CN105641693A - 一种牛病毒性腹泻/黏膜病-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗的生产方法 - Google Patents

一种牛病毒性腹泻/黏膜病-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗的生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种牛病毒性腹泻-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗及其生产方法。本发明所述牛病毒性腹泻-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗是采用适应微载体悬浮培养细胞MDBK的方法繁殖BVDV？NMG株病毒和IBRV？LY株病毒，该方法能够很好的在微载体培养的细胞上培养病毒，该方法解决微载体培养细胞繁殖病毒过程出现的载体丢失、接毒不均匀甚至没毒价获得较高效价的病毒液，其TCID50大于7.5，并且微载体损失量非常小，细胞生长均匀，是一个值得推广应用的方法。

Description

一种牛病毒性腹泻/黏膜病-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗的生产方法
技术领域
本发明涉及一种牛病毒性腹泻/黏膜病-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗的生产方法。属于兽用生物制品领域。
技术背景
牛病毒性腹泻(Bovineviraldiarrhea，BVD)是黄病毒科瘟病毒属牛病毒性腹泻病毒/黏膜病病毒(BovineviraldiarrheaVirus，BVDV)引起的以腹泻为主要症状的重要传染病，各年龄牛均易感。主要症状为：腹泻，急、慢性黏膜病，持续性感染与免疫耐受，母畜流产、死胎和畸形。除感染牛外，还可感染猪、羊、鹿、骆驼及其它野生动物。Olafson(1946)等首先在美国纽约以消化道溃疡和下痢为特征牛中发现牛病毒性腹泻(BVD)。Ransey和Chiver(1953)发现黏膜病(MD)。KMLe等(1957)首次分离到病毒。Gillespie和Barker(1959)分离出New-York株和Indiana株。Gillespie(1960)分离出OregonC24V株(标准毒株)。1971年由美国兽医学会统一命名为BVD-MDV。我国李友民等(1981)在吉林省首次从国外引进牛的流产胎儿脾脏中分离并鉴定出BVDV，证明该病在我国存在。目前，我国20多个省市自治区检出此病。本研究使用的制苗毒株BVDV/NMG株，是2010年从内蒙古某牛场疑似病例中采集血清样品，利用MDBK细胞培养分离出的一株BVDV。该分离株F2代即可在MDBK细胞上产生细胞圆缩、聚合、出现空洞，大部分细胞脱落等BVDV的典型CPE，为CP型BVDV。电镜和理化检测均符合BVDV特征，如为圆形，有囊膜直径约50nm左右病毒粒子，对5-碘脱氧尿核苷不敏感，对乙醚、酸均敏感，56℃作用70min可被完全灭活等。
牛传染性鼻气管炎(Infectiousbovinerhinotracheitis，IBR)俗称“红鼻病”或“坏死性鼻炎”，由牛疱疹病毒I型(BHV-1)牛传染性鼻气管炎病毒(Infectiousbovinerhinotracheitisvirus，IBRV)引起的一种急性、热性、接触性烈性传染病，OIE将其列为法定报告动物疫病。其自然宿主是牛。病毒感染牛体后，可潜伏于神经系统，使感染变得呈间歇性、持续性，而且病牛会长期或终身带毒。1995年本病最现发现于美国科罗拉多州的育肥牛。1956年Madin等首次从患牛分离出病毒。1964年Huck鉴定BHV-1属于疱疹病毒。1990年Edwards等将BHV-1分为2个型，其中BHV-1.1与IBR有关，BHV-1.2与(传染性脓疱性外阴阴道炎)有关。我国最早在20世纪70年代在进口牛群中发现，而1981年周泰冲等首次在深圳海关从新西兰进口奶牛中分离到病毒。1986年王则兴等从乳牛、水牛、黄牛中分离到此病毒，证明IBR在我国存在。经流行病学发现，目前我国绝大部分省、市、区均有IBR感染的牛群，但感染率高低不同，同时亦有病毒分离的报道。
