CN1272879A - 一种适应非洲绿猴肾细胞的减毒的日本脑炎病毒以及日本脑炎疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种通过在Vero细胞上传代来适应Vero细胞的减毒的日本脑炎病毒,以及包含所述减毒病毒的日本脑炎疫苗。

Description

一种适应非洲绿猴肾细胞的减毒的日本脑炎病毒以及日本脑炎疫苗

发明背景

发明领域

本发明涉及一种通过在非洲绿猴肾(Vero)细胞传代来适应Vero细胞的减毒的日本脑炎病毒以及包含所述减毒病毒的日本脑炎疫苗。

现有技术描述

日本脑炎(JE)是亚洲地区对公众健康非常重要的一种由蚊子携带的虫媒病毒疾病。据报道，在亚洲每年有35000起以上的病例以及10000以上人死亡，但是官方的报道却无疑低估了真实的病例数(Okuno，T.《世界健康状况》(World Health Stat Q)3：120-31，1978；Umenei，T.等人，Bull World Health Org.63：625-31，1985)。疾病的表现是发热头痛症状、无菌性脑膜炎或脑炎，且约有一半的幸存者可能有持久的神经学和精神病后遗症(Burke，D.S.等人《虫媒病毒：流行病学和生态学》3：63-92，1988；Monath，T.P.病毒学763-814，1990)。

JE(日本脑炎)病毒是66中黄病毒中的一种，主要是载体携带的有包膜的正的有义单链RNA病毒(Chambers，T.J.等人，Ann.Rev.Microbiol.44：649-88，1990)。从形态上讲，黄病毒呈球形，直径约为40nm，由围绕在核壳外的脂质双层组成，该核壳含有与壳蛋白(C)复合的11kb基因组(Rice，C.M.等人，Science，229：726-33，1985)。膜上的表面突出由糖基化的包膜(E)和膜(M)蛋白组成。在胞内初生毒粒中的前M糖蛋白断裂成在成熟的细胞外毒粒中发现的M蛋白。重要的生理活性与53kd E蛋白有关，这些活性包括血细胞凝集、病毒中和、毒粒装配、膜融合以及病毒与细胞受体结合(Koshini，E.等人，Virol.188：714-20，1992)。

现有三种人用JE疫苗(Tsai，T.等人，疫苗，671-713，1993)。其中只有在小鼠脑中产生的灭活的JE疫苗能在国际上购得。一个生产商，大阪大学微生物疾病研究基金会(Biken)生产了大多数国际上销售的灭活JE疫苗；该病毒于1992年在美国获得许可，由Connaught Laboratories，Inc.以JE-VAX^TM的商品名销售。在原代仓鼠肾(PHK)细胞中制得的灭活和活的减毒JE疫苗只在中国销售。

在小鼠脑中产生的灭活的JE疫苗在1954年在日本获得许可。由于它是通过注入幼鼠大脑来产生的，因此生产很费力，且涉及到引起疫苗相关神经病学副作用的可能性。尽管对生产方法所作的一系列改进已经提高了疫苗的纯度和效力(Oye，A.疫苗接种理论和实践，69-82，1975；Oya，A.Acta PediatrJpn.30：175-84，1988；Takaku，K.Biken J.11：25-39，1968)，但是直到最近还报道存在一定频度的局部反应和轻微的系统性反应(Hoke，C.H.等人，New Engl J Med.319：608-14，1988；Poland，J.D.等人，J InfectDis.161：878-82，1990；Sanchez，J.L.等人，Lancet 335：972-73，1990)。有20％的疫苗在注射部位产生局部触痛、发红和/或肿胀。据报道，有10-30％的疫苗产生了轻微的系统性症状，主要是头痛、低烧、肌肉疼痛、不适和肠胃症状。自1989年起，已经报道的明显新的不良反应包括荨麻疹、血管性水肿、呼吸窘迫、多形性红斑、结节性红斑(erythema nosodum)和严重的神经病学疾病，这些主要是在澳州、欧洲和北美洲受疫苗接种的游客中发现(Anderson，M.M.等人，Lancet.337：1044，1991；Ruff，T.A.等人，Lancet 228：881-2，1991)。另外，在1992和1995年，Ohtaki报道说有7名儿童在经JE疫苗接种后患急性播散性脑脊髓炎(ADEM)，并伴有磁共振图象(MRI)变化(Ohtaki，E.等人，Pediatr Neutrol.8：137-9，1992；Ohtaki，E.等人，J Neurol Neruosurg Psychiatry59：316-7，1995)。还注意到用含动物脑组织的狂犬病疫苗接种会引起严重的神经病学并发症(Plotkin，S.A.等人，疫苗，661-2，1994)。出于这些原因，WHO已经优先考虑开发JE疫苗。

最近，已经证实，中国的灭活和活的减毒JE疫苗是有效的，它诱发了高滴度的中和病毒的抗体，并提供了实体保护(Tsai，T.等人，疫苗，671-713，1993)。然而，制备中国疫苗的PHK细胞没有被世界健康组织(WHO)批准用于生产病毒疫苗，也没有被发达国家许可用于人用。用原代仓鼠细胞生产疫苗的主要缺点是疫苗质量的不确定性。即使采用没有特异性病原体的仓鼠，动物仍会被意外感染，这是疫苗生产中的一个问题。有时，这类感染能长时间内不被检测到。出于这些批评，需要对疫苗安全性作进一步的控制性研究，以使其广泛的应用可信。从原代细胞生产疫苗的另一个缺点是病毒收获率低，成本高，且不能大量生产。

