CN108310374A - 一种禽流感病毒灭活疫苗的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种禽流感病毒灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：禽流感病毒细胞置于30‑40摄氏度的密封容器内，并向其中通入60‑80%含量的氧气，观察新生细胞的病变程度，提取新生细胞的病变样本，将储存的新生细胞再次置于密封的容器内，并向其中置于反应酶，形成禽流感病毒蛋白，再次向其中添加复合佐剂，采集样本，将检测无菌样本进行超声破碎，再次离心后，收集上清液，即得到禽流感病毒灭活疫苗本发明能够对病毒储放的温度实时监控，并严格控制其的存放温度，自动化控制程度高，能够增加疫苗的形成速率，该疫苗能够有效预防禽流感，适合大范围推广。

Description

一种禽流感病毒灭活疫苗的制备方法
技术领域
本发明涉及禽流感疫苗制备技术领域，尤其涉及一种禽流感病毒灭活疫苗的制备方法。
背景技术
禽流感，全名鸟禽类流行性感冒，是由病毒引起的动物传染病，通常只感染鸟类，少见情况会感染猪。禽流感病毒高度针对特定物种，但在罕有情况下会跨越物种障碍感染人。自从1997年在香港发现人类也会感染禽流感之后，此病症引起全世界卫生组织的高度关注。2013年3月31日，我国上海市和安徽省发现3例人感染H7N9禽流感病例，其中两个抢救无效死亡。这也是全球首次发现的新亚型流感病毒，目前国内外都没有针对H7N9禽流感病毒的疫苗。随着禽流感发生的普遍性，对疫苗的研制也显得至关重要，为此，我们提出了一种禽流感病毒灭活疫苗的制备方法。
发明内容
本发明提出了一种禽流感病毒灭活疫苗的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
本发明提出了一种禽流感病毒灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：
S1：选取含有禽流感病毒细胞，并将其保存在零下10-零下4摄氏度的无菌条件下，且储存需在真空条件下，备用；
S2：将S1中保存的禽流感病毒细胞置于30-40摄氏度的密封容器内，并向其中通入60-80%含量的氧气，使其快速繁衍，并产生出新生细胞，再次将新生细胞移动至培养基中静置，且保证培养基内的温度始终处在15-25摄氏度，并对其进行静置200-240min，此过程，需在无菌条件下进行，以避免细菌与新生细胞发生变异，从而产生不必要的影响；
S3：观察新生细胞的病变程度，待新生细胞病变达到一半以上时，缓慢去除培养基，且确保培养基清除干净，并迅速将新生细胞存放环境的温度降低至零下15-零下12摄氏度；
S4：提取S3中的新生细胞的病变样本，将样本温度升高至15-25摄氏度，并对其内部组织形态进行观察，从而判断其是否能够再次进行反应，若是达到要求，备用；
S5：将S3中储存的新生细胞再次置于密封的容器内，并向其中置于反应酶，并在30-45摄氏度的条件下进行反应，待反应酶完全被新生细胞侵入后，形成禽流感病毒蛋白，然后将其放置在5-15摄氏度的无菌环境中，备用；
S6：待S5中的禽流感病毒蛋白放置3-6h后，再次向其中添加复合佐剂，并再次将温度升高至20-30摄氏度，待其反应30-45min后，形成混合液，将混合液离心处理，去掉上清，然后将其存放在零下30-零下20摄氏度的无菌环境下；
S7：采集样本，将检测无菌样本进行超声破碎，再次离心后，收集上清液，即得到禽流感病毒灭活疫苗。
优选的，在S2中的氧气内需含有氮气、氢气以及氖气，且氧气、氮气、氢气以及氖气的摩尔质量比为10：2：0.5：0.5。
优选的，所述的培养基的选择需为新鲜的肉类，且培养基具体为鸡肉、鸭肉、鹅肉中一种或者是多种混合物。
优选的，在S5中的反应酶具体为胰酶、谷氨酰胺合成酶、DNA连接酶中的一种或者是多种混合物。
