CN105744952A - 病毒疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了使抗原产量最大化并且还稳定Vero细胞来源的纯化的灭活乙型脑炎病毒原液的新颖的方法和适当的实验技术。公开了用于疫苗制剂的商业化制备的细胞培养和病毒培养的可选方法。稳定化的灭活病毒原液在2℃?8℃可被长期贮存直到疫苗配制。

Description

病毒疫苗及其制备方法
发明领域
本发明涉及病毒疫苗组合物的领域。特别地，本发明涉及乙型脑炎疫苗组合物以及制备抵抗乙型脑炎感染的疫苗组合物的过程或方法。本发明涉及用于生产和纯化病毒原液(virus bulk)的方法及其所述乙型脑炎病毒原液的灭活技术。
发明背景
乙型脑炎病毒(JEV)是蚊传感染，是整个亚洲病毒性脑炎的主要原因，并越过其大陆界限进行传播。JEV被归类为黄病毒科(flavivirus family)和黄病毒属(genus flavivirus)。它是包含10.9kb单链、反义RNA基因组的小包膜病毒(50nm)。病毒体RNA编码包括四种结构蛋白和七种非结构蛋白的11种蛋白。在4种结构蛋白之中，表面包膜蛋白(E蛋白)作为细胞受体结合蛋白和融合蛋白，用于病毒附着并进入宿主中。所以抗体抵抗E蛋白中和病毒，并在保护中发挥重要作用。表面结构E蛋白是疫苗的重要组分，因此它对于用合适的疫苗效力稳定剂稳定该蛋白分子是非常重要的。
由于疫苗的广大区域分布和环境温度的差异，存在改进制备乙型脑炎病毒原液的生物过程用于制备生产用微生物并进一步利用疫苗的需求。乙型脑炎的生物过程包括在滚瓶烧瓶或细胞工厂单位中生长。通过滚瓶细胞培养或通过细胞工厂生产工业量的乙型脑炎疫苗需要较大量的时间，产量相对较少，并且还占用大量空间，这使得在每个细胞工厂中时常并经常难以控制和调节实验参数。病毒原液的生产因此固有地缺乏操作的均一性。本发明通过其新的生物处理技术克服了这些困难，其中得到大量的工业乙型脑炎原液所需要的时间被大幅减少。与早期培养技术相比，使得疫苗原液能够在少得多的时间内商业化生产。首先使Vero细胞在一次性生物反应器中生长，随后是用JEV感染，其中，作为该发明的新颖的特征，完成了多次病毒收获。产生病毒，接着是特别适用于乙型脑炎疫苗抗原的同时灭活和稳定化方法。乙型脑炎疫苗的稳定化通常需要在2℃-8℃的规定的温度范围保持疫苗小瓶或原液，稳定较长的时间段。这需要另外的基础设施以运输和贮存疫苗，从而增加了疫苗的成本。对于乙型脑炎，克服一些最实际的限制需要可选的稳定化技术。根据本发明中公开的方法从病毒原液如此获得的疫苗不需要以上提及的任何特定冷藏设施并且在环境温度条件即在室温(25℃)是稳定的。通过本发明获得的稳定性与在将乙型脑炎疫苗贮存在冷藏温度(2℃-8℃)的情况中观察到的稳定性是相当的。病毒原液和疫苗赋予受试者足够免疫的效力和免疫原性也被保留。
发明目的：
本发明的一个目的是提供能够预防乙型脑炎病毒的印度科拉尔(IndianKolar)毒株引起的乙型脑炎感染并对其提供治疗的稳定的灭活的疫苗组合物。
本发明的另一个目的是提供使乙型脑炎病毒的科拉尔毒株在Vero细胞中适应的方法。
本发明的又另一个目的是提供以指定的实验参数商业化生产纯化的灭活的乙型脑炎原液的合适方法，以及能够使用一次性生物反应器以高得多的产量多次收获乙型脑炎原液的技术。
本发明的又一个目的是提供在乙型脑炎病毒原液的下游处理期间使用特定的基质柱的商业化规模的新颖纯化技术。
本发明的又另一个目的是提供同时灭活和稳定所纯化的乙型脑炎病毒原液的方法。
发明概述：
根据本发明的一个实施方案，公开了在一次性生物反应器中培养Vero细胞的多种方法。在包括适当的培养基组成和培养基所需的变化的多种实验参数方面，Vero细胞的生长满意水平被优化，以在期望量的时间内获得满意水平的细胞计数。用活的乙型脑炎病毒印度科拉尔毒株感染Vero细胞，并且相应地实施方案描述了在一次性生物反应器中使乙型脑炎病毒适应在Vero细胞中生长的方法。
根据本发明的另一个实施方案，乙型脑炎病毒的科拉尔毒株在Vero细胞中的适应从一次性生物反应器放大至下一后续规模的一次性生物反应器，以生成生产批次规模产量的纯化的JEV原液。根据细胞容量，一次性生物反应器被命名为DB-1至DB-100至DB-500。
本发明的另外的实施方案提供了使用多种新颖的层析技术下游纯化活JEV原液的可选方法，所述方法导致获得高量的纯化的JEV原液。
本发明的又一个实施方案公开了同时灭活和稳定纯化的JEV原液的新颖方法。
本发明还提供了在25℃-37℃纯化的灭活的JEV原液的稳定性的实验数据，为疫苗配制做好准备。
本发明的又另外的实施方案提供了包含疫苗抗原的乙型脑炎疫苗组合物，其中所述抗原是乙型脑炎病毒的科拉尔毒株。
发明详述：
定义
初始细胞接种：在培养烧瓶中接种所需的初始量的细胞。
DMEM：Dulbecco改良的Eagle培养基
EMEM：Eagle最小必需培养基
NBCS：新生牛血清
本发明公开了乙型脑炎病毒的新颖的印度毒株JEV821564-XY，其为乙型脑炎病毒的科拉尔毒株。乙型脑炎病毒的该科拉尔毒株JEV821564(在下文被称为‘科拉尔毒株’)通过材料转移协议被从National Institute ofVirology,Pune转移至Bharat Biotech International Limited。目前，不存在抵抗乙型脑炎病毒的印度毒株(科拉尔)的疫苗组合物。此外，乙型脑炎病毒的该特定毒株以以下方法生长：其中为了毒株的培养，使毒株适应于Vero细胞。病毒培养物通常在液体培养基中生长。任何生物产品的Vero细胞的细胞培养包括非常高数目的滚瓶或细胞工厂。在细胞工厂中的病毒培养耗费较长的持续时间。细胞工厂占据较高的空间量，并且还难以在病毒培养期间个体地监测细胞工厂中的所有实验参数。通过常规细胞工厂，乙型脑炎的产量是极小的。
