高的水平，随后下降到初始水平。本发明方法培养的猪视网膜上皮细胞系的纯度为99.9％；与现有技术培养细胞平均纯度91％相比有显著提高；细胞群体倍增时间(PDT)为36h与现有技术胶原酶消化法和胰酶消化法获得的PDT-42h和48h相比具有显著的提高，证明细胞纯度高、生命力旺盛。
4)细胞活率测定
检测冻存细胞的存活率可采用台盼蓝拒染试验，将待检细胞复苏后制成细胞悬液，取10μL细胞悬液加入10μL 1％台盼蓝染液，混匀。血球计数板计数，健康活细胞胞体完整，细胞透明，不着色，凡着色呈蓝色者为死细胞。计数1000个细胞，计算细胞存活率。统计二种细胞总数，以活细胞占细胞总数的百分比反映细胞活力。
结论：细胞冻存前后对猪视网膜上皮细胞进行细胞活率测定。结果表明：冻存前细胞活率在96.0～98.7％之间，冻存后细胞活率为93.6％～96.2％，且复苏的细胞与冻存前相比，细胞形态发生变化，但生长速度没有发生变化，冻存细胞质量稳定。
5)核型的制备
(1)加秋水仙素：取对数生长期的细胞培养物，加秋水仙素到培养基内，终浓度为0.1～0.4g/mL。
(2)在37℃培养箱中继续培养1～4h，使大部分细胞处于分裂中期。
(3)采集分裂相细胞：加0.25％胰蛋白酶溶液用常规方法消化，然后加培养基，终止胰蛋白酶对细胞的作用。转入15mL离心管，以1000rpm离心8min，收集细胞。
(4)低渗：将沉淀细胞用预热至37℃，0.075M KCl溶液2mL，重悬，吹打均匀后，继续加KC1溶液至l0mL，放入37℃温箱中温育15min。
(5)预固定：悬液中加入新鲜固定液(醋酸:甲醇＝1:3)1mL，轻轻打匀。
(6)固定：将悬液以1000rpm离心8min，去掉上清夜，加入新鲜固定液8mL，打匀，室温静置20min。
(7)重固定：重复2次，离心后去掉部分上清夜，剩余1～1.5mL，混匀。
(8)滴片：滴2～3滴细胞悬液于45°倾斜载玻片，使细胞分散均匀，室温下干燥。
(9)染色：用磷酸盐缓冲液(pH6.8)稀释10倍的Giemsa液染色l0min，自来水冲洗，空气干燥。
(10)倒置显微镜下观察得到的染色体配对后观察，结果如图5所示。结果显示，建立的猪视网膜上皮细胞系有染色体19对。
6)病毒含量测定结果
将收获的在PR细胞增殖三代的病毒液，按照《中国兽药典》2020年版三部方法测定病毒含量(TCID50)，按照Reed-Muench法计算TCID50。结果分别为：10-7.75/0.1ml。
图6为猪视网膜上皮细胞系上皮细胞特异性表型标记物CK18 IFA鉴定结果；图7为猪视网膜上皮细胞系上皮细胞特异性表型标记物CK19 IFA鉴定结果。
实施例4、猪圆环病毒2型在猪视网膜上皮细胞系上的增殖及鉴定
将培养48小时的PK-15细胞、PR细胞按常规方法进行细胞传代，放置37℃培养箱静置4小时后，将PCV2毒液分别按5％比例接种到细胞瓶中，同时做未接毒的细胞对照，放置于37℃培养箱继续培养24小时，弃去细胞培养液换含400mM D-氨基葡萄糖盐酸盐的细胞维持液，继续培养，每天观察。如果产生细胞病变，将在85％细胞发生细胞病变时收获；如果不产生细胞病变在48小时后收获冻融。
将在两种细胞上培养的毒液分别用DMEM维持液作10倍系列稀释，取10-3、10-4、10-5、10-6、4个稀释度，分别接种含PK-15细胞单层的96孔培养板6孔，100μl/孔，同时设立阴性对照。置37℃含5％CO2培养箱中吸附1小时，换用含400mM的D-氨基葡萄糖盐酸盐的维持液，继续培养48小时。弃去维持液，用PBS(0.01mol/L，PH值7.4)洗涤3次。
用冷丙酮，(80％丙酮，20％双蒸水)固定细胞，100μl/孔，在4℃放置30分钟；弃丙酮，在室温下干燥，用PBS洗涤3次；加入1：300倍稀释的PCV2单克隆抗体，50μl/孔，置37℃下1小时；移去孔内液体，用PBS洗涤3次；加入1：100稀释的FITC标记羊抗鼠IgG，50μl/孔，37℃1小时，移去孔内液体，用PBS洗涤3次。
将上述细胞板置于荧光显微镜下观察，细胞对照孔应无荧光物质着染，而被PCV2感染的阳性细胞孔应有绿色荧光可见。统计每个稀释度病毒接种细胞孔中PCV2阳性孔数，按Reed-Muench法计算TCID50。
将收获的在PR细胞和PK-15细胞增殖三代的PCV2病毒液，将上述细胞板置于荧光显微镜下观察，细胞对照孔应无荧光物质着染，而被PCV2感染的阳性细胞孔应有绿色荧光可见，结果如图8所示。结果显示PCV2接种PR细胞，培养24小时时细胞无细胞病变，32小时时出现轻微的细胞病变，48小时时已有85％的细胞发生细胞病变，主要表现为细胞皱缩、拉网，最后脱落。接种PCV2的PK-15细胞(这里要用PK15)培养至72小时无细胞病变出现。对照细胞均正常。
用IFA法测定病毒含量。病毒含量分别为106.125TCID50/ml、106.0TCID50/ml。
实施例5、猪伪狂犬病毒在猪视网膜上皮细胞系上的增殖及鉴定
将培养48小时的BHK-21细胞、PR细胞按常规方法进行细胞传代。待细胞长满单层后，弃掉细胞培养液，用PBS轻洗细胞面一次。将PRV-K61毒液分别按2％比例接种到细胞瓶中，同时做未接毒的细胞对照。放置37℃培养箱吸附1小时，之后补加DMEM细胞维持液，放置于37℃培养箱继续培养，每天观察细胞病变，结果如图9所示。待85％细胞出现细胞病变(CPE)时，收获病毒液冻融2次，按此方法连续传3代后，按照《中国兽药典》2020年版三部方法测定病毒含量(TCID50)，按照Reed-Muench法计算TCID50。
