CN108239619A - 悬浮mdck细胞相关疫苗生产的二阶培养工艺技术 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及悬浮MDCK细胞相关疫苗生产的二阶培养工艺技术。本发明以悬浮MDCK细胞作为宿主细胞，采用二阶培养接毒方式生产能在MDCK悬浮细胞上病变的病毒，即，在细胞密度生长到2×106/mL‑20×106/mL时，用生产培养基稀释1‑5倍，稀释后细胞密度在1×106/mL‑10×106/mL之间，然后接毒，或在稀释之前接毒。本发明的生产工艺简单；不浪费培养基；不换液；生产培养基和生长培养基为相同或不同培养基，二者按比例混合，即可以达到细胞生长和病毒生长的作用。

Description

悬浮MDCK细胞相关疫苗生产的二阶培养工艺技术
技术领域
本发明涉及悬浮MDCK细胞相关疫苗生产领域，具体涉及30L及以上罐培养、以二阶培养方法培养悬浮MDCK细胞以生产疫苗的工艺技术。
背景技术
随着转瓶工艺、贴壁培养越来越向悬浮培养和无血清培养过渡，细胞高密度生长、较低(合适)密度接毒，得到疫苗生产领域的技术认可。为了简洁、高效、低成本的生产出合格的疫苗，首先是使原有的贴壁细胞能够悬浮生长。获得悬浮生长的方式有简单的驯化，即通过培养基的改变和培养方式的改变使原有贴壁生长的细胞能够悬浮生长；同样，获得细胞悬浮生长的方法还有基因改造方法，即修改细胞原有的基因使细胞能够悬浮生长，再通过培养基的改变使细胞能够无血清高密度生长。
传统的病毒性疫苗生产工艺是细胞生长到一定的密度后换液接毒或者直接接毒。截至目前，并未有关于MDCK悬浮细胞二阶培养方法的相关报道。
发明内容
本发明涉及一种悬浮MDCK细胞相关疫苗生产的二阶培养方法，其包含如下步骤：
1)细胞生长：MDCK细胞在生长培养基中生长至2X106/mL-20X106/mL；
2)接毒：接毒量在10-1-10-5之间；
3)稀释/补加生产培养基：用生产培养基稀释1-5倍，稀释后细胞密度为2X106/mL-10X106/mL；
4)二次生长：细胞二次生长，
其中步骤2)和步骤3)不分先后，既可以先进行步骤2)，也可以先进行步骤3)。
在一些实施方案中，在步骤4)二次生长的细胞密度达到工艺要求后，包括按照生产工艺收获病毒液纯化制苗的步骤，其中，所述生产工艺是指利用MDCK细胞生产相应疫苗的已知生产工艺。
在一些实施方案中，MDCK细胞生长为悬浮罐培养，培养工作体积为30L及以上。
在一些实施方案中，生长培养基与生产培养基为相同的培养基或不同的培养基，优选地，生长培养基和生产培养基为相同的培养基，优选地，生长培养基和生产培养基都为CD MDCK SFM无血清培养基(JSB，DP197)或MDCK无血清培养基(Sigma，货号：14581C)。
在一些实施方案中，步骤1)中细胞密度在5X106/mL-16X106/mL，优选地，8X106/mL-12X106/mL，最优选地，10X106/mL。
在一些实施方案中，步骤2)中细胞接毒量在10-1-10-4之间，更优接地，10-1-10-3，最优接地，10-2。
在一些实施方案中，步骤3)中MDCK细胞生产培养基稀释为1-4倍，更优选地，1-3倍稀释，最优选为2倍稀释。
在一些实施方案中，步骤3)中接毒后细胞密度在1X106/mL-5X106/mL，优选地，2X106/mL-3X106/mL。
在一些实施方案中，步骤4)中二次生长后的细胞密度为2X106/mL-20X106/mL，例如，2X106/mL、3X106/mL、4X106/mL、5X106/mL、6X106/mL、7X106/mL、8X106/mL、9X106/mL、10X106/mL、11X106/mL、12X106/mL、13X106/mL、14X106/mL、15X106/mL、16X106/mL、17X106/mL、18X106/mL、19X106/mL、20X106/mL。
