CN104726392A

CN104726392A - 一种制备无血清培养的悬浮哺乳动物细胞系的方法、及其制备的细胞系和应用

Info

Publication number: CN104726392A
Application number: CN201310706556.8A
Authority: CN
Inventors: 张许科; 孙进忠; 白朝勇
Original assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Current assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Priority date: 2013-12-18
Filing date: 2013-12-18
Publication date: 2015-06-24
Anticipated expiration: 2033-12-18
Also published as: CN104726392B

Abstract

本发明提供了一种制备无血清培养的悬浮哺乳动物细胞系的方法，该方法包括：（1）复苏并培养哺乳动物细胞，得到贴壁培养的该哺乳动物细胞，用胰酶消化；（2）用添加了一定量血清的无血清培养基培养该贴壁培养的哺乳动物细胞，连续培养该哺乳动物细胞至适应该添加了一定量血清的无血清培养基；以及（3）重复步骤（2）中的该连续培育程序，逐渐降低该无血清培养基中的血清添加量，直到该无血清培养基中血清添加量为0，得到该悬浮培养的哺乳动物细胞。本发明的方法解决细胞获得均衡的营养，保证了疫苗的稳定性和均一性，同时取得了血清添加产生副作用的问题，使遭受外源污染的风险降低，且降低了动物的应激反应，也使得后续处理简单易行。

Description

一种制备无血清培养的悬浮哺乳动物细胞系的方法、及其制备的细胞系和应用

技术领域

本发明涉及一种适应单细胞纯悬浮无血清培养的哺乳动物细胞系的驯化方法以及使用该方法制备的细胞系。

背景技术

哺乳动物细胞的培养经历了滚瓶-微载体的培养模式。培养模式的改进，不但更容易实现规模化生产，而且降低了后期纯化工艺的难度。

转瓶培养技术是传统的贴壁细胞培养方式，将细胞接种在旋转的圆筒形转瓶中，细胞贴附于玻璃壁四周，培养过程中转瓶在轴承上不断旋转，使细胞能够交替接触培养液和空气，实现细胞生长代谢的目的。

滚瓶培养工艺不能对培养液组分、pH以及DO等条件实时控制调整，无法保证细胞处于最佳的生长状态，不能实现工业的大规模生产；滚瓶培养工艺繁琐复杂，周期长，劳动强度大，占地空间大，费时费力，且批次间差异较大，生产质量难以控制，产品质量不稳定。

微载体培养技术成为目前大规模培养应用较多的一项工艺，常使用的载体有两种，一种是片状载体，一种是球状载体。细胞在载体表面呈现单层生长，实现了在相当少的空间生产高密度的细胞和细胞产物。

微载体的价格昂贵，生产成本高，对动物疫苗生产不适合。而且微载体培养细胞过程中需要添加一定量的血清，不利于流感病毒的增殖；血清添加产生的副作用较大，后期纯化工艺困难。此外，培养基中添加了动物源血清使得在病毒培养或疫苗生产中遭受外源污染的风险大大提高，并且生产成本提高。

流感病毒疫苗的制备经过了从动物组织器官到细胞培养的规模化发展过程，流感病毒的培养经历了从鸡胚到哺乳动物细胞的发展过程，因此，基于以上考虑，开发出一种适合流感病毒无血清纯悬浮培养制备流感疫苗工艺具有重要意义。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种适应单细胞纯悬浮无血清培养的哺乳动物细胞系的驯化方法以及使用该方法制备的细胞系。

本发明的主要目的在于提供一种制备无血清培养的悬浮哺乳动物细胞系的方法，所述方法包括：（1）复苏并培养哺乳动物细胞，得到贴壁培养的所述哺乳动物细胞，用胰酶消化；（2）用添加了一定量血清的无血清培养基培养所述贴壁培养的哺乳动物细胞，连续培育所述哺乳动物细胞至适应所述添加了一定量血清的无血清培养基；以及（3）重复步骤（2）中的所述连续培育程序，逐渐降低所述无血清培养基中的血清添加量，直到所述无血清培养基中血清添加量为0，得到所述悬浮培养的哺乳动物细胞。