本发明还提供了一种复合佐剂，其特征在于，其原料按重量的配方如下：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸20-35份、氢氧化锌胶体10-16份、透明质酸10-16份、氢氧化铝佐剂3-6份、氨基转移酶1-4份。
本发明还提供了一种复合佐剂的制备工艺，具体步骤如下：
选取搅拌器，并将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、氢氧化锌胶体、透明质酸以及氢氧化铝佐剂置入搅拌器内，在100-120摄氏度的条件下进行混合搅拌，在搅拌15-20min后，再次向其中添加氨基转移酶，待其混合均匀后，静置80-110min后，再次进行混合搅拌5-8min,完成后取出，待其温度恢复至常温后，再次进行浓缩处理，完成后，即得到复合佐剂。
本发明提出的一种禽流感病毒灭活疫苗的制备方法，有益效果在于：该禽流感病毒灭活疫苗的制备方法能够根据该病毒的需求进行细胞的高密度培养，从而形成疫苗，本发明能够对病毒储放的温度实时监控，并严格控制其的存放温度，自动化控制程度高，生产可实时监控，保证了产品质量的均一、稳定，使其与反应酶以及复合佐剂反应，能够增加疫苗的形成速率，该疫苗能够有效预防禽流感，适合大范围推广。
具体实施方式
下面结合具体实施例来对本发明做进一步说明。
实施例1
本发明提出了一种禽流感病毒灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：
S1：选取含有禽流感病毒细胞，并将其保存在零下10摄氏度的无菌条件下，且储存需在真空条件下，备用；
S2：将S1中保存的禽流感病毒细胞置于30摄氏度的密封容器内，并向其中通入60%含量的氧气，使其快速繁衍，并产生出新生细胞，再次将新生细胞移动至培养基中静置，且保证培养基内的温度始终处在15摄氏度，并对其进行静置200min，此过程，需在无菌条件下进行，以避免细菌与新生细胞发生变异，从而产生不必要的影响；
S3：观察新生细胞的病变程度，待新生细胞病变达到一半以上时，缓慢去除培养基，且确保培养基清除干净，并迅速将新生细胞存放环境的温度降低至零下15摄氏度；
S4：提取S3中的新生细胞的病变样本，将样本温度升高至15摄氏度，并对其内部组织形态进行观察，从而判断其是否能够再次进行反应，若是达到要求，备用；
S5：将S3中储存的新生细胞再次置于密封的容器内，并向其中置于反应酶，并在30摄氏度的条件下进行反应，待反应酶完全被新生细胞侵入后，形成禽流感病毒蛋白，然后将其放置在5摄氏度的无菌环境中，备用；
S6：待S5中的禽流感病毒蛋白放置3h后，再次向其中添加复合佐剂，并再次将温度升高至20摄氏度，待其反应30min后，形成混合液，将混合液离心处理，去掉上清，然后将其存放在零下30摄氏度的无菌环境下；
S7：采集样本，将检测无菌样本进行超声破碎，再次离心后，收集上清液，即得到禽流感病毒灭活疫苗。
在S2中的氧气内需含有氮气、氢气以及氖气，且氧气、氮气、氢气以及氖气的摩尔质量比为10：2：0.5：0.5。
所述的培养基的选择需为新鲜的肉类，且培养基具体为鸡肉、鸭肉、鹅肉中一种或者是多种混合物。
在S5中的反应酶具体为胰酶、谷氨酰胺合成酶、DNA连接酶中的一种或者是多种混合物。
本发明还提供了一种复合佐剂，其特征在于，其原料按重量的配方如下：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸20份、氢氧化锌胶体10份、透明质酸10份、氢氧化铝佐剂3份、氨基转移酶1份。
本发明还提供了一种复合佐剂的制备工艺，具体步骤如下：
选取搅拌器，并将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、氢氧化锌胶体、透明质酸以及氢氧化铝佐剂置入搅拌器内，在100摄氏度的条件下进行混合搅拌，在搅拌15min后，再次向其中添加氨基转移酶，待其混合均匀后，静置80min后，再次进行混合搅拌5min,完成后取出，待其温度恢复至常温后，再次进行浓缩处理，完成后，即得到复合佐剂。
