CN104611297B

CN104611297B - 一种猪流行性腹泻病毒的培养方法

Info

Publication number: CN104611297B
Application number: CN201510052418.1A
Authority: CN
Inventors: 冯晓声; 贾爱卿; 王贵平
Original assignee: Sichuan Hailinge Biological Pharmaceutical Co Ltd; GUANGDONG HAID ANIMAL HUSBANDRY VETERINARY RESEARCH INSTITUTE Co Ltd
Current assignee: Guangdong Haid Animal Husbandry Veterinary Research Institute Co., Ltd.; SICHUAN HAILINGE BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO., LTD.
Priority date: 2015-01-31
Filing date: 2015-01-31
Publication date: 2017-06-30
Anticipated expiration: 2035-01-31
Also published as: CN104611297A

Abstract

本发明公开了一种猪流行性腹泻病毒的培养方法，包括以下步骤：(1)DMEM培养基的配制：(2)在DMEM培养基中加入1‑8％的胎牛血清，进行单层细胞的培养；(3)将形成有单层细胞的培养容器内的DMEM培养基弃去，并洗液洗涤；(4)弃去洗液，向形成有单层细胞的培养容器内加入猪胰蛋白酶、细胞亲和剂和DMEM培养基；(5)将步骤(4)中的单层细胞放置细胞培养箱中静置培养1分钟‑30分钟，静置培养后取出并迅速接种猪流行性腹泻病毒，混合均匀后放置于细胞培养箱进行培养，收集猪流行性腹泻病毒液。本培养方法主要是在培养过程中通过改变病毒与细胞间的微关系，增加病毒与细胞间亲和度，使病毒更容易感染细胞。

Description

一种猪流行性腹泻病毒的培养方法

技术领域

本发明涉及微生物病毒领域，更具体地说，涉及一种猪流行性腹泻病毒的培养方法。

背景技术

猪流行性腹泻病毒严重影响了我国的养猪业，其感染性强、危害性大，是影响全球养猪业的最重要病毒之一，哺乳仔猪感染后死亡率可达100％，母猪常以带毒而不表现症状形式出现。猪流行性腹泻病毒属于冠状病毒科冠状病毒属的1群，传染性胃肠炎，猫冠状病毒、犬冠状病毒与其属于同一冠状病毒属(Utiger等，1995a)。猪流行性腹泻病毒最初在20世纪70年代被发现，首次发现的病毒经分离纯化及传代后的病毒被命名为CV777，至今很多疫苗生产单位仍然在使用该毒株作为疫苗毒株使用。最近几年在临床上爆发了严重的哺乳仔猪腹泻，且死亡率极高，因此各研究机构都在对引起该疾病的病原进行分析。调查结果显示，引起哺乳仔猪腹泻并死亡的主要病原为猪流行性腹泻病毒，通过对现流行毒株的基因分析，发现流行毒株与二十世纪70年代分离到的CV777毒力基因发生了较大的改变，所以这也许是用含有原始毒株的疫苗免疫失败的原因之一。

目前，各个研究机构对临床分离的猪流行性腹泻病毒进行了体外细胞感染，试图通过体外培养来使该病毒增殖以期用于目前的猪流行性腹泻的防控。国内外有多篇文献报道指出，临床分离到的猪流行性腹泻病毒可以用多种细胞进行体外感染，如VERO细胞、BHK细胞等，但临床新分离的猪流行性腹泻病毒野毒株很难培养，并且培养后基本测不到半数组织细胞感染量(TCID50)，这给该病毒扩大生产及病毒量确定造成了巨大难题，所以如何提高病毒对细胞的浸染效率使之适应体外规模化培养是该病毒体外培养的难点所在。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供一种猪流行性腹泻病毒的培养方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：本发明提供一种猪流行性腹泻病毒的培养方法，包括以下步骤：

(1)DMEM培养基的配制：将13.4克DMEM干粉溶于一升的去离子水中，搅拌至完全溶解后，调节pH值至6.8-7.8，并用≤0.22μm的无菌滤膜进行除菌过滤，置于≤4℃的冰箱待用；