发明内容
本发明的目的在于解决微载体悬浮培养MDBK细胞繁殖牛病毒性腹泻/黏膜病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒以制备牛病毒性腹泻/黏膜病、牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗。
本发明采用MDBK一种细胞繁殖牛病毒性腹泻/黏膜病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒，进而将此两种病毒作为制苗用抗原并制备成预防牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎的二联灭活疫苗。。同时，本发明提供了一种牛病毒性腹泻/黏膜病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒适应微载体悬浮培养细胞MDBK的方法。
本发明的技术方案
1.一种牛病毒性腹泻/黏膜病-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗，其特征在于该疫苗含有灭活的牛病毒性腹泻/黏膜病病毒(BVDV)NMG株和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)LY株。
2.如权利要求1所述的一种牛病毒性腹泻/黏膜病-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗的生产方法，其特征在于该方法为：
(1)分别用BVDVNMG株病毒和IBRVLY株病毒作为生产种毒通过细胞繁殖获得制备疫苗用病毒抗原；
(2)两种病毒抗原经灭活后按比例混合配制成水相；
(3)与油相混合乳化成二联灭活疫苗。
3.如权利要求1所述的一种牛病毒性腹泻/黏膜病-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗的生产方法，其特征在于其中BVDVNMG株病毒和牛传染性鼻气管炎病毒IBRVLY株病毒均用传代细胞MDBK繁殖的；
4.如权利要求2、3所述的一种牛病毒性腹泻/黏膜病-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗的生产方法，其特征在于其中病毒抗原是两种病毒分别通过生物反应器中微载体悬浮培养传代细胞MDBK繁殖后获得的。
5.如权利要求4所述的一种牛病毒性腹泻/黏膜病-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗的生产方法，其特征在于其中使用的微载体为CytodexI。
本发明具体实施方式
一、疫苗制备
1.制苗毒株
牛病毒性腹泻/黏膜病病毒(Bovineviraldiarrheavirus，BVDV)NMG株(来自中国兽医微生物菌种保藏管理中心)能被牛病毒性腹泻/黏膜病病毒标准阳性血清中和，且能被BVDVIFA荧光抗体识别；针对常用BVDV基因分型的5′-UTR设计特异性引物，经RT-PCR可扩增出288bp特异性片段。将该片段进行测序后与Genbank中已发表BVDV毒株序列的5′-UTR进行同源性比较，该分离毒株与BVDV经典毒株NADL株和Singer株同源性均达到90.3％以上，与BVDV经典毒株890株同源性仅为79.7％。该分离株与2008年～2011年我国分离的BVDV1BJ09-02、BVDVisolateNX0803、BVDVisolateHZ0602、BVDVisolateZD05(2010)等4个国内分离毒株同源性达到97.7％，与2012～2013年我国各地分离的BVDV毒株同源性为82％～87％，说明该分离毒株具有一定的代表性。纯净性检测显示该毒株无菌、无支原体以及无外源病毒污染，纯净性良好，对MDBK细胞适应性好，TCID50稳定但对牛的毒力较弱，病毒回归健康易感牛除鼻孔出现水样或粘性分泌物外，未见其它明显病理变化，鼻拭子采集样品RT-PCR检测结果显示其排毒期持续约为11日。
