JP7443233B2 - ジカウイルスを不活性化する方法及び関連する方法 - Google Patents

ジカウイルスを不活性化する方法及び関連する方法 Download PDF

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Description

連邦政府支援の研究に関する声明
本発明は、保健福祉省、事前準備対応次官補局、生物医学先進研究開発局と共に契約番号第ＨＨＳＯ１００２０１６０００１５Ｃ号のもとで政府の支援で行われた。本発明は、保健福祉省の疾病管理予防センターとの共同研究開発契約の履行において考案された。アメリカ合衆国の政府は、本発明において一定の権利を有する。
本開示は、ワクチン及び免疫原性組成物において使用され得るジカウイルスを不活性化するための方法に関する。本開示はまた、アルボウイルス調製物の不活性化の完全性を決定する方法、及び不活性化されたウイルスを含む薬学的組成物中の残留ホルムアルデヒド含有量を決定する方法に関する。
フラビウイルス科に属する他の蚊媒介性ウイルス（例えば、黄熱病、デング熱、ウエストナイル、及び日本脳炎ウイルス）と共にフラビウイルスとして分類されるジカウイルスは、２０１３年にブラジルにおいてそのウイルスが導入されて以来、流行性で半球の広範囲において、急速に蔓延している。ウイルスは、米国の領域を含む中央及び北アメリカに達しており、その結果として、今や米国大陸を脅かしている。実際に、ジカウイルス株ＰＲＶＡＢＣ５９は、２０１５年にプエルトリコに旅行していた人の血清から分離された。この株のゲノムは、少なくとも３回、配列決定されている（Ｌａｎｃｉｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２０１６ Ｍａｙ；２２（５）：９３３－５、及びＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＵ５０１２１５．１；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＸ０８７１０１．３、ならびにＹｕｎ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎｎｏｕｎｃ．２０１６ Ａｕｇ １８；４（４）、及びＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＮＫ５７８９７．１を参照されたい）。
１９４７年にウガンダで最初に単離されたウイルスは、１９５２年に最初にヒト疾患と関連付けられ、アフリカ及び東南アジアにおいて軽度の自己限定的な熱性疾患の原因として散発的に認識されている（Ｗｅａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．１３０：６９－８０；Ｆａｒｉａ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ．３５２（６２８３）：３４５－３４９）。しかしながら、２００７年には、北太平洋のヤップ島で大流行が発生し、その後、太平洋を越えて島から島へと蔓延し、２０１３年～２０１４年にフランス領ポリネシアで広範な大流行を引き起こし、その後ニューカレドニア、クック諸島、及び最終的にはイースター島に蔓延した。その後、アジア血統ウイルスは、未確定のままの経路によって西半球に移行した（Ｆａｒｉａ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ．３５２（６２８３）：３４５－３４９）。ウイルスは、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ、Ａ． ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓによって、ならびに、Ａ． ｈｅｎｓｉｌｌｉ、及びＡ． ｐｏｌｙｎｉｅｓｅｉｎｓｉｓによって人畜共通に伝染し得る（Ｗｅａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．１３０：６９－８０）。さらに、ウイルスを伝染させる他のベクターが存在し得、ウイルスは、輸血、経胎盤的、及び／または性的伝染により、伝染し得ると考えられる。
２０１５年後半に、ジカウイルスが広範囲に感染している地域において胎児の異常（例えば、小頭症）及びギランバレー症候群（ＧＢＳ）の大幅な増加により、ジカウイルスが当初考えられていたよりもはるかに毒性が強いと警告し、国際的に懸念される公衆衛生上の緊急事態（ＰＨＥＩＣ）として世界保健機関（ＷＨＯ）が促した（Ｈｅｙｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｌａｎｃｅｔ ３８７（１００２０）：７１９－２１）。ジカウイルスは、実質的な公衆衛生上の提起となるが、現在、ＦＤＡ承認のワクチン、または療法は存在せず、ジカウイルスを制御する唯一の予防策は、蚊の個体群の管理である。
潜在的なワクチンの開発のための組換えジカウイルスを特徴付ける最近の取り組みでは、３３０位にウイルスエンベロープタンパク質の変異を抱える非ヒト細胞適応ジカウイルスが特定された（Ｗｅｇｅｒ－Ｌｕｃａｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１７．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）。この研究の著者は、ジカウイルス株ＰＲＶＡＢＣ５９の完全長の感染性ｃＤＮＡクローンが、クローニング中に増幅されると遺伝的に不安定であり、２つのプラスミド系を開発及び適用して、観察された不安定性に対処するためにウイルスゲノムを分割する選択を見出した。しかしながら、ジカワクチンの開発のための２つのプラスミド系は、あまり望ましくない。
発明の概要
したがって、遺伝的に安定したジカウイルスを利用するジカウイルス感染を治療及び／または予防するためのワクチン、ならびに免疫原性組成物を開発する必要がある。ワクチンの開発のための１つの選択肢は、ウイルス全体を不活性化し、この不活性化されたウイルス全体を対象のワクチン接種に使用することである。しかしながら、不活性化されたウイルスワクチンの開発中、主要な安全性保証は、感染性ウイルスが、製剤または原薬内に残存しないことを確実にすることである。感染性ビリオンの残存の可能性を測定及び決定するための効果的な不活性化プロセスならびに高感度分析を開発することは、野生型ウイルスに由来する精製され不活性化されたウイルスの開発にとって重要な安全面であるが、胎児の異常を引き起こす可能性のある病原性／脳炎ウイルスを確実に伴う。さらに、ウイルスを不活性化するために使用され得るホルムアルデヒドは、遺伝毒性及び発がん性であることが知られており、そのため、原薬及び製剤中のホルムアルデヒドの残留レベルをモニタリングすることが重要であり、規制当局は、製剤中の残留ホルムアルデヒド含有量を特定するために、不活性化剤としてホルムアルデヒドを使用する製造業者に要求する。したがって、不活性化されたジカウイルスなどの不活性化されたウイルスを含む製剤、または薬学的組成物中の残留ホルムアルデヒドを検出するための高感度な方法が必要とされる。
本開示は、少なくとも部分的に、室温で比較的短時間でウイルスに適用される低濃度のホルムアルデヒドを用いてジカウイルスを効率的に不活性化できるという驚くべき発見に基づく。さらに、感染性ビリオンが、不活性化後に依然として存在するかを高感度で決定できるアッセイを開発した。最後に、最終的な製剤または薬学的組成物中の低レベルの残留ホルムアルデヒドを検出できる方法を開発した。
したがって、本開示の特定の態様は、ジカウイルス調製物を不活性化する方法であって、
（ａ）試験管内で培養された１つ以上の細胞からジカウイルス調製物を単離することであって、細胞が、ジカウイルス調製物を生成するために使用され、ジカウイルス調製物を単離することが、
（ｉ）深層ろ過、
（ｉｉ）バッファー交換及び／または希釈、
（ｉｉｉ）イオン交換クロマトグラフィーから選択される１つ以上のステップを含む、単離することと、
（ｂ）ジカウイルス調製物をホルムアルデヒドで処理することであって、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度と、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果が、０．０２５～０．５である、処理することとを含む、方法に関する。
いくつかの実施形態において、細胞は、非ヒト細胞またはベロ細胞である。
いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、ジカウイルスの異種集団を含む種菌から得られる。
いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、臨床単離株から得られる。
いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、ジカウイルスクローン単離株から得られる。ジカウイルスクローン単離株は、プラーク精製により得られ得る。プラーク精製の前に、複数の細胞は、ジカウイルスの異種集団を含む種菌を接種され得る。
本開示のいくつかの態様は、ジカウイルス調製物を不活性化する方法であって、
（ａ）臨床単離株からジカウイルス調製物を得ることと、
（ｂ）ジカウイルス調製物をホルムアルデヒドで処理することであって、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度と、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果が、０．０２５～０．５である、処理することとを含む、方法に関する。
本開示のいくつかの態様は、ジカウイルス調製物を不活性化する方法であって、
（ａ）ジカウイルスの異種集団を含む種菌からジカウイルス調製物を得ることと、
（ｂ）ジカウイルス調製物をホルムアルデヒドで処理することであって、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度と、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果が、０．０２５～０．５である、処理することとを含む、方法に関する。
いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、０．００５％（ｗ／ｖ）～０．０２％（ｗ／ｖ）の濃度のホルムアルデヒドで処理される。
いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、８～１２日間または１０日間処理される。
いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、１５℃～３０℃または２２℃の温度で処理される。
いくつかの実施形態において、方法は、不活性化の完全性を決定するステップ（ｃ）をさらに含む。
いくつかの実施形態において、ステップ（ｃ）は、
（ｉ）培養された昆虫細胞に、ステップ（ｂ）に従って処理されたジカウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第１の期間でインキュベートし、それにより昆虫細胞上清を生成することと、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された昆虫細胞上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートすることと、
（ｉｉｉ）ジカウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定することとを含む。
いくつかの実施形態において、昆虫細胞は、ＣＣＬ－１２５細胞、Ａａｇ－２細胞、ＲＭＬ－１２細胞、Ｃ６／３６細胞、Ｃ７－１０細胞、ＡＰ－６１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ－１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ－２細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ－３細胞、ＵＭ－ＡＶＥ１細胞、Ｍｏｓ．５５細胞、Ｓｕａ１Ｂ細胞、４ａ－３Ｂ細胞、Ｍｏｓ．４２細胞、ＭＳＱ４３細胞、ＬＳＢ－ＡＡ６９５ＢＢ細胞、ＮＩＩＤ－ＣＴＲ細胞、及びＴＲＡ－１７１細胞、例えば、Ｃ６／３６細胞から選択される。
いくつかの実施形態において、第１の期間は、３～７日である。
いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、ベロ細胞、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４ ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）細胞、ＭＤＣＫ ３３０１６（ＷＯ９７／３７００１に記載される寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９）細胞、ＢＨＫ２１－Ｆ細胞、ＨＫＣＣ細胞、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、例えば、ベロ細胞から選択される。
いくつかの実施形態において、第２の期間は、３～１４日である。
方法は、ホルムアルデヒド処理されたジカウイルス調製物を、メタ重亜硫酸ナトリウムで中和するステップ（ｄ）をさらに含み得、例えば、ホルムアルデヒド処理されたジカウイルス調製物を、ホルムアルデヒド処理の少なくとも５、少なくとも７、少なくとも９、少なくとも１１、または少なくとも１４日後に中和する。
いくつかの実施形態において、方法は、不活性化されたジカウイルス調製物を含む薬学的組成物を調製するステップ（ｅ）をさらに含む。
いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、アジュバントと混合される。アジュバントは、アルミニウム塩、トル様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）、合成リピドＡ、リピドＡ模倣体または類似体、ＭＬＡ誘導体、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、乳剤、ビロソーム、コクリエート物、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマー粒子、微粒子、リポソーム、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、アジュバントは、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、またはＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ ８５などのアルミニウム塩である。
いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物中の１つ以上の抗原の少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％は、アジュバントに吸着される。
いくつかの実施形態において、ジカウイルスは、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置に変異を含み、例えば、配列番号１のＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異などである。
いくつかの実施形態において、ジカウイルスは、エンベロープタンパク質（Ｅ）に変異を含まない。いくつかの実施形態において、エンベロープタンパク質をコードする配列は、配列番号２の対応する配列と同じである。
本開示のいくつかの態様はまた、本明細書に記載される方法のいずれかによって得ることができる不活性化されたジカウイルスを含む薬学的組成物に関する。
本開示のいくつかの態様はまた、不活性化されたジカウイルスを含み、かつ５０μｇ／ｍｌ未満の残留ホルムアルデヒド含有量を有する、薬学的組成物に関する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法により得られる。
本開示のいくつかの態様はまた、アルボウイルス調製物の不活性化の完全性を決定するための方法であって、
（ｉ）培養された昆虫細胞に、不活性化ステップに供されたアルボウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を最第１の期間でインキュベートし、それにより昆虫細胞上清を生成するステップと、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された昆虫細胞上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートするステップと、
（ｉｉｉ）アルボウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定するステップと、を含む、方法に関する。
いくつかの実施形態において、アルボウイルスは、フラビウイルスまたはアルファウイルスである。いくつかの実施形態において、アルボウイルスは、ジカウイルス、ウエストナイルウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、デング熱ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、チクングニアウイルス、オニョンニョンウイルス、またはマヤロウイルスである。
いくつかの実施形態において、アルボウイルス調製物は、界面活性剤、ホルマリン、過酸化水素、ベータ－プロピオラクトン（ＢＰＬ）、二成分エチルアミン（ＢＥＩ）、アセチルエチレンイミン、メチレンブルー、またはソラレンを用いた処理に供された。
いくつかの実施形態において、昆虫細胞は、ＣＣＬ－１２５細胞、Ａａｇ－２細胞、ＲＭＬ－１２細胞、Ｃ６／３６細胞、Ｃ７－１０細胞、ＡＰ－６１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ－１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ－２細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ－３細胞、ＵＭ－ＡＶＥ１細胞、Ｍｏｓ．５５細胞、Ｓｕａ１Ｂ細胞、４ａ－３Ｂ細胞、Ｍｏｓ．４２細胞、ＭＳＱ４３細胞、ＬＳＢ－ＡＡ６９５ＢＢ細胞、ＮＩＩＤ－ＣＴＲ細胞、及びＴＲＡ－１７１細胞、例えば、Ｃ６／３６細胞から選択される。
いくつかの実施形態において、第１の期間は、３～７日である。
いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、ベロ細胞、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４ ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）細胞、ＭＤＣＫ ３３０１６（ＷＯ９７／３７００１に記載される寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９）細胞、ＢＨＫ２１－Ｆ細胞、ＨＫＣＣ細胞、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、例えば、ベロ細胞から選択される。
いくつかの実施形態において、第２の期間は、３～１４日である。
いくつかの実施形態において、方法は、アルボウイルスの１．０ ＴＣＩＤ５０未満を検出することが可能である。
本開示のいくつかの態様はまた、不活性化されたウイルスを含む薬学的組成物中の残留ホルムアルデヒド含有量を決定する方法であって、
（ａ）ホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む組成物を提供するステップと、
（ｂ）（ａ）の組成物を、リン酸及び２，４－ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）と混合し、それにより混合物を提供するステップと、
（ｃ）（ｂ）の混合物を、好適な条件下でインキュベートするステップと、
（ｄ）残留ホルムアルデヒドの存在について前記混合物を分析するステップと、を含む、方法に関する。
いくつかの実施形態において、（ａ）の組成物は、アジュバントを含み、水酸化アルミニウムであり得る。いくつかの実施形態において、（ａ）の組成物は、０．１ｍｇ／ｍｌ～１．０ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムをアジュバントとして含む。
いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）は、５０部の（ａ）の組成物を、１部の１５～２５％（ｖ／ｖ）リン酸、及び２．５部の０．９～１．１ｍｇ／ｍｌのＤＮＰＨと混合することを含む。
いくつかの実施形態において、（ａ）の組成物と、リン酸及び２，４－ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）との混合物は、室温でインキュベートされる。いくつかの実施形態において、（ａ）の組成物と、リン酸及び２，４－ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）との混合物は、１０～３０分間でインキュベートされる。
いくつかの実施形態において、（ａ）の組成物と、リン酸及び２，４－ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）との混合物は、ＨＰＬＣによって分析され、逆相ＨＰＬＣであり得る。いくつかの実施形態において、水及びアセトニトリルの混合物（１：１、ｖ／ｖ）は、ＨＰＬＣにおける移動相として使用される。
いくつかの実施形態において、ウイルスは、不活性化されたジカウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、不活性化されたジカウイルスである。いくつかの実施形態において、不活性化されたジカウイルスは、０．０１％（ｗ／ｖ）ホルムアルデヒドで、２２℃で１０日間処理されている。いくつかの実施形態において、ジカウイルスは、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置に変異を含み、例えば、配列番号１のＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異などである。
模擬感染（上部）またはＺＩＫＡＶ株ＰＲＶＡＢＣ５９に感染（下部）したベロ細胞単層の明視野顕微鏡画像を示す。 ＴＣＩＤ５０で測定したベロ細胞単層上でのＺＩＫＡＶ ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ１の増殖動態を示す。 ジカウイルスＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ５クローンａ～ｆを試験した効力アッセイ（ＴＣＩＤ５０）を示す。 ベロ細胞単層上のジカウイルスＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ６クローンａ～ｆの増殖の細胞変性効果（ＣＰＥ）を示す明視野顕微鏡画像を示す。 ジカウイルスＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ６クローンａ～ｆを試験した効力アッセイ（ＴＣＩＤ５０）を示す。 ジカウイルス株ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ６ｅ（配列番号８）及びＰＲＶＡＢＣ５９（配列番号９）からの残基３３０付近のジカウイルスのエンベロープ糖タンパク質配列を、いくつかの他のフラビウイルスと比較するアミノ酸配列アライメントを示す（ＷＮＶ（配列番号：１０）；ＪＥＶ（配列番号：１１）；ＳＬＥＶ（配列番号：１２）；ＹＦＶ（配列番号：１３）；ＤＥＮＶ １ １６００７（配列番号：１４）；ＤＥＮＶ ２ １６６８１（配列番号：１５）；ＤＥＮＶ ３ １６５６２（配列番号：１６）；及びＤＥＮＶ ４ １０３６（配列番号：１７））。 ジカウイルス株ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ６ｅ（配列番号１８）及びＰＲＶＡＢＣ５９（配列番号１９）からの残基９８付近のジカウイルスのＮＳ１タンパク質配列を、いくつかの他のフラビウイルスと比較するアミノ酸配列アライメントを示す（ＷＮＶ（配列番号：２０）；ＪＥＶ（配列番号：２１）；ＳＬＥＶ（配列番号：２２）；ＹＦＶ（配列番号：２３）；ＤＥＮＶ １ １６００７（配列番号：２４）；ＤＥＮＶ ２ １６６８１（配列番号：２５）；ＤＥＮＶ ３ １６５６２（配列番号：２６）；及びＤＥＮＶ ４ １０３６（配列番号：２７））。 ＺＩＫＡＶ ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ１ウイルスと比較した、ＺＩＫＡＶ ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ６ウイルスクローンａ～ｆのプラーク表現型を示す。 ＺＩＫＡＶ ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ１ウイルスと比較した、ＺＩＫＡＶ ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ６ウイルスクローンのプラークサイズの平均値を示す。 無血清増殖条件下のベロ細胞におけるＺＩＫＡＶ ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ６クローンａ～ｆの増殖動態を示す。 免疫実験のためにＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ６ｂ及びＰ６ｅの製剤化した薬剤を調製するために実行した手順の概略を示す。 ＺＩＫＡＶ ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ６ｂ及びＰ６ｅクローンに由来するワクチン製剤を用いたＣＤ－１マウスの投薬スケジュールを示す。ＰＢＳをプラセボとして使用した。 ＺＩＫＡＶ ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ６ｂ及びＰ６ｅクローンに由来するワクチン製剤を使用する図１２Ａに記載されるように、免疫したＣＤ－１マウスの血清ＺＩＫＡＶ中和抗体力価を示す。ＺＩＫＡＶ中和抗体力価は、レポーターウイルス粒子（ＲＶＰ）中和アッセイによって決定した。実線は、群の幾何平均を表す。検出限界（１．９３ ｌｏｇ１０）は、破線で表す。 ＺＩＫＡＶ ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ６ｂ及びＰ６ｅクローンに由来するワクチン製剤を用いたＡＧ１２９マウスの投薬スケジュールを示す。ＰＢＳをプラセボとして使用した。 ＺＩＫＡＶ ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ６ｂ及びＰ６ｅクローンに由来するワクチン製剤を使用する図１３Ａに記載されるように、免疫したＡＧ１２９マウスの血清ＺＩＫＡＶ中和抗体力価を示す。実線は、群の幾何平均を表す。検出限界（１．３０ ｌｏｇ１０）は、破線で表す。検出可能な力価を有しない動物（＜１．３０）は、０．５の力価を割り当てた。 負荷後のＡＧ１２９試験群の体重の平均値示し、開始時の体重の割合として表す。エラーバーは、標準偏差を表す。 負荷後２日目の個々のＡＧ１２９マウスの血清ウイルス血症を示し、ＰＦＵ／ｍＬとして報告した。実線は、群の平均値を表す。検出限界（２．０ ｌｏｇ１０）は、破線で表す。 負荷後のＡＧ１２９試験群の生存分析を示す。 ワクチン接種及び負荷したＡＧ１２９マウスからのプールされた血清の受動的移入後の、負荷前の血清循環ＺＩＫＡＶ中和抗体（Ｎａｂ）力価を示す。 ジカウイルス用いて負荷した受動移入及び対照マウスの体重の平均値を示す。 負荷後３日目の個々のＡＧ１２９マウスの血清ウイルス血症を示し、ＰＦＵ／ｍＬとして報告した。 ジカウイルスを用いて負荷した受動移入マウス及び対照マウスの生存分析を示す。 受動移入マウスで観察されたＺＩＫＡＶ中和抗体力価及びウイルス血症との間の相関を示す。 カプランマイヤー生存曲線を使用して、Ｐ６ａ及びＰ６ｅのジカウイルスｐｒｅＭＶＳストックに感染した後のＡＧ１２９マウスの生存分析を示す。 Ｐ６ａ及びＰ６ｅのジカウイルスプレＭＶＳストックを用いた感染後の発明の開始時の体重の割合で表される体重の平均値を示す。破線は、参照のために開始時の体重の１００％を表す。 ジカウイルスを用いた負荷後３日目の個々のＡＧ１２９マウスの血清ウイルス血症を示し、ＰＦＵ／ｍＬとして報告されるＰ６ａ及びＰ６ｅのｐｒｅＭＶＳストックを示す。破線は、アッセイの検出限界を表す。 不活性化データの収集された動態を示す。データは、４つの毒性学ロットからの試料について感染力（ＴＣＩＤ５０）と、ＲＮＡコピー、及び不活性化の完全性（ＣＯＩ）とを比較する。これらのデータは、ＣＯＩアッセイの感度が、ＴＣＩＤ５０より大きいことを示す。 ０．３１ ＴＣＩＤ５０のインプットウイルス力価で示された、アッセイにおけるＣ６／３６及びベロの感度の比較を示す。 ０．０１ ＴＣＩＤ５０／ウェル（－２ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／ウェル）の標的値の周りに９９％信頼区間を含むＣ６／３６細胞部位を使用したＣＰＥ対ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０のロジスティック回帰分析を示し、モデルは、ウェルの０．８５％が陽性であろうと予測する。 ＰＢＳ（ａ）、ならびに０．０４９μｇ／ｍＬ（ｂ）、０．０９８μｇ／ｍＬ（ｃ）、０．１９６μｇ／ｍＬ（ｄ）、０．４９１μｇ／ｍＬ（ｅ）、０．９８２μｇ／ｍＬ（ｆ）、及び１．９６４ μｇ／ｍＬ（ｇ）ホルムアルデヒドを含むＰＢＳ溶液のクロマトグラムを示す。
一般的な技法
本明細書に記載または参照される技法及び手順は、一般に周知であり、当業者による従来の方法論、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，（２００３））；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ），ｅｄ．，１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；及びＴｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．，Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）に記載される広く利用されている方法論などを使用して一般的に用いられる。
ジカウイルス
本開示の特定の態様は、ワクチン及び／または免疫原性組成物において有用であり得る、精製され不活性化された全ジカウイルスに関する。
ジカウイルス（ＺＩＫＶ）は、１９４７年にウガンダのジカ森内のセンチネルアカゲザルから初めて単離された蚊媒介フラビウイルスである。それ以来、単離物は、アフリカ及びアジアの両方、ならびに最近ではアメリカ大陸におけるヒトから作製されている。ＺＩＫＶは、アフリカ系統（あるいは東及び西アフリカ系統を分離する）及びアジア系統の２つ（あるいは３つ）の系統が見出されている。したがって、本開示の適切なジカウイルスの例には、限定されないが、アフリカ及び／またはアジア系統からのウイルスが含まれる。いくつかの実施形態において、ジカウイルスは、アフリカ系統ウイルスである。いくつかの実施形態において、ジカウイルスは、アジア系統ウイルスである。さらに、ジカウイルスのアフリカ及びアジア系統内の複数の株が以前に識別されている。当技術分野で即知であるジカウイルスの任意の１つ以上の好適な株が、本開示で使用され得、例えば、Ｍｒ ７６６、ＡｒＤ ４１５１９、ＩｂＨ ３０６５６、Ｐ６－７４０、ＥＣ Ｙａｐ、ＦＳＳ１３０２５、ＡｒＤ ７１１７、ＡｒＤ ９９５７、ＡｒＤ ３０１０１、ＡｒＤ ３０１５６、ＡｒＤ ３０３３２、ＨＤ ７８７８８、ＡｒＤ １２７７０７、ＡｒＤ １２７７１０、ＡｒＤ １２７９８４、ＡｒＤ １２７９８８、ＡｒＤ １２７９９４、ＡｒＤ １２８０００、ＡｒＤ １３２９１２、１３２９１５、ＡｒＤ １４１１７０、ＡｒＤ １４２６２３、ＡｒＤ １４９９１７、ＡｒＤ １４９８１０、ＡｒＤ １４９９３８、ＡｒＤ １５７９９５、ＡｒＤ １５８０８４、ＡｒＤ １６５５２２、ＡｒＤ １６５５３１、ＡｒＡ １４６５、ＡｒＡ ２７１０１、ＡｒＡ ２７２９０、ＡｒＡ ２７１０６、ＡｒＡ ２７０９６、ＡｒＡ ２７４０７、ＡｒＡ ２７４３３、ＡｒＡ ５０６／９６、ＡｒＡ ９７５－９９、Ａｒａ ９８２－９９、ＡｒＡ ９８６－９９、ＡｒＡ ２７１８、ＡｒＢ １３６２、Ｎｉｇｅｒｉａ６８、Ｍａｌａｙｓｉａ６６、Ｋｅｄｏｕｇｏｕ８４、Ｓｕｒｉｎａｍｅ、ＭＲ１４２９、ＰＲＶＡＢＣ５９、ＥＣＭＮ２００７、ＤａｋＡｒ４１５２４、Ｈ／ＰＦ／２０１３、Ｒ１０３４５１、１０３３４４、８３７５、ＪＭＢ－１８５、ＺＩＫＶ／Ｈ、ｓａｐｉｅｎｓ／Ｂｒａｚｉｌ／Ｎａｔａｌ／２０１５、ＳＰＨ２０１５、ＺＩＫＶ／Ｈｕ／Ｃｈｉｂａ／Ｓ３６／２０１６、及び／、またはＣｕｂａ２０１７．株が含まれる。いくつかの実施形態において、ＰＲＶＡＢＣ５９株が、本開示で使用される。
いくつかの実施形態において、ジカウイルスゲノム配列の例は、配列番号２として以下に示される：
１ ｇｔｔｇｔｔｇａｔｃ ｔｇｔｇｔｇａａｔｃ ａｇａｃｔｇｃｇａｃ ａｇｔｔｃｇａｇｔｔ ｔｇａａｇｃｇａａａ ｇｃｔａｇｃａａｃａ
６１ ｇｔａｔｃａａｃａｇ ｇｔｔｔｔａｔｔｔｔ ｇｇａｔｔｔｇｇａａ ａｃｇａｇａｇｔｔｔ ｃｔｇｇｔｃａｔｇａ ａａａａｃｃｃａａａ
１２１ ａａａｇａａａｔｃｃ ｇｇａｇｇａｔｔｃｃ ｇｇａｔｔｇｔｃａａ ｔａｔｇｃｔａａａａ ｃｇｃｇｇａｇｔａｇ ｃｃｃｇｔｇｔｇａｇ
１８１ ｃｃｃｃｔｔｔｇｇｇ ｇｇｃｔｔｇａａｇａ ｇｇｃｔｇｃｃａｇｃ ｃｇｇａｃｔｔｃｔｇ ｃｔｇｇｇｔｃａｔｇ ｇｇｃｃｃａｔｃａｇ
２４１ ｇａｔｇｇｔｃｔｔｇ ｇｃｇａｔｔｃｔａｇ ｃｃｔｔｔｔｔｇａｇ ａｔｔｃａｃｇｇｃａ ａｔｃａａｇｃｃａｔ ｃａｃｔｇｇｇｔｃｔ
３０１ ｃａｔｃａａｔａｇａ ｔｇｇｇｇｔｔｃａｇ ｔｇｇｇｇａａａａａ ａｇａｇｇｃｔａｔｇ ｇａａａｃａａｔａａ ａｇａａｇｔｔｃａａ
３６１ ｇａａａｇａｔｃｔｇ ｇｃｔｇｃｃａｔｇｃ ｔｇａｇａａｔａａｔ ｃａａｔｇｃｔａｇｇ ａａｇｇａｇａａｇａ ａｇａｇａｃｇａｇｇ
４２１ ｃｇｃａｇａｔａｃｔ ａｇｔｇｔｃｇｇａａ ｔｔｇｔｔｇｇｃｃｔ ｃｃｔｇｃｔｇａｃｃ ａｃａｇｃｔａｔｇｇ ｃａｇｃｇｇａｇｇｔ
４８１ ｃａｃｔａｇａｃｇｔ ｇｇｇａｇｔｇｃａｔ ａｃｔａｔａｔｇｔａ ｃｔｔｇｇａｃａｇａ ａａｃｇａｔｇｃｔｇ ｇｇｇａｇｇｃｃａｔ
５４１ ａｔｃｔｔｔｔｃｃａ ａｃｃａｃａｔｔｇｇ ｇｇａｔｇａａｔａａ ｇｔｇｔｔａｔａｔａ ｃａｇａｔｃａｔｇｇ ａｔｃｔｔｇｇａｃａ
６０１ ｃａｔｇｔｇｔｇａｔ ｇｃｃａｃｃａｔｇａ ｇｃｔａｔｇａａｔｇ ｃｃｃｔａｔｇｃｔｇ ｇａｔｇａｇｇｇｇｇ ｔｇｇａａｃｃａｇａ
６６１ ｔｇａｃｇｔｃｇａｔ ｔｇｔｔｇｇｔｇｃａ ａｃａｃｇａｃｇｔｃ ａａｃｔｔｇｇｇｔｔ ｇｔｇｔａｃｇｇａａ ｃｃｔｇｃｃａｔｃａ
７２１ ｃａａａａａａｇｇｔ ｇａａｇｃａｃｇｇａ ｇａｔｃｔａｇａａｇ ａｇｃｔｇｔｇａｃｇ ｃｔｃｃｃｃｔｃｃｃ ａｔｔｃｃａｃｃａｇ
７８１ ｇａａｇｃｔｇｃａａ ａｃｇｃｇｇｔｃｇｃ ａａａｃｃｔｇｇｔｔ ｇｇａａｔｃａａｇａ ｇａａｔａｃａｃａａ ａｇｃａｃｔｔｇａｔ
８４１ ｔａｇａｇｔｃｇａａ ａａｔｔｇｇａｔａｔ ｔｃａｇｇａａｃｃｃ ｔｇｇｃｔｔｃｇｃｇ ｔｔａｇｃａｇｃａｇ ｃｔｇｃｃａｔｃｇｃ
９０１ ｔｔｇｇｃｔｔｔｔｇ ｇｇａａｇｃｔｃａａ ｃｇａｇｃｃａａａａ ａｇｔｃａｔａｔａｃ ｔｔｇｇｔｃａｔｇａ ｔａｃｔｇｃｔｇａｔ
９６１ ｔｇｃｃｃｃｇｇｃａ ｔａｃａｇｃａｔｃａ ｇｇｔｇｃａｔａｇｇ ａｇｔｃａｇｃａａｔ ａｇｇｇａｃｔｔｔｇ ｔｇｇａａｇｇｔａｔ
１０２１ ｇｔｃａｇｇｔｇｇｇ ａｃｔｔｇｇｇｔｔｇ ａｔｇｔｔｇｔｃｔｔ ｇｇａａｃａｔｇｇａ ｇｇｔｔｇｔｇｔｃａ ｃｃｇｔａａｔｇｇｃ
１０８１ ａｃａｇｇａｃａａａ ｃｃｇａｃｔｇｔｃｇ ａｃａｔａｇａｇｃｔ ｇｇｔｔａｃａａｃａ ａｃａｇｔｃａｇｃａ ａｃａｔｇｇｃｇｇａ
１１４１ ｇｇｔａａｇａｔｃｃ ｔａｃｔｇｃｔａｔｇ ａｇｇｃａｔｃａａｔ ａｔｃａｇａｃａｔｇ ｇｃｔｔｃｔｇａｃａ ｇｃｃｇｃｔｇｃｃｃ
１２０１ ａａｃａｃａａｇｇｔ ｇａａｇｃｃｔａｃｃ ｔｔｇａｃａａｇｃａ ａｔｃａｇａｃａｃｔ ｃａａｔａｔｇｔｃｔ ｇｃａａａａｇａａｃ
１２６１ ｇｔｔａｇｔｇｇａｃ ａｇａｇｇｃｔｇｇｇ ｇａａａｔｇｇａｔｇ ｔｇｇａｃｔｔｔｔｔ ｇｇｃａａａｇｇｇａ ｇｃｃｔｇｇｔｇａｃ
１３２１ ａｔｇｃｇｃｔａａｇ ｔｔｔｇｃａｔｇｃｔ ｃｃａａｇａａａａｔ ｇａｃｃｇｇｇａａｇ ａｇｃａｔｃｃａｇｃ ｃａｇａｇａａｔｃｔ
１３８１ ｇｇａｇｔａｃｃｇｇ ａｔａａｔｇｃｔｇｔ ｃａｇｔｔｃａｔｇｇ ｃｔｃｃｃａｇｃａｃ ａｇｔｇｇｇａｔｇａ ｔｃｇｔｔａａｔｇａ
１４４１ ｃａｃａｇｇａｃａｔ ｇａａａｃｔｇａｔｇ ａｇａａｔａｇａｇｃ ｇａａａｇｔｔｇａｇ ａｔａａｃｇｃｃｃａ ａｔｔｃａｃｃｇａｇ
１５０１ ａｇｃｃｇａａｇｃｃ ａｃｃｃｔｇｇｇｇｇ ｇｔｔｔｔｇｇａａｇ ｃｃｔａｇｇａｃｔｔ ｇａｔｔｇｔｇａａｃ ｃｇａｇｇａｃａｇｇ
１５６１ ｃｃｔｔｇａｃｔｔｔ ｔｃａｇａｔｔｔｇｔ ａｔｔａｃｔｔｇａｃ ｔａｔｇａａｔａａｃ ａａｇｃａｃｔｇｇｔ ｔｇｇｔｔｃａｃａａ
１６２１ ｇｇａｇｔｇｇｔｔｃ ｃａｃｇａｃａｔｔｃ ｃａｔｔａｃｃｔｔｇ ｇｃａｃｇｃｔｇｇｇ ｇｃａｇａｃａｃｃｇ ｇａａｃｔｃｃａｃａ
１６８１ ｃｔｇｇａａｃａａｃ ａａａｇａａｇｃａｃ ｔｇｇｔａｇａｇｔｔ ｃａａｇｇａｃｇｃａ ｃａｔｇｃｃａａａａ ｇｇｃａａａｃｔｇｔ
１７４１ ｃｇｔｇｇｔｔｃｔａ ｇｇｇａｇｔｃａａｇ ａａｇｇａｇｃａｇｔ ｔｃａｃａｃｇｇｃｃ ｃｔｔｇｃｔｇｇａｇ ｃｔｃｔｇｇａｇｇｃ
１８０１ ｔｇａｇａｔｇｇａｔ ｇｇｔｇｃａａａｇｇ ｇａａｇｇｃｔｇｔｃ ｃｔｃｔｇｇｃｃａｃ ｔｔｇａａａｔｇｔｃ ｇｃｃｔｇａａａａｔ
１８６１ ｇｇａｔａａａｃｔｔ ａｇａｔｔｇａａｇｇ ｇｃｇｔｇｔｃａｔａ ｃｔｃｃｔｔｇｔｇｔ ａｃｔｇｃａｇｃｇｔ ｔｃａｃａｔｔｃａｃ
１９２１ ｃａａｇａｔｃｃｃｇ ｇｃｔｇａａａｃａｃ ｔｇｃａｃｇｇｇａｃ ａｇｔｃａｃａｇｔｇ ｇａｇｇｔａｃａｇｔ ａｃｇｃａｇｇｇａｃ
１９８１ ａｇａｔｇｇａｃｃｔ ｔｇｃａａｇｇｔｔｃ ｃａｇｃｔｃａｇａｔ ｇｇｃｇｇｔｇｇａｃ ａｔｇｃａａａｃｔｃ ｔｇａｃｃｃｃａｇｔ
２０４１ ｔｇｇｇａｇｇｔｔｇ ａｔａａｃｃｇｃｔａ ａｃｃｃｃｇｔａａｔ ｃａｃｔｇａａａｇｃ ａｃｔｇａｇａａｃｔ ｃｔａａｇａｔｇａｔ
２１０１ ｇｃｔｇｇａａｃｔｔ ｇａｔｃｃａｃｃａｔ ｔｔｇｇｇｇａｃｔｃ ｔｔａｃａｔｔｇｔｃ ａｔａｇｇａｇｔｃｇ ｇｇｇａｇａａｇａａ
２１６１ ｇａｔｃａｃｃｃａｃ ｃａｃｔｇｇｃａｃａ ｇｇａｇｔｇｇｃａｇ ｃａｃｃａｔｔｇｇａ ａａａｇｃａｔｔｔｇ ａａｇｃｃａｃｔｇｔ
２２２１ ｇａｇａｇｇｔｇｃｃ ａａｇａｇａａｔｇｇ ｃａｇｔｃｔｔｇｇｇ ａｇａｃａｃａｇｃｃ ｔｇｇｇａｃｔｔｔｇ ｇａｔｃａｇｔｔｇｇ
２２８１ ａｇｇｃｇｃｔｃｔｃ ａａｃｔｃａｔｔｇｇ ｇｃａａｇｇｇｃａｔ ｃｃａｔｃａａａｔｔ ｔｔｔｇｇａｇｃａｇ ｃｔｔｔｃａａａｔｃ
２３４１ ａｔｔｇｔｔｔｇｇａ ｇｇａａｔｇｔｃｃｔ ｇｇｔｔｃｔｃａｃａ ａａｔｔｃｔｃａｔｔ ｇｇａａｃｇｔｔｇｃ ｔｇａｔｇｔｇｇｔｔ
２４０１ ｇｇｇｔｃｔｇａａｃ ａｃａａａｇａａｔｇ ｇａｔｃｔａｔｔｔｃ ｃｃｔｔａｔｇｔｇｃ ｔｔｇｇｃｃｔｔａｇ ｇｇｇｇａｇｔｇｔｔ
２４６１ ｇａｔｃｔｔｃｔｔａ ｔｃｃａｃａｇｃｃｇ ｔｃｔｃｔｇｃｔｇａ ｔｇｔｇｇｇｇｔｇｃ ｔｃｇｇｔｇｇａｃｔ ｔｃｔｃａａａｇａａ
２５２１ ｇｇａｇａｃｇａｇａ ｔｇｃｇｇｔａｃａｇ ｇｇｇｔｇｔｔｃｇｔ ｃｔａｔａａｃｇａｃ ｇｔｔｇａａｇｃｃｔ ｇｇａｇｇｇａｃａｇ
２５８１ ｇｔａｃａａｇｔａｃ ｃａｔｃｃｔｇａｃｔ ｃｃｃｃｃｃｇｔａｇ ａｔｔｇｇｃａｇｃａ ｇｃａｇｔｃａａｇｃ ａａｇｃｃｔｇｇｇａ
２６４１ ａｇａｔｇｇｔａｔｃ ｔｇｃｇｇｇａｔｃｔ ｃｃｔｃｔｇｔｔｔｃ ａａｇａａｔｇｇａａ ａａｃａｔｃａｔｇｔ ｇｇａｇａｔｃａｇｔ
２７０１ ａｇａａｇｇｇｇａｇ ｃｔｃａａｃｇｃａａ ｔｃｃｔｇｇａａｇａ ｇａａｔｇｇａｇｔｔ ｃａａｃｔｇａｃｇｇ ｔｃｇｔｔｇｔｇｇｇ
２７６１ ａｔｃｔｇｔａａａａ ａａｃｃｃｃａｔｇｔ ｇｇａｇａｇｇｔｃｃ ａｃａｇａｇａｔｔｇ ｃｃｃｇｔｇｃｃｔｇ ｔｇａａｃｇａｇｃｔ
２８２１ ｇｃｃｃｃａｃｇｇｃ ｔｇｇａａｇｇｃｔｔ ｇｇｇｇｇａａａｔｃ ｇｔａｔｔｔｃｇｔｃ ａｇａｇｃａｇｃａａ ａｇａｃａａａｔａａ
２８８１ ｃａｇｃｔｔｔｇｔｃ ｇｔｇｇａｔｇｇｔｇ ａｃａｃａｃｔｇａａ ｇｇａａｔｇｃｃｃａ ｃｔｃａａａｃａｔａ ｇａｇｃａｔｇｇａａ
２９４１ ｃａｇｃｔｔｔｃｔｔ ｇｔｇｇａｇｇａｔｃ ａｔｇｇｇｔｔｃｇｇ ｇｇｔａｔｔｔｃａｃ ａｃｔａｇｔｇｔｃｔ ｇｇｃｔｃａａｇｇｔ