鉴于上述原因，需要有一种在标准的细胞系如非洲绿猴肾细胞或人二倍细胞(这些细胞已经被认可作为人疫苗基质)中产生且成本较低的新的JE疫苗。Vero细胞是衍生自猴肾的经转化但不导致肿瘤的细胞。Vero细胞系比其它任何标准细胞系都更为有利，因为Vero细胞更容易适应大规模细胞培养，并且作为一种转化的细胞，它具有无限的生命。

已经发现，JE病毒能在Vero细胞培养中生长。在JE疫苗领域中，已经作了相当多的努力来从标准细胞生产疫苗，从而能进行大体积的细胞培养。然而，病毒的特性分析(包括遗传稳定性)、通过从Vero细胞培育来使疫苗商业化所需的得率和方法还决不能满足人疫苗的需求。由于这些事实且难以将其它病毒培养获得的知识用于JE病毒，现有技术并没有成功地从传代细胞系开发出在遗传上稳定的、且免疫原性高的JE病毒疫苗。所有这些研究至今均未能得出一种满足本背景中所述标准的新的疫苗生产方法。

本发明提出了一种在传代细胞(Vero细胞)中发育和增殖JE病毒用于生产疫苗的方法，该方法克服了以前在小鼠脑或原代细胞系中生产JE病毒的问题。本发明还确定了培育JE病毒的方法以及一种低成本生产疫苗的下游方法。

另外，本发明确定了对原先的商业化JE疫苗作下列方法上的改进。

1.安全性：本发明的病毒通过Vero细胞培育没有获得毒性，减少了生产的危险，并为接受者提供了额外的安全性(除了严格控制病毒灭活方法所提供的安全性外)。以前的商业化的JE疫苗从未提供过这种优点。

2.在更安全的生产基质中的供应量增加：在牛血清不存在下生产本发明的JE疫苗，获得了高的得率和廉价以及可放大规模的生产，这些是原来的商业化JE疫苗所不能实现的。

3.更少的反应原性(reactogenicity)：在本发明的JE疫苗中没有掺入明胶稳定剂，从而减少了象已有疫苗那样(Saakaguchi M.等人，疫苗，68-69，1998)的疫苗反应的危险。另外，有效地除去了掺入已有JE疫苗中的不需要的牛衍生成分。总之，以前的JE疫苗从未提供过本发明的这一安全性。

4.提高的效力：Vero细胞大规模生产的成功、用于生产的添加物的不存在、以及有效的纯化，这些使得在配制JE疫苗时能首先使用有效的佐剂。尽管在疫苗配方中应用佐剂也适用于其它疫苗，但是将这一知识运用于JE疫苗是很困难的，因为没有一种现有的JE疫苗能确保其安全的生产。

总之，至今还没有产生一种新的疫苗能满足JE疫苗商业化的上述优点。

因此，本发明的一个目的是提供一种安全有效的、在标准细胞基底中产生的JE疫苗，以提高其在许多国家的可接受性。本发明另一个目的是提供一种有效方法，用于生产高度纯化的稳定的疫苗以及用少量抗原配制高免疫原性的疫苗。

发明概述

一方面，本发明提供了一种通过在Vero细胞上传代来适应Vero细胞的减毒的日本脑炎病毒。本发明的减毒的日本脑炎病毒在文中称为CJ50003，根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约，于1998年4月20日保藏在韩国微生物培养中心(Seoul，Korea)，按照保藏号KCCM-10125可以从该保藏机构获得该病毒的传代培养物。

另一方面，本发明提供了一种日本脑炎疫苗，它含有通过在Vero细胞上传代来适应Vero细胞的减毒的日本脑炎病毒。

附图简述

在参看了下列描述、所附权利要求以及附图后，就能更好地了解本发明的这些以及其它特征、方面和优点，这些附图如下：

图1显示了JE病毒SA14-14-2(PDK)在Vero细胞中的传代和适应。用0.1moi的SA 14-14-2株(PDK)接种Vero细胞单层后第5天，收获第一代病毒。在Vero细胞单层上进行噬斑试验，测定JE病毒的滴度。随后用第一代病毒作为起始材料，按照实施例1所述的进行连续病毒感染和滴定，传代30代。

图2显示了在感染后第3天至第17天每隔一天在滚瓶中多次收获JE病毒CJ50003。以每个细胞0.01噬斑形成单位(pfu)的感染复数感染Vero细胞单层。使病毒于35℃吸附2小时，然后用PBS洗涤细胞三次，加入100毫升无血清EMEM，35℃培育。在感染后第3天至第17天，每隔48小时用新鲜的无血清EMEM替换培养上清液。通过在Vero细胞单层上测定噬斑来进行收获物的病毒感染性滴定。

图3显示了用SDS-PAGE和Western印迹来分析经蔗糖梯度超离心纯化的JE病毒CJ50003。将60毫升浓缩的培养上清加入40毫升15-60％蔗糖梯度，在45 Ti转头中12℃、22000rpm离心18小时。从试管底部收集2毫升样品，并进行4-20％梯度的SDS-PAGE，将分辨的蛋白转移至硝酸纤维素膜上。通过考马斯亮蓝(组A)或硝酸银(组B)染色来显色，抗原通过和JE病毒E蛋白有反应性的单克隆抗体(组C)反应来显色。泳道1是预先染色的蛋白标准品(Novex Seeblue^TM)，从顶部起代表250、98、64、50、36、30、16和6kDa的分子量；泳道2-10，超离心后来自底部的级分No.3-11；E，包膜蛋白；C，壳蛋白；M，膜蛋白。

