CN101633912A - 适合于大规模生产人用禽流感疫苗的裂解方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及禽流感病毒的一种裂解方法，适合用于人用禽流感病毒裂解疫苗的大规模生产，其特征在于首先加入吐温80分散病毒，以乙醚作为裂解剂，该方法作用缓和，裂解剂易于去除，所制备的疫苗具有卵清蛋白含量低、安全性高等优势。

Description

适合于大规模生产人用禽流感疫苗的裂解方法

技术领域

本技术属于生物制药领域。涉及一种可满足人用禽流感病毒裂解疫苗规模化生产的禽流感病毒裂解方法。

背景技术

禽流感病毒是由正黏病毒科流感病毒属的A型流感病毒引起的，是各种家禽和野鸟的一种急性传染病。该病呈全球性分布，给养禽业造成巨大的经济损失。1997年一株禽流感H5N1病毒在香港直接从禽传染给人造成18人感染，6人死亡，该事件说明由禽流感可以造成人流感流行。近几年禽流感在世界范围内有蔓延之势。亚洲近几年一直处于世界禽流感危机中心。据有关人员分析，禽流感的威胁将会持续很多年，卫生专家担心禽流感会和人流感病毒相结合，产生一种易于在人类间传播的疾病。2003年SARS夺走了近800人的生命，禽流感对人类健康的威胁远要比SARS严重许多。目前接种疫苗是预防疾病最有效、最经济的手段。

本发明的目标是研制一种安全有效的人用禽流感裂解疫苗，以预防可能造成的禽流感病毒在人群中的流行。

该发明是利用禽流感病毒反向遗传株NIBGR-14，建立主代种子及工作种子库，规模化、工业化在鸡胚细胞上进行病毒扩增，在此基础上对病毒进行纯化、裂解、灭活等一系列的工艺过程，再进行稀释、除菌过滤制成疫苗。

该发明技术主要是确认禽流感病毒裂解方法及裂解条件，建立具有独立知识产权的人用禽流感病毒裂解疫苗生产工艺。

裂解剂大体可分为三类，即阴离子型裂解剂、非离子型裂解剂和阳离子型裂解剂。其中阳离子型裂解剂，能使病毒变性，生产裂解流感病毒疫苗时多数采用非离子型裂解剂TritonX-100。也有采用3-N-磷酸酯-Tween-80混合来裂解流感病毒。目前国内外人用流感病毒疫苗裂解剂的使用情况：

国外：巴斯德生产的凡尔灵使用TritonX-100、葛兰素史克生产的福禄立适使用去氧胆酸钠、凯龙公司生产的爱阁立保使用Tween-80和CTAB。

国内：使用TritonX-100有5个厂家、TritonX-101的1个厂家、TritonX-101或去氧胆酸钠1家。

我公司采用乙醚进行禽流感病毒的裂解。乙醚是有机溶剂，可溶解脂肪，易挥发微溶于水，使用乙醚可提取尿囊液中的脂类，减少卵清白蛋白的残余，另外还有一定的去除热原和灭活病毒的作用，乙醚的去除方法也简单快捷，由于禽流感病毒具有易聚集的特点，在乙醚裂解之前用Tween-80处理病毒液以减少病毒的聚集，获得了良好的病毒裂解效果，使疫苗的安全性更好。

该发明方法解决了规模化生产中禽流感病毒裂解技术，为大规模生产安全、有效的禽流感病毒裂解疫苗奠定了理论基础。

发明内容

该发明是要摸索禽流感病毒裂解方法及裂解条件，建立具有独立知识产权的人用禽流感病毒裂解疫苗生产裂解方法。

为满足人用禽流感病毒裂解疫苗的生产需要，本发明选用符合疫苗生产的海兰白种蛋孵化的9-11日龄鸡胚，使用禽流感病毒工作种子，进行病毒的生产规模化扩增，收获病毒液。

在本发明方法中，我公司研究用的禽流感毒种为NIBRG-14(05/160)重配高产株，是由A/Vietnam/1194/2004(H5N1)毒株经重配获得，来自英国的NIBSC。

毒种传代和制备用鸡胚来源于无外源性禽白血病病毒、I型和III型禽腺病毒的SPF鸡群；疫苗生产用鸡胚来源于封闭式房舍内饲养的、符合疫苗生产的海兰白或来亨健康鸡群。并选用9～11日龄无畸形、血管清晰、活动的健康鸡胚。

本发明涉及一种规模化生产人用禽流感病毒裂解疫苗的病毒裂解方法，其特征在于乙醚裂解禽流感病毒。

本发明所述的乙醚裂解禽流感病毒的方法，其特征在于将纯化后的禽流感全病毒置于在密闭的容器中，加入适宜浓度的乙醚，并采用磁力搅拌装置进行搅拌，其中包括：禽流感病毒的接踵、病毒培养、病毒收获、病毒纯化、病毒裂解、病毒洗滤及除菌过滤。本发明的优点是：

乙醚是有机溶剂，可溶解脂肪，易挥发微溶于水，使用乙醚可提取尿囊液中的脂类，减少卵清白蛋白的残余，另外还有一定的去除热原和灭活病毒的作用，乙醚的去除方法也简单快捷，由于禽流感病毒具有易聚集的特点，在乙醚裂解之前用Tween-80处理病毒液以减少病毒的聚集，获得了良好的病毒裂解效果。减少疫苗的不良反应，使疫苗的安全性更好。