(2)在上述配制好的DMEM培养基中加入占DMEM培养基体积1-8％的胎牛血清，并将该DMEM培养基置于培养容器内进行单层细胞的培养；

(3)将形成有单层细胞的培养容器内的DMEM培养基弃去，并用洗液洗涤2-3次；

(4)弃去洗液，向形成有单层细胞的培养容器内加入猪胰蛋白酶、细胞亲和剂和步骤(1)中的DMEM培养基，其中猪胰蛋白酶的用量为DMEM培养基体积用量的0.1-0.5％，细胞亲和剂用量为DMEM培养基体积用量的0.01-1％；

(5)将步骤(4)中加入猪胰蛋白酶和细胞亲和剂的DMEM培养基放置细胞培养箱中静置培养1分钟-30分钟，静置培养后取出并迅速接种猪流行性腹泻病毒，混合均匀后放置于细胞培养箱进行培养，收集猪流行性腹泻病毒液。

本发明所述的猪流行性腹泻病毒的培养方法，其中，步骤(2)中所述的单层细胞为Vero单层细胞、293单层细胞、ST单层细胞、BHK单层细胞中的任意一种。

本发明所述的猪流行性腹泻病毒的培养方法，其中，步骤(3)中所述的洗液为无菌去离子水、无菌PBS、无菌无血清DMEM培养液中的任意一种。

本发明所述的猪流行性腹泻病毒的培养方法，其中，在步骤(4)中所述的细胞亲和剂由原料混合液制成，所述原料混合液由按照质量百分数计的如下组分：

本发明所述的猪流行性腹泻病毒的培养方法，其中，所述无机盐由氯化钠、氯化钾和磷酸二氢钠组成，所述氯化钠占细胞亲和剂总重的0.1-1.2％；所述氯化钾占细胞亲和剂总重的0.1-1％；所述磷酸二氢钠占细胞亲和剂总重的0.16-0.8％。

本发明所述的猪流行性腹泻病毒的培养方法，其中，所述氯化钠占细胞亲和剂总重的0.2-0.8％；所述氯化钾占细胞亲和剂总重的0.3-0.5％；所述磷酸二氢钠占细胞亲和剂总重的0.25-0.5％。

本发明所述的猪流行性腹泻病毒的培养方法，其中，所述细胞亲和剂的制备方法如下，按照质量百分比称取适量的苹果酸、草酸、山梨酸、磷酸、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠和去离子水，将上述各组分溶于去离子水中，过滤即得。

本培养方法主要是在培养过程中通过改变病毒与细胞间的微关系，增加病毒与细胞间亲和度，使病毒更容易感染细胞。此方法的优点在于可以使猪流行性腹泻病毒更加快速的感染非易感细胞，减少了非易感细胞对于猪流行性腹泻病毒的排斥，从而可以使猪流行性腹泻病毒比通用方法更加快速的在体外培养，根据病毒在细胞产生的病变确定病毒的TCID50，为该病毒的疫苗研发奠定基础。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1为添加本发明实施例1的细胞亲和剂后，原代病毒盲传5-8代次后细胞的病变情况的倒置显微镜图；

图2为添加本发明实施例2的细胞亲和剂后，原代病毒盲传5-8代次后细胞的病变情况的倒置显微镜图；

图3为添加本发明实施例3的细胞亲和剂后，原代病毒盲传5-8代次后细胞的病变情况的倒置显微镜图；

图4为原代病毒盲传5-8代次后细胞的病变情况的倒置显微镜图(未添加细胞亲和剂)。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：

提供一种猪流行性腹泻病毒的培养方法，包括以下步骤：

(2)在上述配制好的DMEM培养基中加入占DMEM培养基体积1-8％的胎牛血清，并将该DMEM培养基置于培养容器内进行单层细胞的培养；所述的单层细胞为Vero单层细胞、293单层细胞、ST单层细胞、BHK单层细胞中的任意一种。