结果显示，病毒在两种细胞上均能产生明显的细胞病变，接毒后16小时，倒置显微镜下观察接毒的PR细胞可见70％的细胞已产生细胞病变，24小时时细胞已全部发生病变。主要表现为细胞变圆、聚堆拉网，最后脱落。未接毒的对照细胞正常。
病毒在两种细胞上均能产生明显的细胞病变，接毒后16小时，倒置显微镜下观察接毒的PR细胞可见70％的细胞已产生细胞病变，24小时时细胞已全部发生病变。主要表现为细胞变圆、聚堆拉网，最后脱落。未接毒的对照细胞正常。
BHK-21细胞接毒后16小时，有约75％的细胞产生细胞病变，24小时时细胞已全部发生病变。主要表现为细胞变圆膨大空泡化、融合、最后脱落。未接毒的对照细胞正常。
将收获的在PR细胞和BHK-21细胞增殖三代的病毒液，按照《中国兽药典》2020年版三部方法测定病毒含量(TCID50)，按照Reed-Muench法计算TCID50。结果分别为：10-7.75/0.1ml、10-7.875/0.1ml。
序列表
<110> 山东省滨州畜牧兽医研究院
<120> 猪视网膜上皮细胞系及其建立方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2722
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggcgaaca gacttcacct ggactgggac ggaaaccccg aggtggtgcc ggtgctggaa 60
tgggacccgg tggatctgcg cgacccctct ccgggggatg agggcttctg tgagccgtgc 120
tgggagagtc tggtcgatgg actgccggac gagtggctgg acagtgtgga cgaggtggag 180
gtgattgtga ctgagggggg tgagtcagag gacagtggtg ggagtgccgc tggtgactca 240
ggtggctctc agggggtctt tgagatggac cccccagaag agggggacag taatgaggag 300
gatatcagcg cggtggctgc ggaggtgctg tctgaactgg ctgatgtggt gtttgaggac 360
ccacttgcgc caccctctcc gtttgtgttg gactgccccg aggtacctgg tgtgaactgc 420
cgctcttgtg attaccatcg ctttcactcc aaggacccca atctgaagtg cagtctgtgc 480
tacatgaggg atgcatgcct ttgctgtcta tggtgagtgt ttttggacat ttgtgggatt 540
atgtggaaaa aaaggaaaaa gtgcttgtaa gaaatctcat gtgctatttc ccattttttg 600
tctttttaga agctgtttct ccagcacctc acaggtcggg ttccccggga cttggagacc 660
tgccaggacg caagaggaag tactgctatg actcatgcag cgaacaacct ttggacctgt 720
ctatgaagcg cccccgcgat taatcattaa cctcaataaa cagcatgtga tgatgactga 780
ttgtctgtgt ctctgcctat atataccctt gtggtttgca gggaagggat gtggtgactg 840
agctattcct cagcatcatc atcgctctgc ttttttctac tgcaggctat ttcttgctag 900
ctcgctgtcc cttttctttt tctgtgggca tggactatca acttctggcc aagcttacta 960
acgtgaacta ccttaggaag gtgatagtac aggggtctca gaactgccct tggtggaaaa 1020
agattttttc ggacaggttt atcaaggtag tagcagaggc caggaggcag tacgggcaag 1080
agttgattga gatttttgtg gagggtgaga ggggctttgg tcctgagttc ctgcgggaag 1140
ggggactgta cgaagaggcc gttctgaaag agttggattt cagcaccttg ggacgcaccg 1200
tagctagtgt ggctctggtc tgcttcattt ttgagaagct tcagaagcac agcgggtgga 1260
ctgacgaggg tattttaagt cttctggtgc cgccactatg ttccctgctg gaggcgcgaa 1320
tgatggcgga gcaggtgcgg caggggctgt gcatcatcag gatgccgagc gcggagcggg 1380