３００１ ｔａｇａｇａａｇａｔ ｔａｔｔｃａｔｔａｇ ａｇｔｇｔｇａｔｃｃ ａｇｃｃｇｔｔａｔｔ ｇｇａａｃａｇｃｔｇ ｔｔａａｇｇｇａａａ
３０６１ ｇｇａｇｇｃｔｇｔａ ｃａｃａｇｔｇａｔｃ ｔａｇｇｃｔａｃｔｇ ｇａｔｔｇａｇａｇｔ ｇａｇａａｇａａｔｇ ａｃａｃａｔｇｇａｇ
３１２１ ｇｃｔｇａａｇａｇｇ ｇｃｃｃａｔｃｔｇａ ｔｃｇａｇａｔｇａａ ａａｃａｔｇｔｇａａ ｔｇｇｃｃａａａｇｔ ｃｃｃａｃａｃａｔｔ
３１８１ ｇｔｇｇａｃａｇａｔ ｇｇａａｔａｇａａｇ ａｇａｇｔｇａｔｃｔ ｇａｔｃａｔａｃｃｃ ａａｇｔｃｔｔｔａｇ ｃｔｇｇｇｃｃａｃｔ
３２４１ ｃａｇｃｃａｔｃａｃ ａａｔａｃｃａｇａｇ ａｇｇｇｃｔａｃａｇ ｇａｃｃｃａａａｔｇ ａａａｇｇｇｃｃａｔ ｇｇｃａｃａｇｔｇａ
３３０１ ａｇａｇｃｔｔｇａａ ａｔｔｃｇｇｔｔｔｇ ａｇｇａａｔｇｃｃｃ ａｇｇｃａｃｔａａｇ ｇｔｃｃａｃｇｔｇｇ ａｇｇａａａｃａｔｇ
３３６１ ｔｇｇａａｃａａｇａ ｇｇａｃｃａｔｃｔｃ ｔｇａｇａｔｃａａｃ ｃａｃｔｇｃａａｇｃ ｇｇａａｇｇｇｔｇａ ｔｃｇａｇｇａａｔｇ
３４２１ ｇｔｇｃｔｇｃａｇｇ ｇａｇｔｇｃａｃａａ ｔｇｃｃｃｃｃａｃｔ ｇｔｃｇｔｔｃｃｇｇ ｇｃｔａａａｇａｔｇ ｇｃｔｇｔｔｇｇｔａ
３４８１ ｔｇｇａａｔｇｇａｇ ａｔａａｇｇｃｃｃａ ｇｇａａａｇａａｃｃ ａｇａａａｇｃａａｃ ｔｔａｇｔａａｇｇｔ ｃａａｔｇｇｔｇａｃ
３５４１ ｔｇｃａｇｇａｔｃａ ａｃｔｇａｔｃａｃａ ｔｇｇａｃｃａｃｔｔ ｃｔｃｃｃｔｔｇｇａ ｇｔｇｃｔｔｇｔｇａ ｔｃｃｔｇｃｔｃａｔ
３６０１ ｇｇｔｇｃａｇｇａａ ｇｇｇｃｔｇａａｇａ ａｇａｇａａｔｇａｃ ｃａｃａａａｇａｔｃ ａｔｃａｔａａｇｃａ ｃａｔｃａａｔｇｇｃ
３６６１ ａｇｔｇｃｔｇｇｔａ ｇｃｔａｔｇａｔｃｃ ｔｇｇｇａｇｇａｔｔ ｔｔｃａａｔｇａｇｔ ｇａｃｃｔｇｇｃｔａ ａｇｃｔｔｇｃａａｔ
３７２１ ｔｔｔｇａｔｇｇｇｔ ｇｃｃａｃｃｔｔｃｇ ｃｇｇａａａｔｇａａ ｃａｃｔｇｇａｇｇａ ｇａｔｇｔａｇｃｔｃ ａｔｃｔｇｇｃｇｃｔ
３７８１ ｇａｔａｇｃｇｇｃａ ｔｔｃａａａｇｔｃａ ｇａｃｃａｇｃｇｔｔ ｇｃｔｇｇｔａｔｃｔ ｔｔｃａｔｃｔｔｃａ ｇａｇｃｔａａｔｔｇ
３８４１ ｇａｃａｃｃｃｃｇｔ ｇａａａｇｃａｔｇｃ ｔｇｃｔｇｇｃｃｔｔ ｇｇｃｃｔｃｇｔｇｔ ｃｔｔｔｔｇｃａａａ ｃｔｇｃｇａｔｃｔｃ
３９０１ ｃｇｃｃｔｔｇｇａａ ｇｇｃｇａｃｃｔｇａ ｔｇｇｔｔｃｔｃａｔ ｃａａｔｇｇｔｔｔｔ ｇｃｔｔｔｇｇｃｃｔ ｇｇｔｔｇｇｃａａｔ
３９６１ ａｃｇａｇｃｇａｔｇ ｇｔｔｇｔｔｃｃａｃ ｇｃａｃｔｇａｔａａ ｃａｔｃａｃｃｔｔｇ ｇｃａａｔｃｃｔｇｇ ｃｔｇｃｔｃｔｇａｃ
４０２１ ａｃｃａｃｔｇｇｃｃ ｃｇｇｇｇｃａｃａｃ ｔｇｃｔｔｇｔｇｇｃ ｇｔｇｇａｇａｇｃａ ｇｇｃｃｔｔｇｃｔａ ｃｔｔｇｃｇｇｇｇｇ
４０８１ ｇｔｔｔａｔｇｃｔｃ ｃｔｃｔｃｔｃｔｇａ ａｇｇｇａａａａｇｇ ｃａｇｔｇｔｇａａｇ ａａｇａａｃｔｔａｃ ｃａｔｔｔｇｔｃａｔ
４１４１ ｇｇｃｃｃｔｇｇｇａ ｃｔａａｃｃｇｃｔｇ ｔｇａｇｇｃｔｇｇｔ ｃｇａｃｃｃｃａｔｃ ａａｃｇｔｇｇｔｇｇ ｇａｃｔｇｃｔｇｔｔ
４２０１ ｇｃｔｃａｃａａｇｇ ａｇｔｇｇｇａａｇｃ ｇｇａｇｃｔｇｇｃｃ ｃｃｃｔａｇｃｇａａ ｇｔａｃｔｃａｃａｇ ｃｔｇｔｔｇｇｃｃｔ
４２６１ ｇａｔａｔｇｃｇｃａ ｔｔｇｇｃｔｇｇａｇ ｇｇｔｔｃｇｃｃａａ ｇｇｃａｇａｔａｔａ ｇａｇａｔｇｇｃｔｇ ｇｇｃｃｃａｔｇｇｃ
４３２１ ｃｇｃｇｇｔｃｇｇｔ ｃｔｇｃｔａａｔｔｇ ｔｃａｇｔｔａｃｇｔ ｇｇｔｃｔｃａｇｇａ ａａｇａｇｔｇｔｇｇ ａｃａｔｇｔａｃａｔ
４３８１ ｔｇａａａｇａｇｃａ ｇｇｔｇａｃａｔｃａ ｃａｔｇｇｇａａａａ ａｇａｔｇｃｇｇａａ ｇｔｃａｃｔｇｇａａ ａｃａｇｔｃｃｃｃｇ
４４４１ ｇｃｔｃｇａｔｇｔｇ ｇｃｇｃｔａｇａｔｇ ａｇａｇｔｇｇｔｇａ ｔｔｔｃｔｃｃｃｔｇ ｇｔｇｇａｇｇａｔｇ ａｃｇｇｔｃｃｃｃｃ
４５０１ ｃａｔｇａｇａｇａｇ ａｔｃａｔａｃｔｃａ ａｇｇｔｇｇｔｃｃｔ ｇａｔｇａｃｃａｔｃ ｔｇｔｇｇｃａｔｇａ ａｃｃｃａａｔａｇｃ
４５６１ ｃａｔａｃｃｃｔｔｔ ｇｃａｇｃｔｇｇａｇ ｃｇｔｇｇｔａｃｇｔ ａｔａｃｇｔｇａａｇ ａｃｔｇｇａａａａａ ｇｇａｇｔｇｇｔｇｃ
４６２１ ｔｃｔａｔｇｇｇａｔ ｇｔｇｃｃｔｇｃｔｃ ｃｃａａｇｇａａｇｔ ａａａａａａｇｇｇｇ ｇａｇａｃｃａｃａｇ ａｔｇｇａｇｔｇｔａ
４６８１ ｃａｇａｇｔａａｔｇ ａｃｔｃｇｔａｇａｃ ｔｇｃｔａｇｇｔｔｃ ａａｃａｃａａｇｔｔ ｇｇａｇｔｇｇｇａｇ ｔｔａｔｇｃａａｇａ
４７４１ ｇｇｇｇｇｔｃｔｔｔ ｃａｃａｃｔａｔｇｔ ｇｇｃａｃｇｔｃａｃ ａａａａｇｇａｔｃｃ ｇｃｇｃｔｇａｇａａ ｇｃｇｇｔｇａａｇｇ
４８０１ ｇａｇａｃｔｔｇａｔ ｃｃａｔａｃｔｇｇｇ ｇａｇａｔｇｔｃａａ ｇｃａｇｇａｔｃｔｇ ｇｔｇｔｃａｔａｃｔ ｇｔｇｇｔｃｃａｔｇ
４８６１ ｇａａｇｃｔａｇａｔ ｇｃｃｇｃｃｔｇｇｇ ａｔｇｇｇｃａｃａｇ ｃｇａｇｇｔｇｃａｇ ｃｔｃｔｔｇｇｃｃｇ ｔｇｃｃｃｃｃｃｇｇ
４９２１ ａｇａｇａｇａｇｃｇ ａｇｇａａｃａｔｃｃ ａｇａｃｔｃｔｇｃｃ ｃｇｇａａｔａｔｔｔ ａａｇａｃａａａｇｇ ａｔｇｇｇｇａｃａｔ
４９８１ ｔｇｇａｇｃｇｇｔｔ ｇｃｇｃｔｇｇａｔｔ ａｃｃｃａｇｃａｇｇ ａａｃｔｔｃａｇｇａ ｔｃｔｃｃａａｔｃｃ ｔａｇａｃａａｇｔｇ
５０４１ ｔｇｇｇａｇａｇｔｇ ａｔａｇｇａｃｔｔｔ ａｔｇｇｃａａｔｇｇ ｇｇｔｃｇｔｇａｔｃ ａａａａａｃｇｇｇａ ｇｔｔａｔｇｔｔａｇ
５１０１ ｔｇｃｃａｔｃａｃｃ ｃａａｇｇｇａｇｇａ ｇｇｇａｇｇａａｇａ ｇａｃｔｃｃｔｇｔｔ ｇａｇｔｇｃｔｔｃｇ ａｇｃｃｃｔｃｇａｔ
５１６１ ｇｃｔｇａａｇａａｇ ａａｇｃａｇｃｔａａ ｃｔｇｔｃｔｔａｇａ ｃｔｔｇｃａｔｃｃｔ ｇｇａｇｃｔｇｇｇａ ａａａｃｃａｇｇａｇ
５２２１ ａｇｔｔｃｔｔｃｃｔ ｇａａａｔａｇｔｃｃ ｇｔｇａａｇｃｃａｔ ａａａａａｃａａｇａ ｃｔｃｃｇｔａｃｔｇ ｔｇａｔｃｔｔａｇｃ
５２８１ ｔｃｃａａｃｃａｇｇ ｇｔｔｇｔｃｇｃｔｇ ｃｔｇａａａｔｇｇａ ｇｇａｇｇｃｃｃｔｔ ａｇａｇｇｇｃｔｔｃ ｃａｇｔｇｃｇｔｔａ
５３４１ ｔａｔｇａｃａａｃａ ｇｃａｇｔｃａａｔｇ ｔｃａｃｃｃａｃｔｃ ｔｇｇａａｃａｇａａ ａｔｃｇｔｃｇａｃｔ ｔａａｔｇｔｇｃｃａ
５４０１ ｔｇｃｃａｃｃｔｔｃ ａｃｔｔｃａｃｇｔｃ ｔａｃｔａｃａｇｃｃ ａａｔｃａｇａｇｔｃ ｃｃｃａａｃｔａｔａ ａｔｃｔｇｔａｔａｔ
５４６１ ｔａｔｇｇａｔｇａｇ ｇｃｃｃａｃｔｔｃａ ｃａｇａｔｃｃｃｔｃ ａａｇｔａｔａｇｃａ ｇｃａａｇａｇｇａｔ ａｃａｔｔｔｃａａｃ
５５２１ ａａｇｇｇｔｔｇａｇ ａｔｇｇｇｃｇａｇｇ ｃｇｇｃｔｇｃｃａｔ ｃｔｔｃａｔｇａｃｃ ｇｃｃａｃｇｃｃａｃ ｃａｇｇａａｃｃｃｇ
５５８１ ｔｇａｃｇｃａｔｔｔ ｃｃｇｇａｃｔｃｃａ ａｃｔｃａｃｃａａｔ ｔａｔｇｇａｃａｃｃ ｇａａｇｔｇｇａａｇ ｔｃｃｃａｇａｇａｇ
５６４１ ａｇｃｃｔｇｇａｇｃ ｔｃａｇｇｃｔｔｔｇ ａｔｔｇｇｇｔｇａｃ ｇｇａｔｃａｔｔｃｔ ｇｇａａａａａｃａｇ ｔｔｔｇｇｔｔｔｇｔ
５７０１ ｔｃｃａａｇｃｇｔｇ ａｇｇａａｃｇｇｃａ ａｔｇａｇａｔｃｇｃ ａｇｃｔｔｇｔｃｔｇ ａｃａａａｇｇｃｔｇ ｇａａａａｃｇｇｇｔ
５７６１ ｃａｔａｃａｇｃｔｃ ａｇｃａｇａａａｇａ ｃｔｔｔｔｇａｇａｃ ａｇａｇｔｔｃｃａｇ ａａａａｃａａａａｃ ａｔｃａａｇａｇｔｇ
５８２１ ｇｇａｃｔｔｔｇｔｃ ｇｔｇａｃａａｃｔｇ ａｃａｔｔｔｃａｇａ ｇａｔｇｇｇｃｇｃｃ ａａｃｔｔｔａａａｇ ｃｔｇａｃｃｇｔｇｔ
５８８１ ｃａｔａｇａｔｔｃｃ ａｇｇａｇａｔｇｃｃ ｔａａａｇｃｃｇｇｔ ｃａｔａｃｔｔｇａｔ ｇｇｃｇａｇａｇａｇ ｔｃａｔｔｃｔｇｇｃ
５９４１ ｔｇｇａｃｃｃａｔｇ ｃｃｔｇｔｃａｃａｃ ａｔｇｃｃａｇｃｇｃ ｔｇｃｃｃａｇａｇｇ ａｇｇｇｇｇｃｇｃａ ｔａｇｇｃａｇｇａａ
６００１ ｔｃｃｃａａｃａａａ ｃｃｔｇｇａｇａｔｇ ａｇｔａｔｃｔｇｔａ ｔｇｇａｇｇｔｇｇｇ ｔｇｃｇｃａｇａｇａ ｃｔｇａｃｇａａｇａ
６０６１ ｃｃａｔｇｃａｃａｃ ｔｇｇｃｔｔｇａａｇ ｃａａｇａａｔｇｃｔ ｃｃｔｔｇａｃａａｔ ａｔｔｔａｃｃｔｃｃ ａａｇａｔｇｇｃｃｔ
６１２１ ｃａｔａｇｃｃｔｃｇ ｃｔｃｔａｔｃｇａｃ ｃｔｇａｇｇｃｃｇａ ｃａａａｇｔａｇｃａ ｇｃｃａｔｔｇａｇｇ ｇａｇａｇｔｔｃａａ
６１８１ ｇｃｔｔａｇｇａｃｇ ｇａｇｃａａａｇｇａ ａｇａｃｃｔｔｔｇｔ ｇｇａａｃｔｃａｔｇ ａａａａｇａｇｇａｇ ａｔｃｔｔｃｃｔｇｔ
６２４１ ｔｔｇｇｃｔｇｇｃｃ ｔａｔｃａｇｇｔｔｇ ｃａｔｃｔｇｃｃｇｇ ａａｔａａｃｃｔａｃ ａｃａｇａｔａｇａａ ｇａｔｇｇｔｇｃｔｔ
６３０１ ｔｇａｔｇｇｃａｃｇ ａｃｃａａｃａａｃａ ｃｃａｔａａｔｇｇａ ａｇａｃａｇｔｇｔｇ ｃｃｇｇｃａｇａｇｇ ｔｇｔｇｇａｃｃａｇ
６３６１ ａｃａｃｇｇａｇａｇ ａａａａｇａｇｔｇｃ ｔｃａａａｃｃｇａｇ ｇｔｇｇａｔｇｇａｃ ｇｃｃａｇａｇｔｔｔ ｇｔｔｃａｇａｔｃａ
６４２１ ｔｇｃｇｇｃｃｃｔｇ ａａｇｔｃａｔｔｃａ ａｇｇａｇｔｔｔｇｃ ｃｇｃｔｇｇｇａａａ ａｇａｇｇａｇｃｇｇ ｃｔｔｔｔｇｇａｇｔ
６４８１ ｇａｔｇｇａａｇｃｃ ｃｔｇｇｇａａｃａｃ ｔｇｃｃａｇｇａｃａ ｃａｔｇａｃａｇａｇ ａｇａｔｔｃｃａｇｇ ａａｇｃｃａｔｔｇａ
６５４１ ｃａａｃｃｔｃｇｃｔ ｇｔｇｃｔｃａｔｇｃ ｇｇｇｃａｇａｇａｃ ｔｇｇａａｇｃａｇｇ ｃｃｔｔａｃａａａｇ ｃｃｇｃｇｇｃｇｇｃ
６６０１ ｃｃａａｔｔｇｃｃｇ ｇａｇａｃｃｃｔａｇ ａｇａｃｃａｔａａｔ ｇｃｔｔｔｔｇｇｇｇ ｔｔｇｃｔｇｇｇａａ ｃａｇｔｃｔｃｇｃｔ
６６６１ ｇｇｇａａｔｃｔｔｃ ｔｔｃｇｔｃｔｔｇａ ｔｇａｇｇａａｃａａ ｇｇｇｃａｔａｇｇｇ ａａｇａｔｇｇｇｃｔ ｔｔｇｇａａｔｇｇｔ
６７２１ ｇａｃｔｃｔｔｇｇｇ ｇｃｃａｇｃｇｃａｔ ｇｇｃｔｃａｔｇｔｇ ｇｃｔｃｔｃｇｇａａ ａｔｔｇａｇｃｃａｇ ｃｃａｇａａｔｔｇｃ
６７８１ ａｔｇｔｇｔｃｃｔｃ ａｔｔｇｔｔｇｔｇｔ ｔｃｃｔａｔｔｇｃｔ ｇｇｔｇｇｔｇｃｔｃ ａｔａｃｃｔｇａｇｃ ｃａｇａａａａｇｃａ
６８４１ ａａｇａｔｃｔｃｃｃ ｃａｇｇａｃａａｃｃ ａａａｔｇｇｃａａｔ ｃａｔｃａｔｃａｔｇ ｇｔａｇｃａｇｔａｇ ｇｔｃｔｔｃｔｇｇｇ
６９０１ ｃｔｔｇａｔｔａｃｃ ｇｃｃａａｔｇａａｃ ｔｃｇｇａｔｇｇｔｔ ｇｇａｇａｇａａｃａ ａａｇａｇｔｇａｃｃ ｔａａｇｃｃａｔｃｔ
６９６１ ａａｔｇｇｇａａｇｇ ａｇａｇａｇｇａｇｇ ｇｇｇｃａａｃｃａｔ ａｇｇａｔｔｃｔｃａ ａｔｇｇａｃａｔｔｇ ａｃｃｔｇｃｇｇｃｃ
７０２１ ａｇｃｃｔｃａｇｃｔ ｔｇｇｇｃｃａｔｃｔ ａｔｇｃｔｇｃｃｔｔ ｇａｃａａｃｔｔｔｃ ａｔｔａｃｃｃｃａｇ ｃｃｇｔｃｃａａｃａ
７０８１ ｔｇｃａｇｔｇａｃｃ ａｃｃｔｃａｔａｃａ ａｃａａｃｔａｃｔｃ ｃｔｔａａｔｇｇｃｇ ａｔｇｇｃｃａｃｇｃ ａａｇｃｔｇｇａｇｔ
７１４１ ｇｔｔｇｔｔｔｇｇｃ ａｔｇｇｇｃａａａｇ ｇｇａｔｇｃｃａｔｔ ｃｔａｃｇｃａｔｇｇ ｇａｃｔｔｔｇｇａｇ ｔｃｃｃｇｃｔｇｃｔ
７２０１ ａａｔｇａｔａｇｇｔ ｔｇｃｔａｃｔｃａｃ ａａｔｔａａｃａｃｃ ｃｃｔｇａｃｃｃｔａ ａｔａｇｔｇｇｃｃａ ｔｃａｔｔｔｔｇｃｔ
７２６１ ｃｇｔｇｇｃｇｃａｃ ｔａｃａｔｇｔａｃｔ ｔｇａｔｃｃｃａｇｇ ｇｃｔｇｃａｇｇｃａ ｇｃａｇｃｔｇｃｇｃ ｇｔｇｃｔｇｃｃｃａ
７３２１ ｇａａｇａｇａａｃｇ ｇｃａｇｃｔｇｇｃａ ｔｃａｔｇａａｇａａ ｃｃｃｔｇｔｔｇｔｇ ｇａｔｇｇａａｔａｇ ｔｇｇｔｇａｃｔｇａ
７３８１ ｃａｔｔｇａｃａｃａ ａｔｇａｃａａｔｔｇ ａｃｃｃｃｃａａｇｔ ｇｇａｇａａａａａｇ ａｔｇｇｇａｃａｇｇ ｔｇｃｔａｃｔｃａｔ
７４４１ ａｇｃａｇｔａｇｃｃ ｇｔｃｔｃｃａｇｃｇ ｃｃａｔａｃｔｇｔｃ ｇｃｇｇａｃｃｇｃｃ ｔｇｇｇｇｇｔｇｇｇ ｇｇｇａｇｇｃｔｇｇ
７５０１ ｇｇｃｔｃｔｇａｔｃ ａｃａｇｃｃｇｃａａ ｃｔｔｃｃａｃｔｔｔ ｇｔｇｇｇａａｇｇｃ ｔｃｔｃｃｇａａｃａ ａｇｔａｃｔｇｇａａ
７５６１ ｃｔｃｃｔｃｔａｃａ ｇｃｃａｃｔｔｃａｃ ｔｇｔｇｔａａｃａｔ ｔｔｔｔａｇｇｇｇａ ａｇｔｔａｃｔｔｇｇ ｃｔｇｇａｇｃｔｔｃ
７６２１ ｔｃｔａａｔｃｔａｃ ａｃａｇｔａａｃａａ ｇａａａｃｇｃｔｇｇ ｃｔｔｇｇｔｃａａｇ ａｇａｃｇｔｇｇｇｇ ｇｔｇｇａａｃａｇｇ
７６８１ ａｇａｇａｃｃｃｔｇ ｇｇａｇａｇａａａｔ ｇｇａａｇｇｃｃｃｇ ｃｔｔｇａａｃｃａｇ ａｔｇｔｃｇｇｃｃｃ ｔｇｇａｇｔｔｃｔａ
７７４１ ｃｔｃｃｔａｃａａａ ａａｇｔｃａｇｇｃａ ｔｃａｃｃｇａｇｇｔ ｇｔｇｃａｇａｇａａ ｇａｇｇｃｃｃｇｃｃ ｇｃｇｃｃｃｔｃａａ
７８０１ ｇｇａｃｇｇｔｇｔｇ ｇｃａａｃｇｇｇａｇ ｇｃｃａｔｇｃｔｇｔ ｇｔｃｃｃｇａｇｇａ ａｇｔｇｃａａａｇｃ ｔｇａｇａｔｇｇｔｔ
７８６１ ｇｇｔｇｇａｇｃｇｇ ｇｇａｔａｃｃｔｇｃ ａｇｃｃｃｔａｔｇｇ ａａａｇｇｔｃａｔｔ ｇａｔｃｔｔｇｇａｔ ｇｔｇｇｃａｇａｇｇ
７９２１ ｇｇｇｃｔｇｇａｇｔ ｔａｃｔａｃｇｔｃｇ ｃｃａｃｃａｔｃｃｇ ｃａａａｇｔｔｃａａ ｇａａｇｔｇａａａｇ ｇａｔａｃａｃａａａ
７９８１ ａｇｇａｇｇｃｃｃｔ ｇｇｔｃａｔｇａａｇ ａａｃｃｃｇｔｇｔｔ ｇｇｔｇｃａａａｇｃ ｔａｔｇｇｇｔｇｇａ ａｃａｔａｇｔｃｃｇ
８０４１ ｔｃｔｔａａｇａｇｔ ｇｇｇｇｔｇｇａｃｇ ｔｃｔｔｔｃａｔａｔ ｇｇｃｇｇｃｔｇａｇ ｃｃｇｔｇｔｇａｃａ ｃｇｔｔｇｃｔｇｔｇ
８１０１ ｔｇａｃａｔａｇｇｔ ｇａｇｔｃａｔｃａｔ ｃｔａｇｔｃｃｔｇａ ａｇｔｇｇａａｇａａ ｇｃａｃｇｇａｃｇｃ ｔｃａｇａｇｔｃｃｔ
８１６１ ｃｔｃｃａｔｇｇｔｇ ｇｇｇｇａｔｔｇｇｃ ｔｔｇａａａａａａｇ ａｃｃａｇｇａｇｃｃ ｔｔｔｔｇｔａｔａａ ａａｇｔｇｔｔｇｔｇ
８２２１ ｃｃｃａｔａｃａｃｃ ａｇｃａｃｔａｔｇａ ｔｇｇａａａｃｃｃｔ ｇｇａｇｃｇａｃｔｇ ｃａｇｃｇｔａｇｇｔ ａｔｇｇｇｇｇａｇｇ
８２８１ ａｃｔｇｇｔｃａｇａ ｇｔｇｃｃａｃｔｃｔ ｃｃｃｇｃａａｃｔｃ ｔａｃａｃａｔｇａｇ ａｔｇｔａｃｔｇｇｇ ｔｃｔｃｔｇｇａｇｃ
８３４１ ｇａａａａｇｃａａｃ ａｃｃａｔａａａａａ ｇｔｇｔｇｔｃｃａｃ ｃａｃｇａｇｃｃａｇ ｃｔｃｃｔｃｔｔｇｇ ｇｇｃｇｃａｔｇｇａ
８４０１ ｃｇｇｇｃｃｔａｇｇ ａｇｇｃｃａｇｔｇａ ａａｔａｔｇａｇｇａ ｇｇａｔｇｔｇａａｔ ｃｔｃｇｇｃｔｃｔｇ ｇｃａｃｇｃｇｇｇｃ
８４６１ ｔｇｔｇｇｔａａｇｃ ｔｇｃｇｃｔｇａａｇ ｃｔｃｃｃａａｃａｔ ｇａａｇａｔｃａｔｔ ｇｇｔａａｃｃｇｃａ ｔｔｇａａａｇｇａｔ
８５２１ ｃｃｇｃａｇｔｇａｇ ｃａｃｇｃｇｇａａａ ｃｇｔｇｇｔｔｃｔｔ ｔｇａｃｇａｇａａｃ ｃａｃｃｃａｔａｔａ ｇｇａｃａｔｇｇｇｃ
８５８１ ｔｔａｃｃａｔｇｇａ ａｇｃｔａｔｇａｇｇ ｃｃｃｃｃａｃａｃａ ａｇｇｇｔｃａｇｃｇ ｔｃｃｔｃｔｃｔａａ ｔａａａｃｇｇｇｇｔ
８６４１ ｔｇｔｃａｇｇｃｔｃ ｃｔｇｔｃａａａａｃ ｃｃｔｇｇｇａｔｇｔ ｇｇｔｇａｃｔｇｇａ ｇｔｃａｃａｇｇａａ ｔａｇｃｃａｔｇａｃ
８７０１ ｃｇａｃａｃｃａｃａ ｃｃｇｔａｔｇｇｔｃ ａｇｃａａａｇａｇｔ ｔｔｔｃａａｇｇａａ ａａａｇｔｇｇａｃａ ｃｔａｇｇｇｔｇｃｃ
８７６１ ａｇａｃｃｃｃｃａａ ｇａａｇｇｃａｃｔｃ ｇｔｃａｇｇｔｔａｔ ｇａｇｃａｔｇｇｔｃ ｔｃｔｔｃｃｔｇｇｔ ｔｇｔｇｇａａａｇａ
８８２１ ｇｃｔａｇｇｃａａａ ｃａｃａａａｃｇｇｃ ｃａｃｇａｇｔｃｔｇ ｃａｃｃａａａｇａａ ｇａｇｔｔｃａｔｃａ ａｃａａｇｇｔｔｃｇ
８８８１ ｔａｇｃａａｔｇｃａ ｇｃａｔｔａｇｇｇｇ ｃａａｔａｔｔｔｇａ ａｇａｇｇａａａａａ ｇａｇｔｇｇａａｇａ ｃｔｇｃａｇｔｇｇａ
８９４１ ａｇｃｔｇｔｇａａｃ ｇａｔｃｃａａｇｇｔ ｔｃｔｇｇｇｃｔｃｔ ａｇｔｇｇａｃａａｇ ｇａａａｇａｇａｇｃ ａｃｃａｃｃｔｇａｇ
９００１ ａｇｇａｇａｇｔｇｃ ｃａｇａｇｃｔｇｔｇ ｔｇｔａｃａａｃａｔ ｇａｔｇｇｇａａａａ ａｇａｇａａａａｇａ ａａｃａａｇｇｇｇａ
９０６１ ａｔｔｔｇｇａａａｇ ｇｃｃａａｇｇｇｃａ ｇｃｃｇｃｇｃｃａｔ ｃｔｇｇｔａｔａｔｇ ｔｇｇｃｔａｇｇｇｇ ｃｔａｇａｔｔｔｃｔ
９１２１ ａｇａｇｔｔｃｇａａ ｇｃｃｃｔｔｇｇａｔ ｔｃｔｔｇａａｃｇａ ｇｇａｔｃａｃｔｇｇ ａｔｇｇｇｇａｇａｇ ａｇａａｃｔｃａｇｇ
９１８１ ａｇｇｔｇｇｔｇｔｔ ｇａａｇｇｇｃｔｇｇ ｇａｔｔａｃａａａｇ ａｃｔｃｇｇａｔａｔ ｇｔｃｃｔａｇａａｇ ａｇａｔｇａｇｔｃｇ
９２４１ ｔａｔａｃｃａｇｇａ ｇｇａａｇｇａｔｇｔ ａｔｇｃａｇａｔｇａ ｃａｃｔｇｃｔｇｇｃ ｔｇｇｇａｃａｃｃｃ ｇｃａｔｔａｇｃａｇ
９３０１ ｇｔｔｔｇａｔｃｔｇ ｇａｇａａｔｇａａｇ ｃｔｃｔａａｔｃａｃ ｃａａｃｃａａａｔｇ ｇａｇａａａｇｇｇｃ ａｃａｇｇｇｃｃｔｔ
９３６１ ｇｇｃａｔｔｇｇｃｃ ａｔａａｔｃａａｇｔ ａｃａｃａｔａｃｃａ ａａａｃａａａｇｔｇ ｇｔａａａｇｇｔｃｃ ｔｔａｇａｃｃａｇｃ
９４２１ ｔｇａａａａａｇｇｇ ａａａａｃａｇｔｔａ ｔｇｇａｃａｔｔａｔ ｔｔｃｇａｇａｃａａ ｇａｃｃａａａｇｇｇ ｇｇａｇｃｇｇａｃａ
９４８１ ａｇｔｔｇｔｃａｃｔ ｔａｃｇｃｔｃｔｔａ ａｃａｃａｔｔｔａｃ ｃａａｃｃｔａｇｔｇ ｇｔｇｃａａｃｔｃａ ｔｔｃｇｇａａｔａｔ
９５４１ ｇｇａｇｇｃｔｇａｇ ｇａａｇｔｔｃｔａｇ ａｇａｔｇｃａａｇａ ｃｔｔｇｔｇｇｃｔｇ ｃｔｇｃｇｇａｇｇｔ ｃａｇａｇａａａｇｔ
９６０１ ｇａｃｃａａｃｔｇｇ ｔｔｇｃａｇａｇｃａ ａｃｇｇａｔｇｇｇａ ｔａｇｇｃｔｃａａａ ｃｇａａｔｇｇｃａｇ ｔｃａｇｔｇｇａｇａ
９６６１ ｔｇａｔｔｇｃｇｔｔ ｇｔｇａａｇｃｃａａ ｔｔｇａｔｇａｔａｇ ｇｔｔｔｇｃａｃａｔ ｇｃｃｃｔｃａｇｇｔ ｔｃｔｔｇａａｔｇａ
９７２１ ｔａｔｇｇｇａａａａ ｇｔｔａｇｇａａｇｇ ａｃａｃａｃａａｇａ ｇｔｇｇａａａｃｃｃ ｔｃａａｃｔｇｇａｔ ｇｇｇａｃａａｃｔｇ
９７８１ ｇｇａａｇａａｇｔｔ ｃｃｇｔｔｔｔｇｃｔ ｃｃｃａｃｃａｃｔｔ ｃａａｃａａｇｃｔｃ ｃａｔｃｔｃａａｇｇ ａｃｇｇｇａｇｇｔｃ
９８４１ ｃａｔｔｇｔｇｇｔｔ ｃｃｃｔｇｃｃｇｃｃ ａｃｃａａｇａｔｇａ ａｃｔｇａｔｔｇｇｃ ｃｇｇｇｃｃｃｇｃｇ ｔｃｔｃｔｃｃａｇｇ
９９０１ ｇｇｃｇｇｇａｔｇｇ ａｇｃａｔｃｃｇｇｇ ａｇａｃｔｇｃｔｔｇ ｃｃｔａｇｃａａａａ ｔｃａｔａｔｇｃｇｃ ａａａｔｇｔｇｇｃａ
９９６１ ｇｃｔｃｃｔｔｔａｔ ｔｔｃｃａｃａｇａａ ｇｇｇａｃｃｔｃｃｇ ａｃｔｇａｔｇｇｃｃ ａａｔｇｃｃａｔｔｔ ｇｔｔｃａｔｃｔｇｔ
１００２１ ｇｃｃａｇｔｔｇａｃ ｔｇｇｇｔｔｃｃａａ ｃｔｇｇｇａｇａａｃ ｔａｃｃｔｇｇｔｃａ ａｔｃｃａｔｇｇａａ ａｇｇｇａｇａａｔｇ
１００８１ ｇａｔｇａｃｃａｃｔ ｇａａｇａｃａｔｇｃ ｔｔｇｔｇｇｔｇｔｇ ｇａａｃａｇａｇｔｇ ｔｇｇａｔｔｇａｇｇ ａｇａａｃｇａｃｃａ
１０１４１ ｃａｔｇｇａａｇａｃ ａａｇａｃｃｃｃａｇ ｔｔａｃｇａａａｔｇ ｇａｃａｇａｃａｔｔ ｃｃｃｔａｔｔｔｇｇ ｇａａａａａｇｇｇａ
１０２０１ ａｇａｃｔｔｇｔｇｇ ｔｇｔｇｇａｔｃｔｃ ｔｃａｔａｇｇｇｃａ ｃａｇａｃｃｇｃｇｃ ａｃｃａｃｃｔｇｇｇ ｃｔｇａｇａａｃａｔ
１０２６１ ｔａａａａａｃａｃａ ｇｔｃａａｃａｔｇｇ ｔｇｃｇｃａｇｇａｔ ｃａｔａｇｇｔｇａｔ ｇａａｇａａａａｇｔ ａｃａｔｇｇａｃｔａ
１０３２１ ｃｃｔａｔｃｃａｃｃ ｃａａｇｔｔｃｇｃｔ ａｃｔｔｇｇｇｔｇａ ａｇａａｇｇｇｔｃｔ ａｃａｃｃｔｇｇａｇ ｔｇｃｔｇｔａａｇｃ
１０３８１ ａｃｃａａｔｃｔｔａ ａｔｇｔｔｇｔｃａｇ ｇｃｃｔｇｃｔａｇｔ ｃａｇｃｃａｃａｇｃ ｔｔｇｇｇｇａａａｇ ｃｔｇｔｇｃａｇｃｃ
１０４４１ ｔｇｔｇａｃｃｃｃｃ ｃｃａｇｇａｇａａｇ ｃｔｇｇｇａａａｃｃ ａａｇｃｃｔａｔａｇ ｔｃａｇｇｃｃｇａｇ ａａｃｇｃｃａｔｇｇ
１０５０１ ｃａｃｇｇａａｇａａ ｇｃｃａｔｇｃｔｇｃ ｃｔｇｔｇａｇｃｃｃ ｃｔｃａｇａｇｇａｃ ａｃｔｇａｇｔｃａａ ａａａａｃｃｃｃａｃ
１０５６１ ｇｃｇｃｔｔｇｇａｇ ｇｃｇｃａｇｇａｔｇ ｇｇａａａａｇａａｇ ｇｔｇｇｃｇａｃｃｔ ｔｃｃｃｃａｃｃｃｔ ｔｃａａｔｃｔｇｇｇ
１０６２１ ｇｃｃｔｇａａｃｔｇ ｇａｇａｔｃａｇｃｔ ｇｔｇｇａｔｃｔｃｃ ａｇａａｇａｇｇｇａ ｃｔａｇｔｇｇｔｔａ ｇａｇｇａ
いくつかの実施形態において、ジカウイルスは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＵ５０１２１５．１のゲノム配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ジカウイルスは、ＰＲＶＡＢＣ５９株からである。いくつかの実施形態において、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＵ５０１２１５．１のゲノム配列は、配列番号２の配列を含む。いくつかの実施形態において、ジカウイルスは、配列番号２の配列と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するゲノム配列を含み得る。
いくつかの実施形態において、ジカウイルスは、配列番号２の配列によってコードされる少なくとも１つのポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態において、ジカウイルスは、配列番号２の配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドを含み得る。
したがって、いくつかの実施形態において、本開示の不活性化されたジカウイルスは、本明細書に開示されるワクチン及び／または免疫原性組成物のいずれかで使用され得る。例えば、本開示の不活性化されたジカウイルスは、それを必要とする対象におけるジカウイルス感染を治療もしくは予防するため、及び／またはそれを必要とする対象においてジカウイルスに指向する免疫応答、例えば、防御免疫応答を誘導するために有用な１つ以上の抗原を提供するために使用され得る。
本開示で使用されるジカウイルスは、細胞培養中の１つ以上の細胞から得られ得る（例えば、プラーク精製を介して）。ジカウイルスを生成するために当技術分野で即知である任意の好適な細胞が、使用され得、例えば、昆虫細胞（例えば、ＣＣＬ－１２５細胞、Ａａｇ－２細胞、ＲＭＬ－１２細胞、Ｃ６／３６細胞、Ｃ７－１０細胞、ＡＰ－６１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ－１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ－２細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ－３細胞、ＵＭ－ＡＶＥ１細胞、Ｍｏｓ．５５細胞、Ｓｕａ１Ｂ細胞、４ａ－３Ｂ細胞、Ｍｏｓ．４２細胞、ＭＳＱ４３細胞、ＬＳＢ－ＡＡ６９５ＢＢ細胞、ＮＩＩＤ－ＣＴＲ細胞、ＴＲＡ－１７１細胞などの蚊細胞、及びＡｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ、Ａｅｄｅｓ ｐｓｅｕｄｏｓｃｕｔｅｌｌａｒｉｓ、Ａｅｄｅｓ ｔｒｉｓｅｒｉａｔｕｓ、Ａｅｄｅｓ ｖｅｘａｎｓ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ａｌｂｉｍｕｓ、Ｃｕｌｅｘ ｑｕｉｎｑｕｅｆａｓｃｉａｔｕｓ、Ｃｕｌｅｘ ｔｈｅｉｌｅｒｉ、Ｃｕｌｅｘ ｔｒｉｔａｅｎｉｏｒｈｙｎｃｈｕｓ、Ｃｕｌｅｘ ｂｉｔａｅｎｉｏｒｈｙｎｃｈｕｓ、及び／またはＴｏｘｏｒｈｙｎｃｈｉｔｅｓ ａｍｂｏｉｎｅｎｓｉｓなどの蚊種からの追加の細胞もしくは細胞株）、及び哺乳動物細胞（例えば、ベロ細胞（サル腎臓から）、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞（サル腎臓から）、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４ ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）細胞、ＭＤＣＫ ３３０１６（ＷＯ９７／３７００１に記載されるように、寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９）細胞、ＢＨＫ２１－Ｆ細胞、ＨＫＣＣ細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）が含まれる。いくつかの実施形態において、ジカウイルス（例えば、ジカウイルスクローン単離株）は、非ヒト細胞から生成される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス（例えば、ジカウイルスクローン単離株）は、昆虫細胞から生成される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス（例えば、ジカウイルスクローン単離株）は、蚊細胞から生成される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス（例えば、ジカウイルスクローン単離株）は、哺乳動物細胞から生成される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス（例えば、ジカウイルスクローン単離株）は、ベロ細胞から生成される。
ジカウイルスは、構造的及び非構造的ポリペプチドの両方をコードするポジティブセンスの一本鎖ＲＮＡゲノムを所有する。ゲノムは、ウイルスの複製に役割を果たす５’－及び３’－末端領域の両方に非コード配列をさらに含む。これらのウイルスによってコードされる構造的ポリペプチドには、限定されないが、カプシド（Ｃ）、前駆体膜（ｐｒＭ）、及びエンベロープ（Ｅ）が含まれる。これらのウイルスによってコードされる非構造的（ＮＳ）ポリペプチドには、限定されないが、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、及びＮＳ５が含まれる。
特定の実施形態において、ジカウイルスは、ジカウイルス非構造的タンパク質１（ＮＳ１）における変異を含む。いくつかの実施形態において、ジカウイルスは、配列番号１の９８位、または配列番号１の９８位に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む。
いくつかの実施形態において、変異は、ＮＳ１ポリペプチド内である。例示的なジカウイルス株からの野生型ＮＳ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、以下のように示される：
ＤＶＧＣＳＶＤＦＳＫＫＥＴＲＣＧＴＧＶＦＶＹＮＤＶＥＡＷＲＤＲＹＫＹＨＰＤＳＰＲＲＬＡＡＡＶＫＱＡＷＥＤＧＩＣＧＩＳＳＶＳＲＭＥＮＩＭＷＲＳＶＥＧＥＬＮＡＩＬＥＥＮＧＶＱＬＴＶＶＶＧＳＶＫＮＰＭＷＲＧＰＱＲＬＰＶＰＶＮＥＬＰＨＧＷＫＡＷＧＫＳＹＦＶＲＡＡＫＴＮＮＳＦＶＶＤＧＤＴＬＫＥＣＰＬＫＨＲＡＷＮＳＦＬＶＥＤＨＧＦＧＶＦＨＴＳＶＷＬＫＶＲＥＤＹＳＬＥＣＤＰＡＶＩＧＴＡＶＫＧＫＥＡＶＨＳＤＬＧＹＷＩＥＳＥＫＮＤＴＷＲＬＫＲＡＨＬＩＥＭＫＴＣＥＷＰＫＳＨＴＬＷＴＤＧＩＥＥＳＤＬＩＩＰＫＳＬＡＧＰＬＳＨＨＮＴＲＥＧＹＲＴＱＭＫＧＰＷＨＳＥＥＬＥＩＲＦＥＥＣＰＧＴＫＶＨＶＥＥＴＣＧＴＲＧＰＳＬＲＳＴＴＡＳＧＲＶＩＥＥＷＣＣＲＥＣＴＭＰＰＬＳＦＲＡＫＤＧＣＷＹＧＭＥＩＲＰＲＫＥＰＥＳＮＬＶＲＳＭＶＴ（配列番号１）。
いくつかの実施形態において、ＮＳ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１の配列と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＮＳ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＵ５０１２１５．１（配列番号２）の配列によってコードされるアミノ酸配列からであり得る。いくつかの実施形態において、ＮＳ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＵ５０１２１５．１の配列によってコードされるアミノ酸配列のアミノ酸位置７９５～１１４５であり得る。いくつかの実施形態において、ＮＳ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、ジカウイルス株ＰＲＶＡＢＣ５９からであり得る。
「配列同一性」、「配列同一性％」、「同一性％」、「同一％」または「配列アライメント」は、第１のアミノ酸配列及び第２のアミノ酸配列の比較、または第１の核酸配列及び第２の核酸配列の比較を意味し、比較に基づいて割合として算出される。この算出の結果は、「同一割合」または「ＩＤ割合」として記載される。
一般に、配列アライメントを使用して、２つの異なるアプローチの１つで配列同一性を算出できる。第１のアプローチでは、単一の位置でのミスマッチ及びギャップの両方が、最終的な配列同一性の算出で非同一位置としてカウントされる。第２のアプローチでは、単一の位置でのミスマッチは、最終的な配列同一性の算出で非同一位置としてカウントされ、しかしながら、単一の位置でのギャップでは、最終的な配列同一性の算出で非同一位置としてカウント（無視）されない。換言すると、第２のアプローチでは、最終的な配列同一性の算出でギャップが無視される。これら２つのアプローチの違い、すなわち、単一の位置で非同一位置としてギャップをカウントするか、ギャップを無視することは、２つの配列間の配列同一性値に可変性を生じることができる。
いくつかの実施形態において、配列同一性は、アライメントを生成し、単一の位置でのミスマッチ及び単一の位置でのギャップの両方を最終的な配列同一性の算出における非同一位置としてカウントする同一性を算出するプログラムによって決定される。例えば、プログラムＮｅｅｄｌｅ（ＥＭＢＯＳ）は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）のアルゴリズムを実装しており、第１の配列及び第２の配列間のアライメントを第１に生産することにより、初期状態の設定ごとに配列同一性を算出し、次に、アライメントの長さにわたって同一位置の数をカウントし、次に、同一残基の数をアライメントの長さで割り、次に、この数に１００を掛けて、％配列同一性を生成する［％配列同一性＝（同一残基の＃／アライメントの長さ）ｘ１００）］。
配列同一性は、完全長にわたって両方の配列を示す対でのアライメントから算出でき、第１の配列及び第２の配列がそれらの完全長で示される（「グローバル配列同一性」）。例えば、プログラムＮｅｅｄｌｅ（ＥＭＢＯＳＳ）は、かかるアライメントを生成する；％配列同一性＝（同一残基の＃／アライメントの長さ）ｘ１００）］。
配列同一性は、第１の配列または第２の配列の局所領域のみを示す対のアライメントから算出できる（「局所同一性」）。例えば、プログラムＢｌａｓｔ （ＮＣＢＩ）は、かかるアライメントを生成する；％配列同一性＝（同一残基の＃／アライメントの長さ）ｘ１００）］。
配列アライメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズムを使用して生成されることが好ましい（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９７９）４８，ｐ．４４３－４５３）。好ましくは、プログラム「ＮＥＥＤＬＥ」（Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ（ＥＭＢＯＳＳ））は、プログラムの初期状態のパラメータと共に使用される（タンパク質についてはギャップオープン＝１０．０、ギャップ拡張＝０．５、及びマトリックス＝ＥＢＬＯＳＵＭ６２、ならびにヌクレオチドについてはマトリックス＝ＥＤＮＡＦＵＬＬ）。次に、配列同一性は、完全長にわたって両方の配列を示すアライメントから算出でき、第１の配列及び第２の配列がそれらの完全長で示される（「グローバル配列同一性」）。例えば、％配列同一性＝（同一残基の＃／アライメントの長さ）ｘ １００）］。
いくつかの実施形態において、変異は、ＮＳ１ポリペプチド内の１つ以上のアミノ酸位置で発生する。いくつかの実施形態において、変異は、対のアライメントアルゴリズムを使用して配列番号１にアライメントされた場合、配列番号１の９８位、または配列番号１の９８位に対応する位置で生じる。いくつかの実施形態において、９８位の変異は、トリプトファンからグリシンへの置換である。
いくつかの実施形態において、ジカウイルスは、配列番号１の９８位、または配列番号１の９８位に対応する位置に変異を含む。配列番号１の９８位に対応する位置は、対のアライメントアルゴリズムを使用して、ＮＳ１タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１にアライメントすることにより決定できる。配列番号１の９８位のトリプトファン残基に対応するジカウイルス以外のウイルス中のアミノ酸残基は、これらの残基が囲われている本出願の図７に示される。いくつかの実施形態において、９８位の変異は、トリプトファンからグリシンへの置換である。いくつかの実施形態において、９８位の変異は、配列番号１の９８位でのトリプトファンからグリシンへの置換である。いくつかの実施形態において、９８位の変異は、対のアライメントアルゴリズムを使用して配列番号１にアライメントされた場合、配列番号１の９８位に対応する位置でのトリプトファンからグリシンへの置換である。
いくつかの実施形態において、ジカウイルスは、ＮＳ１タンパク質内の変異、ならびにＣ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、及びＮＳ５ウイルスタンパク質のうちの１つ以上に少なくとも１つの変異を含む。いくつかの実施形態において、ジカウイルスは、ＮＳ１タンパク質内に１つ以上の変異を含み、ならびにＣ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、及びＮＳ５ウイルスタンパク質のうちの１つ以上に少なくとも１つの変異を含まない。いくつかの実施形態において、ジカウイルスは、ＮＳ１タンパク質内に変異を含み、及びエンベロープタンパク質Ｅ内に少なくとも１つの変異を含まない。いくつかの実施形態において、全体の不活性化されたウイルスは、ジカウイルス非構造的タンパク質１（ＮＳ１）に少なくとも１つの変異を含み、及びジカウイルスエンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）に変異を含まない。いくつかの実施形態において、ジカウイルスは、配列番号１の９８位、または配列番号１の９８位に対応する位置に変異を含み、エンベロープタンパク質Ｅ内に変異を含まない。いくつかの実施形態において、全体の不活性化されたジカウイルスは、配列番号１の９８位、または配列番号１の９８位に対応する位置に変異を含み、ジカウイルスエンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）に変異を含まない。いくつかの実施形態において、全体の不活性化されたウイルスは、ジカウイルス非構造的タンパク質１（ＮＳ１）に少なくとも１つの変異を含み、エンベロープタンパク質をコードする配列は、配列番号２の対応する配列と同じである。いくつかの実施形態において、ジカウイルスは、配列番号１の９８位、または配列番号１の９８位に対応する位置に変異を含み、及びエンベロープタンパク質をコードする配列は、配列番号２の対応する配列と同じである。いくつかの実施形態において、全体の不活性化されたジカウイルスは、配列番号１の９８位、または配列番号１の９８位に対応する位置に変異を含み、及びエンベロープタンパク質をコードする配列は、配列番号２の対応する配列と同じである。いくつかの実施形態において、全体の不活性化されたジカウイルスは、配列番号１の９８位、または配列番号１の９８位に対応する位置にトリプトファンからグリシンへの置換を含み、及びエンベロープタンパク質をコードする配列は、配列番号２の対応する配列と同じである。
いくつかの実施形態において、ジカウイルスは、少なくとも１つの変異を欠くジカウイルスと比較して、遺伝的安定性を増強する少なくとも１つの変異を含む。いくつかの実施形態において、ジカウイルスは、少なくとも１つの変異を欠くジカウイルスと比較して、ウイルス複製を増強する少なくとも１つの変異を含む。いくつかの実施形態において、ジカウイルスは、ジカウイルスのエンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）内などの望ましくない変異の発生を低減、またはそうでなければ阻害する少なくとも１つの変異を含む。
本開示の上記の実施形態において、例示的な対のアライメントアルゴリズムは、初期状態のパラメータを使用するＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈグローバルアライメントアルゴリズムである（例えば、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用して、ギャップオープニングペナルティ＝１０．０を伴って、及びギャップ拡張ペナルティ＝０．５を伴って）。このアルゴリズムは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルツールに便利に実装される。
いくつかの実施形態において、不活性化されたジカウイルスは、ワクチン及び免疫原性組成物に使用され得る。例えば、不活性化されたジカウイルスは、それを必要とする対象におけるジカウイルス感染を治療もしくは予防するため、及び／またはそれを必要とする対象においてジカウイルスに指向する免疫応答、例えば、防御免疫応答を誘導するのに有用であり得る。
ワクチン及び免疫原性組成物の製造
本開示の他の態様は、変異を有するジカウイルスなどの精製され不活性化された全ウイルスを含むジカウイルスワクチン及び免疫原性組成物に関し、変異とは本明細書に記載されるように、配列番号１の９８位、または配列番号１の９８位に対応する位置でのトリプトファンからグリシンへの置換である。いくつかの実施形態において、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む、精製され不活性化された全ジカウイルスを含み、ジカウイルスは、ＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。いくつかの実施形態において、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む、精製され不活性化された全ジカウイルスを含み、ジカウイルスは、配列番号２によるゲノム配列を含むＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。一実施形態において、ワクチン及び免疫原性組成物は、プラーク精製されたクローンジカウイルス単離株を含む。かかるワクチン及び免疫原性組成物は、例えば、それを必要とする対象におけるジカウイルス感染を治療もしくは予防するため、及び／またはそれを必要とする対象におけるジカウイルスに指向する免疫応答、例えば、防御免疫応答を誘導するのに有用であり得る。
本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物の製造は、ジカウイルスの増殖を含む。細胞培養における増殖は、本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物を調製するための方法である。ウイルス増殖のための細胞は、浮遊または付着条件で培養され得る。
本開示の少なくとも１つのウイルスの増殖に好適な細胞株には、昆虫細胞（例えば、本明細書に記載の蚊細胞、ベロ細胞（サル腎臓から）、馬、牛（例えば、ＭＤＢＫ細胞）、羊、イヌ（例えば、イヌ腎臓からのＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４ ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）またはＭＤＣＫ ３３０１６、ＷＯ９７／３７００１に記載される寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９）、ネコ、及びげっ歯類（例えば、ＢＨＫ２１－Ｆ、ＨＫＣＣ細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）などのハムスター細胞）が含まれるが、これらに限定されず、例えば、成体、新生児、胎児、及び胚を含む、多種多様な発達段階から得られ得る。特定の実施形態において、細胞は、不死化される（例えば、ＷＯ ０１／３８３６２及びＷＯ ０２／４０６６５に記載され、ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０のもとで寄託されたＰＥＲＣ．６細胞）。好ましい実施形態において、哺乳動物細胞が利用され、かつ以下の非限定的な細胞種のうちの１つ以上から選択及び／またはそれらから誘導され得る：線維芽細胞（例えば、真皮、肺）、内皮細胞（例えば、大動脈、冠状動脈、肺性、血管、皮膚微小血管、臍帯）、肝細胞、ケラチノサイト、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ、樹状細胞）、乳腺細胞（例えば、上皮細胞）、平滑筋細胞（例えば、血管、大動脈、冠状動脈、動脈、子宮、気管支、子宮頸部、網膜周皮細胞）、メラノサイト、神経細胞（例えば、星状細胞）、前立腺細胞（例えば、上皮、平滑筋）、腎細胞（例えば、上皮、メサンギウム、近位尿細管）、骨格細胞（例えば、軟骨細胞、破骨細胞、骨芽細胞）、筋細胞（例えば、筋芽細胞、骨格、平滑、気管支）、肝臓細胞、網膜芽細胞、及び間質細胞。ＷＯ９７／３７０００及びＷＯ９７／３７００１は、浮遊及び無血清培地中で増殖することが可能であり、ウイルスの生成及び複製において有用である、動物細胞及び細胞株の生成を記載する。一実施形態において、少なくとも１つのウイルスを増殖させるために使用される細胞は、ベロ細胞である。
