ES2281929T3 - Virus de la encefalitis japonesa atenuado adaptado a las celulas vero y vacuna contra la encefalitis japonesa. - Google Patents
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Abstract
Virus de la encefalitis japonesa atenuado caracterizado porque el gen de la proteína E de dicho virus comprende las mutaciones puntuales T19A, T177A, K243E y Q264H.
Description
Virus de la encefalitis japonesa atenuado
adaptado a las células Vero y vacuna contra la encefalitis
japonesa.
La presente invención se refiere a un virus de
la encefalitis japonesa atenuado adaptado a células Vero por pases
en células Vero y a una vacuna contra la encefalitis japonesa que
comprende dicho virus atenuado.
La encefalitis japonesa (JE) es una enfermedad
arbovírica transmitida por mosquitos de importancia sanitaria
pública principal en Asia. Anualmente se presentan más de 35.000
casos y 10.000 muertes en este continente, pero los informes
oficiales subestiman indudablemente el verdadero número de casos
(Okuno, T. World Health Stat Q. 3: 120-31,
1978; Umenei, T. et al. Bull World Health Org. 63:
625-31, 1985). La enfermedad puede manifestarse por
un síndrome febril de cefalea, meningitis aséptica o encefalitis y
aproximadamente la mitad de los supervivientes tienden a presentar
secuelas neurológicas y psiquiátricas permanentes (Burke, D. S.
et al. The Arbovirus: Epidemiology and Ecology
3:63-92, 1988; Monath, T. P. Virology
763-814, 1990).
El virus de la JE es uno de los 66 virus
Flaviviridae, de ARN monocatenario, encapsulado,
transcrito-positivo; que en su mayor parte son
transmitidos por vectores (Chambers, T. J. et al. Ann.
Rev. Microbiol. 44:649-88, 1990).
Morfológicamente, los flavivirus son esféricos, de aproximadamente
40 nm de diámetro, se componen de una bicapa de lípido que rodea
una nucleocápside que contiene un genoma de 11 kb acomplejado con
una proteína de la cápside (C) (Rice, C. M. et al.
Science 229:726-33, 1985). Las proyecciones
superficiales sobre la membrana se componen de envoltura
glucosilada (E) y proteínas de la membrana (M). Una glucoproteína
pre-M, presente en los viriones intracelulares
nacientes, se escinde a la proteína M, hallada en viriones
extracelulares maduros. Actividades fisiológicas importantes se
asocian a la proteína E de 53 kd, incluyendo la hemoaglutinación,
la neutralización vírica, el montaje del virión, la fusión de la
membrana y la unión vírica a receptores celulares (Koshini et
al., Virol. 188:714-20, 1992).
Existen tres vacunas contra la JE para seres
humanos (Tsai, T. et al. Vaccines
671-713, 1993). De las tres, únicamente la vacuna
contra la JE inactivada producida en el cerebro del ratón está
disponible internacionalmente. Un fabricante, la Research
Foundation for Microbial Diseases of Osaka University (Biken)
produce la mayor parte de la vacuna JE inactivada distribuida
internacionalmente; esta vacuna fue autorizada en 1992 en los
Estados Unidos en los que es distribuida por Connaught Laboratorios,
Inc., como JE-VAX^{TM}. La vacuna contra la JE
inactivada y atenuada con organismos vivos preparada en células de
riñón de hámster primarias (PHK) se distribuye solamente en
China.
La vacuna contra la JE inactivada producida en
cerebros de ratones fue autorizada en Japón en 1954. Debido a que
se produce por inyección cerebral en ratones jóvenes, es laboriosa
de preparar y preocupa la posibilidad de que se produzcan efectos
secundarios neurológicos relacionados con la vacuna. Aunque
sucesivos perfeccionamientos en el proceso de fabricación han
aumentado su pureza y potencia (Oya, A. Vaccination Theory and
Practice 69-82, 1975; Oya, A. Acta Pediatr.
Jpn. 30:175-84, 1988; Takaku, K. Biken J.
11:25-39, 1968), una frecuencia moderada de
reacciones locales y generalizadas leves no ha sido publicada hasta
recientemente (Hoke, C. H. et al. New Engl. J. Med.
319:608-14, 1988; Poland, J. D. et al. J.
Infect. Dis. 161:878-82, 1990; Sánchez, J. L.
et al. Lancet 335:972-73, 1990). En
el 20% de las vacunas se produce dolor con la palpación,
enrojecimiento y/o hinchazón local en el punto de inyección.
Síntomas generalizados leves, cefalea principalmente, fiebre de
pocos grados, mialgias, malestar y síntomas gastrointestinales, son
descritos para el 10 al 30% de las vacunas. Un patrón aparentemente
nuevo de reacciones adversas que comprende urticaria, angioedema,
disnea, eritema multiforme, eritema nodular y trastornos
neurológicos graves han sido descritos desde 1989, principalmente
entre trabajadores vacunados en Australia, Europa y América del
Norte (Anderson, M. M. et al. Lancet. 337:1044, 1991;
Ruff, T. A. et al. Lancet 228:881-2,
1991). Además, en 1992 y 1995 Ohtaki describió varios niños con
encefalomielitis aguda diseminada (ADEM) con cambios en el
diagnóstico por la imagen por resonancia magnética (MRI) después de
la vacunación contra la JE (Ohtaki, E. et al. Pediatr.
Neurol. 8:137-9, 1992; Ohtaki, E. et al.
J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 59:316-7,
1995). También hay que destacar que esta vacunación con vacuna
contra la rabia que contiene tejido de cerebro animal ha producido
complicaciones neurológicas graves (Plotkin, S. A. et al.
Vaccines 661-2, 1994). Por estas razones, la
OMS ha designado el desarrollo de la vacuna contra la JE como de
alta prioridad.
Más recientemente, la vacuna contra la JE
inactivada y atenuada con organismos vivos de China ha demostrado
ser eficaz, produciendo títulos elevados de anticuerpo neutralizante
de virus y proporcionando sólida protección (Tsai, T. et al.
