KR101144993B1 - 돼지 일본뇌염 바이러스의 고농축 혈구응집용 항원 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돼지 일본뇌염 바이러스의 고농축 혈구응집용 항원 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 돼지 일본뇌염 바이러스의 고농축 혈구응집용 항원의 제조 방법은: 조직 배양 세포에 돼지 일본뇌염 바이러스를 접종하여 배양(Planting)하는 단계; 배양액의 세포변성효과(CPE)가 90% 정도가 되면 냉동하는 단계; 상기 냉동된 배양액을 해동한 후, 다시 냉동과 해동을 1회 반복하는 단계; 배양된 상기 돼지 일본뇌염 바이러스를 수확하는 단계; 상기 돼지 일본뇌염 바이러스를 불활화하는 단계; 상기 돼지 일본뇌염 바이러스의 불활화를 확인한 후, 상기 돼지 일본뇌염 바이러스를 농축하는 단계; 및 상기 농축된 돼지 일본뇌염 바이러스를 원심분리 후 침전시켜 상기 돼지 일본뇌염 바이러스의 혈구응집용 항원을 수득하는 단계;를 포함한다.

돼지 일본뇌염 바이러스, 조직배양, 고농축 혈구응집용 항원

Description

돼지 일본뇌염 바이러스의 고농축 혈구응집용 항원{ANTIGEN FOR HIGH CONCENTRATED HEMAGGLUTINATION OF PORCINE JAPANESE ENCEPHALITIS VIRUS}

본 발명은 본 발명은 돼지 일본뇌염 바이러스를 세포에서 증식시켜 농축한 항원을 이용하여 일본뇌염 항체를 검출할 수 있는 항원 및 이의 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 돼지 일본뇌염 바이러스를 조직배양세포에서 증식시키고 불활화하여, PEG 8,000 및 NaCl을 이용하여 돼지 일본뇌염 바이러스를 농축하고 보레이트 살린(borate saline)으로 처리하였을 때 기존의 생산한 항원보다 2배 이상의 혈구응집용 항원을 생산할 수 있는 돼지 일본뇌염 바이러스의 고농축 혈구응집용 항원 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

일본뇌염은 한국과 일본에서 작은 빨간 집모기(Culex tritaeniorhynchus)에 의해 매개되는 인수공통질병이다. 작은 빨간 집모기는 주로 논이나 작은 웅덩이에서 주로 서식한다. 성인에서 일본뇌염은 대부분 불현성 감염을 나타내지만 어린이나 노약자는 고열, 두통, 지각이상, 의식장애, 혼수 및 사망을 일으키며 회복기에는 언어장애 판단능력저하 등의 후유증이 나타난다.

일본뇌염 바이러스는 파충류, 왜가리와 같은 양생 조류뿐 만 아니라 돼지, 말, 닭에 감염증을 유발할 수 있다. 특히, 가축인 돼지는 일본뇌염 바이러스를 증폭하는 숙주로 알려져 있기 때문에 매년 모기발생이전에 예방접종을 실시하고 있다. 모기에 의해 일본뇌염 바이러스가 성돈과 비육돈에 감염되면 바이러스 혈증을 나타내지만 불현성 임상증상을 나타낸다. 하지만 임신한 돼지에 일본뇌염이 감염되면, 조산 미이라 태아 등 유사산 증상과 신경증상을 동반하는 허약자돈을 분만하는 번식장애질병을 유발한다. 웅돈에서는 생식기에 침입하여 정자 형성을 저해하며, 정자수의 감소, 기형정자의 증가로 수태율을 떨어뜨린다. 자연적으로 일본뇌염 바이러스에 감염된 말은 식욕결핍, 발열, 신경증상과 함께 폐사를 일으킨다.