图4显示了纯化的JE病毒CJ50003的甲醛灭活动力学。在4℃或22℃用0.018％甲醛灭活纯化的JE病毒制备物。通过在Vero细胞单层上直接显示噬斑来滴定指定时间时所取样品的残余感染性病毒。另外，如下所述进行扩增试验，以检测低水平的病毒。用病毒灭活时间点的样品接种含有Vero细胞单层的烧瓶(一式两份)。35℃吸附2小时后，重新加入细胞并35℃培育。在感染后第7天和第14天重新加入细胞。收获培养基并形成噬斑，以检测感染性病毒。图中显示了两个不同实验的灭活时间点：4℃(实心矩形)、22℃(实心圆形)。平行进行热灭活(没有甲醛)对照(4℃表示为空心矩形，22℃表示为空心圆形)。

发明详述

本发明涉及一种具有用于制备JE疫苗所希望性质的JE病毒株。所述病毒是一种减毒的病毒，能在传代细胞系中增殖，该传代细胞系是WHO认可作为人疫苗生产用细胞基底的Vero细胞。因此，预计所述病毒能用来制备比现有疫苗更安全的灭活的和活的JE疫苗。

本发明提供了一种满足目前需要的疫苗。通过在不高于35℃下连续传代，使JE病毒适应Vero细胞。在Vero细胞中连续传代导致病毒滴度升高至高于10⁷pfu/毫升培养上清液，并减少了显示病毒滴度峰值的培养时间。本发明涉及一种多次收获方法的发展，该方法不需要血清作为添加物，产生病毒的产量得率高，这对于低成本大规模生产所述疫苗是商业上可行的性质。根据本发明，在病毒培育时的多次收获方法导致受感染细胞的细胞病变效应(CPE)程度降低。由于CPE水平的减少，本发明的JE疫苗含有极少量的残余细胞衍生成分。另外，预计本发明的JE疫苗将提供比现有JE疫苗增强的免疫原性和提高的抗病保护性。本发明的纯化的JE疫苗与现有疫苗相比的主要优点在于，从培养的Vero细胞纯化的病毒满足了人用疫苗的发展需要。

本发明还涉及制备所述疫苗的方法。该方法能提供高产量、高纯度和高效力的所述疫苗。JE病毒CJ50003这样获得：使JE病毒SA 14-14-2(PDK)在不高于35℃的温度下在Vero组织培养细胞中适应，传代4次或更多代，选择培养的病毒，同时根据在Vero和/或LLC-MK2细胞中形成的转化灶的数量，监测病毒的增殖。从该适应方法获得的病毒在每毫升培养Vero细胞的培养上清液中至少有1×10⁷pfu的峰值滴度，并减少了收获的培育期。JE病毒SA14-14-2是一种减毒的病毒株，它通过使蚊子的野生型JE病毒SA 14适应原代仓鼠肾(PHK)组织培养细胞和原代狗肾(PDK)组织培养细胞来获得(Kenneth H.Eckels，等人，疫苗，6513-518，1988)。但是PHK和PDK细胞没有被WHO许可，因此它们不适于用来制备人用疫苗。Vero细胞受WHO许可用于人用，因此Vero适应的JE病毒株CJ50003是生产人用疫苗的良好基础。

已知SA 14-14-2(PDK)病毒属于黄病毒，并具有下列理化性质：单链，正的有义RNA基因组，有5′甲基化的末端，3′端没有poly A结构。RNA基因组的大小约为11kb，基因组和13500Da的核壳(C)蛋白处于组合状态。病毒另外还包括8700Da的膜(M)蛋白、53000的Da的包膜(E)蛋白以及非结构性蛋白NS1、2a、2b、3、4a、5等。

使Vero适应的JE病毒株CJ50003在Vero细胞中传代30代以上。通过传代，病毒滴度和噬斑形态学没有改变，这提出病毒具有稳定的表型特征。

为了了解JE病毒CJ50003的生物性质的分子基础，分析病毒的理化性质。用cDNA克隆和测序法确定病毒基因组的碱基序列。结果发现，JE SA 14-14-2(PDK)的E蛋白基因中1032、1506和1704位的三个腺嘌呤以及1769位的鸟嘌呤碱基分别被JE CJ50003病毒中的三个鸟嘌呤和一个胸腺嘧啶取代。因此，E蛋白的氨基酸序列中19位的苏氨酸、177位的苏氨酸、243位的赖氨酸以及264位的谷氨酰胺分别变为丙氨酸、丙氨酸、谷氨酸和组氨酸。只要我们的研究继续下去，在病毒在Vero细胞中传代时，E蛋白的氨基酸变化就保持不变。

当将在Vero细胞中传代数不同的病毒注射入幼鼠大脑内时，JE病毒CJ50003不会杀死小鼠。因此，可以说，适应Vero的JE病毒CJ50003是一种减毒和稳定的病毒株，它没有或只有很少的神经毒性。这是将所述病毒用于活的JE病毒疫苗和/或灭活疫苗的关键因素之一。

本发明还提供了一种从细胞培养物纯化病毒而不用冷冻粗制物或期间的纯度物质的方法。所述方法包括下列步骤：除去细胞碎片，浓缩病毒，通过沉淀细胞源物质和进行蔗糖梯度超离心来纯化，分级梯度，并测定病毒级分。更具体地说，本发明提供了一种生产纯化JE病毒的方法，该方法包括，在血清蛋白添加物存在或不存在下，在传代细胞系中将病毒增殖至高滴度，用超离心纯化病毒，并合并病毒阳性级分。

