KR20200094191A - 지카 백신 및 면역원성 조성물, 그리고 이를 이용하는 방법들 - Google Patents

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Abstract

본 명세서는 지카 바이러스 백신 및 지카 바이러스 (가령, 지카 바이러스 클론 분리주, 비-인간 세포 개작된(adapted) 지카 바이러스, 등)로부터 하나 또는 그 이상의 항원들을 갖는 면역원성 조성물, 그리고 이의 치료 방법에 관계한다.

Description

지카 백신 및 면역원성 조성물, 그리고 이를 이용하는 방법들
연방 정부의 지원을 받은 연구에 관한 진술
본 발명은 미국 보건복지부 산하의 질병예방대응본부(Office of the Assistant Secretary for Preparedness and Response)의 생물의약품첨단연구개발국(Biomedical Advanced Research and Development Authority)과의 계약 번호 HHSO100201600015C 하에 정부 지원을 받아 만들어졌다. 본 발명은 미국 보건복지부의 산하 기관인 질병통제예방센터와의 공동 연구 개발 협약의 성과로 창출되었다. 미국 정부는 본 발명에서 일정한 권리를 갖는다.
발명의 분야
본 명세서는 지카 바이러스 백신 및 지카 바이러스 (가령, 지카 바이러스 클론 분리주, 비-인간 세포 개작된(adapted) 지카 바이러스, 등)로부터 하나 또는 그 이상의 항원들을 갖는 면역원성 조성물, 그리고 이의 치료 방법에 관계한다.
배경
플라비바이러스과 (Flaviviridae) 내에 다른 모기 매개 바이러스 (예를 들면, 황열병, 뎅기, 웨스트 나일, 그리고 일본 뇌염 바이러스)와 함께 분류되는 플라비바이러스(flavivirus)인 지카 바이러스는 상기 바이러스가 2013년에 브라질 내로 도입된 이후로, 반구 전역에 걸친 유행병으로 급속하게 확산되었다. 상기 바이러스는 미국의 영토를 비롯한 중앙아메리카와 북아메리카에 도달하였고, 결과적으로 현재 US 본토를 위협하고 있다. 실제로, 지카 바이러스 계열 PRVABC59는 2015년에 푸에르토리코를 여행했던 한 개인으로부터 얻은 혈청으로부터 단리되었다. 이러한 계열의 게놈은 적어도 3회 염기서열결정되었다 (참조: Lanciotti 외. Emerg. Infect. Dis. 2016 May;22(5):933-5 및 GenBank 수탁 번호 KU501215.1; GenBank 수탁 번호 KX087101.3; 그리고 Yun 외. Genome Announc. 2016 Aug 18;4(4) 및 GenBank 수탁 번호 ANK57897.1).
1947년에 우간다에서 최초 단리되었던 상기 바이러스는 1952년에 인간 질환에 우선 연계되었고, 그리고 아프리카 및 동남아시아에서 경등도, 자기 한정 열성 질병의 원인으로서 산발적으로 인식되었다(Weaver 외. (2016) Antiviral Res. 130:69-80; Faria 외. (2016) Science. 352(6283):345-349). 하지만, 2007년에, 북태평양의 얍(Yap) 섬에서 발병이 발생하였고, 그리고 이후, 태평양의 전역에서 섬에서 섬으로 전파되어, 2013-2014년에 프랑스령 폴리네시아에서 광범위한 발병을 야기하였고, 이후 뉴칼레도니아(New Caledonia), 쿡(Cook) 섬, 그리고 궁극적으로, 이스터(Easter) 섬까지 확산되었다. 아시아 계통 바이러스가 차후에, 미확인 상태로 남아있는 루트에 의해 서반구로 이전되었다(Faria 외. (2016) Science. 352(6283):345-349). 상기 바이러스는 아에데스 아에집티 (Aedes aegypti), 아에데스 알보픽투스 (A. albopictus), 그리고 아마도 아에데스 헨실리 (A. hensilli) 및 아에데스 폴리니에세인시스 (A. polynieseinsis)에 의해 인수공통으로 전염될 수 있다.(Weaver 외. (2016) Antiviral Res. 130:69-80). 추가적으로, 상기 바이러스를 전파하기 위한 다른 벡터가 존재할 수 있고, 그리고 상기 바이러스가 수혈에 의해, 경태반으로(transplacentally) 및/또는 성관계에 의한 전염을 통해 전파될 수 있는 것으로 생각된다.
2015년 말에, 광범위한 지카 바이러스 감염의 지역에서 태아 이상 (예를 들면, 소두증) 및 길랭 바레(Guillain-Barre) 증후군 (GBS)의 유의미한 증가는 지카 바이러스가 초기에 생각했던 것보다 훨씬 독성일 수도 있다는 경종을 울렸고, 이로 인해 세계 보건 기구 (WHO)는 세계 공중보건 비상사태 (PHEIC)를 선언해야만 했다(PHEIC) (Heymann 외. (2016) Lancet 387(10020): 719-21). WHO가 이후 PHEIC의 종말을 선포했지만, 지카는 여전히 임산부와 태아에게 특히 심각한 위협이 되고 있다.
지카 바이러스가 실제적인 공중 보건 위협을 촉발하고 있음에도 불구하고, 어떠한 FDA-승인된 백신 또는 치료제도 현재 존재하지 않으며, 그리고 지카 바이러스를 제어하기 위한 유일한 방지적 조치는 모기 집단을 관리하는 것을 수반한다.
잠재적인 백신의 개발을 위한 재조합 지카 바이러스를 특징짓기 위한 최근 노력에서, 위치 330에서 바이러스 외피 단백질에서 돌연변이를 품는 비인간 세포 적응된 지카 바이러스가 확인되었다 (Weger-Lucarelli 외. (2017) Journal of Virology 91(1): 1-10). 이 연구의 저자들은 지카 바이러스 계열 PRVABC59의 전장 감염성 cDNA 클론이 클로닝 동안 증폭될 때 유전적으로 불안정하다는 것을 발견하였고, 그리고 관찰된 불안정을 다루기 위해 바이러스 게놈을 분할하여, 2-플라스미드 시스템(two plasmid system)을 개발하고 적용하기로 선택하였다. 하지만, 지카 백신의 개발을 위한 2-플라스미드 시스템은 별로 바람직하지 않다.
간단한 요약
따라서, 지카 바이러스를 치료하고, 및/또는 예방하기 위한 백신 및 면역원성 조성물을 개발하는 것이 요구된다. 따라서, 본 명세서의 특정 측면들은 1μg 내지 40μg 투여량(dose)의 지카 바이러스로부터 (하나의) 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물에 관계하며, 이때 상기 항원은 비활성화된 온전체(whole) 바이러스이다.
따라서, 본 명세서의 특정 측면들은 1μg 내지 40μg 투여량의 지카 바이러스로부터 (하나의) 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물에 관계하며, 이때 상기 지카 바이러스는 적어도 하나의 비-인간 세포 개작(adaptation) 돌연변이를 포함한다.
따라서, 본 명세서의 특정 측면들은 1μg 내지 40μg 투여량(dose)의 지카 바이러스로부터 (하나의) 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물에 관계하며, 상기 지카 바이러스는 서열 번호:1의 위치 98에서, 또는 서열 번호:1의 위치 98에 상응하는 위치에서 돌연변이를 갖는다.
상기의 요구 및 다른 요구를 충족시키기 위해, 본 명세서는 적어도 부분적으로 비-구조 단백질 1에서의 개작(adaptation) (야생형 외피 단백질와 함께)을 보유하는 유전적으로 안정된 비-인간 세포 개작된 지카 바이러스에 관한 것이며, 이 바이러스로 인하여 백신 생산을 위해 단일 바이러스/바이러스 게놈 시스템의 사용이 허용된다. 본 명세서는 또한 적어도 부분적으로는 유전적으로 상동성이며 및/또는 하나 또는 이상의 외래성 오염물질들(adventitious agents)로부터 정제된 지카 바이러스 클론 분리주에 관한 것이다. 따라서, 본 명세서는 지카 바이러스 감염 (인간에서)을 치료 및/또는 예방하는데 유용한 백신 및 면역원성 조성물을 제공하는데, 이는 적어도 하나의 비-인간 세포 개작 돌연변이 (가령, 지카 바이러스 비-구조 단백질 1에 돌연변이) 및/또는 지카 바이러스 클론 분리주를 품고 있는 지카 바이러스로부터 하나 또는 그 이상의 지카 바이러스 항원들 (가령, 온전체 비활성화된 지카 바이러스로부터 하나 또는 그 이상의 항원들)를 포함한다.
본 명세서는 비-인간 세포 개작된 지카 바이러스의 별도 유도된 클론 바이러스 집단으로부터 하나 또는 그 이상의 항원들을 포함하는 고-투여량 및 저-투여량 백신 모두 강건한 면역 반응을 유도할 수 있고, 지카 바이러스 감염으로부터 유의적인 보호를 제공할 수 있었다는 놀라운 발견에 적어도 부분적으로, 기초한다 (하기 실시예 2 및 실시예 6 참조). 지카 바이러스 계열의 클론 분리는 또한 다음을 허용했다: 1) 오염 물질 (예를 들면, 부모 계열과 공동-정제될 수 있는 외래성 오염물질)로부터 상기 바이러스의 성공적인 정제, 그리고 2) 유전적으로 상동성인 바이러스 집단의 생성. 더욱이, 본 명세서는 단백질 NS1에 개작 돌연변이를 품고 있는 클론 단리된 지카 바이러스는 Vero 세포에서 예상대로 고-역가(역가)로 잘 성장하고, 그리고 놀라운 것은 이 바이러스 외피 단백질 (하기 실시예 1 및 2 참조)에 임의의 탐지가능한 돌연변이들 없이, 유전적으로 안정적/유전적으로 상동성이었다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다. 지카 바이러스 비-구조 단백질 1에서 유사한 돌연변이가 지카 바이러스 계열 PRVABC59의 3가지 공개된 서열중 1의 게놈 서열분석에서 관찰될 수 있지만 (Yun 외. Genome Announc. 2016 Aug 18;4(4)), 이 문헌은 NS1에서 돌연변이는 상기 바이러스의 안정성을 개선시킬 수 있다고 교시하거나 암시하지 못하였고; 상기 돌연변이를 품고 있는 바이러스가 지카 바이러스에 대항하는 효과적인 백신 개발에 이용될 수 있다고 교시하거나 암시하지 못하였고; 그리고 낮은 투여량 및 높은 투여량 모두에서 이용될 때, 강력한 면역 반응을 유도하는데 효과적일 수 있고, 그리고 지카 바이러스 감염으로부터 유의적인 보호를 제공할 수 있다고 교시하거나 암시하지 못하였다. 따라서, 이론에 결부됨 없이, 본 명세서의 발명자들은 단백질 NS1에서 개작 돌연변이는 상기 지카 바이러스 내에서 유전적 안정성을 강화시키는 것으로 보이며, 이는 증가된/강화된 복제 효능을 초래한다고 결론내렸다. 더욱이, 단백질 NS1에서 개작 돌연변이를 품고 있는 지카 계열은 추가 돌연변이들의 발생없이, 다수 횟수로 계대될 수 있었다. 이러한 안정적 지카 바이러스 계열은 백신 생산 및 제조를 위한 마스터 바이러스 씨드 (MVS), 또는 상기 MVS로부터 유래된 후속 씨드로 유리한데, 그 이유는 바람직하지 않은 돌연변이를 발생시키는 마스터 바이러스 씨드(master virus seed)의 위험이 감소되기 때문이다. 더욱이, 이론에 결부됨 없이, 본 명세서의 상기 지카 계열의 단백질 NS1에서 개작 돌연변이는 바람직하지 않은 돌연변이들, 이를 테면, 상기 지카 바이러스 계열의 외피 단백질 E (Env) 안에 돌연변이의 발생을 또한 감소시키거나, 또는 그렇지 않으면 발생을 억제시킬 수 있다.
따라서, 본 명세서의 특정 측면은 지카 바이러스로부터 하나 또는 그 이상의 항원을 내포하는 백신 또는 면역원성 조성물에 관계하며, 이때 상기 지카 바이러스는 적어도 하나의 비-인간 세포 개작 돌연변이를 내포한다. 일부 구체예들에서, 상기 적어도 하나의 비-인간 세포 개작 돌연변이는 지카 바이러스 비-구조 단백질 1 (NS1) 안에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 적어도 하나의 개작 돌연변이는 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 발생한다. 일부 구체예들에서, 상기 적어도 하나의 개작 돌연변이는 Trp98Gly 돌연변이다.
따라서, 본 명세서의 특정 측면들은 1μg 내지 40μg 투여량의 지카 바이러스로부터 (하나의) 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물에 관계하며, 이때 상기 지카 바이러스는 적어도 하나의 비-인간 세포 개작(adaptation) 돌연변이를 포함한다.
따라서, 본 명세서의 특정 측면들은 1μg 내지 40μg 투여량(dose)의 지카 바이러스로부터 (하나의) 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물에 관계하며, 상기 지카 바이러스는 서열 번호:1의 위치 98에서, 또는 서열 번호:1의 위치 98에 상응하는 위치에서 돌연변이를 갖는다.
선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 적어도 하나의 개작 돌연변이는 상기 적어도 하나의 개작 돌연변이가 결여된 지카 바이러스와 비교하였을 때, 유전적 안정성을 강화시킨다. 선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 적어도 하나의 개작 돌연변이는 상기 적어도 하나의 개작 돌연변이가 결여된 지카 바이러스와 비교하였을 때, 바이러스 복제를 강화시킨다. 선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스는 외피 단백질 E (Env)에서 돌연변이를 포함하지 않는다.
선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 비-인간 세포는 포유류 세포이다. 선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 비-인간 세포는 원숭이 세포이다. 일부 구체예들에서, 상기 원숭이 세포는 Vero 세포주에서 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 Vero 세포주는 WHO Vero 10-87 세포주이다.
선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스는 아프리카 계통(lineage) 바이러스 또는 아시아 계통 바이러스이다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스는 아시아 계통 바이러스이다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스는 계열 PRVABC59로부터 유래된다.
선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 정제된 항원 백신 또는 면역원성 조성물, 하위단위 백신 또는 면역원성 조성물, 비활성화된 온전체 바이러스 백신 또는 면역원성 조성물, 또는 감쇠된(attenuated) 바이러스 백신 또는 면역원성 조성물이다. 일부 구체예들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 비활성화된 온전체 바이러스 백신 또는 면역원성 조성물이다. 일부 구체예들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 정제된 활성화된 온전체 지카 바이러스를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함하는 정제된 비활성화된 온전체 지카 바이러스를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는 정제된 비활성화된 온전체 지카 바이러스를 포함한다. 일부 구체예들에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는 정제된 비활성화된 온전체 지카 바이러스를 포함하고, 여기서 상기 지카 바이러스는 계열 PRVABC59로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는 정제된 비활성화된 온전체 지카 바이러스를 포함하고, 여기서 상기 지카 바이러스는 서열 번호: 2에 따른 게놈 서열을 포함하는 계열 PRVABC59로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 서열 번호: 1의 위치 98에서 Trp98Gly 돌연변이에서 계열 PRVABC59와 상이한 정제된 비활성화된 온전체 지카를 포함한다.
선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 바이러스는 화학적으로 비활성화되었다. 일부 구체예들에서, 상기 바이러스는 하나 또는 그 이상의 세정제, 포르말린, 베타-프로피올락톤 (BPL), 이성분 에틸아민 (BEI), 아세틸 에틸렌이민, 메틸렌 블루, 또는 소랄렌에 의해 화학적으로 비활성화되었다. 일부 구체예들에서, 상기 바이러스는 포르말린에 의해 화학적으로 비활성화되었다.
선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 어쥬번트(adjuvant)를 더 함유한다. 일부 구체예들에서, 상기 어쥬번트는 알루미늄 염, 톨-유사 수용체 (TLR) 효현제, 모노포스포릴 지질 A (MLA), 합성 지질 A, 지질 A 모방체 또는 유사체, MLA 유도체, 사이토킨, 사포닌, 무라밀 디펩티드 (MDP) 유도체, CpG 올리고, 그람 음성균의 지질다당류 (LPS), 폴리포스파젠, 에멀션, 비로솜, 카클리어트, 폴리(락티드-코-글리콜리드) (PLG) 마이크로입자, 폴록사머 입자, 마이크로입자, 리포솜, 완전한 프로인드 어쥬번트 (CFA), 및/또는 불완전 프로인드 어쥬번트 (IFA)로부터 선택된다. 일부 구체예들에서, 상기 어쥬번트는 알루미늄 염이다. 일부 구체예들에서, 상기 어쥬번트는 백반, 인산알루미늄, 수산화알루미늄, 황산알루미늄칼륨 및 알하이드로겔(Alhydrogel) 85로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예들에서, 상기 하나 또는 그 이상의 항원들중 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%가 상기 어쥬번트에 흡착된다.
선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 낮은 또는 중간 투여량 백신 또는 면역원성 조성물 (가령, 약 1μg 내지 약 5μg 항원 또는 2μg 항원 또는 5μg 항원 내포)이다. 선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 높은 투여량 백신 또는 면역원성 조성물 (가령, 약 10μg의 항원을 내포)이다. 선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 약 1μg 내지 약 25μg의 상기 하나 또는 그 이상의 항원, 구적으로 2μg, 5μg 또는 10μg, 또는 특히 10μg의 상기 하나 또는 그 이상의 항원을 함유한다. 이러한 특정 구체예들에서, 상기 항원은 정제된 비활성화된 온전체 바이러스, 이를 테면 본원에서 설명된 바와 같이 서열 번호: 1의 위치 98에서 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 트립토판에서 글리신으로의 치환 돌연변이를 갖는 지카 바이러스이다. 일부 구체예들에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는 정제된 비활성화된 온전체 지카 바이러스를 포함하고, 여기서 상기 지카 바이러스는 계열 PRVABC59로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는 정제된 비활성화된 온전체 지카 바이러스를 포함하고, 여기서 상기 지카 바이러스는 서열 번호: 2에 따른 게놈 서열을 포함하는 계열 PRVABC59로부터 유래된다. 이러한 특정 구체예들에서, 상기 지카 바이러스는 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주이다. 선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 약 0.1μg 내지 약 100μg 지카 바이러스 항원 또는 Env를 함유한다. 일부 구체예들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 어쥬번트화되지 않았다. 선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스는 클론 분리주다. 일부 구체예들에서, 상기 클론 분리주는 하나 또는 그 이상의 외래성 오염물질이 실질적으로 없다 (가령, 부모계 계열과 함께 공동-정제될 수 있는 하나 또는 그 이상의 외래성 오염물질이 없다).
본 명세서의 다른 측면들은 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 돌연변이를 갖는 지카 바이러스를 포함하는 백신에 관계한다. 일부 구체예들에서, 상기 백신은 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는 정제된 비활성화된 온전체 지카 바이러스를 포함하고, 이때 상기 지카 바이러스는 계열 PRVABC59로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 백신은 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는 정제된 비활성화된 온전체 지카 바이러스 를 포함하고, 이때 상기 지카 바이러스는 서열 번호:2에 따른 게놈 서열을 포함하는 계열 PRVABC59로부터 유래된다. 이러한 특정 구체예들에서, 상기 지카 바이러스는 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주이다.
본 명세서의 다른 측면들은 a) 알루미늄 염 어쥬번트; 및 b) 정제된 비활성화된 온전체 지카 바이러스를 함유하는 백신 또는 면역원성 조성물에 관계하는데, 이때 상기 지카 바이러스는 비-인간 세포 개작 돌연변이를 내포하고, 이때 상기 비-인간 세포 개작 돌연변이는 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이다.
본 명세서의 다른 측면들은 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 요하는 인간 대상에서 이를 치료 또는 예방하는, 특히 예방하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 치료요법적으로 유효량의 본원에서 기술된 임의의 상기 백신 또는 면역원성 조성물을 상기 인간 대상에게 투여하는 것을 포함한다.
본 명세서의 다른 측면들은 면역반응의 유도를 요하는 인간 대상에게서 이를 유도하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 상기 인간 대상에게 면역원성 양(amount)의 본원에서 기술된 임의의 상기 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
한 측면에서, 본 명세서는 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 요하는 인간 대상에서 이를 치료 또는 예방하는, 특히 예방하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 상기 인간 대상에게 상기 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
한 측면에서, 본 명세서는 지카 바이러스 항원에 대항하는 면역 반응 유도를 요하는 인간 대상에게서 이를 유도하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 상기 인간 대상에게 상기 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
한 측면에서, 본 명세서는 지카 바이러스 질환의 예방을 요하는 인간 대상에게서 이를 예방하는 방법에 관한 것으로, 상기 인간 대상에게 상기 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 이 경우, 상기 질환은 미열, 반구진성 발진(maculopapular rash), 결막염 및 관절통과 관련있다. 더욱이, 상기 지카 바이러스는 중추 신경계 및
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증후군 (GBS) 내에서 잠재적 질환을 야기할 수 있는 향신경성 플라비바이러스이다.
한 측면에서, 본 명세서는 지카 바이러스 질환의 방지를 요하는 태아 또는 신생아에서 이를 예방하는 방법에 관한 것으로써, 당해 임신한 인간 대상 또는 임신 의향이 있는 인간 대상 또는 가임기 여성에게 상기 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 이 경우, 상기 지카 질환은 태아와 신생아의 심각한 결과와 관련있다. 선천적 지카 증후군 (CZS)으로 알려진, 지카 바이러스 감염과 연합된 선천적 기형의 범주는 부분적으로 붕괴된 두개골을 갖는 심각한 소두(microcephaly), 피질하부 석회화를 동반한 대뇌 피질, 황반 반흔(macular scarring) 및 국소 색소성 망막 반점(mottling), 선천성 경축(congenital contractures) 및 추체외 관련 증상(symptoms of extrapyramidal involvement)이 있는 두드러진 조기 기능항진(marked early hypertonia)으로 구성된다.
한 측면에서, 본 명세서는 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방, 특히 예방을 요하는 인간 대상에서 이를 치료 또는 예방하는 방법, 지카 바이러스 항원에 대항하는 면역 반응 유도를 요하는 인간 대상에게서 이를 유도하는 방법, 그리고 지카 바이러스 질환의 예방을 요하는 인간 대상, 태아 또는 신생아에서 이를 예방하는 방법에 사용하기 위한 백신 또는 면역원성 조성물에 관계한다.
한 측면에서, 본 명세서는 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방, 특히 예방을 요하는 인간 대상에서 이를 치료 또는 예방하는 방법, 면역 반응 유도를 요하는 인간 대상에게서 이를 유도하는 방법, 그리고 지카 바이러스 질환의 예방을 요하는 인간 대상, 태아 또는 신생아에서 이를 예방하는 방법을 위한 약물 제조에 있어서 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 용도에 관계한다.
본 명세서의 의미 내에서, 상기 치료는 한 사람의 인간 대상의 치료 및 인간 대상 집단의 치료를 포함한다. 인간 대상 집단은 한 명 이상 개체, 가령, 2명 또는 그 이상의 개체의 치료를 포괄하는 것으로 간주된다.
따라서, 본 명세서의 특정 측면들은 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 요하는 인간 대상 집단에서 이를 치료 또는 예방하는, 특히 예방하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 전술한 인간 대상 집단의 개별 인간 대상에게 지카 바이러스의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하고, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 약 1 내지 약 16주 간격을 두고 제2 투여 (추가접종)로 투여되며, 그리고 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 플라크 환원 중화 검사 (PRNT)에 의해 측정될 때, 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브(
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) 인간 대상 집단 및/또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 집단에서 추가접종 투여 후 14일 및/또는 28일 후에, 300 이상, 또는 500 이상, 또는 1000 이상, 또는 1500 이상, 또는 2000 이상, 또는 3000 이상의 기하학적 평균 중화 항체 역가를 유도한다.
따라서, 본 명세서의 특정 측면들은 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 요하는 인간 대상 집단에서 이를 치료 또는 예방하는, 특히 예방하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 전술한 인간 대상 집단의 개별 인간 대상에게 지카 바이러스의 (하나의) 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 약 1 내지 약 16주 간격을 두고 제2 투여 (추가접종)으로 투여되며, 그리고 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 플라크 환원 중화 검사 (PRNT)에 의해 측정될 때, 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상의 집단 및/또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 집단에서 일차접종 후 28일차에 유도되는 기하학적 평균 중화 항체 역가보다 적어도 10 배, 또는 적어도 15 배, 또는 적어도 20 배, 또는 적어도 25 배 더 높은 추가접종 투여 후 28일차의 기하학적 평균 중화 항체 역가를 유도한다. 따라서, 상기 추가접종 투여는 장기적인 보호를 담당하는 매우 높은 기하학적 평균 중화 항체 역가를 제공한다.
따라서, 본 명세서의 특정 측면들은 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 요하는 인간 대상 집단에서 이를 치료 또는 예방하는, 특히 예방하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 전술한 인간 대상 집단의 개별 인간 대상에게 지카 바이러스의 (하나의) 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 단일 투여량으로 투여되거나 또는 일차접종 투여되며, 그리고 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 단일 투여 또는 일차접종 투여 후 14 일 및/또는 28 일에 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상의 집단 및/또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 집단에서 플라크 환원 중화 검사 (PRNT)에 의해 측정될 때, 10 이상, 또는 50 이상, 또는 100 이상, 또는 200 이상, 또는 250 이상의 기하학적 평균 중화 항체 역가를 유도한다. 높은 기하 평균 중화 항체 역가는 초기 보호 개시를 나타내며, 이는 백신 또는 면역원성 조성물을 투여한 후 짧은 기간 내에 발병 상황, 또는 풍토 지역을 방문하는 여행자에게 유리하다.
본 명세서의 의미 안에서, PRNT는 이미 기술된 바와 같이 (참고: Sun, W. 외. Protection of Rhesus monkeys against dengue virus challenge after tetravalent live attenuated dengue virus vaccination. J. Infect. Dis. 193, 1658-1665 (2006) Muthumani K, Griffin BD, Agarwal S, et al. In vivo protection against ZIKV infection and pathogenesis through passive antibody transfer and active immunisation with a prMEnv DNA vaccine. NPJ Vaccines 2016; 1: 16021)에서 설명된 바와 같이, 플라크 환원 중화 검사 (PRNT)에 의해 결정된 인간 대상내 지카 바이러스 중화 항체 역가를 지칭한다.
