CN101818131A - 一种流感病毒疫苗的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种禽流感病毒以及其它流感病毒如猪流感，犬流感，马流感疫苗的生产方法，包括如下步骤：(1)制苗用细胞的传代与培养；(2)制苗用毒种的繁殖；(3)MDCK细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养；(4)制苗毒液的繁殖；(5)病毒液的收获。本发明可以大量降低生产成本，而且生产周期短，不会受制于原料供应，占用场地小，易于快速扩大生产规模，环境污染少且易于处理，自动化程度高，用人少，质量易于实现均衡稳定，显著提高疫苗产量和质量。

Description

一种流感病毒疫苗的生产方法

技术领域

本发明涉及一种应用生物反应器微载体细胞培养生产禽流感病毒以及其它流感病毒如猪流感，犬流感，马流感的流感疫苗的方法。可用于工业化生产禽流感病毒以及其它流感病毒如猪流感，犬流感，马流感的流感疫苗，替代传统的鸡胚培养法。

背景技术

目前，国内禽流感病毒以及其它流感病毒如猪流感，犬流感，马流感的流感疫苗生产唯一依靠鸡胚法实现。该传统工艺劳动强度大，耗时长、效率低，生产成本高；容易被环境污染；鸡胚不同批次间的差异大；难以扩大生产；鸡胚自身被细菌或其它病毒污染而致生产的疫苗或有质量隐患；废胚数量多，无害化处理难度大，涉及生物安全和公共卫生问题。另外，目前已经有利用生物反应器微载体培养狂犬病疫苗的报道，但尚没有利用生物反应器微载体生产禽流感病毒以及其它流感病毒如猪流感，犬流感，马流感的流感疫苗的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有鸡胚法技术存在的不足之处，提供一种应用生物反应器微载体细胞培养生产禽流感病毒以及其它流感病毒如猪流感，犬流感，马流感的流感疫苗的方法。该方法可以大量降低生产成本，而且生产周期短，不会受制于原料供应，占用场地小，易于快速扩大生产规模，环境污染少且易于处理，自动化程度高，用人少，质量易于实现均衡稳定，显著提高疫苗产量和质量。

为达到上述目的，本发明采取了如下的技术方案：

一种禽流感病毒以及其它流感病毒如猪流感，犬流感，马流感的流感疫苗的生产方法，选择生物反应器作为培养工具；选择微载体作为细胞贴附生长的载体；选择MDCK细胞作为制苗用细胞；

包括如下步骤：

(1)制苗用细胞的传代与培养：取细胞培养瓶中生长良好的MDCK细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液在细胞培养瓶中继续培养，培养温度为37℃，形成良好细胞单层时，用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养；

(2)制苗用毒种的繁殖：将基础毒种10-4稀释，尿囊腔接种11日龄SPF鸡胚，0.1ml/枚，置37℃孵化，每天照蛋2～4次，收获36～96小时死亡鸡胚的尿囊液，置-18℃保存。将此病毒液作为生产种毒.

(3)MDCK细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养：取步骤(1)中已形成良好单层的细胞培养瓶上生长良好的MDCK细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液，细胞计数后按5×10⁵/ml～5×10⁶/ml的细胞密度接种于生物反应器中，在生物反应器中加有微载体，设定培养温度37℃、PH6.8-7.6、溶氧30％-60％、搅拌速度30-60rpm，进行反应器自动控制、微载体悬浮培养；

(4)制苗毒液的繁殖：观察微载体上细胞基本长满，且细胞计数结果达到5×10⁶/ml～5×10⁷/ml后进行接毒操作，所接入种毒为步骤(2)中之种毒，接毒前用含有10ug/ml胰酶的病毒培养液洗涤2-4次。设定培养温度37℃、PH6.8-7.6、溶氧30％-60％、搅拌速度30-60rpm，进行反应器自动控制培养，接毒后每隔一定时间取反应器中微载体，用显微镜观察细胞病变情况；

(5)病毒液的收获：待微载体上细胞基本全部脱落，且DO值呈明显上升趋势，将反应器内液体连同微载体一起收获，置-20℃反复冻融两次，然后经离心或过滤去除细胞碎片，即制得病毒液。

病毒液一般于-20℃冷冻保存备用。

上述技术方案中，(1)生物反应器为能够自动控制温度、PH、溶氧、搅拌速度等参数，适用于微载体悬浮培养的生物反应器，容积为3L-3000L。上述技术方案中，(3)步骤中的微载体为Cytodex系列微载体5--10g/L，微载体在使用前需清洗、灭菌，方法如下：1)用PBS浸泡微载体过夜；2)用PBS清洗微载体3遍；3)用PBS浸泡微载体，121℃蒸汽灭菌三十分钟，微载体经清洗、灭菌处理后，加入到已灭菌的生物反应器中，用DMEM清洗。

