发明内容
本发明目的是在于提供了一种生物反应器大规模培养的方法,方法易行,操作简便,适应后病毒HA效价>27;该病毒从方瓶、转瓶培养工艺快速转换到操作简单的固定床篮式搅拌系统反应器的大规模培养,其HA效价可以达到211,解决了目前重组H5N1禽流感病毒在MDCK细胞上培养病毒滴度不能满足疫苗生产的难题。
为了实现上述的目的,本发明采用以下技术方案:
一种生物反应器大规模培养的方法(一种重组H5N1型禽流感病毒在MDCK细胞上的快速适应方法和该适应病毒的生物反应器大规模培养工艺),其步骤是:
(1)重组H5N1禽流感病毒在MDCK细胞(见遗传资源表)上的快速适应,所述的步骤(1)病毒36.5-37.5℃吸附1-2小时,去除病毒液,病毒稀释液清洗MDCK细胞2-4次后更换细胞维持液,取血凝效价>24且病毒稀释倍数最高的病毒液或者致细胞最晚产生病变的最高稀释倍数病毒作为种子病毒继续适应;病毒在5代以内适应MDCK细胞,且病毒血凝效价>27。
(2)经过步骤(1)适应MDCK细胞内增殖的重组H5亚型禽流感病毒作为反应器大规模培养的种子病毒,所述的步骤(2)种子病毒代次≥F6;血凝效价≥28;EID50≥107.5。所述病毒稀释液为含TPCK-胰酶1.0-1.5ug/ml的高糖DMEM;病毒维持液为含TPCK-胰酶0.5-1ug/ml高糖DMEM。
(3)以聚酯片为载体培养MDCK细胞,所述的步骤(3)以聚酯片为载体,反应器为篮式固定床,30-50g/L载体投放量,每克载体投放0.5-4.5*107个细胞;完全培养基为含8-10%(体积比)新生牛血清DMEM;细胞20分钟内贴壁,此阶段搅拌转速45r/min,DO为60%,温度为36-38℃,pH为7.0-7.3,通气量为0.1SLPM;细胞培养阶段依据细胞耗氧,搅拌转速控制50-120r/ml,通气量0.1-0.5SLPM,pH7.2,反应器中糖浓度1.8-2.2g/L,调整灌流速度为5-40ml/min;细胞培养50-70小时生长至平台期,此时平均每200g载体上的 细胞糖耗为1.7-2.5g/h(具体见附图1)。
(4)上述步骤(3)培养的MDCK细胞接种病毒,所述的步骤(4)反应器培养MDCK细胞接种病毒时,PBS清洗细胞2-4次,病毒稀释液清洗细胞1-2次,病毒接种MOI为0.01-0.00001;病毒吸附过程中TPCK-胰酶浓度1.0-1.5ug/ml,温度36.5-37.5℃,搅拌转速40-60r/min,DO为60%,pH为7.6,病毒吸附2小时;病毒培养阶段细胞维持和病毒培养温度为33-35℃,搅拌转速60-120r/min,通气量为0.2-0.6SLPM,4-6小时后更换细胞维持液。
(5)MDCK细胞维持和病毒增殖,所述的步骤(5)病毒培养阶段细胞维持和病毒培养温度为33-35℃,搅拌转速60-120r/min,通气量为0.2-0.6SLPM,4-6小时后更换细胞维持液;灌流培养速度为10-50ml/min,糖浓度保持2.0-2.8g/L。所述病毒稀释液为含TPCK-胰酶1.0-1.5ug/ml的高糖DMEM;病毒维持液为含TPCK-胰酶0.5-1ug/ml高糖DMEM。
(6)监测血凝效价收获病毒,所述的步骤(6)病毒血凝效价最高为211,可以收获7.5-9个反应器培养体积病毒液,其中4.5-5个反应器培养体积病毒液血凝效价大于29;另外3-4个反应器培养体积病毒液血凝效价27-8。
本发明提供最系统的重组H5N1禽流感病毒的生物反应器大规模培养,该方法从重组H5N1禽流感病毒在细胞适应到反应器规模培养具有以下优点和效果:
①与传统的H5N1流感病毒在MDCK细胞上方法相比较,本发明提供以六孔板梯度适应方法操作简单,工作量小;病毒在5代以内能够适应MDCK细胞并且稳定的增殖,其HA效价大于27;该方法易于标准化,适用于所有的H5亚型流感病毒。
②本发明提供的聚酯片为载体,运用固定床生物反应器大规模培养MDCK细胞,增殖H5亚型流感病毒,只需要每克载体投放0.5-4.5*107个细胞,细胞增殖增殖快速,接毒工艺简单,易于工业化大规模操作。