본 명세서의 의미 안에서, 인간 대상에서의 GMT 값은 특히 다음과 같이 측정되는 것으로 간주된다. Zika PRNT 분석에서, 인간 혈청을 1:5 내지 1:10,240으로 2-배 연속 희석하고, 동일한 용적의 희석된 지카 바이러스 (ZIKV) (PRVABC59)와 혼합하여 1:10 내지 1:20,480의 최종 희석액을 수득하였다. 2-8℃에서 20 ± 2 시간 동안 중화를 진행시킨 후, 혈청/바이러스 혼합물을 사용하여 Vero E6 세포에 접종하였다. 바이러스 흡착은 습도와 CO2로 37 ± 2℃에서 60 ± 10 분 동안 수행한 다음 메틸셀룰로스 오버레이(overlay)를 추가했다. 감염된 세포를 37±2℃에서 72 ± 2 시간 동안 습도 및 CO2에서 함께 배양하였다. 크리스탈 바이올렛 착색을 사용하여, 플라크를 시각화하고 CTL (Cellular Technology Limited) 판독기를 사용하여 계수하였다. 50% 중화 역가 (PRNT50)의 결정은 혈청-없는 바이러스 대조군의 것과 비교하여, 혈청 존재 하에서 바이러스 플라크의 감소 백분율에 기초하고, 선형 회귀(linear regression)에 의해 산출되었다. 상기 역가는 최고 희석의 역(reciprocal)을 나타내며, 그 결과 플라크 수는 50% 감소된다. 임상 표본과 병행하여 시험된 바이러스 대조군 (~60 pfu/웰을 표적으로 함), 세포 대조군, 양성 대조군 (173-658의 PRNT50) 및 음성 대조군 (PRNT50 <10)을 평가하여 수용성(acceptance)을 평가하였다. 선형 회귀에 의해 생성된 적정 곡선의 상관 계수가 ≥0.85 인 경우, 개별 표본 및 양성 대조군 결과는 수용되었다. 추가 수용 기준은 평판 또는 런(run)에 대해 생성된 크리스탈 바이올렛 착색 및 플라크의 질에 기초하였다. PRNT50 결과는 상기 검정의 출발 희석 (1:10)까지 보고된다. ULOQ보다 높은 PRNT50 결과는 사전-희석(pre-dilution)에서 반복되어, 상기 검정의 정량화 가능한 범위 내에서 결과를 생성한다. 사전-희석된 표본의 결과에 희석 인자를 곱하면 최종 결과가 생성될 것이다.
본 명세서의 의미 안에서 혈청양성(seropositivity)은 플라크 환원 중화 검사 (PRNT)로 결정될 때 역가 ≥ 10으로 정의되며; 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상은 플라크 환원 중화 검사 (PRNT)에 의해 결정될 때 역가 <10을 갖는 대상이며, 혈청전환(seroconversion)은 다음과 같이 특정된다: 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상 (역가 <10)은 플라크 환원 중화 검사 (PRNT)에 의해 결정된 때, 예방접종-후 역가 ≥10를 갖고; 플라크 환원 중화 검사 (PRNT)에 의해 결정될 때 결과　<　10　은 5의 역가를 할당받고; 플라크 환원 중화 검사 (PRNT)에 의해 결정될 때 역가 　10 (검출 한계)　내지 26 (정량 하한) 사이의 역가는 값　 13이 할당된다.
본 명세서의 플라비바이러스 나이브 인간 대상은 반응성 항체 기반 검정 (Luminex)에 의해 측정될 때, 플라비바이러스 패널에 대항하여 탐지가능한 혈청 항체가 없는 인간 대상으로 정의된다. 플라비바이러스 스크리닝 검정은 동일한 표본에서 다중 표적 항원을 동시에 탐지하기 위한 루미넥스(luminex) 플렛폼에 기초한다. 이러한 비드(bead) 기반 검정은 민감하고, 특이적이며, 그리고 재현가능하다. 본 명세서의 경우, 상기 표적화된 항원은 지카(Zika), 뎅기(Dengue), 황열(Yellow fever), JEV, USUV, SLEV 및 WNV이다. 플라비바이러스 간 교차 반응성으로 인해, 현재 항원 세트는 임의의 기존 플라비바이러스 노출을 검출하는데 도움이 될 것이다. 루미넥스 개념에 대한 참조는 다음과 같다: Dias D, Van Doren J, Schlottmann S, Kelly S, Puchalski D, Ruiz W, Boerckel P, Kessler J, Antonello JM, Green T, Brown M, Smith J, Chirmule N, Barr E, Jansen KU, Esser MT. 2005. Optimization and validation of a multiplexed Luminex assay to quantify antibodies to neutralizing epitopes on human papillomaviruses 6, 11, 16, and 18. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 12:959-969 [PMC free article] [PubMed]. Ayouba A 외, Development of a Sensitive and Specific Serological Assay Based on Luminex Technology for Detection of Antibodies to Zaire Ebola Virus. J Clin Microbiol. 2017 Dec 28;55(1):165-176. doi: 10.1128/JCM.01979-16.
본 명세서의 의미 안에서, 풍토병은 질병 통제 예방 센터(Centers for Disease Control and Prevention)에서 정의된 바와 같이, 가령, 2018년 3월에 감염 위험 지역은 예를 들면, 다음과 같다: 아시아: 방글라데시, 버마 (미얀마), 캄보디아, 인도, 인도네시아, 라오스, 말레이시아, 몰디브, 파키스탄, 필리핀, 싱가포르, 태국, 동-티모르 (동 티모르), 베트남: 태평양 제도: 피지, 마샬 군도, 파푸아 뉴기니, 사모아, 솔로몬 제도, 통가. 캐리비안: 앙귈라; 앤티가 바부다; 아루바; 바베이도스; 보네르; 영국령 버진 아일랜드; 쿠바; 쿠라사오; 도미니카; 도미니카 공화국; 그레나다; 아이티; 자메이카; 몬세라트; 미국 영토 푸에르토 리코 연방; 사바; 세인트 키츠 네비스; 세인트 루시아; 세인트 마틴; 세인트 빈센트 그레나딘; 신트 유스타티우스; 신트 마르턴; 트리니다드 토바고; 터크스 케이커스 제도; 미국령 버진 아일랜드. 북아메리카: 멕시코 중앙 아메리카: 벨리즈, 코스타리카, 엘 살바도르, 과테말라, 온두라스, 니카라과, 파나마 남아메리카: 아르헨티나, 볼리비아, 브라질, 콜롬비아, 에콰도르, 프랑스령 기아나, 가이아나, 파라과이, 페루, 수리남, 베네수엘라 아프리카:앙골라, 베냉, 부르키나-파소, 부룬디, 카메룬, 카보 베르데, 중앙 아프리카 공화국, 차드, 콩고 (콩고-브라자빌), 코트 디부아르, 콩고 민주 공화국 (콩고-킨샤사), 적도 기니, 가봉, 감비아, 가나, 기니, 기니-비사우, 케냐, 라이베리아, 말리, 니제르, 나이지리아, 르완다, 세네갈, 시에라 리온, 남 수단, 수단, 탄자니아, 토고, 우간다. 이들 영역은 변경될 수 있다.
따라서, 본 명세서의 특정 측면들은 면역 반응의 유도를 요하는 인간 대상 집단에서 이를 유도하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 전술한 인간 대상 집단의 개별 인간 대상에게 지카 바이러스의 (하나의) 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하고, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 약 1 내지 약 16주 간격을 두고 제2 투여 (추가접종)로 투여되며, 그리고 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 리포트 바이러스 입자 중화 검정 (RVP)에 의해 측정될 때, 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상의 인간 대상 집단 및/또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단에서 추가접종 투여 후 14일 및/또는 28일 후에, 300 이상, 또는 500 이상, 또는 1000 이상, 또는 1500 이상, 또는 2000 이상, 또는 3000 이상, 또는 5000 이상, 10,000 이상의 기하학적 평균 중화 항체 역가를 유도한다.
따라서, 본 명세서의 특정 측면들은 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 요하는 인간 대상 집단에서 이를 치료 또는 예방하는, 특히 예방하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 전술한 인간 대상 집단의 개별 인간 대상에게 지카 바이러스의 (하나의) 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 단일 투여량으로 투여되거나 또는 일차접종 투여되며, 그리고 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 단일 투여 또는 일차접종 투여 후 14 일 및/또는 28 일에 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상의 집단 및/또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 집단에서 리포트 바이러스 입자 중화 검정 (RVP)에 의해 측정될 때, 300 이상, 또는 500 이상, 1000 이상, 또는 2000 이상의 기하학적 평균 중화 항체 역가를 유도하였다. 높은 기하 평균 중화 항체 역가는 초기 보호 개시를 나타내며, 이는 백신 또는 면역원성 조성물을 투여한 후 짧은 기간 내에 발병 상황, 또는 풍토 지역을 방문하는 여행자에게 유리하다.
본 명세서의 의미 안에서 리포터 바이러스 입자 (RVP) 중화 검정이란 96-웰 평판에서 성장된 Vero 세포에서 일정한 양의 지카 RVPs를 갖는 혈청 표본의 적정에 의해 분석된 지카 중화 항체 역가를 지칭한다. RVPs는 지카 (계열 SPH2012)의 prME 단백질 및 뎅기(Dengue)-기반의 레닐라 루시페라아제 리포터를 내포하였다. 간단히 말하면, 혈청은 56℃에서 30 분 동안 열에 의해 비활성화되고, 희석되고, 그리고 이후, 37℃에서 RVPs와 함께 배양되었다. 혈청/RVP 혼합물은 이후, Vero 세포와 혼합되고, 그리고 루시페라아제 기질(substrate)로 검출 전, 37℃± 2℃/5% CO2에서 72 시간 동안 배양되었다. 데이터는 양성 추적 대조에 대해 표준화된 JMP11 비-선형 4 매개변수 분석을 이용하여 분석되었고, 그리고 유효 용량 50% (EC50)이 보고되었다.
따라서, 본 명세서의 특정 측면들은 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 요하는 인간 대상 집단에서 이를 치료 또는 예방하는, 특히 예방하는 방법에 관한 것에 관한 것이며, 이 방법은 전술한 인간 대상 집단의 개별 인간 대상에게 지카 바이러스의 (하나의) 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하고, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 약 1 내지 약 16주 간격을 두고 제2 투여 (추가접종)로 투여되며, 그리고 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 플라크 환원 중화 검사 (PRNT)에 의해 결정될 때, 추가접종 투여 후 14일 및/또는 28일 후, 적어도 20명의 혈청음성 인간 대상의 집단에서에서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 혈청전환율을 유도한다.
따라서, 본 명세서의 특정 측면들은 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 요하는 인간 대상 집단에서 이를 치료 또는 예방하는, 특히 예방하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 전술한 인간 대상 집단의 개별 인간 대상에게 지카 바이러스의 (하나의) 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하고, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 단일 투여량으로 투여되거나, 또는 일차접종 투여로 투여되며, 그리고 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 집단에서 단일 투여 또는 일차접종 투여 후 14 일 및/또는 28 일에 플라크 환원 중화 검사 (PRNT)에 의해 결정될 때 25%, 30%, 40%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90%의 혈청전환율을 유도한다. 단일 투여 또는 일차접종 투여 후 높은 혈청전환율은 초기 보호 개시를 나타내며, 이는 백신 또는 면역원성 조성물을 투여한 후 짧은 기간 내에 발병 상황, 또는 풍토 지역을 방문하는 여행자에게 유리하다.
따라서, 본 명세서의 특정 측면들은 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 요하는 인간 대상 집단에서 이를 치료 또는 예방하는, 특히 예방하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 전술한 인간 대상 집단의 개별 인간 대상에게 지카 바이러스의 (하나의) 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 단일 투여량으로 투여되거나, 또는 일차접종 투여로 투여되며, 그리고 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 집단에서 플라크 환원 중화 검사 (PRNT)에 의해 결정될 때, 단일 투여 또는 일차접종 투여 후 14 일 및/또는 28 일에 25%, 30%, 40%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90%의 상기 혈청양성율을 유도한다. 단일 투여 또는 일차접종 투여 후 높은 혈청전환율은 초기 보호 개시를 나타내며, 이는 백신 또는 면역원성 조성물을 투여한 후 짧은 기간 내에 발병 상황, 또는 풍토 지역을 방문하는 여행자에게 유리하다.
본 명세서의 특정 다른 측면들은 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 요하는 인간 대상 집단에서 이를 치료 또는 예방하는, 특히 예방하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 전술한 인간 대상 집단의 개별 인간 대상에게 지카 바이러스의 (하나의) 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 가령, 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)에서 단일 투여량 또는 다중 투여량으로 투여되며, 그리고 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 투여 후 7일까지 적어도 20명의 인간 대상의 인간 대상 집단, 특히 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상의 집단, 또는 특히, 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 집단의 50% 미만에서 전신 부작용을 유도한다. 상기 방법들은 지카 바이러스 감염을 치료 또는 예방하기 위한 약물 제조에 있어서 본원에서 개시하는 지카 바이러스의 (하나의) 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물의 상응하는 용도에 또한 관계하는 것으로 이해된다.
본 명세서의 의미 안에서, “전신 부작용”은 특히 열, 두통, 피로, 관절통, 근육통 및 불안감(malaise)이다.
상기 방법들은 지카 바이러스 감염을 치료 또는 예방하기 위한 본원에서 개시하는 지카 바이러스의 (하나의) 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물에 또한 관계하는 것으로 이해된다.
일부 구체예들에서, 투여는 근육내 또는 피하(subcutaneous) 투여다. 일부 구체예들에서, 투여는 약 1 내지 약 16주 간격을 두고(제1 투여 (일차접종)와 제2 투여(추가접종) 제공될 때, 본원에서 기술된 바와 같은 상기 백신 또는 면역원성 조성물(가령, 10μg의 정제된 비활성화된 온전체 바이러스, 이를 테면, 본원에서 기술된 바와 같이 에서열 번호:1의 위치 98 또는 서열 번호:1의 위치 98에 상응하는 위치에서 트립토판에서 글리신으로의 치환 돌연변이를 갖는 지카 바이러스)의 2 투여량(doses)의 투여를 포함한다. 이러한 특정 구체예들에서, 상기 지카 바이러스는 특히 본원에서 기술된 바와 같은 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주이다.
본 명세서의 상기 측면들은 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 요하는 인간 대상에서 이의 치료 또는 예방용으로 사용하기 위한, 면역 반응 유도를 요하는 인간 대상에서 이의 유도용으로 사용하기 위한, 그리고 지카 바이러스 질환 예방을 요하는 인간 대상, 태아 또는 신생아에서 이의 예방용으로 사용하기 위한 본원에서 기술된 상기 백신 또는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 투여는 근육내 또는 피하 투여다. 일부 구체예들에서, 투여는 약 1 내지 약 16주 간격을 두고(제1 투여 (일차접종)와 제2 투여(추가접종)) 제공될 때, 본원에서 기술된 바와 같은 상기 백신 또는 면역원성 조성물(가령, 10μg의 정제된 비활성화된 온전체 바이러스, 이를 테면, 본원에서 기술된 바와 같이 에서열 번호:1의 위치 98 또는 서열 번호:1의 위치 98에 상응하는 위치에서 트립토판에서 글리신으로의 치환 돌연변이를 갖는 지카 바이러스)의 2 투여량(doses)의 투여를 포함한다. 이러한 특정 구체예들에서, 상기 지카 바이러스는 특히 본원에서 기술된 바와 같은 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주이다.
본 명세서의 상기 측면들은 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 요하는 인간 대상에서 이의 치료 또는 예방용 면역 반응 유도를 요하는 인간 대상에서 이의 유도용 그리고 지카 바이러스 질환 예방을 요하는 인간 대상, 태아 또는 신생아에서 이의 예방용 약물 제조에서 본원에서 기술된 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 용도에 관계한다. 일부 구체예들에서, 투여는 근육내 또는 피하 투여다. 일부 구체예들에서, 투여는 약 1 내지 약 16주 간격을 두고(제1 투여 (일차접종)와 제2 투여(추가접종)) 제공될 때, 본원에서 기술된 바와 같은 상기 백신 또는 면역원성 조성물(가령, 10μg의 정제된 비활성화된 온전체 바이러스, 이를 테면, 본원에서 기술된 바와 같이 에서열 번호:1의 위치 98 또는 서열 번호:1의 위치 98에 상응하는 위치에서 트립토판에서 글리신으로의 치환 돌연변이를 갖는 지카 바이러스)의 2 투여량(doses)의 투여를 포함한다. 이러한 특정 구체예들에서, 상기 지카 바이러스는 특히 본원에서 기술된 바와 같은 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주이다.
선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 인간 대상은 임신하거나, 임신 의향이 있거나, 또는 가임기 여성이다.
선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하면 상기 인간 대상에서 보호성 면역 반응이 유도된다. 일부 구체예들에서, 상기 인간 대상에서 유도된 보호성 면역 반응은 상기 적어도 하나의 비-인간 세포 개작 돌연변이가 결여된 지카 바이러스로부터 하나 또는 그 이상의 항원들이 함유된 백신 또는 면역원성 조성물이 투여된 대응 인간 대상에서 유도된 보호성 면역 반응보다 더 크다. 선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하면 상기 인간 대상에게서 지카 바이러스에 대한 중화 항체 생성을 유도한다. 일부 구체예들에서, 상기 인간 대상에게서 생성된 중화 항체의 농도는 상기 적어도 하나의 비-인간 세포 개작 돌연변이가 결여된 지카 바이러스로부터 하나 또는 그 이상의 항원들을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 투여받는 대응하는 인간 대상에서 생성된 중화 항체의 농도보다 더 높다.
선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 피하(subcutaneous) 투여, 경피(transcutaneous) 투여, 피내(intradermal) 투여, 피부 아래(subdermal) 투여, 근육 내 투여, 경구(peroral) 투여, 비강내(intranasal) 투여, 협측(buccal) 투여, 복강내(intraperitoneal) 투여, 질내(intravaginal) 투여, 항문(anal) 투여 및/또는 두개내(intracranial) 투여로부터 선택된 경로에 의해 투여된다. 선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 하나 또는 그 이상의 횟수로 투여된다. 일부 구체예들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 백신 또는 면역 원성 조성물은 제 1 (일차접종) 및 제 2 (추가접종) 투여로서 투여된다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 (추가접종) 투여는 상기 제 1 (일차접종) 투여후 적어도 28 일 후에 투여된다. 일부 구체예들에서, 투여는 약 1 내지 약 16주 간격을 두고(제1 투여 (일차접종)와 제2 투여(추가접종)) 제공될 때, 본원에서 기술된 바와 같은 상기 백신 또는 면역원성 조성물(가령, 10μg의 정제된 비활성화된 온전체 바이러스, 이를 테면, 본원에서 기술된 바와 같이 에서열 번호:1의 위치 98 또는 서열 번호:1의 위치 98에 상응하는 위치에서 트립토판에서 글리신으로의 치환 돌연변이를 갖는 지카 바이러스)의 2 투여량(doses)의 투여를 포함한다. 이러한 특정 구체예들에서, 상기 지카 바이러스는 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주이다.
선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 바이러스 조직표본(preparation)은 어쥬번트와 혼합된다. 일부 구체예들에서, 상기 어쥬번트는 알루미늄 염, 톨-유사 수용체 (TLR) 효현제, 모노포스포릴 지질 A (MLA), 합성 지질 A, 지질 A 모방체 또는 유사체, MLA 유도체, 사이토킨, 사포닌, 무라밀 디펩티드 (MDP) 유도체, CpG 올리고, 그람 음성균의 지질다당류 (LPS), 폴리포스파젠, 에멀션, 비로솜, 카클리어트, 폴리(락티드-코-글리콜리드) (PLG) 마이크로입자, 폴록사머 입자, 마이크로입자, 리포솜, 완전한 프로인드 어쥬번트 (CFA), 및/또는 불완전 프로인드 어쥬번트 (IFA)로부터 선택된다. 일부 구체예들에서, 상기 어쥬번트는 알루미늄 염이다. 일부 구체예들에서, 상기 어쥬번트는 백반, 인산알루미늄, 수산화알루미늄, 황산알루미늄칼륨 및/또는 알하이드로겔 85에서 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 바이러스 조직표본 내에 한 가지 또는 그 이상의 항원 중에서 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%가 어쥬번트에 흡착된다.
선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 적어도 하나의 비-인간 세포 개작 돌연변이는 지카 바이러스 NS1에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 적어도 하나의 개작 돌연변이는 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 발생한다. 일부 구체예들에서, 상기 적어도 하나의 개작 돌연변이는 Trp98Gly 돌연변이다. 선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 적어도 하나의 개작 돌연변이는 상기 적어도 하나의 개작 돌연변이가 결여된 지카 바이러스와 비교하였을 때, 유전적 안정성을 강화시킨다. 선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 적어도 하나의 개작 돌연변이는 상기 적어도 하나의 개작 돌연변이가 결여된 지카 바이러스와 비교하였을 때, 바이러스 복제를 강화시킨다. 선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스는 외피 단백질 E (Env)에서 돌연변이를 포함하지 않는다.
선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 집단은 이종적(heterogeneous)이다. 선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 집단은 지카 바이러스 임상 분리주를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 임상 분리주는 계열 PRVABC59로부터 유래된다. 선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 집단은 하나 또는 그 이상의 횟수로 세포 배양에서 이미 계대된 지카 바이러스를 포함한다. 선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 접종물(inoculum)은 인간 혈청을 포함한다. 선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 접종물은 하나 또는 그 이상의 외래성 오염물질(adventitious agents)을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 클론 분리주는 실질적으로 상기 하나 또는 그 이상의 외래성 오염물질이 없다.
선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 방법들은 상기 지카 바이러스 클론 분리주의 하나 또는 그 이상의 추가 플라크 정제를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 클론 분리주는 2회 또는 그 이상 정제된 추가 플라크다. 선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 방법들은 세포 배양에서 하나 또는 그 이상의 횟수로 상기 지카 바이러스 클론 분리주를 계대하는 것을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 클론 분리주는 2회 또는 그 이상으로 계대된다.
선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 방법들은 상기 지카 바이러스 클론 분리주로부터 하나 또는 그 이상의 항원들을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 제형화하는 것을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 정제된 항원 백신 또는 면역원성 조성물, 하위단위 백신 또는 면역원성 조성물, 비활성화된 온전체 바이러스 백신 또는 면역원성 조성물, 또는 감쇠된 바이러스 백신 또는 면역원성 조성물이다. 일부 구체예들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 정제된 비활성화된 온전체 바이러스 백신 또는 면역원성 조성물이다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 클론 분리주는 화학적으로 비활성화되었다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 클론 분리주는 하나 또는 그 이상의 세정제, 포르말린, 베타-프로피올락톤 (BPL), 이성분 에틸아민 (BEI), 아세틸 에틸렌이민, 메틸렌 블루, 또는 소랄렌에 의해 화학적으로 비활성화되었다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 클론 분리주는 포르말린으로 화학적으로 비활성화되었다.
선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 방법들은 상기 백신 또는 면역원성 조성물에 어쥬번트를 혼합하는 것을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 어쥬번트는 알루미늄 염, 톨-유사 수용체 (TLR) 효현제, 모노포스포릴 지질 A (MLA), 합성 지질 A, 지질 A 모방체 또는 유사체, MLA 유도체, 사이토킨, 사포닌, 무라밀 디펩티드 (MDP) 유도체, CpG 올리고, 그람 음성균의 지질다당류 (LPS), 폴리포스파젠, 에멀션, 비로솜, 카클리어트, 폴리(락티드-코-글리콜리드) (PLG) 마이크로입자, 폴록사머 입자, 마이크로입자, 리포솜, 완전한 프로인드 어쥬번트 (CFA), 및 불완전 프로인드 어쥬번트 (IFA)로부터 선택된다. 일부 구체예들에서, 상기 어쥬번트는 알루미늄 염이다. 일부 구체예들에서, 상기 어쥬번트는 백반, 인산알루미늄, 수산화알루미늄, 황산알루미늄칼륨 및 알하이드로겔 85에서 선택된다. 일부 구체예들에서, 상기 하나 또는 그 이상의 항원들중 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%가 상기 어쥬번트에 흡착된다. 선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 1μg 내지 약 40μg의 상기 정제된 비활성화된 온전체 바이러스, 또는 1μg 내지 약 30μg의 상기 정제된 비활성화된 온전체 바이러스, 또는 1μg 내지 약 20μg의 상기 정제된 비활성화된 온전체 바이러스, 특히 2μg, 또는 5μg, 또는 10μg, 또는 15μg 또는 20μg 또는 특히 10μg의 상기 정제된 비활성화된 온전체 바이러스, 이를 테면 본원에서 기술된 바와 같이 에서열 번호:1의 위치 98 또는 서열 번호:1의 위치 98에 상응하는 위치에서 트립토판에서 글리신으로의 치환 돌연변이를 갖는 지카 바이러스를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 1μg 내지 약 30μg의 상기 정제된 비활성화된 온전체 바이러스, 특히 에서열 번호:1의 위치 98 또는 서열 번호:1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는, 2μg, 5μg 또는 10μg, 또는 특히 10μg의 정제된 비활성화된 온전체 지카 바이러스를 포함하며, 이때 상기 지카 바이러스는 계열 PRVABC59로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 1μg 내지 약 30μg의 상기 정제된 비활성화된 온전체 바이러스, 특히 에서열 번호:1의 위치 98 또는 서열 번호:1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는 2μg, 5μg 또는 10μg, 또는 특히 10μg의 정제된 비활성화된 온전체 지카 바이러스를 포함하며, 이때 상기 지카 바이러스는 서열 번호: 2에 따른 게놈 서열을 포함하는 계열 PRVABC59로부터 유래된다.
선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 약 0.1μg의 Env 내지 약 100μg의 Env를 포함한다. 이러한 특정 구체예들에서 상기 지카 바이러스는 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주이다. 일부 구체예들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 어쥬번트화되지 않는다.
선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 클론 분리주는 상동성 유전적 집단이다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 클론 분리주는 외피 단백질 E (Env)에서 돌연변이를 함유하지 않는다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 클론 분리주는 적어도 하나의 돌연변이를 함유한다. 일부 구체예들에서, 상기 적어도 하나의 돌연변이는 지카 바이러스 비-구조 단백질 1 (NS1)에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 적어도 하나의 돌연변이는 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 발생한다. 일부 구체예들에서, 상기 적어도 하나의 돌연변이는 Trp98Gly 돌연변이이다. 일부 구체예들에서 상기 적어도 하나의 돌연변이는 외피 단백질 E (Env)에 있지 않는다. 일부 구체예들에서, 상기 적어도 하나의 돌연변이는 상기 적어도 하나의 돌연변이가 결여된 지카 바이러스와 비교하였을 때, 유전적 안정성을 강화시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 적어도 하나의 돌연변이는 상기 적어도 하나의 돌연변이가 결여된 지카 바이러스와 비교하였을 때, 바이러스 복제를 강화시킨다.