上述技术方案中，(1)、(3)步骤中的EDTA-胰酶细胞分散液配方为：重量分数分别是0.25％的胰酶(1∶250)、0.02％的EDTA的Hank′s液；细胞生长液的配方为：重量分数分别是90％-98％DMEM液、2％-10％牛血清、加适量的抗菌素，PH为6.8-7.6。

上述技术方案中，(4)步骤中的种毒接种量为0.01-0.5MOI、病毒培养液配方为：不含血清，含有胰酶的DMEM液、加适量的抗菌素，PH为6.8-7.6。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)用细胞系代替鸡胚组织培养制造禽流感病毒以及其它流感病毒如猪流感，犬流感，马流感的流感疫苗，可解决鸡胚自身及受外源病毒污染的问题，通过原材料和培养条件的严格控制，保证生产出来的疫苗纯粹，确保疫苗的安全性。

(2)本发明可以大量降低生产成本，不会受制于原料供应，而且生产周期短，每个生产周期仅需5-7天，相比现有鸡胚培养法的15天以上大大缩短。

(3)应用生物反应器进行疫苗生产，具有自动化程度高，用人少，生产工艺简单稳定。易操作、产量大占用场地小，易于快速扩大生产规模。质量易于实现均衡稳定。

(4)应用本方法生产疫苗，环境污染少且易于处理。而现有的鸡胚生产法会产生的大量废胚等废物，且处理难度大，涉及生物安全和公共卫生问题。

本方法同时也适用于生产其他流感病毒如猪流感、犬流感、马流感等。

附图说明：

图1为本发明的制备流程图。

具体实施方式：

以下结合说明书附图及具体实施例来对本发明作进一步的描述。

实施例一

一种禽流感疫苗的生产方法，包括如下步骤：

(1)制苗用细胞的传代与培养：取MDCK细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液(含0.25％胰酶(1∶250)、0.02％EDTA的Hank′s液)消化传代，以含90％DMEM液、10％牛血清、各200单位/ml的青霉素钠和硫酸链霉素，PH调整为7.4的细胞生长液继续培养，培养温度为37℃，形成良好细胞单层时，用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养，其中生物反应器为能够自动控制温度、PH、溶氧、搅拌速度等参数，适用于微载体悬浮培养的生物反应器；

(2)制苗用毒种的繁殖：将禽流感(H9亚型)基础毒种10-4稀释，尿囊腔接种11日龄SPF鸡胚，0.1ml/枚，置37℃孵化，每天照蛋2～4次，收获36～96小时死亡鸡胚的尿囊液，置-18℃保存。将此病毒液作为生产种毒.

(3)MDCK细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养：取步骤(1)培养好的MDCK细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液，细胞计数后接种于生物反应器中，在生物反应器中加有微载体，设定培养温度37℃、PH7.4、溶氧50％、搅拌速度60rpm，进行反应器自动控制培养，其中生物反应器容积为75L；微载体为Cytodex系列微载体，微载体在使用前，需清洗、灭菌，具体步骤为：1)称量Cytodex1微载体500g、使用20LPBS液浸泡过夜；2)用10LPBS液清洗3遍；3)加入10LPBS液浸泡微载体，121℃蒸汽灭菌三十分钟；

(4)制苗毒液的繁殖：培养后第三日观察微载体上细胞基本长满，且细胞计数结果为9.6×10⁶/ml后进行接毒操作，接毒前用含有10ug/ml胰酶的病毒培养液洗涤4次。接种量为0.1MOI，设定培养温度37℃、PH7.4、溶氧50％、搅拌速度60rpm，进行反应器自动控制培养，接毒后每隔一定时间取反应器中微载体，用显微镜观察细胞病变情况；

(5)病毒液的收获：待微载体上细胞基本全部脱落，且DO值呈明显上升趋势，将反应器内液体连同微载体一起收获，置-20℃反复冻融两次，然后经过滤去除细胞碎片，即制得病毒液。