上記の細胞種についての培養条件は既知であり、様々な刊行物に記載される。代替的には、培養培地、サプリメント、及び条件は、例えば、Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｅａｓｔ Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，Ｎ．Ｊ．）のカタログ及び追加の文献に記載されるように、商業的に購入され得る。
特定の実施形態において、本明細書に記載される方法で使用される細胞は、無血清及び／または無タンパク質培地で培養される。培地は、それがヒトまたは動物起源の血清からの任意の添加物を含まない場合、本開示の状況下では無血清培地と称される。無タンパク質とは、タンパク質、増殖因子、他のタンパク質添加物、及び非血清タンパク質を除いて細胞の増殖が起こる培養を意味するが、ウイルスの増殖に必要であり得るトリプシンまたは他のプロテアーゼなどのタンパク質を任意に含むことができる。かかる培養において増殖する細胞は、自然にタンパク質のそれ自体を含む。
既知の無血清培地には、Ｉｓｃｏｖｅ‘ｓ培地、Ｕｌｔｒａ－ＣＨＯ培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）またはＥＸ－ＣＥＬＬ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が含まれる。通常の血清含有培地には、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）または最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｅａｇｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３０，４３２（１９５９））、またはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭまたはＥＤＭ）が含まれ、通常、最大１０％のウシ胎児血清または類似の添加物と共に使用される。通常、最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｅａｇｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３０，４３２（１９５９））またはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭまたはＥＤＭ）は、任意の血清含有サプリメントなしで使用され得る。ＰＦ－ＣＨＯ（ＪＨＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）などの無タンパク質培地、ＰｒｏＣＨＯ ４ＣＤＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）またはＳＭＩＦ ７（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの化学的に定義された培地、及びＰｒｉｍａｃｔｏｎｅ、Ｐｅｐｔｉｃａｓｅ、もしくはＨｙＰｅｐ．ＴＭなどの分裂促進ペプチド（全てＱｕｅｓｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから）、またはラクトアルブミン加水分解物（Ｇｉｂｃｏ及び他の製造業者）もまた、先行技術において十分に知られている。植物加水分解物を基準とした培地添加物には、ウイルス、マイコプラズマ、または未知の感染因子による汚染を排除できるという特別な利点を有する。
細胞培養条件（温度、細胞密度、ｐＨ値など）は、本開示に従って利用される細胞株の適合性により、非常に広い範囲にわたって変化し、特定のウイルス株の要件に適合させることができる。
培養細胞においてウイルスを増殖させる方法は、一般に、培養された細胞に培養すべき株を接種し、例えば、ウイルス力価または抗原発現によって決定されるようなウイルス増殖のための所望される期間、感染細胞を培養し（例えば、接種後２４～１６８時間）、増殖したウイルスを収集するステップを含む。いくつかの実施形態において、ウイルスは、プラーク精製を介して収集される。培養細胞に、ウイルス（ＰＦＵまたはＴＣＩＤ５０で測定）と細胞の比率が１：５００～１：１、好ましくは１：１００～１：５で接種される。ウイルスは、細胞の浮遊液に加えられるか、または細胞の単層に適用され、ウイルスは、２５℃～４０℃、好ましくは２８℃～３８℃で、少なくとも１０分、少なくとも２０分、少なくとも３０分、少なくとも４０分、少なくとも５０分、少なくとも６０分であるが、通常は３００分未満で細胞に吸収される。感染した細胞培養物（例えば、単層）は、上清（細胞を含まない）を採取する、凍結融解する、または酵素作用のいずれかにより除去し、採取した培養上清のウイルス含有量を増加させる。採取した液体は、その後、不活性化されるか、冷凍保存される。培養した細胞は、約０．０００１～１０、好ましくは０．００２～５、より好ましくは０．００１～２の感染効率（「ＭＯＩ」）で感染し得る。さらにより好ましくは、細胞は、約０．０１のＭＯＩで感染する。感染中、培養培地の細胞培養容器の面積に対する比率は、細胞の培養中よりも低くなり得る。この比率を低く保つと、ウイルスが細胞に感染する可能性が最大になる。感染した細胞の上清は、感染後３０～６０時間、または感染後３～１０日で採取され得る。特定の好ましい実施形態において、感染した細胞の上清は、感染後３～７日で採取される。より好ましくは、感染した細胞の上清は、感染後３～５日で採取される。いくつかの実施形態において、プロテアーゼ（例えば、トリプシン）は、ウイルス放出を可能にするために細胞培養中に添加され得、プロテアーゼは、培養中の任意の好適な段階で添加され得る。代替的には、特定の実施形態において、感染した細胞培養物の上清が採取され得、ウイルスを単離するか、またはそうでなければ上清から精製され得る。
ウイルス種菌及びウイルス培養物は、好ましくは、単純ヘルペスウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス３、ＳＡＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルス、及び／またはパルボウイルス（ＷＯ２００６／０２７６９８）を含まない（すなわち、検査され、それによる汚染について否定的な結果が与えられているだろう）。
ウイルスが、細胞株で増殖されている場合、宿主細胞ＤＮＡの発がん活性を最小限に抑えるために、最終的なワクチンに残存する細胞株ＤＮＡの量を最小限に抑えることが標準的な実行である。汚染ＤＮＡは、標準的な精製手順、例えば、クロマトグラフィーなどを使用して、ワクチン調製中に除去できる。残留宿主細胞ＤＮＡの除去は、例えば、ＤＮａｓｅを使用することによるヌクレアーゼ処理によって強化できる。参考文献（Ｌｕｎｄｂｌａｄ（２００１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１９５－１９７，Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ：Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （ＣＤＥＲ） Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＣＶＭ）．Ｍａｙ ２００１．）に開示される宿主細胞ＤＮＡ汚染を低減する簡便な方法は、最初に、ウイルスの増殖中に使用され得るＤＮａｓｅ（例えば、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）、その後、ビリオンの破壊中に使用され得るカチオン性洗剤（例えば、ＣＴＡＢ）を使用する２段階の処理を伴う。β－プロピオラクトン処理による除去も使用できる。一実施形態において、汚染ＤＮＡは、培養上清のベンゾナーゼ処理によって除去される。
抗原の生産
ジカウイルスは、当技術分野で知られている任意の好適な方法によって生成及び／または精製もしくは単離され得る。一実施形態において、本開示の抗原は、精製され不活性化された全ジカウイルスである。
いくつかの実施形態において、不活性化されたウイルスは、「ワクチン及び免疫原性組成物の製造」と題された上記段落に記載されるように製造することができる。
特定の実施形態において、本開示のジカウイルスは、非ヒト細胞を培養することによって生成され得る。本開示のジカウイルスの生成に好適な細胞株は、昆虫細胞（例えば、本明細書に記載される任意の蚊細胞）を含み得る。本開示のジカウイルスの生成に好適な細胞株はまた、哺乳動物起源の細胞であり得、及びベロ細胞（サル腎臓から）、馬、牛（例えば、ＭＤＢＫ細胞）、羊、イヌ（例えば、イヌ腎臓からのＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４ ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）またはＭＤＣＫ ３３０１６、ＷＯ９７／３７００１に記載される寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９）、ネコ、及びげっ歯類（例えば、ＢＨＫ２１－Ｆ、ＨＫＣＣ細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）などのハムスター細胞）が含まれるが、これらに限定されず、例えば、成体、新生児、胎児、及び胚を含む、多種多様な発達段階から得られ得る。特定の実施形態において、細胞は、不死化される（例えば、ＷＯ ０１／３８３６２及びＷＯ ０２／４０６６５に記載され、ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０のもとで寄託されたＰＥＲＣ．６細胞）。好ましい実施形態において、哺乳動物細胞が利用され、かつ以下の非限定的な細胞種のうちの１つ以上から選択及び／またはそれらから誘導され得る：線維芽細胞（例えば、真皮、肺）、内皮細胞（例えば、大動脈、冠状動脈、肺性、血管、皮膚微小血管、臍帯）、肝細胞、ケラチノサイト、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ、樹状細胞）、乳腺細胞（例えば、上皮細胞）、平滑筋細胞（例えば、血管、大動脈、冠状動脈、動脈、子宮、気管支、子宮頸部、網膜周皮細胞）、メラノサイト、神経細胞（例えば、星状細胞）、前立腺細胞（例えば、上皮、平滑筋）、腎細胞（例えば、上皮、メサンギウム、近位尿細管）、骨格細胞（例えば、軟骨細胞、破骨細胞、骨芽細胞）、筋細胞（例えば、筋芽細胞、骨格、平滑、気管支）、肝臓細胞、網膜芽細胞、及び間質細胞。ＷＯ９７／３７０００及びＷＯ９７／３７００１は、浮遊及び無血清培地中で増殖することが可能であり、ウイルス抗原の生成に有用である、動物細胞及び細胞株の生成を記載する。特定の実施形態において、非ヒト細胞は、無血清培地で培養される。特定の実施形態において、本開示のジカウイルスは、ベロ細胞を培養することによって生成され得る。
ウイルス不活性化
本開示の特定の実施形態は、ジカウイルスワクチン及び／または精製され不活性化されたジカウイルスを含む免疫原性組成物に関する。本明細書で使用される「不活性化されたジカウイルス」という用語は、有効量のホルマリンを用いた処理などの不活性化方法で処理されているジカウイルスを含むことが意図される。特に、不活性化されたジカウイルスは、ジカウイルスが、約０．０１％ｗ／ｖの量のホルムアルデヒドで２０℃～２４℃の温度で１０日間処理する方法により得ることができる／得られる。不活性化されたジカウイルスは、不活性化されていないジカウイルスに感染できる宿主細胞には、もはや感染できない。一実施形態において、不活性化されたジカウイルスは、もはやベロ細胞に感染することができず、ベロ細胞に細胞変性効果を及ぼすことができない。
「精製されたジカウイルス」という用語は、ジカウイルスが以下に記載されるような精製プロセスに供されたことを意味する。精製されたジカウイルスは、非精製ジカウイルスよりも低いベロ細胞タンパク質などの宿主細胞タンパク質、及びベロ細胞ＤＮＡなどの宿主細胞ＤＮＡの含有量を有する。精製されたジカウイルスの純度は、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定することができる。サイズ排除クロマトグラフィーにおける精製されたジカウイルスのメインピークは、サイズ排除クロマトグラフィーにおける曲線下の総面積の８５％超、サイズ排除クロマトグラフィーにおける曲線下の総面積の９０％超、サイズ排除クロマトグラフィーにおける曲線下の総面積の９５％超であり得る。このような結果は、「精製された」ジカウイルスと見なされる。
したがって、「精製され不活性化された全ジカウイルス」という用語は、精製されたジカウイルスが、０．０１％ｗ／ｖの量のホルムアルデヒドで２０℃～２４℃の温度で１０日間処理する方法により得ることができる／得られるジカウイルスを指し、サイズ排除クロマトグラフィーにおける曲線下の総面積の少なくとも８５％のメインピークを提供する。いくつかの実施形態において、「精製され不活性化された全ジカウイルス」という用語は、精製されたジカウイルスが、０．０１％ｗ／ｖの量のホルムアルデヒドで２０℃～２４℃の温度で１０日間処理する方法により得ることができる／得られるジカウイルスを指し、サイズ排除クロマトグラフィーにおける曲線下の総面積の少なくとも９０％のメインピークを提供する。いくつかの実施形態において、「精製され不活性化された全ジカウイルス」という用語は、精製されたジカウイルスが、０．０１％ｗ／ｖの量のホルムアルデヒドで２０℃～２４℃の温度で１０日間処理する方法により得ることができる／得られるジカウイルスを指し、サイズ排除クロマトグラフィーにおける曲線下の総面積の少なくとも９５％のメインピークを提供する。特定の実施形態において、精製され不活性化された全ジカウイルスは、プラーク精製により得られる／得ることができるクローン単離株である。
ウイルスを不活性化または殺傷して、哺乳動物細胞に感染する能力を破壊するが、ウイルスの二次、三次、または四次構造、及び免疫原性エピトープは破壊しない方法は、当技術分野で即知である。かかる方法は、化学的手段及び物理的手段の両方を含む。ウイルスを不活性化するための好適な手段には、限定されないが、界面活性剤、ホルマリン（本明細書では「ホルムアルデヒド」とも称される）、過酸化水素、ベータ－プロピオラクトン（ＢＰＬ）、バイナリエチルアミン（ＢＥＩ）、アセチルエチレンイミン、熱、電磁放射、Ｘ線放射、ガンマ放射、紫外線放射（ＵＶ放射）、ＵＶ－Ａ放射、ＵＶ－Ｂ放射、ＵＶ－Ｃ放射、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）、過酸化水素、及びこれらの任意の組み合わせから選択される有効量の１つ以上の薬剤を用いた処理が含まれる。すでに上述したように、本出願の目的のために、「ホルマリン」及び「ホルムアルデヒド」という用語は互換的に使用される。本明細書でホルムアルデヒドの濃度に言及する場合、それはホルマリンの濃度ではなくホルムアルデヒドの濃度を指す。したがって、「０．０１％（ｗ／ｖ）のホルムアルデヒド濃度」は、０．０１％（ｗ／ｖ）ホルムアルデヒドを指し、ホルマリンストック溶液（通常、質量で３７％ホルムアルデヒドを含む）中のホルムアルデヒド濃度についてこの濃度をさらに補正する必要はない。例えば、ウイルス調製物中のこのようなホルムアルデヒド濃度は、ホルマリンを１．８５％（ｗ／ｖ）のホルムアルデヒド含有量を有する作業溶液に希釈することで得ることができ、次に、ジカウイルス調製物などのウイルス調製物と混合する際に必要な濃度にさらに希釈される。
本開示の特定の実施形態において、少なくとも１つのウイルスは、化学的に不活性化される。化学的不活性化のための薬剤及び化学的不活性化の方法は、当該分野で周知であり、本明細書に記載される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのウイルスは、ＢＰＬ、過酸化水素、ホルマリン、またはＢＥＩのうちの１つ以上を用いて化学的に不活性化される。少なくとも１つのウイルスが、ＢＰＬを用いて化学的に不活性化される特定の実施形態では、ウイルスは、１つ以上の修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の修飾は、修飾された核酸を含み得る。いくつかの実施形態において、修飾された核酸は、アルキル化された核酸である。他の実施形態において、１つ以上の修飾は、修飾されたポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態において、修飾されたポリペプチドは、修飾されたシステイン、メチオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、リジン、セリン、及びスレオニンのうちの１つ以上を含む修飾されたアミノ酸残基を含む。
少なくとも１つのウイルスが、ホルマリンを用いて化学的に不活性化される特定の実施形態では、不活性化されたウイルスは、１つ以上の修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の修飾は、修飾されたポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の修飾は、架橋ポリペプチドを含み得る。少なくとも１つのウイルスが、ホルマリンで化学的に不活性化されるいくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、ホルマリンをさらに含む。少なくとも１つのウイルスが、ＢＥＩを用いて化学的に不活性化される特定の実施形態では、ウイルスは、１つ以上の修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の修飾は、修飾された核酸を含み得る。いくつかの実施形態において、修飾された核酸は、アルキル化された核酸である。
少なくとも１つのウイルスが、ホルマリンで化学的に不活性化されるいくつかの実施形態では、任意の残りの未反応のホルマリンは、メタ重亜硫酸ナトリウムで中和されるか、透析されるか、及び／またはバッファー交換され、残りの未反応のホルマリンを除去し得る。いくつかの実施形態において、メタ重亜硫酸ナトリウムは、過剰に添加される。いくつかの実施形態において、溶液は、インラインスタティックミキサーなどのミキサーを使用して混合され、その後ろ過またはさらに精製され得る（例えば、クロスフローろ過システムを使用して）。
本開示の特定実施形態は、ジカウイルス調製物を不活性化する方法に関する。いくつかの実施形態において、方法は、
（ａ）試験管内で培養された１つ以上の細胞からジカウイルス調製物を単離することであって、細胞が、ジカウイルス調製物を生成するために使用され、ジカウイルス調製物を単離することが、
（ｉ）深層ろ過、
（ｉｉ）バッファー交換及び／または希釈、
（ｉｉｉ）イオン交換クロマトグラフィーから選択される１つ以上のステップを含む、単離することと、
（ｂ）ジカウイルス調製物をホルムアルデヒドで処理することであって、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度と、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果が、０．０２５～０．５である、処理することとを含む。
例えば、ホルムアルデヒド濃度が０．０１％（ｗ／ｖ）であり、ホルムアルデヒドによる処理の期間が１０日である場合、ホルムアルデヒド濃度のホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果は、０．０１×１０＝０．１である。
いくつかの実施形態において、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度の、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果は、０．０５～０．２５である。いくつかの実施形態において、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度の、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果は、０．０７５～０．１５である。いくつかの実施形態において、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度の、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果は、０．１である。
いくつかの実施形態において、ホルムアルデヒド濃度は、０．００５％（ｗ／ｖ）～０．０２％（ｗ／ｖ）である。いくつかの実施形態において、ホルムアルデヒド濃度は、０．００７５％（ｗ／ｖ）～０．０１５％（ｗ／ｖ）である。いくつかの実施形態において、ホルムアルデヒド濃度は、０．０１（ｗ／ｖ）である。
いくつかの実施形態において、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度の、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果は、０．０２５～０．５であり、ホルムアルデヒド濃度は、０．００５％（ｗ／ｖ）～０．０２％（ｗ／ｖ）である。いくつかの実施形態において、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度の、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果は、０．０２５～０．５であり、ホルムアルデヒド濃度は、０．００７５％（ｗ／ｖ）～０．０１５％（ｗ／ｖ）である。いくつかの実施形態において、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度の、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果は、０．０２５～０．５であり、ホルムアルデヒド濃度は、０．０１（ｗ／ｖ）である。
いくつかの実施形態において、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度の、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果は、０．０５～０．２５であり、ホルムアルデヒド濃度は、０．００５％（ｗ／ｖ）～０．０２％（ｗ／ｖ）である。いくつかの実施形態において、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度の、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果は、０．０５～０．２５であり、ホルムアルデヒド濃度は、０．００７５％（ｗ／ｖ）～０．０１５％（ｗ／ｖ）である。いくつかの実施形態において、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度の、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果は、０．０５～０．２５であり、ホルムアルデヒド濃度は、０．０１（ｗ／ｖ）である。
いくつかの実施形態において、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度の、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果は、０．０７５～０．１５であり、ホルムアルデヒド濃度は、０．００５％（ｗ／ｖ）～０．０２％（ｗ／ｖ）である。いくつかの実施形態において、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度の、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果は、０．０７５～０．１５であり、ホルムアルデヒド濃度は、０．００７５％（ｗ／ｖ）～０．０１５％（ｗ／ｖ）である。いくつかの実施形態において、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度の、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果は、０．０７５～０．１５であり、ホルムアルデヒド濃度は、０．０１（ｗ／ｖ）である。
いくつかの実施形態において、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度の、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果は、０．１であり、ホルムアルデヒド濃度は、０．００５％（ｗ／ｖ）～０．０２％（ｗ／ｖ）である。いくつかの実施形態において、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度の、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果は、０．１であり、ホルムアルデヒド濃度は、０．００７５％（ｗ／ｖ）～０．０１５％（ｗ／ｖ）である。いくつかの実施形態において、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度の、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果は、０．１であり、ホルムアルデヒド濃度は、０．０１（ｗ／ｖ）である。
いくつかの実施形態において、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度の、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果は、０．０２５～０．５であり、ホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間は、８～１２日である。いくつかの実施形態において、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度の、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果は、０．０２５～０．５であり、ホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間は、９～１１日である。いくつかの実施形態において、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度の、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果は、０．０２５～０．５であり、ホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間は、１０日である。
いくつかの実施形態において、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度の、ホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果は、０．０５～０．２５であり、ホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間は、８～１２日である。いくつかの実施形態において、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度の、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果は、０．０５～０．２５であり、ホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間は、９～１１日である。いくつかの実施形態において、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度の、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果は、０．０５～０．２５であり、ホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間は、１０日である。
いくつかの実施形態において、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度の、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果は、０．０７５～０．１５であり、ホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間は、８～１２日である。いくつかの実施形態において、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度の、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果は、０．０７５～０．１５であり、ホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間は、９～１１日である。いくつかの実施形態において、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度の、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果は、０．０７５～０．１５であり、ホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間は、１０日である。
いくつかの実施形態において、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度の、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果は、０．１であり、ホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間は、８～１２日である。いくつかの実施形態において、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度の、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果は、０．１であり、ホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間は、９～１１日である。いくつかの実施形態において、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度の、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果は、０．１であり、ホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間は、１０日である。
いくつかの実施形態において、細胞は、非ヒト細胞である。好適な非ヒト哺乳動物細胞には、これらに限定されないが、ベロ細胞、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４ ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）細胞、ＭＤＣＫ ３３０１６（ＷＯ９７／３７００１に記載される寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９）細胞、ＢＨＫ２１－Ｆ細胞、ＨＫＣＣ細胞、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）が挙げられる。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、ベロ細胞である。
方法の特定の実施形態において、ジカウイルス調製物は、約２℃～約４２℃の範囲の温度で、ホルマリンで処理される。例えば、ジカウイルス調製物は、約２℃～約４２℃、約２℃～約８℃、約１５℃～約３７℃、約１７℃～約２７℃、約２０℃～約２５℃の範囲の温度、または約２℃、約４℃、約８℃、約１０℃、約１５℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３７℃、もしくは約４２℃の温度で、ホルマリンで処理され得る。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、１５℃～３０℃の温度で、ホルマリンで処理される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、１８℃～２５℃の温度で、ホルマリンで処理される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、室温で、ホルマリンで処理される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、２２℃の温度で、ホルマリンで処理される。
いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、少なくとも１日間ホルマリンで処理される。例えば、ジカウイルス調製物は、約１日、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、少なくとも約１６日、少なくとも約１７日、少なくとも約１８日、少なくとも約１９日、少なくとも約２０日、少なくとも約２１日、少なくとも約２２日、少なくとも約２３日、少なくとも約２４日、少なくとも約２５日、少なくとも約２６日、少なくとも約２７日、少なくとも約２８日、少なくとも約２９日、少なくとも約３０日、またはそれ以上の間、ホルマリンで処理され得る。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、少なくとも９日間ホルマリンで処理される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、少なくとも１１日間ホルマリンで処理される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、少なくとも１４日間ホルマリンで処理される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、少なくとも２０日間ホルマリンで処理される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、少なくとも３０日間ホルマリンで処理される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、８～１２日間ホルマリンで処理される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、９～１１日間ホルマリンで処理される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、１０日間ホルマリンで処理される。
不活性化処理の期間の途中で、ウイルス調製物及びホルマリンの混合物は、凝集体を除去するためにろ過され得る。ろ過の後、ウイルス調製物及びホルマリンの混合物は、新しい容器に移され、不活性化処理の期間の終了までにホルマリンでさらに処理される。いくつかの実施形態において、ウイルス調製物及びホルマリンの混合物は、全体のホルマリン処理の期間が８～１２日である場合に、ホルマリン処理の４～６日後にろ過される。いくつかの実施形態において、ウイルス調製物及びホルマリンの混合物は、全体のホルマリン処理の期間が９～１１日である場合に、ホルマリン処理の５～６日後にろ過される。いくつかの実施形態において、ウイルス調製物及びホルマリンの混合物は、全体のホルマリン処理の期間が１０日である場合に、ホルマリン処理の５日後にろ過される。このステップの好適なフィルターは、０．２μｍのフィルターである。
いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、１５℃～３０℃の温度で８～１２日間、０．００５～０．０２％（ｗ／ｖ）のホルマリンで処理される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、１５℃～３０℃の温度で９～１１日間、０．００５～０．０２％（ｗ／ｖ）のホルマリンで処理される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、１５℃～３０℃の温度で１０日間、０．００５～０．０２％（ｗ／ｖ）のホルマリンで処理される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、１５℃～３０℃の温度で８～１２日間、０．００８～０．０１５％（ｗ／ｖ）のホルマリンで処理される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、１５℃～３０℃の温度で９～１１日間、０．００８～０．０１５％（ｗ／ｖ）のホルマリンで処理される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、１５℃～３０℃の温度で１０日間、０．００８～０．０１５％（ｗ／ｖ）のホルマリンで処理される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、１５℃～３０℃の温度で８～１２日間、０．０１％（ｗ／ｖ）のホルマリンで処理される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、１５℃～３０℃の温度で９～１１日間、０．０１％（ｗ／ｖ）のホルマリンで処理される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、１５℃～３０℃の温度で１０日間、０．０１％（ｗ／ｖ）のホルマリンで処理される。
いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、１８℃～２５℃の温度で８～１２日間、０．００５～０．０２％（ｗ／ｖ）のホルマリンで処理される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、１８℃～２５℃の温度で９～１１日間、０．００５～０．０２％（ｗ／ｖ）のホルマリンで処理される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、１８℃～２５℃の温度で１０日間、０．００５～０．０２％（ｗ／ｖ）のホルマリンで処理される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、１８℃～２５℃の温度で８～１２日間、０．００８～０．０１５％（ｗ／ｖ）のホルマリンで処理される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、１８℃～２５℃の温度で９～１１日間、０．００８～０．０１５％（ｗ／ｖ）のホルマリンで処理される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、１８℃～２５℃の温度で１０日間、０．００８～０．０１５％（ｗ／ｖ）のホルマリンで処理される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、１８℃～２５℃の温度で８～１２日間、０．０１％（ｗ／ｖ）のホルマリンで処理される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、１８℃～２５℃の温度で９～１１日間、０．０１％（ｗ／ｖ）のホルマリンで処理される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、１８℃～２５℃の温度で１０日間、０．０１％（ｗ／ｖ）のホルマリンで処理される。
いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、２２℃の温度で８～１２日間、０．００５～０．０２％（ｗ／ｖ）のホルマリンで処理される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、２２℃の温度で９～１１日間、０．００５～０．０２％（ｗ／ｖ）のホルマリンで処理される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、２２℃の温度で１０日間、０．００５～０．０２％（ｗ／ｖ）のホルマリンで処理される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、２２℃の温度で８～１２日間、０．００８～０．０１５％（ｗ／ｖ）のホルマリンで処理される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、２２℃の温度で９～１１日間、０．００８～０．０１５％（ｗ／ｖ）のホルマリンで処理される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、２２℃の温度で１０日間、０．００８～０．０１５％（ｗ／ｖ）のホルマリンで処理される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、２２℃の温度で８～１２日間、０．０１％（ｗ／ｖ）のホルマリンで処理される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、２２℃の温度で９～１１日間、０．０１％（ｗ／ｖ）のホルマリンで処理される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、２２℃の温度で１０日間、０．０１％（ｗ／ｖ）のホルマリンで処理される。