因此，本发明公开了在一次性生物反应器中制备乙型脑炎病毒的该科拉尔毒株的新颖方法。乙型脑炎病毒适于在Vero细胞中生长，并且病毒的该特定毒株适于在供给特定培养基的Vero细胞中繁殖。相同的Vero细胞能够在单次感染内给予病毒原液的多次收获。尽管JE病毒在Vero细胞中的繁殖已被认知，但是在本发明中展示的乙型脑炎病毒(JEV)的多次病毒收获的该特定技术是独特且不同的。此外，在新型设备(除了滚瓶和细胞工厂之外)诸如在本发明中使用的新型设备中获得期望量的(Vero细胞的)细胞生长先前未被提供，在本发明中使用的所述新型设备是一次性生物反应器，且从较小容量一次性生物反应器放大至较高容量生产规模批次的一次性生物反应器。乙型脑炎病毒在Vero细胞中繁殖的常规使用方法是通常在细胞工厂或滚瓶中生长，其中Vero细胞以层的形式仅被利用一次。Vero细胞系通过感染乙型脑炎病毒来利用，并且该细胞系仅在被病毒种子库感染一次之后就被耗尽。但是，在本发明中，Vero细胞以此类独特且新颖的技术生长，并且实验参数以这样的方式来设置：种子乙型脑炎病毒的单次感染能够从一次性生物反应器中的同一Vero细胞系培养物产生至少三次至五次的病毒原液收获。同时，这减少了感染的次数以及空间量和需要感染以及感染和生长相同的病毒细胞培养物量所需的较多的细胞工厂量。另外，与涉及用细胞工厂完成并获得相似产量的方法相比，从细胞培养物多次收获还在病毒收获的数量和质量两方面将产量的量上自动地增加至非常高的量。
此外，本发明涉及在灭活过程期间和在病毒原液的贮存期间稳定纯化的JEV原液。每种稳定剂成分的范围从0.5％w/v至1％w/v。被添加至病毒抗原的化学稳定剂是D-山梨醇和甘氨酸。病毒抗原和合适的稳定剂一起被贮存在足够的生理上可接受的磷酸盐缓冲液盐水中，以使pH保持在从7.0至约7.4。
实施例1：细胞培养及JE病毒的科拉尔毒株对Vero细胞的适应。
Vero细胞的初始细胞接种在包含Vero细胞的T-175烧瓶中进行。Vero细胞培养在T-175烧瓶中进行并在合适的培养基中生长。在4-5天之后，将从1个T-175烧瓶获得的细胞生长物转移至5个T-175烧瓶。又在4-5天之后，将其进一步转移至1个细胞工厂-10(CF10)，并且然后再次转移至5个细胞工厂-40(CF-40)。目前，CF-40被用于JEV原液的商业化生产。对于生产一个商业批次的JEV原液，在一个月的时间段内产生一个批次的JEV原液需要至少30个CF-40。本发明教导了在Vero细胞中繁殖JE的科拉尔毒株的特定方法，所述方法可用于商业化放大原液生产，并能够在相同的时间段即大约一个月内产生多达大约140个CF-40的JEV原液。与30个CF40相比，这导致了较高的病毒产量，因为被提取的原液总量是非常高的。在相同的时间段内如此高的JEV原液产量对于商业上增加生产能力是大的优势。此外，对于持续大量的时间即大约一个月同时监测并控制大约200个CF40在实践上是不可能的。根据目前的实践，对于操作30个CF-40的批次规模，需要可容纳至少3-4个人操作并进行实验的小型孵育室(walk-in incubator room)作为培养设施的最低需求。孵育室应贯穿批次保持在37℃的恒定的规定温度。因此，可以确定的是，使将提供200个细胞工厂-40(200个CF40)的孵育室恒定地运行5-6个月的时间段的要求将肯定地增加生产成本。可选地，对于在一个月的时间段内同时运行大约多达150个CF-40，将需要恒定地保持在37℃的巨大规模和特大规模的孵育室，以提供足够至少20个人操作和控制实验参数的空间。建立如此设施是完全不经济的。如此巨大的孵育室将引起另外的和巨大的投资，从而使最需要JE疫苗的那些人难以负担疫苗。对于疫苗生产所必须的回收批量乙型脑炎病毒，所有的实验参数将是变化的，并且实验终点不能同时完成。对于等量的JEV原液生产，在150-200个CF40中的细胞培养将耗费大约多于6个月的时间。对于150-200个CF40，在一个月的时间内同时调控诸如温度、pH、溶解氧、搅拌和培养基供给的重要实验参数是不可能的。此外，在一个批次的JEV原液中，操作30个CF40的所有所述实验参数也是非常多的，并需要高度成熟的技术以及人力资源和劳动力，以确保批次成功生产出所需数量的JEV原液。与CF40的情况不同，本发明公开了在一次性生物反应器而不是在细胞工厂(CF40)中制备JEV原液的新颖方法，其中在一次性生物反应器中所有的技术规格都可随细胞培养和病毒培养所需要的准确度和精确度的所需程度而被调节，在细胞工厂的情况中这是无法达到的。本发明用此类合适的一次性生物反应器代替了在JEV原液生产中CF40的使用。给定的一次性生物反应器提供了必要的通道、探针和传感器，通过所述必要的通道、探针和传感器自动地调控细胞培养和病毒培养过程是可能的。因此，在给定的一次性生物反应器中，多种实验参数如温度、pH、溶解氧、搅拌和培养基供给的控制被容易地实现，且具有所需的准确度和精确度。另外，JE病毒的科拉尔毒株在生物反应器中的Vero细胞中的适应能够在与在一个批次中30个CF40的情况中所需的相同的时间内在一个生产批次中产生至少40个CF40至200个CF40的量的JEV原液。在30个CF40的等价相应生产能力和产出量的情况中，所获得的产量是较高的，并且对于5-6月内多达200个CF40会获得的相应生产能力和产量的情况中，获得的产量明显是非常非常高的。另外，对于使用生物反应器而不是CF40，损失的量显著地最小化，达到相当的程度。非常明显的是，在生产包括大约200个细胞工厂的情况中，在持续5-6个月的时间段的批量生产中，一定或势必会经历损失。