在一些实施方案中，MDCK细胞为疫苗生产所用的悬浮细胞，或由贴壁驯化而来、能够悬浮生长生产的悬浮细胞。
在一些实施方案中，病毒为在对应悬浮MDCK细胞上敏感、能够生产出对应疫苗的病毒。在一些实施方案中，病毒选自禽流感病毒、呼肠孤病毒、腺病毒或犬细小病毒。
在一些实施方案中，细胞生长温度在35℃-37℃，接毒后病毒生产温度在30℃-37℃。
在一些实施方案中，细胞生长接种密度在0.3X106/mL-1.0X106/mL，例如0.3X106/mL、0.4X106/mL、0.5X106/mL、0.6X106/mL、0.7X106/mL、0.8X106/mL、0.9X106/mL或1.0X106/mL，生长天数在2-8天达到最高细胞密度，例如3天、4天、5天、6天、7天或8天。
本发明的MDCK细胞相关疫苗生产的二阶培养的优势在于：生产工艺简单；不浪费培养基；不换液；生产培养基和生长培养基可以为相同的培养基，也可以为不同的培养基。生产培养基和生长培养基按照比例混合，既可以达到细胞生长的作用，又可以达到病毒复制增殖的作用。
附图说明
图1显示了禽流感病毒Re-6在MDCK细胞上的病毒滴度比时间的曲线。
具体实施方式
换言之，本发明的创新性在于让MDCK细胞生长到平台期前的较高细胞密度，例如细胞密度达到10X106/mL左右，然后稀释原有培养体积，再接种病毒。MDCK细胞稀释到低密度后又开始二次生长，病毒也随之复制，最终提高病毒产量。
为了达到以上生产优势，本发明提供一种关于悬浮MDCK细胞相关疫苗生产的二阶培养工艺方法，具体过程和步骤如下：
1)细胞生长：MDCK细胞在生长培养基如CD MDCK SFM(JSB-DP197)培养基中生长，密度达到2X106/mL-20X106/mL间；优选细胞密度在5X106/mL-16X106/mL，更优选地，8X106/mL-12X106/mL，最优选细胞密度为10X106/mL。
2)接毒：细胞接毒量在10-1-10-5之间，优选接毒量在10-1-10-4，更优接毒量在10-1-10-3，最优接毒量在10-2；
3)补液：补加生产培养基，补加原有生长培养基体积的1-5倍的新鲜生产培养基，优选地，1-4倍，更优选地，1-3倍，最优选为2倍，使细胞密度达到1X106/mL-10X106/mL，优选地，1X106/mL-5X106/mL，更优选地，2X106/mL-3X106/mL。
4)二次生长：细胞继续生长，
其中步骤2)和步骤3)不分先后，既可以先进行步骤2)，也可以先进行步骤3)。
在一些实施方案中，在步骤4)二次生长的细胞密度达到工艺要求后，包括按照生产工艺收获病毒液纯化制苗的步骤，其中，所述生产工艺是指利用MDCK细胞生产相应疫苗的已知生产工艺。。
其中步骤1)中细胞生长温度在35-37℃，例如35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃。
其中步骤2)中接毒量在10-1-10-5之间，具体由生产工艺以及病毒和细胞之间的关系控制，病毒生产温度在30-37℃之间，例如30℃、32℃、33℃、34℃、35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃，最优选择温度为35℃。
其中补加生产培养基量为原有生长培养基的1-5倍。
其中，“生长培养基”是指用于细胞从低密度生长到高密度的低血清或无血清细胞培养基。
“生产培养基”是指可以满足病毒有效复制的病毒生产液。
本发明的“生长培养基”和“生产培养基”可以是本领域已知的任何可以用于MDCK细胞生长和生产的培养基，如SIGMA的MDCK无血清培养基(货号：14581C)或健顺生物商业化CD MDCK SFM无血清培养基，编号为JSB-DP197(货号为88022-197)。
