CN108277199A - 广谱低致瘤性mdck细胞系及其应用 - Google Patents

广谱低致瘤性mdck细胞系及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及广谱低致瘤性MDCK细胞系及其应用，所述的细胞株为MDCK‑15D3和MDCK‑6A8，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为CCTCC NO:C2017155和CCTCC NO:C2017154，地址，湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，邮编430072，电话027‑68752319。本发明还涉及所述的细胞株的培养方法，以及所述的MDCK‑15D3、MDCK‑6A8细胞株在制备预防或治疗流感的产品中的应用。

Description

广谱低致瘤性MDCK细胞系及其应用
技术领域
本发明属于医药生物领域，具体而言，涉及广谱低致瘤性MDCK细胞系及其应用。
背景技术
事实证明，不管是季节性流感，还是大流行流感肆虐人类的时候，接种流感病毒疫苗相对于使用抗流感的化学药物是更经济有效的防控手段，因此，流感病毒疫苗的研制有着非常重大和现实的意义。目前大部分流感疫苗的生产是基于鸡胚来进行的，该套生产方法已经有 60多年的历史，工艺已经相当成熟，虽然部分工序可以实现自动化，但生产周期还是很长，不利于质量控制和保证，且鸡胚培养的流感病毒经过连续传代后常常会发生基因序列变异，使所制备的流感疫苗与人群中流行的流感毒株不能完全匹配。另外，在禽流感高发期，可能会因为鸡的大量感染死亡而缺乏制备疫苗的原料，此时如果仍使用鸡胚生产流感疫苗，则存在着极大的安全隐患。因此，WHO建议用哺乳动物细胞培养流感病毒来替代鸡胚制备流感疫苗，这样不仅可使其抗原性更接近自然流行株，同时还可减少宿主蛋白成分，降低鸡胚残留物引起的过敏反应。
MDCK(Madin-Darby canine kidney)细胞为连续传代细胞，是Madin和Darby在1958年从一只健康成年母狗(cocker spaniel，可卡犬，一种英国的小猎犬)的肾组织得到的，由于该细胞对流感病毒比较敏感，目前广泛应用于流感病毒的增殖和感染性滴度检测，而且经常用于流感病毒的分离培养。
1997年，荷兰Solvay公司以A/Taiwan/1/86(H1N1)为毒种，基于无血清培养的MDCK细胞为基质的亚单位疫苗在I期临床中获得良好的效果，与其公司已经商品化的基于鸡胚的流感疫苗具有相同效果(Palache,A M等，J Infect Dis.1997,176:20-23.)。2002年，加拿大BioChem Pharma公司基于MDCK细胞的流感疫苗在健康成人、老年人和儿童的I期和 II临床实验中都表现出良好的安全性和免疫原性，大约有83％～100％的受试人群在接种疫苗后血凝抑制滴度可超过40，对三价季节性流感的三种病毒的抗体反应也与传统鸡胚来源的流感疫苗相似(Scott A等，Vaccine,1998,16(13):1331-1335.和2002,20(7-8):1240-1247.)。目前，瑞士Novartis公司以MDCK细胞为基质的流感疫苗在I期和II临床实验中同样表现出良好的效果，在受试人群中表现出与基于鸡胚的流感疫苗相似的耐受性和免疫原性，完全达到了欧洲人用药品委员会(EU Committee for Medicinal Products for HumanUse)会制定的关于流感疫苗的相关标准(N.Grotha等，Vaccine,2009,27(5):786-791)。