Vaccines 671-713, 1993). Sin embargo, las
células PHK en las que se prepararon las vacunas chinas no están
aprobadas por la Organización Mundial de la Salud (OMS) para la
producción de vacuna vírica o autorizadas para la utilización
humana por los países desarrollados. El principal inconveniente para
utilizar las células primarias de hámster para la producción de
vacunas es la incertidumbre con respecto a la calidad de la vacuna.
Incluso si se utilizan hámsteres exentos de patógeno específico, los
animales pueden llegar a infectarse inesperadamente, siendo
problemático la producción de la vacuna. Ocasionalmente una
infección de este tipo pudo detectarse durante un periodo
prolongado. Con estas críticas, se requieren más estudios
controlados de la seguridad de la vacuna que aporten confianza
respecto a su utilización ampliamente generalizada. Otro
inconveniente de la producción de la vacuna a partir de células
primarias es la poca velocidad de recogida del virus y su elevado
coste sin permitir la producción en
masa.
masa.
En vista de lo anterior, existe la necesidad de
una nueva vacuna contra la JE que se produzca en estirpes celulares
normales tales como células Vero o diploides humanas que han sido
aceptadas como sustratos para vacunas humanas, con buena relación
coste-eficacia. Las células Vero se transforman pero
no las células tumorígenas procedentes del riñón de mono. La
estirpe de células Vero presenta más ventajas que cualquier otra
estirpe celular normal porque las células Vero se adaptan más
fácilmente al cultivo celular a gran escala y como célula
transformada tiene una duración infinita.
Se ha descubierto ahora que el virus de la JE
puede cultivarse en cultivo de células Vero. Se han realizado
esfuerzos considerables en el campo de la vacuna contra la JE para
producir vacunas en células normales que permitan efectuar cultivos
celulares en un gran volumen. No obstante, la caracterización del
virus que incluye la estabilidad genética, rendimiento y el proceso
necesario para la comercialización de la vacuna por cultivo con
células Vero no ha reunido nunca los requisitos de la vacuna humana.
Debido a estos hechos y a las dificultades de trasladar un
conocimiento adquirido en otros cultivos de virus al virus de la JE,
la técnica anterior no ha alcanzado éxito en el desarrollo de la
vacuna del virus de la JE que es genéticamente estable y tiene un
gran carácter inmunógeno de las estirpes celulares continuas. De
entre todas estas investigaciones, ninguna ha dado como resultado
hasta el presente una nueva producción de vacunas que satisfaga los
criterios mencionados en estos antecedentes.
La presente invención sugiere un desarrollo y
una propagación de virus JE en estirpe celular continua, células
Vero para la producción de la vacuna que superan los problemas
anteriores en el virus JE producido en el cerebro de ratón o en
estirpes celulares primarias. La presente invención identifica
asimismo la metodología desarrollada para cultivar el virus JE y un
procedimiento corriente abajo para la producción de la vacuna con
coste-eficacia.
Además, la presente invención identifica la
metodología mejorada en las vacunas contra la JE comercializadas
anteriormente de las maneras siguientes.
- 1.
- Seguridad: El virus inventado no adquirió la virulencia por el cultivo de células Vero, reduciendo los riesgos de producción y proporcionando un nivel adicional de seguridad a los receptores más allá del proporcionado por el control severo sobre el procedimiento de inactivación del virus. Esta ventaja no ha sido nunca proporcionada por las vacunas contra la JE comercializadas anteriormente.
- 2.
- Aumento de aporte en el sustrato con producción segura: La vacuna contra la JE de la presente invención se produce en ausencia de suero bovino, produciendo altos rendimientos y producción económica y a escala que no se consiguen en las vacunas contra la JE comercializadas anteriormente.
- 3.
- Menos reactogenia: No se incorpora ningún estabilizador de gelatina en la vacuna contra la JE de la presente invención, reduciendo el riesgo de las reacciones de la vacuna similares a las observadas con la vacuna existente (Saskaguchi M. et al. Vaccines 68-69, 1998). Además, los componentes bovinos indeseables, incorporados en las vacunas contra la JE existentes se eliminan de manera eficaz. En conclusión, este punto de seguridad de la presente invención no ha sido proporcionado nunca por la vacuna contra la JE anterior.
- 4.
- Aumento de potencia: El éxito de la producción a escala con células Vero y la ausencia de complementos para la producción, así como la purificación eficaz, permite la primera utilización de potentes adyuvantes en la formulación de la vacuna contra la JE. Aunque la utilización de los adyuvantes en la formulación de la vacuna ha sido aplicada en otra vacuna, ha sido difícil trasladar este conocimiento a la vacuna contra la JE ya que ninguna de las vacunas contra la JE existentes asegura su producción segura.
En conclusión, ninguna ha dado como resultado
hasta el presente una nueva vacuna que satisfaga las ventajas
mencionadas anteriormente en la comercialización de la vacuna contra
la JE.
Por consiguiente, un objetivo de la presente
invención consiste en proporcionar una vacuna contra la JE segura y
eficaz producida en sustrato celular normal para aumentar su
aceptación en muchos países. Otro objetivo de la invención consiste
en proporcionar un procedimiento eficaz para producir una vacuna
estable muy purificada y formular una vacuna que presente un
carácter muy inmunógeno con una pequeña cantidad de antígeno.
En un aspecto, la presente invención proporciona
un virus atenuado de la encefalitis japonesa tal como el descrito
en la reivindicación 1 adaptado a células Vero por pases en células
Vero. El virus atenuado de la encefalitis japonesa de la presente
invención, que se denomina CJ50003 en la presente memoria, fue
depositado en la colección permanente del Korean Culture Center of
Microorganisms, Seúl, Corea, el 20 de abril de 1998 bajo el tratado
de Budapest de reconocimiento internacional del depósito de
microorganismos para el procedimiento de patente, y un subcultivo
de los mismos puede obtenerse en el lugar de depósito con el número
de registro KCCM-10125.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona una vacuna contra la encefalitis japonesa que comprende
un virus atenuado de la encefalitis japonesa adaptado a la célula
Vero por atenuaciones en la célula Vero.