在Vero组织培养细胞中增殖所述病毒。用CJ50003病毒感染在滚瓶中生长至铺满的Vero细胞并作培育。可用多次收获方法收获病毒。在感染后第2或第3天(根据感染复数)，开始收获培养上清液，向培养物中重新加入新鲜的培养基。培育重新加入的培养物2天后，再次收获培养上清液。收获可在感染后8或9天重复4次，病毒滴度维持在高于10⁷pfu/毫升培养上清液。多次收获方法提供了较高的每单位滚瓶的病毒得率，从而使得本发明更适应市场的规律。另外，该方法还导致受感染细胞的CPE程度降低。降低的CPE水平赋予本发明JE疫苗中极低水平的残余细胞衍生成分。收获的培养上清液能4℃保藏直至纯化开始。收获的培养上清液可用本领域已知的常用方法来实现澄清化，这些方法包括，例如，1500g低速离心10分钟，和/或通过孔径为0.45的滤膜过滤。4℃保藏收获的培养液至浓缩。为使病毒浓缩，对培养液进行超滤，然后收集保留物。在另一浓缩方法中，将聚乙二醇(PEG)8000溶解在培养液中至10％，将沉淀物溶解在合适的缓冲液(例如磷酸盐缓冲液，PBS，pH7.0)中。进行鱼精蛋白硫酸盐沉淀，以除去DNA或来自细胞的其它物质，这可通过将鱼精蛋白硫酸盐加入浓缩的病毒溶液中并高速离心(例如12000g)5分钟来实现。为进一步纯化病毒，密度在15-60％连续或多步蔗糖梯度上进行密度梯度超离心。分级蔗糖梯度，测定级分中的病毒。测定含病毒阳性级分的方法包括噬斑试验、血细胞凝集试验、聚丙烯酰胺凝胶电泳、和抗原试验(如免疫试验)。根据高病毒滴度和其它杂质的低水平，合并级分以便进一步处理。通过测试来源于Vero细胞的染色体DNA和蛋白质，估计合并的纯化病毒的纯度。结果表明，每5微克纯化JE病毒的宿主细胞DNA和蛋白质的含量分别低达2.5pg和2ng，这表明上述纯化方法有效地除去了病毒抗原中的其它杂质。估计1升感染培养液的JE病毒得率约为2.3毫克。

本发明还提供了一种灭活JE病毒以破坏其感染性同时保留其抗原性的方法。所述方法包括，加入有效量的甲醛，使所述病毒和所述试剂在一定条件下培育，从而使得所述病毒被灭活。具体地说，用合适的缓冲液(例如PBS)将级分合并物稀释至合适的蛋白浓度，向稀释的级分合并物中加入甲醛。和甲醛的培育在22℃或4℃下进行。在22℃或4℃下，完全破坏病毒感染性而不丧失病毒抗原性至少分别需要4天或46天。为了大规模培养的简便，宜选择在22℃下灭活JE病毒的方法，并将培育时间延长至7天，以提供安全的宽裕量。然而，有效的灭活剂的例子包括但不局限于甲醛。通常，这能通过化学或物理方式来实现。化学灭活可通过用(例如)酶、β丙酸内酯、乙烯亚胺或其衍生物、以及有机溶剂(如Tween、Triton、脱氧胆酸钠和磺基海啶(sulphohetain))处理来实现。如果需要，随后可中和灭活材料；例如，被甲醛灭活的材料可用硫代硫酸盐中和。物理灭活宜通过使病毒受高能辐射(如UV光、X辐射或x辐射)实现。

JE疫苗可制成可液体溶液或悬液形式的注射剂。可以加入稳定剂如糖类(山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、蔗糖、葡聚糖、葡萄糖等)、蛋白质(白蛋白、酪蛋白等)、含蛋白试剂(牛血清、脱脂牛奶等)和缓冲液(如碱金属磷酸盐)。制备物在加入稳定剂后可以冻干，它能真空或氮气保藏。如果需要，可以加入具有佐剂作用的一种或多种化合物。用于此目的的合适的化合物例如是氢氧化铝、磷酸铝或氧化铝、矿物油(如Bayol，Marcol 52)和皂素。另外，如果需要，病毒材料中还可加入一种或多种乳化剂，例如Tween和span。

通过测定针对病毒的中和抗体量，确定佐剂的效果，该中和抗体通过给予疫苗中也吸附于佐剂的无活性病毒产生。有效的佐剂例子包括，但不局限于，氢氧化铝。用所述疫苗免疫的小鼠血清进行噬斑减少中和测试(PRNT)和用神经毒性病毒直接攻击免疫的小鼠，研究所得疫苗的效力。结果表明，所述疫苗具有和可比疫苗相同或更佳的诱发中和抗体的效力。

为了研究传代次数不同的Vero适应的病毒免疫原性可能的变化，制得不同传代次数的疫苗并比较每一疫苗的效力。不管在Vero细胞中连续传代，从不同传代次数的病毒制得的疫苗其效力之间没有显著的差别。因此可以说，Vero适应的JE病毒株CJ50003具有稳定的免疫原性。