病毒液于-20℃冷冻保存备用。

上述技术方案中，(4)步骤中病毒培养时，使用的病毒培养液配方为：不含血清，含有胰酶的DMEM液、加各200单位/ml的青霉素钠和硫酸链霉素，PH为7.4。

实施例二

一种猪流感疫苗的生产方法，包括如下步骤：

(1)制苗用细胞的传代与培养：取MDCK细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液(含质量体积分数为0.25％胰酶(1∶250)和0.02％EDTA的Hank′s液)消化传代，以含重量分数95％DMEM液、5％牛血清、各250单位/ml的青霉素钠和硫酸链霉素，PH调整为7.3的细胞生长液继续培养，培养温度为37℃，形成良好细胞单层时，用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养，其中生物反应器为能够自动控制温度、PH、溶氧、搅拌速度等参数，适用于微载体悬浮培养的生物反应器；

(2)制苗用毒种的繁殖：将禽流感(H9亚型)基础毒种10-4稀释，尿囊腔接种11日龄SPF鸡胚，0.1ml/枚，置37℃孵化，每天照蛋2～4次，收获36～96小时死亡鸡胚的尿囊液，置-18℃保存。将此病毒液作为生产种毒.

(3)MDCK细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养：取步骤(1)培养好的MDCK细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液，细胞计数后接种于生物反应器中，在生物反应器中加有微载体，设定培养温度37℃、PH7.3、溶氧45％、搅拌速度50rpm，进行反应器自动控制培养，其中生物反应器容积为75L；微载体为Cytodex系列微载体，微载体在使用前，需清洗、灭菌，具体步骤为：1)称量Cytodex1微载体500g、使用20LPBS液浸泡过夜；2)用10LPBS液清洗3遍；3)加入10LPBS液浸泡微载体，121℃蒸汽灭菌三十分钟；

(4)制苗毒液的繁殖：培养后第三日观察微载体上细胞基本长满，且细胞计数结果为2×10⁷/ml后进行接毒操作，接毒前用含有10ug/ml胰酶的病毒培养液洗涤4次。接种量为0.1MOI，设定培养温度37℃、PH7.3、溶氧45％、搅拌速度50rpm，进行反应器自动控制培养，接毒后每隔一定时间取反应器中微载体，用显微镜观察细胞病变情况；

(5)病毒液的收获：待微载体上细胞基本全部脱落，且DO值呈明显上升趋势，将反应器内液体连同微载体一起收获，置-20℃反复冻融两次，然后经过滤去除细胞碎片，即制得病毒液。

病毒液于-20℃冷冻保存备用。

上述技术方案中，(4)步骤中病毒培养时，使用的病毒培养液配方为：不含血清，含有胰酶的DMEM液、加各200单位/ml的青霉素钠和硫酸链霉素，PH为7.4。

半成品检验及制苗、成品检验：

1.血凝价及毒价的测定：将以上收获的细胞病毒液混合后取样，测定血凝价及毒价。血凝价≥8log2，病毒含量≥10⁸ELD₅₀/0.1ml。

灭活：按总量的0.2％向病毒液中加入甲醛溶液，振摇2分钟，置37℃条件灭活30小时。期间定时振摇。

2.半成品检验

无菌检验：按《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》附录301页进行，无菌生长。

灭活检验：灭活后，无菌从每瓶病毒灭活液中取样，经尿囊腔途径接种10日龄SPF鸡胚5枚，0.1ml/胚，37℃孵化，每天照蛋，120小时内应无死亡，若有死亡，尿囊液应无血凝价。

3.油佐剂灭活疫苗的配制

油相制备  按注射用白油(见《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》附录343页)96份、司本-804份和硬脂酸铝2份的比例配制油相。

取硬脂酸铝，用少量注射用白油混合，加热融化至半透明状，再与全量司本-80及剩余注射用白油混合均匀，经121℃灭菌15分钟，冷却至室温，备用。

水相制备  取经检验合格的H9亚型禽流感病毒灭活液，按病毒液的4％加入吐温-80乳化1分钟。

灭活疫苗的制备  按水相和油相为1∶3(体积比)比例进行乳化，10000r/min乳化3～5分钟。

4.成品检验

4.1性状：

外观  为白色乳状液。

剂型  呈油包水型。

稳定性  在37℃保存21日或以3000r/min离心15分钟，未破乳。

粘度  用1ml洁净吸管(上口内径2.7mm、下口内径1.2mm)，吸取25℃左右的疫苗1ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需时间，在8秒以内。

4.2无菌检验  按《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》附录301页进行，无菌生长。

4.3安全检验  用3～5周龄非免疫鸭、鸡(应无抗H9亚型禽流感HI抗体或低于22)各10只，皮下、肌肉注射疫苗2羽份(0.6ml)，观察14日。全部存活，且无因疫苗注射引起的全身反应和严重的局部反应。