본 명세서의 다른 측면들은 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주로부터 하나 또는 그 이상의 항원들을 내포하는 백신 또는 면역원성 조성물에 관계한다. 일부 구체예들에서, 상기 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주는 지카 바이러스 집단을 포함하는 접종물에 접촉된 세포로부터 정제된 플라크다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 비-인간 세포이다. 일부일부 구체예들에서, 상기 세포는 곤충 세포이다. 일부 구체예들에서, 상기 곤충 세포는 모기 세포이다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 포유류 세포이다. 일부 구체예들에서, 상기 포유류 세포는 원숭이 세포이다. 일부 구체예들에서, 상기 원숭이 세포는 Vero 세포주로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 Vero 세포주는 WHO Vero 10-87 세포주이다.
선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 집단은 이종적이었다. 선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 집단은 지카 바이러스 임상 분리주를 포함하였다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 임상 분리주는 계열 PRVABC59로부터 유래된다. 선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 집단은 하나 또는 그 이상의 횟수로 세포 배양에서 이미 계대된 지카 바이러스를 포함하였다. 선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 접종물은 인간 혈청을 포함하였다. 선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 접종물은 하나 또는 그 이상의 외래성 오염물질을 포함하였다. 일부 구체예들에서, 상기 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주는 실질적으로 상기 하나 또는 그 이상의 외래성 오염물질이 없다.
선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주는 야생형 지카 바이러스와 비교하였을 때, 변형된다. 선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주는 상동성 유전적 집단이다. 선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주는 외피 단백질 E (Env)에서 돌연변이를 함유하지 않는다. 선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 적어도 하나의 돌연변이는 지카 바이러스 비-구조 단백질 1 (NS1)에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 적어도 하나의 돌연변이는 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 발생한다. 일부 구체예들에서, 상기 적어도 하나의 돌연변이는 Trp98Gly 돌연변이이다. 일부 구체예들에서, 상기 적어도 하나의 돌연변이는 지카 바이러스 외피 단백질 E (Env)에 있지 않는다. 일부 구체예들에서, 상기 적어도 하나의 돌연변이는 상기 적어도 하나의 돌연변이가 결여된 지카 바이러스와 비교하였을 때, 유전적 안정성을 강화시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 적어도 하나의 돌연변이는 상기 적어도 하나의 돌연변이가 결여된 지카 바이러스와 비교하였을 때, 바이러스 복제를 강화시킨다. 선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주는 아프리카 계통 바이러스 또는 아시아 계통 바이러스이다. 일부 구체예들에서, 상기 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주는 아시아 계통 바이러스다.
선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 정제된 항원 백신 또는 면역원성 조성물, 하위단위 백신 또는 면역원성 조성물, 비활성화된 온전체 바이러스 백신 또는 면역원성 조성물, 또는 감쇠된 바이러스 백신 또는 면역원성 조성물이다. 일부 구체예들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 비활성화된 온전체 바이러스 백신 또는 면역원성 조성물이다. 선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주는 화학적으로 비활성화되었다. 일부 구체예들에서, 상기 플라크 정제된 지카 바이러스는 하나 또는 그 이상의 세정제, 포르말린, 베타-프로피올락톤 (BPL), 이성분 에틸아민 (BEI), 아세틸 에틸렌이민, 메틸렌 블루, 또는 소랄렌에 의해 화학적으로 비활성화되었다. 일부 구체예들에서, 상기 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주는 포르말린으로 화학적으로 비활성화되었다.
선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 어쥬번트를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 어쥬번트는 알루미늄 염, 톨-유사 수용체 (TLR) 효현제, 모노포스포릴 지질 A (MLA), 합성 지질 A, 지질 A 모방체 또는 유사체, MLA 유도체, 사이토킨, 사포닌, 무라밀 디펩티드 (MDP) 유도체, CpG 올리고, 그람 음성균의 지질다당류 (LPS), 폴리포스파젠, 에멀션, 비로솜, 카클리어트, 폴리(락티드-코-글리콜리드) (PLG) 마이크로입자, 폴록사머 입자, 마이크로입자, 리포솜, 완전한 프로인드 어쥬번트 (CFA), 및 불완전 프로인드 어쥬번트 (IFA)로부터 선택된다. 일부 구체예들에서, 상기 어쥬번트는 알루미늄 염이다. 일부 구체예들에서, 상기 어쥬번트는 백반, 인산 알루미늄, 수산화알루미늄, 황산 알루미늄칼륨 및 알하이드로겔 85에서 선택된다. 일부 구체예들에서, 상기 하나 또는 그 이상의 항원들중 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%가 상기 어쥬번트에 흡착된다. 선행 구체예들중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 구체예들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 0.1μg 내지 약 25μg의 상기 정제된 비활성화된 온전체 바이러스, 이를 테면 본원에서 기술된 바와 같이 서열 번호:1의 위치 98에 트립토판에서 글리신으로의 치환 돌연변이를 갖는 지카 바이러스, 특히 2μg, 5μg 또는 10μg, 또는 특히 10μg 정제된 비활성화된 온전체 바이러스 또는 약 0.1μg의 Env 내지 약 100μg의 Env를 함유한다. 이러한 특정 구체예들에서, 상기 지카 바이러스는 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주이다. 일부 구체예들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 어쥬번트화되지 않았다.
상기 및 본원에 기재된 다양한 구체예들의 특성 중 하나, 일부 또는 전부는 본 개시 내용의 다른 구체예들 형성하기 위해 조합 될 수 있음을 이해해야 한다. 본 개시의 이들 및 다른 측면은 당업자에게 명백해질 것이다. 본 명세서의 이들 및 다른 구체예들은 하기의 상세한 설명에 의해 추가로 설명된다.
도 1은 모의 감염된 (위쪽) 또는 ZIKAV 균주 PRVABC59로 감염된 (아래쪽) Vero 세포 단층의 명시야 현미경검사(bright field microscopy) 이미지를 도시한다.
도 2는 TCID50에 의해 결정될 때, Vero 세포 단층에서 ZIKAV PRVABC59 P1의 성장 동역학을 도시한다.
도 3은 지카 바이러스 PRVABC59 P5 클론 a-f의 효능 검정 검사 (TCID50)를 도시한다.
도 4는 Vero 세포 단층에 대한, 지카 바이러스 PRVABC59 P6 클론 a-f의 성장의 세포변성 효과 (CPE)를 묘사하는 명시야-현미경검사 이미지를 도시한다.
도 5는 지카 바이러스 PRVABC59 P6 클론 a-f의 효능 검정 검사 (TCID50)를 도시한다.
도 6은 지카 바이러스 계열 PRVABC59 P6e (서열 번호: 8) 및 PRVABC59 (서열 번호: 9)로부터 잔기 330 인근에서 지카 바이러스의 외피 당단백질 서열을 여러 다른 플라비바이러스 (WNV (서열 번호: 10); JEV (서열 번호: 11); SLEV (서열 번호: 12); YFV (서열 번호: 13); DENV 1 16007 (서열 번호: 14); DENV 2 16681 (서열 번호: 15); DENV 3 16562 (서열 번호: 16); 그리고 DENV 4 1036 (서열 번호: 17))와 비교하는 아미노산 서열 정렬을 도시한다.
도 7은 지카 바이러스 계열 PRVABC59 P6e (서열 번호: 18) 및 PRVABC59 (서열 번호: 19)로부터 잔기 98 인근에서 지카 바이러스의 NS1 단백질 서열을 여러 다른 플라비바이러스 (WNV (서열 번호: 20); JEV (서열 번호: 21); SLEV (서열 번호: 22); YFV (서열 번호: 23); DENV 1 16007 (서열 번호: 24); DENV 2 16681 (서열 번호: 25); DENV 3 16562 (서열 번호: 26); 그리고 DENV 4 1036 (서열 번호: 27))와 비교하는 아미노산 서열 정렬을 도시한다.
도 8은 ZIKAV PRVABC59 P1 바이러스와 비교하여, ZIKAV PRVABC59 P6 바이러스 클론 a-f의 플라크 표현형을 도시한다.
도 9는 ZIKAV PRVABC59 P1 바이러스와 비교하여, ZIKAV PRVABC59 P6 바이러스 클론의 평균 플라크 크기를 도시한다.
도 10은 혈청-없는 성장 조건 하에 Vero 세포에서 ZIKAV PRVABC59 P6 클론 a-f의 성장 동역학을 도시한다.
도 11은 면역화 실험을 위한 PRVABC59 P6b와 P6e 조제된 의약품을 제조하기 위해 취해진 단계들의 계통도를 도시한다.
도 12a는 ZIKAV PRVABC59 P6b와 P6e 클론으로부터 유래된 백신 제형으로 CD-1 마우스의 투약의 일정을 도시한다. PBS가 위약(placebo)으로 이용되었다.
도 12b는 ZIKAV PRVABC59 P6b와 P6e 클론으로부터 유래된 백신 제형을 이용하여, 도 12a에서 설명된 바와 같이 면역화된 CD-1 마우스의 혈청 ZIKAV 중화 항체 역가를 도시한다. ZIKAV 중화 항체 역가는 리포터 바이러스 입자(Reporter Virus Particle: RVP) 중화 검정에 의해 결정되었다. 실선은 군(group)의 기하 평균을 나타낸다. 검출 한계 (1.93 log10)는 파선에 의해 표시된다.
도 13a는 ZIKAV PRVABC59 P6b와 P6e 클론으로부터 유래된 백신 제형으로 AG129 마우스의 투약의 일정을 도시한다. PBS가 위약으로서 이용되었다.
도 13b는 ZIKAV PRVABC59 P6b와 P6e 클론으로부터 유래된 백신 제형을 이용하여, 도 13a에서 설명된 바와 같이 면역화된 AG129 마우스의 혈청 ZIKAV 중화 항체 역가를 도시한다. 실선은 군의 기하 평균을 나타낸다. 검출 한계 (1.30 log10)는 파선에 의해 표시된다. 검출가능한 역가를 갖지 않는 동물 (<1.30)은 0.5의 역가가 배정되었다.
도 14는 시작 체중의 백분율로서 표시된, 공격접종(challenge)-후 AG129 검사 군의 평균 체중을 도시한다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 15는 PFU/mL로서 보고된, 공격접종-후 2 일에 개별 AG129 마우스의 혈청 바이러스혈증(viremia)을 도시한다. 실선은 군의 평균을 나타낸다. 검출 한계 (2.0 log10)는 파선에 의해 표시된다.
도 16은 공격접종-후 AG129 검사 군의 생존 분석을 도시한다.
도 17은 예방접종된(vaccinated) 그리고 공격접종된(challenged) AG129 마우스로부터 모아진(pooled) 혈청의 수동 전달 이후에, 공격접종-전 혈청 순환 ZIKAV 중화 항체 (Nab) 역가를 도시한다.
도 18은 지카 바이러스로 공격접종된 수동 전달 마우스 및 대조군 마우스의 평균 체중을 도시한다.
도 19는 PFU/mL로서 보고된, 공격접종후 3 일에 개별 AG129 마우스의 혈청 바이러스혈증을 도시한다.
도 20은 지카 바이러스로 공격접종된 수동 전달 마우스 및 대조군 마우스의 생존 분석을 도시한다.
도 21은 수동 전달 생쥐에서 관찰된, ZIKAV 중화 항체 역가 및 바이러스혈증 사이에 상관을 도시한다.
도 22는 Kaplan Meier 생존 곡선을 이용하여, P6a와 P6e의 preMVS 스톡으로 공격접종 후, AG129 마우스의 생존 분석을 도시한다.
도 23은 P6a와 P6e의 preMVS 스톡으로 공격접종 후, 발명의 시점에서 시작 체중의 백분율에서 표현된 바와 같은 평균 체중을 도시한다. 파선은 참조를 위한, 시작 체중의 100%를 나타낸다.
도 24는 PFU/mL로서 보고된, P6a와 P6e의 preMVS 스톡으로 공격접종-후 3 일차에 개별 AG129 마우스의 혈청 바이러스혈증을 도시한다. 파선은 검정의 검출 한계를 나타낸다.
도 25는 비활성화 데이터의 편집된 동역학을 도시한다. 데이터는 RNA 사본에 감염력 (TCID50), 그리고 4개의 독성학 로트(lots)로부터 표본에 대한 비활성화의 완결도 (COI)를 비교한다. 이들 데이터는 COI 검정의 민감도가 TCID50보다 크다는 것을 지시한다.
도 26은 0.31 TCID50의 입력 바이러스 역가로 증명된 바와 같이, 검정에서 C6/36과 Vero 민감도의 비교를 도시한다.
도 27은 0.01 TCID50/웰 (-2 로그 TCID50/웰)의 목표 값 주변에서 99% 신뢰 구간을 포함하는, C6/36 세포 부위를 이용한 CPE 대(vs.) 로그 TCID50의 로지스틱 회귀 분석(logistic regression analysis)을 도시한다; 상기 모델에서 0.85%의 웰이 양성일 것으로 예측된다.
도 28은 PBS (a), 그리고 0.049μg/mL (b), 0.098μg/mL (c), 0.196μg/mL (d), 0.491μg/mL (e), 0.982μg/mL (f) 및 1.964μg/mL (g) 포름알데히드를 내포하는 PBS 용액의 크로마토그램을 도시한다.
도 29는 실시예 6을 위한 임상 연구 기획을 요약한 것이다.
도 30은 실시예 6에서 인간 대상의 PRNT를 사용하여 측정된 기하 평균 역가 (GMT)를 도시한다.
도 31은 실시예 6에 기재된 연구의 29 일차 (일차접종 투여 후 28 일 시점) 및 57 일차(추가접종 투여 후 28 일 시점)에 PRNT를 사용하여 결정된 혈청전환을 달성한 인간 대상의 백분율을 보여준다.
도 32은 실시예 6에 기재된 연구의 29 일차 (일차접종 투여 후 28 일 시점)에 특정 기하학적 평균 역가 (PRNT를 사용하여 결정됨)를 달성하는 인간 대상의 백분율의 플롯을 도시한다.
도 33은 실시예 6에 기재된 연구의 57 일차 (일차접종 투여 후 56 일 시점)에 특정 기하학적 평균 역가 (PRNT를 사용하여 결정됨)를 달성하는 인간 대상의 백분율의 플롯을 도시한다.
상세한 설명
일반적인 기술
본원에서 설명되거나 또는 언급된 기술과 절차는 일반적으로, 당업자에 의해 전통적인 방법론, 예컨대, 예를 들면, Sambrook 외, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, 외 eds., (2003)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane, eds. (1988), and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology (J. M. Walker, ed. Humana Press (1983)); Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Celis, ed., Academic Press (1998)) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, eds. Plenum Press (1998)); Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., J. Wiley and Sons (1993-8)); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1987)); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis 외, eds., Springer (1994)); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan 외, eds., Wiley (1991)); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, (1997)); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, (1988-1989)); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, (2000)); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1999)); 그리고 The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, (1995))에서 설명된 폭넓게 활용되는 방법론을 이용하여 충분히 이해되고 통상적으로 이용된다.
지카(Zika) 바이러스
본 명세서의 특정 측면들은 정제된 바이러스, 비활성화된 바이러스, 감쇠된 바이러스, 재조합 바이러스, 또는 정제된 및/또는 하위단위 백신용 재조합 바이러스 단백질을 포함하는(이에 국한되지 않음) 백신 및/또는 면역원성 조성물로 유용할 수 있는 적어도 하나의 지카 바이러스 (가령, 본원에 기술된 상기 방법들에 의해 정제된, 지카 바이러스 클론 분리주, 하나 또는 그 이상의 비-인간 세포 개작 돌연변이들을 포함하는 지카 바이러스, 등)에 관계한다.
지카 바이러스 (ZIKV)는 1947년에 우간다의 지카 숲에서 센티넬 붉은 털 원숭이로부터 최초 단리된 모기-매개된 플라비바이러스이다. 그 이후로, 아프리카와 아시아 둘 모두에서, 그리고 더욱 최근에는, 아메리카에 거주하는 인간으로부터 단리가 이루어졌다. ZIKV는 2가지 (아마도 3가지) 계통에서 발견된다: 아프리카 계통 (아마도 별개의 동아프리카와 서아프리카 계통) 및 아시아 계통. 따라서, 본 발명의 적합한 지카 바이러스의 실례는 제한 없이, 아프리카 및/또는 아시아 계통으로부터 바이러스를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스는 아프리카 계통 바이러스이다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스는 아시아 계통 바이러스이다. 또한, 지카 바이러스의 아프리카 및 아시아 계통 내 여러 계통이 이미 확인되었다. 예를 들면, 계열 Mr 766, ArD 41519, IbH 30656, P6-740, EC Yap, FSS13025, ArD 7117, ArD 9957, ArD 30101, ArD 30156, ArD 30332, HD 78788, ArD 127707, ArD 127710, ArD 127984, ArD 127988, ArD 127994, ArD 128000, ArD 132912, 132915, ArD 141170, ArD 142623, ArD 149917, ArD 149810, ArD 149938, ArD 157995, ArD 158084, ArD 165522, ArD 165531, ArA 1465, ArA 27101, ArA 27290, ArA 27106, ArA 27096, ArA 27407, ArA 27433, ArA 506/96, ArA 975-99, Ara 982-99, ArA 986-99, ArA 2718, ArB 1362, Nigeria68, Malaysia66, Kedougou84, Suriname, MR1429, PRVABC59, ECMN2007, DakAr41524, H/PF/2013, R103451, 103344, 8375, JMB-185, ZIKV/H, sapiens/Brazil/Natal/2015, SPH2015, ZIKV/Hu/Chiba/S36/2016 및/또는 Cuba2017을 포함하는, 당해 분야에서 공지된 지카 바이러스의 한 가지 또는 그 이상의 적합한 계열이 본 발명에서 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 계열 PRVABC59는 본 명세서에서 이용된다.
일부 구체예에서, 지카 바이러스 게놈 서열의 실례는 아래에 서열 번호: 2에 제시된다:
1 gttgttgatc tgtgtgaatc agactgcgac agttcgagtt tgaagcgaaa gctagcaaca
61 gtatcaacag gttttatttt ggatttggaa acgagagttt ctggtcatga aaaacccaaa
121 aaagaaatcc ggaggattcc ggattgtcaa tatgctaaaa cgcggagtag cccgtgtgag
181 cccctttggg ggcttgaaga ggctgccagc cggacttctg ctgggtcatg ggcccatcag
241 gatggtcttg gcgattctag cctttttgag attcacggca atcaagccat cactgggtct
301 catcaataga tggggttcag tggggaaaaa agaggctatg gaaacaataa agaagttcaa
361 gaaagatctg gctgccatgc tgagaataat caatgctagg aaggagaaga agagacgagg
421 cgcagatact agtgtcggaa ttgttggcct cctgctgacc acagctatgg cagcggaggt
481 cactagacgt gggagtgcat actatatgta cttggacaga aacgatgctg gggaggccat
541 atcttttcca accacattgg ggatgaataa gtgttatata cagatcatgg atcttggaca
601 catgtgtgat gccaccatga gctatgaatg ccctatgctg gatgaggggg tggaaccaga
661 tgacgtcgat tgttggtgca acacgacgtc aacttgggtt gtgtacggaa cctgccatca
721 caaaaaaggt gaagcacgga gatctagaag agctgtgacg ctcccctccc attccaccag
781 gaagctgcaa acgcggtcgc aaacctggtt ggaatcaaga gaatacacaa agcacttgat
841 tagagtcgaa aattggatat tcaggaaccc tggcttcgcg ttagcagcag ctgccatcgc
901 ttggcttttg ggaagctcaa cgagccaaaa agtcatatac ttggtcatga tactgctgat
961 tgccccggca tacagcatca ggtgcatagg agtcagcaat agggactttg tggaaggtat
1021 gtcaggtggg acttgggttg atgttgtctt ggaacatgga ggttgtgtca ccgtaatggc
1081 acaggacaaa ccgactgtcg acatagagct ggttacaaca acagtcagca acatggcgga
1141 ggtaagatcc tactgctatg aggcatcaat atcagacatg gcttctgaca gccgctgccc
1201 aacacaaggt gaagcctacc ttgacaagca atcagacact caatatgtct gcaaaagaac
1261 gttagtggac agaggctggg gaaatggatg tggacttttt ggcaaaggga gcctggtgac
1321 atgcgctaag tttgcatgct ccaagaaaat gaccgggaag agcatccagc cagagaatct
1381 ggagtaccgg ataatgctgt cagttcatgg ctcccagcac agtgggatga tcgttaatga
1441 cacaggacat gaaactgatg agaatagagc gaaagttgag ataacgccca attcaccgag
1501 agccgaagcc accctggggg gttttggaag cctaggactt gattgtgaac cgaggacagg
1561 ccttgacttt tcagatttgt attacttgac tatgaataac aagcactggt tggttcacaa
1621 ggagtggttc cacgacattc cattaccttg gcacgctggg gcagacaccg gaactccaca
1681 ctggaacaac aaagaagcac tggtagagtt caaggacgca catgccaaaa ggcaaactgt
1741 cgtggttcta gggagtcaag aaggagcagt tcacacggcc cttgctggag ctctggaggc
1801 tgagatggat ggtgcaaagg gaaggctgtc ctctggccac ttgaaatgtc gcctgaaaat
1861 ggataaactt agattgaagg gcgtgtcata ctccttgtgt actgcagcgt tcacattcac
1921 caagatcccg gctgaaacac tgcacgggac agtcacagtg gaggtacagt acgcagggac
1981 agatggacct tgcaaggttc cagctcagat ggcggtggac atgcaaactc tgaccccagt
2041 tgggaggttg ataaccgcta accccgtaat cactgaaagc actgagaact ctaagatgat
2101 gctggaactt gatccaccat ttggggactc ttacattgtc ataggagtcg gggagaagaa
2161 gatcacccac cactggcaca ggagtggcag caccattgga aaagcatttg aagccactgt
2221 gagaggtgcc aagagaatgg cagtcttggg agacacagcc tgggactttg gatcagttgg
2281 aggcgctctc aactcattgg gcaagggcat ccatcaaatt tttggagcag ctttcaaatc
2341 attgtttgga ggaatgtcct ggttctcaca aattctcatt ggaacgttgc tgatgtggtt
2401 gggtctgaac acaaagaatg gatctatttc ccttatgtgc ttggccttag ggggagtgtt
2461 gatcttctta tccacagccg tctctgctga tgtggggtgc tcggtggact tctcaaagaa
2521 ggagacgaga tgcggtacag gggtgttcgt ctataacgac gttgaagcct ggagggacag
2581 gtacaagtac catcctgact ccccccgtag attggcagca gcagtcaagc aagcctggga
2641 agatggtatc tgcgggatct cctctgtttc aagaatggaa aacatcatgt ggagatcagt
2701 agaaggggag ctcaacgcaa tcctggaaga gaatggagtt caactgacgg tcgttgtggg
2761 atctgtaaaa aaccccatgt ggagaggtcc acagagattg cccgtgcctg tgaacgagct
2821 gccccacggc tggaaggctt gggggaaatc gtatttcgtc agagcagcaa agacaaataa
2881 cagctttgtc gtggatggtg acacactgaa ggaatgccca ctcaaacata gagcatggaa
2941 cagctttctt gtggaggatc atgggttcgg ggtatttcac actagtgtct ggctcaaggt
3001 tagagaagat tattcattag agtgtgatcc agccgttatt ggaacagctg ttaagggaaa
3061 ggaggctgta cacagtgatc taggctactg gattgagagt gagaagaatg acacatggag
3121 gctgaagagg gcccatctga tcgagatgaa aacatgtgaa tggccaaagt cccacacatt
3181 gtggacagat ggaatagaag agagtgatct gatcataccc aagtctttag ctgggccact
3241 cagccatcac aataccagag agggctacag gacccaaatg aaagggccat ggcacagtga
3301 agagcttgaa attcggtttg aggaatgccc aggcactaag gtccacgtgg aggaaacatg
3361 tggaacaaga ggaccatctc tgagatcaac cactgcaagc ggaagggtga tcgaggaatg
3421 gtgctgcagg gagtgcacaa tgcccccact gtcgttccgg gctaaagatg gctgttggta
3481 tggaatggag ataaggccca ggaaagaacc agaaagcaac ttagtaaggt caatggtgac
3541 tgcaggatca actgatcaca tggaccactt ctcccttgga gtgcttgtga tcctgctcat
3601 ggtgcaggaa gggctgaaga agagaatgac cacaaagatc atcataagca catcaatggc
3661 agtgctggta gctatgatcc tgggaggatt ttcaatgagt gacctggcta agcttgcaat
3721 tttgatgggt gccaccttcg cggaaatgaa cactggagga gatgtagctc atctggcgct
3781 gatagcggca ttcaaagtca gaccagcgtt gctggtatct ttcatcttca gagctaattg
3841 gacaccccgt gaaagcatgc tgctggcctt ggcctcgtgt cttttgcaaa ctgcgatctc
3901 cgccttggaa ggcgacctga tggttctcat caatggtttt gctttggcct ggttggcaat
3961 acgagcgatg gttgttccac gcactgataa catcaccttg gcaatcctgg ctgctctgac
4021 accactggcc cggggcacac tgcttgtggc gtggagagca ggccttgcta cttgcggggg
4081 gtttatgctc ctctctctga agggaaaagg cagtgtgaag aagaacttac catttgtcat
4141 ggccctggga ctaaccgctg tgaggctggt cgaccccatc aacgtggtgg gactgctgtt
4201 gctcacaagg agtgggaagc ggagctggcc ccctagcgaa gtactcacag ctgttggcct
4261 gatatgcgca ttggctggag ggttcgccaa ggcagatata gagatggctg ggcccatggc
4321 cgcggtcggt ctgctaattg tcagttacgt ggtctcagga aagagtgtgg acatgtacat
4381 tgaaagagca ggtgacatca catgggaaaa agatgcggaa gtcactggaa acagtccccg
4441 gctcgatgtg gcgctagatg agagtggtga tttctccctg gtggaggatg acggtccccc
