CN105602909A - 一种猪伪狂犬病毒的培养方法 - Google Patents

一种猪伪狂犬病毒的培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪伪狂犬病毒的培养方法，解决了猪伪狂犬病毒的滴度较低、生产成本较高的问题。本发明包括：（1）配置细胞亲和剂，将细胞亲和剂的各物质溶于去离子水中并过滤；（2）配置适用于猪伪狂犬病毒培育的DMEM培养液；（3）培育单层细胞；（4）将单层细胞、DMEM培养液以及细胞亲和剂混合均匀，然后放置细胞培养箱中静置1～30min；该细胞亲和剂的终浓度为0.01%～1%；（5）静置完成后取出，并迅速加入猪伪狂犬病毒混合均匀，最后放置到细胞培养箱进行培养，直至细胞病变脱落。本发明具有有效增加猪伪狂犬病毒的滴度、降低生产成本、节省培育时间等优点。

Description

一种猪伪狂犬病毒的培养方法
技术领域
本发明涉及一种培养方法，具体涉及一种猪伪狂犬病毒的培养方法。
背景技术
猪伪狂犬病毒属于猪疱疹病毒属，在全世界广泛分布。目前，各个研究机构对经典毒株和临床分离的猪伪狂犬病毒进行了体外细胞感染，并已研制出相关疫苗进入商品化销售。
国内外有多篇文献报道指出，猪伪狂犬经典株与临床分离到的猪伪狂犬病毒可以用多种细胞进行体外感染，如VERO细胞、ST细胞等，实验室病毒培养滴度一般在107TCID50，但对于疫苗生产企业来讲，病毒的滴度越高，单位时间内生产病毒的效率就越高，生产成本也就越低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：对于疫苗生产企业而言，现有猪伪狂犬病毒的培养方法培育得到的溶液的病毒滴度较低、生产成本较高；目的在于提供提高猪伪狂犬病毒体外感染效率，有效提高培育后溶液病毒滴度的一种猪伪狂犬病毒的培养方法；本发明大大提高工业化生产猪伪狂犬病毒效率，为生产企业提高猪伪狂犬疫苗质量、降低生产成本提供方法和依据。
本发明通过下述技术方案实现：
一种猪伪狂犬病毒的培养方法，包括：
(1)配置细胞亲和剂，将细胞亲和剂的各物质溶于去离子水中并过滤；
其中，细胞亲和剂包括苹果酸、草酸、山梨酸、磷酸、磷酸氢二钠、氯化钾和氯化钠；
(2)配置适用于猪伪狂犬病毒培育的DMEM培养液；即将DMEM溶于去离子水中，搅拌至完全溶解，调节pH值至6.8～7.8，并用0.22um的无菌滤膜进行除菌过滤，放4℃待用；
(3)培育单层细胞；即将胎牛血清加入DMEM培养液混合后制成溶液，血清加入体积范围为DMEM培养液体积的1％～8％，将细胞加入到该溶液中进行单层培养，待培养好后弃去溶液保留细胞，并用无血清液体清洗后获得单层细胞；
(4)将单层细胞、DMEM培养液以及细胞亲和剂混合均匀，然后放置细胞培养箱中静置1～30min；该细胞亲和剂的质量终浓度为0.01％～1％；
(5)静置完成后取出，并迅速加入猪伪狂犬病毒混合均匀，最后放置到细胞培养箱进行培养，直至细胞病变脱落。
本发明通过优化复合酸与无机盐的组成物质的优选配合，有效改变猪伪狂犬病毒与细胞间的微环境，增加病毒与细胞接触亲和度，从而增加病毒对细胞的感染率，进而有效增加猪伪狂犬病毒的滴度，降低生产成本。
本发明通过优化细胞亲和剂的使用量，不仅仅能有效增加猪伪狂犬病毒的滴度，而且还能有效减少培育时间，效果对比结果如表2所示，通过表2可知，细胞亲和剂的使用量的优化使伪狂犬病毒的滴度增强数倍以上，且培育时间至少要节省四分之一，效果更加显著。
优选地，所述苹果酸为1～10份，草酸为1～12份，山梨酸为1～10份，磷酸为0.1～1份；所述磷酸氢二钠为1～16份，氯化钾为6～60份，氯化钠为1～9份。
优选地，所述苹果酸为1～10份，草酸为1.2～12份，山梨酸为1～10份，磷酸为0.1～1份；所述磷酸氢二钠为5～7份，氯化钾为6～10份，氯化钠为3～8份。
通过采用上述优选组成和配比的细胞亲和剂，并将其使用到病毒生产后，不仅仅使病毒滴度从原先的107.0TCID50每毫升增加至109.2TCID50每毫升，病毒滴度比原先提高近100倍。