实施例2
本发明提出了一种禽流感病毒灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：
S1：选取含有禽流感病毒细胞，并将其保存在零下8摄氏度的无菌条件下，且储存需在真空条件下，备用；
S2：将S1中保存的禽流感病毒细胞置于33摄氏度的密封容器内，并向其中通入65%含量的氧气，使其快速繁衍，并产生出新生细胞，再次将新生细胞移动至培养基中静置，且保证培养基内的温度始终处在18摄氏度，并对其进行静置210min，此过程，需在无菌条件下进行，以避免细菌与新生细胞发生变异，从而产生不必要的影响；
S3：观察新生细胞的病变程度，待新生细胞病变达到一半以上时，缓慢去除培养基，且确保培养基清除干净，并迅速将新生细胞存放环境的温度降低至零下14摄氏度；
S4：提取S3中的新生细胞的病变样本，将样本温度升高至18摄氏度，并对其内部组织形态进行观察，从而判断其是否能够再次进行反应，若是达到要求，备用；
S5：将S3中储存的新生细胞再次置于密封的容器内，并向其中置于反应酶，并在35摄氏度的条件下进行反应，待反应酶完全被新生细胞侵入后，形成禽流感病毒蛋白，然后将其放置在8摄氏度的无菌环境中，备用；
S6：待S5中的禽流感病毒蛋白放置4h后，再次向其中添加复合佐剂，并再次将温度升高至23摄氏度，待其反应35min后，形成混合液，将混合液离心处理，去掉上清，然后将其存放在零下24摄氏度的无菌环境下；
S7：采集样本，将检测无菌样本进行超声破碎，再次离心后，收集上清液，即得到禽流感病毒灭活疫苗。
在S2中的氧气内需含有氮气、氢气以及氖气，且氧气、氮气、氢气以及氖气的摩尔质量比为10：2：0.5：0.5。
所述的培养基的选择需为新鲜的肉类，且培养基具体为鸡肉、鸭肉、鹅肉中一种或者是多种混合物。
在S5中的反应酶具体为胰酶、谷氨酰胺合成酶、DNA连接酶中的一种或者是多种混合物。
本发明还提供了一种复合佐剂，其特征在于，其原料按重量的配方如下：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸25份、氢氧化锌胶体12份、透明质酸12份、氢氧化铝佐剂4份、氨基转移酶2份。
本发明还提供了一种复合佐剂的制备工艺，具体步骤如下：
选取搅拌器，并将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、氢氧化锌胶体、透明质酸以及氢氧化铝佐剂置入搅拌器内，在105摄氏度的条件下进行混合搅拌，在搅拌16min后，再次向其中添加氨基转移酶，待其混合均匀后，静置90min后，再次进行混合搅拌6min,完成后取出，待其温度恢复至常温后，再次进行浓缩处理，完成后，即得到复合佐剂。
实施例3
本发明提出了一种禽流感病毒灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：
S1：选取含有禽流感病毒细胞，并将其保存在零下6摄氏度的无菌条件下，且储存需在真空条件下，备用；
S2：将S1中保存的禽流感病毒细胞置于37摄氏度的密封容器内，并向其中通入75%含量的氧气，使其快速繁衍，并产生出新生细胞，再次将新生细胞移动至培养基中静置，且保证培养基内的温度始终处在22摄氏度，并对其进行静置230min，此过程，需在无菌条件下进行，以避免细菌与新生细胞发生变异，从而产生不必要的影响；
S3：观察新生细胞的病变程度，待新生细胞病变达到一半以上时，缓慢去除培养基，且确保培养基清除干净，并迅速将新生细胞存放环境的温度降低至零下13摄氏度；
S4：提取S3中的新生细胞的病变样本，将样本温度升高至22摄氏度，并对其内部组织形态进行观察，从而判断其是否能够再次进行反应，若是达到要求，备用；
S5：将S3中储存的新生细胞再次置于密封的容器内，并向其中置于反应酶，并在40摄氏度的条件下进行反应，待反应酶完全被新生细胞侵入后，形成禽流感病毒蛋白，然后将其放置在12摄氏度的无菌环境中，备用；