本发明用牛传染性鼻气管炎病毒(Infectiousbovinerhinotracheitisvirus，IBRV)LY株(来自中国兽医微生物菌种保藏管理中心)，攻毒毒株和生产用毒株为同一毒株，是2010年从河南洛阳某牛场疑似IBR感染的鼻拭子分离而来。该分离株第一代即可在MDBK细胞上产生细胞圆缩、聚合、出现空洞，甚至脱落等特异性CPE。电镜及理化检测均符合IBRV特征，如病毒粒子近似球形，有囊膜，直径约150nm左右，对5-碘脱氧尿核苷敏感，对乙醚、酸均敏感，56℃作用60min可使病毒滴度显著降低。IBRVLY株毒株可被牛传染性鼻气管炎病毒标准阳性血清中和，且能被IBRVFA荧光抗体识别，通过针对gB基因特异性引物可扩增出IBRVgB基因491bp片段，与Genbank中已发表的IBRVgB基因序列进行同源性比较，结果同源性为93.0％～100％，与我国2012年北京分离株(DX)和新疆分离株(XJ)同源性为100％，以上均证实分离到的毒株为IBRV。纯净性检测显示该毒株无菌、无支原体以及无外源病毒污染，纯净性良好。动物回归试验表明该分离毒株对牛的毒力较强，按每头健康易感牛滴鼻攻击IBRV/LY株强毒10ml(病毒含量为107.5TCID50/ml)，分两次滴鼻攻击(上午和下午各1次)，每次攻击时左右鼻孔各2.5ml，攻毒后2～14日陆续出现呼吸道症状(单侧或双侧鼻孔出现粘性或脓性分泌物，部分牛出现呼吸困难、咳嗽等)或眼部症状(眼部有粘性或脓性分泌物，或出现眼结膜炎、结膜充血，大量流泪，甚至出现坏死膜)，部分牛出现体温升高(体温≥40.0℃且至少持续2日)等典型的牛传染性鼻气管炎症状。采集鼻拭子进行排毒期监测显示，约从攻毒后第3日开始排毒，最长可持续至14日，其中排毒高峰期为攻毒后8～10日。从临床症状上看该分离株可划归为呼吸道型IBRV，因此选用IBRV/LY株毒株作为攻毒用毒株。
2.抗原制备
为了解决牛病毒性腹泻/黏膜病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒适应微载体悬浮培养细胞牛肾细胞系MDBK(来自中国兽医微生物菌种保藏管理中心)过程中出现的一系列问题，本发明提供了一种BVDVNMG株、IBRVLY株病毒适应微载体悬浮培养细胞MDBK的方法。该方法解决微载体培养细胞繁殖牛病毒性腹泻/黏膜病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒液过程出现的载体丢失、微载体上细胞生长慢、微载体上细胞生长不均匀、血清清洗不干净、接毒不均匀甚至没毒价和毒价不符合要求等问题。
(1)细胞培养
1)细胞工厂繁殖细胞传代的方法：首先复苏步骤1所选择的种细胞牛肾细胞系MDBK(来自中国兽医微生物菌种保藏管理中心)到T225的细胞瓶中，生长48h左右，按照体积比1:3的比例进行传代；然后把7个长满细胞的T225细胞瓶(GreinerBio-OneGmbH)中的细胞转到1个细胞(10层)工厂(购自Thermo公司，体积为33.5cm×20.5cm×19.0cm＝13048.25cm3)进行培养；48小时左右按照1:3的比例进行细胞传代培养；
2)收获细胞工厂中的细胞：将步骤2所得细胞用PBS洗涤2～3次，然后加入胰酶-EDTA溶液消化；1个细胞(10层)工厂(体积为33.5cm×20.5cm×19.0cm＝13048.25cm3)加入1000ml胰酶-EDTA溶液，其它类型的细胞工厂按照类似比例添加胰酶-EDTA溶液消化，然后收集细胞；
3)收获的细胞计数后，按照每个微载体添加15～20个细胞的比例进行细胞接种；每升培养基中加入3～5克微载体CytodexI(购自GE公司)；
4)生物反应器培养接种细胞：
生物反应器投放载体的量为3～5克/升；生物反应器培养细胞的培养基为DMEM高糖培养基(Gibco)；血清使用浓度为8％～10％；溶氧量为35％的溶液饱和溶氧量；温度为36.7℃；搅拌速度为50～60r/min，pH为7.15～7.40；每个微载体上细胞数达到150个以上能够达到接种BVDVNMG株和IBRVLY株的要求；
当培养的细胞达到接种牛病毒性腹泻/黏膜病病毒BVDV/NMG株的要求后，进行下述步骤：生物反应器中的搅拌桨叶上方连接有一个100目不锈钢筛网的旋转滤器，旋转滤器能够阻隔微载体，旋转滤器的底部含有一个排液出口；在搅拌状态下，容器中的培养基通过排液出口排掉；然后用PBS洗涤收集在容器中的微载体，并通过容器的底部排液出口排出PBS；如上反复2～3次，停搅拌，15～20min后通过罐底的排出口将PBS和培养基混合液排出，只留下沉积在罐底部的微载体；然后关闭排液出口。