虽然MDCK细胞对大部分流感病毒比较敏感，非常适合规模化生产用，制备的疫苗在人体内也能产生较好的免疫原性和抗体保护水平，但目前尚未得到WHO或我国相关部门的批准可用于人用流感疫苗的生产，其最重要和最直接的原因就是其潜在的致瘤性、致畸性、外源因子污染等安全性问题还有待解决。另外MDCK细胞表面存在的流感病毒受体的类型和数量是不同的，因此对流感病毒的增值能力也是不尽相同得，不同单克隆株之间增值能力相差可达到 20倍。
常规细胞培养所使用的培养基的制备方法是在基础培养基中添加相应量的血清或组织提取物，其中最常用于细胞培养基的血清是一种成分很不明确的混合物。血清对细胞在体外培养时的主要作用是提供生长因子、激素、结合蛋白，并提供保护作用。但使用血清也有以下几个不可避免的缺点：首先，血清非常昂贵，血清的费用占到培养基费用的50％，致使生产成本大幅度提高；其次，血清中含有某些不利于细胞生长的毒性物质或抑制物质，对某些细胞的体外培养有去分化作用；第三，血清中含大量成分复杂的蛋白质对下游培养产物的分离纯化带来很大的困难；第四，血清易被支原体和朊病毒等外源因子污染，这对大规模生产极为不利；第五，就是批次与批次之间血清质量的差异，会影响细胞生长，最终会影响产品质量。因此，细胞工程中无血清培养技术的应用，在很大程度上可以避免含血清培养所带来的诸多不利因素，这也是未来疫苗生产发展的必然趋势。
发明内容
本发明首先涉及一种广谱低致瘤性MDCK细胞系，所述的细胞系为MDCK-15D3、MDCK-6A8，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2017155和CCTCC NO:C2017154，地址，湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，邮编430072，电话027-68752319。
本发明还涉及所述的MDCK-15D3、MDCK-6A8细胞株在制备流感病毒疫苗中的应用，所述的流感病毒优选为H1N1、H3N2、B、H5N1，所述的疫苗包括减毒活疫苗或灭活疫苗，优选为灭活疫苗，最优选的，所述的流感病毒细胞株为季节性流感病毒为H1N1(NIB-74XP)、H3N2(NIB-79)和B(BX-51B)，大流行流感病毒为禽流感H5N1(NIBRG-14)。
本发明还涉及所述的MDCK-15D3、MDCK-6A8细胞株的培养方法，所述的培养基为无血清 VP-SFM培养基，培养参数为37℃，5％CO2；接种密度为细胞密度1.5×104(cell/cm2)。
本发明还涉及所述的MDCK-15D3、MDCK-6A8细胞株生产的流感疫苗在制备预防或治疗流感的产品中的应用。
本发明还涉及所述的MDCK-15D3、MDCK-6A8细胞株在制备预防或治疗流感的产品中的应用。
附图说明
图1、典型细胞亚克隆形态(×250)(A、B、C、D 60min；a、b、c、d 48h)：图1A&1a: 细胞呈块状，细胞长成单层后，细胞饱满界限清晰；图1B&1b:细胞以铺路石样形态汇合呈单层，细胞饱满界限清晰，继续培养细胞会分裂变小，但细胞界限仍旧清晰；图1C&c:细胞则在汇合后连接成片，继续培养，细胞界限开始模糊；图1D&d:细胞呈长棒状、放射样生长。
图2、软琼脂克隆形成检测
图3、备选单克隆细胞株的支原体检测
图4、备选单克隆细胞株外源因子检定
图5、15D3和6A8单克隆细胞核型分析：图5A:15D3P72,图5B:15D3P92,图5C:6A8P71,图5D:6A8P91
图6、MDCK-6A8细胞在含血清和不含血清培养基中生长曲线
图7、MDCK-15D3细胞在含血清和不含血清培养基中生长曲线
图8、H1N1在15D3细胞上种毒后收获液的血凝滴度
图9、H3N2在MDCK-15D3细胞上种毒后收获液的血凝滴度
