CN103865886A - 猪伪狂犬病毒的培养方法 - Google Patents

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张述智
夏伟
朱绍辉
张�浩
王晓丽
徐权汗
李之详
许团辉
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Abstract

本发明公开了一种猪伪狂犬病毒的培养方法，利用仓鼠肾细胞（BHK-21）细胞作为猪伪狂犬病毒培养的细胞源，在细胞传代的同时接种病毒，从而进行病毒的增殖培养。该方法具有工艺简便、生长量大、得率高、成本低廉的特点，并且利用本发明培养的猪伪狂犬病毒制备的疫苗对猪伪狂犬病毒病具有完全的防治作用，具有很好的社会效益和应用前景。

Description

猪伪狂犬病毒的培养方法
 
技术领域
本发明属于猪伪狂犬病毒疫苗生产技术领域，具体涉及用细胞培养技术培养猪伪狂犬病毒的方法。
 
背景技术
猪伪狂犬病(Porcine Pseudorabies, PR)是由伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus, PRV)引起的以发热和脑脊髓炎为主要特征的急性、发热性传染病。该病可引起猪、牛、羊、犬、猫、家兔、小白鼠、水貂、狐等多种家畜和野生动物发病，具有高致死率。而猪是该病毒增殖感染唯一可存活的宿主，是该病毒的自然储存库。所以，从猪群中切断伪狂犬病毒的传播是控制伪狂犬病的有效途径。成年猪一般呈隐性感染，引起生长停滞，增重缓慢等；怀孕母猪可导致流产、死胎、木乃伊等综合症；7日龄以内的仔猪发病死亡率可达100 %，断奶仔猪发病率可达20 %～40%。
目前，该病分布于全世界50多个国家和地区，我国已有23个省(市)报道了该病的发生，给畜牧业造成了巨大的损失。因此必须对该病进行有效的预防和控制，最根本的措施是疫苗接种，而疫苗效果好坏主要取决于抗原的制备，抗原的制备又大多采用细胞增殖病毒的方法，但由于该病毒在不同的细胞上增殖效果不尽相同，出现病变的时间、病变特征、病变观察的难易程度、病毒含量均有所差别，如不能掌握其规律选择最佳的细胞系进行病毒的培养，将难以生产出优质的疫苗的。
 
发明内容
为了克服现有技术领域存在的上述缺陷，本发明的目的在于，提供一种猪伪狂犬病毒的培养方法，解决现有技术采用细胞增殖病毒的方法制备抗原，不容易掌握病毒的规律选择最佳细胞进行病毒培养的问题。
本发明提供的猪伪狂犬病毒的培养方法，包括以下步骤：
（1）细胞传代，将BHK-21细胞用胰酶-EDTA溶液进行消化，待细胞松动后，加入DMEM细胞培养液，并用吸管将消化下来的细胞吹散均匀，倒出4/5的细胞悬液，再加入等量的DMEM细胞培养液，即将细胞密度稀释为原来的5倍；
（2）病毒增殖，将PRV毒种2 %单层接种BHK-21，并同时设未接毒的正常对照细胞，37℃孵育1h后，加入细胞维持液，置37℃、5%CO2培养箱培养，观察CPE出现的时间及特征，当细胞出现80 % CPE时收毒，冻融3次，1500 r/min离心l5min，小瓶分装上清液备用，按此方法传代至第3代，-70 ℃冰柜保存备用；
它还包括以下步骤：将所述步骤（2）中增殖后的第3代PRV病毒液用含10 %血清的DDMEM细胞培养液进行10倍系列稀释，取10-4～10-9 6个稀释度接种单层BHK-21细胞的96孔微量培养板各8孔，每孔100μl，同时设细胞对照孔，置37℃、5%CO2培养箱培养，观察6日，按Reed-Muench法计算TCID50；将所述步骤（2）中增殖后的第3代PRV病毒液用含2%血清的DMEM培养液做1000倍稀释，与等量PRV标准阳性血清1:128混合，置37℃水浴中和1h后分别接种相对应的细胞，同时设病毒对照、空白对照及阳性血清对照，置37℃、5%CO2培养箱观察6日，观察各组细胞有无CPE。
本发明提供的猪伪狂犬病毒的培养方法，其有益效果在于，该方法具有工艺简便、生长量大、得率高、成本低廉的特点，并且利用本发明培养的猪伪狂犬病毒制备的疫苗对猪伪狂犬病毒病具有完全的防治作用，具有很好的社会效益和应用前景；所培养的病毒液病毒含量需不低于107.0 TCID50/0.1ml,显著高于现行技术培养的猪伪狂犬病毒的毒价；所用细胞BHK-21细胞为普通的常用细胞，来源充足，获取成本低，培养技术成熟，易于生产。
 