(2)接毒、收毒和灭活
1)把牛病毒性腹泻/黏膜病病毒BVDV/NMG株接种液加入到生物反应器中，同时改变搅拌速度，以便病毒均匀接种；
细胞接种病毒后，向装有微载体的容器加入2％血清的DMEM高糖培养基(Gibco)，然后进行病毒繁殖，病毒在生物反应器中繁殖的条件为：培养基为DMEM高糖培养基(Gibco)；溶氧量为25％的溶液饱和溶氧量；温度为36.7℃；搅拌速度为60r/min，pH为7.4；培养结束后收集BVDVNMG株液并经灭活得到制苗用灭活抗原。
2)以同上方法繁殖并收获IBRV/LY株液并经灭活得到制苗用灭活抗原。
3.配苗
将分别制得BVDVNMG株病毒和IBRVLY株病毒灭活抗原按比例混合配制成水相与油相混合经乳化成二联灭活疫苗。
二、疫苗成品检验
1.物理性状
(1)外观应为乳白色或淡粉红色略带粘滞性均匀乳状液。
(2)剂型水包油包水型(W/O/W)。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于清洁冷水表面，应呈云雾状扩散。
(3)稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15min，管底析出的水相应不超过0.5ml。
(4)黏度按现行《中国兽药典》附录(中国兽药典委员会编.中华人民共和国兽药典二〇一〇年版三部，中国农业出版社，2011年，本发明称《中国兽药典》)进行，应符合规定。
(5)装量检查按《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
2.无菌检验按《中国兽药典》附录进行，应无菌生长。
3.安全检验
(1)小动物检验用体重350～400g的豚鼠2只，各皮下注射疫苗0.5ml；用体重18～22g小鼠5只，各皮下注射疫苗0.2ml。逐日观察7日，均不应出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局部反应或全身反应。
(2)本动物检验用至少6月龄的BVDV抗原阴性、IBRV抗原阴性、BVDV抗体阴性(血清中和抗体效价不高于1:4或ELISA抗体阴性)、IBRV抗体阴性(血清中和抗体效价不高于1:4或ELISA抗体阴性)的健康易感牛3头，每头颈部肌肉注射4ml(2头份)疫苗，逐日观察14日，均不应出现BVD症状和IBR症状或因注射疫苗引起的明显局部反应或全身反应。
4.效力检验
(1)豚鼠中和抗体测定法用体重350～400g健康易感雌性豚鼠(BVDV血清中和抗体效价不高于1:4、IBRV血清中和抗体效价不高于1:4)10只，每只肌肉注射疫苗1.0ml(分两点注射，每点0.5ml)，免疫后21日加强免疫一次，二免后21日分别采血测定中和抗体，至少8只豚鼠BVDV中和抗体效价不低于1:45，至少8只豚鼠IBRV中和抗体效价不低于1:45。
(2)牛免疫攻毒法用2～6月龄的BVDV抗原阴性、IBRV抗原阴性、BVDV抗体阴性(血清中和抗体效价不高于1:4或ELISA抗体阴性)、IBRV抗体阴性(血清中和抗体效价不高于1:4或ELISA抗体阴性)的健康易感牛20头，随机分为2组，其中免疫组10头，攻毒对照组10头。免疫组牛每头颈部肌肉注射疫苗2ml，免疫后21日加强免疫一次，二免后21日将免疫牛随机均分为BVDV组和IBRV组，分圈饲养。BVDV组，连同对照牛5头，用BVDV强毒进行攻击，每头牛接种10mlBVDV/W株强毒，即滴左右鼻孔各2ml，滴口腔2ml，颈部肌肉左右各注射2ml。IBRV组，连同对照牛5头，用IBRV强毒进行攻击，每头牛滴鼻攻击10mlIBRV/LY株强毒，分两次滴鼻攻击(上午和下午各1次)，每次攻击时左右鼻孔各2.5ml。攻毒后连续观察14日，每日测定体温并采集鼻拭子进行病毒分离。BVDV组攻毒对照组牛均应至少3头发病，免疫攻毒组牛均应至少4头保护；IBRV组攻毒对照组牛均应至少3头发病，免疫攻毒组牛均应至少4头保护。
本发明涉及微生物资源信息