③本发明提供的方法病毒效价高、产量大,可以提供4.5-5个反应器培养体积的病毒液,其血凝效价大于29;该病毒免疫原性好,抗体水平维持时间长,在该病毒液制备疫苗免疫SPF鸡后14天HI效价即可达到25.5,28天可以达到28.5。第11周时抗体仍在27以上。
具体实施方式
实施例1:重组H5N1禽流感病毒毒株rC4/W1株快速适应MDCK细胞
rC4/W1株(见遗传资源表):该病毒是全禽源性H5亚型禽流感病毒,保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏编号为:CCTCC NO:V201029,其快速适应MDCK细胞步骤如下:
1)取1个MDCK细胞长成致密单层的T75细胞瓶,细胞消化后平均铺入3个6孔细胞培养板。
2)将鸡胚尿囊液毒液以10倍倍比稀释至10-6。
3)取10-3、10-4、10-5、10-6各稀释度毒液200ul,并用细胞维持液补充至3ml,分别加入长满MDCK细胞单层的6孔板中,每个稀释浓度做一个重复,取200ul稀释液用细胞维持液补充至3ml,加入长满MDCK细胞单层的作为阴性对照。
4)在37℃条件下,病毒吸附1.5小时后去除病毒液,以病毒稀释液清洗MDCK细胞3次后,每孔加入细胞维持液3ml,24小时后每6个小时观测细胞病变,测HA效价,48小时后每3个小时观测细胞病变,测HA效价,接毒84小时后6孔板于-80℃冻融一次,均未检测到HA效价,但是10-3、10-4分别在36-48小时和55-65小时出现了典型流感病毒导致脱落型的细胞病变。
5)以65小时收获的10-4稀释度病毒为F0代继续在MDCK细胞上适应培养。
6)取FO代病毒重复步骤1、2,取10-1、10-2、10-3、10-4、按照步骤3、4操作,在48小时10-2接种孔MDCK细胞出现病变,在60小时10-3、10-4稀释度接种孔出现明显的病变,测HA效价发现10-3稀释度效价最高可以达到27-8,其他的稀释度液均达到26左右(见表1),以60小时收获的10-4病毒为F1代病毒,按照步骤3、4操作继续在MDCK细胞上适应培养。
7)按照上述方法连续传至F4代,接种10-4、10-5稀释度病毒的MDCK细胞在36-52小时出现典型病变,HA效价>27。
表1:rC4/W1株F0-F4代在MDCK细胞适应增殖表
实施例2:重组H5N1禽流感病毒毒株XN/PR8(见遗传资源表)快速适应MDCK细胞
1)取1个MDCK细胞长成致密单层的T75细胞瓶,细胞消化后平均铺入3个6孔细胞培养板。
2)将鸡胚尿囊液毒液以10倍倍比稀释至10-8。
3)取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8各稀释度毒液200ul,并用细胞维持液补充至3ml,分别加入长满MDCK细胞单层的6孔板中,每个稀释浓度做一个重复,取200ul稀释液用细胞维持液补充至3ml,加入长满MDCK细胞单层的作为阴性对照。
4)在37℃条件下,病毒吸附1.5小时后去除病毒液,以病毒稀释液清洗MDCK细胞3次后,每孔加入细胞维持液3ml,24小时后每6个小时观测细胞病变,测HA效价,35小时后每3个小时观测细胞病变,测HA效价,10-4、10-5、10-6、分别在55-66小时出现了典型流感病毒导致脱落型的细胞病变,HA效价分别为7、8、8。
5)以66小时收获的10-6稀释度病毒为F0代继续在MDCK细胞上适应培养。
6)取FO代病毒重复步骤1、2,取10-4、10-5、10-6、10-7、按照步骤3、4操作,在48-65小时MDCK细胞出现病变,10-4、10-5测HA效价发现10-3稀释度效价最高可以达到29-10,10-6稀释度液达到25左右(见表2),以60小时收获的10-6病毒为F1代病毒,继续在MDCK细胞上适应培养如下表所示选取10-7稀释度60小时收获病毒为F2代种毒继续培养;选取10-7稀释度65小时收获病毒为F3代种毒继续 培养。
7)按照上述方法连续传至F3代,病毒HA效价可以达到29-10。
表2:XN/PR8株F0-F3代在MDCK细胞适应增殖表
实施例3:重组H5N1禽流感病毒毒株XN/W1快速适应MDCK细胞