因为使用了根据该发明中公开的方法的用于JEV原液生产的生物反应器，该可能性完全被排除。从以下实验，显示出在如在30个CF40和/或200个CF40两者中的可比的产量的情况中，使JE病毒的特定科拉尔毒株适应于在给定的生物反应器中生长的Vero细胞的本发明增加了病毒生产的产量。除了以上提及的在一次性生物反应器中生产JE原液的优势以外，一个另外的优势在于如下事实：在如本发明公开的一次性生物反应器的情况下，污染风险被极大程度地最小化。在一次性生物反应器中生产JE原液的情况中，由于所有实验参数通过电子指令来控制，所以手动操作最少。因此，与其中存在批次污染的较大概率和可能性的在细胞工厂中批次生产的情况不同，在如以下在接下来的段落中描述的被称为DB、DB-100和DB-500的多种规模的一次性生物反应器中生产JE原液的情况中批次污染的较大概率和可能性是不适用的。一次性生物反应器的一个另外的优势是，它可产生一致的细胞，从而导致一致的产量，然而在细胞工厂的情况中，由于手动处理调控实验参数，保持一致的产量达到与一次性生物反应器的一致的产量如此相似的程度是不可能的。
通常，在30个CF40中用于细胞生长的总可用表面积是763200cm2，可具有～75000-90000x 106个细胞的容量，然而在该发明中使用的一次性生物反应器具有范围从26000cm2至5000000cm2的可用于细胞生长的总表面积，该总表面积支持所需要的量的细胞生长,并且支持Vero细胞作为病毒的基础(substrate)的另外的可用性以使得病毒可感染越来越多数目的Vero细胞，以满足在生物反应器中所需要的量的增加的JE原液生产。总细胞计数容量范围为从大约7800x 106个至1500000x 106个细胞。可用的细胞数目增加表示着病毒可用的基础增加，以感染越来越多数目的细胞，并因此可实现较大量的JE原液生产。
表1.1：细胞工厂和一次性生物反应器之间的比较。
细胞培养是在生物技术过程中被广泛实践的技术。但是，虽然给定的细胞能够在多于一种给定的培养基中生长，当培养基被改变时，给定的细胞的特征可改变。同样重要的是要注意，对于特定的细胞系，细胞生长的时间和持续时间也变化。细胞生长取决于几个重要的参数，诸如，培养基、生长因子、葡萄糖浓度、氧气可用性以及初始接种的量和感染复数(MOI)。此外，细胞的生长还倾向于不规律的pH改变，这需要在细胞培养的不同阶段进行持续的监测。因此，已证实，细胞的生长对于目的和周围环境，以及物理-化学因素是特异性的。与早期实践不同，使Vero细胞系在所提到的生物反应器中而非细胞工厂中生长是在本发明中已克服的单独障碍。另外，使Vero细胞系在生物反应器中生长可需要以特定和适当的时间间隔频繁改变培养基，以优化细胞生长。培养基上的改变还需要特别计算的成本效益措施，以确证细胞生长最大化。生物反应器中的温度波动的控制对于支持良好的细胞生长也是一个重要的问题。同时，非常高的细胞生长量可导致低的产量，然而在低于期望的水平的非常低或低的细胞生长的情况中，也导致实验失败。因此，期望在新的环境(即，一次性生物反应器)中增强和改善所有以上提及的参数，以获得所需量的健康Vero细胞，其将产生最佳产量的JE原液。因此，进行了许多实验，以使Vero细胞在给定的合适的一次性生物反应器中的基于微载体的细胞培养中生长，且根据相应的天数在各自培养基中的细胞生长被观察并被制成表。实验成功地达到大于100000个细胞/cm2并且自初始接种的相应天数被记下。所得物被进一步用来在相应实验中以0.005的感染复数(MOI)感染乙型脑炎病毒。
病毒的特定毒株对特定细胞基础的适应是又一个挑战。尽管JE病毒对Vero细胞的适应是已知的，但是它始终是毒株特异性的。病毒的每个单独的毒株涉及到生长并以给定的方式感染Vero细胞的特定条件，所述特定条件确保病毒的高增长和快速增殖。如在本申请中展示的发明涉及乙型脑炎病毒的科拉尔毒株在Vero细胞中的适应。JE病毒的实验室适应的毒株的特征可表现出与其早期分离的毒株的特征在以下方面不同的特征：Vero细胞中快速生长、病毒滴度及它们的生成物效力。病毒特征和遗传稳定性可使产量和JE原液的商业化生产所需的必要过程不同。与病毒毒株中的差异相关的困难不能与早期的适应过程直接关联。因此，本发明公开了乙型脑炎病毒的新毒株(其是分离的JE病毒的科拉尔毒株且是印度次大陆特有的)在如以上实施例中提及的特定一次性生物反应器中的Vero细胞中的适应，所述适应能够得到高产量的JE原液，所述JE原液具有足够引发给定受试者抵抗乙型脑炎病毒感染的保护性免疫应答的高效力。如在本发明中呈现的实施例公开了使乙型脑炎病毒的新颖科拉尔毒株在Vero细胞中适应的独特方法，以及从初始细胞系获得的所述新颖科拉尔毒株的多次的收获物。详述在一次性生物反应器(DB)中并进一步放大至在DB-100(实验I-II)和DB-500中的多次病毒收获的实验在下面提及的实验中被列举，并在以下被制成表(表1.2)。尽管细胞培养在细胞工厂中进行，细胞培养以以下所给定的顺序从T-175烧瓶逐步地、连续地并按时间顺序地放大至细胞工厂：1个T-175至5个T-175至1个CF10至5个CF10至5个CF40至30个CF40。将活Vero细胞系从一个平台转移至下一个平台需要胰蛋白酶消化。胰蛋白酶消化是这样的过程：通过该过程粘附的细胞从单层分离，以使得它们可被转移至被称为细胞扩增的下一个水平。此类胰蛋白酶消化是重要的过程并需要技术来执行它，并且在每个特定中间步骤的胰蛋白酶消化也是耗时的。用26000个细胞/cm2的初始细胞接种在初始规模体积的一次性生物反应器(被称为DB)中进行的初始实验意味着尽管使用DB100或DB500，在一次性生物反应器中初始地接种细胞之前，将仍需要数次胰蛋白酶消化。因此，我们需要使在一次性生物反应器中的细胞接种最少化，因为它与大规模的生物反应器接种直接成正比。例如，如果对于初始规模的一次性生物反应器(DB)我们优化接种26000个细胞/cm2，则DB-100接种将需要10个CF-40生长的细胞(26000x 106个细胞)，而对于DB-500将需要50个CF-40的细胞(130000x 106个细胞)。用胰蛋白酶处理这些许多的CF以从其收集细胞是非常困难的。用改变的或最小化的3000个细胞/cm2接种DB-100需要1个CF-40生长的细胞(3000x 106个细胞)，而对于DB-500将需要6个CF-40的细胞(15000x 106个细胞)。