优选地，所述步骤（1）中的哺乳动物为MDCK细胞。

优选地，所述步骤（2）和（3）中的所述无血清培养基包括VP-SFMAGT^TM、MDCK细胞无血清无蛋白化学培养基、InVitrus^TM、或SFM4MegaVir^TM培养基以及在所述步骤（3）中当血清添加量为1%及以下时，所述无血清培养基还包括添加成分Pluronic F-68和硫酸葡聚糖。

优选地，所述步骤（2）中所述血清添加量为5%；所述步骤（3）中所述逐渐降低的血清添加量分别为3%、1%、0.5%、0%。

优选地，所述步骤（2）和（3）中的连续培养所述哺乳动物细胞至适应所述添加了一定量血清的无血清培养基的程序为连续培养3～5代。

本发明的另一目的在于提供所述方法制备的所述悬浮培养的哺乳动物细胞系。

本发明的再一目的在于提供一种制备流感病毒疫苗的方法，所述方法包括，（1）用所述无血清培养基扩增培养所述悬浮培养的哺乳动物细胞；（2）在所述步骤（1）中培养的所述悬浮培养的哺乳动物细胞中接种所述流感病毒，扩增培养所述流感病毒；以及（3）收获所述流感病毒，灭活。

具体而言，复苏一支冻存的已经适应无血清悬浮培养的MDCK细胞，复苏方法为：液氮中取出细胞一支，迅速放入37℃水浴锅中溶解。75%酒精擦拭后放入超净工作台，1ml吸管吸出细胞轻轻加入15ml离心管中，然后加入10ml生长液（成分是VP-SFM AGT^TM(Gibco公司)无血清培养基、0.1%Pluronic F-68、30μg/ml硫酸葡聚糖），生长液应该逐滴滴入，10ml液用时不少于2min，混匀后800rpm，离心3min。弃上清，加入新鲜生长液10ml，轻轻吹打混匀，将细胞悬液放入100ml三角瓶中，补足生长液30ml摇床培养。培养2d后离心换液。

当细胞生长速率恢复后，将细胞扩大培养在Bioflo115发酵罐，工作体积1.2L，培养液组成为：0.2%Pluronic F-68、30μg/ml硫酸葡聚糖、VP-SFM AGT^TM(Gibco公司)；培养条件为：37℃、80～110rpm、DO30～50%、pH7.20；细胞接种密度为30～50万/ml。

待细胞密度达到3×10⁶～4×10⁶/ml时，接种流感病毒，接种剂量为MOI=0.001～0.1，另外培养基中添加1.0～5.0μg/ml的TPCK-胰酶（购自Sigma公司）；培养条件为：33℃、80～110rpm、DO30～50%、pH7.20。80%细胞出现病变、死亡时停止培养，收获病毒液，测定血凝效价。

优选地，所述无血清培养基包括VP-SFM AGT^TM、MDCK细胞无血清无蛋白化学培养基、InVitrus^TM、或SFM4MegaVir^TM培养基以及所述无血清培养基中的添加成分Pluronic F-68和硫酸葡聚糖。

优选地，所述流感病毒为禽流感病毒、猪流感病毒。

本发明的又一目的在于提供所述方法制备的流感病毒疫苗。

本发明具有以下有益效果：

1.解决了细胞传统转瓶培养工艺繁琐复杂，不易实现大规模生产的问题。悬浮培养细胞可以使细胞获得均衡的营养，可以直观地反映细胞生长代谢的过程，简化了生产工艺、节省了人力、降低了生产成本，保证了疫苗的稳定性和均一性，且实验操作简单、周期短。纯悬浮培养既可以选择灌注培养又可以选择流加培养。流加工艺采用不断补充细胞生长过程中所消耗的营养，来延长细胞生长时间，从而达到细胞高密度, 培养病毒的高含量。

