CN104630156A - 一种提高猪流行性腹泻病毒体外感染效率的细胞亲和剂及其制备方法 - Google Patents

一种提高猪流行性腹泻病毒体外感染效率的细胞亲和剂及其制备方法 Download PDF

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冯晓声
贾爱卿
王贵平
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Guangdong Haid Animal Husbandry Veterinary Research Institute Co., Ltd.
SICHUAN HAILINGE BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO., LTD.
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GUANGDONG HAID ANIMAL HUSBANDRY VETERINARY RESEARCH INSTITUTE Co Ltd
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Abstract

本发明公开了一种提高猪流行性腹泻病毒体外感染效率的细胞亲和剂，由原料混合液制成，所述原料混合液由按照质量百分数计的如下组分：苹果酸0.1-1％；草酸0.12-1.2％；山梨酸0.1-1％；磷酸0.01-0.1％；无机盐0.36-3％；去离子水余量。本发明通过改变猪流行性腹泻病毒与细胞间的微环境，增加病毒与细胞接触亲和度，从而增加病毒对细胞的感染率使之适应体外规模化培养。

Description

一种提高猪流行性腹泻病毒体外感染效率的细胞亲和剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及微生物病毒领域，更具体地说，涉及一种提高猪流行性腹泻病毒体外感染效率的细胞亲和剂及其制备方法。
背景技术
猪流行性腹泻病毒严重影响了我国的养猪业，其感染性强、危害性大，是影响全球养猪业的最重要病毒之一，哺乳仔猪感染后死亡率可达100％，母猪常以带毒而不表现症状形式出现。猪流行性腹泻病毒属于冠状病毒科冠状病毒属的1群，传染性胃肠炎，猫冠状病毒、犬冠状病毒与其属于同一冠状病毒属(Ut iger等，1995a)。猪流行性腹泻病毒最初在20世纪70年代被发现，首次发现的病毒经分离纯化及传代后的病毒被命名为CV777，至今很多疫苗生产单位仍然在使用该毒株作为疫苗毒株使用。最近几年在临床上爆发了严重的哺乳仔猪腹泻，且死亡率极高，因此各研究机构都在对引起该疾病的病原进行分析。调查结果显示，引起哺乳仔猪腹泻并死亡的主要病原为猪流行性腹泻病毒，通过对现流行毒株的基因分析，发现流行毒株与二十世纪70年代分离到的CV777毒力基因发生了较大的改变，所以这也许是用含有原始毒株的疫苗免疫失败的原因之一。
目前，各个研究机构对临床分离的猪流行性腹泻病毒进行了体外细胞感染，试图通过体外培养来使该病毒增殖以期用于目前的猪流行性腹泻的防控。国内外有多篇文献报道指出，临床分离到的猪流行性腹泻病毒可以用多种细胞进行体外感染，如VERO细胞、BHK细胞等，但从临床分离到的流行毒株(野毒株)培养较为困难，在相当长的代次内仍然看不到有明显的细胞病变产生，从而也无法进行病毒效价评估和工业化生产，这成为了制约含有流行毒株疫苗面世的最严重困难，所以如何提高病毒对细胞的浸染效率使之适应体外规模化培养是该病毒体外培养的难点所在。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述猪流行性腹泻病毒体外感染效率低的缺陷，提供一种提高猪流行性腹泻病毒体外感染效率的细胞亲和剂及其制备方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种提高猪流行性腹泻病毒体外感染效率的细胞亲和剂，由原料混合液制成，所述原料混合液由按照质量百分数计的如下组分：
本发明所述的提高猪流行性腹泻病毒体外感染效率的细胞亲和剂，其中，所述原料混合液由按照质量百分数计的如下组分：
本发明所述的提高猪流行性腹泻病毒体外感染效率的细胞亲和剂，其中，所述原料混合液由按照质量百分数计的如下组分：
本发明所述的提高猪流行性腹泻病毒体外感染效率的细胞亲和剂，其中，所述原料混合液由按照质量百分数计的如下组分：
本发明所述的提高猪流行性腹泻病毒体外感染效率的细胞亲和剂，其中，所述原料混合液由按照质量百分数计的如下组分：
本发明所述的提高猪流行性腹泻病毒体外感染效率的细胞亲和剂，其中，所述无机盐由氯化钠、氯化钾和磷酸二氢钠组成，所述氯化钠占细胞亲和剂总重的0.1-1.2％；所述氯化钾占细胞亲和剂总重的0.6-6％；所述磷酸二氢钠占细胞亲和剂总重的0.16-1.6％。
本发明所述的提高猪流行性腹泻病毒体外感染效率的细胞亲和剂，其中，所述氯化钠占细胞亲和剂总重的0.2-0.8％；所述氯化钾占细胞亲和剂总重的2-5％；所述磷酸二氢钠占细胞亲和剂总重的0.25-0.8％。
本发明还提供一种提高猪流行性腹泻病毒体外感染效率的细胞亲和剂的制备方法，按照上述质量百分比称取适量的苹果酸、草酸、山梨酸、磷酸、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠和去离子水，将上述各组分溶于去离子水中，过滤即得。
实施本发明的提高猪流行性腹泻病毒体外感染效率的细胞亲和剂，具有以下有益效果：通过改变猪流行性腹泻病毒与细胞间的微环境，增加病毒与细胞接触亲和度，从而增加病毒对细胞的感染率使之适应体外规模化培养。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1是原代病毒盲传5-8代次后细胞的病变情况的倒置显微镜图(未添加细胞亲和剂)；