가축에서 이러한 일본뇌염의 유행을 막고, 사람으로의 유입을 차단할 뿐만 아니라 유행을 예측하기 위하여, 우리나라에서는 1990년부터 돼지에 일본뇌염의 백신을 접종하고 있다. 그리고 2001년부터 전국에 걸쳐 매년 9,000여 두의 혈청을 이용하여 돼지 일본뇌염 바이러스에 대한 혈청검사를 실시하고 있다.

한편, 다른 혈구응집성 바이러스는 조직배양세포에서 증식시켰을 때 혈구응집능을 가지고 있으나, 돼지 일본뇌염 바이러스는 조직배양세포에 감염시키고 그 상층액은 혈구응집능을 가지고 있지 않다. 따라서, 종래의 돼지 일본뇌염 바이러스에 대한 고농축 혈구응집용 항원을 생산하는 방법은 다음과 같다.

우선, 국내에서 1990년 이후로 분리되고 있는 유전자형으로 genotype I의 돼지 일본뇌염 바이러스를 3-4일령 포유마우스의 뇌에 접종하고, 접종된 마우스가 신경마비 증상을 보이기 시작하여 죽기 직전에 마우스를 냉동한 후 8.5%의 sucrose 를 이용하여 뇌유제액을 만든다. 이 유제액을 냉아세톤에 첨가하면서 뇌조직의 지용성 물질을 제거한다. 지용성물질이 제거된 유제액은 아세톤액에서 침전되고, 침전물을 수확하기 위하여 1 시간 동안 4℃에 배양한 후 상층액을 버리고 진공펌프를 이용하여 침전된 유제액을 건조시킨다. 건조된 침전물을 최초 유제액의 1/10에 해당하는 생리식염수로 현탁하고, 10,000 rpm에서 10분 동안 원심한 후 그 상층액을 일본뇌염 바이러스 혈구응집용 항원으로 준비한다.

그러나, 종래 방법은 생산과정에서 생물학적 위험과 동물복지에 대한 논란이 있어, 종래 방법으로는 혈구응집용 항원을 생산하기가 어려워지고 있는 실정이다. 따라서, 3-4일령 포유마우스를 사용하지 않고, 실험실내에서 손쉽게 돼지 일본뇌염 바이러스 혈구응집용 항원을 생산할 수 있는 방법에 대한 요구가 대두되고 있다.

상술한 문제점을 해결하기 위해, 본 발명에서는 돼지 일본뇌염 바이러스를 세포에서 증식시켜 농축한 항원을 이용하여 일본뇌염 항체를 검출할 수 있는 항원 및 이의 제조 방법을 제공하기 위한 것으로서, 보다 상세하게는 돼지 일본뇌염 바이러스를 조직배양세포에서 증식시키고 불활화하여, PEG 8,000 및 NaCl을 이용하여 돼지 일본뇌염 바이러스를 농축하고 보레이트 살린(borate saline)으로 처리하였을 때 기존의 생산한 항원보다 2배 이상의 혈구응집용 항원을 생산할 수 있는 돼지 일본뇌염 바이러스의 고농축 혈구응집용 항원 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상술한 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 돼지 일본뇌염 바이러스의 고농축 혈구응집용 항원의 제조 방법은: 조직 배양 세포에 돼지 일본뇌염 바이러스를 접종하여 배양(Planting)하는 단계; 배양액의 세포변성효과(CPE)가 90% 정도가 되면 냉동하는 단계; 상기 냉동된 배양액을 해동한 후, 다시 냉동과 해동을 1회 반복하는 단계; 배양된 상기 돼지 일본뇌염 바이러스를 수확하는 단계; 상기 돼지 일본뇌염 바이러스를 불활화하는 단계; 상기 돼지 일본뇌염 바이러스의 불활화를 확인한 후, 상기 돼지 일본뇌염 바이러스를 농축하는 단계; 및 상기 농축된 돼지 일본뇌염 바이러스를 원심분리 후 침전시켜 상기 돼지 일본뇌염 바이러스의 혈구응집용 항원을 수득하는 단계;를 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 돼지 일본뇌염 바이러스는 돼지 일본뇌염 바이러스 KV1899 strain인 것이 바람직하다.