而且病毒感染细胞后，通常至少需要48h以上才能达到细胞病变脱落的目的，而加入本发明优化组分和配比的细胞亲和剂后，仅仅只需要不到36h即可使细胞病变脱落，细胞病变速度显著加快，节省培育时间。
优选地，所述细胞包括Vero细胞、293细胞、ST细胞、BHK细胞中的一种或多种；所述无血清液体为无菌去离子水、无菌PBS、无菌无血清DMEM培养液；所述无血清液体的清洗次数为2～3次。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明通过优化复合酸和无机盐的组成物质，有效改变猪伪狂犬病毒与细胞间的微环境，增加病毒与细胞接触亲和度，从而增加病毒对细胞的感染率，进而有效增加猪伪狂犬病毒的滴度，降低生产成本；
2、本发明通过采用上述组成和配比的细胞亲和剂，并将其使用到病毒生产后，不仅仅使病毒滴度比原先不使用细胞亲和剂时提高近100倍，而且还能使细胞病变速度显著加快，从原先的48h缩短到36h，显著节省培育时间。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例
一种猪伪狂犬病毒的培养方法，包括：
(1)配置细胞亲和剂，将细胞亲和剂的各物质溶于去离子水中并过滤；
其中，细胞亲和剂包括苹果酸、草酸、山梨酸、磷酸、磷酸氢二钠、氯化钾和氯化钠。
本发明细胞亲和剂的具体组成成份如表1所示。
表1
上述表1中各组成成份的单位均为重量份，细胞亲和剂的终浓度以质量计。
(2)配置适用于猪伪狂犬病毒培育的DMEM培养液；即将DMEM溶于去离子水中，搅拌至完全溶解，调节pH值至6.8～7.8，并用0.22um的无菌滤膜进行除菌过滤，放4℃待用。
(3)培育单层细胞；即将胎牛血清加入DMEM培养液混合后制成溶液，血清加入体积范围为DMEM培养液体积的1％～8％，将细胞加入到该溶液中进行单层培养，待培养好后弃去溶液保留细胞，并用无血清液体清洗后获得单层细胞。
所述细胞包括Vero细胞、293细胞、ST细胞、BHK细胞中的一种或多种；所述无血清液体为无菌去离子水、无菌PBS、无菌无血清DMEM培养液；所述无血清液体的清洗次数为2～3次。
(4)将单层细胞、DMEM培养液以及细胞亲和剂混合均匀，然后放置细胞培养箱中静置1～30min；该细胞亲和剂的质量终浓度为0.01％～1％。
(5)静置完成后取出，并迅速加入猪伪狂犬病毒混合均匀，最后放置到细胞培养箱进行培养，直至细胞病变脱落。
为了能达到更好地体现本发明优选配比的效果，本实施例还公开了五组对照例，分别为对照例1、对照例2、对照例3、对照例4和对照例5，该五组对照例与实例1～5相比仅仅只有细胞亲和剂不同，具体设置如下：
对照例1为不添加细胞亲和剂；对照例2中各物质的组成成分不同，本实施例中对照例2是在实例1的基础上将草酸修改成磷酸二氢钠；对照例3、对照例4和对照例5中各物质的配比不同和使用浓度不同，具体配比和使用浓度如表1所示。
对上述实例和对照例进行了猪伪狂犬病毒TCID50的测定，测定方法如下：
步骤1将各对照例和实例的培养液分别离心取上清，并用0.22um滤膜过滤获得病毒；
步骤2将上述对照例和实例的病毒在离心管中作连续10倍的稀释，从10～ 1～10～10；
步骤3将稀释好的病毒接种到96孔微量细胞培养板中，每一稀释度接种一纵排共8孔，每孔100ul；
步骤4每孔加入细胞悬液100ul，使细胞量达到3*105个/ml；
步骤5设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排(加100ul生长液和100ul细胞悬液)；
步骤6逐日观察并记录结果，一般需要观察4～6天；
步骤7结果计算，按Karber法进行计算。
本发明公开了对照例1和实例1的具体记录结果和计算方法，记录结果如表2所示。
表2
病毒液稀释度 对照例1出现CPE孔的比率 实例1出现CPE孔的比率
10～1 8/8＝1 8/8＝1
10～2 8/8＝1 8/8＝1
10～3 8/8＝1 8/8＝1
10～4 8/8＝1 8/8＝1
10～5 6/8＝0.75 8/8＝1
10～6 5/8＝0.625 7/8＝0.875
10～7 1/8＝0.125 7/8＝0.875