图10、B型流感病毒在MDCK-15D3细胞上种毒后收获液的血凝滴度
图11、H5N1在MDCK-15D3细胞上种毒后收获液的血凝滴度
图12、H1N1流感病毒在MDCK-6A8细胞上种毒后收获液的血凝滴度
图13、H3N2在MDCK-6A8细胞上种毒后收获液的血凝滴度
图14、B型流感病毒在MDCK-6A8细胞上种毒后收获液的血凝滴度
图15、H5N1在MDCK-6A8细胞上种毒后收获液的血凝滴度
具体实施方式
细胞、病毒株及培养材料
1、细胞：MDCK CCL-34细胞(P55)购自ATCC。
2、流感病毒：季节性流感病毒为H1N1(NIB-74XP)、H3N2(NIB-79)和B(BX-51B)，大流行流感病毒为禽流感H5N1(NIBRG-14)，均购自NIBSC。
3、培养基MEM、VP-SFM购买自Invitrogen公司，0.25％trypsin-EDTA、FBS、TPCK-trypsin 等购自Gibco公司。
实施例1、MDCK细胞亚克隆培养
1、复苏一支前工作细胞库中的MDCK细胞到细胞瓶中，生长液为MEM+5％FBS。
2、待细胞铺满接近单层时用0.25％trypsin-EDTA将MDCK消化成单个细胞。
3、对消化下来MDCK细胞进行计数。
4、根据计数，以平均每孔0.5～0.7个细胞铺到96孔板中，生长液为MEM+20％FBS。
5、将铺完细胞的96孔板置于37℃、5％CO2孵箱中培养。
6、细胞培养8～10天后，在倒置显微镜下逐孔观察，对形态均一、生长良好的细胞团块进行标记，待细胞铺满孔底面积约50％时传代。
本实施例中克隆试验共接种21块96孔培养板，接种的细胞数目约为1080个，平均每孔约0.5个细胞，最终得到单克隆细胞株数目为175个，计算细胞克隆形成率为16％。
本实施例中筛选出的细胞克隆贴壁伸展后，就出现显著形态差异，分别表现为块状、铺路石状、纺锤体状和梭形细胞，如图1所示。当细胞培养到后期，则差异更明显(如图1所示)：A细胞呈块状，细胞长成单层后，细胞饱满界限清晰；B则以铺路石样形态汇合呈单层，细胞饱满界限清晰，继续培养细胞会分裂变小，但细胞界限仍旧清晰；C细胞则在汇合后连接成片，继续培养，细胞界限开始模糊；D细胞呈长棒状、放射样生长。
本实施例中不同形态单克隆细胞数目占原始MDCK细胞群的比例各不相同，因而筛选出来的不同形态的单克隆细胞数目也会有所不同。如表1，筛选得到四种细胞形态数目占总体单克隆细胞比例大体上接近。
表1各种形态单克隆细胞的数目
实施例2 MDCK亚克隆细胞流感病毒敏感性筛选
当MDCK细胞克隆传代至24孔板内长成致密单层厚后，以1:5传5孔，其中1孔继续传代，剩下4孔作为敏感性检测。
当24孔板内细胞汇合度约70～90％时，弃去培养液后加1mLPBS润洗。
以MOI＝0.001在4孔MDCK细胞克隆上分别接种4型流感病毒(H1N1(NIB-74XP)、H3N2(NIB-79)、B(BX-51B)和H5N1(NIBRG-14))，病毒维持液为100μl的VP-SFM，其中含有2μg/mL的TPCK-trypsin。
接种病毒后置于33℃，5％CO2孵箱中吸附1h。
补加含2μg/mL TPCK-trypsin的病毒维持液至1mL，置于33℃，5％CO2孵箱中培养。
每天观察细胞病变情况，当细胞病变(+++)以上或96h时取样，做血凝滴度检测，对血凝滴度较高细胞克隆进行冻存。
本实施例中接种4型病毒后血凝滴度都不小于1:256或针对某型病毒血凝滴度远大于 1:256的细胞克隆株数目为25株。名称分别命名为MDCK-15D3、MDCK-6A8、MDCK-10C1、MDCK-3F2、 MDCK-1F4、MDCK-6H9、MDCK-4A5、MDCK-9D11、MDCK-8D7、MDCK-9D9、MDCK-19B9、MDCK-10C2、 MDCK-4E9、MDCK-19G8、MDCK-10B2、MDCK-7A12、MDCK-15C9、MDCK-20H7、MDCK-6H12、MDCK-9F5、 MDCK-10H1、MDCK-1G5、MDCK-4A2、MDCK-15H8、MDCK-13B7。