(3)将形成有单层细胞的培养容器内的DMEM培养基弃去，并用洗液洗涤2-3次；所述的洗液为无菌去离子水、无菌PBS、无菌无血清DMEM培养液中的任意一种。

其中，所述的细胞亲和剂由原料混合液制成，所述原料混合液由按照质量百分数计的如下组分：

优选地，所述原料混合液由按照质量百分数计的如下组分：

所述无机盐由氯化钠、氯化钾和磷酸二氢钠组成，所述氯化钠占细胞亲和剂总重的0.1-1.2％；所述氯化钾占细胞亲和剂总重的0.1-1％；所述磷酸二氢钠占细胞亲和剂总重的0.16-0.8％。

优选地，所述氯化钠占细胞亲和剂总重的0.2-0.8％；所述氯化钾占细胞亲和剂总重的0.3-0.5％；所述磷酸二氢钠占细胞亲和剂总重的0.25-0.5％。

其中，所述细胞亲和剂的制备方法如下，按照上述质量百分比称取适量的苹果酸、草酸、山梨酸、磷酸、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠和去离子水，将上述各组分溶于去离子水中，过滤即得。

下面，采用本发明提供的猪流行性腹泻病毒的培养方法，收集各实施例的猪流行性腹泻病毒液。其中，各实施例的细胞亲和剂的原料组分质量百分比如表1所示。按照表1各实施例的原料组分质量百分比称取适量的苹果酸、草酸、山梨酸、磷酸、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠和去离子水，将上述各原料组分溶于去离子水中，过滤即得细胞亲和剂。

表1细胞亲和剂各组分的质量百分比(％)

实施例1

(1)DMEM培养基的配制：将DMEM干粉溶于去离子水中，搅拌至完全溶解后，调节pH值至7.2，并用≤0.22μm的无菌滤膜进行除菌过滤，置于≤4℃的冰箱待用；

(2)在上述配制好的DMEM培养基中加入占DMEM培养基体积1-8％的胎牛血清，并将该DMEM培养基置于培养容器内进行Vero单层细胞的培养；

(3)将形成有单层细胞的培养容器内的DMEM培养基弃去，并用洗液洗涤2-3次；所述的洗液为无菌去离子水。

(4)弃去洗液，向形成有单层细胞的培养容器内加入猪胰蛋白酶、细胞亲和剂和步骤(1)中的DMEM培养基，其中猪胰蛋白酶的用量为DMEM培养基体积用量的0.3％，细胞亲和剂用量为DMEM培养基体积用量的0.5％；

(5)将步骤(4)中加入猪胰蛋白酶和细胞亲和剂的DMEM培养基放置细胞培养箱中静置培养15分钟，静置培养后取出并迅速接种猪流行性腹泻病毒，混合均匀后放置于细胞培养箱进行培养，收集猪流行性腹泻病毒液1。

实施例2

(1)DMEM培养基的配制：将DMEM干粉溶于去离子水中，搅拌至完全溶解后，调节pH值至6.8，并用≤0.22μm的无菌滤膜进行除菌过滤，置于≤4℃的冰箱待用；

(4)弃去洗液，向形成有单层细胞的培养容器内加入猪胰蛋白酶、细胞亲和剂和步骤(1)中的DMEM培养基，其中猪胰蛋白酶的用量为DMEM培养基体积用量的0.1％，细胞亲和剂用量为DMEM培养基体积用量的0.01％；

(5)将步骤(4)中加入猪胰蛋白酶和细胞亲和剂的DMEM培养基放置细胞培养箱中静置培养10分钟，静置培养后取出并迅速接种猪流行性腹泻病毒，混合均匀后放置于细胞培养箱进行培养，收集猪流行性腹泻病毒液2。

实施例3

(1)DMEM培养基的配制：将DMEM干粉溶于去离子水中，搅拌至完全溶解后，调节pH值至7.8，并用≤0.22μm的无菌滤膜进行除菌过滤，置于≤4℃的冰箱待用；

(4)弃去洗液，向形成有单层细胞的培养容器内加入猪胰蛋白酶、细胞亲和剂和步骤(1)中的DMEM培养基，其中猪胰蛋白酶的用量为DMEM培养基体积用量的0.5％，细胞亲和剂用量为DMEM培养基体积用量的1％；