用具有3000个细胞/cm2的初始细胞接种，具有EMEM、葡萄糖1g/L的一次性生物反应器来进行实验。对于细胞生长，进行多次培养基更换，并且近似葡萄糖浓度为约1gm/L。在细胞增殖中存在逐渐增加，但生长速率较慢并耗时，这延迟了被病毒感染，在第一次和第二次收获之后进一步导致低的病毒收获。因此，进行了后续实验，以获得最小化在一次性生物反应器中大约3000个细胞/cm2的初始细胞接种的目的，以使得只要供应的适当的培养基诸如DMEM和高的葡萄糖浓度(4.5g/L)，Vero细胞的相当多的生长就被实现。与用同样不需要更换培养基的优化的培养基进行先前实验相比，获得了较快的生长速率。
在以下表中提供了(实验III-IV)：
表1.2：从一次性生物反应器(DB)放大至DB-100和DB-500，以及多次的病毒收获值。病毒收获数据全都以噬斑形成单位来提及。
系列号 说明 范围
1 溶解氧ppm 50-70
2 pH 7.2-7.6
3 温度℃ 35.5-37.5
4 搅拌rpm 260-280
5 流入速率ml/min 80-150
6 流出速率ml/min 84-156
表1.3：对于在表1.2中提到的所进行的实验，一次性生物反应器的操作参数
实验的合理目的和结果：
实验I-目的：从一次性生物反应器放大至商业化批次规模的一次性生物反应器100(DB-100)。
该实验用具有3000个细胞/cm2的初始细胞接种，具有EMEM、葡萄糖1.5g/L的一次性生物反应器-100(DB100)来进行。对于细胞生长，不更换培养基，并使保持的葡萄糖浓度保持为约1gm/L。培养基还包含5％NBCS(moregate)。细胞增殖存在逐渐增加。在第5天，它达到了100000个细胞/cm2的最大值。在第5天，JE病毒科拉尔毒株以0.005MOI(感染复数)感染Vero细胞。从感染日开始，在感染的第4天，已使用无血清培养基来收集病毒收获物1(VH1)，并以3天的间隔分别收集VH2、VH3和VH4。通过微滤或深度过滤来净化病毒收获物。通过使用切向流动过滤300kDa盒来浓缩所净化的收获物，并使所浓缩的收获物进一步经受柱纯化。
结果：在以上表中提到了单独的病毒收获物滴度值。获得了期望的病毒生长滴度。不需要更换培养基。VH1显示出106.88PFU的滴度值，且VH2显示出107.02PFU的滴度值。VH3和VH4病毒滴度分别显示为106.49PFU和105.84PFU。
实验II-目的：从一次性生物反应器放大至商业化批次规模的一次性生物反应器100。
该实验用具有3000个细胞/cm2的初始细胞接种，具有DMEM、葡萄糖4.5g/L的一次性生物反应器-100(DB100)来进行。对于细胞生长，不更换培养基，并且使保持的葡萄糖浓度保持为约1.0gm/L。培养基还包含5％NBCS(moregate)。细胞增殖存在逐渐增加。在第5天，它达到100000个细胞/cm2的最大值。在第5天，以0.005MOI来感染细胞。从感染日开始，在感染后的第4天已使用无血清培养基收集病毒收获物1，并以3天的间隔分别收集VH2和VH3。通过微滤或深度过滤来净化病毒收获物。通过使用切向流动过滤300kDa盒来浓缩所净化的收获物，并且使所浓缩的收获物进一步经受柱纯化。
结果：在以上表中提到了单独的病毒收获物的滴度值。获得了期望的生长滴度。不需要更换培养基。VH1显示出106.75PFU的滴度值，且VH2显示出107.16PFU的滴度值。VH3和VH4病毒滴度显示为小于107PFU。
实验III-目的：从一次性生物反应器-100(DB100)放大至商业化批次规模的一次性生物反应器-500(DB500)。
该实验用具有3000个细胞/cm2的初始细胞接种，具有EMEM、葡萄糖1.5g/L的一次性生物反应器-100(DB100)来进行。对于细胞生长，不更换培养基，并且使保持的葡萄糖浓度保持为约1gm/L。培养基还包含5％NBCS(moregate)。细胞增殖存在逐渐增加。在第7天以0.005MOI来感染细胞。从感染日开始，在感染之后的第4天，已使用无血清培养基收集病毒收获物1，并以3天的间隔分别收集VH2和VH3。通过微滤或深度过滤来净化病毒收获物。通过使用切向流动过滤300kDa盒来浓缩所净化的收获物，并使所浓缩的收获物进一步经受柱纯化。
结果：以上表中提到了单独的病毒收获物滴度值。获得了期望的生长滴度。不需要更换培养基。VH1显示出107.22PFU的高滴度值，且VH2显示出106.92PFU的滴度值。VH3和VH4病毒滴度显示为小于107PFU。
实验IV-目的：从一次性生物反应器-100(DB100)放大至商业化批次规模的一次性生物反应器-500(DB500)。
该实验用具有3000个细胞/cm2的初始细胞接种，具有DMEM、葡萄糖4.5g/L的一次性生物反应器-100(DB100)来进行。对于细胞生长，不更换培养基，并且使保持的葡萄糖浓度保持为约1gm/L。培养基还包含5％NBCS(moregate)。在细胞增殖中存在逐渐增加。在第7天用JE病毒科拉尔毒株以0.005MOI来感染细胞。从感染日开始，在感染之后第4天已使用无血清培养基收集病毒收获物1，并以3天的间隔分别收集VH2、VH3。通过微滤或深度过滤来净化病毒收获。通过使用切向流动过滤300kDa盒来浓缩所净化的收获物，并且使所浓缩的收获物进一步经受柱纯化。