또한, 상기 조직 배양 세포는 베로 세포(Vero Cell)인 것이 바람직하다.

또한, 상기 단계 e)는 BEI(Binary Ethylenimine)를 이용하여 불활화하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 단계 f)는 NaCl 및 PEG 8,000을 이용하여 농축하는 것이 바람직하다.

또한, 적혈구를 이용하여 상기 돼지 일본뇌염 바이러스의 고농축 혈구응집용 항원의 혈구응집반응을 실시하여 혈구응집능을 검사하는 단계를 더 포함하는 것이 바람직하다.

한편, 본 발명에 따른 돼지 일본뇌염 바이러스의 고농축 혈구응집용 항원은 상기 제조 방법 중 하나에 따른 방법으로 제조된 돼지 일본뇌염 바이러스의 고농축 혈구응집용 항원인 것이 바람직하다.

한편, 본 발명에 따른 돼지 일본뇌염 바이러스의 고농축 혈구응집용 항원은 조직 배양 세포에서 배양된 돼지 일본뇌염 바이러스를 불활화하고 농축시킨 후 혈구응집반응을 실시하여 혈구응집능을 갖는 항원만으로 선별된 것이 바람직하다.

또한, 상기 돼지 일본뇌염 바이러스는 돼지 일본뇌염 바이러스 KV1899 strain인 것이 바람직하다.

또한, 상기 조직 배양 세포는 베로 세포(Vero Cell)인 것이 바람직하다.

또한, 상기 불활화는 BEI(Binary Ethylenimine)를 이용하는 것이 바람직하 다.

또한, 상기 농축은 NaCl 및 PEG 8,000을 이용하는 것이 바람직하다.

또한, 적혈구 50 ㎕ 당 512 배 이상의 혈구응집능을 갖는 항원만으로 선별된 돼지 일본뇌염 바이러스의 고농축 혈구응집용 항원인 것이 바람직하다.

본 발명에 따르면, 돼지 일본뇌염 바이러스를 조직배양세포에서 증식시키고 불활화하여, PEG 8,000 및 NaCl을 이용하여 돼지 일본뇌염 바이러스를 농축하고 보레이트 살린(borate saline)으로 처리하였을 때 기존의 생산한 항원보다 2배 이상의 고농축 혈구응집용 항원을 생산할 수 있는 돼지 일본뇌염 바이러스의 고농축 혈구응집용 항원 및 이의 제조방법을 제공할 수 있다.

따라서, 돼지 일본뇌염 항체를 측정하기 위하여 살아있는 3-4일령 포유마우스를 이용하여 혈구응집용 항원을 생산할 때 발생하는 생물학적 위험과 아세톤의 추출에 따른 오염을 줄일 수 있다.

또한, 세포에서 증식한 것을 직접적으로 혈구응집용 항원으로 사용하였을 때 혈구응집이 되지 않지만 본 발명을 통하여 배양세포액의 농축액을 처리함으로써, 혈구응집능을 보유하게 한다.

또한, 본 발명에 따른 돼지 일본뇌염 바이러스 혈구응집용 항원은 BEI로 불활화된 것이므로, 불활화되지 않았을 때 예상되는 실험자 및/또는 공중보건학상 위험을 제거할 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면, 조직배양세포를 이용한 일본뇌염 바이러스 혈구응 집억제용 항원 생산은 실험실 내에서 불활화하여 농축한 항원을 생산하고, 항원함량이 높기 때문에, 기존의 생산방법을 개량할 뿐만 아니라, 생물학적 위험과 환경오염을 줄일 수 있다.

본 발명에 따른 돼지 일본뇌염 바이러스의 고농축 혈구응집용 항원 및 이의 제조 방법은 상기 목적에 대한 기술적 구성을 비롯한 작용효과에 관한 사항은 본 발명의 바람직한 실시예가 도시된 아래의 도면을 참조한 상세한 설명에 의해서 명확하게 이해될 것이다.