Estas y otras características, aspectos y
ventajas de la presente invención se comprenderán mejor a partir de
la siguiente descripción, reivindicaciones adjuntas y dibujos anexos
de la manera siguiente:
La Figura 1 presenta los pases y la adaptación
del virus SA14-14-2(PDK) de
la JE en células Vero. El pase 1 del virus fue recogida 5 días
después de la inoculación de la monocapa de la célula Vero con 0,1
moles de la cepa
SA14-14-2(PDK). El título del
virus JE se midió por análisis en placa realizado en monocapas de
célula Vero. Se realizaron pases en serie posteriores a 30 pases
con el virus del pase 1 como material de partida por infección y
valoración sucesivas del virus como se describe en el Ejemplo 1.
La Figura 2 presenta la recogida en múltiples
tiempos del virus CJ50003 de la JE en un frasco cilíndrico cada dos
días desde el día 3 hasta el 17 después de la infección. Se
infectaron monocapas de célula Vero a una m.o.i. de 0,01 unidades
formadoras de placa (pfu) por célula. Se dejó adsorber el virus
durante 2 h a 35ºC, se lavaron las células con PBS tres veces, se
alimentaron con 100 ml de EMEM exento de suero y se incubaron a
35ºC. Cada 48 h de 3 a 17 días tras la inoculación, se sustituyeron
los sobrenadantes del cultivo con EMEM exento de suero reciente. Se
realizaron valoraciones de la infectividad del virus de las
recogidas colocando en placas en monocapas de células Vero.
La Figura 3 presenta un análisis del virus
CJ50003 de la JE purificado por ultracentrifugación en gradiente de
sacarosa por SDS-PAGE y transferencia Western. Se
aplicaron sesenta ml de sobrenadante de cultivo concentrado a un
gradiente de sacarosa de cuarenta ml del 15 al 60% y se centrifugó
en una centrifugadora 45 Ti a 22.000 rpm, 18 h, 12ºC. Se recogieron
muestras de dos ml del fondo del tubo y se sometieron a un gradiente
SDS-PAGE del 4 al 20% y las proteínas resueltas se
transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Se observaron las
proteínas tiñéndolas con azul brillante de Coomassie (Panel A) o
con nitrato de plata (Panel B), y se observaron antígenos por
reacción con reactivo de anticuerpo monoclonal contra la proteína E
del virus JE (Panel C). Banda 1, patrones de proteína antes de ser
teñidos (Novex Seeblue^{TM}) que representan pesos moleculares de
250, 98, 64, 50, 36, 30, 16 y 6 kDa de la parte superior; bandas 2
a 10, fracciones nº 3 a 11 del fondo tras la ultracentrifugación;
E, proteína de la cápsula; C, proteína de la cápside; M, proteína de
la membrana.
La Figura 4 presenta la cinética de la
inactivación con formaldehído del virus CJ50003 purificado de JE. Se
inactivaron las preparaciones del virus purificado de JE con
formaldehído al 0,018% a 4ºC o 22ºC. Se valoró el virus infeccioso
residual en las muestras tomadas en los tiempos indicados por
colocación directa en placas en monocapas de célula Vero. Además,
se realizó el ensayo de ampliación para detectar bajos niveles de
virus de la forma siguiente. Frascos por duplicado que contienen
monocapas de célula Vero se inocularon con muestras de los puntos
de tiempo de inactivación del virus. Después de un periodo de
adsorción de 2 h a 35ºC, se volvieron a alimentar las células y se
incubaron a 35ºC. Las células se volvieron a alimentar a los 7 y 14
días tras la infección. Se recogieron los medios de cultivo y se
colocaron en placas para detectar el virus infeccioso. Se presentan
los puntos de tiempo de inactivación de dos experimentos por
separado: 4ºC (rectángulo negro), 22ºC (círculo negro). Se
realizaron en paralelo controles (rectángulo blanco para 4ºC y
círculo blanco para 22ºC) de inactivación térmica (sin
formaldehído).
La presente invención se refiere a una cepa de
virus de JE que presenta propiedades deseables para la preparación
de la vacuna contra la JE. Dicho virus es un virus atenuado y puede
propagarse en la estirpe de células Vero continua que es admitida
por la OMS como sustrato celular para la producción de vacunas
humanas. De este modo es de esperar que dicho virus pueda
utilizarse para la preparación de vacunas contra la JE inactivadas y
atenuadas más seguras que las vacunas actuales.
La presente invención proporciona una vacuna que
satisface la presente necesidad. Se ha adaptado un virus de la JE a
la célula Vero por pases en serie a no más de 35ºC. Los pases
continuos en célula Vero produjeron el aumento del título del
virus, superior a 10^{7} pfu por ml de sobrenadante de cultivo y
redujeron el tiempo de cultivo para mostrar el pico del título del
virus. La invención se refiere al desarrollo de un procedimiento de
recogida múltiple en el tiempo sin ningún requisito de suero como
suplemento producido con alto rendimiento de productividad de
virus, que presenta propiedades comercialmente factibles para la
producción a gran escala de dicha vacuna con
coste-eficacia. Según la invención, el procedimiento
de recogida múltiple en el cultivo del virus es responsable del
grado reducido de efecto citopático (CPE) de las células infectadas.
La vacuna contra la JE de la presente invención contiene una
cantidad sumamente pequeña de componentes residuales derivados de
la célula debido al nivel reducido del CPE. Además, la vacuna contra
la JE de la presente invención es de esperar que proporcione un
aumento de inmunogenicidad y mayor protección contra la enfermedad
que las vacunas contra la JE actuales. La vacuna contra la JE
purificada de la presente invención presentan una ventaja mayor
sobre las vacunas actuales porque las vacunas purificadas de las
células Vero cultivadas cumplen los requisitos de desarrollo para
la vacuna humana.