结果：在以上表中提到了单独的病毒收获物的滴度值。获得了期望的生长滴度。不需要更换培养基。VH1显示出107.41PFU的高滴度值，且VH2显示出107.11PFU的滴度值。VH3和VH4病毒滴度分别显示为106.47PFU和105.78PFU。
实施例2：使用celufine硫酸酯基质纯化JE原液以及JE原液的灭活。
在一次性生物反应器中产生的JE原液的纯化基于亲和层析术使用celufine硫酸酯柱来进行。Celufine硫酸酯柱纯化包括层析技术，其中所述celufine硫酸酯是由纤维素支持基质在活化的基团硫酸酯的存在下构成的柱基质。首先将总的收获物体积用300kDa膜从300升浓缩至50升，以获得包含活JEV的存留物。将渗透物丢弃。存留物包含JE病毒。使存留物经受使用所述celufine硫酸酯基质的柱纯化。使50升的浓缩的收获物体积经过celufine硫酸酯柱，并将流出物丢弃，因为流出物包含不想要的蛋白以及其他遗传材料。与柱结合的病毒将通过使用包含高量的盐的洗脱缓冲液洗脱出来。通过所测量的给出锐锋的光密度值来定量洗脱物，所述锐锋表示着纯化的活乙型脑炎病毒的存在。将在洗脱中收集的病毒通过相对于磷酸盐缓冲盐水的缓冲液交换重复进行至少5-6次来渗滤，以去除盐、某些不想要的蛋白以及其他遗传材料。收集存留物并通过0.45μPVDF(聚偏二氟乙烯)膜过滤。随后，用1:1500v/v至1:2500v/v之间的比率的福尔马林连同仅在灭活过程期间添加的包含0.1-1％山梨醇和0.1-1％甘氨酸的稳定剂混合物在22℃持续7天来使活JE原液灭活。将0.5％w/v甘氨酸和1％w/v山梨醇的比浓度的稳定剂连同灭活剂福尔马林或BPL一起添加至活JE病毒。添加稳定剂，仅是防止病毒在以上提到的7天的灭活孵育时间段期间降解，所述灭活孵育是由添加了灭活剂福尔马林或β-内丙酯(BPL)引起。在灭活之后，使JE原液通过相对于磷酸盐缓冲盐水缓冲液交换至少5-6次而被进一步渗滤，以将福尔马林从纯化的灭活的JE原液去除。通过使用0.22μPVDF(聚偏二氟乙烯)膜过滤，将经渗滤的JE原液无菌过滤。将灭活的JE原液在5℃±3℃贮存持续至少24个月至36个月，用于稳定性研究。根据本发明中公开的方法之一，乙型脑炎(科拉尔毒株)原液的纯化和灭活步骤可被概括如下：
(a)将病毒收获物用0.45μ膜净化，以将细胞碎片从所述病毒收获物去除；
(b)用300kDa聚醚砜(PESU)膜盒将收获物体积浓缩至少4倍，以获得浓缩的存留物；
(c)使步骤(b)的浓缩的收获物存留物通过celufine硫酸酯基质柱来进行柱纯化，以收集包含期望的病毒、高量的盐细胞蛋白和核酸物质的洗脱物，其中所述基质由纤维素支持基质在活性基团硫酸酯的存在下组成；
(d)使用300kDa PESU膜盒使步骤(c)的洗脱物相对于磷酸盐缓冲盐水渗滤和缓冲液交换至少5-6次，以收集存留物，并将不期望的高量的盐细胞蛋白和核酸物质从感兴趣的病毒去除，以收集纯化的浓缩的病毒原液；
(e)使步骤(d)的所纯化的浓缩的病毒原液经受0.45μPVDF(聚偏二氟乙烯)膜过滤，以消除过程中的任何污染物；
(f)将步骤(e)的纯化的病毒用1:1500v/v至1:2500v/v之间的比率的福尔马林(即1体积的福尔马林处理2500体积的活JE)连同稳定剂在22℃持续7天的时间段来同时稳定化和灭活，其中所述稳定剂由甘氨酸和山梨醇组成，或者用1:1500v/v至1:2500v/v之间的比率的β-丙内酯(即1体积福尔马林处理2500体积的活JE)连同稳定剂在5℃±3℃持续7天的时间段来同时稳定化和灭活，其中所述稳定剂由甘氨酸和山梨醇组成；
(g)仅在福尔马林灭活的情况中，使用300kDa PESU膜盒使步骤(f)的灭活的纯化的病毒原液相对于磷酸盐缓冲盐水渗滤和缓冲液交换至少5-6次，以去除的福尔马林；
(h)使步骤(g)的纯化的灭活的病毒原液进行0.22μPVDF(聚偏二氟乙烯)膜过滤，以获得在5℃±3℃持续至少24个月至36个月不含任何污染物、适合于配制乙型脑炎疫苗的最终且稳定的灭活的JEV原液。
提供了在30个CF40中通过多次病毒收获的批次规模生产的情况中通过celufine磷酸酯基质纯化的结果。在一个月内一个批次的30个CF40用celufine磷酸酯获得的总病毒原液在下面提及。相应地，可用每剂NLT(不少于)5μg灭活JE制备的JE疫苗的剂数也从在30个CF40的情况下的至少60,000剂可观地增加至分别在一次性生物反应器-100(DB-100)和一次性生物反应器-500(DB-500)的情况下的至少10万剂至30万剂。
表2.1：通过celufine硫酸酯基质纯化，纯化的灭活的JEV原液和使用30个CF40在1个月内的剂数。
以下提到了一个批次的DB100在一个月内获得的总的病毒原液。相应地，还在以下还计算并提供了可用每剂7μg灭活的JE制备的JE疫苗的剂数：
表2.2：通过celufine硫酸酯基质纯化，纯化的灭活的JEV原液和使用DB-100在1个月内的剂数。
在以下提到了一个批次的DB-500在一个月内获得的总的病毒原液。相应地，以下还计算并提供了可用每剂7μg灭活JE制备的JE疫苗的剂数：
表2.3：通过celufine硫酸酯基质纯化，纯化的灭活的JEV原液和使用DB-500在1个月内的剂数。