XN/W1株(见遗传资源表)属于全禽源性H5亚型禽流感病毒,其快速适应MDCK细胞步骤如下:
1)取1个MDCK细胞长成致密单层的T75细胞瓶,细胞消化后平均铺入3个6孔细胞培养板。
2)将鸡胚尿囊液毒液以10倍倍比稀释至10-6。
3)取10-3、10-4、10-5、10-6各稀释度毒液200ul,并用细胞维持液补充至3ml,分别加入长满MDCK细胞单层的6孔板中,每个稀释浓度做一个重复,取200ul稀释液用细胞维持液补充至3ml,加入长满MDCK细胞单层的作为阴性对照。
4)在37℃条件下,病毒吸附1.5小时后去除病毒液,以病毒稀释液清洗MDCK细胞3次后,每孔加入细胞维持液3ml,24小时后每6个小时观测细胞病变,测HA效价,48小时后每3个小时观测细胞病变,测HA效价,接毒84小时后6孔板于-80℃冻融一次,均未检测到HA效价,但是10-3、10-4分别在36-48小时和55-65小时出现了典型流感病毒导致脱落型的细胞病变。
5)以65小时收获的10-4稀释度病毒为F0代继续在MDCK细胞上适应培养。
6)取FO代病毒重复步骤1、2,取10-1、10-2、10-3、10-4、按照步骤3、4操作,在58小时10-2接种孔MDCK细胞出现病变,在66小时10-3稀释度接种孔出现明显的病变,测HA效价发现10-3稀释度效价最高可以达到25(见表3),以66小时收获 的10-3病毒为F1代病毒,按照步骤3、4操作继续在MDCK细胞上适应培养。
7)按照上述方法连续传至F4代,接种10-4、10-5稀释度病毒的MDCK细胞在36-52小时出现典型病变,HA效价>27。
表3:XN/W1株F0-F4代在MDCK细胞适应增殖表
实施例4:NBS FibraCel Discs为载体灌流培养方式在固定床篮式搅拌系统7.5L反应器大规模培养MDCK细胞
1)反应器的准备:
取30-50g载体/L新载体(或经NaOH处理的,蒸馏水清洗的旧载体)置于反应器中一起灭菌后,向反应器中加入8%(体积比)新生牛血清的DMEM培养基至5L,使温度稳定至37℃,搅拌转速为45r/min,DO为60%,pH为7.0-7.3。
2)种子细胞准备:
取3-5个长满单层MDCK细胞的10L转瓶,以0.25%(质量体积比)EDTA-胰酶消化后,以15%(体积比)新生牛血清的DMEM 500ml重悬细胞,细胞成单个分布,以压力把细胞注入反应器中,细胞20分钟内贴壁。
3)细胞生长曲线:
每6小时测糖耗,大约24小时反应器糖浓度达到细胞生长所需要的极限值,依据糖耗设定灌流,并且随时调节灌流速度,以保证细胞生长所需要的营养。从细胞糖耗曲线(见图1)可以看出细胞糖耗在50小时左右达到平台期,表明此时细胞已经长满整个片状载体,7 0小时以内细胞处于高活力状态,为病毒接种最佳时间。
4)病毒接种:
将病毒以MOI0.01-0.00001接种MDCK细胞,确保病毒吸附过程中病毒维持液中TPCK-胰酶浓度为1.0-1.5ug/ml,pH为7.6,温度36.5-37℃,DO为60%,通气量<0.2SLPM,病毒吸附2小时后,调节培养温度至33-35℃,6小时以后更换维持液(TPCK-胰酶浓度0.8ug/ml),每6小时测糖含量,调整培养过程中的灌流速度,确保维持液中糖浓度>2.5g/L。24小时以后每隔3小时测HA效价,结果如图2所示:大约29小时HA效价为28,33小时HA效价到达29,38小时HA效价到达211,39-49小时HA效价维持在29-10,56小时以后HA效价才降至28。整个过程中收获30LHA效价>29的病毒液。
实施例5:病毒免疫效力评价
1)细胞毒的灭活及乳化
反应器生产病毒(HA效价为29)经甲醛溶液灭活,将灭活的病毒与白油按照2:1的体积比进行乳化,制备成油佐剂灭活疫苗。
2)免疫实验
取10只3-4周龄的SPF鸡,每只鸡经肌肉注射0.3ml疫苗,免疫后以一定间隔定期采血测抗体效价,共检测4个月。
3)抗体消长规律
见图2.在免疫后抗体水平在该病毒液制备疫苗免疫SPF鸡后14天HI效价即可达到25.5,28天可以达到28.5。第11周时抗体仍在27以上。