具体实施方式
下面结合一个实施例，对本发明提供的猪伪狂犬病毒的培养方法进行详细的说明。
 
实施例
本实施例的猪伪狂犬病毒的培养方法，包括以下步骤：
（1）细胞传代，将BHK-21细胞用胰酶-EDTA溶液进行消化，待细胞松动后，加入DMEM细胞培养液，并用吸管将消化下来的细胞吹散均匀，倒出4/5的细胞悬液，再加入等量的DMEM细胞培养液，即将细胞密度稀释为原来的5倍；
（2）病毒增殖，将PRV毒种2 %单层接种BHK-21，并同时设未接毒的正常对照细胞，37℃孵育1h后，加入细胞维持液，置37℃、5%CO2培养箱培养，观察CPE出现的时间及特征，当细胞出现80 % CPE时收毒，冻融3次，1500 r/min离心l5min，小瓶分装上清液备用，按此方法传代至第3代，-70 ℃冰柜保存备用；
（3）将步骤（2）中增殖后的第3代PRV病毒液用含10 %血清的DDMEM细胞培养液进行10倍系列稀释，取10-4～10-9 6个稀释度接种单层BHK-21细胞的96孔微量培养板各8孔，每孔100μl，同时设细胞对照孔，置37℃、5%CO2培养箱培养，观察6日，按Reed-Muench法计算TCID50  ，病毒含量高于107.0 TCID50/0.1ml；
（4）将步骤（2）中增殖后的第3代PRV病毒液用含2%血清的DMEM培养液做1000倍稀释，与等量PRV标准阳性血清1:128混合，置37℃水浴中和1h后分别接种相对应的细胞，同时设病毒对照、空白对照及阳性血清对照，置37℃、5%CO2培养箱观察6日，观察各组细胞有无CPE，其中病毒对照组细胞圆缩，折光性增强，继而发生脱落，而中和组、空白对照及阳性血清对照组均无CPE。

Claims (3)

1.一种猪伪狂犬病毒的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）细胞传代，将BHK-21细胞用胰酶-EDTA溶液进行消化，待细胞松动后，加入DMEM细胞培养液，并用吸管将消化下来的细胞吹散均匀，倒出4/5的细胞悬液，再加入等量的DMEM细胞培养液，即将细胞密度稀释为原来的5倍；
（2）病毒增殖，将PRV毒种2 %单层接种BHK-21，并同时设未接毒的正常对照细胞，37℃孵育1h后，加入细胞维持液，置37℃、5%CO2培养箱培养，观察CPE出现的时间及特征，当细胞出现80 % CPE时收毒，冻融3次，1500 r/min离心l5min，小瓶分装上清液备用，按此方法传代至第3代，-70 ℃冰柜保存备用。
2.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病毒的培养方法，其特征在于：它还包括以下步骤：将所述步骤（2）中增殖后的第3代PRV病毒液用含10 %血清的DDMEM细胞培养液进行10倍系列稀释，取10-4～10-9 6个稀释度接种单层BHK-21细胞的96孔微量培养板各8孔，每孔100μl，同时设细胞对照孔，置37℃、5%CO2培养箱培养，观察6日，按Reed-Muench法计算TCID50。
3.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病毒的培养方法，其特征在于：它还包括以下步骤：
将所述步骤（2）中增殖后的第3代PRV病毒液用含2%血清的DMEM培养液做1000倍稀释，与等量PRV标准阳性血清1:128混合，置37℃水浴中和1h后分别接种相对应的细胞，同时设病毒对照、空白对照及阳性血清对照，置37℃、5%CO2培养箱观察6日，观察各组细胞有无CPE。
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PB01 Publication
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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