不活性化された全ジカウイルス調製物は、方法により得ることができる／得られると見なされ、ジカウイルスは、２２℃の温度で１４日間、約０．０２％ｗ／ｖの範囲の量のホルムアルデヒドで処理される。いくつかの実施形態において、不活性化された全ジカウイルス調製物は、方法により得ることができる／得られると見なされ、ジカウイルスは、２２℃の温度で１０日間、約０．０１％ｗ／ｖの量のホルムアルデヒドで処理される。
いくつかの実施形態において、方法は、未反応のホルマリンを、有効量のメタ重亜硫酸ナトリウムで中和することをさらに含む。いくつかの実施形態において、有効量のメタ重亜硫酸ナトリウムは、約０．０１ｍＭ～約１００ｍＭの範囲である。例えば、メタ重亜硫酸ナトリウムは、約０．０１ｍＭ～約１００ｍＭ、約０．１ｍＭ～約５０ｍＭ、約０．５ｍＭ～約２０ｍＭ、もしくは約１ｍＭ～約１０ｍＭの有効濃度、または約０．０１ｍＭ、約０．０５ｍＭ、約０．１ｍＭ、約０．２５ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．７５ｍＭ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約７５ｍＭ、もしくは約１００ｍＭの濃度で添加され得る。いくつかの実施形態において、ホルマリンは、約２ｍＭのメタ重亜硫酸ナトリウムで中和される。
いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、過酸化水素で処理される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、２０℃～３０℃の任意の温度で５～１２０分間、０．１～３％、または０．１～１％の範囲の濃度で、過酸化水素で処理される。いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物は、０．０１％の最終濃度で６０分以下の間、過酸化水素で処理される。
いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）ウイルス調製物を生成するために使用される試験管内で培養された１つ以上の細胞からジカウイルス調製物を単離することと、（ｂ）１つ以上の精製ステップによってウイルス調製物を精製することと、（ｃ）有効量のホルマリンでウイルス調製物を処理することと、（ｄ）有効量のメタ重亜硫酸ナトリウムでウイルス調製物を中和することと、（ｅ）不活性化されたジカウイルスを含む薬学的組成物を調製することとを含む。限定することなく、クロスフローろ過（ＣＦＦ）、マルチモーダルクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、及び／またはアニオン交換クロマトグラフィーを使用することを含めて、当技術分野で既知のウイルス調製物を精製する任意の方法は、ジカウイルスを単離するために用いられ得る。いくつかの実施形態において、ウイルス調製物は、クロスフローろ過（ＣＦＦ）によって単離される。いくつかの実施形態において、ウイルス調製物は、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれ以上の量で高度に精製される。
いくつかの実施形態において、ジカウイルスは、Ｍｒ ７６６、ＡｒＤ ４１５１９、ＩｂＨ ３０６５６、Ｐ６－７４０、ＥＣ Ｙａｐ、ＦＳＳ１３０２５、ＡｒＤ ７１１７、ＡｒＤ ９９５７、ＡｒＤ ３０１０１、ＡｒＤ ３０１５６、ＡｒＤ ３０３３２、ＨＤ ７８７８８、ＡｒＤ １２７７０７、ＡｒＤ １２７７１０、ＡｒＤ １２７９８４、ＡｒＤ １２７９８８、ＡｒＤ １２７９９４、ＡｒＤ １２８０００、ＡｒＤ １３２９１２、１３２９１５、ＡｒＤ １４１１７０、ＡｒＤ １４２６２３、ＡｒＤ １４９９１７、ＡｒＤ １４９８１０、ＡｒＤ １４９９３８、ＡｒＤ １５７９９５、ＡｒＤ １５８０８４、ＡｒＤ １６５５２２、ＡｒＤ １６５５３１、ＡｒＡ １４６５、ＡｒＡ ２７１０１、ＡｒＡ ２７２９０、ＡｒＡ ２７１０６、ＡｒＡ ２７０９６、ＡｒＡ ２７４０７、ＡｒＡ ２７４３３、ＡｒＡ ５０６／９６、ＡｒＡ ９７５－９９、Ａｒａ ９８２－９９、ＡｒＡ ９８６－９９、ＡｒＡ ２７１８、ＡｒＢ １３６２、Ｎｉｇｅｒｉａ６８、Ｍａｌａｙｓｉａ６６、Ｋｅｄｏｕｇｏｕ８４、Ｓｕｒｉｎａｍｅ、ＭＲ１４２９、ＰＲＶＡＢＣ５９、ＥＣＭＮ２００７、ＤａｋＡｒ４１５２４、Ｈ／ＰＦ／２０１３、Ｒ１０３４５１、１０３３４４、８３７５、ＪＭＢ－１８５、ＺＩＫＶ／Ｈ、ｓａｐｉｅｎｓ／Ｂｒａｚｉｌ／Ｎａｔａｌ／２０１５、ＳＰＨ２０１５、ＺＩＫＶ／Ｈｕ／Ｃｈｉｂａ／Ｓ３６／２０１６、Ｔｈａｉｌａｎｄ ＳＶＯ１２７／１４、Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅ ＣＯＣ Ｃ０７４０、Ｂｒａｚｉｌ Ｆｏｒｔａｌｅｚａ ２０１５、及びＣｕｂａ２０１７株からなる株の群から選択され得る。
特定の実施形態において、ジカウイルスは、ジカウイルス非構造的タンパク質１（ＮＳ１）における変異を含む。いくつかの実施形態において、ジカウイルスは、配列番号１の９８位、または配列番号１の９８位に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む。いくつかの実施形態において、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む、精製され不活性化された全ジカウイルスを含み、ジカウイルスは、ＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。いくつかの実施形態において、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む、精製され不活性化された全ジカウイルスを含み、ジカウイルスは、配列番号２によるゲノム配列を含むＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。いくつかの実施形態において、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８でのＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異におけるＰＲＶＡＢＣ５９株とは異なる精製され不活性化された全ジカを含む。
少なくとも１つの不活性化されたジカウイルスから１つ以上の抗原を含む本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物は、それを必要とする対象におけるジカウイルス感染を治療もしくは予防するため、及び／またはそれを必要とする対象においてジカウイルスに指向する免疫応答、例えば、防御免疫応答を誘導するのに有用であり得る。
方法は、以下に本明細書に記載されるように、不活性化の完全性を決定するステップ（ｃ）をさらに含み得る。
不活性化の完全性の決定
本開示の他の態様は、２つの異なる細胞型の逐次的な感染を使用することによって、アルボウイルス調製物の不活性化の完全性を決定する方法に関する。この方法は、１つの細胞型のみを使用するアッセイと比較して、またＴＣＩＤ５０方法などの他の方法と比較して、検出の驚くべき下限（ＬＯＤ）を有する。さらに、この方法は、不活性化されたウイルスの感染性を決定するための動物の使用を回避する。
アルボウイルス調製物の不活性化の完全性を決定する方法は、
（ｉ）培養された昆虫細胞に、不活性化ステップに供されたアルボウイルス調製物を接種し、前記昆虫細胞を最第１の期間でインキュベートし、それにより昆虫細胞上清を生成するステップと、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された前記昆虫細胞上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、前記哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートするステップと、
（ｉｉｉ）ウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定するステップとを含む。
アルボウイルスは、節足動物によってヒトに伝染されるウイルスである。それらは、フラビウイルス、トガウイルス、ブニヤウイルス属からのウイルスを含む。本明細書に開示される方法によって試験されるアルボウイルス調製物は、哺乳動物細胞、特に、ベロ細胞を感染させること、及びこれらの細胞に細胞変性効果を引き起こすことができるアルボウイルスを含む。いくつかの実施形態において、アルボウイルスは、ジカウイルス、ウエストナイルウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、デング熱ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、チクングニアウイルス、オニョンニョンウイルス、またはマヤロウイルスから選択される。いくつかの実施形態において、アルボウイルスは、ジカウイルスである。
いくつかの実施形態において、ジカウイルスは、Ｍｒ ７６６、ＡｒＤ ４１５１９、ＩｂＨ ３０６５６、Ｐ６－７４０、ＥＣ Ｙａｐ、ＦＳＳ１３０２５、ＡｒＤ ７１１７、ＡｒＤ ９９５７、ＡｒＤ ３０１０１、ＡｒＤ ３０１５６、ＡｒＤ ３０３３２、ＨＤ ７８７８８、ＡｒＤ １２７７０７、ＡｒＤ １２７７１０、ＡｒＤ １２７９８４、ＡｒＤ １２７９８８、ＡｒＤ １２７９９４、ＡｒＤ １２８０００、ＡｒＤ １３２９１２、１３２９１５、ＡｒＤ １４１１７０、ＡｒＤ １４２６２３、ＡｒＤ １４９９１７、ＡｒＤ １４９８１０、ＡｒＤ １４９９３８、ＡｒＤ １５７９９５、ＡｒＤ １５８０８４、ＡｒＤ １６５５２２、ＡｒＤ １６５５３１、ＡｒＡ １４６５、ＡｒＡ ２７１０１、ＡｒＡ ２７２９０、ＡｒＡ ２７１０６、ＡｒＡ ２７０９６、ＡｒＡ ２７４０７、ＡｒＡ ２７４３３、ＡｒＡ ５０６／９６、ＡｒＡ ９７５－９９、Ａｒａ ９８２－９９、ＡｒＡ ９８６－９９、ＡｒＡ ２７１８、ＡｒＢ １３６２、Ｎｉｇｅｒｉａ６８、Ｍａｌａｙｓｉａ６６、Ｋｅｄｏｕｇｏｕ８４、Ｓｕｒｉｎａｍｅ、ＭＲ１４２９、ＰＲＶＡＢＣ５９、ＥＣＭＮ２００７、ＤａｋＡｒ４１５２４、Ｈ／ＰＦ／２０１３、Ｒ１０３４５１、１０３３４４、８３７５、ＪＭＢ－１８５、ＺＩＫＶ／Ｈ、ｓａｐｉｅｎｓ／Ｂｒａｚｉｌ／Ｎａｔａｌ／２０１５、ＳＰＨ２０１５、ＺＩＫＶ／Ｈｕ／Ｃｈｉｂａ／Ｓ３６／２０１６、Ｔｈａｉｌａｎｄ ＳＶＯ１２７／１４、Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅ ＣＯＣ Ｃ０７４０、Ｂｒａｚｉｌ Ｆｏｒｔａｌｅｚａ ２０１５、及びＣｕｂａ２０１７株からなる株の群から選択され得る。
特定の実施形態において、ジカウイルスは、ジカウイルス非構造的タンパク質１（ＮＳ１）における変異を含む。いくつかの実施形態において、ジカウイルスは、配列番号１の９８位、または配列番号１の９８位に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む。いくつかの実施形態において、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む、精製され不活性化された全ジカウイルスを含み、ジカウイルスは、ＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。いくつかの実施形態において、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む、精製され不活性化された全ジカウイルスを含み、ジカウイルスは、配列番号２によるゲノム配列を含むＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。いくつかの実施形態において、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８でのＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異におけるＰＲＶＡＢＣ５９株とは異なる精製され不活性化された全ジカを含む。
培養された昆虫細胞は、アルボウイルス調製物を、昆虫細胞及び増殖培地を含む昆虫細胞培養物に添加することによって、アルボウイルス調製物と共に接種される。次いで、接種された昆虫細胞は、好適な条件下で、アルボウイルス調製物と共に第１の期間でインキュベートされる。いくつかの実施形態において、第１の期間は、３～７日である。いくつかの実施形態において、第１の期間は、５～７日である。いくつかの実施形態において、第１の期間は、６日である。したがって、いくつかの実施形態において、接種された昆虫細胞は、３～７日間アルボウイルス調製物と共にインキュベートされる。いくつかの実施形態において、接種された昆虫細胞は、５～７日間アルボウイルス調製物と共にインキュベートされる。いくつかの実施形態において、接種された昆虫細胞は、６日間アルボウイルス調製物と共にインキュベートされる。インキュベーションの間、任意の生ウイルスは、昆虫細胞上清に分泌される。
使用される昆虫細胞は、調査されるアルボウイルスによって感染され得る任意の昆虫細胞であり得、その生存性は、ウイルス感染によって変更されない。昆虫細胞は、ウイルスが細胞への細胞変性効果を有さないように選択される。好適な昆虫細胞には、これらに限定されないが、ＣＣＬ－１２５細胞、Ａａｇ－２細胞、ＲＭＬ－１２細胞、Ｃ６／３６細胞、Ｃ７－１０細胞、ＡＰ－６１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ－１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ－２細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ－３細胞、ＵＭ－ＡＶＥ１細胞、Ｍｏｓ．５５細胞、Ｓｕａ１Ｂ細胞、４ａ－３Ｂ細部、Ｍｏｓ．４２細胞、ＭＳＱ４３細胞、ＬＳＢ－ＡＡ６９５ＢＢ細胞、ＮＩＩＤ－ＣＴＲ細胞、及びＴＲＡ－１７１細胞が挙げられる。いくつかの実施形態において、昆虫細胞は、Ｃ６／３６細胞である。
次いで、昆虫細胞をアルボウイルス調製物と共にインキュベートすることによって生成された昆虫細胞上清は、培養された哺乳動物細胞を接種するために使用される。接種について、昆虫細胞上清は、哺乳動物細胞に移され、６０～１２０分間または８０～１００分間または９０分間、哺乳動物細胞と共にインキュベートされる。接種後、細胞培養培地を添加し、哺乳動物細胞は、好適な条件下で、第２の期間で昆虫細胞上清と共にインキュベートされる。いくつかの実施形態において、第２の期間は、３～１４日である。いくつかの実施形態において、第２の期間は、５～１２日である。いくつかの実施形態において、第２の期間は、６～１０日である。いくつかの実施形態において、第２の期間は、７～９日である。いくつかの実施形態において、第２の期間は、８日である。したがって、いくつかの実施形態において、接種された昆虫細胞は、３～１４日間昆虫細胞上清と共にインキュベートされる。いくつかの実施形態において、接種された昆虫細胞は、５～１２日間昆虫細胞上清と共にインキュベートされる。いくつかの実施形態において、接種された昆虫細胞は、７～９日間昆虫細胞上清と共にインキュベートされる。いくつかの実施形態において、接種された昆虫細胞は、８日間昆虫細胞上清と共にインキュベートされる。インキュベーションの間、任意の生ウイルスは、哺乳動物細胞に細胞変性効果を及ぼす。インキュベーションの間、任意の残留複製ウイルスは、ベロ細胞などの哺乳動物細胞に細胞変性効果を及ぼす。
使用される哺乳動物細胞は、調査されるアルボウイルスによって感染され得、ウイルスが細胞変性効果を及ぼす任意の哺乳動物細胞であり得る。好適な哺乳動物細胞には、これらに限定されないが、ベロ細胞、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４ ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）細胞、ＭＤＣＫ ３３０１６（ＷＯ９７／３７００１に記載される寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９）細胞、ＢＨＫ２１－Ｆ細胞、ＨＫＣＣ細胞、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）が挙げられる。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、ベロ細胞である。
いくつかの実施形態において、アルボウイルス調製物の不活性化の完全性を決定する方法は、
（ｉ）Ｃ６／３６細胞に、不活性化ステップに供されたアルボウイルス調製物を接種し、Ｃ６／３６細胞を第１の期間でインキュベートし、それによりＣ６／３６細胞上清を生成するステップと、
（ｉｉ）（ｉ）で生成されたＣ６／３６細胞上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートするステップと、及び、
（ｉｉｉ）ウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定するステップとを含む。
いくつかの実施形態において、アルボウイルス調製物の不活性化の完全性を決定する方法は、
（ｉ）培養された昆虫細胞に、不活性化ステップに供されたアルボウイルス調製物を接種し、前記昆虫細胞を最第１の期間でインキュベートし、それにより昆虫細胞上清を生成するステップと、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された昆虫細胞上清をベロ細胞に接種し、ベロ細胞を第２の期間でインキュベートするステップと、
（ｉｉｉ）ウイルス調製物が、ベロ細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定するステップとを含む。
いくつかの実施形態において、アルボウイルス調製物の不活性化の完全性を決定する方法は、
（ｉ）Ｃ６／３６細胞に、不活性化ステップに供されたアルボウイルス調製物を接種し、Ｃ６／３６細胞を第１の期間でインキュベートし、それによりＣ６／３６細胞上清を生成するステップと、
（ｉｉ）（ｉ）で生成されたＣ６／３６細胞上清をベロ細胞に接種し、ベロ細胞を第２の期間でインキュベートするステップと、
（ｉｉｉ）ウイルス調製物が、ベロ細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定するステップと、を含む。
いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物の不活性化の完全性を決定する方法は、
（ｉ）Ｃ６／３６細胞に、不活性化ステップに供されたアルボウイルス調製物を接種し、Ｃ６／３６細胞を第１の期間でインキュベートし、それによりＣ６／３６細胞上清を生成するステップと、
（ｉｉ）（ｉ）で生成されたＣ６／３６細胞上清をベロ細胞に接種し、ベロ細胞を第２の期間でインキュベートするステップと、
（ｉｉｉ）ウイルス調製物が、ベロ細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定するステップと、を含む。
いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物の不活性化の完全性を決定する方法は、
（ｉ）Ｃ６／３６細胞に、不活性化ステップに供されたアルボウイルス調製物を接種し、Ｃ６／３６細胞を３～７日間インキュベートし、それによりＣ６／３６細胞上清を生成するステップと、
（ｉｉ）（ｉ）で生成されたＣ６／３６細胞上清をベロ細胞に接種し、ベロ細胞を第２の期間でインキュベートするステップと、
（ｉｉｉ）ウイルス調製物が、ベロ細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定するステップと、を含む。
いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物の不活性化の完全性を決定する方法は、
（ｉ）Ｃ６／３６細胞に、不活性化ステップに供されたアルボウイルス調製物を接種し、Ｃ６／３６細胞を第１の期間でインキュベートし、それによりＣ６／３６細胞上清を生成するステップと、
（ｉｉ）（ｉ）で生成されたＣ６／３６細胞上清をベロ細胞に接種し、ベロ細胞を３～１４日間インキュベートするステップと、
（ｉｉｉ）ウイルス調製物が、ベロ細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定するステップと、を含む。
いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物の不活性化の完全性を決定する方法は、
（ｉ）Ｃ６／３６細胞に、不活性化ステップに供されたアルボウイルス調製物を接種し、Ｃ６／３６細胞を３～７日間インキュベートし、それによりＣ６／３６細胞上清を生成するステップと、
（ｉｉ）（ｉ）で生成されたＣ６／３６細胞上清をベロ細胞に接種し、ベロ細胞を３～１４日間インキュベートするステップと、
（ｉｉｉ）ウイルス調製物が、ベロ細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定するステップと、を含む。
いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物の不活性化の完全性を決定する方法は、
（ｉ）Ｃ６／３６細胞に、不活性化ステップに供されたアルボウイルス調製物を接種し、Ｃ６／３６細胞を６日間インキュベートし、それによりＣ６／３６細胞上清を生成するステップと、
（ｉｉ）（ｉ）で生成されたＣ６／３６細胞上清をベロ細胞に接種し、ベロ細胞を８日間インキュベートするステップと、
（ｉｉｉ）ウイルス調製物が、ベロ細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定するステップとを含む。
第２の期間の終了時に、ウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果を有するかを決定する。細胞変性効果は、ウイルス複製中に細胞からのウイルス侵入、感染、及び出芽によって引き起こされる細胞構造の任意の変化である。本開示の方法において、細胞変性効果は、細部がフェノールレッドを含む培地で培養されている場合、ピンク色から橙色または黄色への培地の色の変化によって、または哺乳動物細胞の顕微鏡検査によって決定される。哺乳動物細胞の顕微鏡検査が、円形の細胞が、組織培養容器（プレート、ウェル、またはフラスコ）から離れ始めるか、または組織培養プレート／フラスコから取り除かれ始めると示す場合、細胞変性効果は存在すると考えられる。細胞変性の他の兆候には、核または細胞質封入体の合胞体及び外観を形成する隣接する細胞の融合が含まれる。
上に議論されるように、本明細書に開示される方法は、検出の非常に低い限界を有する。この方法では、１．０ ＴＣＩＤ５０未満のウイルス含有量が検出され得る。いくつかの実施形態において、０．８ ＴＣＩＤ５０未満のウイルス含有量が検出され得る。いくつかの実施形態において、０．５ ＴＣＩＤ５０未満のウイルス含有量が検出され得る。いくつかの実施形態において、０．２ ＴＣＩＤ５０未満のウイルス含有量が検出され得る。いくつかの実施形態において、０．１ ＴＣＩＤ５０未満のウイルス含有量が検出され得る。
不活性化の完全性を決定する上記の方法は、アルボウイルスを不活性化する任意の方法において使用され得る。一実施形態において、アルボウイルス調製物を不活性化する方法は、
（ａ）試験管内で培養された１つ以上の細胞からアルボウイルス調製物を単離することであって、細胞が、アルボウイルス調製物を生成するために使用される、単離することと、
（ｂ）アルボウイルス調製物を、０．００５％～０．０２％ｗ／ｖのホルムアルデヒドで処理することと、
（ｃ）
（ｉ）培養された昆虫細胞に、ステップ（ｂ）に従って処理されたウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第１の期間でインキュベートし、それにより上清を生成すること、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートすること、及び、
（ｉｉｉ）アルボウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定することによって、不活性化の完全性を決定することとを含む。
一実施形態において、アルボウイルス調製物を不活性化する方法は、
（ａ）試験管内で培養された１つ以上の細胞からアルボウイルス調製物を単離することであって、細胞が、アルボウイルス調製物を生成するために使用される、単離することと、
（ｂ）アルボウイルス調製物を、０．００７５％～０．０１５％ｗ／ｖのホルムアルデヒドで処理することと、
（ｃ）
（ｉ）培養された昆虫細胞に、ステップ（ｂ）に従って処理されたウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第１の期間でインキュベートし、それにより上清を生成すること、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートすること、及び、
（ｉｉｉ）アルボウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定することによって、不活性化の完全性を決定することとを含む。
一実施形態において、アルボウイルス調製物を不活性化する方法は、
（ａ）試験管内で培養された１つ以上の細胞からアルボウイルス調製物を単離することであって、細胞が、アルボウイルス調製物を生成するために使用される、単離することと、
（ｂ）アルボウイルス調製物を、０．０１％ｗ／ｖのホルムアルデヒドで処理することと、
（ｃ）
（ｉ）培養された昆虫細胞に、ステップ（ｂ）に従って処理されたウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第１の期間でインキュベートし、それにより上清を生成すること、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートすること、及び、
（ｉｉｉ）アルボウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定することによって、不活性化の完全性を決定することとを含む。
一実施形態において、アルボウイルス調製物を不活性化する方法は、
（ａ）試験管内で培養された１つ以上の細胞からアルボウイルス調製物を単離することであって、細胞が、アルボウイルス調製物を生成するために使用される、単離することと、
（ｂ）アルボウイルス調製物を、８～１２日の期間、０．００５％～０．０２％ｗ／ｖのホルムアルデヒドで処理することと、
（ｃ）
（ｉ）培養された昆虫細胞に、ステップ（ｂ）に従って処理されたウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第１の期間でインキュベートし、それにより上清を生成すること、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートすること、及び、
（ｉｉｉ）アルボウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定することによって、不活性化の完全性を決定することとを含む。
一実施形態において、アルボウイルス調製物を不活性化する方法は、
（ａ）試験管内で培養された１つ以上の細胞からアルボウイルス調製物を単離することであって、細胞が、アルボウイルス調製物を生成するために使用される、単離することと、
（ｂ）アルボウイルス調製物を、８～１２日の期間、０．００７５％～０．０１５％ｗ／ｖのホルムアルデヒドで処理することと、
（ｃ）
（ｉ）培養された昆虫細胞に、ステップ（ｂ）に従って処理されたウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第１の期間でインキュベートし、それにより上清を生成すること、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートすること、及び、
（ｉｉｉ）アルボウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定することによって、不活性化の完全性を決定することとを含む。
一実施形態において、アルボウイルス調製物を不活性化する方法は、
（ａ）試験管内で培養された１つ以上の細胞からアルボウイルス調製物を単離することであって、細胞が、アルボウイルス調製物を生成するために使用される、単離することと、
（ｂ）アルボウイルス調製物を、８～１２日の期間、０．０１％ｗ／ｖのホルムアルデヒドで処理することと、
（ｃ）
（ｉ）培養された昆虫細胞に、ステップ（ｂ）に従って処理されたウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第１の期間でインキュベートし、それにより上清を生成すること、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートすること、及び、
（ｉｉｉ）アルボウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定することによって、不活性化の完全性を決定することとを含む。
一実施形態において、アルボウイルス調製物を不活性化する方法は、
（ａ）試験管内で培養された１つ以上の細胞からアルボウイルス調製物を単離することであって、細胞が、アルボウイルス調製物を生成するために使用される、単離することと、
（ｂ）アルボウイルス調製物を、９～１１日の期間、０．００５％～０．０２％ｗ／ｖのホルムアルデヒドで処理することと、
（ｃ）
（ｉ）培養された昆虫細胞に、ステップ（ｂ）に従って処理されたウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第１の期間でインキュベートし、それにより上清を生成すること、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートすること、及び、
（ｉｉｉ）アルボウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定することによって、不活性化の完全性を決定することとを含む。
一実施形態において、アルボウイルス調製物を不活性化する方法は、
（ａ）試験管内で培養された１つ以上の細胞からアルボウイルス調製物を単離することであって、細胞が、アルボウイルス調製物を生成するために使用される、単離することと、
（ｂ）アルボウイルス調製物を、９～１１日の期間、０．００７５％～０．０１５％ｗ／ｖのホルムアルデヒドで処理することと、
（ｃ）
（ｉ）培養された昆虫細胞に、ステップ（ｂ）に従って処理されたウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第１の期間でインキュベートし、それにより上清を生成すること、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートすること、及び、
（ｉｉｉ）アルボウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定することによって、不活性化の完全性を決定することとを含む。
一実施形態において、アルボウイルス調製物を不活性化する方法は、
（ａ）試験管内で培養された１つ以上の細胞からアルボウイルス調製物を単離することであって、細胞が、アルボウイルス調製物を生成するために使用される、単離することと、
（ｂ）アルボウイルス調製物を、９～１１日の期間、０．０１％ｗ／ｖのホルムアルデヒドで処理することと、
（ｃ）
（ｉ）培養された昆虫細胞に、ステップ（ｂ）に従って処理されたウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第１の期間でインキュベートし、それにより上清を生成すること、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートすること、及び、
（ｉｉｉ）アルボウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定することによって、不活性化の完全性を決定することとを含む。
一実施形態において、アルボウイルス調製物を不活性化する方法は、
（ａ）試験管内で培養された１つ以上の細胞からアルボウイルス調製物を単離することであって、細胞が、アルボウイルス調製物を生成するために使用される、単離することと、
（ｂ）アルボウイルス調製物を、１０日の期間、０．００５％～０．０２％ｗ／ｖのホルムアルデヒドで処理することと、
（ｃ）
（ｉ）培養された昆虫細胞に、ステップ（ｂ）に従って処理されたウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第１の期間でインキュベートし、それにより上清を生成すること、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートすること、及び、
（ｉｉｉ）アルボウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定することによって、不活性化の完全性を決定することとを含む。
一実施形態において、アルボウイルス調製物を不活性化する方法は、
（ａ）試験管内で培養された１つ以上の細胞からアルボウイルス調製物を単離することであって、細胞が、アルボウイルス調製物を生成するために使用される、単離することと、
（ｂ）アルボウイルス調製物を、１０日の期間、０．００７５％～０．０１５％ｗ／ｖのホルムアルデヒドで処理することと、
（ｃ）
（ｉ）培養された昆虫細胞に、ステップ（ｂ）に従って処理されたウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第１の期間でインキュベートし、それにより上清を生成すること、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートすること、及び、
（ｉｉｉ）アルボウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定することによって、不活性化の完全性を決定することとを含む。
一実施形態において、アルボウイルス調製物を不活性化する方法は、
（ａ）試験管内で培養された１つ以上の細胞からアルボウイルス調製物を単離することであって、細胞が、アルボウイルス調製物を生成するために使用される、単離することと、
（ｂ）アルボウイルス調製物を、１０日の期間、０．０１％ｗ／ｖのホルムアルデヒドで処理することと、
（ｃ）
（ｉ）培養された昆虫細胞に、ステップ（ｂ）に従って処理されたウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第１の期間でインキュベートし、それにより上清を生成すること、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートすること、及び、
（ｉｉｉ）アルボウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定することによって、不活性化の完全性を決定することとを含む。
いくつかの実施形態において、アルボウイルス調製物を不活性化する方法は、
（ａ）試験管内で培養された１つ以上の細胞からアルボウイルス調製物を単離することであって、細胞が、アルボウイルス調製物を生成するために使用される、単離することと、
（ｂ）アルボウイルス調製物を、２０℃～３０℃の温度で５～１２０分間、０．１％～３％の過酸化水素で処理することと、
（ｃ）
（ｉ）培養された昆虫細胞に、ステップ（ｂ）に従って処理されたウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第１の期間でインキュベートし、それにより上清を生成すること、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートすること、及び、
（ｉｉｉ）アルボウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定することによって、不活性化の完全性を決定することとを含む。
いくつかの実施形態において、アルボウイルス調製物を不活性化する方法は、
（ａ）試験管内で培養された１つ以上の細胞からアルボウイルス調製物を単離することであって、細胞が、アルボウイルス調製物を生成するために使用される、単離することと、
（ｂ）アルボウイルス調製物を、２０℃～３０℃の温度で６０分間、０．０１％の過酸化水素で処理することと、
（ｃ）
（ｉ）培養された昆虫細胞に、ステップ（ｂ）に従って処理されたウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第１の期間でインキュベートし、それにより上清を生成すること、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートすること、及び、
（ｉｉｉ）アルボウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定することによって、不活性化の完全性を決定することとを含む。
不活性化の完全性を決定する上記の方法は、ジカウイルスを不活性化する任意の方法において使用され得る。一実施形態において、ジカウイルス調製物を不活性化する方法は、
（ａ）試験管内で培養された１つ以上の細胞からジカウイルス調製物を単離することであって、細胞が、ジカウイルス調製物を生成するために使用される、単離することと、
（ｂ）ジカウイルス調製物を、０．００５％～０．０２％ｗ／ｖのホルムアルデヒドで処理することと、
（ｃ）
（ｉ）培養された昆虫細胞に、ステップ（ｂ）に従って処理されたジカウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第１の期間でインキュベートし、それにより上清を生成すること、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートすること、及び、
（ｉｉｉ）ジカウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定することによって、不活性化の完全性を決定することとを含む。
一実施形態において、ジカウイルス調製物を不活性化する方法は、
（ａ）試験管内で培養された１つ以上の細胞からジカウイルス調製物を単離することであって、細胞が、ジカウイルス調製物を生成するために使用される、単離することと、
（ｂ）ジカウイルス調製物を、０．００５％～０．０２％ｗ／ｖのホルムアルデヒドで処理することと、
（ｃ）
（ｉ）培養された昆虫細胞に、ステップ（ｂ）に従って処理されたウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第１の期間でインキュベートし、それにより上清を生成すること、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートすること、及び、
（ｉｉｉ）ジカウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定することによって、不活性化の完全性を決定することとを含む。
一実施形態において、ジカウイルス調製物を不活性化する方法は、
（ａ）試験管内で培養された１つ以上の細胞からジカウイルス調製物を単離することであって、細胞が、ジカウイルス調製物を生成するために使用される、単離することと、
（ｂ）ジカウイルス調製物を、０．００７５％～０．０１５％ｗ／ｖのホルムアルデヒドで処理することと、
（ｃ）
（ｉ）培養された昆虫細胞に、ステップ（ｂ）に従って処理されたウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第１の期間でインキュベートし、それにより上清を生成すること、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートすること、及び、
（ｉｉｉ）ジカウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定することによって、不活性化の完全性を決定することとを含む。
一実施形態において、ジカウイルス調製物を不活性化する方法は、
（ａ）試験管内で培養された１つ以上の細胞からジカウイルス調製物を単離することであって、細胞が、ジカウイルス調製物を生成するために使用される、単離することと、
（ｂ）ジカウイルス調製物を、０．０１％ｗ／ｖのホルムアルデヒドで処理することと、
（ｃ）
（ｉ）培養された昆虫細胞に、ステップ（ｂ）に従って処理されたウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第１の期間でインキュベートし、それにより上清を生成すること、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートすること、及び、