2.解决了微载体价格昂贵的问题。纯悬浮培养工艺使细胞悬浮在培养罐中，不需要依附微载体生长，在搅拌力的作用下悬浮在培养基中生长。

3.解决了血清添加产生副作用的问题。采用无血清培养基使得在病毒培养或疫苗生产中遭受外源污染的风险降低，且降低了动物的应激反应，安全系数高，也使得后续病毒处理如过滤、纯化等步骤更加简单易行，大大减少了工作量。

附图说明

图1为生物反应器培养过程中悬浮细胞与贴壁细胞生长曲线，图中Viability代表的是悬浮培养细胞的存活率；Cell density代表的是悬浮培养的细胞密度；adherent-cell代表的是贴壁细胞的密度；

图2为本发明MDCK细胞悬浮培养与贴壁培养的流感病毒血凝价比较。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例以MDCK细胞为例说明本发明的纯悬浮无血清培养的哺乳动物细胞系的驯化方法。

实施例1.适应单细胞无血清纯悬浮培养MDCK细胞的驯化

（1）复苏一支MDCK细胞贴壁培养。细胞复苏方法为，37℃迅速溶解后接种到含5%PAA血清的MEM培养基中，每支冻存管中细胞数量至少为300万，置37℃培养箱培养24h换上新鲜的含5%PAA的MEM 培养基。72h细胞长成致密单层，用0.125%胰酶消化，按照1:3的分散比例传代。

（2）复苏后，连续传代3次，使用添加了5%（v/v）PAA的VP-SFMAGT^TM(Gibco公司)无血清培养基（或MDCK细胞无血清无蛋白化学培养基(江阴剑桥生物技术有限公司)、或InVitrus^TM(瑞士Cell Culture Technologies公司)、或SFM4MegaVir^TM(HyClone公司)）替换含5%（v/v）PAA的MEM，通过倒置显微镜观察细胞长成致密单层进行传代，连续培养三代。

（3）使用添加了含3%（v/v）PAA的VP-SFM AGT^TM(Gibco公司)（或MDCK细胞无血清无蛋白化学培养基(江阴剑桥生物技术有限公司)、或InVitrus^TM(瑞士Cell Culture Technologies公司)、或SFM4MegaVir^TM(HyClone公司)）培养细胞，通过倒置显微镜观察细胞长成致密单层进行传代，连续培养三代。

（4）使用添加了1%（v/v）PAA的VP-SFM AGT^TM(Gibco公司)培养基培养细胞24h后细胞未贴壁，呈现团块漂浮，收集团块，800rpm离心5min，换上新鲜生长液，生长液组成为1%（v/v）PAA、无血清培养基、0.1%Pluronic F-68、30μg/ml硫酸葡聚糖，摇瓶110rpm、37℃培养。

（5）连续培养三代，细胞适应悬浮培养，继续降低血清含量至0.5%（v/v），该培养基还添加有0.1%Pluronic F-68、30μg/ml硫酸葡聚糖成分，培养三代。

（6）用VP-SFM AGT^TM(Gibco公司)完全无血清培养基替换含0.5%（v/v）的培养基，该无血清培养基还添加有0.1%Pluronic F-68、30μg/ml硫酸葡聚糖成分，，细胞生长良好，活力均在90%以上，在对数生长期冻存细胞。

（7）悬浮培养的冻存条件为：50%条件培养基（即含0.1%PluronicF-68、30μg/ml硫酸葡聚糖的无血清培养基接种细胞后培养24h的培养基），5%DMSO，45%的新鲜无血清培养基。