本研究使用的制苗用的牛病毒性腹泻/黏膜病病毒BVDVNMG株，是2010年从内蒙古某牛场疑似病例中采集血清样品种分离到的一株疫苗生产种毒；BVDVW株是疫苗检验用攻毒用强毒病毒株是2010年从云南分离到的一株疫苗检验用强毒株；牛传染性鼻气管炎病毒IBRVLY株生产和检验用毒株，是2010年从河南洛阳某牛场疑似IBR感染的鼻拭子分离而来，以上三株病毒均由北京市海淀区中关村南大街8号中国兽医微生物菌种保藏管理中心得到。
附图说明
图1细胞接种在微载体上24h后的生长状况；
图2细胞接种在微载体上48h后的生长状况；
图3细胞接种在微载体上60h后的生长状况；
图4细胞接种在微载体上接种牛病毒性腹泻病毒(BVDVNMG株)收毒时的生长状况。
图5细胞接种在微载体上24h后的生长状况；
图6细胞接种在微载体上55h后的生长状况；
图7细胞接种在微载体上接种牛传染性鼻气管炎病毒液(IBRVLY株)收毒时的生长状况。；
本发明的积极意义
本发明涉及一种牛病毒性腹泻-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗及其生产方法。本发明所述牛病毒性腹泻-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗是采用适应微载体悬浮培养细胞MDBK的方法繁殖BVDVNMG株病毒和IBRVLY株病毒，该方法能够很好的在微载体培养的细胞上培养病毒，该方法解决微载体培养细胞繁殖病毒过程出现的载体丢失、接毒不均匀甚至没毒价获得较高效价的病毒液，其TCID50大于7.5，并且微载体损失量非常小，细胞生长均匀，是一个值得推广应用的方法。
实施例
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1
——微载体生物反应器悬浮培养繁殖牛病毒性腹泻/黏膜病病毒NMG株
1.选择导入载体所需要的种细胞MDBK(来自中国兽医微生物菌种保藏管理中心)；
2.细胞工厂繁殖细胞传代的方法：首先复苏步骤1所选择的种细胞到T225的细胞瓶中，生长48h左右，按照1:3的比例进行传代；然后把7个长满细胞的T225细胞瓶中的细胞传到1个细胞(10层)工厂(体积为33.5cm×20.5cm×19.0cm＝13048.25cm3)进行培养；48小时左右按照1：3的比例进行细胞传代培养；该过程中使用的培养基为DMEM高糖培养基，血清为胎牛血清，使用量为10％；
3.收获细胞工厂中的细胞：将步骤2所得细胞用PBS洗涤2-3次，然后加入胰酶-EDTA溶液消化；1个细胞(10层)工厂(体积为33.5cm×20.5cm×19.0cm＝13048.25cm3)加入1000ml胰酶-EDTA溶液，其它类型的细胞工厂按照类似比例添加胰酶-EDTA溶液消化，然后收集细胞；
4.收获的细胞计数后，选用的微载体为CytodexI，按照每个微载体添加20个细胞的比例进行细胞接种；每升培养基中加入4克微载体；细胞接种后在24h、48h、60h取样观察细胞在微载体上的生长状况，如图1-3所示。
5.生物反应器培养细胞的条件为：
选用5L的NBS生物反应器，其工作体积为5L，培养基为DMEM高糖培养基(Gibco)；血清使用浓度为10％；溶氧量为35％的溶液饱和溶氧量；温度为36.7℃；搅拌速度为50r/min，pH为7.3；培养时间为60h。
6.步骤5培养的细胞达到接种BVDVNMG株病毒的要求后，进行下述步骤：生物反应器中的搅拌桨叶上方连接有一个100目不锈钢筛网的旋转滤器，旋转滤器能够阻隔微载体，旋转滤器的底部含有一个排液出口；在搅拌状态下，容器中的培养基通过排液出口排掉；然后用PBS洗涤收集在容器中的微载体，并通过容器的底部排液出口排出PBS；如上反复2～3次，停搅拌，15～20min后通过罐底的排出口将PBS和培养基混合液排出，只留下沉积在罐底部的微载体；
7.然后关闭排液出口，把BVDVNMG株病毒接种液加入到生物反应器中，同时改变搅拌速度，以便病毒均匀接种；
8.细胞接种病毒后，向步骤7所得装有微载体的容器加入2％血清的DMEM高糖培养基(Gibco)，然后进行病毒繁殖，病毒在生物反应器中繁殖的条件为：培养基为DMEM高糖培养基(Gibco)；溶氧量为25％的溶液饱和溶氧量；温度为36.7℃；搅拌速度为60r/min，pH为7.4；