下列实施例描述了本发明的适应Vero细胞的减毒JE病毒以及包含本发明的所述减毒病毒的JE疫苗。相信本领域技术人员根据前述描述和后文实施例完全实施本发明。

实施例1

SA 14-14-2(PDK)病毒在Vero细胞中的适应

用JE SA 14-14-2(PDK)，狗肾细胞培养第8代SA 14-14-2病毒，来启动在Vero细胞培养中的连续传代。用JE SA 14-14-2(PDK)以每细胞0.1pfu的感染复数接种Vero细胞单层。在约5％CO₂的空气气氛下，在不高于约35℃的温度(通常约32℃至35℃，较佳的约35℃)下，使受感染的细胞培养在含5毫升营养物培养基的25cm²培养瓶中生长，该培养基由Eagle的极限必需培养基组成，其中添加了10％胎牛血清。通过显微镜观察细胞病变效应(CPE)以及用各种试验(如红细胞吸附试验(HA)、空斑试验、和酶联免疫吸附试验(ELISA))确定病毒抗原的存在，来监测病毒生长。在感染后第5天，培养物表现出病毒滴度峰值时，收获JE病毒，并离心澄清。从澄清化上清液中纯化单噬斑并在Vero细胞中扩增。用扩增的病毒重新感染Vero细胞，作进一步传代。随后通过如上所述的连续病毒感染、滴定和噬斑纯化，进行连续传代30代。如图1所示，在Vero细胞中传4代后，病毒滴度达到约4×10⁷pfu/毫升培养上清液，并在以后的传代中维持接近该水平。另外，病毒收获的最佳期间从第一代的5天缩短至第4代的2-3天。病毒得率的明显提高(从约10⁵pfu/ml到超过10⁷pfu/ml)以及培育时间的缩短导致选择Vero细胞中第4代JE作为用于制备候选JE疫苗的起始材料。将Vero细胞中第4代JE标为CJ50003(Vero，PS4)。缩写PS指在指定细胞中的病毒传代数。

实施例2

CJ50003病毒的特性分析；包膜基因的测序和神经毒性研究

为了了解CJ50003株生物特性的分子基础，测定具有主要中和表位的编码包膜蛋白(E)基因的1500个核苷酸序列，并和亲代疫苗株SA14-14-2(PDK)、SA 14-14-2(PHK)和野生型SA14病毒(Aihira，S.等人，Virus Genes，5：95-109，1991；Ni，H.等人，JGen Virol.76：401-407，1995；Ni，H.等人，J Gen Virol.76：409-413，1995；Nitayaphan，S.等人，Virology 177：541-542，1990)的序列比较。用CJ50003病毒(Vero，PS4)作序列分析。结果表明，C端区域(氨基酸280-500)完全保守，而N端区域(氨基酸1-279)表现出病毒株之间有序列差异。N端区域中的突变大多数是平均分布的。CJ50003的E蛋白基因的核苷酸序列与SA14/CDC有8个核苷酸不同(7个氨基酸不同)，而SA14-14-2(PDK)与SA14/CDC有7个核苷酸不同(5个氨基酸不同)。结果归纳在表1中。

CJ50003病毒的序列在5处位置与已经公开的SA 14-14-2(PDK)病毒不同：1032、1506、1704和1769位的核苷酸变化导致SA 14-14-2(PDK)和CJ50003病毒有4个氨基酸不同：989位的核苷酸变化没有导致氨基酸替代。较高代数的CJ50003病毒(即15代至30代)未揭示额外的核苷酸变化。因此，CJ50003和亲代病毒SA 14-14-2(PDK)之间有5个明显的核苷酸变化和4个明显的氨基酸变化。这些变化在该病毒在细胞培养中传代时是稳定的。SA 14-14-2(PDK)中243位的Lys残基是与其它减毒JE病毒相比唯一不同的残基，它在CJ50003中被Glu残基替代。

CJ50003序列与公开的SA 14-14-2(PHK)病毒序列(Aihira，S.等人，Virus Genes，5：95-109，1991)也不同。1032位的核苷酸差别导致E19位的氨基酸不同，但是989位核苷酸的变化没有引起氨基酸替代。CJ50003病毒中1506和1704位的核苷酸与SA14-14-2(PHK)中那些位置的核苷酸相同，但与SA 14-14-2(PDK)中那些位置的核苷酸不同。CJ50003和SA 14-14-2(PHK)E基因的N端区域替代方式是基本上相同的，除了E19处的氨基酸替代外。

与亲代SA 14病毒的序列相比，SA 14-14-2(PHK)、SA 14-14-2(PDK)和CJ50003病毒在E107、E138、E176和E279位有4个相同的氨基酸替代。其中E138和E176位的氨基酸(Ni，H.等人，J Gen Virol.76：409-413，1995)(已知这两个氨基酸对减毒有贡献)在Vero适应后仍然保守，这提示CJ50003没有丧失其减毒特征。

表1 JE病毒株、SA14、SA 14-14-2(PHK)、SA 14-14-2(PDK)和CJ50003之间的核苷酸和氨基酸序列比较位置                  核苷酸                          氨基酸NT    AA    SA14/    SA14/    SA14/    SA14-14-SA14-14-CJ50003    SA14/    SA14/    SA14/    SA14-14-SA14-14-CJ50003