实施例3备选MDCK克隆株表面受体丰度比较
1、将25株克隆细胞正常传代至T-75(细胞量约1×107cells)，待细胞汇合至90％左右时消化，制备单细胞悬液备用。
2、将细胞转入15mL离心管，4℃、1000rpm，离心5min。
3、弃上清，加10mLPBS缓冲液轻轻吹打混匀，4℃、1000rpm、离心5min，弃上清。重复洗两遍之后换BufferI洗一遍。
4、以TBS10倍稀释Blocking reagent(Roch，地高辛糖苷键分型试剂盒)后，加2mL到离心管中，用移液枪轻轻吹打混悬细胞后，置37℃水浴中封闭1小时。
5、按相同方法洗涤，PBS缓冲液洗两遍、加5mL BufferI(Roch，地高辛糖苷键分型试剂盒)于离心管后，重悬混匀细胞，平均分成三份，分别加入到3个1.5mL EP管中，再洗一遍。
6、稀释一抗：向1000μL BufferI中分别加入15μLSNA、MAA。尽可能吸去残留上清后，以100μL一抗重悬细胞，并置37℃水浴中孵育1小时。
7、按相同方法洗涤，PBS缓冲液洗两遍、Buffer I再洗一遍。
8、稀释二抗：1000μL Buffer I中加入100μL anti-DIG-FITC(Jackson，mouse,Anti-DIG-FITC)；尽可能吸去残留上清后，以70μL二抗重悬细胞，并置冰上孵育1小时。
9、按相同方法洗涤，PBS缓冲液洗三遍后用流式细胞仪检测，FL1通道记录荧光强度。
大流行流感病毒主要以细胞表面N-acetylneuraminic acid a2,3Gal(NeuAc a2,3Gal) 作为受体，季节性流感主要以细胞表面NeuAc a2,6Gal作为受体。因此MDCK细胞是否对各型流感病毒敏感，具体表现为细胞表面NeuAc a2,3Gal受体和NeuAc a2,6Gal受体丰度是否够高。
本实施例中对初步筛选的25株MDCK细胞克隆株进行两种表面受体丰度检测，主要检测结果见表2。对表2结果进行t检验，发现MDCK-15D3和MDCK-6A8这两株细胞都是P<0.05，说明MDCK-15D3和MDCK-6A8这两株细胞相比于其他单克隆株及MDCK原始细胞都具有显著性差异。因此，在所有单克隆细胞株中，MDCK-15D3和MDCK-6A8这两株细胞表面受体丰度最高。然后通过优化病毒接种MOI，对筛选的25株细胞克隆进行病毒敏感性复筛，检测结果如表3所示，结果表明受体丰度表现最好MDCK-15D3、MDCK-6A8两株细胞表现优异，血凝滴度最高可达1:1024。
表2细胞株流式检测结果(Mean值)
表3针对四型流感病毒的MDCK单克隆细胞株的血凝复筛
实施例4MDCK亚克隆细胞软琼脂克隆形成试验
1、当上述两株MDCK亚克隆细胞处于对数生长期时，用0.25％trypsin-EDTA消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20％FBS的MEM培养液调整细胞密度至1000cell/mL。
2、用注射用水分别制备出1.2％和0.6％两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，置于 40℃水浴锅中，使之保持液态。
3、按1:1比例将1.2％的琼脂糖和2×MEM培养基(含有20％的小牛血清)混合后，取2mL 混合液注入6孔板中，冷却凝固，作底层琼脂置CO2孵箱中备用。