9.培养45h后收集BVDVNMG株病毒，(病变图片见附图4)，收获量为5L，TCID50为8.0/1ml。
实施例2
——微载体生物反应器悬浮培养繁殖牛传染性鼻气管炎LY株
1.选择导入载体所需要的种细胞MDBK；
2.细胞工厂繁殖细胞传代的方法：首先复苏步骤1所选择的种细胞到T225的细胞瓶中，生长48h左右，按照1:3的比例进行传代；然后把7个长满细胞的T225细胞瓶中的细胞传到1个细胞(10层)工厂(体积为33.5cm×20.5cm×19.0cm＝13048.25cm3)进行培养；48小时左右按照1:3的比例进行细胞传代培养；该过程中使用的培养基为DMEM高糖培养基，血清为胎牛血清，使用量为10％；
3.收获细胞工厂中的细胞：将步骤2所得细胞用PBS洗涤2～3次，然后加入胰酶-EDTA溶液消化；1个细胞(10层)工厂(体积为33.5cm×20.5cm×19.0cm＝13048.25cm3)加入1000ml胰酶-EDTA溶液，其它类型的细胞工厂按照类似比例添加胰酶-EDTA溶液消化，然后收集细胞；
4.收获的细胞计数后，选用的微载体为CytodexI，按照每个微载体添加20个细胞的比例进行细胞接种；每升培养基中加入4g微载体；细胞接种后在24h、55h取样观察细胞在微载体上的生长状况，如图5-6所示。
5.生物反应器培养细胞的条件为：
选用5L的NBS生物反应器，其工作体积为5L，培养基为DMEM高糖培养基(Gibco)；血清使用浓度为10％；溶氧量为35％的溶液饱和溶氧量；温度为36.7℃；搅拌速度为50r/min，pH为7.35；培养时间为55h。
6.步骤5培养的细胞达到接种IBRV/LY株病毒的要求后，进行下述步骤：生物反应器中的搅拌桨叶上方连接有一个100目不锈钢筛网的旋转滤器，旋转滤器能够阻隔微载体，旋转滤器的底部含有一个排液出口；在搅拌状态下，容器中的培养基通过排液出口排掉；然后用PBS洗涤收集在容器中的微载体，并通过容器的底部排液出口排出PBS；如上反复2～3次，停搅拌，15～20min后通过罐底的排出口将PBS和培养基混合液排出，只留下沉积在罐底部的微载体；
7.然后关闭排液出口，把IBRV/LY株病毒接种液加入到生物反应器中，同时改变搅拌速度，以便病毒均匀接种；
8.细胞接种病毒后，向步骤7所得装有微载体的容器加入2％血清的DMEM高糖培养基(Gibco)，然后进行病毒繁殖，病毒在生物反应器中繁殖的条件为：培养基为DMEM高糖培养基(Gibco)；溶氧量为25％的溶液饱和溶氧量；温度为36.7℃；搅拌速度为60转/分，pH为7.4；
9.培养50h后收集IBRVLY株病毒液(细胞病变见附图7)，收获量为5L，TCID50为8.25/1ml。
实施例3
——牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗(BVDV/NMG株+IBRV/LY株)的制备及检验
1设备寄原材料
1.1主要设备5L搅拌式反应器(NBS生物反应器BF-310CELLIGEN)。
1.2Cytodex1微载体(购自GE公司)。
1.3传代细胞MDBK工作种细胞(来自中国兽医微生物菌种保藏管理中心)。
1.4种毒BVDVNMG株生产种毒；IBRVLY株生产种毒(来自中国兽医微生物菌种保藏管理中心)。
1.5攻毒用强毒BVDVW株和IBRVLY(来自中国兽医微生物菌种保藏管理中心)株。
1.6培养基DMEM培养基；硫乙醇酸盐(TG)、酪胨琼脂培养基(GA)、葡萄糖蛋白胨培养基(GP)、支原体液体培养基、支原体固体培养基。
1.7新生牛血清经检验BVDV和IBRV血清中和抗体均不高于1∶4，BVDV和IBRV抗原检测均为阴性。
1.9其它化学试剂灭活剂2-溴乙胺氢溴酸盐(BEA)(西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司)，206佐剂(购自赛彼科(上海)特殊化学品有限公司)。
2方法
2.15L反应器微载体培养细胞的制备复苏MDBK工作种细胞1～2支，按T25、T75、T225、转瓶逐级扩大贴壁培养，生长至致密单层后用胰蛋白酶消化分散，细胞活力不低于95％时，接种密度转移至生物反应器中，设定反应器细胞培养的参数，定时取样进行细胞观察、计数。