        USA      CDC      JAP      2/PHK    2/PDK             USA      CDC      JAP      2/PHK    2/PDK989   E4    G        G        G        U        U        G        Leu      Leu      Leu      Leu      Leu      Leu1032  E19   A        A        A        A        A        G        Thr      Thr      Thr      Thr      Thr      Ala1052  E25   G        A        A        A        A        A        Leu      Leu      Leu      Leu      Leu      Leu1061  E28   U        U        U        C        C        C        Asp      Asp      Asp      Asp      Asp      Asp1217  E80   C        C        U        U        C        C        Ala      Ala      Ala      Ala      Ala      Ala1296  E107  C        C        C        U        U        U        Leu      Leu      Leu      Phe      Phe      Phe1389  E138  G        G        G        A        A        A        Glu      Glu      Glu      Lys      Lys      Lys1503  E176  A        A        A        G        G        G        Ile      Ile      Ile      Val      Val      Val1506  E177  A        A        A        G        A        G        Thr      Thr      Thr      Ala      Thr      Ala1704  E243  G        G        G        G        A        G        Glu      Glu      Glu      Glu      Lys      Glu1708  E244  G        A        A        A        A        A        Gly      Gly      Gly      Gly      Gly      Gly1769  E264  G        G        G        A        G        U        Gln      Gln      Gln      His      Gln      His1813  E279  A        A        A        U        U        U        Lys      Lys      Lys      Met      Met      Met1921  E315  C        U        C        U        U        U        Ala      Val      Ala      Val      Val      Val1977  E334  C        C        U        C        C        C        Pro      Pro      Ser      Pro      Pro      Pro2293  E439  A        G        A        G        G        G        Lys      Arg      Arg      Arg      Arg      Arg2441  E488  G        A        G        A        A        A        Gly      Gly      Gly      Gly      Gly      Gly

AA：氨基酸；NT：核苷酸位置链。

通过注射入4周龄BALB/c小鼠大脑内(i.c.)，测试CJ50003和亲代SA 14-14-2(PDK)的小鼠神经毒性。结果显示在表2中。与野生型SA 14病毒相比，SA 14-14-2(PDK)和CJ50003病毒对于幼成年小鼠的致死性没有显著差别，都非常低。因此，导入Vero细胞基底没有为SA 14-14-2(PDK)提供神经毒力表型，且CJ50003病毒仍具有减毒特性。

表2.接种了Vero传代的CJ50003病毒的4周龄小鼠的大脑内毒性。PS代表在PDK或Vero细胞中的传代数。

病毒                   PFU接种量        Log LD₅₀ml^-1      LD₅₀/PFU比

SA14(PDK，PS3)         2×10⁷           6.5                  0.17^*

SA14-14-2(PDK，PS8)    1.3×10⁶         ＜1.5^b              ＜0.00002^*

CJ50003(Vero，PS6)     3.4×10⁷         ＜1.5^b              ＜0.00001

CJ50003(Vero，PS15)    3.2×10⁷         ＜1.5^b              ＜0.00001

CJ50003(Vero，PS30)    3.6×10⁷         ＜1.5^b              ＜0.00001

a：Kenneth H.Eckels等人(Vaccine 6：513-518，1988)。

b：接种了未稀释的病毒后，10只小鼠无一死亡。

大脑内注射接种体积为每只小鼠0.03毫升。

实施例3

病毒生长和纯化

在Vero细胞中的第5代病毒[CJ50003(Vero，PS5)]中制备生产种子，并深冻保藏。Vero细胞在含有10％胎牛血清(FBS，Gibco)的Eagle极限必需培养基(EMEM，Gibco)中生长。用生产种子病毒以0.01-0.1pfu/细胞的感染复数感染Vero细胞单层的滚瓶培养物。在病毒吸附2小时后，用PBS洗涤培养物3次，加入不含血清的EMEM，并35℃培育。在感染的Vero细胞培养中，病毒在感染后2至3天达到约10⁷至10⁸pfu/ml的滴度。尽管从感染后2或3天开始到感染后8或9天内每隔2天共收获病毒4次，病毒滴度仍维持在超过10⁷pfu/ml，且CPE非常弱。但是在感染9天后，滴度低于10⁷pfu/ml(图2)。8000rpm离心合并的收获物15分钟，使上清液通过0.45微米滤膜过滤。用超滤(Ultrasette，Filtron，100k)或PEG沉淀浓缩病毒上清液。离心收集PEG法沉淀的病毒并悬于PBS或STE(10mM Tris pH7.2，1mM EDTA，150mM NaCl)缓冲液中。将超滤后的保留物浓缩至250毫升，用100毫升PBS洗涤盒。在加入0.5-2毫克/毫升鱼精蛋白硫酸盐后，使病毒浓缩液在冰上骤冷2小时，10000rpm离心5分钟，获得上清液。通过蔗糖梯度上超离心来纯化浓缩的病毒。超离心在38000g下进行18小时。使级分在含有洗涤剂十二烷基硫酸钠的聚丙烯酰胺凝胶上电泳(SDS-PAGE)。在SDS-PAGE中看到核壳蛋白(C，13500Da)、膜蛋白(M，8700Da)和包膜蛋白(E，53000Da)条带(图3，组A)。用小鼠抗JE病毒单克隆抗体通过Western印迹检测包膜抗原(E)(图3，组C)。合并银染凝胶中未显现出除病毒蛋白外的其它蛋白条带的病毒阳性级分(级分4至9)(图3，组B)，用Lowry方法测定蛋白浓度。表3和表4显示了从感染的Vero培养经两种纯化方法(切向流超滤或PEG8000沉淀)的详细结果。用两倍体积的PBS稀释纯化的病毒，加Tween80至最终浓度为0.01％，通过0.22微米滤膜来过滤。

表3.通过切向流超滤浓缩纯化JE病毒

样品               总体积    总pfu          得率％       总蛋白       ％得率(蛋       比活

                   (毫升)                   (pfu)        (毫克)       白)             (pfu/mg)合并培养上清液         10,000  4.4×10¹¹         100          600          100             7.3×10⁷过滤浓缩液             200     4.0×10¹¹         90           280          47              1.4×10⁸蔗糖梯度合并物         500     3.8×10¹¹         86           42           7               9.0×10⁹0.22微米过滤           50      2.4×10¹¹         55           23           3.8             1.0×10¹⁰