（ｉｉｉ）ジカウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定することによって、不活性化の完全性を決定することとを含む。
一実施形態において、ジカウイルス調製物を不活性化する方法は、
（ａ）試験管内で培養された１つ以上の細胞からジカウイルス調製物を単離することであって、細胞が、ジカウイルス調製物を生成するために使用される、単離することと、
（ｂ）ジカウイルス調製物を、８～１２日の期間、０．００５％～０．０２％ｗ／ｖのホルムアルデヒドで処理することと、
（ｃ）
（ｉ）培養された昆虫細胞に、ステップ（ｂ）に従って処理されたウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第１の期間でインキュベートし、それにより上清を生成すること、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートすること、及び、
（ｉｉｉ）ジカウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定することによって、不活性化の完全性を決定することとを含む。
一実施形態において、ジカウイルス調製物を不活性化する方法は、
（ａ）試験管内で培養された１つ以上の細胞からジカウイルス調製物を単離することであって、細胞が、ジカウイルス調製物を生成するために使用される、単離することと、
（ｂ）ジカウイルス調製物を、８～１２日の期間、０．００７５％～０．０１５％ｗ／ｖのホルムアルデヒドで処理することと、
（ｃ）
（ｉ）培養された昆虫細胞に、ステップ（ｂ）に従って処理されたウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第１の期間でインキュベートし、それにより上清を生成すること、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートすること、及び、
（ｉｉｉ）ジカウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定することによって、不活性化の完全性を決定することとを含む。
一実施形態において、ジカウイルス調製物を不活性化する方法は、
（ａ）試験管内で培養された１つ以上の細胞からジカウイルス調製物を単離することであって、細胞が、ジカウイルス調製物を生成するために使用される、単離することと、
（ｂ）ジカウイルス調製物を、８～１２日の期間、０．０１％ｗ／ｖのホルムアルデヒドで処理することと、
（ｃ）
（ｉ）培養された昆虫細胞に、ステップ（ｂ）に従って処理されたウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第１の期間でインキュベートし、それにより上清を生成すること、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートすること、及び、
（ｉｉｉ）ジカウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定することによって、不活性化の完全性を決定することとを含む。
一実施形態において、ジカウイルス調製物を不活性化する方法は、
（ａ）試験管内で培養された１つ以上の細胞からジカウイルス調製物を単離することであって、細胞が、ジカウイルス調製物を生成するために使用される、単離することと、
（ｂ）ジカウイルス調製物を、９～１１日の期間、０．００５％～０．０２％ｗ／ｖのホルムアルデヒドで処理することと、
（ｃ）
（ｉ）培養された昆虫細胞に、ステップ（ｂ）に従って処理されたウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第１の期間でインキュベートし、それにより上清を生成すること、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートすること、及び、
（ｉｉｉ）ジカウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定することによって、不活性化の完全性を決定することとを含む。
一実施形態において、ジカウイルス調製物を不活性化する方法は、
（ａ）試験管内で培養された１つ以上の細胞からジカウイルス調製物を単離することであって、細胞が、ジカウイルス調製物を生成するために使用される、単離することと、
（ｂ）ジカウイルス調製物を、９～１１日の期間、０．００７５％～０．０１５％ｗ／ｖのホルムアルデヒドで処理することと、
（ｃ）
（ｉ）培養された昆虫細胞に、ステップ（ｂ）に従って処理されたウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第１の期間でインキュベートし、それにより上清を生成すること、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートすること、及び、
（ｉｉｉ）ジカウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定することによって、不活性化の完全性を決定することとを含む。
一実施形態において、ジカウイルス調製物を不活性化する方法は、
（ａ）試験管内で培養された１つ以上の細胞からジカウイルス調製物を単離することであって、細胞が、ジカウイルス調製物を生成するために使用される、単離することと、
（ｂ）ジカウイルス調製物を、９～１１日の期間、０．０１％ｗ／ｖのホルムアルデヒドで処理することと、
（ｃ）
（ｉ）培養された昆虫細胞に、ステップ（ｂ）に従って処理されたウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第１の期間でインキュベートし、それにより上清を生成すること、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートすること、及び、
（ｉｉｉ）ジカウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定することによって、不活性化の完全性を決定することとを含む。
一実施形態において、ジカウイルス調製物を不活性化する方法は、
（ａ）試験管内で培養された１つ以上の細胞からジカウイルス調製物を単離することであって、細胞が、ジカウイルス調製物を生成するために使用される、単離することと、
（ｂ）ジカウイルス調製物を、１０日の期間、０．００５％～０．０２％ｗ／ｖのホルムアルデヒドで処理することと、
（ｃ）
（ｉ）培養された昆虫細胞に、ステップ（ｂ）に従って処理されたウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第１の期間でインキュベートし、それにより上清を生成すること、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートすること、及び、
（ｉｉｉ）ジカウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定することによって、不活性化の完全性を決定することとを含む。
一実施形態において、ジカウイルス調製物を不活性化する方法は、
（ａ）試験管内で培養された１つ以上の細胞からジカウイルス調製物を単離することであって、細胞が、ジカウイルス調製物を生成するために使用される、単離することと、
（ｂ）ジカウイルス調製物を、１０日の期間、０．００７５％～０．０１５％ｗ／ｖのホルムアルデヒドで処理することと、
（ｃ）
（ｉ）培養された昆虫細胞に、ステップ（ｂ）に従って処理されたウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第１の期間でインキュベートし、それにより上清を生成すること、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートすること、及び、
（ｉｉｉ）ジカウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定することによって、不活性化の完全性を決定することとを含む。
一実施形態において、ジカウイルス調製物を不活性化する方法は、
（ａ）試験管内で培養された１つ以上の細胞からジカウイルス調製物を単離することであって、細胞が、ジカウイルス調製物を生成するために使用される、単離することと、
（ｂ）アルボウイルス調製物を、１０日の期間、０．０１％ｗ／ｖのホルムアルデヒドで処理することと、
（ｃ）
（ｉ）培養された昆虫細胞に、ステップ（ｂ）に従って処理されたウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第１の期間でインキュベートし、それにより上清を生成すること、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートすること、及び、
（ｉｉｉ）ジカウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定することによって、不活性化の完全性を決定することとを含む。
いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物を不活性化する方法は、
（ａ）試験管内で培養された１つ以上の細胞からジカウイルス調製物を単離することであって、細胞が、ジカウイルス調製物を生成するために使用される、単離することと、
（ｂ）ジカウイルス調製物を、２０℃～３０℃の温度で５～１２０分間、０．１％～３％の過酸化水素で処理することと、
（ｃ）
（ｉ）培養された昆虫細胞に、ステップ（ｂ）に従って処理されたジカウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第１の期間でインキュベートし、それにより上清を生成すること、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートすること、及び、
（ｉｉｉ）ジカウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定することによって、不活性化の完全性を決定することとを含む。
いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物を不活性化する方法は、
（ａ）試験管内で培養された１つ以上の細胞からジカウイルス調製物を単離することであって、細胞が、ジカウイルス調製物を生成するために使用される、単離することと、
（ｂ）ジカウイルス調製物を、２０℃～３０℃の温度で６０分間、０．０１％の過酸化水素で処理することと、
（ｃ）
（ｉ）昆虫細胞に、ステップ（ｂ）に従って処理されたジカウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第１の期間でインキュベートし、それにより上清を生成すること、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された上清を哺乳動物細胞に接種し、哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートすること、及び、
（ｉｉｉ）ジカウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定することによって、不活性化の完全性を決定することとを含む。
いくつかの実施形態において、ジカウイルス調製物を不活性化する方法は、
（ａ）試験管内で培養された１つ以上の細胞からジカウイルス調製物を単離することであって、細胞が、ジカウイルス調製物を生成するために使用される、単離することと、
（ｂ）ジカウイルス調製物を、２２℃などの２０℃～３０℃の温度で７日間、０．０５％のホルマリンで処理することと、
（ｃ）
（ｉ）培養された昆虫細胞に、ステップ（ｂ）に従って処理されたジカウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第１の期間でインキュベートし、それにより上清を生成すること、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートすること、及び、
（ｉｉｉ）ウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定することによって、不活性化の完全性を決定することとを含む。
いくつかの実施形態において、細胞は、非ヒト細胞である。好適な非ヒト哺乳動物細胞には、これらに限定されないが、ベロ細胞、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４ ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）細胞、ＭＤＣＫ ３３０１６（ＷＯ９７／３７００１に記載される寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９）細胞、ＢＨＫ２１－Ｆ細胞、ＨＫＣＣ細胞、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）が挙げられる。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、ベロ細胞である。
薬学的組成物
本開示の他の態様は、本明細書に開示される方法によって得ることができる不活性化されたジカウイルスを含む薬学的組成物に関する。これらの薬学的組成物は、特に低含有量の残留ホルムアルデヒドを有する。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、低含有量の残留ホルムアルデヒドが、副作用を発症する対象のリスクを低下させると仮定される。
「残留ホルムアルデヒド含有量」という用語は、ジカウイルスが不活性化され、調製物が中和され、任意に１つ以上のさらなる精製またはろ過ステップに晒された後に、薬学的組成物中に依然として存在するホルムアルデヒドの量を指す。米国薬局方によると、不活性化された細菌またはウイルスを含むワクチン中の残留ホルムアルデヒドの上限は、１００μｇ／ｍｌのホルムアルデヒドと当量である０．０２％である。
残留ホルムアルデヒド含有量は、熟練者に既知の任意の方法によって決定され得る。１つの好適な方法は、ＥＭＥＡ，ＶＩＣＨ Ｔｏｐｉｃ ＧＬ２５，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ：Ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ，３０ Ａｐｒｉｌ ２００２に記載され、メチルベンゾチアゾリノンヒドラゾン塩酸塩（ＭＢＴＨ）の使用を含む。他の方法は、アセチルアセトン滴定、塩化第二鉄滴定、及び塩基性フクシン試験を含む。特に好適な方法は、本明細書に記載される。
薬学的組成物は、対象に投与され得る、典型的に１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む形態である。
薬学的組成物中の残留ホルムアルデヒドの含有量は、５０μｇ／ｍｌ未満である。一実施形態において、薬学的組成物中の残留ホルムアルデヒド含有量は、４５μｇ／ｍｌ未満、４０μｇ／ｍｌ未満、３５μｇ／ｍｌ未満、３０μｇ／ｍｌ未満、２５μｇ／ｍｌ未満、２０μｇ／ｍｌ未満、１５μｇ／ｍｌ未満、または１０μｇ／ｍｌである。一実施形態において、薬学的組成物中の残留ホルムアルデヒド含有量は、９．５μｇ／ｍｌ未満、９μｇ／ｍｌ未満、８．５μｇ／ｍｌ未満、８μｇ／ｍｌ未満、７．５μｇ／ｍｌ未満、７μｇ／ｍｌ未満、６．５μｇ／ｍｌ未満、６μｇ／ｍｌ未満、５．５μｇ／ｍｌ未満、５μｇ／ｍｌ未満、４．５μｇ／ｍｌ未満、４μｇ／ｍｌ未満、３．５μｇ／ｍｌ未満、３μｇ／ｍｌ未満、２．５μｇ／ｍｌ未満、２μｇ／ｍｌ未満、１．５μｇ／ｍｌ未満、１μｇ／ｍｌ未満、または０．５μｇ／ｍｌ未満である。一実施形態において、薬学的組成物中の残留ホルムアルデヒド含有量は、０．５μｇ／ｍｌ未満である。
残留ホルムアルデヒド含有量を決定する方法
本開示の他の態様は、不活性化されたウイルスを含む薬学的組成物中の残留ホルムアルデヒド含有量を決定する方法に関し、
（ａ）ホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む組成物を提供するステップと、
（ｂ）（ａ）の組成物を、リン酸及び２，４－ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）と混合し、それにより混合物を提供するステップと、
（ｃ）（ｂ）の混合物を、好適な条件下でインキュベートするステップと、
（ｄ）残留ホルムアルデヒドの存在について混合物を分析するステップとを含む。
検出試薬としてのＤＮＰＨの使用は、以下の利点：（１）高感受性、（２）誘導体化されたホルムアルデヒドのＵＶ検出、及び（３）加熱なしの１つのステップの試料調製を提供する。本方法は、水酸化アルミニウムなどのアジュバントを含むワクチン中の残留ホルムアルデヒドを検出するのに特に好適である。方法は、調和国際会議（ＩＣＨ）Ｑ２ガイドラインに従って、特異性、直線性、正確度、再現性、ロバスト性、及び安定性に関して検証された。
ホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む組成物は、アジュバントをさらに含み得る。一実施形態において、アジュバントは、水酸化アルミニウムである。一実施形態において、ホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む組成物は、アジュバントとして０．１ｍｇ／ｍｌ～１．０ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムを含む。一実施形態において、ホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む組成物は、アジュバントとして０．２ｍｇ／ｍｌ～０．９ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムを含む。一実施形態において、ホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む組成物は、アジュバントとして０．３ｍｇ／ｍｌ～０．８ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムを含む。一実施形態において、ホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む組成物は、アジュバントとして０．３ｍｇ／ｍｌ～０．７ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムを含む。一実施形態において、ホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む組成物は、アジュバントとして０．３ｍｇ／ｍｌ～０．６ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムを含む。一実施形態において、ホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む組成物は、アジュバントとして０．３ｍｇ／ｍｌ～０．５ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムを含む。一実施形態において、ホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む組成物は、アジュバントとして０．４ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムを含む。
いくつかの実施形態において、ホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む５０部の組成物は、１部の１５～２５％（ｖ／ｖ）リン酸及び２．５部の０．９～１．１ｍｇ／ｍｌ ＤＮＰＨと混合される。いくつかの実施形態において、ホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む５０部の組成物は、１部の２０％（ｖ／ｖ）リン酸及び２．５部の１．０ｍｇ／ｍｌ ＤＮＰＨと混合される。いくつかの実施形態において、ホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む１ｍｌの組成物は、２０μｌの２０％（ｖ／ｖ）リン酸及び５０μｌの１．０ｍｇ／ｍｌ ＤＮＰＨと混合される。
いくつかの実施形態において、リン酸及びＤＮＰＨとホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む組成物との混合物は、１８℃～３０℃の温度でインキュベートされる。いくつかの実施形態において、リン酸及びＤＮＰＨとホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む組成物との混合物は、２０℃～２５℃の温度でインキュベートされる。いくつかの実施形態において、リン酸及びＤＮＰＨとホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む組成物との混合物は、２２℃の温度でインキュベートされる。
いくつかの実施形態において、リン酸及びＤＮＰＨとホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む組成物との混合物は、１０～３０分間インキュベートされる。いくつかの実施形態において、リン酸及びＤＮＰＨとホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む組成物との混合物は、１５～２５分間インキュベートされる。いくつかの実施形態において、リン酸及びＤＮＰＨとホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む組成物との混合物は、２０分間インキュベートされる。
いくつかの実施形態において、リン酸及びＤＮＰＨとホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む組成物との混合物は、１８℃～３０℃の温度で１０～３０分間インキュベートされる。いくつかの実施形態において、リン酸及びＤＮＰＨとホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む組成物との混合物は、１８℃～３０℃の温度で１５～２５分間インキュベートされる。いくつかの実施形態において、リン酸及びＤＮＰＨとホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む組成物との混合物は、１８℃～３０℃の温度で２０分間インキュベートされる。
いくつかの実施形態において、リン酸及びＤＮＰＨとホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む組成物との混合物は、２０℃～２５℃の温度で１０～３０分間インキュベートされる。いくつかの実施形態において、リン酸及びＤＮＰＨとホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む組成物との混合物は、２０℃～２５℃の温度で１５～２５分間インキュベートされる。いくつかの実施形態において、リン酸及びＤＮＰＨとホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む組成物との混合物は、２０℃～２５℃の温度で２０分間インキュベートされる。
いくつかの実施形態において、リン酸及びＤＮＰＨとホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む組成物との混合物は、２２℃の温度で１０～３０分間インキュベートされる。いくつかの実施形態において、リン酸及びＤＮＰＨとホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む組成物との混合物は、２２℃の温度で１５～２５分間インキュベートされる。いくつかの実施形態において、リン酸及びＤＮＰＨとホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む組成物との混合物は、２２℃の温度で２０分間インキュベートされる。
いくつかの実施形態において、１部の２０％リン酸及び２．５部の１．０ｍｇ／ｍｌ ＤＮＰＨとホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む５０部の組成物との混合物は、１８℃～３０℃の温度で１０～３０分間インキュベートされる。いくつかの実施形態において、１部の２０％リン酸及び２．５部の１．０ｍｇ／ｍｌ ＤＮＰＨとホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む５０部の組成物との混合物は、１８℃～３０℃の温度で１５～２５分間インキュベートされる。いくつかの実施形態において、１部の２０％リン酸及び２．５部の１．０ｍｇ／ｍｌ ＤＮＰＨとホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む５０部の組成物との混合物は、１８℃～３０℃の温度で２０分間インキュベートされる。
いくつかの実施形態において、１部の２０％リン酸及び２．５部の１．０ｍｇ／ｍｌ ＤＮＰＨとホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む５０部の組成物との混合物は、２０℃～２５℃の温度で１０～３０分間インキュベートされる。いくつかの実施形態において、１部の２０％リン酸及び２．５部の１．０ｍｇ／ｍｌ ＤＮＰＨとホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む５０部の組成物との混合物は、２０℃～２５℃の温度で１５～２５分間インキュベートされる。いくつかの実施形態において、１部の２０％リン酸及び２．５部の１．０ｍｇ／ｍｌ ＤＮＰＨとホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む５０部の組成物との混合物は、２０℃～２５℃の温度で２０分間インキュベートされる。
いくつかの実施形態において、１部の２０％リン酸及び２．５部の１．０ｍｇ／ｍｌ ＤＮＰＨとホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む５０部の組成物との混合物は、２２℃の温度で１０～３０分間インキュベートされる。いくつかの実施形態において、１部の２０％リン酸及び２．５部の１．０ｍｇ／ｍｌ ＤＮＰＨとホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む５０部の組成物との混合物は、２２℃の温度で１５～２５分間インキュベートされる。いくつかの実施形態において、１部の２０％リン酸及び２．５部の１．０ｍｇ／ｍｌ ＤＮＰＨとホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む５０部の組成物との混合物は、２２℃の温度で２０分間インキュベートされる。
インキュベーション後、リン酸及びＤＮＰＨとホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む組成物との混合物は、任意の好適な方法によって分析され得る。一実施形態において、インキュベーション後、リン酸及びＤＮＰＨとホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む組成物との混合物は、ＨＰＬＣによって分析される。一実施形態において、インキュベーション後、リン酸及びＤＮＰＨとホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む組成物との混合物は、逆相ＨＰＬＣによって分析される。一実施形態において、逆相ＨＰＬＣカラムのリガンドは、Ｃ１８、ｎ－ブタル、ｎ－オクチル、フェニル、及びシアノプロピルから選択される。一実施形態において、逆相ＨＰＬＣカラムのリガンドは、Ｃ１８である。－実施形態において、水及びアセトニトリルの混合物（１：１、ｖ／ｖ）は、逆相ＨＰＬＣにおける移動相として使用される。一実施形態において、検出波長は、３６０ｎｍである。
一実施形態において、本開示は、不活性化されたウイルスを含む薬学的組成物中の残留ホルムアルデヒド含有量を決定する方法を提供し、
（ａ）ホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む組成物を提供するステップと、
（ｂ）５０部（ａ）の組成物を、１部の２０％リン酸及び２．５部の１ｍｇ／ｍｌ２，４－ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）と混合し、それにより混合物を提供するステップと、
（ｃ）（ｂ）の混合物を、室温で２０分間インキュベートするステップと、
（ｄ）Ｃ１８カラムならびに移動相として水及びアセトニトリル（１：１、ｖ／ｖ）の混合物を使用して、逆相ＨＰＬＣにより残留ホルムアルデヒドの存在について混合物を分析するステップとを含む。
一実施形態において、本開示は、不活性化されたジカウイルスを含む薬学的組成物中の残留ホルムアルデヒド含有量を決定する方法を提供し、
（ａ）ホルムアルデヒドで処理されているジカウイルスを含む組成物を提供するステップと、
（ｂ）５０部（ａ）の組成物を、１部の２０％リン酸及び２．５部の１ｍｇ／ｍｌ２，４－ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）と混合し、それにより混合物を提供するステップと、
（ｃ）（ｂ）の混合物を、室温で２０分間インキュベートするステップと、
（ｄ）Ｃ１８カラムならびに移動相として水及びアセトニトリル（１：１、ｖ／ｖ）の混合物を使用して、逆相ＨＰＬＣにより残留ホルムアルデヒドの存在について混合物を分析するステップとを含む。
アジュバント
本開示の他の態様は、ジカウイルスワクチン及び／または１つ以上のアジュバントと組み合わせた本明細書に記載の少なくとも１つのジカウイルスからの１つ以上の抗原を含む免疫原性組成物に関する。いくつかの実施形態において、ワクチン及び／または免疫原性組成物は、１つ以上のアジュバントと組み合わせた本明細書に記載されるような、配列番号１の９８位、または配列番号１の９８位に対応する位置でのトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有するジカウイルスなどの精製され不活性化された全ジカウイルスを含む。いくつかの実施形態において、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む、精製され不活性化された全ジカウイルスを含み、ジカウイルスは、１つ以上のアジュバントと組み合わせたＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。いくつかの実施形態において、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む、精製され不活性化された全ジカウイルスを含み、ジカウイルスは、１つ以上のアジュバントと組み合わせた配列番号２によるゲノム配列を含むＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。一実施形態において、ワクチン及び免疫原性組成物は、１つ以上のアジュバントと組み合わせたプラーク精製されたクローンジカウイルス単離株を含む。本開示のそのようなアジュバントワクチン及び／または免疫原性組成物は、それを必要とする対象におけるジカウイルス感染を治療もしくは予防するため、及び／またはそれを必要とする対象においてジカウイルスに指向する免疫応答、例えば、防御免疫応答を誘導するのに有用であり得る。
ワクチンのアジュバント効果を達成する様々な方法は、既知であり、本明細書に開示されるジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物と併せて使用され得る。一般原則及び方法は、“Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ“，１９９５，Ｄｕｎｃａｎ Ｅ．Ｓ．Ｓｔｅｗａｒｔ－Ｔｕｌｌ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ，ＩＳＢＮ ０－４７１－９５１７０－６、及びまた”Ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ“，１９９５，Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ Ｇ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＩＳＢＮ ０－３０６－４５２８３－９に詳述される。
例示的なアジュバントには、これらに限定されないが、アルミニウム塩、リン酸カルシウム、トル様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）、ＭＬＡ誘導体、合成リピドＡ、リピドＡ模倣体または類似体、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、乳剤（油乳剤）、キトサン、ビタミンＤ、ステアリルまたはオクタデシルチロシン、ビロソーム、コクリエート物、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマー粒子、微粒子、リポソーム、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）が含まれ得る。いくつかの実施形態において、アジュバントは、アルミニウム塩である。
いくつかの実施形態において、アジュバントは、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、及びＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ ８５のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態において、本開示のアルミニウム塩アジュバントは、本開示のジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物の抗原の吸着を増加させることが見出されている。したがって、いくつかの実施形態において、抗原の少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％は、アルミニウム塩アジュバントに吸着される。
本開示の特定の実施形態は、アジュバントジカウイルスワクチンまたは免疫原性組成物を調製する方法を含み、それは（ａ）アルミニウム塩アジュバントを有するワクチンまたは免疫原性組成物を、本明細書に記載される少なくとも１つのジカウイルスからの１つ以上の抗原を含むワクチンまたは免疫原性組成物と混合することと、（ｂ）混合物を、好適な条件下で、約１時間～約２４時間（例えば、約１６時間～約２４時間）の範囲の期間、アルミニウム塩アジュバントに吸着された少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の抗原と共にインキュベートすることとを含む。方法の特定の実施形態において、少なくとも１つのジカウイルスは、非ヒト細胞適応変異（例えば、Ｔｒｐ９８Ｇｌｙ変異などのタンパク質ＮＳ１における非ヒト細胞適応変異）を含むジカウイルスである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのジカウイルスは、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む、精製され不活性化された全ジカウイルスであり、ジカウイルスは、ＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。いくつかの実施形態において、ジカウイルスは、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む、精製され不活性化された全ジカウイルスであり、ジカウイルスは、配列番号２によるゲノム配列を含むＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。
ウイルス精製
本開示のさらなる態様は、ジカウイルスを精製する方法に関する。いくつかの実施形態において、方法は、複数の細胞にジカウイルスの集団を含む種菌を接種することと、プラーク精製により接種された細胞の１つ以上からジカウイルスクローン単離株を得ることとを含む、いくつかの実施形態において、細胞は、非ヒト細胞（例えば、昆虫細胞、哺乳動物細胞など）である。いくつかの実施形態において、細胞は、昆虫細胞（本明細書に記載される蚊細胞／細胞株のいずれかなど）である。いくつかの実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞（本明細書に記載される哺乳動物細胞／細胞株のいずれかなど）である。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、ベロ細胞である。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、ベロ細胞である。
いくつかの実施形態において、ジカウイルスの集団は、異種であり、すなわち、それは２つ以上の遺伝子型を含む。２つ以上の遺伝子型は、少なくとも１つのヌクレオチドにおいて互いに異なる。いくつかの実施形態において、ジカウイルスの集団は、ジカウイルス臨床単離株（例えば、ＰＲＶＡＢＣ５９株から）及び／または細胞培養物に以前に継代されている１つ以上のジカウイルスを含む。ジカウイルスの臨床単離株は、ジカウイルスに感染している患者の試料から得られる。いくつかの実施形態において、プラーク精製（例えば、本明細書に記載されるような）は、異種ウイルス集団からの（遺伝子的に同種の）臨床単離株の実質的及び／完全な分離を可能にする。いくつかの実施形態において、サル細胞は、ベロ細胞株からのものである（例えば、ベロ１０－８７細胞）。いくつかの実施形態において、種菌は、ヒト血清を含む。いくつかの実施形態において、種菌は、１つ以上の外来性物質（例えば、１つ以上の汚染ウイルス）を含む。いくつかの実施形態において、プラーク精製（例えば、本明細書に記載されるような）は、１つ以上の外来性物質からの（遺伝子的に同種の）臨床単離株の実質的及び／完全な精製を可能にする。
いくつかの実施形態において、ジカウイルスクローンを単離及び／または精製するための記載される方法は、ジカウイルスクローン単離株の１つ以上（例えば、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上など）の追加のプラーク精製を含む。いくつかの実施形態において、ジカウイルスクローン単離株を単離及び／または精製するための記載される方法は、ジカウイルスクローン単離株を、細胞培養物中（例えば、蚊細胞株などの昆虫細胞中及び／またはベロ細胞中株などの哺乳動物細胞中で）で１回以上（例えば、１回以上、２回以上、３回以上、４回以上、５回以上など）継代することを含む。
本開示のさらなる態様は、ワクチンまたは免疫原性組成物の調製のためにジカウイルスを精製する方法に関する。いくつかの実施形態において、方法は、１つ以上（例えば、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ）のステップを（以下の順番を含む、任意の順番で）含む：ジカウイルスを含む試料もしくは調製物の深層ろ過を行うステップ；ジカウイルスを含む試料をバッファー交換及び／または希釈し（例えば、クロスフローろ過（ＣＦＦ）によって）、保持物を生成するステップ；ジカウイルスを含む試料をイオン交換膜（例えば、アニオン交換膜、カチオン交換膜）と結合し、ジカウイルスを含む結合された画分を生成するステップ、及び結合された画分をイオン交換膜から溶出するステップ；ジカウイルスを含む試料を、有効量の、本明細書に記載される化学不活性化剤のいずれかで処理するステップ；化学的に不活性化されたジカウイルスを含む試料を、メタ重亜硫酸ナトリウムで中和するステップ；及び／または化学的に不活性化されたジカウイルスを含む中和された試料を精製するステップ（例えば、クロスフローろ過（ＣＦＦ）によって）。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）ジカウイルスを含む試料を第１の深層フィルターに通し、ジカウイルスを含む第１の溶出液を生成するステップ；（ｂ）クロスフローろ過（ＣＦＦ）によって、第１の溶出液をバッファー交換及び／または希釈し、ジカウイルスを含む第１の保持物を生成するステップ；（ｃ）第１の保持物をイオン交換膜と結合し、ジカウイルスを含む第１の結合された画分を生成するステップ、及び第１の結合された画分をイオン交換膜から溶出し、ジカウイルスを含む第２の溶出液を生成するステップ；（ｄ）第２の溶出液を第２の深層フィルターに通し、ジカウイルスを含む第２の保持物を生成するステップ；（ｅ）第２の保持物を、有効量の化学不活性化剤で処理するステップ；（ｆ）処理された第２の保持物を、メタ重亜硫酸ナトリウムで中和するステップ；ならびに（ｇ）クロスフローろ過（ＣＦＦ）によって、中和された第２の保持物を精製するステップを含む。