4501 catgagagag atcatactca aggtggtcct gatgaccatc tgtggcatga acccaatagc
4561 catacccttt gcagctggag cgtggtacgt atacgtgaag actggaaaaa ggagtggtgc
4621 tctatgggat gtgcctgctc ccaaggaagt aaaaaagggg gagaccacag atggagtgta
4681 cagagtaatg actcgtagac tgctaggttc aacacaagtt ggagtgggag ttatgcaaga
4741 gggggtcttt cacactatgt ggcacgtcac aaaaggatcc gcgctgagaa gcggtgaagg
4801 gagacttgat ccatactggg gagatgtcaa gcaggatctg gtgtcatact gtggtccatg
4861 gaagctagat gccgcctggg atgggcacag cgaggtgcag ctcttggccg tgccccccgg
4921 agagagagcg aggaacatcc agactctgcc cggaatattt aagacaaagg atggggacat
4981 tggagcggtt gcgctggatt acccagcagg aacttcagga tctccaatcc tagacaagtg
5041 tgggagagtg ataggacttt atggcaatgg ggtcgtgatc aaaaacggga gttatgttag
5101 tgccatcacc caagggagga gggaggaaga gactcctgtt gagtgcttcg agccctcgat
5161 gctgaagaag aagcagctaa ctgtcttaga cttgcatcct ggagctggga aaaccaggag
5221 agttcttcct gaaatagtcc gtgaagccat aaaaacaaga ctccgtactg tgatcttagc
5281 tccaaccagg gttgtcgctg ctgaaatgga ggaggccctt agagggcttc cagtgcgtta
5341 tatgacaaca gcagtcaatg tcacccactc tggaacagaa atcgtcgact taatgtgcca
5401 tgccaccttc acttcacgtc tactacagcc aatcagagtc cccaactata atctgtatat
5461 tatggatgag gcccacttca cagatccctc aagtatagca gcaagaggat acatttcaac
5521 aagggttgag atgggcgagg cggctgccat cttcatgacc gccacgccac caggaacccg
5581 tgacgcattt ccggactcca actcaccaat tatggacacc gaagtggaag tcccagagag
5641 agcctggagc tcaggctttg attgggtgac ggatcattct ggaaaaacag tttggtttgt
5701 tccaagcgtg aggaacggca atgagatcgc agcttgtctg acaaaggctg gaaaacgggt
5761 catacagctc agcagaaaga cttttgagac agagttccag aaaacaaaac atcaagagtg
5821 ggactttgtc gtgacaactg acatttcaga gatgggcgcc aactttaaag ctgaccgtgt
5881 catagattcc aggagatgcc taaagccggt catacttgat ggcgagagag tcattctggc
5941 tggacccatg cctgtcacac atgccagcgc tgcccagagg agggggcgca taggcaggaa
6001 tcccaacaaa cctggagatg agtatctgta tggaggtggg tgcgcagaga ctgacgaaga
6061 ccatgcacac tggcttgaag caagaatgct ccttgacaat atttacctcc aagatggcct
6121 catagcctcg ctctatcgac ctgaggccga caaagtagca gccattgagg gagagttcaa
6181 gcttaggacg gagcaaagga agacctttgt ggaactcatg aaaagaggag atcttcctgt
6241 ttggctggcc tatcaggttg catctgccgg aataacctac acagatagaa gatggtgctt
6301 tgatggcacg accaacaaca ccataatgga agacagtgtg ccggcagagg tgtggaccag
6361 acacggagag aaaagagtgc tcaaaccgag gtggatggac gccagagttt gttcagatca
6421 tgcggccctg aagtcattca aggagtttgc cgctgggaaa agaggagcgg cttttggagt
6481 gatggaagcc ctgggaacac tgccaggaca catgacagag agattccagg aagccattga
6541 caacctcgct gtgctcatgc gggcagagac tggaagcagg ccttacaaag ccgcggcggc
6601 ccaattgccg gagaccctag agaccataat gcttttgggg ttgctgggaa cagtctcgct
6661 gggaatcttc ttcgtcttga tgaggaacaa gggcataggg aagatgggct ttggaatggt
6721 gactcttggg gccagcgcat ggctcatgtg gctctcggaa attgagccag ccagaattgc
6781 atgtgtcctc attgttgtgt tcctattgct ggtggtgctc atacctgagc cagaaaagca
6841 aagatctccc caggacaacc aaatggcaat catcatcatg gtagcagtag gtcttctggg
6901 cttgattacc gccaatgaac tcggatggtt ggagagaaca aagagtgacc taagccatct
6961 aatgggaagg agagaggagg gggcaaccat aggattctca atggacattg acctgcggcc
7021 agcctcagct tgggccatct atgctgcctt gacaactttc attaccccag ccgtccaaca
7081 tgcagtgacc acctcataca acaactactc cttaatggcg atggccacgc aagctggagt
7141 gttgtttggc atgggcaaag ggatgccatt ctacgcatgg gactttggag tcccgctgct
7201 aatgataggt tgctactcac aattaacacc cctgacccta atagtggcca tcattttgct
7261 cgtggcgcac tacatgtact tgatcccagg gctgcaggca gcagctgcgc gtgctgccca
7321 gaagagaacg gcagctggca tcatgaagaa ccctgttgtg gatggaatag tggtgactga
7381 cattgacaca atgacaattg acccccaagt ggagaaaaag atgggacagg tgctactcat
7441 agcagtagcc gtctccagcg ccatactgtc gcggaccgcc tgggggtggg gggaggctgg
7501 ggctctgatc acagccgcaa cttccacttt gtgggaaggc tctccgaaca agtactggaa
7561 ctcctctaca gccacttcac tgtgtaacat ttttagggga agttacttgg ctggagcttc
7621 tctaatctac acagtaacaa gaaacgctgg cttggtcaag agacgtgggg gtggaacagg
7681 agagaccctg ggagagaaat ggaaggcccg cttgaaccag atgtcggccc tggagttcta
7741 ctcctacaaa aagtcaggca tcaccgaggt gtgcagagaa gaggcccgcc gcgccctcaa
7801 ggacggtgtg gcaacgggag gccatgctgt gtcccgagga agtgcaaagc tgagatggtt
7861 ggtggagcgg ggatacctgc agccctatgg aaaggtcatt gatcttggat gtggcagagg
7921 gggctggagt tactacgtcg ccaccatccg caaagttcaa gaagtgaaag gatacacaaa
7981 aggaggccct ggtcatgaag aacccgtgtt ggtgcaaagc tatgggtgga acatagtccg
8041 tcttaagagt ggggtggacg tctttcatat ggcggctgag ccgtgtgaca cgttgctgtg
8101 tgacataggt gagtcatcat ctagtcctga agtggaagaa gcacggacgc tcagagtcct
8161 ctccatggtg ggggattggc ttgaaaaaag accaggagcc ttttgtataa aagtgttgtg
8221 cccatacacc agcactatga tggaaaccct ggagcgactg cagcgtaggt atgggggagg
8281 actggtcaga gtgccactct cccgcaactc tacacatgag atgtactggg tctctggagc
8341 gaaaagcaac accataaaaa gtgtgtccac cacgagccag ctcctcttgg ggcgcatgga
8401 cgggcctagg aggccagtga aatatgagga ggatgtgaat ctcggctctg gcacgcgggc
8461 tgtggtaagc tgcgctgaag ctcccaacat gaagatcatt ggtaaccgca ttgaaaggat
8521 ccgcagtgag cacgcggaaa cgtggttctt tgacgagaac cacccatata ggacatgggc
8581 ttaccatgga agctatgagg cccccacaca agggtcagcg tcctctctaa taaacggggt
8641 tgtcaggctc ctgtcaaaac cctgggatgt ggtgactgga gtcacaggaa tagccatgac
8701 cgacaccaca ccgtatggtc agcaaagagt tttcaaggaa aaagtggaca ctagggtgcc
8761 agacccccaa gaaggcactc gtcaggttat gagcatggtc tcttcctggt tgtggaaaga
8821 gctaggcaaa cacaaacggc cacgagtctg caccaaagaa gagttcatca acaaggttcg
8881 tagcaatgca gcattagggg caatatttga agaggaaaaa gagtggaaga ctgcagtgga
8941 agctgtgaac gatccaaggt tctgggctct agtggacaag gaaagagagc accacctgag
9001 aggagagtgc cagagctgtg tgtacaacat gatgggaaaa agagaaaaga aacaagggga
9061 atttggaaag gccaagggca gccgcgccat ctggtatatg tggctagggg ctagatttct
9121 agagttcgaa gcccttggat tcttgaacga ggatcactgg atggggagag agaactcagg
9181 aggtggtgtt gaagggctgg gattacaaag actcggatat gtcctagaag agatgagtcg
9241 tataccagga ggaaggatgt atgcagatga cactgctggc tgggacaccc gcattagcag
9301 gtttgatctg gagaatgaag ctctaatcac caaccaaatg gagaaagggc acagggcctt
9361 ggcattggcc ataatcaagt acacatacca aaacaaagtg gtaaaggtcc ttagaccagc
9421 tgaaaaaggg aaaacagtta tggacattat ttcgagacaa gaccaaaggg ggagcggaca
9481 agttgtcact tacgctctta acacatttac caacctagtg gtgcaactca ttcggaatat
9541 ggaggctgag gaagttctag agatgcaaga cttgtggctg ctgcggaggt cagagaaagt
9601 gaccaactgg ttgcagagca acggatggga taggctcaaa cgaatggcag tcagtggaga
9661 tgattgcgtt gtgaagccaa ttgatgatag gtttgcacat gccctcaggt tcttgaatga
9721 tatgggaaaa gttaggaagg acacacaaga gtggaaaccc tcaactggat gggacaactg
9781 ggaagaagtt ccgttttgct cccaccactt caacaagctc catctcaagg acgggaggtc
9841 cattgtggtt ccctgccgcc accaagatga actgattggc cgggcccgcg tctctccagg
9901 ggcgggatgg agcatccggg agactgcttg cctagcaaaa tcatatgcgc aaatgtggca
9961 gctcctttat ttccacagaa gggacctccg actgatggcc aatgccattt gttcatctgt
10021 gccagttgac tgggttccaa ctgggagaac tacctggtca atccatggaa agggagaatg
10081 gatgaccact gaagacatgc ttgtggtgtg gaacagagtg tggattgagg agaacgacca
10141 catggaagac aagaccccag ttacgaaatg gacagacatt ccctatttgg gaaaaaggga
10201 agacttgtgg tgtggatctc tcatagggca cagaccgcgc accacctggg ctgagaacat
10261 taaaaacaca gtcaacatgg tgcgcaggat cataggtgat gaagaaaagt acatggacta
10321 cctatccacc caagttcgct acttgggtga agaagggtct acacctggag tgctgtaagc
10381 accaatctta atgttgtcag gcctgctagt cagccacagc ttggggaaag ctgtgcagcc
10441 tgtgaccccc ccaggagaag ctgggaaacc aagcctatag tcaggccgag aacgccatgg
10501 cacggaagaa gccatgctgc ctgtgagccc ctcagaggac actgagtcaa aaaaccccac
10561 gcgcttggag gcgcaggatg ggaaaagaag gtggcgacct tccccaccct tcaatctggg
10621 gcctgaactg gagatcagct gtggatctcc agaagaggga ctagtggtta gagga
일부 구체예들에서, 지카 바이러스는 GenBank 수탁 번호 KU501215.1의 게놈 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스는 계열 PRVABC59로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, GenBank 수탁 번호 KU501215.1의 유전체 서열은 서열 번호: 2의 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 지카 바이러스는 서열 번호: 2의 서열과 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 게놈 서열을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 지카 바이러스는 서열 번호: 2의 서열에 의해 인코딩된 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 지카 바이러스는 서열 번호: 2의 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
따라서, 일부 구체예들에서, 본 명세서의 지카 바이러스는 본원에서 개시된 임의의 백신 및/또는 면역원성 조성물에서 이용될 수 있다. 예를 들면, 본 명세서의 지카 바이러스는 치료가 필요한 인간 대상에서 지카 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는데 유용한 및/또는 치료가 필요한 인간 대상에서 지카 바이러스에 대한 면역 반응, 예컨대 보호 면역 반응을 유도하는데 유용한 한 가지 또는 그 이상의 항원을 제공하는데 이용될 수 있다.
바이러스 항원들
일부 구체예들에서, 본 명세서는 정제된 바이러스, 비활성화된 바이러스, 감쇠된 바이러스, 재조합 바이러스, 또는 하위단위 백신을 위한 정제된 및/또는 재조합 바이러스 단백질을 포함하나, 이에 국한되지 않는, 백신 및/또는 면역원성 조성물에 유용한 본원에서 기술하고 있는 임의의 지카 바이러스의 하나 또는 그 이상의 항원들에 관계한다. 일부 구체예들에서, 상기 백신 및/또는 면역원성 조성물은 비활성화된 온전체 바이러스를 함유한다.
본 명세서의 항원들은 면역 반응을 유도할 수 있는 임의의 물질일 수 있다. 적합한 항원들의 예로는 온전체 바이러스, 감쇠된 바이러스, 비활성화된 바이러스, 단백질, 폴리 펩타이드 (단백질안의 활성 단백질 및 개별 폴리펩티드 에피토프 포함), 당폴리펩티드, 리포폴리펩티드, 펩티드, 폴리사카라이드, 폴리사카라이드 접합체, 폴리사카라이드 및 다른 분자의 비-펩티드 모방체(mimics), 소분자, 지질, 당지질 및 탄수화물을 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
본 명세서의 항원들은 세포 배양에서 하나 또는 그 이상의 세포로부터 생산된 (가령, 플라크 정제를 통하여) 임의의 지카 바이러스 (가령, 지카 바이러스 클론 분리주)로부터 유래될 수 있다. 예를 들면, 곤충 세포 (예를 들면, 모기 세포, 예컨대 CCL-125 세포, Aag-2 세포, RML-12 세포, C6/36 세포, C7-10 세포, AP-61 세포, A.t. GRIP-1 세포, A.t. GRIP-2 세포, A.t. GRIP-3 세포, UM-AVE1 세포, Mos.55 세포, Sua1B 세포, 4a-3B 세포, Mos.42 세포, MSQ43 세포, LSB-AA695BB 세포, NIID-CTR 세포, TRA-171, 세포, 그리고 모기 종, 예컨대 아에데스 아에집티 (Aedes aegypti), 아에데스 알보픽투스 (Aedes albopictus), 아에데스 슈도스쿠텔라리스 (Aedes pseudoscutellaris), 아에데스 트리세리아투스 (Aedes triseriatus), 아에데스 벡산스 (Aedes vexans), 아노펠레스 감비아에 (Anopheles gambiae), 아노펠레스 스테펜시 (Anopheles stephensi), 아노펠레스 알비무스 (Anopheles albimus), 쿨렉스 퀸쿠에파시아투스 (Culex quinquefasciatus), 쿨렉스 테일레리 (Culex theileri), 쿨렉스 트리타에니오힌쿠스 (Culex tritaeniorhynchus), 쿨렉스 비타에니오린쿠스 (Culex bitaeniorhynchus) 및/또는 톡소린치테스 암보이넨시스 (Toxorhynchites amboinensis))로부터 추가 세포 또는 세포주, 그리고 포유류 세포 (예를 들면, VERO 세포 (원숭이 신장으로부터), LLC-MK2 세포 (원숭이 신장으로부터), MDBK 세포, MDCK 세포, ATCC CCL34 MDCK (NBL2) 세포, MDCK 33016 (WO97/37001에서 설명된 바와 같은 수탁 번호 DSM ACC 2219) 세포, BHK21-F 세포, HKCC 세포, 또는 중국 햄스터 난소 세포 (CHO 세포)를 비롯하여, 지카 바이러스를 생산하기 위한 당해 분야에서 공지된 임의의 적합한 세포가 이용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 항원들은 비-인간 세포로부터 생산된 (가령, 플라크 정제를 통하여) 지카 바이러스 (가령, 지카 바이러스 클론 분리주)로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 항원들은 곤충 세포로부터 생산된 (가령, 플라크 정제를 통하여) 지카 바이러스 (가령, 지카 바이러스 클론 분리주)로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 항원들은 모기 세포로부터 생산된 (가령, 플라크 정제를 통하여) 지카 바이러스 (가령, 지카 바이러스 클론 분리주)로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 항원들은 포유류 세포로부터 생산된 (가령, 플라크 정제를 통하여) 지카 바이러스 (가령, 지카 바이러스 클론 분리주)로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 항원들은 VERO 세포로부터 생산된 (가령, 플라크 정제를 통하여) 지카 바이러스 (가령, 지카 바이러스 클론 분리주)로부터 유래된다. 플라크 정제를 수행하여 바이러스를 정제하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다(가령, 하기 실시예 1 참고).
본 명세서의 항원들은 적어도 하나의 비-인간 세포 개작 돌연변이를 함유할 수 있다. 특정 세포주에서 성장되도록 바이러스를 개작함으로써, 개작 돌연변이들이 생성될 수 있다. 예를 들면, 세포는 바이러스, 바이러스 (가령, 감염성 바이러스, 또는 감염성 클론)으로부터 전사된 RNA, 및/또는 온전체 바이러스로부터 정제된 RNA로 형질감염 또는 전기천공될 수 있고, 그리고 상기 바이러스 및/또는 바이러스 RNA 레플리케이트(replicates) 및 이의 핵산이 돌연변이되도록 계대된다. 핵산 돌연변이는 점 돌연변이, 삽입 돌연변이, 또는 결손 돌연변이일 수 있다. 핵산 돌연변이는 바이러스 단백질 내에서 비-인간 세포에서 바이러스의 성장을 촉진시키는 아미노산 변화를 야기할 수 있다. 개작 돌연변이들은 플라크 크기의 변화, 성장 동역학, 온도 민감성, 약물 내성, 독성(virulence) 및 세포 배양에서의 바이러스 수율을 포함하여, 바이러스의 표현형 변화를 촉진할 수 있다. 이러한 개작성(adaptive) 돌연변이는 세포주에서 배양된 바이러스의 씨드, 수율 및 일관성을 증가시킴으로써 백신 제조에 유용할 수 있다. 개작성 돌연변이는 면역원성 에피토프의 구조를 변경함으로써 바이러스 항원의 면역원성을 변화(예를 들어, 향상 또는 감소)킬 수 있다. 또한, 개작성 돌연변이들은 또한 다수의 (가령, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 또는 그 이상의) 계대를 통하여, 상기 바이러스의 유전적 안정성을 증가시키거나, 및/또는 상기 바이러스에서 바람직하지 않은 돌연변이들을 감소 또는 그렇지 않으면 억제시킬 수 있다.
따라서, 특정 구체예들에서, 본 명세서의 항원들은 적어도 하나의 비-인간 세포 개작 돌연변이를 내포한다. 특정 구체예들에서, 상기 개작 돌연변이는 비-인간 세포에 대해 바이러스 항원의 돌연변이다. 일부 구체예들에서, 상기 비-인간 세포는 포유류 세포다. 이용될 수 있는 당분야에 공지된 임의의 적합한 포유류 세포는 VERO 세포(원숭이 신장의), LLC-MK2 세포 (원숭이 신장의), MDBK 세포, MDCK 세포, ATCC CCL34 MDCK (NBL2) 세포, MDCK 33016 (WO97/37001에서 설명된 바와 같은 수탁 번호 DSM ACC 2219) 세포, BHK21-F 세포, HKCC 세포, 또는 중국 햄스터 난소 세포 (CHO 세포)를 포함하지만, 이에 국한되지 않는다. 일부 구체예들에서, 상기 비-인간 세포는 원숭이 세포다. 일부 구체예들에서, 상기 원숭이 세포는 Vero 세포주에서 유래된다. 이용될 수 있는 당분야에 공지된 임의의 적합한 Vero 세포주는 WHO Vero 10-87, ATCC CCL-81, Vero 76 (ATCC 수탁 번호. CRL-1587), 또는 Vero C1008 (ATCC 수탁 번호. CRL-1586)을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 일부 구체예들에서, 상기 Vero 세포주는 WHO Vero 10-87이다.
지카 바이러스는 구조적 및 비구조적 폴리펩티드 둘 모두를 인코딩하는 양성 센스(positive sense), 단일-가닥 RNA 게놈을 소유한다. 상기 게놈은 또한, 바이러스 복제에서 일정한 역할을 수행하는 5'-말단 영역과 3'-말단 영역 둘 모두에서 비-코딩 서열을 내포한다. 이들 바이러스에 의해 인코딩된 구조적 폴리펩티드는 제한 없이, 캡시드 (C), 전구체 막 (prM) 및 외피 (E)를 포함한다. 이들 바이러스에 의해 인코딩된 비-구조적 (NS) 폴리펩티드는 제한 없이, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5를 포함한다.
특정 구체예들에서, 본 명세서의 항원들은 C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, 그리고 NS5를 포함하나, 이에 국한되지 않는, 하나 또는 그 이상의 (가령, 하나 또는 그 이상의, 2개 또는 그 이상의, 3개 또는 그 이상의, 4개 또는 그 이상의, 5개 또는 그 이상의, 6개 또는 그 이상의, 7개 또는 그 이상의, 8개 또는 그 이상의, 9개 또는 그 이상의, 또는 10개 모두) 바이러스 항원들/폴리펩티드 안에 적어도 하나의 (가령, 적어도 하나의, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 등) 비-인간 세포 개작 돌연변이들을 내포할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 항원들은 지카 바이러스 비-구조 단백질 1 (NS1) 안에 적어도 하나의 비-인간 세포 개작 돌연변이를 내포한다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 항원들은 적어도 하나의 (가령, 적어도 하나의, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 등) 비-인간 세포 개작 돌연변이들을 함유할 수 있는 온전체, 비활성화된 바이러스를 포함한다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 항원들은 지카 바이러스 비-구조 단백질 1 (NS1) 안에 적어도 온전체, 비활성화된 바이러스를 내포한다.
일부 구체예들에서, 상기 적어도 하나의 비-인간 세포 개작 돌연변이는 NS1 폴리펩티드 안에 있다. 예시적인 지카 바이러스 계열로부터 야생형, 비-세포 개작된 NS1 폴리펩티드의 아미노산 서열은 아래와 같이 제시된다: DVGCSVDFSKKETRCGTGVFVYNDVEAWRDRYKYHPDSPRRLAAAVKQAWEDGICGISSVSRMENIMWRSVEGELNAILEENGVQLTVVVGSVKNPMWRGPQRLPVPVNELPHGWKAWGKSYFVRAAKTNNSFVVDGDTLKECPLKHRAWNSFLVEDHGFGVFHTSVWLKVREDYSLECDPAVIGTAVKGKEAVHSDLGYWIESEKNDTWRLKRAHLIEMKTCEWPKSHTLWTDGIEESDLIIPKSLAGPLSHHNTREGYRTQMKGPWHSEELEIRFEECPGTKVHVEETCGTRGPSLRSTTASGRVIEEWCCRECTMPPLSFRAKDGCWYGMEIRPRKEPESNLVRSMVT (서열 번호: 1).
일부 구체예들에서, NS1 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 번호: 1의 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예들에서, NS1 폴리펩티드의 아미노산 서열은 GenBank 수탁 번호 KU501215.1 (서열 번호: 2)의 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열로부터 유래될 수 있다. 일부 구체예들에서, NS1 폴리펩티드의 아미노산 서열은 GenBank 수탁 번호 KU501215.1의 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열의 아미노산 위치 795 내지 1145일 수 있다. 일부 구체예들에서, NS1 폴리펩티드의 아미노산 서열은 지카 바이러스 계열 PRVABC59로부터 유래될 수 있다.
“서열 동일성”, “% 서열 동일성”, “% 동일성”, “% 동일한” 또는 “서열 정렬”은 제 2 아미노산 서열에 제 1 아미노산 서열의 비교, 또는 제 2 핵산 서열에 제 1 핵산 서열의 비교를 의미하고, 그리고 상기 비교에 근거된 백분율로서 계산된다. 이러한 계산의 결과는 “퍼센트 동일한” 또는 “퍼센트 ID”로서 설명될 수 있다.
일반적으로, 서열 정렬은 2가지 상이한 접근법 중에서 한 가지에 의해 서열 동일성을 계산하는데 이용될 수 있다. 제 1 접근법에서, 단일 위치에서 부정합(mismatches) 및 단일 위치에서 갭 둘 모두 최종 서열 동일성 계산에서 비-동일한 위치로서 계수된다. 제 2 접근법에서, 단일 위치에서 부정합은 최종 서열 동일성 계산에서 비-동일한 위치로서 계수된다; 하지만, 단일 위치에서 갭은 최종 서열 동일성 계산에서 비-동일한 위치로서 계수되지 않는다 (무시된다). 다시 말하면, 제 2 접근법에서 갭은 최종 서열 동일성 계산에서 무시된다. 이들 2가지 접근법 사이에 차이점, 다시 말하면, 단일 위치에서 갭을 비-동일한 위치로서 계수하는 것 대 갭을 무시하는 것은 두 서열 사이에 서열 동일성 값에서 가변성을 야기할 수 있다.
서열 동일성은 프로그램에 의해 결정되는데, 이는 정렬하고, 단일 위치에서 부정합 및 단일 위치에서 갭(gaps) 둘 모두 최종 서열 동일성 계산에서 비-동일한 위치로서 계수된다. 예를 들면, 프로그램 Needle (EMBOS)은 Needleman 및 Wunsch의 알고리즘 (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)을 실행하였고, 그리고 먼저, 제 1 서열 및 제 2 서열 사이에 정렬을 만들고, 이후 정렬의 길이에 걸쳐 동일한 위치의 숫자를 계수하고, 이후 동일한 잔기의 숫자를 정렬의 길이로 나누고, 이후 이러한 숫자에 100을 곱하여% 서열 동일성 [% 서열 동일성 = (동일한 잔기의 #/정렬의 길이) x 100)]을 산출함으로써 디폴트 세팅마다 서열 동일성을 계산한다.
서열 동일성은 전장에 걸쳐 양쪽 서열을 보여주고, 따라서 제 1 서열 및 제 2 서열을 그들의 전장에서 보여주는 쌍별(pairwise) 정렬로부터 계산될 수 있다 (“전역 서열 동일성(Global sequence identity)”). 예를 들면, 프로그램 Needle (EMBOSS)이 이런 정렬을 만든다;% 서열 동일성 = (동일한 잔기의 # /정렬의 길이) x 100)].
서열 동일성은 단지 제 1 서열 또는 제 2 서열의 국부 영역만을 보여주는 쌍별 정렬로부터 계산될 수 있다 (“국부 동일성(Local Identity)”). 예를 들면, 프로그램 Blast (NCBI)가 이런 정렬을 만든다;% 서열 동일성 = (동일한 잔기의 # /정렬의 길이) x 100)].
서열 정렬은 바람직하게는, Needleman 및 Wunsch의 알고리즘 (J. Mol. Biol. (1979) 48, p. 443-453)을 이용함으로써 만든다. 바람직하게는, 프로그램 “NEEDLE”(The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS))은 프로그램 디폴트 파라미터 (갭 개방=10.0, 갭 연장=0.5, 그리고 단백질의 경우에 매트릭스=EBLOSUM62 및 뉴클레오티드의 경우에 매트릭스=EDNAFULL)에서 이용된다. 그 다음, 전장에 걸쳐 양쪽 서열을 보여주고, 따라서 제 1 서열 및 제 2 서열을 그들의 전장에서 보여주는 정렬로부터 서열 동일성이 계산될 수 있다 (“전역 서열 동일성”). 예를 들면:% 서열 동일성 = (동일한 잔기의 # /정렬의 길이) x 100)].