4、按1:1比例将0.9mL 0.6％的琼脂糖和0.9mL 2×MEM培养基在无菌离心管中相混以后，再向管中加入0.2mL的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2％琼脂糖底层平皿中，形成双琼脂层。每个样品做重复三次，阳性对照以Hela细胞、阴性对照以MRC-5细胞同法操作。
5、待上层琼脂凝固后，置37℃5％CO2培养箱中培养。
培养10～14天后将平皿放置在倒置显微镜下，观察并统计细胞克隆形成情况。
本实施例中软琼脂克隆形成试验要求，当试验中阳性对照细胞有大量细胞克隆团块形成，阴性对照细胞无超过50个细胞的细胞团块形成，则试验成立。上述实施例3结果见图2。阳性对照的Hela细胞(P10)组出现明显细胞团块生长，阴性对照组的MRC-5细胞组(P31)未出现细胞团块生长。实施例3中所测定的细胞株MDCK-15D3、MDCK-6A8均未出现明显的细胞团块，因此具有低致瘤性的特性。
实施例5 MDCK亚克隆细胞库无菌检定
待细胞生长2两天后，取细胞上清分别接种于硫乙醇酸盐培养基、马丁培养基、营养琼脂培养基依据无菌检查法：直接接种法进行。检测结果见表4：
表4、单克隆细胞库的无菌检测
本实施例中对2株MDCK亚克隆进行无菌检查，检查结果无细菌类污染。
实施例6 MDCK亚克隆细胞支原体检定
1、待测细胞以低密度传代至T-25细胞瓶中，添加12mLMEM细胞生长液，置二氧化碳培养箱，37℃5％CO2培养，在细胞汇合成片后继续培养三天以上，作为待检细胞。
2、弃细胞废液，加5mL pH7.4PBS清洗细胞一遍，去除脱落细胞。
3、以冰乙酸：甲醇(1:3)配制细胞固定液，向培养瓶内加5mL新配制的固定液室温固定细胞5min，弃固定液，再加5mL固定液固定10min。弃固定液后，置于通风处15min，便于固定液挥发干燥。
4、以pH 7.4PBS将Hoechst 33258染色液原液稀释100倍，加5mL到细胞瓶，避光染色30min。
5、吸管吸出染液，用注射用水清洗两次，每次10mL，弃洗液后，于通风处干燥10min。
6、量取0.1mol/L柠檬酸22.2mL、0.2mol/L Na2HPO4 27.8mL，甘油50.0mL，三者混匀用0.1M氢氧化钠溶液调pH至5.5，即为封片液。向培养瓶内滴加封片液1mL，轻轻摇动培养瓶，使封片液均匀铺满整个细胞面。
7、结果判定：荧光显微镜，蓝紫激发光下观察，细胞核程黄绿色荧光。显微视野下，可见大小一致、边界规则、背景清晰的黄绿色荧光可判为阴性，若细胞核周围有云雾状、大小不等、形态不规则着色颗粒则可判为阳性。
将本发明所述MDCK亚克隆细胞系低密度传代三瓶以上T-25细胞，培养五天以上以后采用本实施例所述方法进行支原体检测，可见细胞核清晰，大小均一，无云雾状或大小不等荧光点围绕。如图3所示。结果判定为支原体阴性。
实施例7 MDCK细胞外源因子检定
1、待测细胞消化后，接种T-175培养瓶3瓶，T-75培养瓶6瓶，置37℃5％CO2培养箱培养，在细胞长成单层后换2％FBS的MEM培养液维持培养，每4天换液维持培养14天。
2、每日镜检细胞，观察细胞是否保持正常形态特征，是否出现细胞病变。
3、维持培养14天后，取2瓶T-75弃废液，加入0.2％～0.5％豚鼠红细胞和鸡红细胞混合悬液5mL进行血吸附试验。新鲜红细胞在生理盐水中，2～8℃保存不得超过7天。
4、加入红细胞后置2～8℃30分钟，然后置20～25℃30分钟，分别进行镜检，观察红细胞吸附情况。
5、结果判定：细胞镜检保持正常形态，无细胞病变；血吸附试验镜检无红细胞吸附情况则判为阴性。
根据本实施例中方法对本发明所述MDCK亚克隆细胞系进行检测，检测结果如图4所示。阳性对照出现红细胞聚集成团吸附在细胞上，而检测细胞均一平铺未见聚集及吸附，判定为阴性。