(5)将步骤(4)中加入猪胰蛋白酶和细胞亲和剂的DMEM培养基放置细胞培养箱中静置培养30分钟，静置培养后取出并迅速接种猪流行性腹泻病毒，混合均匀后放置于细胞培养箱进行培养，收集猪流行性腹泻病毒液3。

对比实施例

(4)弃去洗液，向形成有单层细胞的培养容器内加入猪胰蛋白酶和步骤(1)中的DMEM培养基，其中猪胰蛋白酶的用量为DMEM培养基体积用量的0.3％；

(5)将步骤(4)中加入猪胰蛋白酶和细胞亲和剂的DMEM培养基放置细胞培养箱中静置培养15分钟，静置培养后取出并迅速接种猪流行性腹泻病毒，混合均匀后放置于细胞培养箱进行培养，收集猪流行性腹泻病毒液4。

下面，进行猪流行性腹泻病毒体外感染效率的影响试验：

1、猪流行性腹泻病毒体外感染细胞的倒置显微镜图(放大倍数为250x)

在倒置显微镜下观察采用本发明提供的猪流行性腹泻病毒的培养方法，收集各实施例1-3的猪流行性腹泻病毒液盲传5-8代次后细胞的病变情况与采用本发明提供的猪流行性腹泻病毒的培养方法，但未添加细胞亲和剂进行培养，即直接从原代病毒盲传5-8代次后细胞的病变情况(实施例4)。

图4为原代病毒盲传5-8代次后细胞的病变情况的倒置显微镜图(未添加细胞亲和剂)；

由图可见，从原代病毒盲传5-8代次后，细胞开始出现病变(图4)，采用本发明细胞亲和剂后盲传5-8代次后细胞出现明显细胞病变(图1-3)。说明添加本发明制备的细胞亲和剂进行原代病毒盲传，通过改变病毒与细胞间的微关系，增加病毒与细胞间亲和度，从而使猪流行性腹泻病毒在体外培养比通用方法更容易感染细胞。其中，添加实施例1的细胞亲和剂后盲传5-8代次后细胞出现细胞病变最明显。说明该实施例的原料比例最能增加病毒与细胞间亲和度。

2、猪流行性腹泻病毒TCID₅₀的测定：

对猪流行性腹泻病毒进行培养，培养分为A和B两组，培养基及培养条件完全相同，A组添加细胞亲和剂组(即实施例1)，B组为不添加亲和剂组(即实施例4)，将培养2-3天后的病毒取出在显微镜下观察拍照，然后反复冻融三次，并进行TCID₅₀测定。

步骤1、将A组、B组的病毒液分别离心取上清，并用0.22um滤膜过滤，获得A组、B组的上清病毒液；

步骤2、将上述A组、B组的上清病毒液在离心管中作连续10倍的稀释，从10^-1-10^-10；

步骤3、将稀释好的A组、B组的上清病毒液接种到96孔微量细胞培养板中，每一稀释度接种一纵排共8孔，每孔100ul；

步骤4、每孔加入细胞悬液100ul，使细胞量达到3×10⁵个/ml；

步骤5、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排(加100ul生长液和100ul细胞悬液)；

步骤6、培养5天，并逐日观察并记录结果，结果如表2所示；

步骤7、按Karber法进行计算TCID₅₀。

表1 A组、B组出现CPE孔的比率(即细胞病变孔率)

病毒液稀释度	A组出现CPE孔的比率	B组出现CPE孔的比率
			8/8＝1	0/8＝0
	8/8＝1	0/8＝0
			7/8＝0.875	0/8＝0
	5/8＝0.625	0/8＝0
			5/8＝0.625	0/8＝0
	3/8＝0.375	0/8＝0
			0/8＝0	0/8＝0
	0/8＝0	0/8＝0
			0/8＝0	0/8＝0