일부 구체예들에서, 상기 적어도 하나의 비-인간 세포 개작 돌연변이는 NS1 폴리펩티드 안에 하나 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 일어난다. 일부 구체예들에서, 돌연변이는 쌍별 정렬 알고리즘(pairwise alignment algorithm)을 이용하여, 서열 번호: 1에 맞춰 정렬될 때, 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 발생한다. 일부 구체예에서, 위치 98에서 돌연변이는 트립토판에서 글리신으로의 치환이다.
일부 구체예들에서, 지카 바이러스는 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함한다. 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치는 쌍별 정렬 알고리즘을 이용하여, NS-1 단백질의 아미노산 서열을 서열 번호: 1에 맞춰 정렬함으로써 결정될 수 있다. 서열 번호: 1의 위치 98에서 트립토판 잔기에 상응하는, 지카 바이러스 이외의 바이러스에서 아미노산 잔기가 본 출원의 도 7에서 도시되는데, 여기서 이들 잔기는 상자로 표시된다. 일부 구체예에서, 위치 98에서 돌연변이는 트립토판에서 글리신으로의 치환이다. 일부 구체예에서, 위치 98에서 돌연변이는 서열 번호: 1의 위치 98에서 트립토판에서 글리신으로의 치환이다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 항원들은 NS1 단백질 안에 적어도 하나의 비-인간 세포 개작 돌연변이를 내포하고, 그리고 C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, 그리고 NS5 바이러스 단백질중 하나 또는 그 이상에서 적어도 하나의 돌연변이 (가령, 적어도 하나의 개작 돌연변이)를 내포한다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 항원들은 NS1 단백질 안에 하나 또는 그 이상의 비-인간 세포 개작 돌연변이를 내포하고, 그리고 C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, 그리고 NS5 바이러스 단백질중 하나 또는 그 이상에서 적어도 하나의 돌연변이 (가령, 적어도 하나의 비-인간 세포 개작 돌연변이)를 내포하지 않는다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 항원들 NS1 단백질 안에 적어도 하나의 비-인간 세포 개작 돌연변이를 내포하고, 그리고 외피 단백질 E 안에 적어도 하나의 돌연변이 (가령, 적어도 하나의 비-인간 세포 개작 돌연변이)를 내포하지 않는다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 항원들은 지카 바이러스 비-구조 단백질 1 (NS1) 안에 적어도 하나의 비-인간 세포 개작 돌연변이를 함유하고, 그리고 지카 바이러스 외피 단백질 E (Env) 안에 돌연변이를 함유하지 않는 온전체, 비활성화된 바이러스를 포함한다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 항원들은 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 돌연변이를 내포하고, 그리고 외피 단백질 E 안에 임의의 돌연변이를 내포하지 않는다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 항원들은 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 돌연변이를 내포하고, 그리고 지카 바이러스 외피 단백질 E (Env)에서 돌연변이를 내포하지 않는 온전체, 비활성화된 바이러스를 포함한다. 일부 구체예들에서, 온전체, 비활성화된 바이러스는 지카 바이러스 비-구조 단백질 1 (NS1)에서 적어도 하나의 돌연변이를 내포하고, 그리고 외피 단백질을 인코딩하는 서열은 서열 번호: 2에서 상응하는 서열과 동일하다. 일부 구체예들에서, 지카 바이러스는 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 돌연변이를 내포하고, 그리고 외피 단백질을 인코딩하는 서열은 서열 번호: 2에서 상응하는 서열과 동일하다. 일부 구체예들에서, 온전체, 비활성화된 지카 바이러스는 서열 번호: 1의 위치 98, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 돌연변이를 함유하고, 외피 단백질을 인코딩하는 서열은 서열 번호: 2에서 대응하는 서열과 동일하다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 항원들, 이를 테면 지카 바이러스는 상기 적어도 하나의 개작 돌연변이가 결여된 지카 바이러스와 비교하였을 때, 유전적 안정성을 강화시키는 적어도 하나의 비-인간 세포 개작 돌연변이를 내포한다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 항원들, 이를 테면 지카 바이러스는 상기 적어도 하나의 개작 돌연변이가 결여된 지카 바이러스와 비교하였을 때, 바이러스 복제를 강화시키는 적어도 하나의 비-인간 세포 개작 돌연변이를 내포한다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 항원들, 이를 테면 지카 바이러스는 지카 바이러스의 외피 단백질 E (Env) 내에서 바람직하지 않은 돌연변이의 발생을 감소시키거나 또는 만약 그렇지 않으면, 저해시키는 적어도 하나의 비-인간 개작 돌연변이를 내포한다.
본 발명의 상기 구체예들에서, 예시적인 쌍별 정렬 알고리즘은 디폴트 파라미터 (예를 들면, EBLOSUM62 채점 매트릭스를 이용하여, 갭 개방 페널티=10.0 및 갭 연장 페널티=0.5에서)를 이용한 Needleman-Wunsch 전역 정렬 알고리즘이다. 이 알고리즘은 EMBOSS 패키지 내에 니들(needle) 도구에서 편의적으로 실행된다.
일부 구체예들에서, 지카 바이러스로부터 유래된 본 명세서의 항원은 본 명세서의 상기 백신 및 면역원성 조성물중 임의의 것에 이용될 수 있다. 예를 들면, 상기 본 명세서의 항원들은 치료가 필요한 인간 대상에서 지카 바이러스 감염을 치료하거나 예방하고 및/또는 치료가 필요한 인간 대상에게서 지카 바이러스에 대한 면역 반응, 예컨대 보호 면역 반응을 유도하는데 유용할 수 있다.
백신 및 면역원성 조성물의 생산
본 명세서의 다른 측면들은 적어도 하나의 지카 바이러스의 본 명세서의 하나 또는 그 이상의 항원들을 함유하는 지카 바이러스 백신 및 면역원성 조성물에 관계한다. 이런 백신 및 면역원성 조성물은 예를 들면, 치료가 필요한 인간 대상에서 지카 바이러스 감염을 치료하거나 예방하고 및/또는 치료가 필요한 인간 대상에서 지카 바이러스에 대한 면역 반응, 예컨대, 보호 면역 반응을 유도하는데 유용할 수 있다. 본 명세서의 백신 및/또는 면역원성 조성물은 정제된 바이러스, 비활성화된 바이러스, 감쇠된 바이러스, 재조합 바이러스, 하위단위 백신을 위한 정제된 및/또는 재조합 바이러스 단백질를 함유할 수 있지만, 이에 국한되지 않는다. 본 명세서의 백신 및/또는 면역원성 조성물은 정제된 항원 백신 또는 면역원성 조성물, 하위단위 백신 또는 면역원성 조성물, 비활성화된 온전체 바이러스 백신 또는 면역원성 조성물, 또는 정제된 비활성화된 온전체 바이러스 백신 또는 면역원성 조성물 또는 감쇠된 바이러스 백신 또는 면역원성 조성물을 더 함유할 수 있다.
본 명세서의 백신 및/또는 면역원성 조성물의 생산은 지카 바이러스의 성장을 포함하며, 항원들은 상기 정상된 바이러스로부터 준비된다. 세포 배양 동안 성장은 본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물을 제조하기 위한 방법이다. 바이러스 성장을 위한 세포는 현탁 상태에서 또는 유착성 조건에서 배양될 수 있다.
본 발명의 적어도 하나의 바이러스의 성장에 적합한 세포주는 바람직하게는 포유류 기원이고, 그리고 곤충 세포 (예를 들면, 본원에서 설명된 바와 같은 모기 세포, VERO 세포 (원숭이 신장으로부터), 말, 소 (예를 들면, MDBK 세포), 양, 개 (예를 들면, 개 신장으로부터 MDCK 세포, ATCC CCL34 MDCK (NBL2) 또는 MDCK 33016, WO97/37001에서 설명된 바와 같은 수탁 번호 DSM ACC 2219), 고양이 및 설치류 (예를 들면, 햄스터 세포, 예컨대 BHK21-F, HKCC 세포, 또는 중국 햄스터 난소 세포 (CHO 세포))를 포함하지만 이들에 한정되지 않고, 그리고 예를 들면, 성체, 신생아, 태아 및 배아를 비롯한, 매우 다양한 발달 시기로부터 획득될 수 있다. 특정 구체예들에서, 세포는 영속화된다 (예를 들면, WO 01/38362 및 WO 02/40665에서 설명되고, 그리고 ECACC 수탁 번호 96022940 하에 기탁된 바와 같은 PERC.6 세포). 바람직한 구체예들에서, 포유류 세포가 활용되고, 그리고 하기의 무제한적 세포 유형 중에서 한 가지 또는 그 이상에서 선택되고 및/또는 이들로부터 유래될 수 있다: 섬유모세포 세포 (예를 들면, 진피, 폐), 내피 세포 (예를 들면, 대동맥, 관상, 폐, 혈관, 진피 미세혈관, 배꼽), 간세포, 각질세포, 면역 세포 (예를 들면, T 세포, B 세포, 대식세포, NK, 수지상), 유방 세포 (예를 들면, 상피), 평활근 세포 (예를 들면, 혈관, 대동맥, 관상, 동맥, 자궁, 기관지, 경부, 망막 혈관주위세포), 멜라닌세포, 신경 세포 (예를 들면, 별아교세포), 전립선 세포 (예를 들면, 상피, 평활근), 신장 세포 (예를 들면, 상피, 사구체간질, 근위 세뇨관), 골격 세포 (예를 들면, 연골세포, 파골세포, 조골세포), 근육 세포 (예를 들면, 근모세포, 골격, 평활근, 기관지), 간 세포, 망막모세포, 그리고 간질 세포. WO97/37000 및 WO97/37001은 현탁 상태에서 및 혈청 없는 배지에서 성장할 수 있고, 그리고 바이러스의 생산과 복제에서 유용한 동물 세포와 세포주의 생산을 설명한다.
상기 세포 유형에 대한 배양 조건은 공지되어 있고, 그리고 다양한 간행물에서 설명된다. 대안으로 배양 배지, 보충물, 그리고 조건들은 예를 들면, Cambrex Bioproducts (East Rutherford, N.J.)의 카탈로그 및 추가 문헌에서 설명된 바와 같이, 상업적으로 구입될 수 있다.
특정 구체예들에서, 본원에서 설명된 방법에서 이용되는 세포는 혈청 없는 및/또는 단백질 없는 배지에서 배양된다. 배지는 만약 이것이 인간 또는 동물 기원의 혈청으로부터 어떤 첨가제도 내포하지 않으면, 본 발명의 맥락에서 무-혈청 배지로서 지칭된다. 단백질-없는(protein-free)이란 세포의 증식이 단백질, 성장 인자, 다른 단백질 첨가제 및 비-혈청 단백질을 배제하고 발생하지만, 바이러스 성장에 필요할 수 있는 단백질, 예컨대 트립신 또는 다른 프로테아제를 임의적으로 포함할 수 있는 배양액을 의미하는 것으로 이해된다. 이런 배양물에서 성장하는 세포는 그들 자체가 자연적으로 단백질을 내포한다.
공지된 혈청-없는 배지는 Iscove의 배지, Ultra-CHO 배지 (BioWhittaker) 또는 EX-CELL (JRH Bioscience)를 포함한다. 보편적인 혈청-내포 배지는 Eagle의 기초 배지 (BME) 또는 최소 필수 배지 (MEM) (Eagle, Science, 130, 432 (1959)) 또는 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지 (DMEM 또는 EDM)을 포함하는데, 이들은 통상적으로, 10%까지의 소 태아 혈청 또는 유사한 첨가제와 함께 이용된다. 임의선택적으로, 최소 필수 배지 (MEM) (Eagle, Science, 130, 432 (1959)) 또는 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지 (DMEM 또는 EDM)는 임의의 혈청 내포 보충물 없이, 이용될 수 있다. 단백질-없는 배지, 예컨대 PF-CHO (JHR Bioscience), 화학적으로-규정된 배지, 예컨대 ProCHO 4CDM (BioWhittaker) 또는 SMIF 7 (Gibco/BRL Life Technologies) 및 유사분열성 펩티드, 예컨대 프리막톤, 펩티카아제 또는 HyPep.TM. (이들 모두 Quest International로부터) 또는 락트알부민 가수분해물 (Gibco 및 다른 제조업체) 또한 선행 기술에서 적절하게 공지된다. 식물 가수분해물에 기초된 배지 첨가제는 바이러스, 미코플라스마 또는 알려지지 않은 감염체로 오염이 배제될 수 있다는 특수한 이점을 갖는다.
세포 배양 조건 (온도, 세포 밀도, pH 값 등)은 본 발명에 따라서 이용된 세포주의 적합성으로 인해 매우 넓은 범위에 걸쳐 가변적이고, 그리고 특정 바이러스 계열의 요건에 적합될 수 있다.
배양된 세포에서 바이러스를 증식하기 위한 방법은 일반적으로, 배양된 세포를 배양되는 바이러스 계열로 접종하는 단계, 감염된 세포를 예컨대, 예를 들면, 바이러스 역가 또는 항원 발현에 의해 결정될 때 바이러스 증식을 위한 원하는 기간 (예를 들면, 접종 후 24 내지 168 시간 사이에) 동안 배양하는 단계, 그리고 증식된 바이러스를 수집하는 단계를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 바이러스는 플라크 정제를 통해 수집된다. 배양된 세포는 1:500 내지 1:1, 바람직하게는 1:100 내지 1:5의 바이러스 (PFU 또는 TCID50에 의해 계측됨) 대 세포 비율로 접종된다. 상기 바이러스는 세포의 현탁액에 첨가되거나, 또는 세포의 단층에 적용되고, 그리고 바이러스는 25℃ 내지 40℃, 바람직하게는 28℃ 내지 38℃에서 적어도 10 분, 적어도 20 분, 적어도 30 분, 적어도 40 분, 적어도 50 분, 적어도 60 분, 하지만 통상적으로 300 분 미만 동안 세포 상에서 흡수된다. 감염된 세포 배양액 (예를 들면, 단층)은 수확된 배양 상청액의 바이러스 함량을 증가시키기 위한, 동결-해동 또는 효소적 작용에 의해 제거될 수 있다. 수확된 유체는 비활성화되거나 또는 냉동보관된다. 배양된 세포는 약 0.0001 내지 10, 바람직하게는 0.002 내지 5, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 2의 감염 다중도 ("MOI")에서 감염될 수 있다. 여전히 더욱 바람직하게는, 이들 세포는 약 0.01의 MOI에서 감염된다. 감염된 세포는 감염-후 30 내지 60 시간, 또는 감염-후 3 내지 10 일부터 수확될 수 있다. 특정 바람직한 구체예들에서, 상기 세포들은 감염-후 3 내지 7 일에 수확된다. 더욱 바람직하게는, 상기 세포들은 감염 후 3 내지 5 일에 수확된다. 일부 구체예들에서, 바이러스 방출을 허용하기 위해 프로테아제 (예를 들면, 트립신)가 세포 배양 동안 첨가될 수 있고, 그리고 이들 프로테아제는 배양 동안 임의의 적합한 시기에서 첨가될 수 있다. 대안으로, 특정 구체예들에서, 감염된 세포 배양액의 상청액이 수확될 수 있고, 그리고 바이러스가 상기 상청액으로부터 단리되거나 또는 만약 그렇지 않으면 정제될 수 있다.
바이러스 접종물 및 바이러스 배양액은 바람직하게는, 단순 헤르페스 바이러스(herpes simplex virus), 호흡기 합포체 바이러스(respiratory syncytial virus), 파라인플루엔자 바이러스 3(parainfluenza virus 3), SARS 코로나바이러스(coronavirus), 아데노바이러스(adenovirus), 리노바이러스(rhinovirus), 레오바이러스(reoviruses), 폴리오마바이러스(polyomaviruses), 버나바이러스(birnaviruses), 써코바이러스(circoviruses) 및/또는 파보바이러스(parvoviruses)가 없다 (다시 말하면, 이들에 의한 오염에 대해 검사되고 음성 결과가 제공될 것이다)[WO2006/027698].
바이러스가 세포주 상에서 성장된 경우에, 숙주 세포 DNA의 임의의 종양원성 활성을 최소화하기 위해, 최종 백신에서 잔여 세포주 DNA의 양을 최소화하는 것이 표준 관례이다. 오염 DNA는 표준 정제 절차, 예를 들면, 크로마토그래피 등을 이용하여 백신 제조 동안 제거될 수 있다. 잔류 숙주 세포 DNA의 제거는 뉴클레아제 처리에 의해, 예를 들면, DNase를 이용함으로써 강화될 수 있다. 참고문헌 (Lundblad (2001) Biotechnology and Applied Biochemistry 34:195-197, Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER) Center for Veterinary Medicine (CVM). May 2001.)에서 개시된 숙주 세포 DNA 오염을 감소시키기 위한 편리한 방법은 먼저, 바이러스 성장 동안 이용될 수 있는 DNase (예를 들면, 벤조나아제), 그리고 그 다음, 비리온 붕괴 동안 이용될 수 있는 양이온성 세정제 (예를 들면, CTAB)를 이용하는 2-단계 처리를 수반한다. β-프로피올락톤 처리에 의한 제거 또한 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 오염 DNA는 배양 상청액의 벤조나아제 처리에 의해 제거된다.
항원의 생산
지카 바이러스 감염을 치료 및/또는 예방하기 위하여, 및/또는 면역 반응, 이를 테면 지카 바이러스에 대항하여 보호성 면역 반응을 유도하기 위하여, 정제된 바이러스, 비활성화된 바이러스, 비활성화된 온전체 바이러스, 감쇠된 바이러스, 재조합 바이러스, 또는 하위단위 백신을 위한 정제된 및/또는 재조합 바이러스 단백질(이에 국한되지 않음)을 내포하는 백신 및/또는 면역원성 조성물에 사용되는 본 명세서의 항원들은 당분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 생산되고 및/또는 정제되거나, 또는 그렇지 않으면 단리될 수 있다. 본 명세서의 항원들은 지카 바이러스로부터 만들어지고, 유도되고, 정제되고, 및/또는 그렇지 않으면 단리된 온전체 바이러스, 감쇠된 바이러스, 비활성화된 바이러스, 비활성화된 온전체 바이러스, 단백질, 폴리 펩타이드 (단백질안의 활성 단백질 및 개별 폴리펩티드 에피토프 포함), 당폴리펩티드, 리포폴리펩티드, 펩티드, 폴리사카라이드, 폴리사카라이드 접합체, 폴리사카라이드 및 다른 분자의 비-펩티드 모방체, 소분자, 지질, 당지질 및 탄수화물을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 예를 들면, 적합한 항원들은 지카 바이러스로부터 구조 폴리펩티드 이를 테면 C, prM, 및/또는 E, 그리고 비-구조 폴리펩티드, 이를 테면 NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, 및/또는 NS5(이들에 국한되지 않음)을 내포할 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 항원은 정제된 비활성화된 온전체 지카 바이러스이다.
본 명세서의 항원은 화학적으로 또는 효소적으로 합성되거나, 재조합적으로 생성되거나, 천연 공급원으로부터 단리되거나, 또는 이들의 조합일 수 있다. 특정 구체예들에서, 본 명세서의 항원들은 본 명세서의 적어도 하나의 지카 바이러스로부터 생산, 정제, 단리 및/또는 유래된다. 본 명세서의 항원들은 정제되거나, 부분적으로 정제되거나, 또는 정제안된(crude) 추출물일 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 항원들은 바이러스, 이를 테면 “백신 및 면역원성 조성물의 생산”이라는 제목의 상기 섹션에서 설명된 바와 같이 생산된, 비활성화된 바이러스다.
특정 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 본 명세서의 항원들은 비-인간 세포를 배양함으로써 생산될 수 있다. 본 발명의 상기 하나 또는 그 이상의 항원 생산에 적합한 세포주는 곤충 세포 (예를 들면, 본원에서 설명된 임의의 모기 세포)를 포함할 수 있다. 본 명세서의 상기 하나 또는 그 이상의 항원 생산에 적합한 세포주는 또한 포유류 기원의 세포일 수 있으며, 다음을 포함하나, 이에 국한되지 않는다: VERO 세포 (원숭이 신장으로부터), 말, 소 (예를 들면, MDBK 세포), 양, 개 (예를 들면, 개 신장으로부터 MDCK 세포, ATCC CCL34 MDCK (NBL2) 또는 MDCK 33016, WO97/37001에서 설명된 바와 같은 수탁 번호 DSM ACC 2219), 고양이 및 설치류 (예를 들면, 햄스터 세포, 예컨대 BHK21-F, HKCC 세포, 또는 중국 햄스터 난소 세포 (CHO 세포)), 그리고 예를 들면, 성체, 신생아, 태아 및 배아를 비롯한, 매우 다양한 발달 시기로부터 획득될 수 있다. 특정 구체예들에서, 세포는 영속화된다 (예를 들면, WO01/38362 및 WO02/40665에서 설명되고, 그리고 ECACC 수탁 번호 96022940 하에 기탁된 바와 같은 PERC.6 세포). 바람직한 구체예들에서, 포유류 세포가 활용되고, 그리고 하기의 무제한적 세포 유형 중에서 한 가지 또는 그 이상에서 선택되고 및/또는 이들로부터 유래될 수 있다: 섬유모세포 세포 (예를 들면, 진피, 폐), 내피 세포 (예를 들면, 대동맥, 관상, 폐, 혈관, 진피 미세혈관, 배꼽), 간세포, 각질세포, 면역 세포 (예를 들면, T 세포, B 세포, 대식세포, NK, 수지상), 유방 세포 (예를 들면, 상피), 평활근 세포 (예를 들면, 혈관, 대동맥, 관상, 동맥, 자궁, 기관지, 경부, 망막 혈관주위세포), 멜라닌세포, 신경 세포 (예를 들면, 별아교세포), 전립선 세포 (예를 들면, 상피, 평활근), 신장 세포 (예를 들면, 상피, 사구체간질, 근위 세뇨관), 골격 세포 (예를 들면, 연골세포, 파골세포, 조골세포), 근육 세포 (예를 들면, 근모세포, 골격, 평활근, 기관지), 간 세포, 망막모세포, 그리고 간질 세포. WO97/37000 및 WO97/37001은 현탁 상태에서 및 혈청 없는 배지에서 성장할 수 있고, 그리고 바이러스 항원 생산과 복제에서 유용한 동물 세포와 세포주의 생산을 설명한다. 특정 구체예들에서, 비-인간 세포는 혈청-없는 배지에서 배양된다.
폴리펩티드 항원은 당업계에 공지된 단백질 정제의 표준 방법, 가령, 액체 크로마토 그래피 (예를 들어, 고성능 액체 크로마토 그래피, 고속 단백질 액체 크로마토그래피 등), 크기 배제 크로마토그래피, 겔 전기영동 (1-차원 겔 전기영동, 2-차원 겔 전기영동 포함), 친화력 크로마토그래피, 또는 다른 정제 기술을 포함하지만 이에 국한되지 않는 방법을 사용하여 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 많은 구체예들에서, 상기 항원은 가령, 약 50% 내지 약 75% 순도, 약 75% 내지 약 85% 순도, 약 85% 내지 약 90% 순도, 약 90% 내지 약 95% 순도, 약 95% 내지 약 98% 순도, 약 98% 내지 약 99% 순도, 또는 99% 이상의 순도를 갖는 정제된 항원이다. 정제된 항원의 순도는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정될 수 있고, 순도-%는 곡선 아래의 총 면적에 대한 주요 피크의%에 상응한다. 크기 배제 크로마토그래피에서 정제된 항원의 주요 피크는 이러한 크기 배제 크로마토그래피에서 곡선 아래 총면적의 85% 이상, 또는 이러한 크기 배제 크로마토그래피에서 곡선 아래 총면적의 90% 이상, 또는 이러한 크기 배제 크로마토그래피에서 곡선 아래 총면적의 95% 이상, 또는 98% 이상, 또는 99% 이상일 수 있다. 이러한 결과는 본 발명의 의미 안에서 “정제된” 항원으로 간주된다.
순도에 있어서 상기 명세서에 따르면, 용어 "정제된 지카 바이러스"란 크기 배제 크로마토그래피에서 정제된 지카 바이러스의 주요 피크가 이러한 크기 배제 크로마토그래피에서 곡선 아래 총면적의 85% 이상, 또는 이러한 크기 배제 크로마토그래피에서 곡선 아래 총면적의 90% 이상, 또는 이러한 크기 배제 크로마토그래피에서 곡선 아래 총면적의 95% 이상, 또는 98% 이상 또는 99% 이상임을 의미한다.
순도에 있어서 상기 명세서에 따르면, 용어 "정제된 비활성화된 온전체 지카 바이러스"란 크기 배제 크로마토그래피에서 정제된 비활성화된 온전체 지카 바이러스의 주요 피크가 이러한 크기 배제 크로마토그래피에서 곡선 아래 총면적의 85% 이상, 또는 이러한 크기 배제 크로마토그래피에서 곡선 아래 총면적의 90% 이상, 또는 이러한 크기 배제 크로마토그래피에서 곡선 아래 총면적의 95% 이상, 또는 98% 이상, 또는 99% 이상임을 의미한다.
이러한 기술은 당업자에게 공지된 고체 상 펩티드 합성 기술을 사용할 수 있다. Jones, The Chemical Synthesis of Peptides (Clarendon Press, Oxford) (1994) 참고. 일반적으로, 이러한 방법에서, 펩티드는 활성화된 단량체 단위를 고체 상 결합된 성장하는 펩티드 사슬에 순차적으로 첨가하여 생성된다.
폴리펩티드의 생산을 위해 잘-확립된 재조합 DNA 기술이 사용될 수 있으며, 이때, 예를 들어 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 구조체는 적절한 숙주 세포 (예를 들어, 시험관내에서 단세포 엔터티(entity)로서 성장한 진핵 생물 숙주 세포, 가령, 예를 들어 효모 세포, 곤충 세포, 포유 동물 세포 등) 또는 원핵 세포 (예를 들어, 시험관내 세포 배양에서 성장)로 도입되고, 유전자 변형된 숙주 세포가 생성되고; 적절한 배양 조건 하에서, 단백질은 유전자 변형된 숙주 세포에 의해 생성된다.