实施例8 MDCK亚克隆细胞核型分析
1、待检细胞传代于T-175细胞培养瓶中，当细胞汇合度约70％～80％，处于对数生长期时进行试验。
2、向培养瓶中加秋水仙素，使其最终浓度为0.05μg/mL营养液，二氧化碳培养箱继续培养6h，镜下观察可见20％以上细胞变圆处于分裂期时停止培养。
3、弃培养基，加无菌PBS洗两遍，加3mL胰酶置37℃消化1min，轻轻拍打培养瓶，使对数期细胞脱落。
4、收集细胞悬液，1000转/分钟离心5～10分钟，收集细胞。
5、低渗处理：吸除上清液、加入预温至37℃的0.075M KCl溶液9mL，水浴静置20～30 分钟。
6、预固定：向悬液中加新鲜1：3醋酸、甲醇固定液1mL，用吸管吹打调匀，此措施能起到先使细胞表面轻微固定，可防止固定后细胞粘连成块。
7、固定：离心后操作同4，吸除上清液后加新鲜固定剂10mL；加固定剂时要，把固定剂逐滴滴在离心管壁上使之慢慢流入离心管中，轻轻吹打均匀后置15分钟。
8、重复上一步骤，末次离心后小心吸除大部分上清，据悬液中细胞密度大小，余下固定液0.5～1mL，置4℃冰箱过夜。
9、制片：用滴片法制片，按如下步骤：彻底洗净载物片，勿留任何油脂，置-20℃冰箱中储备备用。滴片前现从冰箱中取出冷载物片1片，在载物片表面出现细微水气时，立即向片的一侧滴2～3滴细胞悬液，滴片时的距离能保持半米高度才好。滴片后置室温中令其自然干燥。如此制备好的标本可置盒中备用或立即进行染色观察。
10、染色和封片：一般常用Giemsa染色：取干液Giemsa 1份加pH6.8磷酸缓冲液9份混合，染色10分钟后，水洗、晾干，直接油镜观察。
采用本实施例中的方法取正常传代培养的MDCK-15D3(P72、P92)和MDCK-6A8(P71、P91)单克隆细胞，秋水仙素处理、收集分裂期细胞制片后，常规Giemsa染色。用油镜观察，随机选取染色体清晰、分布相对集中、分散较好的中期细胞进行计数，每张片子各取约50 个细胞，发现染色体分布在74-83之间，众数为78条，属于正常二倍体。检测结果如图5所示,将两株单克隆细胞株(MDCK-15D3和MDCK-6A8)培养20代后，与起始代次单孔细胞染色体数目相比，终末代次单克隆细胞的染色体条数并未发生巨大变化。
实施例9 MDCK亚克隆株无血清驯化培养
1、MDCK亚克隆细胞如果直接从有血清培养基转换到无血清培养基中培养时，细胞出现大量死亡现象，
2、采用最开始在VP-SFM中加入10％FBS，然后按5％、1％来逐步降低FBS，直至完全不加 FBS来适应性培养。
3、经过6次传代，无血清适应后的MDCK亚克隆细胞跟有血清培养的MDCK亚克隆细胞相比在最大细胞密度上都可达到约1.5～2.0×105cell/cm2。
本实施例中对两株MDCK亚克隆株均成功进行了无血清驯化培养，细胞状态良好。
实施例10 MDCK亚克隆细胞在有血清和无血清培养基中生长曲线对比
1、常规传代细胞，每瓶加入细胞生长液10mL，共计30瓶。
2、取生长状态良好接近汇合的细胞，按细胞传代过程制备成细胞悬液后计数。
3、计数的同时4℃，100g离心去除胰酶，然后根据计数结果用一定量的细胞生长液重悬细胞，使加入10mL细胞悬液到培养瓶中时密度为1.5×104cells/cm2。最后置于37℃，5％ CO2孵箱中培养。
4、24h后随机取3瓶细胞胰酶消化后计数，取其平均值作为本次计数结果。以后每隔 24h重复此操作，连续监测，直至细胞活力下降到60％以下。
5、根据得到的计数结果，绘制生长曲线。同时计算细胞倍增时间，计算公式如下：DT＝Δt×[lg2/(lgNt-lgN0)]。其中，DT为细胞倍增时间，t为细胞接种24h后到达平台期的培养时间，Nt为达到平台期时细胞数，N0为接种24h后细胞数.