10～8 0/8＝0 5/8＝0.625
10～9 0/8＝0 3/8＝0.375
10～10 0/8＝0 0/8＝0
10～11 0/8＝0 0/8＝0
计算公式为：IgTCID50＝L-D(S-0.5)；其中，L:最高稀释度对数，D:稀释度对数之间的差，S:阳性孔比率总和。
根据表2中记录的数据和计算公式，得到如下结果：
对照例1：IgTCID50＝-1-(+1)*(5.5-0.5)＝-6，则TCID50＝106/0.1ml；
实例1：IgTCID50＝-1-(+1)*(7.75-0.5)＝-8.25，则TCID50＝108.25/0.1ml。
通过上述测定方法计算后，得到本发明中该各对照例和实例的具体病毒滴度结果，并对比了在细胞培养箱进行培养直至细胞病变脱落的时间，具体结果如表3所示。
表3
TCID50 培育时间
实例1 108.25/0.1ml ≤36h
实例2 108.25/0.1ml ≤36h
实例3 108.0/0.1ml ≤36h
实例4 108.75/0.1ml ≤36h
实例5 109.25/0.1ml ≤36h
对照例1 106/0.1ml ≥48h
对照例2 107/0.1ml ≥48h
对照例3 106.75/0.1ml ≥48h
对照例4 107.0/0.1ml ≥48h
对照例5 106.75/0.1ml ≥48h
通过上述表3中的数据即可进一步证明：使用本发明的细胞亲和剂后病毒滴度(TCID50)由106/0.1ml上升至109.25/0.1ml。并且通过对照例与实例的结果对比得到，经过本发明组成成份和使用浓度的优化后，能有效增强病毒滴度，并同时有效减少培育时间。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种猪伪狂犬病毒的培养方法，其特征在于，包括：
（1）配置细胞亲和剂，将细胞亲和剂的各物质溶于去离子水中并过滤；
（2）配置适用于猪伪狂犬病毒培育的DMEM培养液；
（3）培育单层细胞；
（4）将单层细胞、DMEM培养液以及细胞亲和剂混合均匀，然后放置细胞培养箱中静置；该细胞亲和剂的终浓度为0.01%～1%；
（5）静置完成后取出，并迅速加入猪伪狂犬病毒混合均匀，最后放置到细胞培养箱进行培养，直至细胞病变脱落。
2.如权利要求1所述的一种猪伪狂犬病毒的培养方法，其特征在于，所述细胞亲和剂包括苹果酸、草酸、山梨酸、磷酸、磷酸氢二钠、氯化钾和氯化钠。
3.如权利要求2所述的一种猪伪狂犬病毒的培养方法，其特征在于，所述苹果酸为1～10份，草酸为1～12份，山梨酸为1～10份，磷酸为0.1～1份；所述磷酸氢二钠为1～16份，氯化钾为6～60份，氯化钠为1～9份。
4.如权利要求3所述的一种猪伪狂犬病毒的培养方法，其特征在于，所述苹果酸为1～10份，草酸为1.2～12份，山梨酸为1～10份，磷酸为0.1～1份；所述磷酸氢二钠为5～7份，氯化钾为6～10份，氯化钠为3～8份。
5.如权利要求1所述的一种猪伪狂犬病毒的培养方法，其特征在于，所述单层细胞的具体培育过程为：
将胎牛血清加入DMEM培养液混合后制成溶液，血清加入体积范围为DMEM培养液体积的1%～8%，再将细胞加入到该溶液中进行单层培养，待培养好后弃去溶液保留细胞，并用无血清液体清洗后获得单层细胞。
6.如权利要求5所述的一种猪伪狂犬病毒的培养方法，其特征在于，所述细胞包括Vero细胞、293细胞、ST细胞、BHK细胞中的一种或多种；所述无血清液体为无菌去离子水、无菌PBS、无菌无血清DMEM培养液；所述无血清液体的清洗次数为2～3次。
7.如权利要求1所述的一种猪伪狂犬病毒的培养方法，其特征在于，所述DMEM培养液的配置过程为：
DMEM溶于去离子水中，搅拌至完全溶解，调节pH值，并用无菌滤膜进行除菌过滤，放4℃待用。
8.如权利要求7所述的一种猪伪狂犬病毒的培养方法，其特征在于，所述DMEM培养液的pH值为6.8～7.8。
9.如权利要求1所述的一种猪伪狂犬病毒的培养方法，其特征在于，所述步骤（4）中的静置时间为1～30min。
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