本発明の方法において、ジカウイルス調製物は、試験管内で培養された１つ以上の細胞から単離され、細胞は、深層ろ過、バッファー交換及び／または希釈、ならびにイオン交換クロマトグラフィーから選択される１つ以上のステップによってジカウイルス調製物を生成するために使用される。一実施形態において、ジカウイルス調製物は、試験管内で培養された１つ以上の細胞から単離され、細胞は、深層ろ過、バッファー交換及び／または希釈、ならびにイオン交換クロマトグラフィーのステップによってジカウイルス調製物を生成するために使用される。一実施形態において、ジカウイルス調製物は、試験管内で培養された１つ以上の細胞から単離され、細胞は、深層ろ過、バッファー交換及び／または希釈、ならびにイオン交換クロマトグラフィーのステップによってジカウイルス調製物を生成するために使用され、ステップは、深層ろ過、バッファー交換及び／または希釈、ならびにイオン交換クロマトグラフィーの順で行われる。
深層ろ過は、多孔質ろ過培地が使用され、粒子は、培地内に保持され、培地表面だけではないことを意味する。
一実施形態において、ジカウイルス調製物を含む試料のバッファー交換及び／または希釈のステップは、クロスフローろ過を含む。タンジェンシャルフローろ過とも称されるクロスフローろ過では、供給流は、フィルターの表面にわたって接線方向に流れ、フィルターには流れない。
一実施形態において、イオン交換クロマトグラフィーのステップは、アニオン交換クロマトグラフィーを含む。一実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィーは、第四級アンモニウムリガンドを含むアニオン交換膜を使用する。いくつかの実施形態において、ウイルスは、段階溶出によって、例えば、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、及び７５０ｍＭ ＮａＣｌを使用して、アニオン交換膜から溶出される。
ワクチン及び／または免疫原性組成物の製剤
本開示のさらなる態様は、本明細書に記載されるジカウイルスからの１つ以上の抗原を含む本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物の製剤に関する。いくつかの実施形態において、ジカウイルスは、精製され不活性化された全ジカウイルスである。いくつかの実施形態において、精製され不活性化された全ジカウイルスは、配列番号１の９８位、または配列番号１の９８位に対応する位置に変異を含む。いくつかの実施形態において、精製され不活性化された全ジカウイルスは、配列番号１の９８位、または配列番号１の９８位に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む。いくつかの実施形態において、精製され不活性化された全ジカウイルスは、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含み、精製され不活性化された全ジカウイルスを含み、ジカウイルスは、ＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。いくつかの実施形態において、精製され不活性化された全ジカウイルスは、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含み、精製され不活性化された全ジカウイルスを含み、ジカウイルスは、配列番号２によるゲノム配列を含むＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。
本明細書に記載されるジカウイルスから１つ以上の抗原を含む本開示のそのようなワクチン及び／または免疫原性組成物は、それを必要とする対象におけるジカウイルス感染を治療もしくは予防するため、及び／またはそれを必要とする対象においてジカウイルスに指向する免疫応答、例えば、防御免疫応答を誘導するのに有用であり得る。
典型的には、本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物は、液体溶液または懸濁液としてのいずれかで注射剤として調製され、注射前の、液体中の溶液または懸濁液に好適な固体形態もまた調製され得る。そのような調製物はまた、乳化され得るか、または乾燥粉末として製造され得る。活性免疫原性成分は、しばしば、薬学的に許容される及び活性成分と適合性である賦形剤と混合される。好適な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、スクロース、グリセロール、エタノール、または同等物、及びそれらの組み合わせである。加えて、所望である場合、ワクチンまたは免疫原性組成物は、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、またはワクチンもしくは免疫原性組成物の効果を高めるアジュバントなどの補助物質を含み得る。
ワクチンまたは免疫原性組成物は、注射によって非経口的に、例えば、皮下、経皮、皮内、皮下、または筋肉内のいずれかで好都合に投与され得る。他の様式の投与に好適な追加の製剤は、座薬を含み、いくつかの場合では、口腔、経口、鼻腔内、頬側、舌下、腹腔内、膣内、肛門、及び頭蓋内製剤を含む。座薬について、伝統的な結合剤及び担体は、例えば、ポリアルカレングリコールまたはトリグリセリドを含み得、そのような座薬は、０．５％～１０％、またはさらには１～２％の範囲で活性成分を含む混合物から形成され得る。特定の実施形態において、脂肪酸グリセリドまたはココアバターの混合物などの低融点ワックスは、最初に溶融され、本明細書に記載されるジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物は、例えば、撹拌することによって、均一に分散される。次いで、溶融した均一な混合物を、好都合なサイズの鋳型に注ぎ入れ、冷却し、凝固させる。
本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物は、投与量製剤と適合性である様式で、及び治療的に有効及び免疫原性であるそのような量で投与され得る。投与される量は、例えば、免疫応答をマウントする個体の免疫系の能力、及び所望の防御の程度を含む、治療される対象に依存する。好適な投与量の範囲は、例えば、約０．１μｇ～約１００μｇの精製され不活性化された全ジカウイルスを含み得る。精製され不活性化されたジカウイルスの量は、標準曲線を確立する組換えジカエンベロープタンパク質の定義された量を使用するブラッドフォードアッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９７６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８－２５４）によって、決定され得る。
初期投与及び補強注射の好適な計画はまた、変化するが、初期投与、続いて、その後の接種または他の投与により典型となっている。
用途の様式は、幅広く変化し得る。ワクチンまたは免疫原性組成物の投与の従来の方法のいずれも適用可能である。これらは、注射または同等物による、非経口的に、固体の生理学的に許容される塩基、または生理学的に許容される分散において経口用途を含む。ワクチンまたは免疫原性組成物の投与量は、投与の経路に依存し、ワクチン接種されるその人の年齢及び抗原の製剤によって変化し得る。ワクチンまたは免疫原性組成物は、本明細書に記載されるように、０．５ｍＬ超、０．５ｍＬ、または０．５ｍＬ未満の単位投与量体積を有し得る。例えば、それは、０．２５ｍＬの体積で投与され得る。
張度を調節するために、ナトリウム塩などの生理学的塩を含むことが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、１～２０ｍｇ／ｍｌで存在し得る。存在し得る他の塩には、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが含まれる。
本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物は、１つ以上のバッファーを含み得る。典型的なバッファーには、リン酸塩バッファー、トリスバッファー、ホウ酸塩バッファー、コハク酸塩バッファー、ヒスチジンバッファー（特に、水酸化アルミニウムアジュバントを含む）、または酢酸塩バッファーが含まれる。バッファーは、典型的には、５～２０ｍＭの範囲で含まれる。
ワクチンまたは免疫原性組成物のｐＨは、概して、５．０～８．５または５．０～８．１、及びより典型的には６．０～８．５、例えば、６．０～８．０、６．５～８．０、６．５～７．５、７．０～８．５、７．０～８．０、または７．０～７．８である。したがって、本開示の製造プロセスは、パッケージングの前に大量のワクチンのｐＨを調節するステップを含み得る。
ワクチンまたは免疫原性組成物は、好ましくは、減菌である。それは、好ましくは、例えば、用量当たり＜１ＥＵ（エンドトキシンユニット、標準測定）、及び好ましくは用量当たり＜０．１ＥＵを含む、非発熱性である。それは、好ましくは、グルテンを含まない。
特定の実施形態において、本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物は、有効濃度で界面活性剤を含み得る。いくつかの実施形態において、有効量の界面活性剤は、限定することなく、約０．００００５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖまたは約０．０００１％ｖ／ｖ～約１％ｖ／ｖを含み得る。特定の実施形態において、有効量の界面活性剤は、約０．００１％ｖ／ｖ、約０．００２％ｖ／ｖ、約０．００３％ｖ／ｖ、約０．００４％ｖ／ｖ、約０．００５％ｖ／ｖ、約０．００６％ｖ／ｖ、約０．００７％ｖ／ｖ、約０．００８％ｖ／ｖ、約０．００９％ｖ／ｖ、または約０．０１％ｖ／ｖである。理論に拘束されることを望まないが、界面活性剤は、溶液中の本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物を維持することを助け、ワクチン及び／または免疫原性組成物が凝集するのを防ぐことを助ける。
好適な界面活性剤には、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「Ｔｗｅｅｎｓ」として既知である）、オクトキシノール（オクトキシノール－９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００）またはｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノールなど）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（「ＣＴＡＢ」）、及びデオキシコール酸ナトリウムが含まれる。界面活性剤は、微量でのみ存在し得る。微量の他の残留構成成分は、抗生物質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）であり得る。いくつかの実施形態において、界面活性剤は、ポリソルベートを含む。いくつかの実施形態において、有効濃度の界面活性剤は、約０．００００５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖの範囲を含む。
ワクチン及び／または免疫原性組成物は、好ましくは、２℃～８℃で保存される。それらは、理想的には直接光を避けるべきである。抗原及び乳剤は、典型的には、混和物中にあり得るが、それらは、即座の混合のための別個の構成成分のキットの形態で存在する。ワクチン及び／または免疫原性組成物は、概して、対象に投与されるときは水性形態である。
本開示の方法
本開示のさらなる態様は、本明細書に記載されるように、配列番号１の９８位、または配列番号１の９８位に対応する位置での、トリプトファンからグリシンへの置換である変異を有するジカウイルスなどの精製され不活性化された全ジカウイルスを含む本明細書に記載されるワクチン及び／または免疫原性組成物を使用して、ジカウイルスを治療もしくは予防する必要がある対象において治療もしくは予防する及び／またはジカウイルスへの免疫応答を誘導する必要がある対象において誘発する方法に関する。本開示のさらなる態様は、配列番号１の９８位、または配列番号１の９８位に対応する位置での、トリプトファンからグリシンへの置換である変異を有する精製され不活性化された全ジカウイルスを含む本明細書に記載されるワクチン及び／または免疫原性組成物を使用して、ジカウイルスを治療もしくは予防する必要がある対象において治療もしくは予防する及び／またはジカウイルスへの免疫応答を誘導する必要がある対象において誘発する方法に関する。本開示のさらなる態様は、配列番号１の９８位、または配列番号１の９８位に対応する位置での、トリプトファンからグリシンへの置換である変異を有する精製され不活性化された全ジカウイルスを含む本明細書に記載されるワクチン及び／または免疫原性組成物を使用して（ジカウイルスは、ＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する）、ジカウイルスを治療もしくは予防する必要がある対象において治療もしくは予防する及び／またはジカウイルスへの免疫応答を誘導する必要がある対象において誘発する方法に関する。本開示のさらなる態様は、配列番号１の９８位、または配列番号１の９８位に対応する位置での、トリプトファンからグリシンへの置換である変異を有する精製され不活性化された全ジカウイルスを含む本明細書に記載されるワクチン及び／または免疫原性組成物を使用して（ジカウイルスは、配列番号２によるゲノム配列を含むＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する）、ジカウイルスを治療もしくは予防する必要がある対象において治療もしくは予防する及び／またはジカウイルスへの免疫応答を誘導する必要がある対象において誘発する方法に関する。
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載されるように、配列番号１の９８位、または配列番号１の９８位に対応する位置でのトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有するジカウイルスなどの精製され不活性化された全ジカウイルスを対象に投与することによって、ジカウイルス感染を治療または予防することを必要とする対象において治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態において、本開示は、配列番号１の９８位、または配列番号１の９８位に対応する位置でのトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有する精製され不活性化された全ジカウイルスを含む、治療有効量の、本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物を対象に投与することによって、ジカウイルス感染を治療または予防することを必要とする対象において治療または予防する方法に関する。いくつかの実施形態において、本開示は、配列番号１の９８位、または配列番号１の９８位に対応する位置でのトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有する精製され不活性化された全ジカウイルスを含む（ジカウイルスは、ＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する）、治療有効量の、本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物を対象に投与することによって、ジカウイルス感染を治療または予防することを必要とする対象において治療または予防する方法に関する。いくつかの実施形態において、本開示は、配列番号１の９８位、または配列番号１の９８位に対応する位置でのトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有する精製され不活性化された全ジカウイルスを含む（ジカウイルスは、配列番号２によるゲノム配列を含むＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する）、治療有効量の、本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物を対象に投与することによって、ジカウイルス感染を治療または予防することを必要とする対象において治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載されるように、配列番号１の９８位、または配列番号１の９８位に対応する位置でのトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有するジカウイルスなどの精製され不活性化された全ジカウイルスを含む、治療有効量の、本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物を対象に投与することによって、ジカウイルスへの免疫応答を誘導することを必要とする対象において誘発する方法に関する。いくつかの実施形態において、本開示は、配列番号１の９８位、または配列番号１の９８位に対応する位置でのトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有する精製され不活性化された全ジカウイルスを含む（ジカウイルスは、ＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する）、治療有効量の、本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物を対象に投与することによって、ジカウイルスへの免疫応答を誘導することを必要とする対象において誘発する方法に関する。いくつかの実施形態において、本開示は、配列番号１の９８位、または配列番号１の９８位に対応する位置でのトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有する精製され不活性化された全ジカウイルスを含む（ジカウイルスは、配列番号２によるゲノム配列を含むＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する）、治療有効量の、本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物を対象に投与することによって、ジカウイルスへの免疫応答を誘発することを必要とする対象において誘導する方法に関する。
いくつかの実施形態において、投与ステップは、対象においてジカウイルスに対する防御免疫応答を誘導する。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態において、対象は、妊娠しているか、または妊娠することを意図している。
いくつかの実施形態において、投与ステップは、１つ以上の投与を含む。投与は、単回投与スケジュールまたは複数回投与（プライムブースト）スケジュールによるものであり得る。複数回投与スケジュールにおいて、同じまたは異なる経路、例えば、プライム及び粘膜ブースト、粘膜プライム及び非経口ブーストなどによって、様々な用量が与えられ得る。典型的には、それらは、同じ経路によって与えられる。複数回用量は、典型的には、少なくとも１週間間隔（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、約１０週間、約１１週間、約１２週間、約１６週間など）で投与される。２５～３０日（例えば、２８日）で分割して２回の用量を与えることは、特に有用である。
本開示の方法は、治療有効量または免疫原性量の、本開示のジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物の投与を含む。治療有効量または免疫原性量は、それが投与される、感染していない、感染している、または曝露されていない対象において防御免疫学的応答を誘導する本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物の量であり得る。そのような応答は、概して、ワクチンに対する分泌性の、細胞及び／または抗体媒介免疫応答の対象における発達をもたらすであろう。通常、そのような応答には、これらに限定されないが、以下の効果のうちの１つ以上異常が含まれる；免疫グロブリンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、またはＭなどの免疫学的分類のうちのいずれかからの抗体の生成；Ｂ及びＴリンパ球の増殖；免疫学的細胞に対する活性化、増殖、及び分化シグナルの提供；ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、及び／または細胞傷害性Ｔ細胞の拡大。
好ましくは、治療有効量または免疫原性量は、疾患症状の治療または予防をもたらすのに十分である。必要とされる正確な量は、他の要因の中でも、治療されている対象；治療されている対象の年齢及び一般的な状態；抗体を合成する対象の免疫系の能力；所望の防御の程度；治療されている状態の重症度；選択される特定のジカウイルスワクチン抗原；ならびに投与のその様式によって変化するであろう。適切な治療有効量または免疫原性量は、当業者によって容易に決定され得る。治療有効量または免疫原性量は、日常の試験を通して決定され得る比較的に幅広い範囲になるであろう。
本開示は、以下の実施例の参照によって、より完全に理解されるであろう。しかしながら、それらは、いかなる方法においても本開示の任意の態様または範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例１：クローンジカウイルス株生成
この実施例は、既知の研究歴と共にジカウイルス（ＺＩＫＡＶ）株の生成を記載する。
材料及び方法
ベロ細胞の維持
１つのバイアルのＷＨＯベロ１０－８７細胞を、水浴中で急速に解凍し、５％ＣＯ２、３６℃＋／２℃で、Ｔ－７５ｃｍ２フラスコ中のペニシリン－ストレプトマイシン、Ｌ－グルタミン４０ｍＭ、及び１０％ＦＢＳを含む１９ｍＬの事前に温められたＤＭＥＭ（ダルベッコ改変最小必須培地）に直接接種した。細胞を、コンフルエンシーに増殖させ、ＴｒｙｐｌＥを使用して継代培養した。このフラスコを、２つのＴ－１８５ｃｍ２フラスコに拡大し、コンフルエンシーに増殖させ、３１ｘＴ－１８５ｃｍ２フラスコに継代培養し、細胞が１００％コンフルエンシーを達成するまで増殖させた。細胞を、トリプシン処理によって採取し、１０分間８００ｘｇで遠心分離し、１．９ｘ１０７個の細胞／ｍＬの濃度で１０％ＦＢＳ及び１０％ＤＭＳＯを含むＤＭＥＭに再懸濁した。１つのバイアルのベロ細胞を、急速に解凍し、Ｔ－７５ｃｍ２フラスコに、上に記載されるように蘇生した。これらを２回継代培養して、１３ｘＴ－１８５ｃｍ２フラスコに細胞バンクを生成した。トリプシン処理後、細胞を、８００ｘｇで遠心分離し、４．６８ｘ１０５個の細胞／ｍＬの濃度で凍結培地（１０％ＦＢＳ、及び１０％ＤＭＳＯを含むＤＭＥＭ）に再懸濁した。この細胞バンクを、凍結保存バイアルにアリコートした。
ベロ細胞を増殖し、ペニシリン－ストレプトマイシン、Ｌ－グルタミン、及び１０％ＦＢＳ（ｃＤＭＥＭ－１０％－ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ中で維持した。ＴｒｙｐｌＥｘｐｒｅｓｓを使用して、細胞を維持及びトリプシン処理した。ウイルス吸着の２日前に、６ウェルプレートに、３ｍＬのｃＤＭＥＭ－１０％－ＦＢＳ中４～５ｘ１０５個の細胞／ウェル、または５ｍＬ ｃＤＭＥＭ－１０％－ＦＢＳ中のＴ－２５ｃｍ２フラスコ中７ｘ１０５個の細胞、または０．１ｍＬ ｃＤＭＥＭ－１０％－ＦＢＳ中の９６ウェルプレート中１ｘ１０４個の細胞／ウェルを播種した。インキュベーターを、毎日監視し、示される温度を維持した。ベロ細胞株を、液体窒素中に保存した。
プラークアッセイ
６ウェルプレートで増殖したベロ細胞の新鮮なコンフルエントな単層におけるプラーク滴定によって、ウイルス力価を決定した。凍結したアリコートを解凍し、アリコートの一連の１０倍希釈を、９６ウェルプレート中のｃＤＭＥＭ－０％－ＦＢＳ中に作成した。希釈したウイルスを、ベロ細胞単層の接種の前に氷上で維持した。アッセイ時に、増殖培地を、６ウェルプレートから吸引し、１００μＬの各ウイルス希釈を、ウェルに添加した。ウイルスを、プレートを頻繁に（１０分毎）振盪しながら、５％ＣＯ２、３６℃±２℃で６０分間吸着させて、細胞シートの乾燥を予防した。ウイルスの吸着後、４０～４１℃で維持された４ｍＬの第１のアガロースの重層（１倍ｃＤＭＥＭ－２％－ＦＢＳ＋０．８％アガロース）を、各ウェルに添加した。アガロースを、室温で３０分間凝固させ、次いで、プレートを、５％ＣＯ２、３６℃＋／２℃で４～６日間、逆さまでインキュベートした。１６０μｇ／ｍＬのニュートラルレッドバイタル色素を含む２ｍＬの第２のアガロースの重層を、４日目に添加した。プラークを、５日目及び６日目に可視化した。
ＴＣＩＤ５０アッセイによるウイルス定量化
９６ウェルプレートで増殖したベロ細胞の新鮮なコンフルエントな単層における滴定によって、ウイルス力価もまた決定した。凍結したアリコートを解凍し、アリコートの一連の１０倍希釈を、９６ウェルプレート中のｃＤＭＥＭ－２％－ＦＢＳ中に作成した。希釈したウイルスを、ベロ細胞単層の接種の前に氷上で維持した。アッセイ時に、増殖培地を、９６ウェルプレートから吸引し、１００μＬの各ウイルス希釈を、ウェルに添加した。プレートを、５％ＣＯ２、３６℃＋／２℃で５日間インキュベートした。５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）力価を、リード・ミュンヒ（Ｒｅｅｄ／Ｍｕｅｎｃｈ）計算法を使用して計算した。
試験物
ジカウイルス株ＰＲＶＡＢＣ５９（ドライアイス上の１つの０．５ｍＬバイアル）を、ＲＴ－ＰＣＲによりジカウイルスの識別が確認された疾病管理予防センター（ＣＤＣ）から受け取った。株は、ＰＣＲによるアルファウイルス及びマイコプラズマ汚染の試験で陰性であった。この情報を、表１に要約する。
Figure 0007443233000001
配列決定
製造業者のプロトコルに従って、ＱＩＡａｍｐＶｉｒａｌ ＲＮＡミニスピンキットを使用して、各単離株の安定化されたウイルス採取物からＲＮＡを抽出した。各単離株から抽出されたＲＮＡを使用して、全ジカウイルスゲノムを包含する６つのｃＤＮＡ断片を作製及び増幅した。増幅されたｃＤＮＡ断片を、１％アガロース／ＴＢＥゲルで、サイズ及び純度について分析し、その後、ゲルを、キアゲンクイックゲル抽出キットを使用して精製した。ＡＢＩ ３１３０ＸＬ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ配列決定を使用して、自動配列決定応答を行った。Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ ＳｅｑＭａｎソフトウェアを使用して、配列決定データを分析した。
結果
米国の現在のＺＩＫＡＶの発生に関連した既知の研究歴を含むＺＩＫＡＶ株を探究した。この理由のために、ＺＩＫＡＶ株ＰＲＶＡＢＣ５９を選択した。ベロ細胞における増殖に適応された十分に特徴付けられたウイルスを生成するために、まずＺＩＫＡＶ ＰＲＶＡＢＣ５９をベロ細胞において増幅した（Ｐ１）。
１００％コンフルエントであるフラスコのベロ細胞（Ｔ－１７５ｃｍ２）を、４ｍＬのｃＤＭＥＭ－０％－ＦＢＳ中０．０１のＭＯＩで感染させた。ウイルスを、５％ＣＯ２、３６℃±２℃で６０分間単層に吸着させ、次いで、２０ｍＬのｃＤＭＥＭ－０％－ＦＢＳを、５％ＣＯ２、３６℃±２℃で、ウイルス増幅に適用した。細胞層を、インキュベーション後に細胞変性効果（ＣＰＥ）について毎日監視した（図１）。培地を収集し、遠心分離により清澄化することによって、９６時間後に上清を採取した（６００ｘｇ、４℃、１０分）。１８％ｗ／ｖの最終濃度までトレハロースを添加することによって、採取物を安定化した。その大半を、０．５ｍＬ凍結保存バイアルにアリコートし、－８０℃で保存した。
安定化したＰ１採取物を、ＴＣＩＤ５０アッセイによってベロ細胞単層上感染性ウイルスの存在について分析した。増殖動態を、０時間から始めて毎日アリコートを取ることによって監視した。ピーク力価は、７２時間までに到達した（図２）。
Ｐ１材料を、ベロ細胞の６ウェル単層上で３日目から採取物を滴定することによってプラーク精製した。プラークを、６日目に可視化し、単離される１０個のプラークを、プラスチックプレートの底の異なる及び別個のプラークの周りに円を描くことによって特定した。ウェルの底を削り、ｃＤＭＥＭ－１０％－ＦＢＳですすぎながら、減菌ワイドボアピペットを使用して、アガロースのプラグを抽出することによってプラークを取った。アガロースプラグを、０．５ｍＬのｃＤＭＥＭ－１０％－ＦＢＳに添加し、ボルテックスし、ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ２ａ－ｊとして標識し、５％ＣＯ２、３６℃±２℃で、一晩インキュベーターに置いた。
３つのプラーク（ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ２ａ－ｃ）を追加の精製に進めた。各単離株を、ベロ細胞の新鮮な６ウェル単層に２つ組で手際よく播種した。このＰ２／Ｐ３移行を、プラーク精製し、ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ３ａ－ｊと標識した。
６つのプラーク（ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ３ａ～ｆ）を、最終回の精製に進めた。各単離株を、ベロ細胞の新鮮な６ウェル単層に２つ組で手際よく播種した。このＰ３／Ｐ４移行を、プラーク精製し、ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ４ａ－ｊと標識した。
Ｐ４プラーク精製からの６つのプラーク（ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ４ａ～ｆ）を、Ｔ－２５ｃｍ２フラスコで、ベロ細胞の単層上で盲目継代した。各プラークピックを、２ｍＬ ｃＤＭＥＭ－０％－ＦＢＳに希釈し、１ｍＬを、５％ＣＯ２、３６℃±２℃で１時間吸着させ、もう一方の１ｍＬを、トレハロース（１８％ｖ／ｖ最終）で安定化し、＜－６０℃で保存した。ウイルス吸着後、ｃＤＭＥＭ－０％－ＦＢＳを、各フラスコに添加し、５％ＣＯ２、３６℃±２℃で４日間増殖させた。ウイルス上清を採取し、遠心分離（６００ｘｇ、４Ｃ、１０分）により清澄化し、１８％トレハロース中で安定化させ、＜－６０℃でアリコート及び保存した。このＰ５シードを、ジカウイルス効力についてＴＣＩＤ５０によって試験した（図３）。
Ｔ－１７５ｃｍ２フラスコのベロ細胞のコンフルエントな単層を、４ｍＬのｃＤＭＥＭ－０％－ＦＢＳ中０．０１のＭＯＩで、ＰＲＶＡＢＣ５９（Ｐ５ａ～ｆ）の６つのクローンの各々に感染させた。ウイルスを、５％ＣＯ２、３６℃＋／２℃で６０分間吸着させ、その後、２０ｍＬのｃＤＭＥＭ－０％－ＦＢＳを、各フラスコに添加し、５％ＣＯ２、３６℃＋／２℃で増殖させた。ベロ細胞単層の健康及びＣＰＥを、毎日監視した。ウイルスを、示されるように３日目及び５日目に採取した（図４）。３日目及び５日目からのＰ６株採取物をプールし、１８％トレハロースで安定化させ、＜－６０℃でアリコート及び保存した。
ＰＲＶＡＢＣ５９（Ｐ６ａ～ｆ）の６つのクローンの各々を、ジカウイルスの試験管内効力について試験した（図５）。効力を、ＴＣＩＤ５０及びプラーク滴定の２つの異なる方法によって決定した。ＴＣＩＤ５０を、ＣＰＥ（顕微鏡）の可視的検査によって、及び赤色（ＣＰＥなし）と比較してＣＰＥ（黄色）を示すウェルの吸光度（Ａ５６０～Ａ４２０）の差を測定することによって計算した。プレートを、プレートリーダーで読み取り、顕微鏡読み取りプレートとして同じ計算法に適用した（吸光度）。２つのスコアリング技術間のＴＣＩＤ５０の値は、かなり似ているが、プラーク滴定によって得られた値は、より低い。
Ｐ６ウイルスの生成及び特徴付けの要約を以下の表２に示す。
Figure 0007443233000002
フラビウイルスのエンベロープタンパク質は、ウイルスの主要な免疫原性部分であるため、元の単離株のエンベロープ糖タンパク質に非常に似ている単離されたジカウイルスクローンを、探究した。ＰＲＶＡＢＣ５９クローンＰ６ａ、Ｐ６ｃ、Ｐ６ｄ、及びＰ６ｆは、エンベロープ領域（Ｇ９９０Ｔ）におけるヌクレオチド９９０でＧ→Ｔ変異を含むが、エンベロープ残基３３０におけるアミノ酸変異をもたすが、ＰＲＶＡＢＣ５９クローンＰ６ｂ及びＰ６ｅのエンベロープ遺伝子は、参照株（ＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＫＵ５０１２１５．１）に対して同一であった（表３及び図６）。
Figure 0007443233000003
次いで、ジカエンベロープ配列において変異を欠乏する２つのクローンに、完全ゲノム配列決定を行った。配列決定の結果を、上の表３に要約する。配列分析は、両方のクローンのＮＳ１領域におけるヌクレオチド２９２でのＴ→Ｇ置換を明らかにし、ＮＳ１残基９８でのＴｒｐ→Ｇｌｙ変異をもたらした。この変異はまた、高重複度な配列決定（ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）により後に確認した。ＮＳ１ Ｗ９８Ｇ変異は、ＺＩＫＡＶ ＮＳ１のウイングドメインの絡み合ったループ内に位置し、それは、膜会合、エンベロープタンパク質との相互作用、及び潜在的に六量体のＮＳ１形成に関与している。他のトリプトファン残基（Ｗ１１５、Ｗ１１８）は、フラビウイルスにわたって高度に保存されるが、一方で、Ｗ９８は、保存されない（図７）。しかしながら、興味深いことに、Ｗ９８残基の１００％の保存が、アフリカ及びアジア系統からのものを含む、１１個の異なるＺＩＫＡＶ株にわたって観察される。各株において特定された変異を、表４に要約する。
Figure 0007443233000004
ＺＩＫＡＶ ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ６ストックの表現型分析を行い、ＺＩＫＡＶクローンを特徴付けた。図８に示され、図９に定量化されるように、各クローン単離株は、大きなプラーク及び小さなプラークの混合集団を有したＰ１ウイルスと比較して、大きなサイズのプラークの比較的に同種の集団からなっていた。これらのデータは、単一ＺＩＫＡＶクローンの成功した単離を提案する。
次に、ＺＩＫＡＶ ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ６クローンのベロ細胞における増殖動態分析を分析した。ベロ細胞を、無血清増殖培地で０．０１ＴＣＩＤ５０／細胞の各ＺＩＫＡＶ Ｐ６クローンに感染させた。ウイルス上清試料を、毎日取り、ＴＣＩＤ５０アッセイにより感染性力価について同時にアッセイした。全てのＰ６クローンについて、ピーク力価は、３日目及び４日目に生じた（約９．０ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）。様々なＰ６クローンの増殖動態に著しい差はなかった（図１０）。
まとめると、結果は、ジカウイルスシードが順調に生成されたことを示す。このシード選択は、ウイルスの増殖歴、動態、収率、遺伝子型、及び表現型の理解を必要とした。重要なことには、ジカウイルス株のクローン単離株は、物質を汚染せずにウイルスの成功した精製を可能にした（例えば、親ヒト単離株にあり得る外来性物質）。興味深いことに、３つの連続したプラーク精製は、これらの株が、ウイルスエンベロープタンパク質において変異を抱える株Ｐ６ａ、ｃ、ｄ、及びｆと共に無血清ベロ細胞培養物において十分に複製することができたベロ細胞適応ウイルス（株Ｐ６ａ～ｆ）をすばやく選択することに成功したが、一方で、株ｐ６ｂ及びｐ６ｅは、ウイルスＮＳ１タンパク質における変異を得た（ウイルスエンベロープへの修飾なし）。さらに、ベロ適応株は、効率的及び再生可能な増殖ならびにこれらの株から増殖されたその後のウイルス継代の製造を可能にした。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、Ｅｎｖ３３０での変異をまたベロ細胞における継代時に観察したため、Ｅｎｖ－Ｖ３３０Ｌ変異は、株Ｐ６ａ、ｃ、ｄ、及びｆは、潜在的に、試験管内適応の結果であり得る（Ｗｅｇｅｒ－Ｌｕｃａｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１７．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）。エンベロープタンパク質が、ジカウイルスの主要な免疫原性エピトープであるため、Ｅｎｖにおいてベロ適応変異を含む株は、ワクチンの免疫原性に負に影響を与え得る。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、タンパク質ＮＳ１における適応変異は、ウイルス複製を高めるだけでなく、またジカウイルスのエンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）内などの望ましくない変異の発生を低減、またはそうでなければ阻害し得るように思われる。加えて、ＮＳ１は、ウイルスの生活環中にエンベロープタンパク質と結合することが既知であり得る。この変異（ＮＳ１ Ｗ９８Ｇ）は、下流プロセス中にウイルスと共に、会合及びあるいは同時精製するＮＳ１の能力を変化させることに関与し得る。ＮＳ１はまた、免疫原性であることが既知であり、ワクチンに対する免疫応答に関与し得る。
実施例２：Ｐ６ｂ及びＰ６ｅ株に由来する精製され不活性化されたジカウイルスワクチン（ＰＩＺＶ）の前臨床免疫原性及び有効性
以下の実施例は、Ｐ６ｂ及びＰ６ｅ株に由来する不活性化されたジカウイルスワクチンの（ＰＩＺＶ）ＣＤ１及びＡＧ１２９マウスにおける前臨床免疫原性及び有効性を説明する。実施例１に記載されるように、６つのクローンを、流行的に関連するＰＲＶＡＢＣ５９株から生成し、２つ（Ｐ６ｂ及びＰ６ｅ）を、さらなる前臨床免疫原性及び有効性研究のために選択した。
材料及び方法
ジカウイルスワクチンの精製、不活性化、及び製剤
前臨床免疫原性及び有効性研究での使用に好適な多数の不活性されたＺＩＫＡＶワクチンを、生成して特徴付けた。ウイルスを、０．０１のＭＯＩで、フラスコのコンフルエントなベロ細胞を感染させることによって、Ｐ６ｂ及びＰ６ｅ株から増幅した。ウイルスを、３６℃±２℃／５％ＣＯ２で１時間吸着させた。吸着後、２０ｍＬのｃＤＭＥＭ－０％－ＦＢＳを、各フラスコに添加し、３６℃±２℃／５％ＣＯ２で５日間インキュベートした。細胞上清を、感染後３日目及び５日目に採取し、細胞片を遠心分離によって清澄化した。
各単離株について、清澄化された上清をプールし、１８％トレハロースを含むＤＭＥＭ中で安定化させ、＜－６０℃で保存した。プールされ、清澄化されたウイルス上清を、３７℃の水浴中で解凍し、４℃で一晩、ベンゾナーゼで処理した。ベンゾナーゼ処理後、各試料を、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＰＰ３深層フィルターに適用した。深層ろ過後、各試料を、セントリコンプラス－７０タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）装置に適用する。保持物を、バッファー交換し、希釈し、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＳａｒｔｏｂｉｎｄＱ ＩＥＸＮａｎｏに適用した。各試料を、第２のＳａｒｔｏｒｉｕｓ ＳａｒｔｏｂｉｎｄＱ ＩＥＸＮａｎｏに適用し、２５０ｍＭ、５００ｍＭ、及び７５０ｍＭ ＮａＣｌでの３段階溶出プロセスを使用して溶出した。ＭｏｎｏＱクロマトグラフィー及び希釈後、各２５０ｍＭ溶出物を、バッファー交換のためにセントリコンプラス－７０クロスフローろ過（ＣＦＦ）装置に適用し、ＰＢＳで３５ｍＬに希釈し、２～８℃で保存した。
ホルマリン不活性化について、新鮮に調製された１％ホルムアルデヒドを、穏やかに撹拌しながら各精製された試料に添加して、０．０２％の最終ホルムアルデヒド濃度を得た。試料を、毎日反転させながら室温（約２２℃）で１４日間インキュベートした。ホルムアルデヒドを、セントリコンプラス－７０タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）装置に適用する前に、室温で１５の間メタ重亜硫酸ナトリウムで中和した。５０ｍＬ原薬バッファー（１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、５０ｍＭ ＮａＣｌ、６％スクロース、ｐＨ７．４）の添加によって、バッファー交換を４回行った。次いで、各試料を、原薬バッファーで１５ｍＬに希釈し、０．２ｍシリンジフィルターを使用して減菌かし、減菌ストッパー付きグラスバイアル（バイアル当たり０．５ｍＬ）中にアリコートし、＜－６０℃で凍結した。
ＴＣＩＤ５０アッセイ及び二重感染性アッセイによって、ウイルス不活性化を確認した。簡単に原薬試料を、Ｃ６／３６細胞に適用し、６日間増幅させた。Ｃ６／３６細胞からの上清を、ベロ細胞に適用し、ＣＰＥを、８日間監視した。薬剤の製剤化のために、バイアルのＰＩＺＶ原薬を解凍し、試料の種類に従ってプールし、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（Ｂｒｅｎｎｔａｇ；０．５ｍｇ／ｍＬ最終、０．０５０ｍｇ／用量）ありまたはなしで、ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬまたは１０μｇ／ｍＬに希釈し、穏やかに撹拌しながら２～８℃で一晩インキュベートした。次いで、得られた製剤ロットを減菌ストッパー付きバイアルにアリコートし、使用まで２～８℃で保存した。図１１は、製剤を調製するために使用されるステップの要約を提供する。
マウス免疫化及び負荷