根据本实施例中方法对本发明中的MDCK亚克隆细胞进行了生长曲线测定。进行生长液为含5％FBS的DMEM和无血清培养基VP-SFM对比。连续监测了10天，计算结果如下表5及表6。生长曲线对比图见图6及图7。根据图6及图7的曲线，可以看出本发明中的MDCK亚克隆细胞能进行无血清维持培养而且无血清培养时在细胞倍增时间和最大生长密度上与有血清培养相近。因此本发明中的MDCK亚克隆细胞系完全可以用无血清培养。
表5各时间点MDCK-6A8细胞计数
表6各时间点MDCK-15D3细胞计数
实施例11各型流感病毒在MDCK克隆株上的培养应用
1、将在无血清培养基VP-SFM中已长成致密单层的MDCK克隆株分别按MOI＝0.1、0.01、 0.001、0.0001、0.00001接种四个类型的流感病毒，并设置阴性对照。所用的病毒维持液为含有2μg/mL TPCK-trypsin+VP-SFM。
2、病毒培养8h后，开始收获各MOI值下细胞培养上清和阴性对照细胞上清，然后4℃， 500×g离心15min，收取上清-70℃保存。每隔8h连续取样，直至细胞全部脱落为止。
3、红细胞凝集实验检测收取样品的血凝滴度，绘制4型病毒在各MOI值下生长曲线。
本实施例中在筛选出的2株MDCK亚克隆株上接种不同MOI值的4型流感病毒，然后每 8h取样，检测病毒培养液的血凝滴度，4型流感病毒分别在MDCK-15D3及MDCK-6A8亚克隆上的检测结果如图8、9、10、11、12、13、14、15。
实施例12 MDCK亚克隆株稳定性考察
1、对MDCK-15D3和MDCK-6A8亚克隆株进行常规传代，观察传代过程中细胞形态。
2、分别用4型流感病毒按最适MOI对2株亚克隆株P70、P80、P90代进行感染。
3、按实施例11中的方法收取病毒液进行血凝滴度和病毒滴度检测。
本实施例中对2株MDCK亚克隆株进行正常传代细胞，每天观察细胞生长情况，未见细胞形态及生长状态发生显著变化。病毒液检测结果见表7及表8，结果显示用4型流感病毒株感染这两株单克隆细胞株，得到的收获液病毒滴度也保持稳定。
表7 MDCK-15D3单克隆株病毒滴度稳定性
表8 MDCK-6A8单克隆株病毒滴度稳定性
最后需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用做的本发明保护范围的限定。

Claims (5)

1.一种广谱低致瘤性MDCK细胞系，所述的细胞系为MDCK-15D3和MDCK-6A8，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2017155和CCTCC NO:C2017154，地址，湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，邮编430072，电话027-68752319。
2.权利要求1所述的MDCK-15D3、MDCK-6A8细胞株在制备流感病毒疫苗中的应用，所述的流感病毒优选为H1N1、H3N2、B、H5N1，最优选的，所述的流感病毒细胞株为季节性流感病毒为H1N1(NIB-74XP)、H3N2(NIB-79)和B(BX-51B)，大流行流感病毒为禽流感H5N1(NIBRG-14)。
3.权利要求1所述的MDCK-15D3、MDCK-6A8细胞株的培养方法，所述的培养方法为：
培养基为无血清VP-SFM培养基；
培养参数为37℃，5％CO2；
接种密度为细胞密度1.5×104(cell/cm2)。
4.权利要求1所述的MDCK-15D3、MDCK-6A8细胞株生产的流感疫苗在制备预防或治疗流感的产品中的应用。
5.权利要求1所述的MDCK-15D3、MDCK-6A8细胞株在制备预防或治疗流感的产品中的应用。
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