La presente invención se refiere asimismo a los
procedimientos para la preparación de dicha vacuna. Los
procedimientos pueden proporcionar productividad, pureza y potencia
elevadas de dicha vacuna. El virus CJ50003 de la JE se obtiene
sometiendo el virus SA14-14-2 de la
JE (PDK) a 4 pases o más de adaptación en las células Vero de
cultivo tisular a temperaturas no superiores a 35ºC y seleccionando
el virus cultivado a la vez que controlando la propagación del
virus basándose en el número de focos que se formaron en las células
Vero y/o LLC-MK2. El virus obtenido a partir de
esta adaptación tiene un título máximo de por lo menos 1 \times
10^{7} pfu/ml de sobrenadante de cultivo en el cultivo de células
Vero y redujo el periodo de incubación para la recogida. El virus
SA14-14-2 de la JE es una cepa
atenuada que se obtiene adaptando un virus SA14 de la JE natural de
mosquito en la célula de cultivo de tejido de riñón de hámster
primario (PHK) y en la célula del cultivo tisular de riñón de perro
primario (PDK) (Kenneth H. Eckels, et al. Vaccine 6
513-518, 1988). Pero las células PHK y PDK no son
admitidas por la OMS, así que no son adecuadas para la preparación
de vacunas aplicables a seres humanos. La célula Vero es admitida
por la OMS para uso humano, así que la cepa del virus de la JE
adaptada a Vero, CJ50003, es una buena base para la producción de
vacuna para los seres humanos.
Es sabido que el virus
SA14-14-2(PDK) pertenece a
los flavoviridae y presenta las siguientes propiedades
fisicoquímicas: genoma de ARN monocatenario,
transcrito-positivo con extremo metilado en 5' y
extremo 3' sin estructura poli A. El tamaño del genoma del ARN es
aproximadamente 11 kb y el genoma está en estado combinado con la
proteína de la nucleocápside (C) de 13.500 Da. El virus además se
compone de proteína de la membrana (M) de 8.700 Da, proteína de la
cápsula (E) de 53.000 Da y proteínas no estructurales NS1, 2a, 2b,
3, 4a, 5 y similares.
La cepa CJ50003 del virus de la JE adaptada a
Vero se atenuó en células Vero durante 30 pases. El título del
virus y la morfología de la placa no variaron en toda la atenuación,
lo que sugiere que el virus presenta carácter fenotípico
estable.
Para conseguir entender en base molecular las
características biológicas del virus CJ50003 de la JE, se analizaron
las propiedades fisicoquímicas del virus. La secuencia de las bases
del genoma vírico se determinó por clonación y secuenciado del
ADNc. Como resultado, se descubrió que tres bases de adenina de las
posiciones 1032, 1506 y 1704, y una base de guanina de la posición
1769 del gen de la proteína E del virus
SA14-14-2(PDK) de la JE eran
sustituidas por tres guaninas y una timina en el virus CJ50003 de la
JE, respectivamente. Por consiguiente, la secuencia de aminoácidos
de la proteína E se cambió de la treonina de la posición 19, la
treonina de la posición 177, la lisina de la posición 243 y la
glutamina de la posición 264 a alanina, alanina, glutamato e
histidina, respectivamente. Los cambios de aminoácidos de la
proteína E se mantuvieron durante los pases del virus en la célula
Vero mientras duró la investigación de los presentes inventores.
El virus CJ50003 de la JE no mata los ratones
cuando virus que tienen diferente número de pases en las células
Vero, se inyectaron a ratones jóvenes por vía intracerebral. Por
consiguiente, puede decirse que el virus CJ50003 una cepa del virus
atenuada y estable que no presenta ninguna o poca neurovirulencia.
Uno de los puntos críticos consiste en utilizar dicho virus para la
vacuna contra el virus de la JE atenuada y/o la vacuna
inactivada.
La presente invención también proporciona un
procedimiento para purificar virus a partir del cultivo celular sin
congelar los materiales en bruto o con pureza temporal. Dicho
procedimiento comprende las etapas que consisten en eliminar el
residuo celular, concentrar el virus, purificar el virus por
precipitación de los materiales de origen celular y
ultracentrifugación en gradiente de sacarosa, fraccionando los
gradientes y analizando el virus en las fracciones. Más
específicamente, la presente invención proporciona un procedimiento
para la producción de virus de JE purificado, proporcionando el
virus a título elevado en estirpes celulares continuas, en
presencia o ausencia de complementos de proteína del suero,
purificando el virus por ultracentrifugación y mezclando las
fracciones positivas al virus.
Dicho virus se propaga en células Vero de
cultivo tisular. Las células Vero que crecen de manera confluente
en frascos cilíndricos se infectan y se incuban con el virus
CJ50003. La recogida del virus puede realizarse por el
procedimiento de recogida múltiple. La recogida del sobrenadante del
cultivo se empezó en el punto de 2 ó 3 días tras la infección según
la m.o.i. de la infección, y se realimentó medio reciente al
cultivo. Después de 2 días de incubación del cultivo realimentado,
se recogió de nuevo el sobrenadante del cultivo. La recogida puede
repetirse hasta 4 veces en 8 ó 9 días tras la infección con el
título del virus mantenido por encima de 10^{7} pfu/ml de
sobrenadante del cultivo. El procedimiento de recogida múltiple
proporcionó un alto rendimiento de virus por unidad de frasco
cilíndrico, de manera que hace a esta invención más compatible con
las leyes del mercado. Además, el procedimiento es responsable del
grado reducido de CPE de las células infectadas. El nivel reducido
de CPE contribuye al nivel sumamente bajo de los componentes
derivados de la célula residual en la vacuna contra JE de la
presente invención. Los sobrenadantes del cultivo recogidos pueden
almacenarse a 4ºC hasta que comience la purificación. La
clarificación de los sobrenadantes del cultivo recogidos puede
realizarse por procedimientos habituales conocidos en la técnica
incluyendo la centrifugación a baja velocidad, por ejemplo, a 1.500
g durante 10 min, y/o por filtración a través de un filtro de tamaño
de poro de 0,45. El fluido del cultivo recogido se almacena a 4ºC
hasta su concentración. Para la concentración del virus, el fluido
de cultivo se ultrafiltra y lo retenido se recoge. En otro
procedimiento de concentración, el polietilenglicol (PEG) 8000 se
disuelve en el fluido de cultivo hasta el 10% y el precipitado se
disuelve en un tampón apropiado, por ejemplo solución salina
tamponada con fosfato (PBS, pH 7,0). La precipitación con sulfato
de protamina se realiza para eliminar el ADN u otros materiales que
se originan en la célula, lo que puede realizarse por adición de
sulfato de protamina a la solución concentrada del virus y
centrifugación a alta velocidad, por ejemplo, a 12.000 g, durante 5
min. Para purificación adicional del virus, se realiza la
ultracentrifugación con gradiente de densidad en gradientes del 15
al 60% de sacarosa continuo o multietapa. El gradiente de sacarosa
se fracciona y se analiza el virus en las fracciones. Los
procedimientos de análisis de las fracciones positivas al virus
incluyen el análisis en placa, análisis de hemoaglutinación,
electroforesis en gel de poliacrilamida y análisis de antígeno tal
como inmunoanálisis. Las fracciones para tratamiento adicional se
mezclan basándose en la valoración elevada del virus y el bajo nivel
de otras impurezas. La pureza de la mezcla de virus purificados se
estimó analizando el ADN cromosómico y la proteína originados en la
célula Vero. Los resultados demostraron que los contenidos de ADN
celular y proteína del hospedador son tan bajos como 2,5 pg y 2 ng
por 5 \mug de virus de la JE purificado, respectivamente, lo que
demuestra que los procedimientos de purificación descritos
anteriormente eliminaron eficazmente otras impurezas del antígeno
vírico. El rendimiento de virus de la JE de 1 l de fluido de
cultivo infectado se estima que es de aproximadamente 2,3
miligramos.