实施例2适应无血清悬浮培养的MDCK细胞生物反应器大规模培养条件下细胞的具体形态

1、生物反应器培养细胞：首先在摇瓶中直接复苏冻存的适应无血清悬浮培养的MDCK细胞，24h换液培养，72h左右细胞密度达到400多万/ml，传代培养，连续传代2-3次，细胞生长恢复；继续扩大培养，接种Bioflo115发酵罐，接种密度为50万/ml，培养条件为37℃、80～110rpm、DO30%～50%、pH7.2。该过程中所用的培养基为VP-SFMAGT^TM(Gibco公司)，添加0.2%Pluronic F-68以及30μg/ml硫酸葡聚糖。

2、生物反应器培养过程中，在接种后18h、24h、42h、48h、66h、72h、90h、96h、114h几个点取样计细胞数，待细胞活率降至50%以下时，停止取样，细胞密度见表1。悬浮细胞与贴壁细胞生长曲线对比见图1。

表1细胞密度

5、细胞在方瓶培养时，所用生长液组成为MEM(Gibco)、NaHCO₃2.2g/L、PAA胎牛血清5%、青链霉素1%。取12个25T细胞培养瓶，每瓶接种20万/ml，5ml培养体积，接种后，每隔24h取3支培养瓶消化计数，连续计数4d，然后绘制生长曲线。细胞密度

见表2；悬浮细胞与贴壁细胞生长曲线对比见附图1。

表2：贴壁细胞生长密度

实施例3.无血清纯悬浮培养繁殖禽流感H9亚型

1、生物反应器培养细胞，培养方法同实施例1；

2、当细胞在发酵罐中密度达到接种禽流感病毒的要求后，接种病毒，按照MOI=0.001-0.1的接种剂量加入病毒液，另外由于TPCK-胰酶对流感病毒的增殖有很大影响，所以接种病毒后添加1.0～5.0μg/ml。培养条件为33℃、80～110rpm、DO30～50%、pH7.20；

3、由于悬浮细胞无法观察细胞病变，所以接种后每隔:12h取样，监测细胞数目及HA测定病毒的含量，找到病毒血凝价的一个极值，在病毒血凝价最高时收获病毒液，经过滤去除细胞碎片，制得病毒液，-20℃保存备用。其病毒液收获量为1.2L，HA价大于12.0。

4、首先取一板96孔血凝板，每孔加入50μl生理盐水，然后再在第1孔内加入50μl病毒液，混匀后，吸取50μl到第2孔，以此类推，最后1孔弃去50μl，同时设定一个阳性对照，最后分别在每孔加入50μl制备好的鸡红细胞，37℃放置15min观察结果。

5、与贴壁前相比，病毒的血凝价得到很大的提高，具体数据见图2。

实施例4.无血清纯悬浮培养繁殖的禽流感H9亚型疫苗的制备及检验

1、将血凝价≥10的病毒液灭活，加入甲醛的量为0.1%，振摇2min，置2～8℃灭活5～10d，期间每隔4～5h振摇一次。

2、半成品检验

（a）无菌检验：按照《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》附录301页进行，无菌生长。

（b）灭活检验：灭活后，无菌从每瓶病毒灭活液中取样，经尿囊腔途径接种10日龄SPF鸡胚5枚，0.1ml/胚，37℃孵化，每天照检，120h内应无死亡，若有死亡，尿囊液无血凝价。

3、油佐剂灭活疫苗的配制

油相制备按注射用白油（见《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》附录343页）96份、司本-804份和硬脂酸铝2份的比例配制油相。