免疫原性研究のために、６週齢の雄及び雌のスイス－ＩＣＲ（ＣＤ－１）マウスを、６つの群（ｎ＝１０／群）に分割した。０日目に、群１～５のマウスに、筋肉内（ｉ．ｍ．）経路（２ｘ０．０５ｍＬ注射）によって０．１ｍＬのワクチンを接種した。群６のマウスに、プラセボ対照としてＰＢＳを接種した。マウスを、０日目と同じ投与量及びワクチンの種類を使用して、２８日目及び５６日目にブーストした。血液試料を、－１日目（事前免疫）、２７日目（プライム）、４２日目（ブースト１）、及び７０日目（ブースト２）に収集した。
免疫原性及び有効性研究のために、４週齢の雄及び雌のＡＧ１２９マウスを、７つの群（ｎ＝５／群）に分割した。０日目に、群１～６のマウスに、筋肉内（ｉ．ｍ．）経路（２ｘ０．０５ｍＬ注射）によって０．１ｍＬのワクチンを接種した。群７のマウスに、プラセボ対照としてＰＢＳを接種した。マウスを、０日目と同じ投与量及びワクチンの種類を使用して、２８日目にブーストした。血液試料を、－１日目（事前免疫）、２７日目（プライム）、及び５５日目（ブースト）に尾静脈から収集した。安楽死時に、マウスは、イソフルランでの深麻酔下で心臓穿刺により出血した（終末）。５６日目に、マウスに、１０４プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＺＩＫＡＶ ＰＲＶＡＢＣ５９で腹腔内に負荷した。
血清移入
血清を、ＰＩＺＶワクチン接種及び負荷したＡＧ１２９マウスから収集し、プールした後に凍結した（表６の群１、２、４、及び５）。血清プールを解凍し、試験物を、ＰＢＳ中３倍希釈の血清プールによって生成した。プラセボを、ＰＢＳ中３倍希釈のＡＧ１２９正常マウス血清を使用して生成した。
試験物を、ＡＧ１２９マウスに０．１ｍＬ腹腔内注射として投与した（等体積のプラセボ物を対照マウスに投与した）。次いで、動物に、１００μＬ中１０４プラーク形成単位のジカウイルス株ＰＲＶＡＢＣ５９で腹腔内に負荷した。
重量により許容される血液体積を、－１１日目（事前免疫化）に１０匹のマウスからの尾の出血による全血として収集した。全血を、尾の出血によって１日目（一次、循環Ｎａｂ）及び４日目（ウイルス血症）に各マウスから収集した。頚椎脱臼による安楽死の前に、より多い体積の深麻酔下で心臓穿刺によって、致命的負荷後の終末出血を行った。遠心分離（２分間１０，０００ｘｇ）により血清の分離の前に、血液試料を、マイクロテイナーＳＳＴ血清分離ゲルチューブに収集し、少なくとも３０分間凝固させ、－８０℃で凍結した。
プラーク低減中和試験
中和抗体力価を、以前に記載されるようなプラーク低減中和試験（ＰＲＮＴ）によって決定した（例えば、Ｏｓｏｒｉｏ ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２０１４ Ｓｅｐ；１４（９）：８３０－８）。
レポーターウイルス粒子（ＲＶＰ）中和アッセイ
中和抗体力価を、９６ウェルプレートで増殖したベロ細胞中一定量のジカＲＶＰを含む血清試料の滴定によって分析した。ＲＶＰは、ジカ（ＳＰＨ２０１２株）のｐｒＭＥタンパク質及びデング熱に基づくレニラルシフェラーゼレポーターを含んだ。簡潔には、血清を、５６℃で３０分間熱不活性化し、希釈し、次いで、３７℃でＲＶＰと共にインキュベートした。次いで、ルシフェラーゼ基質での検出の前に、血清／ＲＶＰ混合物を、ベロ細胞と混合し、３７℃±２℃／５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。データを、ポジティブ追跡制御に正規化されたＪＭＰ１１非線形４パラメータ分析を使用して分析し、有効量５０％（ＥＣ５０）を報告した。
反対に示されない限り、全ての追加の実験方法を、上の実施例１に記載されるように実施した。
結果
６週齢の雄及び雌のＣＤ－１マウスにおけるＰＩＺＶ候補の免疫原性を評価するために、ＣＤ－１マウスの群（Ｎ＝１０／群）を、ＺＩＫＡＶ ＰＲＶＡＢＣ６９ Ｐ６ｂまたはＰ６ｅウイルス株のいずれかに由来するワクチンの、０．１μｇ（＋ミョウバン）、１．０μｇ（＋ミョウバン）のいずれかの用量で、筋肉内経路によって免疫化した。アジュバントの必要性を評価するために、動物の群に、Ｐ６ｅに由来し、ミョウバンアジュバントを欠乏する０．１μｇのワクチンをワクチン接種した。ワクチン接種は、プラセボ対照としてＰＢＳを受ける群６で、０日目、２８日目、及び５６日目に生じた（図１２Ａ及び表５）。
Figure 0007443233000005
ワクチン接種後、一次（２７日目）、二次（４０日目）、及び三次（７０日目）免疫化後に収集された血清試料を、ＲＶＰ中和アッセイによってＺＩＫＡＶ特異性中和抗体について試験した（図１２Ｂ）。最初の用量を受けてから２７日後、ＰＢＳプラセボ対照群と比較して、ミョウバンを含むいずれかのクローンに由来するＰＩＺＶでワクチン接種されたマウスにおいてわずかな中和抗体応答を観察した。重要なことには、この応答は、第２の免疫化（４０日目）により著しく増加したが、第３の用量（７０日目）での免疫化ではさらには高められなかった。非アジュバントワクチンでワクチン接種されたマウスにおいて中和抗体応答は観察されなかった（図１２Ｂ）。
ＰＩＺＶ候補の免疫原性及び防御有効性を評価するために、４週齢のＡＧ１２９マウスの群（ｎ＝５／群）を、１日目及び２８日目に、ＺＩＫＡＶ ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ６ｂまたはＰ６ｅストックのいずれかに由来するワクチンの、０．１μｇ用量（＋ミョウバン）、１．０μｇ用量（＋ミョウバン）、または０．１μｇ用量（－ミョウバン）のいずれかで、筋肉内経路によって免疫化した（図１３Ａ及び表６）。
Figure 0007443233000006
ワクチン接種後、ワクチン接種された対照マウスに、１０４ＰＦＵのＺＩＫＡＶ ＰＲＶＡＢＣ５９（低継代）で５６日目に腹腔内に負荷した。一次（２７日目）及び二次（５５日目）免疫化後に収集された血清試料を、ＺＩＫＡＶ特異性中和抗体応答について試験した（図１３Ｂ及び表７）。高用量のミョウバンアジュバントワクチンを受けている群のみ（群２及び５）が、単一の免疫化後に中和抗体応答を誘発し、それは、ブースト後に劇的に増加した。対照的に、低用量または高用量のミョウバンアジュバントワクチンのいずれかを受けている群は、第２の用量の後に、高中和抗体応答を生成した。２つの用量のワクチンを受けることにあたり、投与量またはＰ６からの由来にかかわらず、ミョウバンアジュバントワクチンを受けているマウスの群の間に、統計学的差異はなかった。
Figure 0007443233000007
全ての群をまた、負荷後２１日間、死亡率、罹患率、及び重量減少について監視した。負荷後のウイルス血症を検出し、プラーク滴定によって定量化した。プラーク低減中和試験（ＰＲＮＴ）アッセイ、ならびに比較二次中和アッセイによって評価されるように、ミョウバンと共に製剤化された低用量または高用量のＰＩＺＶ候補でワクチン接種されたマウス（群１、２、４、及び５）は、致命的ＺＩＫＡＶ負荷から完全に防御された（表８）。ワクチン接種されたマウスにおいて重量減少または病気の臨床徴候は観察されず、負荷後３日で検出可能な感染性ウイルス血症を有するものはなく、低用量または高用量の抗原＋ミョウバンアジュバントのいずれかでワクチン接種された全てのマウスは、負荷後２１日生存した（図１４～１６）。対照的に、全てのナイーブマウスは、負荷後２日目に高いウイルス血症ならびに負荷後１０日目及び１８日目の間、罹患率／死亡率をもたらした（平均生存＝１３日目）。さらに、株Ｐ６ｂに由来する非ミョウバンアジュバント低用量ワクチンでワクチン接種されたマウスの負荷は、負荷後２日目に高いウイルス血症及びプラセボ対照群と同様の平均生存をもたらしたが、一方で、クローンｅに由来する非ミョウバンアジュバント低用量でワクチン接種されたマウスは、１９日の平均生存で、部分的に防御されたままであった。これらの結果は、免疫化が、ミョウバン、ミョウバンと共により効果的であり、二次免疫化が必要条件であり得ること、及び低用量が高用量と同じ程度に効果的であったことを示す。
Figure 0007443233000008
さらに、全不活性化Ｐ７ｂ及びＰ７ｅウイルス（それぞれＰ６ｂ及びＰ６ｅ株から１回の追加の継代）から生成されたワクチン原薬（ＤＳ）中のＮＳ１の存在を試験した。ジカウイルスＮＳ１のアジア及びアフリカ系統の両方に対して反応性であるが、デング熱ＮＳ１に対しては非交差反応性であるモノクローナル抗体で事前にコーティングされたプレートを使用して、サンドイッチＥＬＩＳＡを行った。ＤＳの２つ組の２、４、８、１６、及び３２倍希釈を調製し、０～８ｎｇ／ｍＬの濃度で２つ組の組換え精製されたＮＳ１を使用して標準曲線と比較した。ＤＳバッファーのみの２つ組の希釈を、陰性対照として調製した。結合されたＮＳ１を、抗ＮＳ１ ＨＲＰ複合体で検出し、ＤＳバッファーのみを含むウェルの吸光度（Ａ４５０～Ａ６３０）を、適合するＤＳ試料を含むウェルにおいて測定された吸光度から差し引いた。サンドイッチＥＬＩＳＡの結果を、以下の表９に示す。興味深いことに、ＮＳ１が観察され、ワクチン原薬調製物で同時精製し、ウイルスＮＳ１が全不活性化ウイルスワクチンの免疫原性構成成分であり得ることを提案する。
Figure 0007443233000009
抗体の受身移入後に野生型ジカウイルス負荷からの防御を与えるのに必要とされる中和抗体（Ｎａｂ）の閾値を、次に試験した。（表１０Ａ及びＢ）。
Figure 0007443233000010
ワクチン接種及び負荷したＡＧ１２９マウスからのプールされた血清を、ＰＢＳ中に３倍に連続して希釈し、７群（Ｎ＝５／群）の５～６週齢のＡＧ１２９マウスに腹腔内に注射した。事前免疫ＡＧ１２９マウス血清を、プラセボ対照として使用した（群８）。受身移入後（約１６～１９時間後）、循環中和抗体力価の決定のためのウイルス負荷の前に、全血を収集し、血清を各マウスから遠心分離によって分離した（図１７）。ウイルス負荷の直前に、マウスの群（設計された群１、２、３、４、５、６、７、８）は、それぞれ２．６９、２．２６、１．７２、１．３０、＜１．３０、＜１．３０、＜１．３０、＜１．３０の平均ｌｏｇ１０中和抗体力価を有した。
ＺＩＫＶ ｎＡｂの受身移入から２４時間語、マウスに、１０４ｐｆｕのＺＩＫＶ ＰＲＶＡＢＣ５９で腹腔内に負荷した。負荷後、動物を毎日重量測定し、病気の徴候について２８日間、１日に１～３回監視した。症状に基づいて各動物に対する臨床スコアを得た（表１１）。瀕死の及び／または明らかな神経学的徴候（臨床スコア≧２）を示した動物は、人道的に安楽死させ、非生存としてカウントした。
Figure 0007443233000011
疾患の徴候は、対応する重量減少と共に、対照群（群８）及び群５～７における負荷から９日後に現れ始めた（図１８）。負荷から３日後に、全血を収集し、血清を各動物から遠心分離により分離した。血清試料を、プラーク滴定アッセイを使用してＺＩＫＶの存在について分析した（図１９）。群１～８のマウスの平均感染性力価（ｌｏｇ１０ ｐｆｕ／ｍＬ）は、それぞれ１．６６、２．７４、４．７０、４．９２、７．２４、７．５４、７．５４、及び７．４６であった。重要なことには、検出可能なレベルのＺＩＫＶ中和抗体（≧１．３０ ｌｏｇ１０）を有する群１～４のマウスは、対照マウスよりも統計学的に有意なより低いレベル（１０２．５～１０６．０倍より低い力価）のウイルス血症（ｐ＝０．０００１、０．０００３、０．０００７、及び０．０３７４）を有した。これらの結果は、検出可能なレベルのＺＩＫＶ中和抗体（≧１．３０ ｌｏｇ１０）が、用量依存的様式でウイルス血症を低減したことを提案した。
群１～８のマウスの平均生存日は、それぞれ未決定、１７日目、１７日目、１３日目、１１日目、１１日目、１１日目、及び１０日目であった（図２０）。重要なことには、検出可能なＺＩＫＶ中和抗体力価を有するマウスの群（群１～４）の生存率曲線は、対照群（群８）と比較して統計学的に異なっていた（それぞれ、ｐ＝０．００１９、０．００１９、０．００１９、０．０１５３）．これらの結果は、検出可能なレベル（≧１．３０ ｌｏｇ１０）のＺＩＫＶ中和抗体が、用量依存的様式で疾患の発症を遅延させたことを提案した。
最後に、核動物の抗体力価を中和するＺＩＫＶを、その対応するウイルス血症力価に対してグラフ化し、線形回帰分析を行った。負荷後３日目の抗体力価を中和するＺＩＫＶ及びウイルス血症レベルの非常に逆に相関する関係を観察した（図２１）。受身移入研究からの結果の要約を、以下の表１２に示す。
Figure 0007443233000012
ＺＩＫＡＶ中和抗体を受けているマウスの群は、この実験において致命的ＺＩＫＡＶ負荷から完全に防御されなかったが、一方で、検出可能なレベルの循環ＺＩＫＡＶ中和抗体力価を有するマウスの群の中でも、用量依存的様式での低減されたウイルス血症レベル及び疾患の遅延された発症が示された。
まとめると、ＣＤ－１及びＡＧ１２９マウス研究の両方からの臨床データは、別個の十分に特徴付けられたウイルスクローンに由来するＰＩＺＶが、免疫原性であり、野生型ＺＩＫＡＶによる負荷に対する防御を提供することができることを示す。重要なことには、低ワクチン用量及び高ワクチン用量は、２回の用量後に同様の中和抗体応答を誘発し、致命的ＺＩＫＡＶ負荷に対する同様のレベルの防御を提供した。興味深いことに、非アジュバントＰＩＺＶ候補でワクチン接種されたマウスはまた、ＺＩＫＡＶ負荷からの部分的な防御を示した。ワクチン抗血清は、受身免疫化ＡＧ１２９マウスにおけるウイルス血症を著しく減少させ、致命的ＺＩＫＡＶ負荷に対する生存率を延ばした。これらの結果はまた、十分に特徴付けられたＰＩＺＶ候補が、高ＺＩＫＡＶ感受性ＡＧ１２９マウスモデルにおけるＺＩＫＡＶ感染に対して高度に有効であったことを示す。
さらに、継代７でのＰＲＶＡＢＣ５９（ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ６ｅからの）の配列が、継代６のものと遺伝的に同一であることが見出された。フラビウイルスが概して遺伝的に不安定性であるとして見なされるとすると、これは驚くべきことであった。ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ６ｅを、７継代にわたってその遺伝的安定性に部分的に起因してプレマスターウイルスシードとして選択した。理論に拘束されることを望まないが、この高められた遺伝的安定性は、これがベロ細胞適応ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ６ゲノムにおいて観察された唯一変異であったため、ＮＳ１のウイングドメインにおける単一アミノ酸置換（Ｗ９８Ｇ）に起因し得ると思われる。さらに、遺伝的安定性及び同種性は、それが変動性を低減し、ワクチンの製剤化に使用され得るその後の株の再生可能な生成を増加させるという点で有利である。
実施例３：Ｐ６ａ及びＰ６ｅ株の表現型の事前臨床評価
材料及び方法
ＡＧ１２９マウス（インターフェロンα／β及びγ受容体を欠乏する）は、脳における重度な病理を含むＺＩＫＶ感染及び疾患に対して感受性である。１４週齢のＡＧ１２９マウスを、１０４及び１０３ｐｆｕのＺＩＫＶ継代６クローンａ及びｅで腹腔内に感染させた。
マウスを、病気の臨床徴候（重量減少、逆立った毛皮、前かがみになった姿勢、無気力、脚弱、部分的／完全な麻痺）について毎日（最大２８日）重量測定及び監視した。さらに、実施例１に記載されるように、負荷から３日後に収集された血清試料のプラーク滴定によって、ウイルス血症の分析を行った。
結果
プレＭＶＳ Ｐ６ｅによる感染は、１００％の死亡率（平均生存日数＝１２．５日）をもたらしたが、一方でプレＭＶＳ Ｐ６ａによる感染は、わずか３３％の死亡率（平均生存日数＝未決定）をもたらした（図２２）。これに一致して、マウスに感染したプレＭＶＳ Ｐ６ｅは、マウスに感染したＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ６ａと比較して、より大きな重量減少を示した（３）。ＰＲＶＡＢＣ５９ Ｐ６ａまたはＰ６ｅで感染されたマウスの群の間の平均の群ウイルス血症レベルにおいて、統計学的差異は見出されなかった（図２４）。これらのデータは、増殖動態のみが重要な決定要因ではない場合がある（両方の株が、同様のウイルス血症及び試験管内で同様のピーク力価を生成したため）こと、及びエンベロープタンパク質の特性が、病毒性（野生型株の）及び免疫原性（不活性化された候補の）にとって重要であり得ることを提案する。
実施例４：不活性化の効果を決定するための不活性化アッセイの完全性
不活性化の完全性（ＣＯＩ）アッセイとも称される二重感染性アッセイは、ホルマリン不活性化（０．０１％ホルムアルデヒド）、及び精製され不活性化されたジカウイルス（ＰＩＺＶ）の大半の原薬（ＢＤＳ）の潜在的残留感染性ウイルス活性の効果を判定するために開発された。
試料調製：上に記載されるようなクローンｅの４つの精製され不活性化されたジカワクチン（ＰＩＺＶ）ロット（毒性学ロット１～４）を、ベロ細胞における増殖により製造した。４つの毎日の採取（合計約４０００ｍＬ）からの上清を、クロマトグラフィーにより精製し、続いて、０．０１％ｗ／ｖの最終濃度へのホルムアルデヒドの添加を行った。不活性化を２２℃で１０日間進めた。プロセス対照（ＩＰＣ）試料を、特徴付け及び分析のための不活性化の間に大半の原薬（ＢＤＳ）から毎日の頻度で除去した。毎日のＩＰＣ試料を、メタ重亜硫酸ナトリウムで中和し、ＤＭＥＭ（ウイルス増殖培地）で透析した。試料は、精製され不活性化されたジカウイルスを含む。不活性化の最終日に、ＢＤＳ試料の残りの体積は、中和しなかったが、ＴＦＦで進めてホルムアルデヒドを除去し、ＰＢＳ中にバッファー交換した。
不活性化アッセイの完全性（ＣＯＩ）：ＣＯＩアッセイを、毎日のＩＰＣ試料における不活性化の効果の分析のために使用し、不活性化の動態及び最終ＢＤＳを理解した。最大感受性のために、２つの細胞株、ベロ、及びＣ６／３６を初めに、このアッセイにおいて利用し、ＩＰＣ及びＤＳ試料中の潜在的な生ウイルスを検出した。ジカウイルスが、フェノールレッドを含む増殖培地の存在下でベロ細胞に感染すると、細胞死の副産物は、ｐＨの低下を引き起こす。それ故に、培地の色は、培地ｐＨのこの酸性シフトを示す赤／ピンク色から黄色へ変化する。この現象は、アポトーシス及び細胞変性効果（ＣＰＥ）により引き起こされ、細胞変性効果は、ウイルス複製中に細胞からのウイルス侵入、感染、及び出芽によって引き起こされる宿主細胞の細胞構造の観察される変化を指す。最終的に、Ｃ６／３６蚊及びベロ細胞の両方は、感染に対する許容細胞であるが、一方で、ジカウイルス感染は、試験管内でベロ細胞のみを殺す。したがって、ベロ細胞を、アッセイの指示細胞株として使用した。対照的に、ジカウイルスの自然宿主ベクターに由来するＣ６／３６細胞は、ジカ感染時にＣＰＥを示さず、溶解しない。培地は、色が変わらず、Ｃ６／３６細胞の生存性は、変更されない。
したがって、アッセイを２つの部に分割する。アッセイの第１の部は、６日間の２つの感受性細胞株の９６ウェルプレート上の潜在的生ウイルス粒子の並列増幅を可能にする。アッセイの第２のステップは、ベロ細胞の単層を含む６ウェルプレートへの９６ウェルプレート（潜在的に増幅された粒子を含む）の上清の移入、及びウイルス感染及び細胞変性効果を可能にし、ベロ細胞で開発するための別の８日間のインキュベーションを含む。光学顕微鏡を使用して、観察された任意のＣＰＥを確認した。
細胞変性効果を観察するための、アッセイの第１の部において９６ウェルプレート、すなわち、Ｃ６／３６細胞の培養、及びアッセイの第２部において６ウェルプレート、すなわち、ベロ細胞の培養の使用に関して詳細に記載されているが、アッセイは、以下の表に従って容易にスケールアップされ得る。
Figure 0007443233000013
 スケールアップの間、容器のｃｍ２あたりの試料の体積は、１部については一定のままであり、同じウイルス感染条件が２部で維持されることが明らかである。
ＣＯＩアッセイ対照：このアッセイの力価及び逆滴定対照を、ベロ指示細胞を使用して行い、細胞死のサロゲートとして、ピンク色から黄色の培地の色変化、またはＣＰＥの存在に基づいて陽性とスコア化されたウェルを有するＴＣＩＤ５０ ９６ウェルフォーマットでスコア化した。
ウイルス力価対照試験：既知の力価の対照ウイルス（ＰＲＶＡＢＣ５９）の２つの独立した複製を、２％ＦＢＳを含む培地で一連の１０倍希釈に晒し、１００μＬの各希釈を、ベロ細胞を含む９６ウェルプレートの４つのウェルに添加した。プレートを５日間インキュベートし、次いで、ＣＰＥを含むウェルを記録し、ウイルス力価を、リード・ミュンヒ計算法を使用して計算した。
ウイルス逆滴定対照試験：既知の力価の対照ウイルスを、２００ ＴＣＩＤ５０に連続して希釈した。２００ ＴＣＩＤ５０対照ウイルスの２つの独立した複製を、２％ＦＢＳを含む培地で一連の２倍希釈に晒し、１００μＬの各希釈を、ベロ細胞を含む９６ウェルプレートの４つのウェルに添加した。細胞を５日間インキュベートし、次いで、ＣＰＥを含むウェルを記録し、ウイルス力価を、リード・ミュンヒ計算法を使用して計算した。
ＣＯＩプロトコルの詳細：
１．アッセイの第１部：ベロ（１．４Ｅ＋０５個の細胞／ｍＬ）及びＡｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ蚊Ｃ６／３６（４Ｅ＋０５個の細胞／ｍＬ）細胞を、試料の添加の２日目前に、９６ウェルプレートに播種した。ベロ細胞を、３７℃で、ＤＭＥＭ＋１０％最終ＦＢＳ＋２％Ｌ－グルタミン＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン中に培養した。Ｃ６／３６細胞を、２８℃で、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋２％Ｌ－グルタミン＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン＋１％非必須アミノ酸中に培養した。
２．２００ ＴＣＩＤ５０対照ウイルスの３つの独立した複製（ウイルス逆滴定対照試験で調製された）またはＤＳ試料を、２％ＦＢＳを含む培地に希釈した（５倍及び１０倍希釈）。
３．９６ウェルプレートの細胞に、試料で接種した。９６ウェルプレートでの細胞単層の感染前に、試料を、ボルテックスして、任意の可能な凝集を崩壊させた。１００μＬの各希釈を、それぞれベロ及びＣ６／３６細胞を含む２つの別個の９６ウェルプレートで５ウェルの各々に適用した。
４．陰性ＣＰＥ対照として各細胞型に対して別のウェルに培地のみを含んだ。
５．プレートを、細胞株に対して適切な温度で６日間インキュベートした。
６．アッセイの第２部：生ウイルスをさらに増幅し、許容細胞株上でＣＰＥにより可視化するために、ベロ及びＣ６／３６細胞の両方からの各９６ウェル上清の全体積を、ベロ細胞の６ウェルプレートの個別のウェルに移した。接種を、１５分間隔で、振盪しながら９０分間進めた。
７．２％ＦＢＳを含む培地を、ウェルに添加し、プレートを、ＣＰＥの機能として増幅された試料のその後の検出のためにさらに８日間インキュベートした。不活性化は、ＤＳの複製のいずれかが８日目の終了時にＣＰＥを示した場合に、不完全であると考えられた。
７．生／複製ウイルス粒子の存在を、６ウェルプレートへ移し、ウイルス複製を可能にするために８日間インキュベーションした後に、プラークの形成または感受性細胞単層のＣＰＥによって可視化した。アッセイの終了時に６ウェルプレートでスコアリングするＣＰＥ％を、以下の通りに計算した。
－ベロ細胞の各６ウェルプレートを、比色変化の可視化、続いて倒立光学顕微鏡下での検査によるＣＰＥの確認によりＣＰＥについて試験した。
－各６ウェルプレートは、上に記載される５倍及び１０倍希釈で調製されたＤＳ希釈の複製のうちの１つを表した（５ウェル、加えて培地のみを含む１つのウェル）。
したがって、ＣＰＥ％は、試料あたり合計５ウェル中ＣＰＥを含むウェルの数を反映した（アッセイあたり合計１２０ウェルが使用される）。平均ＣＰＥ％及び標準偏差を、各希釈の３つの複製に基づいて計算した。
結果：毎日の試料を、以下の表に示されるように毒性学ロット番号１～４の各々において分析した。
Figure 0007443233000014
Figure 0007443233000015
Figure 0007443233000016
Figure 0007443233000017
不活性化データの収集された動態：４つの毒性学ロットからの試料のＣＯＩデータを、上に記載されるように測定された感染性効力（ＴＣＩＤ５０）及びＲＮＡコピーと比較した。試料からの核酸を精製し、ＲＴ－ＰＣＲキットを使用して血清型特異性プライマーでジカＲＮＡを増幅することによって、ＲＮＡコピーを決定した。図２５に示される結果は、ＣＯＩアッセイの感受性が、ＴＣＩＤ５０のものよりも著しくより大きいことを示す。
ＣＯＩアッセイの性能特性－正確度：標的希釈（ＴＣＩＤ５０／ウェル）及びＣＰＥのそれらのそれぞれの割合を使用して、相対正確度を決定した。ベロ細胞について、正のＣＰＥの観察された割合及び予期された割合の間に統計学的に有意な線形関係が存在した。観察された結果及び予期された結果に関連する線のスロープは、１００％正確度を示す１を重複する０．８３～１．０１の９５％信頼区間（ＣＩ）で０．９２である。Ｃ６／３６細胞について、正のＣＰＥの観察された割合及び予期された割合の間に統計学的に有意な線形関係が存在する。観察された結果及び予期された結果に関連する線のスロープは、わずかなバイアス（５～２０％）がこの細胞株において見られたことを示す０．８０～０．９５の９５％信頼区間（ＣＩ）で０．８８である。両方の細胞株は、十分な正確度を示す（相対）。
ＣＯＩアッセイの性能特性－検出の限界（ＬｏＤ）：アッセイの感受性を、Ｃ６／３６対ベロ及びベロ対ベロプレートの両方について評価した。上に記載されるように、１０．００ＴＣＩＤ５０／ウェルで開始してから０．０８ ＴＣＩＤ５０までのより低い力価で播種された力価希釈で播種された合計ウェルあたりの観察された＋ｖｅ ＣＰＥの割合の最小二乗回帰を使用して、データを適合した。さらに、陰性対照（０．００ ＴＣＩＤ５０／ウェル）を、プレート内で各希釈に対して含んだ。Ｃ６／３６対ベロ及びベロ対ベロプレートの両方にわたって各希釈に対して、ＣＰＥスコアリングを行った。ＣＰＥ及びｌｏｇインプットウイルス力価の愛大の明確な関係が見られた。これは、下限及び上限９９％信頼限界と共に、ＴＣＩＤ５０／ウェルのｌｏｇ１０濃度に対する正のＣＰＥウェルの割合の間のロジスティック（シグモイド）関係を示す。－２ｌｏｇ１０濃度（＝０．０１ＴＣＩＤ５０／ウェル）で、検証データにおいて全ての固定及びランダム源変動に基づく及びその原因となるモデルは、０．４２％の下限９９％信頼限界で、０．０１ＴＣＩＤ５０／ウェルに切り上げた場合、０．８５％、または０．０１と予期した。下限９９％信頼限界が、ゼロを含まないため、０．８５％ＣＰＥウェルが０ＴＣＩＤ５０／ウェルから生じた可能性がある（すなわち、ノイズに起因する）非常に小さな検証可能な（＜１％）偶然性が存在する。これは、少なくとも０．０１ＴＣＩＤ５０／ウェル（すなわち、検出され得る試料中の生ジカ粒子の最低量）のアッセイの検出限界を確立する。すなわち、切り上げた場合、６０ウェル中１ウェルは、正のＣＰＥであるか、またはこれらのパラメータを与えられ、６０ウェル中で検出され得るＣＰＥ＋ｖｅの最小理論割合は、１．６７％、または０．０１６７となる。
細胞型（Ｃ３６３及びベロ）を、同じウイルスインプットレベル（０．３１ＴＣＩＤ５０）で、図２６に示されるように、ベロ細胞と比較して検出され得るウイルス力価のより低い希釈を示すＣ６／３６で、相対感受性について比較し、正のＣＰＥのウェルの割合は、ベロ細胞に対するＣ６／３６についてより高い。
このアッセイの検証の間に使用された最小ウイルスインプット値は、０．０２ＴＣＩＤ５０（－１．６１ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０）であった。Ｃ６／３６細胞の適合曲線を使用すると、これは、正のＣＰＥをスコアリングする０．０３５または３．５％のウェルをもたらす（２８ウェル中１ウェル）。曲線が、０．１６７または１．６％の最低実用レベルに対して外挿される場合、これは、０．０１５ＴＣＩＤ５０（－１．８２ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０）のウイルスインプットレベルに等しい。しかしながら、＋ｖｅ ＣＰＥの結果に反映されるように検出され得る感染性ウイルスの最低レベルを決定するときに、伝播されるアッセイの変動の影響を考慮する必要がある。このノイズは、インプットウイルスの作業ストックの生成から生じる。標的ＴＣＩＤ５０及び逆滴定計算の比較は、２００のストックＴＣＩＤ５０／ｍＬ濃度を標的とする場合の２１３の平均に由来する８５ＴＣＩＤ５０／ｍＬの標準偏差（ＳＤ）を示した作業ストックウイルスのＴＣＩＤ５０を示す。ＣＶ％は、約＋７％のバイアスで約４０％と計算する。このノイズは、ロジスティック回帰モデルに要因として含まれ、ウイルス希釈の標的値の信頼区間を生成した。０．０１ＴＣＩＤ５０／ウェルの標的値で、２つの部位にわたる検証データにおいて変動の全ての修正及びランダム源に基づく及びその原因となるモデルは、０．８６％のウェルが正のＣＰＥとなると予期する（６０ウェル中１ウェル）。下限９９％信頼限界が、ゼロを含まないため、０．８５％正のＣＰＥウェルが、ノイズに起因する０ＴＣＩＤ５０／ウェルから生じた可能性がある非常に小さな検証可能な（＜１％）偶然性が存在する（図２７）。これは、アッセイの検出限界を確立する。０．０１ＴＣＩＤ５０／ウェルは、検出され得る試料中の生ジカウイルス粒子の最低量である。
ＣＯＩアッセイの性能特性－範囲：アッセイの範囲は、０．０１ＴＣＩＤ５０／ウェル～４．５ＴＣＩＤ５０／ウェルであり、０％超であるが１００％未満をスコアリングするＣＰＥ＋ｖｅ割合をもたらしたインプットウイルスの範囲として定義される。
結論：４つの毒性学の分析は、室温で１０日間、０．０１％ホルムアルデヒド中でインキュベーションした後に不活性化が完了したことを明らかにした。ＣＯＩアッセイによって測定されるように、不活性化は、生成された全てのロットにおいて３日及び４日までに達成された。ＣＯＩアッセイは、ＴＣＩＤ５０効力またはＲＮＡ測定値よりも感受性であり、増加された感受性はまた、ＬｏＤによって観察されている。
実施例５：薬学的組成物中の残留ホルマリン含有量の決定
１．材料及び方法
１．１材料
ホルムアルデヒド標準溶液（メタノール中）（９８２μｇ／ｍＬ）、ＤＮＰＨ、ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル、及びリン酸を、和光純薬株式会社（日本、東京）から購入した。リン酸を希釈するために使用される蒸留水を、大塚製薬（日本、徳島）から入手した。水酸化アルミニウムゲルとして使用されるＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）２％（１０ｍｇ／ｍＬアルミニウムに対応する）を、Ｂｒｅｎｎｔａｇ（Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｓｕｎｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）から入手した。ＰＢＳを社内で調製し、水酸化アルミニウムゲルを含むジカワクチン製剤を、以下に記載されるように製造した。ジカウイルスを、採取後に様々な技術で精製した。ホルムアルデヒドでの不活性化後、ウイルスを濃縮し、バッファーをろ過によってＰＢＳで交換した。大半の原薬を、ＰＢＳで希釈し、水酸化アルミニウムゲル（０．４ｍｇ／ｍＬアルミニウム）で製剤化して、最終製剤を形成した。
１．２ＨＰＬＣ条件
ＵＶ検出器（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＵＳＡ）及び逆相カラム（ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ、４．６ｍｍｘ２５０ｍｍ、５μｍ（日本、京都））を備えたＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣアライアンスシステムを使用した。水及びアセトニトリルの混合物（１：１、ｖ／ｖ）を移動相として使用し、検出波長を３６０ｎｍに設定し、流量は１．０ｍＬ／分であった。カラム温度及び注射体積は、それぞれ２５℃及び５０μＬであった。
１．３試料調製
ワクチン製剤（１．２ｍＬ）を、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清（１ｍＬ）を、Ｗａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＵＳＡ）から購入した２－ｍＬ ＨＰＬＣガラスバイアルに移した。次に、アセトニトリル中２０μＬの２０％（ｖ／ｖ）リン酸及び５０μＬの１．０ｍｇ／ｍＬ ＤＮＰＨ溶液を添加し、混合物を、注射の前に撹拌して室温で２０分間放置した。
１．４方法の検証
ＩＣＨ Ｑ２ガイドラインに従って、試料の特異性、直線性、正確度、再現性、中間精度、ロバスト性、及び安定性に関して、方法を検証した。正確度研究において、ジカワクチン製剤及び水酸化アルミニウムゲルを、特定の量のホルムアルデヒドでスパイクし、試料を、段落２．３に記載される手順を進める前にボルテックスによって十分に混合した。
２．結果及び議論
２．１ 直線性及び特異性
ホルムアルデヒドの６つの標準溶液（０．０４９、０．０９８、０．１９６、０．４９１、０．９８２、及び１．９６４μｇ／ｍＬ）を、ＰＢＳでの希釈によって調製した。次に、アセトニトリル中２０％（ｖ／ｖ）リン酸及び１ｍｇ／ｍＬ ＤＮＰＨ溶液を、各溶液に添加し、対応するクロマトグラムを図２８に示す。明らかに、１０．４分のピーク領域は、回帰方程式：ｙ＝１０７５７３０ｘ＋１１７３１（ｙが、１０．４分のピークの領域であり、ｘが、μｇ／ｍＬ単位のホルムアルデヒドの濃度である）（相関係数：０．９９９８）を有する直線性を示し、それはＨＣＨＯ－ＤＮＰＨ（すなわち、ＤＮＰＨで誘導体化されたホルムアルデヒド）に起因したことを示す。さらに、５．８分でのピークは、それがＤＮＰＨを添加された全ての試料中で検出されたため、ＤＮＰＨに起因していた。したがって、ＨＣＨＯ－ＤＮＰＨピーク領域を、ＰＢＳのバックグラウンドピーク領域を差し引いた後に、直線性及び正確度の評価に使用した。
２．２ 正確度及び精度（再現性）
ワクチン原薬の不在下で０．０５μｇ／ｍＬのホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中の水酸化アルミニウム（０．１、０．４、及び１．０ｍｇ／ｍＬアルミニウム）の３つの試料をスパイクすることによって実施した回収研究によって水酸化アルミニウムアジュバントの効果を評価した。平均回収は、低い相対標準偏差（ＲＳＤ）値で、それぞれ１０２％（ｎ＝３）、１００％（ｎ＝３）、及び１００％（ｎ＝３）であった（表１３）。正確度データのＲＳＤを計算して、再現性を評価し、１．０％であると見出したが、最大１．０ｍｇ／ｍＬのアルミニウム量は、ホルムアルデヒドの回収に干渉しなかったことを示した。
Figure 0007443233000018
３つの濃度のホルムアルデヒド（０．０５、０．１０、及び１．００μｇ／ｍＬ）を有する水酸化アルミニウムアジュバントを含むジカワクチン製剤をスパイクすることによって実施した回収研究によって方法の正確度を評価し、平均回収結果を表１４に示す。正確度データのＲＳＤを計算して、再現性を評価し、３．７％であると見出したが、水酸化アルミニウムで製剤化されたジカワクチン製剤は、０．０５～１．００μｇ／ｍＬでホルムアルデヒドの回収を干渉しないことを示した。
Figure 0007443233000019
２．４ ロバスト性
試料中のホルムアルデヒドの濃度が、試料調製中の実験パラメータの変動によってどのように影響されるかを決定するために、方法のロバスト性を評価した。誘導体化有効性への影響を考慮して、ＤＮＰＨ及びリン酸の濃度を、この研究において監視されるパラメータとして選択した。ＤＮＰＨ及びリン酸の濃度をそれぞれ±０．１ｍｇ／ｍＬ及び±５％変化させることによって、効果を試験した。各条件下で、２つの開発製剤ロットにおいてホルムアルデヒドを判定し、表１５に示される結果は、ＤＮＰＨ及びリン酸濃度の変動が、ホルムアルデヒドの決定に有意な影響を有さなかったことを提案する。
Figure 0007443233000020
 更に、本発明の考えられうる好適な態様を以下に示す。
（項目１）
ジカウイルス調製物を不活性化する方法であって、
（ａ）試験管内で培養された１つ以上の細胞から前記ジカウイルス調製物を単離することであって、前記細胞が、前記ジカウイルス調製物を生成するために使用され、前記ジカウイルス調製物を単離することが、
（ｉ）深層ろ過、
（ｉｉ）バッファー交換及び／または希釈、
（ｉｉｉ）イオン交換クロマトグラフィーから選択される１つ以上のステップを含む、前記単離することと、
（ｂ）前記ジカウイルス調製物をホルムアルデヒドで処理することであって、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度と、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果が、０．０２５～０．５である、前記処理することとを含む、前記方法。
（項目２）
前記細胞が、非ヒト細胞である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記細胞が、ベロ細胞である、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記ジカウイルス調製物が、ジカウイルスの異種集団を含む種菌から得られる、先行項目のいずれか１に記載の方法。
（項目５）
前記ジカウイルス調製物が、臨床単離株から得られる、先行項目のいずれか１に記載の方法。
（項目６）
前記ジカウイルス調製物が、ジカウイルスクローン単離株から得られる、先行項目のいずれか１に記載の方法。
（項目７）
前記ジカウイルスクローン単離株が、プラーク精製により得られる、項目６に記載の方法。
（項目８）
プラーク精製の前に、複数の細胞が、ジカウイルスの異種集団を含む種菌を接種される、項目７に記載の方法。
（項目９）
ジカウイルス調製物を不活性化する方法であって、
（ａ）臨床単離株からジカウイルス調製物を得ることと、
（ｂ）前記ジカウイルス調製物をホルムアルデヒドで処理することであって、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度と、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果が、０．０２５～０．５である、前記処理することとを含む、前記方法。
（項目１０）
ジカウイルス調製物を不活性化する方法であって、
（ａ）ジカウイルスの異種集団を含む種菌からジカウイルス調製物を得ることと、
（ｂ）前記ジカウイルス調製物をホルムアルデヒドで処理することであって、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度と、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果が、０．０２５～０．５である、前記処理することとを含む、前記方法。
（項目１１）
前記ジカウイルス調製物が、０．００５％（ｗ／ｖ）～０．０２％（ｗ／ｖ）の濃度のホルムアルデヒドで処理される、先行項目のいずれか１に記載の方法。
（項目１２）
前記ジカウイルス調製物が、８～１２日間ホルムアルデヒドで処理される、先行項目のいずれか１に記載の方法。
（項目１３）
前記ジカウイルス調製物が、１０日間ホルムアルデヒドで処理される、先行項目のいずれか１に記載の方法。
（項目１４）
前記ジカウイルス調製物が、１５℃～３０℃の温度で、ホルムアルデヒドで処理される、先行項目のいずれか１に記載の方法。
（項目１５）
前記ジカウイルス調製物が、２２℃の温度で、ホルムアルデヒドで処理される、先行項目のいずれか１に記載の方法。
（項目１６）
不活性化の完全性を決定するステップ（ｃ）をさらに含む、先行項目のいずれか１に記載の方法。
（項目１７）
ステップ（ｃ）が、
（ｉ）培養された昆虫細胞に、ステップ（ｂ）に従って処理されたジカウイルス調製物を接種し、前記昆虫細胞を第１の期間でインキュベートし、それにより昆虫細胞上清を生成することと、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された前記昆虫細胞上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、前記哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートすることと、
（ｉｉｉ）前記ジカウイルス調製物が、前記哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定することと、を含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記昆虫細胞が、ＣＣＬ－１２５細胞、Ａａｇ－２細胞、ＲＭＬ－１２細胞、Ｃ６／３６細胞、Ｃ７－１０細胞、ＡＰ－６１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ－１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ－２細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ－３細胞、ＵＭ－ＡＶＥ１細胞、Ｍｏｓ．５５細胞、Ｓｕａ１Ｂ細胞、４ａ－３Ｂ細胞、Ｍｏｓ．４２細胞、ＭＳＱ４３細胞、ＬＳＢ－ＡＡ６９５ＢＢ細胞、ＮＩＩＤ－ＣＴＲ細胞、及びＴＲＡ－１７１細胞、例えば、Ｃ６／３６細胞から選択される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記第１の期間が、３～７日である、項目１７または１８に記載の方法。
