CN102127524B - 细胞载体生物反应器大量繁殖禽流感病毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了了一种在置于生物反应器内的微载体吸附生长的传代细胞中复制繁殖禽流感病毒的方法。本发明建立以细胞为载体的在生物反应器培养繁殖病毒的方法，所得的禽流感病毒以及禽流感疫苗产品质量均一，毒力稳定，可实现疫苗生产的自动化控制，解决大规模生产应用的重大难题，彻底改变我国现行的流感疫苗生产基质，改变传统的鸡胚培养病毒的工艺，减少了由于鸡胚造成的外源因子污染，病毒污染的问题，因鸡胚等异源蛋白而造成的干扰，提高制得疫苗的纯度、安全性和免疫效果，在预防禽流感发生中可起到重要的作用。
Description
技术领域
本发明属于生物领域，特别是一种以微载体培养细胞在生物反应器中大量繁殖病毒工艺。
背景技术
我国富源辽阔，农业占我国的总产值的70％，养殖业是我国农民的经济来源的重要部分。伴随着禽流行性感冒的发生和造成禽类的大面积死亡，我国的预防疫苗的生产远远不能满足现有的养殖业的市场需要，而且有的些疫苗效果不好更加重了疫苗产业困境局面。因此加大力度进行疫苗的研制，是当前疫情的需要，是发展我国国民经济的需要。
目前禽流感疫苗的病毒来源均来自于鸡胚培养，其方法为：流感病毒接种于9-10日龄鸡胚尿囊腔中，1-2d后冷胚收获尿囊液，用福尔马林处理，灭活试验和无菌试验合格后，得到病毒原液，用于制备疫苗。由于其来源于鸡胚培养，受到疫苗的有效性和鸡胚抗体的影响，制备的疫苗病毒效价低，预防免疫效果不佳，甚至免疫失败，导致大规模的禽流感流行。
传统疫苗的生产，选用蛋胚进行流感疫苗的生产，蛋胚抗性干扰严重，产品质量和产量受到严重的制约。
我国的生物制品工业生产各类疫苗采用原代动物细胞较多，而传代细胞应用较少，到目前为止仍未见禽流感病毒采用细胞载体进行大规模疫苗生产的报道和应用。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种细胞载体生物反应器大量繁殖禽流感病毒的方法，其提高了疫苗的纯度和安全性。
本发明的目的是这样实现的：一种细胞载体生物反应器制备禽流感病毒的方法，其特征在于：所述的禽流感病毒在置于生物反应器内的微载体吸附生长的传代细胞中复制繁殖。
所述的禽流感病毒是H9N2型禽流感病毒。
所述的传代细胞为MDCK细胞。
所述的微载体采用Cytodex1。
由上述工艺方法得到的禽流感病毒，其病毒血凝效价达到212。
由上述禽流感病毒制得的禽流感疫苗。
本发明建立以细胞为载体的在生物反应器培养繁殖病毒的方法，所得的禽流感病毒以及禽流感疫苗产品质量均一，毒力稳定，可实现疫苗生产的自动化控制，解决大规模生产应用的重大难题，彻底改变我国现行的流感疫苗生产基质，改变传统的鸡胚培养病毒的工艺，减少了由于鸡胚造成的外源因子污染，病毒污染的问题，因鸡胚等异源蛋白而造成的干扰，提高疫苗的纯度和安全性。
附图说明
图1是应用本发明的方法，于光学显微镜下微载体上生长的MDCK细胞感染驯化禽流感病毒48小时后的情况；
图2是应用本发明的方法，生物反应器微载体培养的禽流感疫苗抗原与抗禽流感疫苗抗体免疫扩散试验结果：中心孔为抗体，倍比稀释的浓缩纯化禽流感疫苗加入周围孔，置于湿盒25℃保温24小时，观察抗原抗体产生的白色沉淀线结果可见，纯化疫苗1∶2倍，1∶4倍，1∶8倍稀释免疫扩散呈阳性反应；
图3是应用本发明的方法所得禽流感疫苗的血凝效价滴度结果。
具体实施方式
本发明是一种细胞载体生物反应器制备禽流感病毒的方法，所述的禽流感病毒在传代细胞中复制繁殖，该传代细胞置于生物反应器内的微载体吸附生长。其中，禽流感病毒采用的是H9N2型禽流感病毒，传代细胞采用的是MDCK细胞，微载体采用Cytodex1。