agatgctgtt gcccagtggg tcatccggca gtggcagcgg ggccgggatg cgggaccagg 1440
tggtgcccaa gcgcccgcgg gagcaggaag aggaggagga ggacgaggat gggatggaag 1500
cgagcgggcg caggctcgaa gggccggatc tggtttagat cgccgccggc ccgggggagc 1560
gggtggagag gggagcgggg aggaggcggg ggggtcttcc atggttagct atcagcaggt 1620
gctttctgag tatctggaga gtcctctgga gatgcatgag cgctacagct ttgagcagat 1680
taggccctat atgcttcagc cgggggatga tctgggggag atgatagccc agcacgccaa 1740
ggtggagttg cagccgggca cggtgtacga gctgaggcgc ccgatcacca tccgcagcat 1800
gtgttacatc atcgggaacg gggccaagat caagattcgg gggaattaca cggagtacat 1860
caacatagag ccgcgtaacc acatgtgttc cattgcgggc atgtggtcgg tgactatcac 1920
ggatgtggtt tttgatcggg agctaccggc ccggggtggt ctgattttag ccaacacgca 1980
cttcatcctg cacggctgca acttcctggg ctttctgggc tcggtaataa cggcgaacgc 2040
cgggggggtg gtgcggggat gctacttttt cgcctgctac aaggcgcttg accaccgggg 2100
gcggctgtgg ctgacggtga acgagaacac gtttgaaaag tgtgtgtacg cggtggtctc 2160
tgcggggcgt tgcaggatca agtacaactc ctccctgtcc accttctgct tcttgcacat 2220
gagctatacg ggcaagatag tggggaacag catcatgagc ccttacacgt tcagcgacga 2280
cccctacgtg gacctggtgt gctgccagag cgggatggtg atgcccctga gcacggtgca 2340
catcgctccc tcgtctcgcc tgccctaccc tgagttccgc aagaatgtgc tcctccgcag 2400
caccatgttt gtgggcggcc gcctgggcag cttcagcccc agccgctgct cctacagcta 2460
cagctccctg gtggtggacg agcagtccta ccggggtctg agtgtgacct gctgcttcga 2520
tcagacctgt gagatgtaca agctgctgca gtgtacggag gcggacgaga tggagacgga 2580
tacctctcag cagtacgcct gcctgtgcgg ggacaatcac ccctggccgc aggtgcggca 2640
gatgaaagtg acagacgcgc tgcgggcccc ccggtccctg gtgagctgca actgggggga 2700
gttcagcgat gacgatgact ga 2722
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctggtgccgc cactatgttc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
catgctgcgg atggtgatcg 20

Claims (2)

1.猪视网膜上皮细胞系，其特征在于：所述猪视网膜上皮细胞系保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C2020112，保藏日为2020年6月18日。
2.权利要求1所述的猪视网膜上皮细胞系的应用，其特征在于：所述应用是在生产猪圆环疫苗、猪流性腹泻疫苗、猪伪狂犬疫苗中的应用。
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Assignor: SHANDONG BINZHOU ANIMAL SCIENCE & VETERINARY MEDICINE ACADEMY

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Denomination of invention: Pig retinal epithelial cell line and its establishment method and application

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License type: Common License

Record date: 20240912