La presente invención proporciona también un
procedimiento de inactivación de virus de JE para destruir su
infectividad a la vez que se conserva su antigenicidad. Dicho
procedimiento comprende la adición de una cantidad eficaz de
formaldehído y la incubación de dicho virus con dicho agente en
determinadas condiciones de modo que dicho virus se inactiva.
Específicamente, la mezcla de la fracción se diluyó a una
concentración de proteína apropiada con un tampón apropiado tal
como PBS y se añadió formaldehído a la mezcla de la fracción
diluida. La incubación con formaldehído se realizó a 22ºC o 4ºC.
Por lo menos 4 ó 46 días se necesitaron para destruir completamente
la infectividad vírica sin pérdida de antigenicidad vírica a 22ºC o
4ºC, respectivamente. El procedimiento de inactivación del virus de
la JE a 22ºC se seleccionó preferentemente por sencillez en el
cultivo a gran escala y el tiempo de incubación se amplió hasta 7
días como margen de seguridad. Sin embargo, ejemplos de agentes de
inactivación que eran eficaces incluyen pero no se limitan a
formaldehído. En general esto puede conseguirse por medios químicos
o físicos. La inactivación química puede efectuarse tratando los
virus, por ejemplo, con enzimas,
\beta-propionlactona, etilenimina o un derivado de
las mismas, y un disolvente orgánico tal como Tween, Triton,
desoxicolato sódico y sulfobetaína. Si es necesario, la sustancia
inactivadora se neutraliza después; el material inactivado con
formaldehído puede neutralizarse, por ejemplo, con tiosulfato. La
inactivación física puede realizarse preferentemente sometiendo los
virus a radiación rica en energía, tal como la luz UV, radiación X
o radiación gamma.
Las vacunas contra la JE se preparan como
inyectables, ya sea como solución líquida o en suspensión. Es
posible añadir un agente estabilizante tal como carbohidratos
(sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, dextrano, glucosa, etc.),
proteínas (albúminas, caseína, etc.), un agente que contiene
proteínas (suero bovino, leche descremada, etc.) y tampones (tales
como fosfato de metal alcalino). La preparación puede liofilizarse
después de añadir un estabilizante y puede almacenarse al vacío o
en nitrógeno. Si se desea, pueden añadirse uno o más compuestos con
acción adyuvante. Los compuestos adecuados para este fin son, por
ejemplo, hidróxido, fosfato u óxido de aluminio, aceite mineral
(tales como Bayol y Marcol 52) y saponinas. Además, si se desea, se
añade uno o más emulsionantes, tal como Tween y se centrifuga, a
los materiales del virus.
La eficacia de un adyuvante se determinó
midiendo la cantidad de anticuerpos neutralizantes dirigidos contra
el virus, de la administración a un adyuvante del virus inactivo en
vacunas que también son absorbidas. Ejemplos de adyuvante que fue
eficaz incluyen pero no se limitan a hidróxido de aluminio. Se
investigó la eficacia de la vacuna obtenida mediante la prueba de
neutralización por reducción en placa (PRNT) con el suero de dichos
ratones inmunizados con la vacuna y la prueba de provocación directa
de los ratones inmunizados con un virus neurovirulento. Como
resultado, se demostró que dicha vacuna presentaba la misma o una
mejor eficacia de producción de anticuerpos neutralizantes que las
vacunas comparables.
Para investigar posibles cambios en la
inmunogenicidad de virus adaptados a Vero con diferentes números de
pases, se prepararon vacunas con diferentes números de pases y se
comparó la eficacia de cada vacuna. No existió ninguna diferencia
notable de eficacia entre las vacunas preparadas a partir de virus
con diferentes números de pases a pesar de la atenuación sucesiva
en células Vero. Por lo tanto puede decirse que la cepa CJ50003 del
virus de la JE adaptado a Vero, presentaba inmunogenicidad estable.
Los ejemplos siguientes ilustran el virus de JE atenuado adaptado a
la célula Vero según la presente invención y la vacuna contra la JE
que comprende dicho virus atenuado según la presente invención. A
partir de la descripción anterior y de los ejemplos siguientes, se
considera que los expertos en la materia serían capaces de realizar
la invención en su totalidad.
Ejemplo
1
Se utilizó
SA14-14-2 (PDK) de JE, virus
SA14-14-2 en 8 pases de cultivo
celular de riñón de perro para iniciar los pases en serie en el
cultivo de células Vero. Se inocularon monocapas de células Vero con
SA14-14-2 (PDK) de JE a una m.o.i.
de 0,1 pfu por célula. Los cultivos de células infectadas se
cultivaron en matraces de cultivo de 25 cm^{2} que contenían 5 ml
de medio nutriente constituido por medio esencial mínimo de Tagle
enriquecido con suero bovino fetal al 10% en una atmósfera de
aproximadamente 5% de CO_{2} en aire y a una temperatura no
superior a aproximadamente 35ºC, típicamente entre aproximadamente
32ºC y aproximadamente 35ºC, prefiriéndose aproximadamente a 35ºC.