由上述工艺方法得到的禽流感病毒，其病毒血凝效价达到212。符合制备疫苗的要求标准，可按常规工艺制备的禽流感疫苗。可应用于生物反应器大规模，自动化，稳定生产病毒，从而制备禽流感疫苗。
本发明中采用传代细胞复制繁殖禽流感病毒，进行细胞载体的自动化生产，对疫苗生产的发展、产业化、提高产品质量、产品批量均质稳定有效等具有重要意义。
以下通过具体的实施例子对本发明做进一步的阐述，但本发明并不限于此特定例子。
实施例
使用试剂：MDCK细胞购自ATCC库，微载体Cytodex1购自Pharmacia Biotech AB Uppsala Sweden公司(批号：223429)。
每克Cytodex1(干粉)溶胀后，表面积为4400cm2，微载体用量为5-10g/L。反应器中的细胞密度＝4400×10×166666/1000＝7.3×106个/ml。接种MDCK细胞密度就是6.6×106个/ml。H9N2型禽流感病毒用含有0.025浓度胰酶DMEN培养基进行1∶1000倍稀释后接种到细胞中，吸附1小时后，加入无血清DMEN培养基培养，细胞接种病毒后分别于24小时，36小时收毒，以50％换液量收获病毒液，48小时全部收获病毒液，停止生物反应器培养。培养参数：搅拌速度40转/min：细胞生长期溶氧达到±50％，细胞表达期溶氧±40％。通气量：5L反应器的通气量可以达到1L/min并且无气泡产生。pH控制在7.2。
收取病毒感染细胞放置-20℃冰箱冻融三次，收取上清放置-20℃保存，检测血凝效价，光学显微镜下微载体上生长的MDCK细胞感染禽流感病毒48小时，细胞有明显的病变产生，细胞开始融合，细胞膜界限不清，有病毒感染复制出现，如图1所示。按常规方法检测血凝效价和病毒毒力测定，将病毒液加入1/1000甲醛灭活，浓缩纯化采用琼脂扩散方法检测抗原性。单向琼脂扩散方法检测抗原方法，溶化琼脂糖，在水平桌上将溶化的琼脂糖倒在预复琼脂玻板上，制成厚度约3～4mm厚的琼脂糖凝胶板，待冷却后打园型孔，将抗体加入中心孔，倍比稀释的浓缩纯化病毒加入周围孔，置于湿盒25℃保温24小时，观察抗原抗体产生的白色沉淀线，以此鉴定培养的禽流感病毒的抗原特异性。结果见图2：中心孔为抗体，倍比稀释的浓缩纯化病毒加入周围孔，置于湿盒25℃保温24小时，观察抗原抗体产生的白色沉淀线结果可见，病毒1∶2倍，1∶4倍，1∶8倍稀释免疫扩散呈阳性反应。从抗原性实验的结果证实获得的病毒具有非常好的病毒抗原性，对于制备疫苗具有明确的物质基础。
经过鉴定后，证实本实验繁殖的病毒为禽流感病毒的专署性和抗原的正确性后，用于制备禽流感疫苗。应用上述病毒制得疫苗的血凝效价滴度结果如图3所示，图中1-5号为培养病毒血凝效价，6号为阴性对照，7号为病毒阳性对照，培养病毒血凝效价为212。
在本发明中，禽流感病毒可以进行MDCK细胞中生长，并在生物反应器中以微载体为贴壁物生产稳定毒力的病毒。使用本病毒，按常规制备工艺可有效的生产禽流感疫苗。
Claims (2)
1.一种细胞载体生物反应器制备禽流感病毒的方法，其特征在于：所述的禽流感病毒在置于生物反应器内的微载体吸附生长的传代细胞中复制繁殖，其中所述的禽流感病毒是H9N2型禽流感病毒，所述的传代细胞为MDCK细胞，所述的微载体采用Cytodex1；繁殖所得的禽流感病毒，可在MDCK细胞中生长其病毒血凝效价达到212。
2.一种禽流感疫苗，其特征在于：由权利要求1所述方法制得的禽流感病毒制备而成。
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