사멸된 및 감쇠된 바이러스 면역원성 조성물 이외에, 동물에 지카 바이러스의 항원 성분을 나타내는 하위단위 면역원성 조성물 또는 다른 유형의 면역원성 조성물을 사용할 수 있다. 상기 항원성 성분은 단백질, 당단백질, 지질-접합된 단백질 또는 당단백질, 변형된 지질 모이어티, 또는 인간에 주사될 때 인간이 지카 바이러스에 대항하여 보호성 면역을 발달할 수 있도록 인간에서 면역 반응을 자극하는 다른 바이러스성 성분일 수 있다. 하위단위 면역원성 조성물의 경우, 상기 바이러스는 상기에서 기술된 바와 같이, 포유류 세포 상에서 배양될 수 있다. 세포 배양물은 균질화될 수 있고, 면역원성 조성물은 세포 배양 균질액을 적절한 칼럼에 걸쳐, 또는 적절한 기공 크기 필터를 통해 통과시키거나, 또는 원심 분리를 통해 세포 배양 균질액을 통과시킴으로써 단리될 수 있다.
항원 성분이 단백질인 경우, 그 다음 이 단백질을 인코딩하는 핵산을 분리하고, 그 단리된 핵산을 함유하는 면역원성 조성물을 생성할 수 있다. 항원 성분을 코딩하는 핵산은 진핵 생물 프로모터의 신호 서열의 하류의 플라스미드 상에 위치될 수 있다. 상기 플라스미드는 하나 또는 그 이상의 선별가능한 표지자들을 함유할 수 있고, 살모넬라 종(Salmonella spp.), 시겔라 종(Shigella spp.), 또는 다른 적합한 박테리아와 같은 감쇠된 원핵 생물로 형질감염 될 수 있다. 박테리아는 인간에게 항원 성분에 대한 보호성 면역 반응을 생성할 수 있도록 인간에게 투여될 수 있다. 대안으로, 상기 항원 성분을 인코딩하는 핵산은 원핵 프로모터의 하류에 위치할 수 있으며, 하나 또는 그 이상의 선별가능한 표지자들을 함유할 수 있고, 살모넬라 종(Salmonella spp.), 시겔라 종(Shigella spp.), 또는 다른 적합한 박테리아와 같은 감쇠된 원핵 생물로 형질감염 될 수 있다. 이어서, 관심 항원에 대한 면역 반응이 바람직한 진핵 생물 인간 대상에게 상기 박테리아를 투여할 수 있다. 예를 들면, U.S. 특허 번호. 6,500,419 참고.
하위단위 면역원성 조성물의 경우, 지카 바이러스의 단백질성 항원 성분을 인코딩하는 핵산은 플라스미드 이를 테면 국제 특허 출원 공개 번호 WO 00/32047 (Galen) 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 02/083890 (Galen)에서 기술된 바와 같이, 플라스미드로 클론될 수 있다. 이어서, 상기 플라스미드를 박테리아로 형질감염시킬 수 있고 박테리아는 원하는 항원 단백질을 생성할 수 있다. 상기 특허 출원 둘 다에 기재된 다양한 방법에 의해 원하는 항원성 단백질을 단리 및 정제할 수 있다.
바이러스 비활성화
본 명세서의 특정 측면들은 지카 바이러스의 하나 또는 그 이상의 항원들을 함유하는 지카 바이러스 백신 및 면역원성 조성물에 관계한다. 본 명세서의 백신 및/또는 면역원성 조성물은 정제된 바이러스, 온전체 바이러스, 재조합 바이러스, 살아있는 감쇠된 온전체 바이러스 또는, 바람직하게는, 비활성화된 온전체 바이러스, 또는 비활성화된 바이러스의 하위단위, 폴리펩티드, 및/또는 항원들을 함유할 수 있다. 이와 같이, 본 명세서의 특정 구체예들은 적어도 하나의 비활성화된 지카 바이러스의 하나 또는 그 이상의 항원들을 함유하는 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물에 관계한다.
바이러스를 비활성화시키거나 또는 사멸시켜, 포유류 세포를 감염시키는 이들의 능력을 파괴하지만, 바이러스의 구조 를 파괴하지 않는 방법은 당해 분야에서 공지된다. 이런 방법은 화학적 및 물리적 수단 둘 모두를 포함한다. 바이러스를 비활성화시키기 위한 적합한 수단은 제한 없이, 세정제, 포르말린 (본원에서 “포름알데히드”로서 또한 지칭됨), 베타-프로피올락톤 (BPL), 이성분 에틸아민 (BEI), 아세틸 에틸렌이민, 열, 전자파 방사선, X선 방사, 감마선 방사, 자외선 방사 (UV 방사), UV-A 방사, UV-B 방사, UV-C 방사, 메틸렌 블루, 소랄렌, 카르복시풀러렌 (C60), 그리고 이들의 임의의 조합에서 선택되는 한 가지 또는 그 이상의 작용제의 유효량으로 처리를 포함한다. 본원에서 포름알데히드의 농도를 언급 할 때, 이는 (포르말린의 농도가 아니라) 포름알데히드의 농도를 지칭한다. 따라서, "0.01% (w/v) 농도의 포름알데히드"는 0.01% (w/v)의 포름알데히드를 지칭하며, 포르말린 저장 용액 (일반적으로 질량 기준으로 37%의 포름알데히드를 함유함)에서 포름알데히드 농도에 대한 이러한 농도의 추가 보정을 할 필요가 없다. 예를 들면, 상기 바이러스 조직표본에서 이러한 포름알데히드 농도는 포르말린을 1.85% (w/v)의 포름알데히드 함량을 갖는 작업 용액으로 희석시킨 다음, 지카 바이러스 조직표본과 같은 바이러스 조직표본과 혼합될 때, 필요한 농도로 추가 희석하여 얻을 수 있다.
본 발명의 특정 구체예들에서, 적어도 하나의 바이러스는 화학적으로 비활성화된다. 화학적 비활성화를 위한 작용제 및 화학적 비활성화의 방법은 당해 분야에서 널리 공지되고, 본원에서 설명된다. 일부 구체예들에서, 적어도 하나의 바이러스는 BPL, 포르말린, 또는 BEI 중에서 한 가지 또는 그 이상으로 화학적으로 비활성화된다. 적어도 하나의 바이러스가 BPL로 화학적으로 비활성화되는 특정 구체예들에서, 바이러스는 한 가지 또는 그 이상의 변형을 내포할 수 있다. 일부 구체예들에서, 한 가지 또는 그 이상의 변형은 변형된 핵산을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 변형된 핵산은 알킬화된 핵산이다. 다른 구체예들에서, 한 가지 또는 그 이상의 변형은 변형된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 변형된 폴리펩티드는 변형된 시스테인, 메티오닌, 히스티딘, 아스파르트산, 글루타민산, 티로신, 리신, 세린 및 트레오닌 중에서 한 가지 또는 그 이상을 포함하는 변형된 아미노산 잔기를 내포한다.
적어도 하나의 바이러스가 포르말린으로 화학적으로 비활성화되는 특정 구체예들에서, 비활성화된 바이러스는 한 가지 또는 그 이상의 변형을 내포할 수 있다. 일부 구체예들에서, 한 가지 또는 그 이상의 변형은 변형된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 한 가지 또는 그 이상의 변형은 교차-연결된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 바이러스가 포르말린으로 화학적으로 비활성화되는 일부 구체예들서, 백신 또는 면역원성 조성물은 포르말린을 더욱 포함한다. 적어도 하나의 바이러스가 BEI로 화학적으로 비활성화되는 특정 구체예들에서, 바이러스는 한 가지 또는 그 이상의 변형을 내포할 수 있다. 일부 구체예들에서, 한 가지 또는 그 이상의 변형은 변형된 핵산을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 변형된 핵산은 알킬화된 핵산이다.
적어도 하나의 바이러스가 포르말린으로 화학적으로 비활성화되는 일부 구체예들에서, 임의의 잔여 반응하지 않은 포르말린은 이러한 잔여 반응하지 않은 포르말린을 제거하기 위해, 메타중아황산나트륨으로 중화될 수 있고, 투석될 수 있고 및/또는 완충제 교체될 수 있다. 일부 구체예들에서, 메타중아황산나트륨이 과량으로 추가된다. 일부 구체예들에서, 이들 용액은 혼합기, 예컨대 직렬(in-line) 정적 혼합기를 이용하여 혼합되고, 그리고 차후에 여과되거나 또는 더욱 정제될 수 있다 (예를 들면, 직교류(cross flow) 여과 시스템을 이용하여).
본 발명의 특정 구체예들은 지카 바이러스 조직표본(preparation)을 비활성화시키기 위한 방법에 관계한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 (a) 바이러스 조직표본을 생산하는데 이용되는, 시험관내에서 배양된 하나 또는 그 이상의 비-인간 세포로부터 지카 바이러스 조직표본을 단리하고, 이어서 정제하고, 그리고 (b) 바이러스 조직표본을 유효량의 포르말린으로 처리하는 것을 수반한다.
본 발명의 특정 구체예들은 지카 바이러스 조직표본을 비활성화시키기 위한 방법에 관계한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 다음을 포함한다:
(a) 시험관내 배양된 하나 또는 그 이상의 세포로부터 지카 바이러스 조직표본을 단리시키고, 이때 상기 세포들을 이용하여 지카 바이러스 조직표본을 만들고, 이때 상기 지카 바이러스 조직표본의 단리는 다음으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 단계들을 포함하고: (i) 심층 여과, (ii) 완충제 교환 및/또는 희석; (iii) 이온 교환 크로마토그래피; 그리고
(b) 상기 지카 바이러스 조직표본을 포름알데히드로 처리하고, 이때 일단위로 측정된 포름알데히드와의 배양 기간에 포름알데히드 농도(% (w/v)로 측정됨)를 곱한 수치적 결과는 0.025 내지 0.5이다.
특정 구체예들에서, 유효량의 포르말린을 이용한 처리는 약 0.001% v/v 내지 약 3.0% v/v 범위의 양의 포르말린으로 처리를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 예를 들면, 유효량의 포르말린을 이용한 처리는 약 0.001% 내지 약 3.0% v/v, 약 0.005% 내지 약 2.0% v/v, 또는 약 0.01% 내지 약 1.0% v/v 범위의 양, 또는 약 0.001%, 약 0.0025%, 약 0.005%, 약 0.0075%, 약 0.01%, 약 0.02%, 약 0.03%, 약 0.04%, 약 0.05%, 약 0.06%, 약 0.07%, 약 0.08%, 약 0.09%, 약 0.1%, 약 0.2%, 약 0.3%, 약 0.4%, 약 0.5%, 약 0.6%, 약 0.7%, 약 0.8%, 약 0.9%, 약 1.0%, 약 1.25%, 약 1.5%, 약 1.75%, 약 2.0%, 약 2.25%, 약 2.5%, 약 2.75%, 또는 약 3.0% v/v 범위의 양의 포르말린으로 처리를 포함할 수 있다.
상기 방법의 특정 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 조직표본은 포르말린으로 약 2℃ 내지 약 42℃의 온도 범위에서 처리된다. 예를 들면, 지카 바이러스 조직표본은 약 2℃ 내지 약 42℃, 약 2℃ 내지 약 8℃, 약 15℃ 내지 약 37℃, 약 17℃ 내지 약 27℃, 약 20℃ 내지 약 25℃ 의 범위에서 변하는 온도에서, 또는 약 2℃, 약 4℃, 약 8℃, 약 10℃, 약 15℃, 약 17℃, 약 18℃, 약 19℃, 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃약 30℃, 약 37℃ 또는 약 42℃의 온도에서 포르말린으로 처리될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 조직표본은 포르말린으로 실온에서 처리된다.
일부 구체예들에서, 지카 바이러스 조직표본은 적어도 약 1 일 동안 포르말린으로 처리된다. 예를 들면, 상기 지카 바이러스 조직표본은 포르말린으로 적어도 약 1 일, 적어도 약 2 일, 적어도 약 3 일, 적어도 약 4 일, 적어도 약 5 일, 적어도 약 6 일, 그리고 가령, 15 일을 넘기지 않는, 가령, 5 내지 15 일 동안 처리될 수 있다. 예를 들면, 상기 지카 바이러스 조직표은 포르말린으로 적어도 약 7 일, 적어도 약 8 일, 적어도 약 9 일, 적어도 약 10 일, 적어도 약 11 일, 적어도 약 12 일, 적어도 약 13 일, 적어도 약 14 일, 적어도 약 15 일, 적어도 약 16 일, 적어도 약 17 일, 적어도 약 18 일, 적어도 약 19 일, 적어도 약 20 일, 적어도 약 21 일, 적어도 약 22 일, 적어도 약 23 일, 적어도 약 24 일, 적어도 약 25 일, 적어도 약 26 일, 적어도 약 27 일, 적어도 약 28 일, 적어도 약 29 일, 적어도 약 30 일, 또는 그 이상 기간 동안 처리될 수 있다. 일부 구체예들에서, 지카 바이러스 조직표본은 적어도 약 9 일 동안 포르말린으로 처리된다. 일부 구체예들에서, 지카 바이러스 조직표본은 적어도 약 11 일 동안 포르말린으로 처리된다. 일부 구체예들에서, 지카 바이러스 조직표본은 적어도 약 14 일 동안 포르말린으로 처리된다. 일부 구체예들에서, 지카 바이러스 조직표본은 적어도 약 20 일 동안 포르말린으로 처리된다. 일부 구체예들에서, 지카 바이러스 조직표본은 적어도 약 30 일 동안 포르말린으로 처리된다.
일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 조직표본은 0.005 내지 0.02% (w/v)의 포르말린으로 8 내지 12 일 동안 15℃ 내지 30℃의 온도에서 처리된다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 조직표본은 0.005 내지 0.02% (w/v)의 포르말린으로 9 내지 11 일 동안 15℃ 내지 30℃의 온도에서 처리된다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 조직표본은 0.005 내지 0.02% (w/v)의 포르말린으로 10 일 동안 15℃ 내지 30℃의 온도에서 처리된다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 조직표본은 0.008 내지 0.015% (w/v)의 포르말린으로 8 내지 12 일 동안 15℃ 내지 30℃의 온도에서 처리된다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 조직표본은 0.008 내지 0.015% (w/v)의 포르말린으로 9 내지 11 일 동안 15℃ 내지 30℃의 온도에서 처리된다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 조직표본은 0.008 내지 0.015% (w/v)의 포르말린으로 10 일 동안 15℃ 내지 30℃의 온도에서 처리된다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 조직표본은 0.01% (w/v)의 포르말린으로 8 내지 12 일 동안 15℃ 내지 30℃의 온도에서 처리된다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 조직표본은 0.01% (w/v)의 포르말린으로 9 내지 11 일 동안 15℃ 내지 30℃의 온도에서 처리된다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 조직표본은 0.01% (w/v)의 포르말린으로 10 일 동안 15℃ 내지 30℃의 온도에서 처리된다.
일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 조직표본은 0.005 내지 0.02% (w/v)의 포르말린으로 8 내지 12 일 동안 18℃ 내지 25℃의 온도에서 처리된다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 조직표본은 0.005 내지 0.02% (w/v)의 포르말린으로 9 내지 11 일 동안 18℃ 내지 25℃의 온도에서 처리된다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 조직표본은 0.005 내지 0.02% (w/v)의 포르말린으로 10 일 동안 18℃ 내지 25℃의 온도에서 처리된다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 조직표본은 0.008 내지 0.015% (w/v)의 포르말린으로 8 내지 12 일 동안 18℃ 내지 25℃의 온도에서 처리된다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 조직표본은 0.008 내지 0.015% (w/v)의 포르말린으로 9 내지 11 일 동안 18℃ 내지 25℃의 온도에서 처리된다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 조직표본은 0.008 내지 0.015% (w/v)의 포르말린으로 10 일 동안 18℃ 내지 25℃의 온도에서 처리된다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 조직표본은 0.01% (w/v)의 포르말린으로 8 내지 12 일 동안 18℃ 내지 25℃의 온도에서 처리된다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 조직표본은 0.01% (w/v)의 포르말린으로 9 내지 11 일 동안 18℃ 내지 25℃의 온도에서 처리된다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 조직표본은 0.01% (w/v)의 포르말린으로 10 일 동안 18℃ 내지 25℃의 온도에서 처리된다.
일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 조직표본은 0.005 내지 0.02% (w/v)의 포르말린으로 8 내지 12 일 동안 22℃의 온도에서 처리된다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 조직표본은 0.005 내지 0.02% (w/v)의 포르말린으로 9 내지 11 일 동안 22℃의 온도에서 처리된다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 조직표본은 0.005 내지 0.02% (w/v)의 포르말린으로 10 일 동안 22℃의 온도에서 처리된다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 조직표본은 0.008 내지 0.015% (w/v)의 포르말린으로 8 내지 12 일 동안 22℃의 온도에서 처리된다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 조직표본은 0.008 내지 0.015% (w/v)의 포르말린으로 9 내지 11 일 동안 22℃의 온도에서 처리된다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 조직표본은 0.008 내지 0.015% (w/v)의 포르말린으로 10 일 동안 22℃의 온도에서 처리된다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 조직표본은 0.01% (w/v)의 포르말린으로 8 내지 12 일 동안 22℃의 온도에서 처리된다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 조직표본은 0.01% (w/v)의 포르말린으로 9 내지 11 일 동안 22℃의 온도에서 처리된다. 일부 구체예들에서, 상기 지카 바이러스 조직표본은 0.01% (w/v)의 포르말린으로 10 일 동안 22℃의 온도에서 처리된다.
일부 구체예들에서, 포름알데히드와의 배양 기간에 포름알데히드 농도를 곱한 수치적 결과는 0.05 내지 0.25이다. 일부 구체예들에서, 일단위로 측정된 포름알데히드와의 배양 기간에 포름알데히드 농도(% (w/v)로 측정됨)를 곱한 수치적 결과는 0.075 내지 0.15이다. 일부 구체예들에서, 포름알데히드와의 배양 기간에 포름알데히드 농도를 곱한 수치적 결과는 0.1이다.
일부 구체예들에서, 상기 포름알데히드 농도는 0.005% (w/v) 내지 0.02% (w/v)이다. 일부 구체예들에서, 상기 포름알데히드 농도는 0.0075% (w/v) 내지 0.015% (w/v)이다. 일부 구체예들에서, 상기 포름알데히드 농도는 0.01% (w/v)이다.
일부 구체예들에서, 일단위로 측정된 포름알데히드와의 배양 기간에 포름알데히드 농도(% (w/v)로 측정됨)를 곱한 수치적 결과는 0.025 내지 0.5이며, 상기 포름알데히드 농도는 0.005% (w/v) 내지 0.02% (w/v)이다. 일부 구체예들에서, 포름알데히드와의 배양 기간에 포름알데히드 농도를 곱한 수치적 결과는 0.025 내지 0.5이며, 상기 포름알데히드 농도는 0.0075% (w/v) 내지 0.015% (w/v)이다. 일부 구체예들에서, 포름알데히드와의 배양 기간에 포름알데히드 농도를 곱한 수치적 결과는 0.025 내지 0.5이며, 상기 포름알데히드 농도는 0.01% (w/v)이다.
일부 구체예들에서, 일단위로 측정된 포름알데히드와의 배양 기간에 포름알데히드 농도(% (w/v)로 측정됨)를 곱한 수치적 결과는 0.05 내지 0.25이며, 상기 포름알데히드 농도는 0.005% (w/v) 내지 0.02% (w/v)이다. 일부 구체예들에서, 포름알데히드와의 배양 기간에 포름알데히드 농도를 곱한 수치적 결과는 0.05 내지 0.25이며, 상기 포름알데히드 농도는 0.0075% (w/v) 내지 0.015% (w/v)이다. 일부 구체예들에서, 포름알데히드와의 배양 기간에 포름알데히드 농도를 곱한 수치적 결과는 0.05 내지 0.25이며, 상기 포름알데히드 농도는 0.01% (w/v)이다.
일부 구체예들에서, 일단위로 측정된 포름알데히드와의 배양 기간에 포름알데히드 농도(% (w/v)로 측정됨)를 곱한 수치적 결과는 0.075 내지 0.15이며, 상기 포름알데히드 농도는 0.005% (w/v) 내지 0.02% (w/v)이다. 일부 구체예들에서, 포름알데히드와의 배양 기간에 포름알데히드 농도를 곱한 수치적 결과는 0.075 내지 0.15이며, 상기 포름알데히드 농도는 0.0075% (w/v) 내지 0.015% (w/v)이다. 일부 구체예들에서, 포름알데히드와의 배양 기간에 포름알데히드 농도를 곱한 수치적 결과는 0.075 내지 0.15이며, 상기 포름알데히드 농도는 0.01% (w/v)이다.
일부 구체예들에서, 일단위로 측정된 포름알데히드와의 배양 기간에 포름알데히드 농도(% (w/v)로 측정됨)를 곱한 수치적 결과는 0.1이며, 상기 포름알데히드 농도는 0.005% (w/v) 내지 0.02% (w/v)이다. 일부 구체예들에서, 포름알데히드와의 배양 기간에 포름알데히드 농도를 곱한 수치적 결과는 0.1이며, 상기 포름알데히드 농도는 0.0075% (w/v) 내지 0.015% (w/v)이다. 일부 구체예들에서, 포름알데히드와의 배양 기간에 포름알데히드 농도를 곱한 수치적 결과는 0.1이며, 상기 포름알데히드 농도는 0.01% (w/v)이다.
일부 구체예들에서, 일단위로 측정된 포름알데히드와의 배양 기간에 포름알데히드 농도(% (w/v)로 측정됨)를 곱한 수치적 결과는 0.025 내지 0.5이며, 포름알데히드와 함께 배양한 기간은 8 내지 12 일이다. 일부 구체예들에서, 포름알데히드와의 배양 기간에 포름알데히드 농도를 곱한 수치적 결과는 0.025 내지 0.5이며, 포름알데히드와 함께 배양한 기간은 9 내지 11 일이다. 일부 구체예들에서, 포름알데히드와의 배양 기간에 포름알데히드 농도를 곱한 수치적 결과는 0.025 내지 0.5이며, 포름알데히드와 함께 배양한 기간은 10 일이다.
일부 구체예들에서, 일단위로 측정된 포름알데히드와의 배양 기간에 포름알데히드 농도(% (w/v)로 측정됨)를 곱한 수치적 결과는 0.05 내지 0.25이며, 포름알데히드와 함께 배양한 기간은 8 내지 12 일이다. 일부 구체예들에서, 포름알데히드와의 배양 기간에 포름알데히드 농도를 곱한 수치적 결과는 0.05 내지 0.25이며, 포름알데히드와 함께 배양한 기간은 9 내지 11 일이다. 일부 구체예들에서, 포름알데히드와의 배양 기간에 포름알데히드 농도를 곱한 수치적 결과는 0.05 내지 0.25이며, 포름알데히드와 함께 배양한 기간은 10 일이다.
일부 구체예들에서, 일단위로 측정된 포름알데히드와의 배양 기간에 포름알데히드 농도(% (w/v)로 측정됨)를 곱한 수치적 결과는 0.075 내지 0.15이며, 포름알데히드와 함께 배양한 기간은 8 내지 12 일이다. 일부 구체예들에서, 포름알데히드와의 배양 기간에 포름알데히드 농도를 곱한 수치적 결과는 0.075 내지 0.15이며, 포름알데히드와 함께 배양한 기간은 9 내지 11 일이다. 일부 구체예들에서, 포름알데히드와의 배양 기간에 포름알데히드 농도를 곱한 수치적 결과는 0.075 내지 0.15이며, 포름알데히드와 함께 배양한 기간은 10 일이다.
일부 구체예들에서, 일단위로 측정된 포름알데히드와의 배양 기간에 포름알데히드 농도(% (w/v)로 측정됨)를 곱한 수치적 결과는 0.1이며, 포름알데히드와 함께 배양한 기간은 8 내지 12 일이다. 일부 구체예들에서, 포름알데히드와의 배양 기간에 포름알데히드 농도를 곱한 수치적 결과는 0.1이며, 포름알데히드와 함께 배양한 기간은 9 내지 11 일이다. 일부 구체예들에서, 포름알데히드와의 배양 기간에 포름알데히드 농도를 곱한 수치적 결과는 0.1이며, 포름알데히드와 함께 배양한 기간은 10 일이다.
일부 구체예들에서, 상기 방법은 반응하지 않은 포르말린을 메타중아황산나트륨의 유효량으로 중화하는 것을 더욱 수반한다. 일부 구체예들에서, 메타중아황산나트륨의 유효량은 약 0.01 mM 내지 약 100 mM의 범위다. 예를 들면, 메타중아황산나트륨은 약 0.01 mM 내지 약 100 mM, 약 0.1 mM 내지 약 50 mM, 약 0.5 mM 내지 약 20mM, 또는 약 1 mM 내지 약 10 mM의 효과적인 농도에서, 또는 약 0.01mM, 약 0.05mM, 약 0.1mM, 약 0.25mM, 약 0.5mM, 약 0.75mM, 약 1mM, 약 2mM, 약 3mM, 약 4mM, 약 5mM, 약 6mM, 약 7mM, 약 8mM, 약 9mM, 약 10mM, 약 20mM, 약 30mM, 약 40mM, 약 50mM, 약 75mM 또는 약 100mM의 농도에서 첨가될 수 있다. 일부 구체예에서, 포르말린은 약 2mM 메타중아황산나트륨으로 중화된다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 (a) 바이러스 조직표본을 생산하는데 이용되는, 시험관내에서 배양된 하나 또는 그 이상의 비-인간 세포로부터 지카 바이러스 조직표본을 단리하고 이어서 정제하고, 그리고 (b) 바이러스 조직표본을 유효량의 포르말린으로 처리하고; (c) 상기 바이러스 조직표본을 유효량의 메타중아황산나트륨으로 중화시키고; 그리고 (d) 상기 중화된 바이러스 조직표본을 정제하는 것을 수반한다. 제한 없이, 직교류 여과 (CFF), 다중모드 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피 및/또는 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하는 것을 포함하나, 이에 국한되지 않은, 당해 분야에서 공지된, 바이러스 조직표본을 정제하는 임의의 방법이 이용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 중화된 바이러스 조직표본은 직교류 여과 (CFF)에 의해 정제된다. 일부 구체예들에서, 바이러스 조직표본은 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 그 이상인 양으로 고도로 정제된다.
따라서 본 발명의 특정 구체예들은 정제된 비활성화된 지카 바이러스를 내포하는 온전체 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물에 관계한다. 본원에 사용된 용어 "비활성화된 온전체 지카 바이러스"는 유효량의 포르말린으로의 처리와 같은 비활성화 방법으로 처리된 지카 바이러스를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 치료는 바이러스의 구조를 파괴하지 않는 것으로 간주되는데, 즉, 바이러스의 2 차, 3 차 또는 4 차 구조 및 면역원성 에피토프를 파괴하지 않지만, 그러나 상기 비활성화된 지카 바이러스는 비활성화되지 않았던 지카 바이러스에 감염될 수 있는 숙주 세포를 감염시킬 수 없다. 한 구체예에서, 상기 비활성화된 지카 바이러스는 더 이상 VERO 세포를 감염시킬 수 없고, VERO 세포 상에서 세포 변성 효과를 발휘할 수 없다.