이하, 도면을 참조하여 본 발명을 상세히 설명하도록 한다.

본 발명에서는 세포배양에서 돼지 일본뇌염 바이러스를 증식시키고 증식된 바이러스를 BEI로 불활화한 후 PEG 8,000 및 NaCl을 이용하여 바이러스를 농축한 후 돼지 일본뇌염 바이러스에 대한 항체를 검사하기 위한 혈구응집용 항원을 생산할 수 있도록 고안되었으며, 3-4일령 포유마우스를 사용하지 않고, 실험실내에서 손쉽게 돼지 일본뇌염 바이러스 혈구응집용 항원을 생산할 수 있도록 하였다.

본 발멸의 돼지 일본뇌염 바이러스의 고농축 혈구응집용 항원 및 이의 제조방법은 아래와 같다.

주화세포에서 계대한 돼지 일본뇌염 바이러스를 롤러 버틀(roller bottle)에 베로 세포(Vero cell)에 배양(planting)한다. 본 발명의 일 실시예로서 사용되 는 돼지 일본뇌염 바이러스는 KV1899 strain 이다.

도 1은 본 발명에 따른 돼지 일본뇌염 바이러스 입자의 전자현미경 사진이다. 특히, 도 1의 A 부분은 베로 세포(Vero Cell)에 감염된 돼지 일본뇌염 바이러스(KV1899 strain)의 입자이다.

한편, 발명의 일 실시예에 따른 일본뇌염 바이러스 KV1899 strain의 prME 유전자 염기서열은 도 3에 도시한다.

0.1 M.O.I 가 되도록 돼지 일본뇌염 바이러스(KV1899 바이러스)를 베로 세포에 접종한다. 접종 후 1 시간 동안 감작하고, 상층액을 버리고 PBS로 3회 세척한다.

그리고 5% FBS가 함유된 MEM 배지를 첨가한다.

접종 후, 3-5일 후 세포변성효과(CPE)가 90% 정도 되었을 때 롤러 버틀을 -70℃ 냉동고에 넣어 얼린다. 롤러 버틀을 2회 냉동/해동(freezing/thawing) 과정을 반복하여 돼지 일본뇌염 바이러스를 수확하고, 6,000 rpm에서 30분간 원심분리한다.

이후, 돼지 일본뇌염 바이러스를 불활화한다. 돼지 일본뇌염항체를 검사하기 위한 항원은 반드시 불활화되어야 한다. 일반적으로, 바이러스를 불활화하는 방법으로 널리 사용되는 용액은 포르말린(formalin)이다. 그러나, 돼지 일본뇌염 바이러스를 0.3% 포르말린을 이용하여 불활화하면 혈구응집능을 나타내지 않는다. 따라서, 본 발명에서는 포르말린 대신에 돼지 일본뇌염 바이러스의 혈구응집능에 영향을 주지 않는 BEI(Binary Ethylenimine)를 사용한다.

그러므로, 조직배양세포를 이용한 돼지 일본뇌염 바이러스 혈구응집억제용 항원 생산은 실험실 내에서 돼지 일본뇌염 바이러스를 불활화하여 농축한 항원을 생산하고, 항원함량이 높기 때문에, 종래 제조방법을 개량할 뿐만 아니라, 생물학적 위험과 환경오염을 줄일 수 있다.

본 발명에 따른 돼지 일본뇌염 바이러스의 불활화를 위하여, 0.1M BEI 용액을 제조한다. 37℃로 가열한 0.2N NaOH 100 ml 용액에 BEA(2-bromoethylamine hydrobromide)를 20.49 g 넣고 용해한 것을 0.1M BEI로 한다. 이 0.1M BEI용액을 돼지 일본뇌염 바이러스에 0.001M이 되도록(100배) 첨가한다.