2.2抗原的制备待反应器中细胞在微载体上长成单层，沉淀排出细胞营养液，更换维持液，分别按1‰种毒含量接种BVDV/NMG株、IBRV/LY株生产种毒，设定反应器病毒培养的参数同实例2所述，进行病毒的繁殖，待70％以上细胞脱落时收获培养物(见表1)。
1.配苗用抗原
实施例1和实施例2制备所收获的两种病毒作为制苗用抗原(见表1)。
表1BVDV、IBRV抗原生产情况汇总
2.抗原液灭活和检验
(1)抗原灭活将纯化抗原液中加入BEI溶液，30℃连续灭活28小时，其间定时搅拌。灭活结束后，立即在灭活病毒液中加入过滤除菌的1mol/L硫代硫酸钠溶液，充分混合，迅速降温取样进行灭活检测，灭活抗原液置2～8℃保存备用。
(2)半成品检验
1)TCID50测定将毒种用DMEM溶液液作10倍系列稀释，取10-5～10-84个稀释度，每个稀释度接种96孔板单层MDBK细胞各4～8孔，每孔100μl，接种后置37℃吸附1小时，再补加含2％新生牛血清的DMEM培养液100μl，置37℃、5％二氧化碳培养箱培养2～4日，记录各稀释度细胞病变孔数，按Reed-Muench法计算TCID50。每1ml病毒含量应≥107.5TCID50。
2)灭活检验取灭活病毒液，按10％(V/V)的比例接种于MDBK细胞2瓶(25cm2/瓶)，置37℃吸附1小时后，弃去病毒液，加入DMEM维持液，同时设正常细胞对照1瓶(25cm2/瓶)。37℃培养2～4日，应不出现细胞病变。收获培养物冻融后再取样接种MDBK细胞盲传两代，均未出现细胞病变(见表2)。
3)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，均无菌生长(见表2)。
表2灭活抗原检测结果
2.5疫苗配制与乳化
2.5.1水相制备分别取检验合格的BVDV和IBRV抗原，按照BVDV∶IBRV＝2∶1的比例混合制备水相。
2.5.2油水比例水相∶206佐剂＝1∶1比例进行乳化。
2.5.3乳化分装将206佐剂真空进料到乳化缸中高压灭菌后使用，先将水相与油相分别加热升温至30±1℃，在搅拌条件下，将BVDV、IBRV混合抗原液缓慢加入到乳化缸中(即油相中)，搅拌乳化30min定量分装，并加盖密封、贴标签。
3.3乳化分装
本次产品共乳化分装1批，灭活后的MSN12001和MSL12001抗原(按体积比2:1)混合后配制的水相与佐剂乳化的批号定为S12001，规格为50ml/瓶，每批分装量5000ml，按操作规程分装后加盖密封并贴上产品标签，置2～8℃冷库保存备用。
实施例4
——牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗(BVDV/NMG株+IBRV/LY株)的成品检验
1.物理性状
(1)性状
(2)外观应为乳白色或淡粉红色略带粘滞性均匀乳状液(见表3)。
(3)剂型水包油包水型(W/O/W)。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于清洁冷水表面，应呈云雾状扩散(见表3)。
(4)稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15min，管底析出的水相应不超过0.5ml(见表3)。
(5)黏度按现行《中国兽药典》附录进行，符合规定(见表3)。
(6)装量检查按现行《中国兽药典》附录进行，符合规定(见表3)。
2.无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，均无菌生长(见表3)。
表3性状、装量、无菌检验结果
3.安全检验
(1)小动物检验用体重350～400g的豚鼠2只，各皮下注射疫苗0.5ml；用体重18～22g小鼠5只，各皮下注射疫苗0.2ml。逐日观察7日，均不应出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局部反应或全身反应。
(2)本动物检验用至少6月龄的BVDV抗原阴性、IBRV抗原阴性、BVDV抗体阴性(血清中和抗体效价不高于1∶4或ELISA抗体阴性)、IBRV抗体阴性(血清中和抗体效价不高于1：4或ELISA抗体阴性)的健康易感牛3头，每头颈部肌肉注射4ml(2头份)疫苗，逐日观察14日，均未出现BVD症状和IBR症状或因注射疫苗引起的明显局部反应或全身反应(见表4)。