지카 바이러스 조직표본의 비활성화의 완결도(completeness)를 결정하기 위한 방법은 하기 단계를 포함한다:
(i) 곤충 세포를 비활성화 단계를 겪었된 지카 바이러스 조직표본으로 접종하고, 그리고 이들 곤충 세포를 제 1 기간 동안 배양하고, 따라서 곤충 세포 상청액을 생산하는 단계;
(ii)포유류 세포를 (i)에서 생산된 곤충 세포 상청액으로 접종하고, 그리고 이들 포유류 세포를 제 2 기간 동안 배양하고; 그리고
(iii) 바이러스 조직표본이 포유류 세포에 대한 세포변성 효과를 발생시키는 잔여 복제 바이러스를 내포하는 지를 결정한다.
일부 구체예에서, 지카 바이러스 조직표본의 비활성화의 완결도를 결정하기 위한 방법은 하기 단계를 포함한다:
(i) C6/36 세포를 비활성화 단계에 종속된 지카 바이러스 조직표본으로 접종하고, 그리고 이들 C6/36 세포를 제1 기간 동안 배양하고, 따라서 C6/36 세포 상청액을 생산하는 단계;
(ii) Vero 세포를 (i)에서 생산된 C6/36 세포 상청액으로 접종하고, 그리고 이들 Vero 세포를 제2 기간 동안 배양하는 단계; 그리고
(iii) 바이러스 조직표본이 Vero 세포에 대한 세포변성 효과를 발생시키는 잔여 복제 바이러스를 내포하는 지를 결정하는 단계.
제2 기간의 종결 시점에서, 바이러스 조직표본이 포유류 세포에 대한 세포변성 효과를 갖는 지가 결정된다. 세포변성 효과는 바이러스 침습, 감염, 그리고 바이러스 복제 동안 세포로부터 발아에 의해 유발된 세포 구조에서 임의의 변화이다. 본 명세서의 방법에서, 세포변성 효과는 만약 세포가 페놀 레드를 내포하는 배지에서 배양되면, 배지 컬러에서 핑크색에서 오렌지색 또는 황색으로의 변화에 의해, 또는 포유류 세포의 현미경검사에 의해 결정된다. 만약 포유류 세포의 현미경검사가 세포가 둥글거나, 조직 배양 용기 (평판, 웰 또는 플라스크)에서 벗어나기 시작하거나, 또는 조직 배양 평판/플라스크로부터 제거된다는 것을 보여주면, 세포변성 효과가 존재하는 것으로 간주된다. 세포변성 효과의 다른 증인은 합포체(syncytia)를 형성하는 인접한 세포의 융합 및 핵 또는 세포질 봉입체(inclusion bodies)의 출현을 포함한다.
앞서 논의된 바와 같이, 본원에서 개시된 방법은 매우 낮은 검출 한계를 갖는다. 이 방법으로, 1.0 TCID50의 바이러스 함량이 탐지될 수 있다. 일부 구체예들에서, 0.8 TCID50의 바이러스 함량이 탐지될 수 있다. 일부 구체예들에서, 0.5 TCID50의 바이러스 함량이 탐지될 수 있다. 일부 구체예들에서, 0.2 TCID50의 바이러스 함량이 탐지될 수 있다. 일부 구체예들에서, 0.1 TCID50의 바이러스 함량이 탐지될 수 있다.
본 명세서의 경우, 용어 “비활성화된 온전체 지카 바이러스”는 따라서 상기 지카 바이러스가 약 0.001% v/v 내지 약 3.0% v/v 범위의 포르말린 양으로 5 내지 15 일 동안 약 15℃ 내지 약 37℃의 온도 범위에서 처리되며, 특히 0.02% v/v의 포름알데히드로 10 일 동안 22℃에서 처리되며, 또는 특히 0.01% v/v의 포름알데히드로 10 일 동안 22℃에서 처리되는 방법으로 획득가능한 지카 바이러스를 지칭한다. 상기 정의는 상기 지카 바이러스가 약 0.001% v/v 내지 약 3.0% v/v 범위의 포르말린 양으로 5 내지 15 일 동안 약 15℃ 내지 약 37℃범위의 온도에서 처리되며, 특히 0.02% v/v의 포름알데히드로 10 일 동안 22℃에서 처리되거나, 또는 특히 0.01% v/v의 포름알데히드로 10 일 동안 22℃에서 처리되는 방법으로 획득된 지카 바이러스를 포괄하는 것이지만, 그러나 다른 방법에 의해 동일한 비활성화된 온전체 지카 바이러스를 만들 수 있기 때문에, 이들 방법으로만 국한되는 것으로 이해되어서는 안된다. 이러한 특정 구체예들에서, 그러나, 상기 지카 바이러스는 약 0.001% v/v 내지 약 3.0% v/v 범위의 양의 포르말린으로 5 내지 15 일 동안 약 15℃ 내지 약 37℃의 온도 범위에서, 특히 0.02% v/v의 포름알데히드로 10 일 동안 22℃에서, 또는 특히 0.01% v/v의 포름알데히드로 10 일 동안 22℃에서 처리되는 방법으로부터 상기 지카 바이러스가 획득된다.
대안으로, 본 명세서 내에서, “비활성화된 온전체 지카 바이러스”는 따라서 단계 (i)에서 (iii를 포함하는 방법에 의해 테스트되었고, 단계 (iii)에서 임의의 플라크 형성을 보이지 않은 지카 바이러스를 지칭한다:
(i) 곤충 세포를 비활성화 단계를 겪었된 지카 바이러스 조직표본으로 접종하고, 그리고 이들 곤충 세포를 제 1 기간 동안 배양하고, 따라서 곤충 세포 상청액을 생산하는 단계;
(ii)포유류 세포를 (i)에서 생산된 곤충 세포 상청액으로 접종하고, 그리고 이들 포유류 세포를 제 2 기간 동안 배양하고; 그리고
(iii) 바이러스 조직표본이 포유류 세포에 대한 세포변성 효과를 발생시키는 잔여 복제 바이러스를 내포하는 지를 결정한다.
따라서, 용어 “정제된 비활성화된 온전체 지카 바이러스”는 상기 지카 바이러스가 약 0.001% v/v 내지 약 3.0% v/v 범위의 양의 포르말린으로 5 내지 15 일 동안 약 15℃ 내지 약 37℃의 온도 범위에서 처리된, 특히 0.02% v/v의 포름알데히드로 10 일 동안 22℃에서 처리된, 또는 특히 0.01% v/v의 포름알데히드로 10 일 동안 22℃에서 처리된 방법, 또는 대안 적으로, 비활성화의 완결도를 결정하기 위한 상기 언급된 방법에 의해, 그리고 필요한 경우 정제 공정을 거쳐서 획득된 또는 획득가능한 지카 바이러스를 지칭한다. 따라서, 상기 정제된 지카 바이러스는 비-정제된 지카 바이러스보다 더욱 낮은 함량의 숙주 세포 단백질, 예컨대 Vero 세포 단백질 및 숙주 세포 DNA, 예컨대 Vero 세포 DNA를 갖는다. 따라서, 용어 “정제된 비활성화된 온전체 지카 바이러스”는 상기 지카 바이러스가 약 0.001% v/v 내지 약 3.0% v/v 범위의 양의 포르말린으로 5 내지 15 일 동안 약 15℃ 내지 약 37℃온도 범위에서 처리된, 특히 0.02% v/v의 포름알데히드로 10 일 동안 22℃에서 처리된, 또는 특히 0.01% v/v의 포름알데히드로 10 일 동안 22℃에서 처리된 방법, 또는 대안 적으로, 비활성화의 완결도를 결정하기 위한 상기 언급된 방법에 의해, 그리고 크기 배제 크로마토그래피에서 곡선 아래의 총 면적의 85% 이상의 주요 피크를 제공하는 방법에 의해 획득가능한 또는 획득된 지카 바이러스를 지칭한다.
이러한 특정 구체예들에서, 상기 정제된 비활성화된 온전체 지카 바이러스는 더욱이 플라크 정제에 의해 획득된 또는 획득가능한 클론 분리주다.
이러한 특정 구체예들에서 상기 정제된 비활성화된 온전체 지카 바이러스(이는 더욱이 임의 선택적으로 플라크 정제에 의해 획득된 또는 획득가능한 클론 분리주이며)는 서열 번호:1의 위치 98에서, 또는 서열 번호:1의 위치 98에 상응하는 위치에서 돌연변이를 함유하고, 외피 단백질 E 안에 임의의 돌연변이를 함유하지 않는다. 이러한 특정 구체예들에서, 상기 돌연변이는 서열 번호:1의 위치 98에서, 또는 서열 번호:1의 위치 98에 대응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이다. 이러한 특정 구체예들에서, 상기 지카 바이러스는 계열 PRVABC59로부터 유래된다. 이러한 특정 구체예들에서, 상기 지카 바이러스는 서열 번호: 2에 따른 게놈 서열을 포함하는 계열 PRVABC59로부터 유래된다.
적어도 하나의 비활성화된 지카 바이러스로부터 한 가지 또는 그 이상의 항원을 내포하는 본 명세서의 백신 및/또는 면역원성 조성물은 치료가 필요한 인간 대상에서 지카 바이러스 감염을 치료하거나 또는 예방하고 및/또는 치료가 필요한 인간 대상에서 지카 바이러스에 대한 면역 반응, 예컨대 보호 면역 반응을 유도하는데 유용할 수 있다.
본 명세서의 다른 측면들은 본원에서 개시된 방법들에 의해 획득가능한 비활성화된 지카 바이러스를 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물에 관계한다. 이들 백신 또는 면역원성 조성물은 특별히 낮은 함량의 잔류 포름알데히드를 갖는다.
용어 "잔류 포름알데히드 함량"이란 상기 지카 바이러스가 비활성화된 후 여전히 백신 또는 면역원성 조성물에 존재하는 포름알데히드의 양을 지칭하며, 상기 조직표본은 중화되었으며, 임의 선택적으로 하나 또는 그 이상의 추가 정제 또는 여과 단계를 거치게 된다. US 약전(pharmacopoiea)에 따르면, 비활성화된 박테리아 또는 바이러스를 포함하는 백신 안에 잔류하는 포름알데히드의 잔류 상한은 0.02%이며, 이는 100μg/ml의 포름알데히드와 대등하다.
상기 잔류 포름알데히드 함량은 당해 업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 하나의 적합한 방법은 EMEA, VICH Topic GL25, Biologicals: Testing of residual formaldehyde, 30 April 2002에 기술되어 있으며, 이는 메틸벤조티아졸론 히드라존 히드로클로라이드 (MBTH)의 사용과 관련된다. 다른 방법으로는 아세틸 아세톤 적정, 염화 제2철 적정 및 기본 퓨신(fuchsin) 테스트를 포함한다. 특별히 적합한 방법은 본원에서 기술된다.
상기 백신 또는 면역원성 조성물은 대상에게 투여될 수 있는 형태이며, 전형적으로 하나 또는 그 이상의 제약학적으로 허용되는 부형제를 함유한다.
상기 백신 또는 면역원성 조성물 안에 잔류 포름알데히드의 함량은 50μg/ml 미만이다. 한 구체예에서, 백신 또는 면역원성 조성물 안에 잔류 포름알데히드의 함량은 45μg/ml 미만, 40μg/ml 미만, 35μg/ml 미만, 30μg/ml 미만, 25μg/ml 미만, 20μg/ml 미만, 15μg/ml 미만 또는 10μg/ml 미만이다. 한 구체예에서, 백신 또는 면역원성 조성물 안에 잔류 포름알데히드의 함량은 9.5μg/ml 미만, 9μg/ml 미만, 8.5μg/ml 미만, 8μg/ml 미만, 7.5μg/ml 미만, 7μg/ml 미만, 6.5μg/ml 미만, 6μg/ml 미만, 5.5μg/ml 미만, 5μg/ml 미만, 4.5μg/ml 미만, 4μg/ml 미만, 3.5μg/ml 미만, 3μg/ml 미만, 2.5μg/ml 미만, 2μg/ml 미만, 1.5μg/ml 미만, 1μg/ml 미만 또는 0.5μg/ml 미만이다. 한 구체예에서, 백신 또는 면역원성 조성물 안에 잔류 포름알데히드의 함량은 0.5μg/ml 미만이다.
잔류 포름알데히드 함량을 측정하는 방법
본 명세서의 다른 측면들은 비활성화된 바이러스를 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물에서 잔류 포름알데히드 함량을 결정하는 방법에 관계하며, 다음의 단계들을 포함한다:
(a) 포름알데히드로 처리된 바이러스를 포함하는 조성물을 제공하는 단계;
(b) 상기 (a)의 조성물에 인산 및 2,4-디니트로페닐히드라진 (DNPH)을 혼합하는 단계, 이로 인하여 혼합물이 제공되며;
(c) 상기 (b)의 혼합물 적합한 조건 하에서 배양하는 단계; 그리고
(d) 상기 혼합물에 대하여 잔류 포름알데히드 존재를 분석하는 단계.
검출 시약으로 DNPH를 사용하면 다음과 같은 장점이 있다: (1) 높은 민감도, (2) 유도된 포름알데히드의 UV 탐지, 그리고 (3) 가열없이, 1-단계 표본 조직표본. 본 방법은 어쥬번트 이를 테면, 수산화 알루미늄을 함유하는 백신내 잔류 포름알데히드를 탐지하는데 특별히 적합하다. 상기 방법은 International Conference on Harmonization(ICH) Q2 지침에 따라 특이성, 선형성(linearity), 정확성, 반복성, 견고성 및 안정성 측면에서 검증되었다. 일부 구체예들에서, 포름알데히드로 처리된 바이러스를 포함하는 조성물 50부(parts)를 15 내지 25% (v/v)의 인산 1부, 그리고 0.9 내지 1.1 mg/ml의 DNPH 2.5 부와 혼합한다. 일부 구체예들에서, 포름알데히드로 처리된 바이러스를 포함하는 조성물 50부를 20% (v/v)의 인산 1부, 그리고 1.0 mg/ml의 DNPH 2.5 부와 혼합한다.
일부 구체예들에서, 포름알데히드로 처리된 바이러스를 포함하는 조성물과 인산 및 DNPH와의 혼합물은 18℃ 내지 30℃의 온도에서 배양된다. 일부 구체예들에서, 포름알데히드로 처리된 바이러스를 포함하는 조성물과 인산 및 DNPH와의 혼합물은 20℃ 내지 25℃의 온도에서 배양된다. 일부 구체예들에서, 포름알데히드로 처리된 바이러스를 포함하는 조성물과 인산 및 DNPH와의 혼합물은 22℃의 온도에서 배양된다.
일부 구체예들에서, 포름알데히드로 처리된 바이러스를 포함하는 조성물과 인산 및 DNPH와의 혼합물은 10 내지 30 분 동안 배양된다. 일부 구체예들에서, 포름알데히드로 처리된 바이러스를 포함하는 조성물과 인산 및 DNPH와의 혼합물은 15 내지 25 분 동안 배양된다. 일부 구체예들에서, 포름알데히드로 처리된 바이러스를 포함하는 조성물과 인산 및 DNPH와의 혼합물은 20 분 동안 배양된다.
일부 구체예들에서, 포름알데히드로 처리된 바이러스를 포함하는 조성물과 인산 및 DNPH와의 혼합물은 18℃ 내지 30℃의 온도에서, 10 내지 30 분 동안 배양된다. 일부 구체예들에서, 포름알데히드로 처리된 바이러스를 포함하는 조성물과 인산 및 DNPH와의 혼합물은 18℃ 내지 30℃의 온도에서, 15 내지 25 분 동안 배양된다. 일부 구체예들에서, 포름알데히드로 처리된 바이러스를 포함하는 조성물과 인산 및 DNPH와의 혼합물은 18℃ 내지 30℃의 온도에서, 20 분 동안 배양된다.
일부 구체예들에서, 포름알데히드로 처리된 바이러스를 포함하는 조성물과 인산 및 DNPH와의 혼합물은 20℃ 내지 25℃의 온도에서, 10 내지 30 분 동안 배양된다. 일부 구체예들에서, 포름알데히드로 처리된 바이러스를 포함하는 조성물과 인산 및 DNPH와의 혼합물은 20℃ 내지 25℃의 온도에서, 15 내지 25 분 동안 배양된다. 일부 구체예들에서, 포름알데히드로 처리된 바이러스를 포함하는 조성물과 인산 및 DNPH와의 혼합물은 20℃ 내지 25℃의 온도에서, 20 분 동안 배양된다.
일부 구체예들에서, 포름알데히드로 처리된 바이러스를 포함하는 조성물과 인산 및 DNPH와의 혼합물은 22℃의 온도에서, 10 내지 30 분 동안 배양된다. 일부 구체예들에서, 포름알데히드로 처리된 바이러스를 포함하는 조성물과 인산 및 DNPH와의 혼합물은 22℃의 온도에서, 15 내지 25 분 동안 배양된다. 일부 구체예들에서, 포름알데히드로 처리된 바이러스를 포함하는 조성물과 인산 및 DNPH와의 혼합물은 22℃의 온도에서, 20 분 동안 배양된다.
일부 구체예들에서, 포름알데히드로 처리된 바이러스를 포함하는 조성물 50부, 그리고 20%의 인산 1부 그리고 1.0 mg/ml의 DNPH 2.5부와의 혼합물은 18℃ 내지 30℃의 온도에서 10 내지 30 분 동안 배양된다. 일부 구체예들에서, 포름알데히드로 처리된 바이러스를 포함하는 조성물 50부, 그리고 20%의 인산 1부 그리고 1.0 mg/ml의 DNPH 2.5부와의 혼합물은 18℃ 내지 30℃의 온도에서 15 내지 25 분 동안 배양된다. 일부 구체예들에서, 포름알데히드로 처리된 바이러스를 포함하는 조성물 50부, 그리고 20%의 인산 1부 그리고 1.0 mg/ml의 DNPH 2.5부와의 혼합물은 18℃ 내지 30℃의 온도에서 20 분 동안 배양된다.
일부 구체예들에서, 포름알데히드로 처리된 바이러스를 포함하는 조성물 50부, 그리고 20%의 인산 1부 그리고 1.0 mg/ml의 DNPH 2.5부와의 혼합물은 20℃ 내지 25℃의 온도에서 10 내지 30 분 동안 배양된다. 일부 구체예들에서, 포름알데히드로 처리된 바이러스를 포함하는 조성물 50부, 그리고 20%의 인산 1부 그리고 1.0 mg/ml의 DNPH 2.5부와의 혼합물은 20℃ 내지 25℃의 온도에서 15 내지 25 분 동안 배양된다. 일부 구체예들에서, 포름알데히드로 처리된 바이러스를 포함하는 조성물 50부, 그리고 20%의 인산 1부 그리고 1.0 mg/ml의 DNPH 2.5부와의 혼합물은 20℃ 내지 25℃의 온도에서 20 분 동안 배양된다.
일부 구체예들에서, 포름알데히드로 처리된 바이러스를 포함하는 조성물 50부, 그리고 20%의 인산 1부 그리고 1.0 mg/ml의 DNPH 2.5부와의 혼합물은 22℃의 온도에서 10 내지 30 분 동안 배양된다. 일부 구체예들에서, 포름알데히드로 처리된 바이러스를 포함하는 조성물 50부, 그리고 20%의 인산 1부 그리고 1.0 mg/ml의 DNPH 2.5부와의 혼합물은 22℃의 온도에서 15 내지 25 분 동안 배양된다. 일부 구체예들에서, 포름알데히드로 처리된 바이러스를 포함하는 조성물 50부, 그리고 20%의 인산 1부 그리고 1.0 mg/ml의 DNPH 2.5부와의 혼합물은 22℃의 온도에서 20 분 동안 배양된다.
배양 후, 포름알데히드로 처리된 바이러스를 포함하는 조성물과 인산 및 DNPH와의 혼합물은 임의의 적합한 방법에 의해 분석될 수 있다. 한 구체예에서, 배양 후, 포름알데히드로 처리된 바이러스를 포함하는 조성물과 인산 및 DNPH와의 혼합물은 HPLC에 의해 분석된다 . 한 구체예에서, 배양 후, 포름알데히드로 처리된 바이러스를 포함하는 조성물과 인산 및 DNPH와의 혼합물은 역상(reverse phase) HPLC에 의해 분석된다. 한 구체예에서, 역상 HPLC 컬럼의 리간드는 C18, n-부탈, n-옥틸, 페닐 및 시아노프로필로부터 선택된다. 한 구체예에서, 역상 HPLC 컬럼의 리간드는 C18이다. 한 구체예에서, 물과 아세토니트릴의 혼합물 (1:1, v/v)은 역상 HPLC에서 이동상(mobile phase)으로 이용된다. 한 구체예에서, 상기 탐지 파장은 360 nm이다.
한 구체예에서, 본 명세서는 비활성화된 바이러스를 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물에서 잔류 포름알데히드 함량을 결정하는 방법을 제공하며, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
(a) 포름알데히드로 처리된 바이러스를 포함하는 조성물을 제공하는 단계;
(b) 상기 (a)의 조성물 50부에 20%의 인산 1부, 그리고 1 mg/ml의 2,4-디니트로페닐히드라진 (DNPH) 2.5 부를 혼합하고, 이로 인하여 혼합물이 제공되며;
(c) (b)의 혼합물을 20 분 동안 실온에서 배양하고; 그리고
(d) C18 컬럼 및 이동상으로 물과 아세토니트릴의 혼합물 (1:1, v/v)을 이용한 역상 HPLC에 의해 잔류 포름알데히드의 존재에 대하여 상기 혼합물을 분석한다.
한 구체예에서, 본 명세서는 비활성화된 지카 바이러스를 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물에서 잔류 포름알데히드 함량을 결정하는 방법을 제공하며, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
(a) 포름알데히드로 처리된 지카 바이러스를 포함하는 조성물을 제공하는 단계;
(b) 상기 (a)의 조성물 50부에 20%의 인산 1부, 그리고 1 mg/ml의 2,4-디니트로페닐히드라진 (DNPH) 2.5 부를 혼합하고, 이로 인하여 혼합물이 제공되며;
(c) (b)의 혼합물을 20 분 동안 실온에서 배양하고; 그리고
(d) C18 컬럼 및 이동상으로 물과 아세토니트릴의 혼합물 (1:1, v/v)을 이용한 역상 HPLC에 의해 잔류 포름알데히드의 존재에 대하여 상기 혼합물을 분석한다.
어쥬번트
본 발명의 다른 측면들은 한 가지 또는 그 이상의 어쥬번트와 조합으로, 본원에서 설명된 적어도 하나의 지카 바이러스로부터 한 가지 또는 그 이상의 항원을 내포하는 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물에 관계한다. 본 명세서의 이런 어쥬번트화된(adjuvanted) 백신 및/또는 면역원성 조성물은 치료가 필요한 인간 대상에서 지카 바이러스 감염을 치료하거나 예방하고 및/또는 치료가 필요한 인간 대상에서 지카 바이러스에 대한 면역 반응, 예컨대 보호 면역 반응을 유도하는데 유용할 수 있다.
백신에 대한 어쥬번트 효과를 달성하는 다양한 방법이 알려져 있고, 그리고 본원에서 개시된 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물과 함께 이용될 수 있다. 일반적인 원리와 방법은 “The Theory and Practical Application of Adjuvants", 1995, Duncan E. S. Stewart-Tull (ed.), John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6에서, 그리고 또한, "Vaccines: New Generation Immunological Adjuvants", 1995, Gregoriadis G 외. (eds.), Plenum Press, New York, ISBN 0-306-45283-9에서 상술된다.
일부 구체예들에서, 지카 바이러스 백신 또는 면역원성 조성물은 상기 항원들과 어쥬번트를 포함한다. 항원들은 적어도 하나의 어쥬번트와 혼합물로 존재할 수 있는데, 약 10:1 내지 약 1010:1의 중량-기반 비율의 항원:어쥬번트, 가령, 약 10:1 내지 약 100:1, 약 100:1 내지 약 103:1, 약 103:1 내지 약 104:1, 약 104:1 내지 약 105:1, 약 105:1 내지 약 106:1, 약 106:1 내지 약 107:1, 약 107:1 내지 약 108:1, 약 108:1 내지 약 109:1, 또는 약 109:1 내지 약 1010:1의 중량-기반 비율의 항원:어쥬번트일 수 있다. 당업자는 최적의 비율을 결정하기 위해, 어쥬번트 및 일상적인 실험에 관한 정보를 통해 적절한 비율을 쉽게 결정할 수 있다.
예시적인 어쥬번트는 알루미늄 염, 인산칼슘, 톨-유사 수용체 (TLR) 효현제, 모노포스포릴 지질 A (MLA), MLA 유도체, 합성 지질 A, 지질 A 모방체 또는 유사체, 사이토킨, 사포닌, 무라밀 디펩티드 (MDP) 유도체, CpG 올리고, 그람-음성균의 지질다당류 (LPS), 폴리포스파젠, 에멀션 (오일 에멀션), 키토산, 비타민 D, 스테아릴 또는 옥타데실 티로신, 비로솜, 카클리어트, 폴리(락티드-코-글리콜리드) (PLG) 마이크로입자, 폴록사머 입자, 마이크로입자, 리포솜, 완전한 프로인드 어쥬번트 (CFA), 그리고 불완전 프로인드 어쥬번트 (IFA)를 포함할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 일부 구체예들에서, 상기 어쥬번트는 알루미늄 염이다.
일부 구체예들에서, 상기 어쥬번트는 백반, 인산알루미늄, 수산화알루미늄, 황산알루미늄칼륨 및 알하이드로겔 85중 적어도 하나를 포함한다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 알루미늄 염 어쥬번트는 본 발명의 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물의 항원의 흡착을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 일부 구체예들에서, 항원 중에서 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100%가 알루미늄 염 어쥬번트에 흡착된다.