表4.通过PEG8000沉淀浓缩纯化JE病毒

样品               总体积    总pfu          得率％       总蛋白       ％得率(蛋       比活

                   (毫升)                   (pfu)        (毫克)       白)             (pfu/mg)合并培养上清液         10,000  4.4×10¹¹         100          600          100             7.3×10⁷PEG沉淀                200     2.7×10¹¹         61           40           6.7             6.8×10⁹蔗糖梯度合并物         500     2.5×10¹¹         56           15           2.5             1.7×10¹⁰0.22微米过滤           50      1.6×10¹¹         41           12           2               1.3×10¹⁰

用比活测定(即pfu/毫克蛋白)比较病毒制备物的相对纯度。通过超滤从浓缩液纯化获得的病毒与通过PEG8000沉淀从浓缩液纯化获得的病毒有大致相同的活性。另外还通过测试来自Vero细胞的染色体DNA和蛋白来估计合并的纯化病毒的纯度。结果表明，无论是那种浓缩方法，每5微克纯化JE病毒中的宿主细胞DNA和蛋白质含量分别低达2.5pg和2ng，这证明上述两种纯化方法均有效地从病毒抗原中除去了其它杂质。然而在纯化病毒的蛋白得率方面，采用超滤的纯化方法比采用PEG8000沉淀的纯化方法好两倍。

实施例4

病毒灭活

将纯化的病毒直接用于在PBS透析后制备活性减毒疫苗或用于甲醛灭活来制备灭活的疫苗。用0.018％甲醛灭活在22℃或4℃进行。定时间隔取样，并通过噬斑滴定来直接测定感染性病毒(图4)。使在直接噬斑试验中呈阴性的样品在Vero细胞单层上盲传代(blind passage)，以便扩增低水平的病毒，然后重新进行噬斑测定。发现完全灭活感染性在22℃时需要4天，在4℃时需要46天(表5和6)。在灭活期间，通过用抗原斑点印迹和多克隆抗血清测试样品来监测病毒抗原性。通过该实验表明，在接触0.018％甲醛10天(22℃)或15天(4℃)后，没有检测到抗原性有损失。

在下列条件下进行甲醛灭活：22℃至少7天或4℃至少60天，给出了安全性宽裕量。在灭活后，加入0.038％偏亚硫酸氢钠中和样品中游离的甲醛。同时用PBS透析，然后通过0.22微米滤膜过滤。

表5.在4℃用甲醛灭活JE病毒CJ50003

天            JE病毒(-HCHO)            JE病毒(+HCHO)            扩增

0             3.2×10⁸                 3.2×10⁸                +

0.5           2.6×10⁸                 3.2×10⁶                +

1             1.52×10⁸                7.9×10⁵                +

1.5           2.4×10⁸                 4.8×10⁵                +

2             2.8×10⁸                 6.4×10⁴                +

3             2.6×10⁸                 4.3×10³                +

4             1.9×10⁸                 1300                     +

5             2.4×10⁸                 285                      +

6             2.8×10⁸                 480                      +

7             1.5×10⁸                 200                      +

11            1.5×10⁸                 0                        +

22            1.4×10⁸                 0                        +

32            1.2×10⁸                 0                        +

46            1.0×10⁸                 0                        -

60            1.0×10⁸                 0                        -

表6在22℃用甲醛灭活JE病毒

小时            JE病毒(-HCHO)            JE病毒(+HCHO)            扩增

0               3.2×10⁸                 3.2×10⁸                +

3               3.0×10⁸                 1.3×10⁶                +

6               2.7×10⁸                 1.1×10⁵                +

12              2.5×10⁸                 3.5×10⁵                +

24              1.2×10⁸                 140                      +

36              1.2×10⁸                 0                        +

48              1.2×10⁸                 0                        +

72              1.1×10⁸                 0                        +

96              1.1×10⁸                 0                        -

360             1.0×10⁸                 0                        -

实施例5

CJ50003的纯化的、灭活的病毒(PIV)和活的减毒病毒(LAV)在小鼠中的免疫原性

然后在小鼠中用已经商业化的Biken灭活疫苗测试LAV和PIV的免疫原性。用三种免疫原对一组20只6周龄BALB/c小鼠作腹膜内(i.p.)免疫。用两种接种物、没有佐剂间隔2周进行免疫。第二次免疫后两周，从各组小鼠获得血清，合并并随后用PRNT方法测试中和抗体的存在(表7)。如表7所示，接受三种免疫原的各组之间的中和抗体滴度没有显著差异。

表7.在PIV或LAV免疫的小鼠中诱导中和抗体免疫原                  剂量                  中和抗体的滴度^aPIV                     5微克                 1∶320PIV                     10微克                1∶320LAV                     5微克                 1∶320LAV                     10微克                1∶640Biken疫苗^b             1剂                   1∶320

a：中和抗体的滴度定义为导致小鼠脑传代的Nakayama病毒噬斑减少50％的血清稀释度的倒数。

b：根据生产商的说明，Biken疫苗1剂含有5微克病毒蛋白(能用TCA沉淀)。

进一步测试PIV在小鼠中的免疫原性。用各种稀释度的灭活病毒和或不和铝佐剂一起免疫成年近交小鼠。用在盐水中或含氢氧化铝(Rehydragel)的盐水中的500、50和5ng PIV皮下免疫一组20只6周龄BALB/c小鼠。小鼠接受两次接种(相隔3周)。在第二次免疫后3周，合并各组小鼠的血清，用小鼠脑传代Nakayana病毒株作为中和病毒，测试中和抗体的存在(表8)。PIV在所有剂量上均优于Biken疫苗，并且佐剂明显使小鼠对50和500ng PIV的免疫应答分别提高了约4和8倍。