Se controló el crecimiento vírico por observación al microscopio del
efecto citopático (CPE) y varios análisis para la presencia de
antígeno vírico incluyendo el análisis de hemoadsorción (HA),
análisis en placa y ensayo inmunoadsorbente con enzima ligada
(ELISA). Se recogió el virus de la JE el día 5 después de la
infección cuando el cultivo presentaba el pico del título del virus,
se purificó por centrifugación. La única placa se purificó a partir
del sobrenadante depurado y se amplió en células Vero. El virus
ampliado se reinfectó en células Vero para pases adicionales. Se
realizaron pases en serie posteriores hasta 30 pases mediante
infección, valoración y purificación sucesivas en placa del virus
como se describió anteriormente. Como se muestra en la Figura 1,
las valoraciones del virus alcanzaron aproximadamente 4 \times
10^{7} pfu por ml de sobrenadante del cultivo con 4 pases en
células Vero y se mantuvieron próximas a este nivel en pases
adicionales. Además, el periodo óptimo para la recogida vírica se
redujo desde 5 días en el pase 1 a 2 a 3 días en el pase 4. Un
aumento significativo en el rendimiento del virus, aproximadamente
10^{5} pfu/ml hasta más de 10^{7} pfu/ml y una disminución en el
tiempo de incubación produjo la selección del pase 4 de JE en
células Vero como material de partida de selección para la
preparación de una vacuna contra JE experimental. El pase 4 de JE
en células Vero se marcó como CJ50003 (Vero, PS4). La abreviatura PS
significa el número de pase del virus en la célula designada.
Ejemplo
2
En un intento de discernir en base molecular la
característica biológica de la cepa CJ50003, se determinó la
secuencia de 1500 nucleótidos que codifica el gen de la cápsula (E)
que posee los epítopos neutralizantes mayores y se comparó con la
de las cepas de la vacuna precursora,
SA14-14-2(PDK),
SA14-14-2(PHK) y virus SA14
natural (Aihira, S. et al., Virus Genes,
5:95-109, 1991; Ni, H. et al. J. Gen.
Virol. 76:401-407, 1995; Ni, H. et al.
J. Gen. Virol. 76:409-413, 1995; Nitayaphan,
S. et al. Virology 177:541-542, 1990).
Se utilizó virus CJ50003 (Vero, PS4) para análisis de la secuencia.
Esto puso de manifiesto que la zona terminal C (aminoácidos 280 a
500) presenta conservación completa, mientras que la zona terminal N
(aminoácidos 1 a 279) presenta variación de la secuencia entre las
cepas del virus. Las mutaciones en la zona terminal N están casi
uniformemente distribuidas. La secuencia de nucleótidos del gen de
la proteína E de CJ50003 se diferencian de SA14/CDC en 8
nucleótidos y 7 aminoácidos mientras que
SA14-14-2(PDK) se diferencian
de SA14/CDC en 7 nucleótidos y 5 aminoácidos. Los resultados se
resumen en la Tabla 1.
La secuencia del virus CJ50003 se diferencia de
la secuencia publicada del virus
SA14-14-2(PDK) en 5
posiciones: los cambios de los nucleótidos en las posiciones 1032,
1506, 1704 y 1769 dieron como resultado diferencias de 4
aminoácidos entre los virus
SA14-14-2 (PDK) y CJ50003: cambios
de nucleótido en la posición 989 no dieron como resultado
sustitución de aminoácido. Los pases mayores del virus CJ50003, es
decir los pases 15 y 30 no pusieron de manifiesto ningún cambio
adicional de nucleótidos. Existen, por consiguiente 5 nucleótidos
distintos y 4 cambios de aminoácidos entre CJ50003 y el virus
precursor, SA14-14-2(PDK) y
estos cambios eran estables en el pase de este virus en el cultivo
celular. El resto Lys en 243 y el
SA14-14-2(PDK), que es
únicamente diferente en comparación con los demás virus de JE
atenuados se sustituyeron con el resto Glu en CJ50003.
La secuencia de CJ50003 se diferenció también de
la secuencia publicada del virus
SA14-14-2(PHK) (Aihira, S.
et al. Virus Genes, 5:95-109, 1991).
La diferencia de nucleótidos en 1032 produjo diferencias de
aminoácidos en la posición E19 pero el cambio en la posición 989
del nucleótido no produjo ninguna sustitución de aminoácido. Los
nucleótidos en 1506 y 1704 en el virus CJ50003 fueron los mismos que
los presentes en el
SA14-14-2(PHK) en estas
posiciones mientras que son diferentes del
SA14-14-2(PDK) en aquellas
posiciones. El modelo de sustituciones en toda la zona
N-terminal del CJ50003 y del gen E de
SA14-14-2(PHK) es casi la
misma excepto para la sustitución de aminoácidos en E19.
Los virus
SA14-14-2(PHK),
SA14-14-2(PDK) y CJ50003
presentan 4 sustituciones idénticas de aminoácidos en comparación
con la secuencia del virus SA14 precursor en las posiciones E107,
E138, E176 y E279. De éstos los aminoácidos en las posiciones E138
y E176 (Ni, H. et al. J. Gen. Virol.
76:409-413, 1995), que se supo que contribuyen a la
atenuación se conservaron incluso después de la adaptación de Vero,
lo que sugiere que CJ50003 no perdió su carácter atenuado.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Se determinó la neurovirulencia en los ratones
en CJ50003 y en el
SA14-14-2(PDK) precursor por
inyección intracerebral (i.c.) en los ratones BALB/c de 4 semanas.