图2是添加本发明制备的实施例1的细胞亲和剂后盲传5-8代次后细胞的病变情况的倒置显微镜图；
图3是添加本发明制备的实施例2的细胞亲和剂后盲传5-8代次后细胞的病变情况的倒置显微镜图；
图4是添加本发明制备的实施例3的细胞亲和剂后盲传5-8代次后细胞的病变情况的倒置显微镜图；
图5是添加本发明制备的实施例4的细胞亲和剂后盲传5-8代次后细胞的病变情况的倒置显微镜图；
图6是添加本发明制备的实施例5的细胞亲和剂后盲传5-8代次后细胞的病变情况的倒置显微镜图。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：
本发明提供一种提高猪流行性腹泻病毒体外感染效率的细胞亲和剂，由原料混合液制成，所述原料混合液由按照质量百分数计的如下组分：
本发明所述的提高猪流行性腹泻病毒体外感染效率的细胞亲和剂，其中，所述无机盐由氯化钠、氯化钾和磷酸二氢钠组成，所述氯化钠占细胞亲和剂总重的0.1-1.2％；所述氯化钾占细胞亲和剂总重的0.1-1％；所述磷酸二氢钠占细胞亲和剂总重的0.16-0.8％。
优选地，所述氯化钠占细胞亲和剂总重的0.2-0.8％；所述氯化钾占细胞亲和剂总重的0.3-0.5％；所述磷酸二氢钠占细胞亲和剂总重的0.25-0.5％。
本发明还提供一种提高猪流行性腹泻病毒体外感染效率的细胞亲和剂的制备方法，按照上述质量百分比称取适量的苹果酸、草酸、山梨酸、磷酸、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠和去离子水，将上述各组分溶于去离子水中，过滤即得。
本发明涉及的实验操作步骤均为本领域常规的步骤，所用物料可从市场上购得。
下面，采用本发明提供的原料组分制备5个实施例的细胞亲和剂，所述实施例的原料组分质量百分比如表1所示。按照下表各实施例的原料组分质量百分比称取适量的苹果酸、草酸、山梨酸、磷酸、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠和去离子水，将上述各原料组分溶于去离子水中，过滤即得。
表1细胞亲和剂各组分的质量百分比(％)
下面，进行猪流行性腹泻病毒体外感染效率的影响试验：
1、猪流行性腹泻病毒体外感染细胞的倒置显微镜检查(放大倍数为250x)
在倒置显微镜下观察未添加细胞亲和剂而直接从原代病毒盲传5-8代次后细胞的病变情况与采用本发明制备的5个实施例的细胞亲和剂后盲传5-8代次后细胞的病变情况。
图1为原代病毒盲传5-8代次后细胞的病变情况的倒置显微镜图(未添加细胞亲和剂)；
图2为添加本发明实施例1的细胞亲和剂后，原代病毒盲传5-8代次后细胞的病变情况的倒置显微镜图；
图3为添加本发明实施例2的细胞亲和剂后，原代病毒盲传5-8代次后细胞的病变情况的倒置显微镜图；
图4为添加本发明实施例3的细胞亲和剂后，原代病毒盲传5-8代次后细胞的病变情况的倒置显微镜图；
图5为添加本发明实施例4的细胞亲和剂后，原代病毒盲传5-8代次后细胞的病变情况的倒置显微镜图；
图6为添加本发明实施例5的细胞亲和剂后，原代病毒盲传5-8代次后细胞的病变情况的倒置显微镜图；
由图可见，从原代病毒盲传5-8代次后，细胞开始出现病变(图1)，采用本发明细胞亲和剂后盲传5-8代次后细胞出现明显细胞病变(图2-6)。说明添加本发明制备的细胞亲和剂进行原代病毒盲传，通过改变病毒与细胞间的微关系，增加病毒与细胞间亲和度，从而使猪流行性腹泻病毒在体外培养比通用方法更容易感染细胞。其中，添加实施例1的细胞亲和剂后盲传5-8代次后细胞出现细胞病变最明显。说明该实施例的原料比例最能增加病毒与细胞间亲和度。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种提高猪流行性腹泻病毒体外感染效率的细胞亲和剂，其特征在于，由原料混合液制成，所述原料混合液由按照质量百分数计的如下组分：
2.根据权利要求1所述的提高猪流行性腹泻病毒体外感染效率的细胞亲和剂，其特征在于，所述原料混合液由按照质量百分数计的如下组分：
3.根据权利要求1所述的提高猪流行性腹泻病毒体外感染效率的细胞亲和剂，其特征在于，所述原料混合液由按照质量百分数计的如下组分：
4.根据权利要求1所述的提高猪流行性腹泻病毒体外感染效率的细胞亲和剂，其特征在于，所述原料混合液由按照质量百分数计的如下组分：
5.根据权利要求1所述的提高猪流行性腹泻病毒体外感染效率的细胞亲和剂，其特征在于，所述原料混合液由按照质量百分数计的如下组分：
6.根据权利要求1-5任一所述的提高猪流行性腹泻病毒体外感染效率的细胞亲和剂，其特征在于，所述无机盐由氯化钠、氯化钾和磷酸二氢钠组成，所述氯化钠占细胞亲和剂总重的0.1-1.2％；所述氯化钾占细胞亲和剂总重的0.1-1％；所述磷酸二氢钠占细胞亲和剂总重的0.16-0.8％。
7.根据权利要求6所述的提高猪流行性腹泻病毒体外感染效率的细胞亲和剂，其特征在于，所述氯化钠占细胞亲和剂总重的0.2-0.8％；所述氯化钾占细胞亲和剂总重的0.3-0.5％；所述磷酸二氢钠占细胞亲和剂总重的0.25-0.5％。
8.根据权利要求6所述的提高猪流行性腹泻病毒体外感染效率的细胞亲和剂的制备方法，其特征在于，按照上述质量百分比称取适量的苹果酸、草酸、山梨酸、磷酸、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠和去离子水，将上述各组分溶于去离子水中，过滤即得。
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