取硬脂酸铝，用少量注射用白油混合，加热融化至半透明状，再与圈梁司本-80及剩余注射用白油混合均匀，经121℃灭菌15min，冷却至室温，备用。

水相制备取经检验合格的H9亚型禽流感病毒灭活液，按病毒液的 4%加入吐温-80乳化1min。

灭活疫苗的制备：水相和油相按照1:3的体积比进行乳化，10000r/min乳化3～5min。

4、成品检验

4.1性状

（a）外观：乳白色乳液状。

（b）剂型：油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，除第1滴外，均不扩散。

（c）稳定性：37℃保存21日或以3000rpm离心15min，未破乳。

（d）黏度：按《中国兽药典》附录28页进行，符合规定。

4.2装量检查按《中国兽药典》附录53页进行，符合规定。

4.3无菌检验按《中国兽药典》附录42页进行，无菌生长。

4.4安全检验用4～5周龄SPF鸡6只，各肌肉注射疫苗1.0ml，观察14日。全部健活，且无因疫苗注射引起的全身反应和严重的局部反应。

4.5效力检验用用7～10日龄SPF鸡15只，其中10只鸡每只肌肉或颈部皮下注射疫苗0.2ml，5只不接种，作为空白对照。接种21日后，采血分离血清，用禽流感病毒（H9亚型）抗原测定HI抗体。对照鸡HI效价≤1:4，免疫鸡HI抗体效价的几何平均值≥1:64。

4.5甲醛和汞类防腐剂残留量测定分别按照《中国兽药典》附录20和10页进行，符合规定。

由实施例可见，本发明具有以下优点：

1.将MDCK细胞由贴壁静止培养驯化为单细胞纯悬浮培养，在生物反应器培养时细胞密度可以达到800万/ml,用此细胞系生产流感病毒制备流感病毒疫苗，病毒血凝价为1:1024，病毒含量为10^8.5TCID₅₀,不仅缩短了生产周期，增加了产量，而且获得的疫苗质量稳定均一。

2.在培养过程中使用无血清培养基，节省了血清的消耗，一方面降低了外源污染的风险，另一方面也减少了动物的应激反映，使得疫苗的安全性提高。

3.纯悬浮培养易于实现规模化生产，运用到大生产中简化了生产工艺，减少了人力、物力的投入，降低了成本。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种制备无血清培养的悬浮哺乳动物细胞系的方法，所述方法包括：

（1）复苏并培养哺乳动物细胞，得到贴壁培养的所述哺乳动物细胞，用胰酶消化；

（2）用添加了一定量血清的无血清培养基培养所述贴壁培养的哺乳动物细胞，连续培养所述哺乳动物细胞至适应所述添加了一定量血清的无血清培养基；以及

（3）重复步骤（2）中的所述连续培育程序，逐渐降低所述无血清培养基中的血清添加量，直到所述无血清培养基中血清添加量为0，得到所述悬浮培养的哺乳动物细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤（1）中的哺乳动物为MDCK细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤（2）和（3）中的所述无血清培养基包括VP-SFM AGT^TM、MDCK细胞无血清无蛋白化学培养基、InVitrus^TM、或SFM4MegaVir^TM培养基以及在所述步骤（3）中当血清添加量为1%及以下时，所述无血清培养基还包括添加成分Pluronic F-68和硫酸葡聚糖。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤（2）中所述血清添加量为5%；所述步骤（3）中所述逐渐降低的血清添加量分别为3%、1%、0.5%、0%。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤（2）和（3）中的连续培养所述哺乳动物细胞至适应所述添加了一定量血清的无血清培养基的程序为连续培养3～5代。

6.根据权利要求1～5任一项所述方法制备的所述悬浮培养的哺乳动物细胞系。

7.一种制备流感病毒疫苗的方法，所述方法包括，

（1）用所述无血清培养基扩增培养权利要求6所述的悬浮培养的哺乳动物细胞；

（2）在所述步骤（1）中培养的所述悬浮培养的哺乳动物细胞中接种所述流感病毒，扩增培养所述流感病毒；以及

（3）收获所述流感病毒，灭活。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述无血清培养基包括VP-SFM AGT^TM、MDCK细胞无血清无蛋白化学培养基、InVitrus^TM、或SFM4MegaVir^TM培养基以及所述无血清培养基中的添加成分PluronicF-68和硫酸葡聚糖。

9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述流感病毒为禽流感病毒、猪流感病毒。

10.根据权利要求7～9任一项所述方法制备的流感病毒疫苗。