表4安全检验结果
4.效力检验
(1)豚鼠中和抗体测定法用体重350～400g健康易感雌性豚鼠(BVDV血清中和抗体效价不高于1：4、IBRV血清中和抗体效价不高于1:4)10只，每只肌肉注射疫苗1.0ml(分两点注射，每点0.5ml)，免疫后21日加强免疫一次，二免后21日分别采血测定中和抗体，至少8只豚鼠BVDV中和抗体效价不低于1:45，至少8只豚鼠IBRV中和抗体效价不低于1:45，检验结果见表5)。
表5效力(豚鼠)检验结果
(2)牛免疫攻毒法用2～6月龄的BVDV抗原阴性、IBRV抗原阴性、BVDV抗体阴性(血清中和抗体效价不高于1:4或ELISA抗体阴性)、IBRV抗体阴性(血清中和抗体效价不高于1:4或ELISA抗体阴性)的健康易感牛20头，随机分为2组，其中免疫组10头，攻毒对照组10头。免疫组牛每头颈部肌肉注射疫苗2ml，免疫后21日加强免疫一次，二免后21日将免疫牛随机均分为BVDV组和IBRV组，分圈饲养。BVDV组，连同对照牛5头，用BVDV强毒进行攻击，每头牛接种10mlBVDV/W株强毒，即滴左右鼻孔各2ml，滴口腔2ml，颈部肌肉左右各注射2ml。IBRV组，连同对照牛5头，用IBRV强毒进行攻击，每头牛滴鼻攻击10mlIBRV/LY株强毒，分两次滴鼻攻击(上午和下午各1次)，每次攻击时左右鼻孔各2.5ml。攻毒后连续观察14日，每日测定体温并采集鼻拭子进行病毒分离。其标准为BVDV组攻毒对照组牛均应至少3头发病，免疫攻毒组牛均应至少4头保护；IBRV组攻毒对照组牛均应至少3头发病，免疫攻毒组牛均应至少4头保护，检验结果见表6。
表6效力(本动物)检验结果
用微载体悬浮工艺在试制了1批牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联灭活苗(BVDV/NMG株+IBRV/LY株)，抗原病毒含量107.5TCID50/ml以上，保证2ml/头份规格疫苗的配制，产品的灭活检验、性状、纯净性、安全检验、效力检验均符合规定，说明本研究建立的MDBK微载体培养技术制备病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联灭活苗(BVDV/NMG株+IBRV/LY株)工艺稳定、重复性强，减少了批间差，实现了自动化，具有较好的推广应用的价值。

Claims (5)

1.一种牛病毒性腹泻/黏膜病-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗，其特征在于该疫苗含有灭活的牛病毒性腹泻/黏膜病病毒(BVDV)NMG株和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)LY株。
2.如权利要求1所述的一种牛病毒性腹泻/黏膜病-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗的生产方法，其特征在于该方法为：
(1)分别用BVDVNMG株病毒和IBRVLY株病毒作为生产种毒通过细胞繁殖获得制备疫苗用病毒抗原；
(2)两种病毒抗原经灭活后按比例混合配制成水相；
(3)与油相混合乳化成二联灭活疫苗。
3.如权利要求1所述的一种牛病毒性腹泻/黏膜病-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗的生产方法，其特征在于其中BVDVNMG株病毒和牛传染性鼻气管炎病毒IBRVLY株病毒均用传代细胞MDBK繁殖的。
4.如权利要求2、3所述的一种牛病毒性腹泻/黏膜病-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗的生产方法，其特征在于其中病毒抗原是两种病毒分别通过生物反应器中微载体悬浮培养传代细胞MDBK繁殖后获得的。
5.如权利要求4所述的一种牛病毒性腹泻/黏膜病-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗的生产方法，其特征在于其中使用的微载体为CytodexI。
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