在本发明的一些实施方案中，所述“生长培养基”与“生产培养基”是同一种培养基，例如都为健顺生物商业化CD MDCK SFM无血清培养基，编号为JSB-DP197。在本发明的另一些实施方案中，所述“生长培养基”与“生产培养基”是不同的培养基，例如生长培养基为MDCK无血清培养基，生产培养基为CD MDCK SFM无血清培养基，或者，生长培养基为CD MDCK SFM无血清培养基，生产培养基为MDCK无血清培养基，二者的比例可以例如为1:1、1:2、1:3、1:4或1:5。
本发明涉及MDCK细胞的低血清培养和无血清培养，用于生产包括禽流感病毒和人用季节性流感在内的所有在MDCK细胞上能够感染的病毒，例如禽流感病毒、呼肠孤病毒、腺病毒或犬细小病毒。
其中，所述“低血清培养”是指在培养过程中添加2％-5％的牛血清以满足细胞的生长的培养方式。
“无血清培养”是指在培养过程中不添加牛血清，只靠培养基提供的营养成分满足细胞的生长的培养方式。
其中所述生产工艺为30L及以上的生物反应器，包含搅拌式生物反应器和激流式生物反应器，例如50L、100L、200L、300L、400L、500L、1000L、2000L、3000L、4000L、5000L、10000L甚至更大的生物反应器。
二阶培养方法是指，MDCK细胞从接种密度通过2-8天的生长，可以生长到2X106/mL-20X106/mL之间，然后接病毒吸附0.5-2个小时，优选0.6-1.5小时，更优选0.7-1.2小时，更优选0.8-1.1小时，最优选1小时，再补加原有工作体积的1-5倍的生产培养基，使细胞密度降低到1X106/mL-10X106/mL之间，通过1-7天的病毒生产，收获毒液制苗。当然，也可以在补加原有工作体积的1-5倍的生产培养基后再接毒。该技术适用于人用疫苗和兽用疫苗的生产。
其中，“接种密度”通常是指，当细胞生长到高密度，培养基营养成分不能满足细胞的生长，再把高密度的细胞按照比例稀释成低密度的过程，一般接种密度在0.1-2X106/mL。
本发明所述的“平台期”是指细胞到达最高的密度的时间，“平台期前”是指细胞达到最高密度之前。
本发明所述的“细胞密度达到最高”是指培养基能够满足细胞生长的最高生长密度。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通知识和惯用方法，在不脱离本发明基本技术思想前提下，还可以做出多种形式的修改和变更。
同时，本领域技术人员也知晓，本发明所述的二阶培养方法不仅适用于MDCK细胞相关疫苗生产，也适用于其它细胞相关疫苗的生产，如BHK21细胞、Vero细胞、CHO细胞等。
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。
实施例1禽流感病毒在MDCK悬浮细胞的二阶培养工艺测试
1、实验材料
细胞株：来源于ATCC的MDCK细胞株，经健顺生物自主驯化，可悬浮生长。其中驯化条件为将MDCK贴壁细胞血清降低到5％以下传3代以上，然后进行悬浮驯化培养，驯化条件为5％CO2，摇床转速为120RPM/min，筛选出能够悬浮生长的MDCK细胞株。
培养基：CD MDCK SFM无血清培养基(JSB，DP197，货号为88022-197)。
禽流感病毒Re-6(法国Valneva公司)。
2、方法
包括以下步骤
(一)细胞的复苏、传代
(1)培养基的配制：按照说明书配制液体培养基CD MDCK SFM 20L，除菌过滤后4℃避光保存。
(2)细胞的复苏：从液氮罐中取出冻存细胞株，37℃融化后加入到30mL培养基中，1000RPM离心，丢弃上清液，重悬细胞于新鲜1X的CD MDCK SFM无血清培养基，置于37℃，5％CO2培养箱进行培养。