4.4效力检验  用3～5周龄非免疫鸭、鸡(应无抗H9亚型禽流感血凝抑制抗体或低于22)各10只，皮下、肌肉注射疫苗0.3ml，另取条件相同的鸭、鸡各10只，不接种，作为对照。21日后，采免疫及对照组鸡、鸭血样并测定血清HI抗体，免疫鸡应有≥90％只数HI抗体≥6log2，免疫鸭应有≥80％只数HI抗体≥2log2，对照组均应为0。

4.5甲醛含量测定  分别按《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》附录311页进行。符合规定。

Claims (10)

1.一种流感病毒疫苗的生产方法，其特征在于：

选择生物反应器作为培养工具；选择微载体作为细胞贴附生长的载体；选择MDCK细胞作为制苗用细胞；

并包括如下步骤：

(1)制苗用细胞的传代与培养：取细胞培养瓶中生长良好的MDCK细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液在细胞培养瓶中继续培养，培养温度为37℃，形成良好细胞单层时，用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养；

(2)制苗用毒种的繁殖：将基础毒种10^-4稀释，尿囊腔接种11日龄SPF鸡胚，0.1ml/枚，置37℃孵化，每天照蛋2-4次，收获36～96小时死亡鸡胚的尿囊液，置-18℃保存。将此病毒液作为生产种毒。

(3)MDCK细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养：取步骤(1)中已形成良好单层的细胞培养瓶上生长良好的MDCK细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液，细胞计数后按5×10⁵/ml～5×10⁶/ml的细胞密度接种于生物反应器中，在生物反应器中加有微载体，设定培养温度37℃、PH6.8-7.6、溶氧30％-60％、搅拌速度30-60rpm，进行反应器自动控制、微载体悬浮培养；

(4)制苗毒液的繁殖：观察微载体上细胞基本长满，且细胞计数结果达到5×10⁶/ml～5×10⁷/ml后进行接毒操作，所接入种毒为步骤(2)中之生产种毒，接毒前用含有10ug/ml胰酶的病毒培养液洗涤2-4次。设定培养温度37℃、PH6.8-7.6、溶氧30％-60％、搅拌速度30-60rpm，进行反应器自动控制培养，接毒后每隔一定时间取反应器中微载体，用显微镜观察细胞病变情况；

(5)病毒液的收获：待微载体上细胞基本全部脱落，且DO值呈明显上升趋势，将反应器内液体连同微载体一起收获，置-20℃反复冻融两次，然后经离心或过滤去除微载体及细胞碎片，即制得病毒液。

2.根据权利要求1所述的流感疫苗的生产方法，其特征在于：所述的生物反应器为能够自动控制温度、PH、溶氧、搅拌速度等参数，适用于微载体悬浮培养的生物反应器，容积为3L-3000L。

3.根据权利要求1所述的流感疫苗的生产方法，其特征在于：所述的微载体为Cytodex系列微载体。

4.根据权利要求3所述的流感疫苗的生产方法，其特征在于：所述的微载体在使用前需清洗、灭菌，方法如下：1)用PBS浸泡微载体过夜；2)用PBS清洗微载体3遍；3)用PBS浸泡微载体，121℃蒸汽灭菌三十分钟，微载体经清洗、灭菌处理后，加入到已灭菌的生物反应器中，用DMEM清洗。

5.根据权利要求1所述的流感疫苗的生产方法，其特征在于：所述的EDTA-胰酶细胞分散液配方为：质量体积浓度分别是0.25％的规格为1∶250的胰酶、0.02％的EDTA的Hank′s液。

6.根据权利要求1所述的流感疫苗的生产方法，其特征在于：所述的细胞生长液的配方为：重量分数分别是90％-98％DMEM液、2％-10％牛血清，在细胞生长液中另加入各100-500单位/ml的抗菌素，PH为6.8-7.6。

7.根据权利要求1所述的流感疫苗的生产方法，其特征在于：所述的步骤(4)中的病毒培养液为含有胰酶的DMEM液，并在DMEM液中加入各100-500单位/ml的抗菌素，PH为6.8-7.6。

8.根据权利要求6或7所述的流感疫苗的生产方法，其特征在于：所述的抗菌素为青霉素钠和硫酸链霉素的混合物。

9.根据权利要求1所述的流感疫苗的生产方法，其特征在于：所述的步骤(4)中的种毒接种量为0.01-0.5MOI。

10.根据权利要求1所述的流感疫苗的生产方法，其特征在于：所述的流感疫苗包括禽流感、猪流感、犬流感、马流感疫苗。