因此，我们可看出，对于相同的时间段或甚至较少的时间段(38天)，在一次性生物反应器DB-100中在一个商业化批次中产生的总的JE原液等于在至少48个CF40中将会产生的JE原液的量。类似地，对于相同的时间段(39天)，在用DB-500的商业化批次的情况中，产生的JE原液的量等于在至少147个CF40中将会产生的JE原液的量。这证实了通过在DB-100和DB-500规模的新颖的一次性生物反应器中进行乙型脑炎病毒的商业化生产实现了显著的技术进步。
实施例3：使用基于琼脂糖的基质柱纯化JE病毒以及JE病毒的灭活。
使用基于琼脂糖的柱Capto Core-700纯化JE病毒是本发明的另一个新颖的方面。与celufine硫酸酯纯化相比，可在一个批次规模的DB-100和DB-500中制备的剂数甚至是较高的。Capto Core 700柱由高度交联的琼脂糖基质与官能活性配体辛胺组成，两者均负责疏水相互作用，并且还带正电荷，以在宽的pH和盐浓度范围内与大部分杂质强烈相互作用。在该使用Capto Core-700基质纯化JE病毒的方法中，优势是对病毒收获的浓度无要求。关于Capto Core基质的原则是尺寸排阻连同亲和层析技术两者同时起作用。柱纯化通过使整个收获物体积通过Capto Core基质来完成。存在于收获物中的具有低于700kDa的分子量的蛋白以及其他遗传材料将被结合至Capto Core基质。收集流出物，流出物包含活JE病毒，因为病毒将不与Capto Core基质结合。这之后是通过300kDa聚醚砜(PESU)膜盒来浓缩。将渗透物丢弃，并且在此阶段存留物包含活JE病毒。之后，将存在于存留物中的浓缩的活JE病毒通过用1:1500v/v至1:2500v/v之间的比率的灭活剂福尔马林或β-丙内酯(BPL)(即1体积的福尔马林处理2500体积的活JE)连同包含0.1-1％山梨醇和0.1-1％甘氨酸的稳定剂混合物在22℃处理持续7天的时间段来化学灭活，所述稳定剂混合物仅在灭活过程期间被添加。0.5％w/v甘氨酸和1％w/v山梨醇的比浓度的稳定剂连同灭活剂福尔马林或BPL一起被添加至活JE病毒。添加稳定剂仅是防止病毒在以上提到的7天的灭活孵育时间段期间降解，所述灭活孵育是由添加了灭活剂福尔马林或β-内丙酯(BPL)引起。在灭活之后，通过以重复的方式相对于磷酸盐缓冲盐水缓冲液交换至少5-6次，将JE原液渗滤并浓缩，以去除福尔马林。在BPL灭活的情况中，不需要渗滤。BPL将通过在37℃孵育原液持续3小时而被中和。经渗滤的JE原液通过使用0.22μPVDF(聚偏二氟乙烯)膜过滤而被无菌过滤。将灭活的乙型脑炎病毒原液进一步贮存在5℃±3℃持续至少24个月至36个月。根据本发明中公开的方法之一，乙型脑炎原液的科拉尔毒株的纯化和灭活步骤可被概括如下：
(a)将病毒收获物用0.45μ膜净化，以将细胞碎片从所述病毒收获物去除；
(b)通过组合的尺寸排阻和亲和层析术利用Capto Core-700基质来进行柱纯化，以收集包含纯化的病毒的流出物，其中所述基质由高度交联的琼脂糖基质与官能活性配体辛胺基团组成；
(c)使用300kDa聚醚砜(PESU)膜盒将步骤(b)的流出物浓缩并渗滤，以获得纯化的浓缩的病毒原液；
(d)使步骤(c)的纯化的浓缩的病毒原液经受0.45μPVDF(聚偏二氟乙烯)膜过滤，以消除过程中的任何污染物；
(e)将步骤(d)的纯化的病毒用1:1500v/v至1:2500v/v之间的比率的福尔马林(即1体积的福尔马林处理2500体积的活JE)连同稳定剂在22℃持续7天的时间段来同时稳定化并灭活，其中所述稳定剂由甘氨酸和山梨醇组成，或者用1:1500v/v至1:2500v/v之间的比率的β-丙内酯(即1体积福尔马林处理2500体积的活JE)连同稳定剂在5℃±3℃持续7天的时间段来同时稳定化并灭活，其中所述稳定剂由甘氨酸和山梨醇组成；
(f)仅在福尔马林灭活的情况中，使用300kDa PESU膜盒使步骤(e)的灭活的纯化的病毒原液相对于磷酸盐缓冲盐水渗滤和缓冲液交换至少5-6次，以去除福尔马林；
(g)使步骤(f)的纯化的灭活病毒原液经受0.22μPVDF(聚偏二氟乙烯)膜过滤，以获得在5℃+3℃持续至少24个月至36个月不含任何污染物、适合于配制乙型脑炎疫苗的最终且稳定的灭活的JEV原液。
在以下表中提供了在30个CF40、DB-100、DB-500中通过多次病毒收获的批次规模生产的情况中，通过Capto Core纯化的结果。以下提到了对于一个批次的30个CF40用Capto Core纯化在一个月内获得的总的病毒原液。相应地，可用每剂NLT 5μg制备的灭活JE疫苗的剂数也从在30个CF40的情况中的大约10万剂可观地增加至分别在DB-100至DB-500的情况中的至少90万剂至200万剂。
表3.1：通过Capto Core-700基质纯化，纯化的灭活的JEV原液和使用30个CF40在1个月内的剂数。
表3.2：通过Capto Core-700纯化，纯化的灭活的JEV原液和使用DB-100在1个月内的剂数。
表3.3：通过Capto Core纯化，纯化的灭活的JEV原液和使用DB-500在1个月内的剂数。
在以下表(表3.4)中另外展示了分别在30个CF40、DB-100和DB-500的批次规模的情况中通过使用Capto Core-700柱在纯化的灭活的JEV原液的产量上的增加。我们可看出，在30个CF40、通过Capto Core纯化的情况中，总的JEV原液是642857mg，并且在DB-100的情况中是964285mg，相当于在所需的相同的时间量内45个CF40产生的等值，并且是2206428mg的灭活的JEV原液，相当于在所需的相同的时间量内大约140个CF40产生的等值。以下提供了Celufine硫酸酯和通过Capto Core 700来纯化JEV原液之间的比较的归纳：
表3.4：通过celufine硫酸酯基质和Capto Core 700基质获得的纯化的JEV原液的比较.