传代：新复苏的细胞实验前需要传代3-4次，每隔4天传代一次，接种密度是1X106/mL，连续传代四天，然后进行实验。
(3)接毒：细胞传代至第4代第3天时细胞密度达到6.19X106/mL，计划细胞接毒密度为3.5X106/mL，在细胞密度为6.19X106/mL时接种禽流感病毒，接毒量为MOI 10-2，吸附1小时候后补加CD MDCK SFM无血清培养至细胞密度为3.5X106/mL。继续培养细胞至7.2X106/mL。
测毒，按照血宁法测试病毒的HA。结果见图1。
由图1可见，禽流感病毒采用MDCK细胞生产工艺二阶培养技术所生产的病毒滴度为HA log211，病毒产量较高，其优越性在于高密度生长，低密度接毒，在接毒后本发明细胞又开始二次生长，节省了生产成本，提高了病毒滴度。采用常规方法获得的病毒滴度通常为HA log29。

Claims (10)

1.一种悬浮MDCK细胞相关疫苗生产的二阶培养方法，其包含如下步骤：
1)细胞生长：MDCK细胞在生长培养基中生长至2X106/mL-20X106/mL；
2)接毒：接毒量在10-1-10-5之间；
3)稀释/补加生产培养基：用生产培养基稀释1-5倍，稀释后细胞密度到2X106/mL-10X106/mL；
4)二次生长：细胞二次生长，
其中步骤2)和步骤3)不分先后，既可以先进行步骤2)，也可以先进行步骤3)。
2.根据权利要求1所述的悬浮MDCK细胞相关疫苗生产的二阶培养方法，其中MDCK细胞生长为悬浮罐培养，培养工作体积为30L及以上，和/或其中生长培养基与生产培养基为相同的培养基或不同的培养基，优选地，生长培养基和生产培养基为相同的培养基，优选地，生长培养基和生产培养基都为CD MDCK SFM无血清培养基(JSB，DP197)或EX-CELLMDCK无血清培养基(Sigma，货号：14581C)。
3.根据权利要求1或2所述的悬浮MDCK细胞相关疫苗生产的二阶培养方法，其中步骤1)中细胞密度在5X106/mL-16X106/mL，优选地，8X106/mL-12X106/mL，最优选地，10X106/mL。
4.根据权利要求1到3任一项所述的悬浮MDCK细胞相关疫苗生产的二阶培养方法，其中步骤2)中细胞接毒量在10-1-10-4之间，更优接地，10-1-10-3，最优接地，10-2。
5.根据权利要求1到4任一项所述的悬浮MDCK细胞相关疫苗生产的二阶培养方法，其中步骤3)中MDCK细胞生产培养基稀释为1-4倍，更优选地，1-3倍稀释，最优选为2倍稀释。
6.根据权利要求1到5任一项所述的悬浮MDCK细胞相关疫苗生产的二阶培养方法，其中步骤3)中接毒后细胞密度在1X106/mL-5X106/mL，优选地，2X106/mL-3X106/mL。
7.根据权利要求1到6任一项所述的悬浮MDCK细胞相关疫苗生产的二阶培养方法，其中MDCK细胞为疫苗生产所用的悬浮细胞，或由贴壁驯化而来、能够悬浮生长生产的悬浮细胞。
8.根据权利要求1到7任一项所述的悬浮MDCK细胞相关疫苗生产的二阶培养方法，其中病毒为在对应悬浮MDCK细胞上敏感、能够生产出对应疫苗的病毒，优选地，病毒选自禽流感病毒、呼肠孤病毒、腺病毒或犬细小病毒。
9.根据权利要求1到8任一项所述的悬浮MDCK细胞相关疫苗生产的二阶培养方法，其中细胞生长温度在35℃-37℃，接毒后病毒生产温度在30℃-37℃。
10.根据权利要求1到9任一项所述的悬浮MDCK细胞相关疫苗生产的二阶培养方法，其中细胞生长接种密度在0.3X106/mL-1.0X106/mL，生长天数在2-8天达到最高细胞密度。
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