37℃에서 18시간 동안 배양한 후 티오황산나트륨(sodium thiosulfate)을 2mM이 되도록 하여 남아있는 BEI를 중화시킨다.

한편, 베로 세포를 이용하여 돼지 일본뇌염 바이러스의 불활화를 확인한 후, 돼지 일본뇌염 바이러스를 농축 시킨다. 돼지 일본뇌염 바이러스를 농축하기 위하여 상층액 100 ml 당 NaCl 및 PEG 8,000을 넣고 완전히 녹인 후, 4℃에 하룻밤 동안 둔다(overnight).

이후, 돼지 일본뇌염 바이러스를 침전시키기 위하여, 6,000 rpm에서 30분간 원심분리 한다. 원심분리 후, 상층액을 주의하면서 버리고, 벽에 붙어있는 침전물을, 농축하기 전 바이러스양의 1/100에 해당하는 4% 보레이트 살린(borate saline)- pH 8.7- 용액으로 다시 현탁 한다.

이후, 이 농축항원을 거위의 적혈구를 이용하여 혈구응집반응을 실시한다. 이때, 50 ㎕당 512배 이상의 혈구응집능을 보이는 항원만을 선별한다. 이는 종래의 방법으로 생산한 항원보다 2배 이상의 혈구응집능을 갖는 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 돼지 일본뇌염 바이러스 항원의 혈구응집능과 종래의 마우스유제액 돼지 일본뇌염 바이러스 항원의 혈구응집능을 비교한 사진이다. 도 2의 A는 본 발명에 따른 돼지 일본뇌염 바이러스 항원의 혈구응집능이 2,048배임을 나타내고 있고, B는 종래의 마우스유제액 돼지 일본뇌염 바이러스 항원의 혈구응집능이 256배임을 나타낸다.

이상에서 상술한 바와 같이 본 발명은 돼지일본뇌염 항체를 측정하기 위하여 살아있는 3-4일령 포유마우스를 이용하여 혈구응집용 항원을 생산할 때 발생하는 생물학적 위험과 acetone의 추출에 따른 오염을 줄이는 방법이다. 또한 세포에서 증식한 것을 직접적으로 혈구응집용 항원으로 사용하였을 때 혈구응집이 되지 않지만 본 발명을 통하여 배양세포액의 농축액을 처리함으로써, 혈구응집능을 보유하게 한다.

또한 돼지 일본뇌염 바이러스항원이 불활화되지 않고 사용되었을 때는 실험자는 물론 공중보건학상 위험이 초래될 수 있으나, 본 발명에 따른 돼지 일본뇌염 바이러스는 BEI로 불활화된다. 따라서 세포를 이용한 일본뇌염 바이러스 혈구응집억제용 항원 생산은 실험실 내에서 불활화하여 농축한 항원을 생산하고, 항원함량이 높기 때문에, 기존의 생산방법을 개량할 뿐만 아니라, 생물학적 위험과 환경오염을 줄일 수 있다.

이상에서 설명한 본 발명의 바람직한 실시예들은 예시의 목적을 위해 개시된 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능할 것이나, 이러한 치환, 변경 등은 이하의 특허청구범위에 속하는 것으로 보아야 할 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 돼지 일본뇌염 바이러스 입자의 전자현미경 사진.

도 2는 본 발명에 따른 돼지 일본뇌염 바이러스 항원의 혈구응집능과 종래의 마우스유제액 돼지 일본뇌염 바이러스 항원의 혈구응집능을 비교한 사진.

도 3a 내지 도 3c는 본 발명의 일실시예에 따른 일본뇌염 바이러스 KV1899 strain의 prME 유전자 염기서열.

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8. 조직 배양 세포에서 배양된 돼지 일본뇌염 바이러스를 불활화하고 농축시킨 후 혈구응집반응을 실시하여 적혈구 50 ㎕ 당 512 배 이상의 혈구응집능을 갖는 항원만으로 선별된 돼지 일본뇌염 바이러스의 고농축 혈구응집용 항원.
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