实施例4：灭活的JEV原液的稳定性研究.
将渗析的灭活的JEV原液在具有合适比例的化学稳定剂或不具有化学稳定剂下储存在5℃±3℃。以不同的时间间隔取出抗原，并通过噬斑减少中和(PRNT50)来测试。根据IP.2007；WHO TRS No.771用小鼠抗血清的病毒中和滴定来进行抗原的稳定性研究。通过50％噬斑减少方法来确定抗血清的病毒中和。病毒的中和滴定被表示为与无活病毒抗原的对照孔的噬斑数目相比显示出50％的噬斑减少的血清稀释度的倒数。
表4.1：纯化的灭活的JEV原液36个月的稳定性。

Claims (12)

1.一种用于预防由乙型脑炎病毒的印度科拉尔毒株引起的感染的病毒疫苗组合物，所述病毒疫苗组合物包含疫苗抗原，其中所述疫苗抗原是灭活的乙型脑炎病毒的科拉尔毒株，所述乙型脑炎病毒的科拉尔毒株适应于在一次性生物反应器中生长的Vero细胞以收获活乙型脑炎病毒原液。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述疫苗抗原生长在所述一次性生物反应器中的Vero细胞中以收集活乙型脑炎病毒原液，且所述病毒原液从Vero细胞的单次培养和所述乙型脑炎病毒的科拉尔毒株的单次感染收获多次(多次病毒收获)，从至少多于一次直至五次或至少三次。
3.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述一次性生物反应器在以下条件下被保持：50ppm-70ppm的范围内的溶解氧、在35.5℃至37.5℃之间的温度范围、在7.2至7.6的保持的pH、伴随260rpm至280rpm的搅拌、80-150ml/min的流入速率和84-156ml/min的流出速率。
4.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中所获得的多次的病毒收获物被进一步纯化和灭活，包括以下步骤：
(a)将病毒收获物用0.45μ膜净化，以将细胞碎片从所述病毒收获物去除；
(b)将收获物体积用300kDa膜盒浓缩至少4倍，以获得浓缩的存留物；
(c)使步骤(b)的所浓缩的收获物存留物通过celufine硫酸酯基质纯化，以收集包含期望的病毒、高量的盐细胞蛋白和核酸物质的洗脱物，其中所述基质由纤维素支持基质在活性基团硫酸酯的存在下组成；
(d)使用300kDa膜盒使步骤(c)的所述洗脱物相对磷酸盐缓冲盐水进行渗滤和缓冲液交换至少5-6次，以收集存留物，并将不期望的高量的盐细胞蛋白和核酸物质从感兴趣的病毒去除，以收集纯化的浓缩的病毒原液；
(e)使步骤(d)的所述纯化的浓缩的病毒原液经受0.45μ膜过滤，以消除过程中的任何污染物；
(f)将步骤(e)的纯化的病毒用1:1500v/v至1:2500v/v之间的比率的福尔马林(即1体积的福尔马林处理2500体积的活JE)连同稳定剂在22℃持续7天的时间段来同时稳定化和灭活，其中所述稳定剂由甘氨酸和山梨醇组成，或者用1:1500v/v至1:2500v/v之间的比率的β-丙内酯(即1体积福尔马林处理2500体积的活JE)连同稳定剂在5℃±3℃持续7天的时间段来同时稳定化和灭活，其中所述稳定剂由甘氨酸和山梨醇组成；
(g)仅在福尔马林灭活的情况中，使用300kDa膜盒使步骤(f)的灭活的纯化的病毒原液相对磷酸盐缓冲盐水进行渗滤和缓冲液交换至少5-6次，以去除福尔马林；
(h)将步骤(g)的纯化的灭活的病毒原液用0.22μ膜过滤，以获得在5℃±3℃持续至少24个月至36个月不含任何污染物、适合于配制乙型脑炎疫苗的最终且稳定的灭活的JEV原液。
5.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中所获得的多次的病毒收获物被进一步纯化和灭活，包括以下步骤：
(a)将病毒收获物用0.45μ膜净化，以将细胞碎片从所述病毒收获物去除；
(b)通过组合的尺寸排阻和亲和层析术利用Capto Core-700基质来纯化，以获得包含纯化的病毒的流出物，其中所述基质由高度交联的琼脂糖基质与官能活性配体辛胺基团组成；
(c)将步骤(b)的所述流出物使用300kDa膜盒来浓缩和渗滤，以获得纯化的浓缩的病毒原液；
(d)使步骤(c)的所述纯化的浓缩的病毒原液经受0.45μ膜过滤，以消除过程中的任何污染物；
(e)将步骤(d)的纯化的病毒用1:1500v/v至1:2500v/v之间的比率的福尔马林(即1体积的福尔马林处理2500体积的活JE)连同稳定剂在22℃持续7天的时间段来同时稳定化和灭活，其中所述稳定剂由甘氨酸和山梨醇组成，或者用1:1500v/v至1:2500v/v之间的比率的β-丙内酯(即1体积福尔马林处理2500体积的活JE)连同稳定剂在5℃±3℃持续7天的时间段来同时稳定化和灭活，其中所述稳定剂由甘氨酸和山梨醇组成；
(f)仅在福尔马林灭活的情况中，使用300kDa膜盒使步骤(e)的灭活的纯化的病毒原液相对磷酸盐缓冲盐水渗滤和缓冲液交换至少5-6次，以去除福尔马林；
(g)将步骤(f)的纯化的灭活的病毒原液用0.22μ膜过滤，以获得在5℃±3℃持续至少24个月至36个月不含任何污染物、适合于配制乙型脑炎疫苗的最终且稳定的灭活的JEV原液。