（項目２０）
前記哺乳動物細胞が、ベロ細胞、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４ ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）細胞、ＭＤＣＫ ３３０１６（ＷＯ９７／３７００１に記載される寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９）細胞、ＢＨＫ２１－Ｆ細胞、ＨＫＣＣ細胞、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、例えば、ベロ細胞から選択される、項目１７～１９のいずれか１に記載の方法。
（項目２１）
前記第２の期間が、３～１４日である、項目１７～２０のいずれか１に記載の方法。
（項目２２）
ホルムアルデヒド処理されたジカウイルス調製物を、メタ重亜硫酸ナトリウムで中和するステップ（ｄ）をさらに含む、先行項目のいずれか１に記載の方法。
（項目２３）
前記ホルムアルデヒド処理されたジカウイルス調製物が、ホルムアルデヒド処理の少なくとも５、少なくとも７、少なくとも９、少なくとも１１、または少なくとも１４日後に中和される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記不活性化されたジカウイルス調製物を含む薬学的組成物を調製するステップ（ｅ）をさらに含む、先行項目のいずれか１に記載の方法。
（項目２５）
前記ジカウイルス調製物が、アジュバントと混合される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記アジュバントが、アルミニウム塩、トル様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）、合成リピドＡ、リピドＡ模倣体または類似体、ＭＬＡ誘導体、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、乳剤、ビロソーム、コクリエート物、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマー粒子、微粒子、リポソーム、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）からなる群から選択される項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記アジュバントが、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、及びＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ ８５などのアルミニウム塩である、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
前記ジカウイルス調製物中の１つ以上の抗原の少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が、前記アジュバントに吸着される、項目２５～２７のいずれか１に記載の方法。
（項目２９）
前記ジカウイルスが、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置に変異を含む、先行項目のいずれか１に記載の方法。
（項目３０）
前記変異が、配列番号１におけるＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異である、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記ジカウイルスが、エンベロープタンパク質（Ｅ）に変異を含まない、項目２９または３０に記載の方法。
（項目３２）
前記エンベロープタンパク質をコードする配列が、配列番号２の対応する配列と同じである、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
項目１～３２のいずれか１に記載の方法により得られる不活性化されたジカウイルスを含む、薬学的組成物。
（項目３４）
不活性化されたジカウイルスを含み、かつ５０μｇ／ｍｌ未満の残留ホルムアルデヒド含有量を有する、薬学的組成物。
（項目３５）
項目１～３２のいずれか１に記載の方法により得られる、項目３４に記載の薬学的組成物。
（項目３６）
アルボウイルス調製物の不活性化の完全性を決定するための方法であって、
（ｉ）培養された昆虫細胞に、不活性化ステップに供されたアルボウイルス調製物を接種し、前記昆虫細胞を最第１の期間でインキュベートし、それにより昆虫細胞上清を生成するステップと、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された前記昆虫細胞上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、前記哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートするステップと、
（ｉｉｉ）前記アルボウイルス調製物が、前記哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定するステップと、を含む、前記方法。
（項目３７）
前記アルボウイルスが、フラビウイルスまたはアルファウイルスである、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記アルボウイルスが、ジカウイルス、ウエストナイルウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、デング熱ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、チクングニアウイルス、オニョンニョンウイルス、またはマヤロウイルスである、項目３６または３７に記載の方法。
（項目３９）
前記アルボウイルス調製物が、界面活性剤、ホルマリン、過酸化水素、ベータ－プロピオラクトン（ＢＰＬ）、二成分エチルアミン（ＢＥＩ）、アセチルエチレンイミン、メチレンブルー、またはソラレンを用いた処理に供された、項目３６～３８のいずれか１に記載の方法。
（項目４０）
前記昆虫細胞が、ＣＣＬ－１２５細胞、Ａａｇ－２細胞、ＲＭＬ－１２細胞、Ｃ６／３６細胞、Ｃ７－１０細胞、ＡＰ－６１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ－１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ－２細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ－３細胞、ＵＭ－ＡＶＥ１細胞、Ｍｏｓ．５５細胞、Ｓｕａ１Ｂ細胞、４ａ－３Ｂ細胞、Ｍｏｓ．４２細胞、ＭＳＱ４３細胞、ＬＳＢ－ＡＡ６９５ＢＢ細胞、ＮＩＩＤ－ＣＴＲ細胞、及びＴＲＡ－１７１細胞、例えば、Ｃ６／３６細胞から選択される、項目３６～３９のいずれか１に記載の方法。
（項目４１）
前記第１の期間が、３～７日である、項目３６～４０のいずれか１に記載の方法。
（項目４２）
前記哺乳動物細胞が、ベロ細胞、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４ ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）細胞、ＭＤＣＫ ３３０１６（ＷＯ９７／３７００１に記載される寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９）細胞、ＢＨＫ２１－Ｆ細胞、ＨＫＣＣ細胞、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、例えば、ベロ細胞から選択される、項目３６～４１のいずれか１に記載の方法。
（項目４３）
前記第２の期間が、３～１４日である、項目３６～４２のいずれか１に記載の方法。
（項目４４）
前記方法が、前記アルボウイルスの１．０ ＴＣＩＤ ５０ 未満を検出することが可能である、項目３６～４３のいずれか１に記載の方法。
（項目４５）
不活性化されたウイルスを含む薬学的組成物中の残留ホルムアルデヒド含有量を決定する方法であって、
（ａ）ホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む組成物を提供するステップと、
（ｂ）前記（ａ）の組成物を、リン酸及び２，４－ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）と混合し、それにより混合物を提供するステップと、
（ｃ）前記（ｂ）の混合物を、好適な条件下でインキュベートするステップと、
（ｄ）前記残留ホルムアルデヒドの存在について前記混合物を分析するステップと、を含む、前記方法。
（項目４６）
前記（ａ）の組成物が、アジュバントを含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記アジュバントが、水酸化アルミニウムである、項目４６記載の方法。
（項目４８）
前記（ａ）の組成物が、０．１ｍｇ／ｍｌ～１．０ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムをアジュバントとして含む、項目４５～４７のいずれか１に記載の方法。
（項目４９）
ステップ（ｂ）が、５０部の前記（ａ）の組成物を、１部の１５～２５％（ｖ／ｖ）リン酸、及び２．５部の０．９～１．１ｍｇ／ｍｌのＤＮＰＨと混合することを含む、項目４５～４８のいずれか１に記載の方法。
（項目５０）
前記（ａ）の組成物と、リン酸及び２，４－ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）との前記混合物が、室温でインキュベートされる、項目４５～４９のいずれか１に記載の方法。
（項目５１）
前記（ａ）の組成物と、リン酸及び２，４－ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）との前記混合物が、１０～３０分間でインキュベートされる、項目４５～５０のいずれか１に記載の方法。
（項目５２）
前記（ａ）の組成物と、リン酸及び２，４－ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）との前記混合物が、ＨＰＬＣによって分析される、項目４５～５１のいずれか１に記載の方法。
（項目５３）
前記ＨＰＬＣが、逆相ＨＰＬＣである、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
水及びアセトニトリルの混合物（１：１、ｖ／ｖ）が、ＨＰＬＣにおける移動相として使用される、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記ウイルスが、不活性化されたジカウイルスである、項目４５～５４のいずれか１に記載の方法。
（項目５６）
前記不活性化されたジカウイルスが、０．０１％（ｗ／ｖ）ホルムアルデヒドで、２２℃で１０日間処理されている、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記ジカウイルスが、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置に変異を含み、例えば、配列番号１のＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異などである、項目５５または５６に記載の方法。

Claims (22)

  1. ホルムアルデヒドで不活性化されたウイルス全粒子およびアジュバントとしての水酸化アルミニウムを含む薬学的組成物中の残留ホルムアルデヒド含有量を決定する方法であって、前記方法が、
    （ａ）ホルムアルデヒドで処理されているウイルス全粒子およびアジュバントとしての水酸化アルミニウム含む組成物を提供するステップと、
    （ｂ）前記（ａ）の組成物を、リン酸及び２，４－ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）と混合し、それにより混合物を提供するステップと、
    （ｃ）前記（ｂ）の混合物を、１８℃～３０℃の温度で１０～３０分間インキュベートするステップと、
    （ｄ）前記残留ホルムアルデヒドの存在について前記混合物を逆相ＨＰＬＣによって分析するステップと、を含み、
    その際、ステップ（ｂ）は、５０部の前記（ａ）の組成物を、１部の１５～２５％（ｖ／ｖ）リン酸、及び２．５部の０．９～１．１ｍｇ／ｍｌのＤＮＰＨと混合することを含む、前記方法。
  2. 前記（ａ）の組成物と、リン酸及び２，４－ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）との前記混合物が、２２℃の温度で、２０分間インキュベートされる、請求項１に記載の方法。
  3. 水及びアセトニトリルの混合物（１：１、ｖ／ｖ）が、逆相ＨＰＬＣにおける移動相として使用される、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記ウイルス全粒子が、不活性化されたジカウイルス全粒子である、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記不活性化されたジカウイルス全粒子が、ホルムアルデヒドで処理されている、請求項４に記載の方法。
  6. 前記不活性化されたジカウイルス全粒子が、０．０１％（ｗ／ｖ）ホルムアルデヒドで、２２℃で１０日間処理されている、請求項５に記載の方法。
  7. ホルムアルデヒドで不活性化されたジカウイルス全粒子調製物を含む薬学的組成物を製造する方法であって、
    （ａ）試験管内で培養された１つ以上の細胞から前記ジカウイルス全粒子調製物を単離することであって、前記細胞が、前記ジカウイルス全粒子調製物を生成するために使用され、前記ジカウイルス全粒子調製物を単離することが、
    （ｉ）深層ろ過、
    （ｉｉ）バッファー交換及び／または希釈、
    （ｉｉｉ）イオン交換クロマトグラフィーから選択される１つ以上のステップを含む、前記単離することと、
    （ｂ）前記ジカウイルス全粒子調製物をホルムアルデヒドで処理することであって、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度と、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果が、０．０２５～０．５である、前記処理し、さらに、残留する未反応のホルムアルデヒドを除去し、かつ、不活性化の完全性を決定することと、
    （ｃ）前記不活性化されたジカウイルス全粒子調製物を含む薬学的組成物を製造することであって、前記不活性化されたジカウイルス全粒子調製物を、アジュバントとしての水酸化アルミニウムと混合することと、ならびに、
    （ｄ）請求項４から６までのいずれか１項に記載の方法により残留ホルムアルデヒド含有量を決定することであって、前記薬学的組成物は５０μｇ／ｍｌ未満の残留ホルムアルデヒド含有量を有することを含む、前記方法。
  8. 前記工程（ａ）において、１つ以上の細胞が非ヒト細胞である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記非ヒト細胞が、ベロ細胞である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記ジカウイルス全粒子調製物が、ジカウイルスの異種集団を含む種菌から、および／または臨床単離株から、および／またはジカウイルスクローン単離株から得られる、請求項７から９までのいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記ジカウイルス全粒子調製物が、０．００５％（ｗ／ｖ）～０．０２％（ｗ／ｖ）の濃度のホルムアルデヒドで処理される、請求項７から１０までのいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記ジカウイルス全粒子調製物が、８～１２日間ホルムアルデヒドで処理される、請求項７から１１までのいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記ジカウイルス全粒子調製物が、１０日間ホルムアルデヒドで処理される、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記ジカウイルス全粒子調製物が、１５℃～３０℃の温度で、ホルムアルデヒドで処理される、請求項７から１３までのいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記ジカウイルス全粒子調製物が、２２℃の温度で、ホルムアルデヒドで処理される、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記不活性化の完全性の決定が、
    （ｉ）培養された昆虫細胞に、ステップ（ｂ）に従って処理されたジカウイルス全粒子調製物を接種し、前記昆虫細胞を第１の期間インキュベートし、それにより昆虫細胞上清を生成することと、
    （ｉｉ）（ｉ）で生成された前記昆虫細胞上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、前記哺乳動物細胞を第２の期間インキュベートすることと、
    （ｉｉｉ）前記ジカウイルス全粒子調製物が、前記哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定することと、を含む、
    請求項７から１５までのいずれか１項に記載の方法。
  17. 第１の期間が３～７日間である、請求項１６に記載の方法。
  18. 第２の期間が３～１４日間である、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記昆虫細胞が、ＣＣＬ－１２５細胞、Ａａｇ－２細胞、ＲＭＬ－１２細胞、Ｃ６／３６細胞、Ｃ７－１０細胞、ＡＰ－６１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ－１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ－２細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ－３細胞、ＵＭ－ＡＶＥ１細胞、Ｍｏｓ．５５細胞、Ｓｕａ１Ｂ細胞、４ａ－３Ｂ細胞、Ｍｏｓ．４２細胞、ＭＳＱ４３細胞、ＬＳＢ－ＡＡ６９５ＢＢ細胞、ＮＩＩＤ－ＣＴＲ細胞、及びＴＲＡ－１７１細胞から選択される、請求項１６から１８までのいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記哺乳動物細胞が、ベロ細胞、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＢＨＫ２１－Ｆ細胞、ＨＫＣＣ細胞、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）から選択される、請求項１６から１９までのいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記残留する未反応のホルムアルデヒドを、ホルムアルデヒド処理されたジカウイルス全粒子調製物を、メタ重亜硫酸ナトリウムで中和するか、透析するか、バッファー交換するか、あるいはタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）することによって除去する、請求項７から２０までのいずれか１項に記載の方法。
  22. 前記ジカウイルス全粒子調製物中の１つ以上の抗原の少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が、前記アジュバントに吸着される、請求項７から２１までのいずれか１項に記載の方法。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2020004543A (es) 2017-11-03 2020-09-18 Takeda Vaccines Inc Vacunas contra el zika, composiciones inmunogenicas y metodos que las utilizan.
MX2020004633A (es) 2017-11-30 2020-09-28 Takeda Vaccines Inc Metodo para inactivar el virus de zika y metodos relacionados.
WO2020017765A1 (ko) * 2018-07-18 2020-01-23 (주)진매트릭스 지카 바이러스 변이주와 이를 포함한 지카 백신 조성물
AU2020269164B2 (en) * 2019-05-08 2024-04-04 Takeda Vaccines, Inc. Inactivated virus compositions and Zika vaccine formulations
RU2717993C1 (ru) * 2019-10-22 2020-03-27 Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) Способ получения антигена вируса Зика, обладающего иммуногенными и антигенными свойствами
WO2023154043A1 (en) 2022-02-09 2023-08-17 Takeda Vaccines, Inc. Zika vaccines and immunogenic compositions, and methods of using the same

Family Cites Families (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT405939B (de) * 1997-02-24 1999-12-27 Immuno Ag Verfahren zur inaktivierung von lipidumhüllten viren
DE122009000037I2 (de) 1997-08-28 2011-06-16 Cheil Jedang Corp Ein an vero-zellen angepasstes abgeschwächtes japanisches enzephalitis virus und ein impfstoff gegen japanische enzephalitis
GB0326439D0 (en) * 2003-11-13 2003-12-17 Imp College Innovations Ltd Methods
EA010057B1 (ru) 2004-08-27 2008-06-30 Панацея Биотек Лтд. Инактивированная полиомиелитная вакцина, полученная из штамма сейбина вируса полиомиелита
EP1724338A1 (en) 2005-05-19 2006-11-22 Crucell Holland B.V. Methods for the production of a whole-inactivated West Nile Virus vaccine
WO2008026225A2 (en) 2006-09-01 2008-03-06 Bharat Biotech International Limited A vaccine for chikungunya virus infection
US8741311B2 (en) 2009-03-27 2014-06-03 Academia Sinica Methods and compositions for immunization against virus
US20100310656A1 (en) 2009-04-27 2010-12-09 Immunitor USA, Inc. Immunotherapy and prevention of autoimmune hepatitis
CN101876650B (zh) * 2010-07-02 2014-04-09 中国烟草总公司郑州烟草研究院 一种烟用水基胶中甲醛含量的测定方法
BR112013030236A2 (pt) 2011-05-26 2016-12-06 Glaxosmithkline Biolog Sa preparação em massa de vírus da dengue inativado ou uma composição imunogênica, e, preparação liofilizada de vírus da dengue inativado
CN103796676B (zh) 2011-06-17 2017-09-12 伯哈拉特生物技术国际有限公司 包含灭活的基孔肯亚病毒株的疫苗组合物
SI3106176T1 (en) 2011-12-06 2018-04-30 Valneva Austria Gmbh Aluminum compounds for use in therapeutics and vaccines
JP2015517089A (ja) 2012-03-08 2015-06-18 ノバルティス アーゲー タンパク質ベースの髄膜炎菌ワクチンのためのインビトロ有効性アッセイ
WO2013132043A1 (en) 2012-03-08 2013-09-12 Novartis Ag Combination vaccines with tlr4 agonists
US9895437B2 (en) 2012-04-18 2018-02-20 Valneva Austria Gmbh Aluminum compounds for use in therapeutics and vaccines
CN102680595A (zh) * 2012-05-03 2012-09-19 安阳市双环助剂有限责任公司 分散剂mf中游离甲醛含量的测定方法
CN105744952A (zh) 2013-09-14 2016-07-06 巴拉特生物技术国际有限公司 病毒疫苗及其制备方法
AU2015318283A1 (en) 2014-09-17 2017-04-06 The University Of Iowa Research Foundation Viral RNA segments as immunomodulatory agents and vaccine components
LT3204494T (lt) 2014-10-07 2020-07-10 Serum Institute Of India Private Limited Polioviruso inaktyvavimo, adjuvanto adsorpcijos pagerinti būdai
MA40920A (fr) * 2014-11-07 2017-09-12 Takeda Vaccines Inc Vaccins de la main, du pied et de la bouche, et procédés de fabrication et d'utilisation de ceux-ci
WO2016145149A1 (en) 2015-03-11 2016-09-15 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Army, On Behalf Of The Walter Reed Army Institute Of Research Combination purified inactivated vaccine for flaviviruses
WO2016209805A1 (en) 2015-06-22 2016-12-29 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for modulating viral infection
MX2018000689A (es) * 2015-07-16 2018-09-06 Bharat Biotech Int Ltd Composiciones de vacuna.
TW201718638A (zh) 2015-07-21 2017-06-01 現代治療公司 傳染病疫苗
EP3355899A4 (en) 2015-09-30 2019-04-03 Ramot at Tel-Aviv University Ltd. In place of EVOLUTIONARY PRESERVED RNA STRUCTURE MUTATED APPROVED VIRUS
EP3364950A4 (en) 2015-10-22 2019-10-23 ModernaTX, Inc. VACCINES AGAINST TROPICAL DISEASES
EP4253403A3 (en) * 2015-12-23 2023-12-27 Valneva Austria GmbH Zika virus purification
EP3184119A1 (en) 2015-12-23 2017-06-28 Themis Bioscience GmbH Chromatography based purification strategies for measles scaffold based viruses
US11434259B2 (en) 2016-01-25 2022-09-06 Iogenetics, Llc Modified Zika virus NS1 protein with reduced cross-reactive immunogenicity
US11723967B2 (en) 2016-02-17 2023-08-15 CureVac SE Zika virus vaccine
BR112018017307A2 (pt) 2016-02-25 2019-01-08 Univ Pennsylvania molécula de ácido nucleico isolada, composição, e, métodos para indução de uma resposta imune contra um zika vírus, para tratamento de um indivíduo e para prevenção de uma infecção por zika vírus
WO2017161151A1 (en) 2016-03-16 2017-09-21 Novavax, Inc. Vaccine compositions containing modified zika virus antigens
CN105749268B (zh) * 2016-04-11 2020-09-11 北京科兴中维生物技术有限公司 一种灭活的寨卡病毒疫苗
US20170298119A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Visterra, Inc. Antibody molecules to zika virus and uses thereof
WO2017192856A1 (en) * 2016-05-04 2017-11-09 University Of Miami Zika virus vector for treating zika virus infection
JP6843970B2 (ja) 2016-05-10 2021-03-17 ナジット テクノロジーズ， インコーポレイテッド 二重酸化プロセスを使用して病原体を不活性化し高度免疫原性不活性化ワクチンを産生すること
WO2017210215A1 (en) 2016-05-31 2017-12-07 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Zika virus vaccine and methods of production
US10967057B2 (en) 2016-06-02 2021-04-06 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Zika viral antigen constructs
US10611801B2 (en) 2016-06-09 2020-04-07 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Compositions and methods for preventing and treating Zika virus infection
GB201610162D0 (en) 2016-06-10 2016-07-27 Imp Innovations Ltd And Inst Pasteur Methods
EP3468590A1 (en) 2016-06-13 2019-04-17 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Nucleic acids encoding zika virus-like particles and their use in zika virus vaccines and diagnostic assays
US10590174B2 (en) 2016-07-08 2020-03-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Genomic sequences encoding for an attenuated mutant Zika virus
WO2018009603A1 (en) 2016-07-08 2018-01-11 The United State of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Service Chimeric west nile/zika viruses and methods of use
WO2018022786A1 (en) 2016-07-26 2018-02-01 Washington University Antibodies to zika virus and methods of use thereof
GB201613191D0 (en) 2016-07-29 2016-09-14 Univ Oxford Innovation Ltd Zika virus vaccine
EP4043031A3 (en) 2016-11-17 2022-11-23 GlaxoSmithKline Biologicals SA Zika viral antigen constructs
EP3558353A2 (en) 2016-12-23 2019-10-30 Expres2ion Biotechnologies ApS New flavivirus vaccine
CN108503696B (zh) 2017-02-27 2023-05-12 中国科学院上海巴斯德研究所 一种酵母细胞表达的寨卡病毒亚单位疫苗
CN108503697B (zh) 2017-02-27 2023-03-31 中国科学院上海巴斯德研究所 一种果蝇细胞表达的寨卡病毒亚单位疫苗
EP4008343A3 (en) 2017-03-08 2022-08-24 University of Georgia Research Foundation Inc. Methods and compositions related to increased viral production
WO2018187799A1 (en) 2017-04-07 2018-10-11 The Rockefeller University Compositions and methods related to human neutralizing antibodies to zika and dengue 1 virus
WO2018237039A1 (en) 2017-06-20 2018-12-27 Texas Tech University System ZIKA VIRAL PSEUDO PARTICLE VACCINE (VLP) VACCINE AND MICRONEUTRALIZATION ASSAY
EP3417943B1 (de) 2017-06-21 2020-02-12 Eppendorf AG Zentrifugenrotor mit abdichtung
CN107188935B (zh) 2017-07-20 2018-10-02 北京健乃喜生物技术有限公司 一种寨卡病毒ns1抗原突变体及其应用
WO2019042555A1 (en) 2017-08-31 2019-03-07 Humabs Biomed Sa MULTISPECIFIC ANTIBODIES SPECIFICALLY BINDING TO ZIKA VIRUS EPITOPES AND USES THEREOF
CN107537029B (zh) 2017-09-14 2021-03-19 北京科兴生物制品有限公司 一种寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗
GB201716254D0 (en) 2017-10-05 2017-11-22 Univ Leuven Kath Live-attenuated flaviruses with heterologous antigens
MX2020004543A (es) 2017-11-03 2020-09-18 Takeda Vaccines Inc Vacunas contra el zika, composiciones inmunogenicas y metodos que las utilizan.
WO2019104157A1 (en) 2017-11-21 2019-05-31 The University Of Vermont And State Agricultural College Highly specific zika neutralizing human antibodies
MX2020004633A (es) 2017-11-30 2020-09-28 Takeda Vaccines Inc Metodo para inactivar el virus de zika y metodos relacionados.
CN108187036A (zh) 2017-12-08 2018-06-22 北京科兴中维生物技术有限公司 一种寨卡病毒与乙脑病毒联合灭活疫苗
CN108210921A (zh) 2017-12-29 2018-06-29 广州恩宝生物医药科技有限公司 一种寨卡病毒疫苗及其制备方法
US20210087617A1 (en) 2018-02-22 2021-03-25 Nano4 Global, Lda Method for detecting flaviviridae
AU2018411586A1 (en) 2018-03-08 2020-09-03 Codagenix Inc. Attenuated flaviviruses
JP2021519762A (ja) 2018-03-29 2021-08-12 イマージェクス ヴァクシンズ ホールディング リミテッドＥｍｅｒｇｅｘ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｈｏｌｄｉｎｇ Ｌｉｍｉｔｅｄ ワクチン組成物
KR102075581B1 (ko) 2018-04-27 2020-02-10 가톨릭대학교 산학협력단 바이러스성 발현 조절 서열이 삽입된 핵산 분자를 포함하는 면역보강제 및 이를 포함하는 약학 조성물
WO2020017765A1 (ko) 2018-07-18 2020-01-23 (주)진매트릭스 지카 바이러스 변이주와 이를 포함한 지카 백신 조성물
WO2020051766A1 (zh) 2018-09-11 2020-03-19 上海市公共卫生临床中心 一种广谱抗流感疫苗免疫原及其应用
EP3870208A4 (en) 2018-10-26 2022-10-26 New York Blood Center, Inc. IMMUNOGENIC COMPOSITIONS OF THE ZIKA VIRUS
JP7463366B2 (ja) 2018-11-20 2024-04-08 タケダ ワクチン，インコーポレイテッド 新規の抗ジカウイルス抗体及びその使用
AU2020269164B2 (en) 2019-05-08 2024-04-04 Takeda Vaccines, Inc. Inactivated virus compositions and Zika vaccine formulations
WO2021262659A1 (en) 2020-06-22 2021-12-30 University Of Connecticut Flavivirus signal peptides, vaccine constructs, and methods therefor

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chinese Journal of Biologicals, 2016年，Vol.29, no.11，p.1210-1214
Scientific Reports, 2017年4月12日，Vol.7，46375 (p.1-9)，DOI: 10.1038/srep46375

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