Los resultados se muestran en la Tabla 2. La letalidad de los
ratones adultos jóvenes no es significativamente diferente entre
los virus SA14-14-2(PDK) y
CJ50003 que es muy baja en comparación con la del virus SA14
natural. Por lo tanto parece ser que la introducción en el sustrato
de la célula Vero no proporcionó un fenotipo neurovirulento a los
virus SA14-14-2(PDK) y
CJ50003 que todavía presenta carácter atenuado.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se preparó la semilla de producción en el pase 5
del virus en célula Vero [CJ50003 (Vero, PS5)] y se almacenó en un
ultracongelador. Se cultivaron células Vero en medio esencial mínimo
de Eagle (EMEM, Gibco) que contenían suero bovino fetal al 10%
(FBS, Gibco). Se infectaron cultivos en frascos cilíndricos de
monocapas de células Vero con virus de semilla de producción
sembrados a una m.o.i. de 0,01 a 0,1 pfu por célula. Después de 2
horas de adsorción del virus, los cultivos se lavaron 3 veces con
PBS y se alimentaron con EMEM que no contenía suero y se incubaron
a 35ºC. En los cultivos infectados de células Vero, el virus alcanzó
valoraciones de entre aproximadamente 10^{7} y 10^{8} pfu/ml a
los 2 ó 3 días después de la infección. Aunque se realizaron
recogidas de virus 4 veces a intervalos de 2 días hasta 8 ó 9 días
después de la infección a partir de 2 ó 3 días después de la
infección, los títulos del virus se mantuvieron superiores a
10^{7} pfu/ml con CPE muy débil. Pero después de 9 días de la
infección, los títulos fueron inferiores a 10^{7} pfu/ml (Figura
2). Las recogidas mezcladas se centrifugaron a 8.000 rpm durante 15
minutos y los sobrenadantes se filtraron a través de un filtro de
0,45 \mum. Los sobrenadantes del cultivo de virus se concentraron
por ultracentrifugación (Ultrasette, Filtron, 100 k) o
precipitación con PEG. El virus precipitado por PEG se recogió por
centrifugación y se puso en suspensión en tampón PBS o STE (Tris 10
mM pH 7,2, EDTA 1 mM, NaCl 150 mM). Lo retenido después de la
ultrafiltración se concentró hasta 250 ml y la casete se lavó con
100 ml de PBS. Se enfriaron los concentrados de virus en hielo
durante 2 horas añadiendo después 0,5 a 2 mg/ml de sulfato de
protamina y los sobrenadantes obtenidos centrifugando a 10.000 rpm
durante 5 minutos. Los virus concentrados se purificaron por
ultracentrifugación en gradientes de sacarosa. La
ultracentrifugación se realizó a 38.000 g durante 18 horas. Las
fracciones se sometieron a electroforesis en geles de poliacrilamida
que contenían el detergente dodecilsulfato sódico
(SDP-PAGE). Las bandas de la proteína de la
nucleocápside (C, 13.500 Da), de la proteína de la membrana (M,
8.700 Da) y de la proteína de la cápsula (E, 53.000 Da) se
observaron en la SDS-PAGE (Figura 3, panel A). Se
detectaron antígenos de la cápsula (E) por transferencia Western con
anticuerpo monoclonal del virus anti-JE de ratón
(Figura 3, panel C). Las fracciones positivas al virus, fracciones
nº 4 a nº 9, en las que otras bandas de proteínas excepto las
proteínas víricas no se pusieron de manifiesto en gel teñido con
plata (Figura 3, panel B) se mezclaron y se analizó la concentración
de proteína por el procedimiento Lowry. Se presentan los resultados
detallados de dos purificaciones de cultivos Vero infectados
concentrados con ultrafiltración en flujo tangencial o por
precipitación con PEG8000 (Tablas 3 y 4). Se diluyó el virus
purificado con dos volúmenes de PBS, se añadió al final 0,01% de
Tween 80 y se filtró a través de un filtro de 0,22 \mum.
\vskip1.000000\baselineskip
Se comparó la pureza relativa de las
preparaciones del virus utilizando medidas de actividad específica
(es decir, pfu/mg de proteína). El virus purificado del concentrado
por ultrafiltración presentaba aproximadamente la misma actividad
que el virus purificado del concentrado por precipitación con
PEG8000. Asimismo se estimó la pureza de los virus purificados
mezclados analizando el ADN cromosómico y la proteína originados por
células Vero. Los resultados demostraron que los contenidos del ADN
celular y de la proteína del hospedador son tan bajos como 2,5 pg y
2 ng por 5 \mug de virus de JE purificado respectivamente
independientemente del procedimiento de concentración, lo que
demostró que ambos procedimientos de purificación descritos
anteriormente eliminaron eficazmente otras impurezas del antígeno
vírico. Sin embargo desde el punto de vista del rendimiento de la
proteína del virus purificado, el procedimiento de purificación que
utiliza ultrafiltración es 2 veces mejor que el procedimiento de
purificación que conlleva la precipitación con PEG8000.
Ejemplo
4
El virus purificado se utilizó directamente para
la preparación de la vacuna atenuada por organismos vivos después
de la diálisis con PBS o se inactivó con formaldehído para la
preparación de la vacuna inactivada. La inactivación con
formaldehído al 0,018% se realizó a 22ºC o 4ºC. Se tomaron muestras
a intervalos regulares y se analizó directamente el virus
infeccioso por titulación en placa (Figura 4). Las muestras que eran
negativas por análisis directo en placa se sometieron a pase a
ciegas en monocapas de célula Vero para ampliar bajos niveles de
virus y a continuación se volvieron a colocar en placas. Se observó
que se requerían 4 días a 22ºC o 46 días a 4ºC para la inactivación
completa de la infectividad (Tablas 5 y 6). Se controló la
antigenicidad del virus durante la inactivación analizando las
muestras por el ensayo de transferencia de la mancha de antígeno y
antisueros policlonales. Mediante este ensayo no parecían existir
pérdidas detectables de antigenicidad después de la exposición a
formaldehído al 0,018% hasta 10 días a 22ºC o 15 días a 4ºC.
Se realizó la inactivación con formaldehído en
estas condiciones durante por lo menos 7 días a 22ºC o 60 días a
4ºC, dando un margen de seguridad. Después de la inactivación, el
formaldehído libre y las muestras se neutralizaron mediante la
adición de 0,038% de metabisulfito sódico. Se realizó la diálisis
simultáneamente con PBS y a continuación se filtró a través de un
filtro de 0,22 \mum.