附图说明

图1禽流感病毒电镜照片(全病毒)(放大3.5万倍)

图2禽流感病毒裂解后电镜照片(放大3.5万倍)

图3禽流感病毒裂解疫苗生产流程图

具体实施方案：

1)鸡胚准备

选用血管清晰、胚胎活动的9～11日龄鸡胚。

2)病毒接种、培育及收获

取禽流感工作种子批毒种根据其感染病毒滴度将病毒稀释成1000-10000个EID50毒种悬液，于鸡胚尿囊腔接种，每胚0.1ml；将鸡胚置33～35℃培育68～72小时，挑选活胚置2～8℃经冷胚16～20小时，分组收获尿囊液。

3)病毒液合并与澄清

病毒的单次收获物合并为病毒合并液，将收获的病毒合并液用300目滤布过滤，再经8000rpm连续流离心澄清。

4)超滤浓缩

选用100～300KD超滤膜，将病毒合并液超滤浓缩30～50倍，血凝滴度应不低于1∶1600。

5)纯化

将浓缩后的病毒液经蔗糖密度梯度30000rpm离心3小时，根据紫外检测仪收集纯化后的病毒峰。

6)裂解与再纯化

在纯化病毒液中按1∶4000加入聚山梨脂80，再按1∶1加入乙醚，室温裂解病毒30分钟。裂解后进行再纯化，收集纯化病毒裂解液。

本发明与现有技术比较的有益效果如下：

项目	本发明技术	现有技术
			纯化效果	好	一般
产品质量	可去除更多的非特异性蛋白	不能去除
			工艺流程	简单	复杂
去除方法	简单	复杂
			产品安全性	用于儿童更安全	付反应较大
产品成本	较原有技术降低	成本较高

实施例

1.材料和设备：

1)乙醚

2)PH7.2PBS

3)纯化后禽流感病毒液：

批号：Q0601          Q0602      Q0603      Q0604

血凝滴度：1∶25600   1∶25600   1∶25600   1∶25600

4)聚山梨酯80(Tween-80)

低速大容量离心机    型号：J-26XP    美国Beckman公司

5)方法：

首先将纯化后禽流感病毒液按终浓度1∶4000加入Tween-80，再按体积比1∶1加入乙醚并混匀，对照组不加裂解剂，置室温并经磁力搅拌器震荡30分钟进行裂解。裂解后经3000rpm低速离心20分钟，收集病毒液层，真空排醚1-2小时，为病毒裂解液。在电镜下观察结果。

从图1可见禽流感全病毒，病毒多数呈球形或椭球形，镜下可见完整的病毒胞膜，表面抗原位于最外层，清晰可见。少数病毒不规则如丝状。

从图2可见禽流感流感病毒裂解均匀，裂解程度较好，完整病毒颗粒极少见。

Claims (9)

1.本发明涉及一种规模化生产人用禽流感病毒裂解疫苗的病毒裂解方法，其特征在于，采用禽流感毒种NIBRG-14(05/160)重配高产株，以鸡胚作为基质细胞，规模化制备人用禽流感病毒裂解疫苗，其中包括：病毒接踵、病毒培养、病毒收获、粗滤尿囊液、连续流低速离心、超滤浓缩及蔗糖密度梯度离心、病毒裂解及再纯化。

2.权利要求1所述的在本发明方法中，采用的禽流感毒种为NIBRG-14(05/160)重配高产株，是由A/Vietnam/1194/2004(H5N1)毒株经重配获得，来自英国的NIBSC。

3.权利要求1所述的在本发明方法中使用鸡胚，病毒种子库为SPF鸡胚，生产用鸡胚为来源于封闭式房舍内饲养的、符合疫苗生产的海兰白或来亨健康鸡群。并选用9～11日龄无畸形、血管清晰、活动的健康鸡胚。

4.权利要求1所述的本发明中病毒培养方法为：

1)将禽流感病毒工作种子制备成1000-10000个EID50毒种悬液，于鸡胚尿囊腔接种，每胚0.1ml；

2)将鸡胚置33～35℃培育68～72小时；

3)挑选活胚置2～8℃经冷胚16～20小时，分组收获尿囊液。

5.权利要求1所述的本发明中病毒液合并与澄清方法其特征为：

1)将收获的病毒合并液用300目滤布过滤；

2)8000rpm连续流离心澄清。

6.权利要求1所述的在本发明中病毒液超滤浓缩方法其特征为：选用100～300KD超滤膜，将病毒合并液超滤浓缩30～50倍。

7.权利要求1所述的在本发明中病毒液纯化方法其特征为：将浓缩后的病毒液经蔗糖密度梯度30000rpm离心3小时。

8.权利要求1所述的本发明中病毒裂解方法其特征为：在纯化病毒液中按1∶4000加入聚山梨脂80，再按1∶1加入乙醚，在室温条件下磁力搅拌裂解病毒30分钟。裂解后进行再纯化，收集纯化病毒裂解液。

9.权利要求1所述的本发明中病毒纯化方法，其中病毒纯化液的收集采用紫外检测仪，收集纯化后的病毒。

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