表8.用含或不含氢氧化铝的PIV免疫的小鼠中中和抗体的滴度比较

免疫原                剂量                中和抗体的滴度^a

PIV                   500ng               1∶160

PIV                   50ng                1∶40

PIV                   5ng                 1∶20

PIV+铝                500ng               1∶1280

PIV+铝                50ng                1∶160

PIV+铝                5ng                 1∶20

Biken疫苗             1/10剂              1∶80

Biken疫苗             1/100剂             1∶10

Biken疫苗             1/1000剂            1∶10

a：中和抗体的滴度定义为导致小鼠脑传代的Nakayama病毒噬斑减少50％的血清稀释度的倒数。

b：根据生产商的说明，Biken疫苗1剂含有5微克病毒蛋白(能用TCA沉淀)。

然后在BALB/c小鼠中测试PIV的体内保护效力。为了进行保护试验，在一组10只3周龄BALB/c小鼠的后腿皮下接种盐水或含氢氧化铝(Rehydragel)盐水中的灭活JE病毒。年龄匹配的对照用PBS或含铝的非特异性抗原接种。三周后用等效剂量强化小鼠。免疫后3周，通过颅内接种含500pfu小鼠神经毒性JE病毒(Nakayama，适应小鼠大脑)的30微升PBS来攻击小鼠。每天监测受攻击的小鼠的发病率和死亡率至第21天。如表9所示，经50ng PIV免疫的小鼠表现出90％受保护。另外，经50和5ng PIV与铝的混合物免疫的小鼠分别表现出100％和70％的保护作用，而1/100剂的Biken疫苗只保护了50％的受免疫小鼠。相比，对照组中的所有小鼠均在攻击后5-7天开始发病和死亡。

表9受疫苗小鼠抗Nakayama病毒^a免疫原攻击的保护作用

免疫原                  剂量                  存活数

对照^b                  N/A                   0/10

PIV                     500ng                 10/10

PIV                     50ng                  9/10

PIV                     5ng                   3/10

PIV+铝                  500ng                 10/10

PIV+铝                  50ng                  10/10

PIV+铝                  5ng                   7/10

Biken疫苗^c             1/10剂                10/10

Biken疫苗               1/100剂               5/10

Biken疫苗               1/1000剂              3/10

a：小鼠用测试疫苗接种2次(相隔3周)免疫，然后用500pfu小鼠神经毒性Nakayama病毒攻击。

b：年龄匹配的对照用PBS或含铝的非特异性抗原接种。

c：根据生产商的说明，Biken疫苗1剂含有5微克病毒蛋白(能用TCA沉淀)。

为了研究CJ50003病毒在Vero细胞传代时的免疫学稳定性，独立纯化在Vero细胞中传代数不同的病毒，用表8所述的方法评价免疫原性。如表10所示，在Vero细胞中不同病毒传代数的病毒制得的疫苗之间，其引发中和抗体的能力没有显著差别，这表明CJ50003病毒在免疫原性方面在Vero细胞代数上非常稳定。

表10用Vero细胞中不同病毒传代数的JE病毒制得的疫苗的效力

免疫原^a           剂量            中和抗体的滴度            S.d.^c

PIV-4ps            0.5微克         1∶150                    20

PIV-6ps            0.5微克         1∶145                    15

PIV-15ps           0.5微克         1∶130                    28

PIV-20ps           0.5微克         1∶140                    18

PIV-30ps           0.5微克         1∶160                    13

a：免疫原(PIV-Xps)；从CJ50003病毒制得的纯化的灭活的疫苗，病毒在Vero细胞中的传代数是X。

b：中和抗体的滴度定义为导致小鼠脑传代的Nakayama病毒噬斑减少50％的血清稀释度的倒数，取三个分开实验的结果的平均值。50％端点用Reed和Muench方法确定。

c：标准偏差

本文示出的结果表明，采用CJ50003株的灭活JE病毒疫苗以及活的减毒疫苗均是有前途的。本发明为在Vero细胞中生长JE病毒、将它们浓缩和纯化至适用于人体的程度、以及将它们灭活而抗原性没有可测定损失提供了相当快速的、有效的方法。发现这些制备物在小鼠体内有免疫原性和保护作用。

Claims (7)

1.一种减毒的日本脑炎病毒，它通过在Vero细胞上传代培育来适应Vero细胞。

2.根据权利要求1所述的减毒的日本脑炎病毒，其特征在于，在Vero细胞中的复数大于1×10⁷PFU/毫升，对幼成年小鼠的LD₅₀/pfu低于0.000001。

3.根据权利要求1或2所述的减毒的日本脑炎病毒，其中该病毒是CJ50003。

4.一种日本脑炎疫苗，它包含权利要求1所述的日本脑炎病毒。

5.根据权利要求4所述的疫苗，其中用灭活剂来灭活病毒。

6.根据权利要求4所述的疫苗，其中病毒是未经灭活剂处理的活的减毒的日本脑炎病毒。

7.根据权利要求4、5或6所述的疫苗，它还包含药学上可接受的添加剂。

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