Ejemplo
5
Se ensayaron a continuación las
inmunogenicidades de LAV y PIV en ratones con la vacuna inactivada
por Biken comercializada anteriormente. Grupos de 20 ratones BALB/c
de seis semanas se inmunizaron por vía intraperitoneal (i.p.) con
tres clases de inmunógeno. La inmunización se realizó con dos
inoculaciones sin adyuvante a intervalos de 2 semanas. Dos semanas
después de la segunda inmunización, se extrajeron sueros de cada
grupo de ratones, se mezclaron y posteriormente se analizó la
presencia de anticuerpos neutralizantes por el procedimiento PRNT
(Tabla 7). Como se muestra en la Tabla 7, no existía diferencia
significativa en el título del anticuerpo neutralizante entre los
grupos que recibieron tres clases de inmunógeno.
Se continuó analizando la inmunogenicidad de PIV
en ratones. Se inmunizaron ratones endogámicos adultos con varias
diluciones de virus inactivado con o sin un adyuvante de alúmina. Se
inmunizaron por vía subcutánea grupos de 20 ratones BALB/c de seis
semanas con 500, 50 y 5 ng de PIV en solución salina o solución
salina con hidróxido de aluminio (Rehydragel). Los ratones
recibieron dos inoculaciones espaciadas 3 semanas. Se mezclaron los
sueros de cada grupo de ratones 3 semanas después de la segunda
inmunización, y se analizó la presencia de anticuerpos
neutralizantes con cepa Nakayama atenuada con cerebro de ratón como
virus neutralizado (Tabla 8). El PIV fue mejor que la vacuna Biken
en todas las dosis y el adyuvante mejoró significativamente la
respuesta inmunitaria de los ratones a 50 y 500 ng de PIV
aproximadamente 4 y 8 veces, respectivamente.
Se determinó a continuación la eficacia
protectora in vivo de PIV en ratones BALB/c. Para los ensayos
de protección, se inocularon por vía subcutánea grupos de 10
ratones BALB/c de tres semanas en los cuartos traseros con virus de
JE inactivados en solución salina o en solución salina con hidróxido
de aluminio (Rehydragel). Se inocularon las referencias de igual
edad con PBS o antígenos no específicos en alúmina. Se administraron
dosis de refuerzo a los ratones con una dosis equivalente tres
semanas después. Se sometieron los ratones a la prueba de
provocación 3 semanas después de la inmunización mediante
inoculación intracraneal con 500 pfu del virus de JE neurovirulento
de ratón (Nakayama, adaptado a cerebro de ratón) contenido en 30
\mul de PBS. En los ratones sometidos a la prueba de provocación
se controló diariamente la morbilidad y la mortalidad hasta veintiún
días. Como se muestra en la Tabla 9, los ratones inmunizados con 50
ng de PIV presentaban el 90% de protección. Además, los ratones
inmunizados con 50 y 5 ng de PIV mezclado con alúmina presentaban el
100% y 70% de protección, respectivamente mientras que una dosis de
1/100 de vacuna Biken protegió solamente el 50% de los ratones
inmunizados. En comparación, todos los ratones del grupo de
referencia enfermaron y murieron empezando a los cinco a siete días
después de la prueba de provocación.
\vskip1.000000\baselineskip
Para investigar la estabilidad inmunológica del
virus CJ50003 sobre los pases de células Vero, los virus con varios
números de pases en células Vero se purificaron independientemente y
se evaluaron las inmunogenicidades por el procedimiento descrito en
la Tabla 8. Como se muestra en la Tabla 10, no hubo ninguna
diferencia notable en la capacidad para producir anticuerpos
neutralizantes entre las vacunas preparadas a partir de virus con
diferentes números de pase de virus en células Vero, lo que indica
que el virus CJ50003 es muy estable en los pases en células Vero
desde el punto de vista de la inmunogenicidad.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Los resultados presentados aquí sugieren que
tanto una vacuna de virus de JE inactivada como una vacuna atenuada
con organismos vivos que utiliza la cepa CJ50003 son prometedoras.
Se desarrollaron procedimientos relativamente rápidos y eficaces
para cultivar virus de JE en células Vero, concentrándolos y
purificándolos hasta un grado que puede ser adecuado para su
utilización humana e inactivándolos sin pérdida de antigenicidad
mensurable. Se observa que estas preparaciones son inmunógenas y
protectoras en ratones.
Claims (11)
1. Virus de la encefalitis japonesa atenuado
caracterizado porque el gen de la proteína E de dicho virus
comprende las mutaciones puntuales T19A, T177A, K243E y Q264H.
2. Virus de la encefalitis japonesa atenuado
según la reivindicación 1, en el que dichas mutaciones de la
proteína E son codificadas a nivel de polinucleótido por las
mutaciones puntuales A1032G, A1506G, A1704G y G1769T.
3. Virus de la encefalitis japonesa atenuado
según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho virus
presenta una multiplicidad de más de 1 x 10^{7} PFU/ml en células
Vero y LD_{50}/pfu para ratón adulto joven inferior a
0,000001.
4. Virus de la encefalitis japonesa atenuado
según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque dicho
virus es CJ50003, con el número de depósito
KCCM-10125.
5. Vacuna contra la encefalitis japonesa que
comprende el virus de la encefalitis japonesa atenuado según la
reivindicación 1.
6. Vacuna según la reivindicación 5,
caracterizada porque dicho virus está inactivado por un
agente inactivador.
7. Vacuna según la reivindicación 5,
caracterizada porque dicho virus es el virus de JE atenuado
vivo no tratado por un agente inactivador.
8. Vacuna según la reivindicación 5, 6 ó 7, que
comprende además los aditivos farmacéuticamente aceptables.
9. Vacuna según la reivindicación 5, que
comprende el virus de la encefalitis japonesa y el hidróxido de
aluminio como adyuvante.
10. Vacuna según la reivindicación 9,
caracterizada porque dicho virus de la encefalitis japonesa
es el virus CJ50003, con el número de depósito
KCCM-10125.
11. Procedimiento para la producción de un virus
de la encefalitis japonesa atenuado según la reivindicación 1,
comprendiendo el procedimiento la etapa de adaptación en la célula
Vero por pases en la célula Vero.
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|---|---|---|---|
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