6.一种使乙型脑炎病毒的科拉尔毒株在能够在一次性生物反应器中工业化生产的Vero细胞中适应以收集活乙型脑炎病毒原液的方法，且所述病毒原液从Vero细胞的单次培养和所述乙型脑炎病毒的科拉尔毒株的单次感染收获多次(多次病毒收获)，从至少多于一次直至五次或至少三次。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述乙型脑炎病毒原液的所述多次病毒收获被从在规模相当于4个细胞工厂的一次性生物反应器中的实验室规模批次放大至在规模相当于大约200个细胞工厂的一次性生物反应器中的生产规模批次。
8.根据权利要求6和7所述的方法，其中所述一次性生物反应器在以下条件下被保持：在50ppm-70ppm的范围内的溶解氧、在35.5℃至37.5℃之间的温度范围、在7.2至7.6的保持的pH、伴随260rpm至280rpm的搅拌、80-150ml/min的流入速率和84-156ml/min的流出速率。
9.根据权利要求7所述的方法，其中乙型脑炎病毒原液的多次的病毒收获物在至少35-40天的时间段内在规模相当于大约200个细胞工厂的一次性生物反应器中被获得至少三次。
10.一种同时纯化和灭活权利要求7所述的乙型脑炎病毒原液的病毒收获物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将所述病毒收获物用0.45μ膜净化，以将细胞碎片从所述病毒收获物去除；
(b)将收获物体积用300kDa膜盒浓缩至少4倍，以获得浓缩的存留物；
(c)使步骤(b)的浓缩的收获物存留物通过celufine硫酸酯基质柱来纯化，以收集包含期望的病毒、高量的盐细胞蛋白和核酸物质的洗脱物，其中所述基质由纤维素支持基质在活性基团硫酸酯的存在下组成；
(d)使用300kDa膜盒使步骤(c)的所述洗脱物相对磷酸盐缓冲盐水渗滤和缓冲液交换至少5-6次，以收集存留物，并将不期望的高量的盐细胞蛋白和核酸物质从感兴趣的病毒去除，以收集纯化的浓缩的病毒原液；
(e)使步骤(d)的所述纯化的浓缩的病毒原液经受0.45μ膜过滤，以消除过程中的任何污染物；
(f)将步骤(e)的纯化的病毒用1:1500v/v至1:2500v/v之间的比率的福尔马林(即1体积的福尔马林处理2500体积的活JE)连同稳定剂在22℃持续7天的时间段来同时稳定化和灭活，其中所述稳定剂由甘氨酸和山梨醇组成，或者用1:1500v/v至1:2500v/v之间的比率的β-丙内酯(即1体积福尔马林处理2500体积的活JE)连同稳定剂在5℃±3℃持续7天的时间段来同时稳定化和灭活，其中所述稳定剂由甘氨酸和山梨醇组成；
(g)仅在福尔马林灭活的情况中，使用300kDa膜盒使步骤(f)的灭活的纯化的病毒原液相对磷酸盐缓冲盐水渗滤和缓冲液交换至少5-6次，以去除福尔马林；
(h)将步骤(g)的纯化的灭活的病毒原液用0.22μ膜过滤，以获得在5℃±3℃持续至少24个月至36个月不含任何污染物、适合于配制乙型脑炎疫苗的最终且稳定化的灭活的JEV原液。
11.一种同时纯化和灭活权利要求7所述的乙型脑炎病毒原液的病毒收获物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将所述病毒收获物用0.45μ膜净化，以将细胞碎片从所述病毒收获物去除；
(b)通过组合的尺寸排阻和亲和层析术利用Capto Core-700基质来纯化，以收集包含纯化的病毒的流出物，其中所述基质由高度交联的琼脂糖基质与官能活性配体辛胺基团组成；
(c)将步骤(b)的所述流出物使用300kDa膜盒来浓缩和渗滤，以获得纯化的浓缩的病毒原液；
(d)使步骤(c)的所述纯化的浓缩的病毒原液经受0.45μ膜过滤，以消除过程中的任何污染物；
(e)将步骤(d)的纯化的病毒用1:1500v/v至1:2500v/v之间的比率的福尔马林(即1体积的福尔马林处理2500体积的活JE)连同稳定剂在22℃持续7天的时间段来同时稳定化和灭活，其中所述稳定剂由甘氨酸和山梨醇组成，或者用1:1500v/v至1:2500v/v之间的比率的β-丙内酯(即1体积福尔马林处理2500体积的活JE)连同稳定剂在5℃±3℃持续7天的时间段来同时稳定化和灭活，其中所述稳定剂由甘氨酸和山梨醇组成；
(f)仅在福尔马林灭活的情况中，使用300kDa膜盒使步骤(e)的灭活的纯化的病毒原液相对磷酸盐缓冲盐水渗滤和缓冲液交换至少5-6次，以去除福尔马林；
(g)将步骤(f)的纯化的灭活的病毒原液用0.22μ膜过滤，以获得在5℃±3℃持续至少24个月至36个月不含任何污染物、适合于配制乙型脑炎疫苗的最终且稳定的灭活的JEV原液。
12.一种方法，所述方法与在35-40天的时间段内在30个细胞工厂中JEV的单批次规模商业化生产中获得的纯化的灭活的JEV原液相比，通过利用组合的尺寸排阻和亲和层析术利用Capto Core-700基质，使在相同的35-40天的时间段内在一次性生物反应器中单批次规模商业化生产纯化的灭活的乙型脑炎病毒(JEV)原液增加至少8倍至10倍的纯化的灭活的JEV原液，其中所述基质由高度交联的琼脂糖基质与官能活性配体辛胺基团组成。
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