S6：待S5中的禽流感病毒蛋白放置5h后，再次向其中添加复合佐剂，并再次将温度升高至27摄氏度，待其反应40min后，形成混合液，将混合液离心处理，去掉上清，然后将其存放在零下24摄氏度的无菌环境下；
S7：采集样本，将检测无菌样本进行超声破碎，再次离心后，收集上清液，即得到禽流感病毒灭活疫苗。
在S2中的氧气内需含有氮气、氢气以及氖气，且氧气、氮气、氢气以及氖气的摩尔质量比为10：2：0.5：0.5。
所述的培养基的选择需为新鲜的肉类，且培养基具体为鸡肉、鸭肉、鹅肉中一种或者是多种混合物。
在S5中的反应酶具体为胰酶、谷氨酰胺合成酶、DNA连接酶中的一种或者是多种混合物。
本发明还提供了一种复合佐剂，其特征在于，其原料按重量的配方如下：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸30份、氢氧化锌胶体14份、透明质酸14份、氢氧化铝佐剂5份、氨基转移酶3份。
本发明还提供了一种复合佐剂的制备工艺，具体步骤如下：
选取搅拌器，并将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、氢氧化锌胶体、透明质酸以及氢氧化铝佐剂置入搅拌器内，在115摄氏度的条件下进行混合搅拌，在搅拌18min后，再次向其中添加氨基转移酶，待其混合均匀后，静置100min后，再次进行混合搅拌7min,完成后取出，待其温度恢复至常温后，再次进行浓缩处理，完成后，即得到复合佐剂。
实施例4
本发明提出了一种禽流感病毒灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：
S1：选取含有禽流感病毒细胞，并将其保存在零下4摄氏度的无菌条件下，且储存需在真空条件下，备用；
S2：将S1中保存的禽流感病毒细胞置于40摄氏度的密封容器内，并向其中通入80%含量的氧气，使其快速繁衍，并产生出新生细胞，再次将新生细胞移动至培养基中静置，且保证培养基内的温度始终处在25摄氏度，并对其进行静置240min，此过程，需在无菌条件下进行，以避免细菌与新生细胞发生变异，从而产生不必要的影响；
S3：观察新生细胞的病变程度，待新生细胞病变达到一半以上时，缓慢去除培养基，且确保培养基清除干净，并迅速将新生细胞存放环境的温度降低至零下12摄氏度；
S4：提取S3中的新生细胞的病变样本，将样本温度升高至25摄氏度，并对其内部组织形态进行观察，从而判断其是否能够再次进行反应，若是达到要求，备用；
S5：将S3中储存的新生细胞再次置于密封的容器内，并向其中置于反应酶，并在45摄氏度的条件下进行反应，待反应酶完全被新生细胞侵入后，形成禽流感病毒蛋白，然后将其放置在15摄氏度的无菌环境中，备用；
S6：待S5中的禽流感病毒蛋白放置6h后，再次向其中添加复合佐剂，并再次将温度升高至30摄氏度，待其反应45min后，形成混合液，将混合液离心处理，去掉上清，然后将其存放在零下20摄氏度的无菌环境下；
S7：采集样本，将检测无菌样本进行超声破碎，再次离心后，收集上清液，即得到禽流感病毒灭活疫苗。
在S2中的氧气内需含有氮气、氢气以及氖气，且氧气、氮气、氢气以及氖气的摩尔质量比为10：2：0.5：0.5。
所述的培养基的选择需为新鲜的肉类，且培养基具体为鸡肉、鸭肉、鹅肉中一种或者是多种混合物。
在S5中的反应酶具体为胰酶、谷氨酰胺合成酶、DNA连接酶中的一种或者是多种混合物。
本发明还提供了一种复合佐剂，其特征在于，其原料按重量的配方如下：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸35份、氢氧化锌胶体16份、透明质酸16份、氢氧化铝佐剂6份、氨基转移酶4份。
本发明还提供了一种复合佐剂的制备工艺，具体步骤如下：