(1)计算方法：lgTCID₅₀＝L-D×(S-0.5)

其中，L为最高稀释度对数；D为稀释度对数之间的差；S为阳性孔比率总和。

(2)根据实验所得A组与B组的结果：S_A＝0；S_B＝4.5

A组：lgTCID₅₀＝-1-(+1)×(4.5-0.5)＝-5，则TCID₅₀＝10⁵/0.1ml

B组：由于测定过程中细胞无病变产生，故无法计量TCID₅₀的值；

(3)结果分析：

由表2及上述计算结果可知，添加了细胞亲和剂进行培养的A组出现死亡鸡胚的比率远大于没有添加亲和剂进行培养的B组出现死亡鸡胚的比率，同样地，A组出现细胞病变，可计算TCID₅₀，而B组由于测定过程中细胞无病变产生，故无法计量TCID₅₀的值；，说明本发明所述的细胞亲和剂使得猪流行性腹泻病毒的病毒滴度得到大大的提高；另外，从A组的细胞病变比率结果来看，A组的猪流行性腹泻病毒液稀释至10^-6倍时仍具有一定的毒力，而B组的猪流行性腹泻病毒液在最低的稀释浓度下并未产生细胞病变，由此可证，本发明所述的培养方法能够大大提高猪流行性腹泻病毒的病毒滴度。

对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims

1.一种猪流行性腹泻病毒的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

(4)弃去洗液，向形成有单层细胞的培养容器内加入猪胰蛋白酶、细胞亲和剂和步骤(1)中的DMEM培养基，其中猪胰蛋白酶的用量为DMEM培养基体积用量的0.1-0.5％，细胞亲和剂用量为DMEM培养基体积用量的0.01-1％；所述的细胞亲和剂由原料混合液制成，所述原料混合液由按照质量百分数计的如下组分组成：

所述无机盐由氯化钠、氯化钾和磷酸二氢钠组成，所述氯化钠占细胞亲和剂总重的0.1-1.2％；所述氯化钾占细胞亲和剂总重的0.1-1％；所述磷酸二氢钠占细胞亲和剂总重的0.16-0.8％；

(5)将步骤(4)中加入猪胰蛋白酶、细胞亲和剂和DMEM培养基的单层细胞放置细胞培养箱中静置培养1分钟-30分钟，静置培养后取出并迅速接种猪流行性腹泻病毒，混合均匀后放置于细胞培养箱进行培养，收集猪流行性腹泻病毒液。

2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒的培养方法，其特征在于，步骤(2)中所述的单层细胞为Vero单层细胞、293单层细胞、ST单层细胞、BHK单层细胞中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒的培养方法，其特征在于，步骤(3)中所述的洗液为无菌去离子水、无菌PBS、无菌无血清DMEM培养液中的任意一种。

4.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒的培养方法，其特征在于，在步骤(4)中所述的细胞亲和剂由原料混合液制成，所述原料混合液由按照质量百分数计的如下组分组成：

5.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒的培养方法，其特征在于，所述氯化钠占细胞亲和剂总重的0.2-0.8％；所述氯化钾占细胞亲和剂总重的0.3-0.5％；所述磷酸二氢钠占细胞亲和剂总重的0.25-0.5％。

6.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒的培养方法，其特征在于，所述细胞亲和剂的制备方法如下，称取适量的苹果酸、草酸、山梨酸、磷酸、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠和去离子水，将苹果酸、草酸、山梨酸、磷酸、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠溶于去离子水中，过滤即得；

所述苹果酸、草酸、山梨酸、磷酸、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠和去离子水，按照如下质量百分比称取：

苹果酸0.1-1％，草酸0.12-1.2％，山梨酸0.1-1％，磷酸0.01-0.1％，无机盐0.36-3％，去离子水余量；其中，无机盐由氯化钠、氯化钾和磷酸二氢钠组成，所述氯化钠占细胞亲和剂总重的0.1-1.2％；所述氯化钾占细胞亲和剂总重的0.1-1％；所述磷酸二氢钠占细胞亲和剂总重的0.16-0.8％。