选取搅拌器，并将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、氢氧化锌胶体、透明质酸以及氢氧化铝佐剂置入搅拌器内，在120摄氏度的条件下进行混合搅拌，在搅拌20min后，再次向其中添加氨基转移酶，待其混合均匀后，静置110min后，再次进行混合搅拌8min,完成后取出，待其温度恢复至常温后，再次进行浓缩处理，完成后，即得到复合佐剂。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种禽流感病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：选取含有禽流感病毒细胞，并将其保存在零下10-零下4摄氏度的无菌条件下，且储存需在真空条件下，备用；
S2：将S1中保存的禽流感病毒细胞置于30-40摄氏度的密封容器内，并向其中通入60-80%含量的氧气，使其快速繁衍，并产生出新生细胞，再次将新生细胞移动至培养基中静置，且保证培养基内的温度始终处在15-25摄氏度，并对其进行静置200-240min，此过程，需在无菌条件下进行，以避免细菌与新生细胞发生变异，从而产生不必要的影响；
S3：观察新生细胞的病变程度，待新生细胞病变达到一半以上时，缓慢去除培养基，且确保培养基清除干净，并迅速将新生细胞存放环境的温度降低至零下15-零下12摄氏度；
S4：提取S3中的新生细胞的病变样本，将样本温度升高至15-25摄氏度，并对其内部组织形态进行观察，从而判断其是否能够再次进行反应，若是达到要求，备用；
S5：将S3中储存的新生细胞再次置于密封的容器内，并向其中置于反应酶，并在30-45摄氏度的条件下进行反应，待反应酶完全被新生细胞侵入后，形成禽流感病毒蛋白，然后将其放置在5-15摄氏度的无菌环境中，备用；
S6：待S5中的禽流感病毒蛋白放置3-6h后，再次向其中添加复合佐剂，并再次将温度升高至20-30摄氏度，待其反应30-45min后，形成混合液，将混合液离心处理，去掉上清，然后将其存放在零下30-零下20摄氏度的无菌环境下；
S7：采集样本，将检测无菌样本进行超声破碎，再次离心后，收集上清液，即得到禽流感病毒灭活疫苗。
2.根据权利要求1所述的一种禽流感病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于：在S2中的氧气内需含有氮气、氢气以及氖气，且氧气、氮气、氢气以及氖气的摩尔质量比为10：2：0.5：0.5。
3.根据权利要求1所述的一种禽流感病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述的培养基的选择需为新鲜的肉类，且培养基具体为鸡肉、鸭肉、鹅肉中一种或者是多种混合物。
4.根据权利要求1所述的一种禽流感病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于：在S5中的反应酶具体为胰酶、谷氨酰胺合成酶、DNA连接酶中的一种或者是多种混合物。
5.一种根据权利要求4所述的复合佐剂，其特征在于，其原料按重量的配方如下：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸20-35份、氢氧化锌胶体10-16份、透明质酸10-16份、氢氧化铝佐剂3-6份、氨基转移酶1-4份。
6.一种根据权利要求5所述的复合佐剂的制备工艺，其特征在于，具体步骤如下：
选取搅拌器，并将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、氢氧化锌胶体、透明质酸以及氢氧化铝佐剂置入搅拌器内，在100-120摄氏度的条件下进行混合搅拌，在搅拌15-20min后，再次向其中添加氨基转移酶，待其混合均匀后，静置80-110min后，再次进行混合搅拌5-8min,完成后取出，待其温度恢复至常温后，再次进行浓缩处理，完成后，即得到复合佐剂。
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