일부 구체예들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 약 100μg 내지 약 600μg, 약 100μg 내지 약 500μg, 약 125μg 내지 약 500μg, 약 150μg 내지 약 500μg, 약 175μg 내지 약 500μg, 약 100μg 내지 약 450μg, 약 125μg 내지 약 450μg, 약 150μg 내지 약 450μg, 약 175μg 내지 약 450μg, 약 100μg 내지 약 400μg, 약 125μg 내지 약 400μg, 약 150μg 내지 약 400μg, 약 175μg 내지 약 400μg, 약 100μg 내지 약 350μg, 약 125μg 내지 약 350μg, 약 150μg 내지 약 350μg, 약 175μg 내지 약 350μg, 약 100μg 내지 약 300μg, 약 125μg 내지 약 300μg, 약 150μg 내지 약 300μg, 약 175μg 내지 약 300μg, 약 100μg 내지 약 250μg, 약 125μg 내지 약 250μg, 약 150μg 내지 약 250μg, 약 175μg 내지 약 250μg, 약 100μg 내지 약 225μg, 약 125μg 내지 약 225μg, 약 150μg 내지 약 225μg, 약 175μg 내지 약 225μg, 또는 약 200μg의 알루미늄 염 어쥬번트 (가령, 백반)을 함유한다. 일부 구체예들에서 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 약 100μg 내지 약 600μg, 약 100μg 내지 약 300μg 또는 약 150μg 내지 약 250μg 또는 약 200μg의 알루미늄 염 어쥬번트 (가령, 백반 이를 테면 수산화 알루미늄)를 함유한다.
일부 구체예들에서, 상기 백신 및/또는 면역원성 조성물은 1μg 내지 15μg, 또는 2μg, 5μg 또는 10μg 투여량의 정제된 비활성화된 온전체 지카 바이러스, 한 가지 또는 그 이상의 어쥬번트, 이를 테면 이를 테면 100　μg 내지 약 600μg 또는 약 150μg 내지 약 250μg 또는 약 200μg 백반, 이를 테면 수산화 알루미늄과 조합으로, 본원에서 설명된 바와 같이 서열 번호: 1의 위치 98에서 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 트립토판에서 글리신으로 치환인 돌연변이를 갖는 지카 바이러스를 함유한다.
일부 구체예들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 하나 또는 그 이상의 어쥬번트, 이를 테면 100μg 내지 약 600μg 또는 약 150μg 내지 약 250μg 또는 약 200μg 백반, 이를 테면 수산화 알루미늄과 복합하여, 에서열 번호:1의 위치 98 또는 서열 번호:1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는 정제된 비활성화된 온전체 지카 바이러스를 1μg 내지 15μg, 또는 2μg, 5μg 또는 10μg 투여량으로 함유하고, 이때 상기 지카 바이러스는 계열 PRVABC59로부터 유래된다.
일부 구체예들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 하나 또는 그 이상의 어쥬번트, 이를 테면 100μg 내지 약 600μg 또는 약 150μg 내지 약 250μg 또는 약 200μg 백반, 이를 테면 수산화 알루미늄과 복합하여, 에서열 번호:1의 위치 98 또는 서열 번호:1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는 정제된 비활성화된 온전체 지카 바이러스를 1μg 내지 15μg, 또는 2μg, 5μg 또는 10μg 투여량으로 함유하고, 이때 상기 지카 바이러스는 서열 번호: 2에 따른 게놈 서열을 포함하는 계열 PRVABC59로부터 유래된다.
일부 구체예들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 하나 또는 그 이상의 어쥬번트, 이를 테면 100μg 내지 약 600μg 또는 약 150μg 내지 약 250μg 또는 약 200μg 백반, 이를 테면 수산화 알루미늄과 복합하여, 에서열 번호:1의 위치 98 또는 서열 번호:1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는 정제된 비활성화된, 플라크 정제된 온전체 지카 바이러스를 1μg 내지 15μg, 또는 2μg, 5μg 또는 10μg 투여량으로 함유하고, 이때 상기 지카 바이러스는 서열 번호: 2에 따른 게놈 서열을 포함하는 계열 PRVABC59로부터 유래된다.
본 명세서의 특정 구체예는 어쥬번트화된(adjuvanted) 지카 바이러스 백신 또는 면역원성 조성물을 제조하기 위한 방법을 포함하고, 상기 방법은 (a) 백신 또는 면역원성 조성물을 알루미늄 염 어쥬번트와 혼합하되, 상기 백신 또는 면역원성 조성물이 본원에서 설명된 적어도 하나의 지카 바이러스로부터 한 가지 또는 그 이상의 항원을 포함하는 단계, 그리고 (b) 혼합물을 적합한 조건 하에 약 1 시간 내지 약 24 시간 (예를 들면, 약 16 시간 내지 약 24 시간)의 범위에서 변하는 기간 동안 항온처리하는 단계를 수반하는데, 상기 항원 중에서 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100%가 알루미늄 염 어쥬번트에 흡착된다. 상기 방법의 특정 구체예들에서, 적어도 하나의 지카 바이러스는 비-인간 세포 적응 돌연변이 (예를 들면, 단백질 NS1에서 비-인간 세포 적응 돌연변이, 예컨대 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는 지카 바이러스이다.
상기 방법의 일부 구체예들에서, 상기 혼합물은 약 2℃ 내지 약 8℃범위의 온도에서 배양된다. 상기 방법의 일부 구체예들에서, 상기 혼합물은 당업계에 공지된 임의의 적합한 믹서를 사용하여 일정한 혼합 하에서 배양된다. 상기 방법의 일부 구체예들에서, 상기 혼합물은 약 6.5 내지 약 8.5, 약 6.5 내지 약 8, 약 6.8 내지 약 7.8, 약 6.9 내지 약 7.6, 약 7 내지 약 7.5, 약 6.8 내지 약 8.5, 약 6.9 내지 약 8.5, 또는 약 7 내지 약 8.5 값 범위의 pH에서 배양된다. 특정 바람직한 구체예들에서, 상기 혼합물은 중성 pH에서 배양된다. 상기 방법의 일부 구체예들에서, 상기 알루미늄 염 어쥬번트는 백반, 인산알루미늄, 수산화알루미늄, 황산알루미늄칼륨 및 알하이드로겔 85에서 선택된다.
살모넬라(Salmonella)로부터의 지질 A의 비-독성 유도체인 모노포스포릴 지질 A (MLA)는 백신 어쥬번트로서 개발된 강력한 TLR-4 효현제이다(Evans 외. (2003) Expert Rev. Vaccines 2(2): 219-229). 전임상 뮤린(murine) 연구에서 비강내 MLA는 전신, 체액성 반응 뿐만 아니라 분비를 향상시키는 것으로 나타났다 (Baldridge 외. (2000) Vaccine 18(22): 2416-2425; Yang 외. (2002) Infect. Immun. 70(7): 3557-3565). 또한 120,000 명 이상의 환자를 대상으로 한 임상 연구에서 백신 어쥬번트로서 안전하고, 효과적임이 입증되었다(Baldrick 외. (2002) Regul. Toxicol. Pharmacol. 35(3): 398-413; Baldrick 외. (2004) J. Appl. Toxicol. 24(4): 261-268). MLA는 TLR-4 수용체를 통해 선천성 면역의 유도를 자극하여 그람 음성 및 그람 양성 박테리아, 바이러스 및 기생충을 포함한 광범위한 감염성 병원체에 대한 비특이적 면역 반응을 유발할 수 있다 (Baldrick 외. (2004) J. Appl. Toxicol. 24(4): 261-268; Persing 외. (2002) Trends Microbiol. 10(10 Suppl): S32-37). 비강 내 제형에 MLA를 포함시키면, 선천적 반응의 신속한 유도를 제공하여, 바이러스 공격으로부터 비특이적 면역 반응을 유도하면서, 백신의 항원 성분에 의해 생성된 특이적 반응을 향상시켜야 한다.
따라서, 한 구체예에서, 본 명세서는 개작성 및 선천성 면역의 증강제로서 모노포스포릴 지질 A (MLA), 3 De-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A (3D-MLA) 또는 이의 유도체를 포함하는 조성물을 제공한다. 화학적으로 3D-MLA는 3 개의 De-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A와 4, 5 또는 6 개의 아실화된 사슬의 혼합물이다. 3 De-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A의 바람직한 형태는 유럽 특허 0 689 454 B1 (SmithKline Beecham Biologicals SA)에 개시되어 있다. 또다른 구체예에서, 본 명세서는 합성 지질 A, 지질 A 모방체 또는 유사체, 예컨대 BioMira의 PET 지질 A, 또는 TLR-4 효현제와 같이 기능하도록 설계된 합성 유도체를 포함하는 조성물을 제공한다.
추가 예시적인 어쥬번트는 폴리펩티드 성분과의 공동-발현, 또는 폴리펩티드 성분과의 융합에 의해 본원에 기재된 항원에 용이하게 첨가되어 키메라(chimeric) 폴리펩티드를 생성할 수 있는 폴리펩티드 어쥬번트를 포함한다. 편모(flagella)의 주요 단백질 성분인 박테리아성 플라겔린(flagellin)은 톨-유사 수용체 TLR5에 의한 선천성 면역계에 의한 인식으로 인해, 어쥬번트 단백질로서 주목을 받고 있는 어쥬번트이다. TLR5를 통한 플라겔린 신호 전달은 대식세포, 호중구 및 장내 상피 세포의 활성화 뿐만 아니라 DC 성숙(maturation) 및 이동을 유도함으로써, 선천성 및 개작성 면역 기능 모두에 영향을 미치며, 전-염증성 매개체의 생성을 초래한다.
TLR5는 플라겔린 단백질에 고유하고, 편모 기능에 필요한 이 단량체 내에서 보존된 구조를 인지하여, 면역원성 압박에 반응하는 돌연변이를 방해한다. 상기 수용체는 100fM 농도에 민감하지만, 무손상(intact) 필라멘트를 인지하지 못한다. 결합 및 자극에는 단량체로의 편모 분해가 필요하다.
어쥬번트로서, 플라겔린은 비경구 또는 비강내 투여된 이종성(heterologous) 항원에 대한 보호 반응의 유도를 위한 강력한 활성을 가지며, DNA 백신에 대한 어쥬번트 효과도 또한 보고되었다. 인플루엔자와 같은 호흡기 바이러스에 적합하지만, 플라겔린이 사용될 때 Th2 편향이 관찰되고, 마우스 또는 원숭이에서 IgE 유도에 대한 증거는 관찰되지 않았다. 또한, 원숭이에서 비강 내 또는 전신 투여 후, 국소 또는 전신 염증 반응은 보고되지 않았다. 플라겔린을 사용한 후에 유도된 반응의 Th2 특성은 MyD88-의존적 방식으로 TLR5를 통한 플라겔린 신호 및 TLRs을 통한 다른 모든 MyD88-의존적 신호가 Th1 편향을 초래하는 것으로 나타났기 때문에, 다소 놀랍다. 중요한 것은, 플라겔린에 대한 기존-항체는 어쥬번트 효능에 뚜렷한 영향을 미치지 않고, 이에 의해 다중 사용-어쥬번트로서 매력적이다.
많은 최근의 비강내 백신 시험에서 공통적인 주제는 백신 효능을 향상시키기 위해 어쥬번트 및/또는 전달 시스템의 사용이다. 이러한 연구중 하나에서, 유 전적으로 해독된 대장균(E. coli) 열-불안정성 장독소 어쥬번트(LT R192G)를 함유하는 인플루엔자 H3 백신은 비강 내 전달 후, 만 H5 공격접종에 대항하여 이종성아형(heterosubtypic) 보호를 초래하였다. 보호는 교차 중화 항체의 유도에 기초하고, 새로운 백신의 개발에서 비강내 경로에 대한 중요한 의미를 나타냈다.
사이토킨, 콜로니-자극 인자 (예를 들어, GM-CSF, CSF 및 이와 유사한 것들); 종양 괴사 인자; 인터루킨-2, 인터루킨-7, 인터루킨-12, 인터페론 및 다른 유사한 성장 인자들은 또한 폴리펩티드 성분과의 혼합 또는 융합에 의해 지카 바이러스 백신 또는 면역원성 조성물에 용이하게 포함될 수 있기 때문에 어쥬번트로서 사용될 수 있다.
일부 구체예들에서, 본 명세서에서 개시된 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물은 톨-유사 수용체를 통하여 작용할 수 있는 다른 어쥬번트, 이를 테면 5'-TCG-3' 서열을 포함하는 핵산 TLR9 리간드; 이미다조퀴놀린 TLR7 리간드; 치환된 구아닌 TLR7/8 리간드; 다른 TLR7 리간드 이를 테면 록소리빈(Loxoribine), 7-데아자데옥시구나오신, 7-티아-8-옥소데옥시구아노신, 이미퀴모드(Imiquimod) (R-837), 그리고 레시퀴모드(Resiquimod) (R-848)를 포함할 수 있다.
특정 어쥬번트는 수지상 세포와 같은 APCs에 의한 백신 분자의 흡수를 촉진하고, 이들을 활성화시킨다. 비-제한적인 예들은 면역 표적화 어쥬번트; 면역 조절 어쥬번트, 이를 테면, 독소, 사이토킨 및 마이코박테리아 유도체; 오일 제형; 중합체; 미셀(micelle) 형성 어쥬번트; 사포닌; 면역 자극 복합체 매트릭스 (ISCOM 매트릭스); 입자; DDA; 알루미늄 어쥬번트; DNA 어쥬번트; MLA; 및 캡슐화 어쥬번트로 구성된 군에서 선택된다.
어쥬번트의 추가 실시예는 물질, 이를 테면 알루미늄 염, 이를 테면 수산화 또는 인산화 알루미늄염 (백반)을 포함하며 완충된 염수에서 0.05 내지 0.1% 용액으로 흔히 이용되며(가령, Nicklas (1992) Res. Immunol. 143:489-493 참고), 0.25% 용액으로 이용되는 당의 합성 중합체 (가령 Carbopol®)와의 혼합물, 70℃ 내지 101℃ 범위 온도에서 30 초 내지 2 분 기간 동안 열 처리에 의해 백신 안에 단백질의 응집, 그리고 가교제 수잔을 이용한 응집 또한 가능하다. 알부민에 대한 펩신 처리된 항체 (Fab 단편들)에 의한 재활성화, C. 파르붐(parvum)과 같은 박테리아 세포, 또는 내독소 또는 그람-음성 박테리아의 리포폴리사카라이드 성분과의 혼합물, 생리적으로 허용되는 오일 비히클, 예를 들어, 만니드 모노-올레에이트 (Aracel A)의 에멀젼, 또는 블록 대체물로서 사용된 퍼플루오로카본 (Fluosol-DA)의 20% 용액을 갖는 에멀젼이 또한 사용될 수 있다. 스쿠알렌 및 IFA와 같은 오일과의 혼합물이 또한 사용될 수 있다.
DDA (디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드)는 어쥬번트의 흥미로운 후보이지만, 프로인드의 완전 및 불완전 어쥬번트, 뿐만 아니라 QuilA 및 QS21과 같은 퀼라야 사포닌(quillaja saponin)도 흥미롭다. 추가 가능성은 모노포스포릴 지질 A (MLA), 뮤라밀 디펩티드 (MDP) 및 트레오닐 뮤라밀 디펩티드 (tMDP)와 같은 리포폴리사카라이드의 폴리 [디(카르복시토페녹시)포스파젠 (PCPP) 유도체를 포함하는 것이다. 3-de-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A와 같은 모노포스포릴 지질 A와 알루미늄 염의 조합을 포함하는 리포폴리사카라이드 기반의 어쥬번트는 또한 예를 들어, 주로 Th1-유형 반응을 생성하는데 사용될 수 있다.
리포좀 제형은 또한 어쥬번트 효과를 부여하는 것으로도 알려져 있고, 따라서 리포좀 어쥬번트는 상기 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물과 병용 이용될 수 있다.
면역 자극 복합 매트릭스 유형 (ISCOM®매트릭스) 어쥬번트는 또한 지카 바이러스 백신 항원 및 면역원성 조성물과 함께 사용될 수 있는데, 특히 그 이유는 이러한 유형의 어쥬번트는 APCs에 의해 MHC 클래스 II 발현을 상향-조절할 수 있는 것으로 밝혀졌기 때문이다. ISCOM 매트릭스는 퀼라야 사포나리아의 사포닌 (트리테르페노이드), 콜레스테롤 및 인지질로 구성된다(선택적으로 분별된). 상기 면역원성 단백질, 이를 테면 상기 지카 바이러스 백신 또는 면역원성 조성물 항원들과 혼합될 때, 생성된 입자 제형은 ISCOM 입자로 알려져 있고, 이때 사포닌이 60-70% w/w, 콜레스테롤 및 인지질 10-15%w/w, 단백질이 10-15% w/w로 구성될 수 있다. 조성물 및 면역자극 복합체의 이용에 관한 상세는 예를 들면, 어쥬번트를 다루는 상기 언급된 텍스트-북에서 찾아볼 수 있고, Morein B 외. (1995) Clin. Immunother. 3: 461-475 뿐만 아니라 Barr I G and Mitchell G F (1996) Immunol. 및 Cell Biol. 74: 8-25는 완전한 면역자극 복합체의 준비를 위한 유용한 지침을 제공한다.
본원에 개시된 지카 바이러스 백신 및 면역원성 조성물과의 어쥬번트 조합으로 사용될 수 있는 이소콤(iscoms) 형태의 여부에 관계없이, 사포닌은 Quil A로 명명된 퀼라자 사포나 리아 몰리나 (Quillaja Saponaria Molina)의 껍질로부터 유도된 것들 및 그의 분획을 포함하며, 이는 U.S. 특허 번호. 5,057,540 및 "Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R. (1996)Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 12 (1-2):1-55; 그리고 EP 0 362 279 B1에 기술되어 있다. Quil A의 예시적인 분획들은 QS21, QS7, 그리고 QS17이다.
β-에신(Escin)은 상기 지카 바이러스 백신 및/또는 면역학적 조성물의 어쥬번트 조성물에 이용될 수 있는 또다른 용혈성(hemolytic) 사포닌이다. 에신(Escin)은 Merck index (12th ed: entry 3737)에 말 밤나무 씨앗 Lat:아에스쿨루 히포카스타눔(Aesculus hippocastanum)의 종에서 발생하는 사포닌의 혼합물로 설명되어 있다. 이의 단리는 크로마토그래피 및 정제 (Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4, 213 (1953)) 및 이온-교환 수지 (Erbring 외, 미국 특허 3,238,190)에 의해 기술된다. 에신 분획이 정제되어 생물학적으로 활성인 것으로 나타났다(Yoshikawa M, 외. (Chem Pharm Bull (Tokyo) 1996 August; 44(8):1454-1464)). β-에신은 또한 아에신(aescin)으로도 알려져 있다.
상기 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물에 사용을 위한 또다른 용혈성 사포닌은 디지토닌(Digitonin)이다. 디지토닌은 Merck index (12th Edition, entry 3204)에 사포닌으로 기술되어 있으며, 디지탈리스 푸르푸레아(Digitalis purpurea)의 씨앗으로부터 유래되며, Gisvold 외. (1934) J.Am.Pharm.Assoc. 23: 664; 그리고 Ruhenstroth-Bauer (1955)Physiol.Chem., 301, 621에서 기술된 절차에 따라 정제된다. 이의 사용은 콜레스테롤 측정을 위한 임상 시약으로 설명되어 있다.
어쥬번트 효과를 달성할 수 있는 또 다른 흥미로운 가능성은 Gosselin 외, 1992에 설명된 기술을 사용하는 것이다. 간단히 말하면, 본 명세서의 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물에서 항원과 같은 관련 항원의 제시는 단핵구/대식세포 상에 Fc 수용체들에 대항하여 상기 항원을 항체(또는 항원 결합 항체 단편들)에 접합시킴으로써 강화될 수 있다. 특히 항원과 항-FCRI 사이의 접합체는 백신 접종의 목적으로 면역원성을 향상시키는 것으로 입증되었다. 상기 항체는 지카 바이러스 백신 또는 면역원성 조성물 항원의 폴리펩티드 성분 중 어느 하나에 대한 융합체로서 발현시키는 것을 포함하여 생성 후 또는 생성의 일부로서, 지카 바이러스 백신 또는 면역원성 조성물 항원에 접합될 수 있다. 다른 가능성은 표적화 및 면역 조절 물질 (가령, 사이토킨)의 사용을 포함한다. 또한, 폴리 I:C와 같은 사이토킨의 합성 유도제가 또한 사용될 수 있다.
적합한 미코박테리아 유도체는 뮤라밀 디펩티드, 완전 프로인드 어쥬번트, RIBI (Ribi ImmunoChem Research Inc., Hamilton, Mont.) 및 트레할로스의 디에스테르, 예컨대 TDM 및 TDE로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
적합한 면역표적화 어쥬번트의 예는 CD40 리간드 및 CD40 항체 또는 이의 특이적으로 결합하는 단편 (상기 논의 참조), 만노스, Fab 단편 및 CTLA-4를 포함한다.
적합한 중합체 어쥬번트의 예는 탄수화물, 예컨대 덱스트란, PEG, 전분, 만난 및 만노스; 가소성(plastic) 폴리머; 라텍스 비드와 같은 라텍스를 포함한다.
면역 반응을 조절하는 또 다른 흥미로운 방법은 "가상 림프절 (virtual lymph node)"(VLN) (ImmunoTherapy, Inc., 360 Lexington Avenue, New York, N.Y. 10017-6501에 의해 개발된 독점적 의료 장치에 면역원 (선택적으로 어쥬번트 및 제약학적으로 허용되는 담체 및 비히클과 함께)을 포함시키는 것이다. VLN (얇은 관형 장치)은 림프절의 구조와 기능을 모방한다. 피부 아래에 VLN을 삽입하면 사이토킨 및 케모카인의 급증으로 멸균 염증 부위가 생성된다. T-세포 및 B-세포 뿐만 아니라 APCs는 염증 부위로 향하는 위험 신호에 신속하게 반응하여, VLN의 다공성 매트릭스 내부에 축적된다. VLN을 사용하는 경우 항원에 대한 면역 반응을 일으키는데 필요한 항원 용량이 감소되고, VLN을 사용한 백신 접종에 의한 면역 보호가 어쥬번트로서 Ribi를 사용하여 종래의 면역을 능가하는 것으로 나타났다. 상기 기술은 Gelber C 외., 1998, "Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Small Amounts of Immunogens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Node", in: "From the Laboratory to the Clinic, Book of Abstracts, Oct. 12-15, 1998, Seascape Resort, Aptos, Calif."에서 간략하게 기술된다.
올리고뉴클레오티드는 상기 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물 항원들과 병용하여 어쥬번트로 이용될 수 있고, 적어도 3개 또는 그 이상 또는 심지어 적어도 6개 또는 그 이상의 뉴클레오티드에 의해 분리된 2개 또는 그 이상의 디뉴클레오티드 CpG를 함유할 수 있다. CpG-함유 올리고뉴클레오티드 (이때 CpG 디뉴클레오티드는 메틸화안됨)는 대부분 Th1 반응을 유도한다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 잘 공지되어 있으며, 예를 들면, WO 96/02555, WO 99/33488 및 U.S. 특허 번호. 6,008,200 그리고 5,856,462에서 기술된다.
이러한 올리고뉴클레오티드 어쥬번트는 데옥시뉴클레오티드일 수 있다. 특정 구체예들에서, 올리고뉴클레오티드에서 뉴클레오티드 골격은 포스포로디티오에이트 또는 포스포로티오에이트 결합이지만, 포스포디에스테르 및 다른 골격 연결을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 PNA와 같은 다른 뉴클레오티드 골격이 또한 사용될 수 있다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 또는 포스포로디티오 에이트의 제조 방법은 U.S. 특허 번호. 5,666,153, U.S. 특허 번호. 5,278,302 및 WO 95/26204에 기술된다.
예시적인 올리고뉴클레오티드는 다음의 서열을 갖는다. 상기 서열은 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오티드 골격을 함유할 수 있다:
(서열 번호: 3) OLIGO 1: TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826);
(서열 번호: 4) OLIGO 2: TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758);
(서열 번호: 5) OLIGO 3: ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG;
(서열 번호: 6) OLIGO 4: TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006); 및
(서열 번호: 7) OLIGO 5: TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)
대체 CpG 올리고뉴클레오티드는 불필요한 결손 또는 부가와 함께 상기 서열을 포함한다. 어쥬번트로써 CpG 올리고뉴클레오티드는 당분야에 공지된 임의의 방법 (가령, EP 468520)으로 합성될 수 있다. 예를 들면, 이러한 올리고뉴클레오티드는 자동화된 합성기를 이용하여 합성될 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드 어쥬번트의 길이는 10-50개 염기 범위 안에 있을 수 있다. 또다른 어쥬번트 시스템은 CpG-함유 올리고뉴클레오티드 및 사포닌 유도체의 조합, 특히 CpG와 QS21의 조합은 WO 00/09159에 개시되어 있다.
많은 단일 또는 다중상(multiphase) 에멀젼 시스템이 설명되었다. 당업자는 이러한 에멀젼이 항원의 구조를 방해하지 않도록 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물 항원과 함께 사용하기 위해 이러한 에멀젼 시스템을 용이하게 적용할 수 있다. 수중유 에멀젼 어쥬번트는 그 자체로 어쥬번트 조성물로서 유용한 것으로 제안되었으며 (EP 399 843B), 또한 수중유 에멀젼 및 다른 활성제의 조합은 백신에 대한 어쥬번트로서 기재되어 있다 (WO 95/17210; WO 98/56414; WO 99/12565; WO 99/11241). 다른 오일 에멀젼 어쥬번트, 예를 들어, 오일 에멀젼 (미국 특허 번호 5,422,109; EP 0 480 982 B2) 및 수중유수(water in oil in water) 에멀젼과 같은 다른 오일 에멀젼 어쥬번트가 설명되었다(U.S. 특허 번호. 5,424,067; EP 0 480 981 B).
본원에 기술된 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물과 함께 사용하기 위한 오일 에멀젼 어쥬번트는 천연 또는 합성일 수 있고, 미네랄 또는 유기일 수 있다. 미네랄 및 유기 오일의 예는 당업자에게 명백할 것이다.
수중유 조성물이 인간 투여에 적합하도록 하기 위해, 에멀젼 시스템의 유상은 대사가능한 오일을 포함할 수 있다. 대사가능한 오일이라는 용어의 의미는 당업계에 잘 알려져 있다. 대사가능한이란 "대사에 의해 변형될 수 있는 것"으로 정의될 수 있다 (Dorland's Illustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 25th edition (1974)). 오일은 수용자에게 유독하지 않고, 신진대사에 의해 변형될 수 있는 임의의 식물성 오일, 어유(fish oil), 동물성 오일 또는 합성 오일일 수 있다. 견과류 (땅콩 기름과 같은), 씨앗 및 곡물은 식물성 기름의 일반적인 공급원이다. 합성 오일이 또한 사용될 수 있으며, NEOBEE®및 기타와 같은 상업적으로 이용가능한 오일을 포함할 수 있다. 스쿠알렌 (2,6,10,15,19,23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22-테트라코사헥사엔)은 불포화 오일이며, 상어-간 기름에서 대량으로 발견되며, 올리브 오일, 밀 배아 오일, 쌀겨 오일 및 효모에서는 더 적은 양으로 제공되며, 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물과 함께 사용될 수 있다. 스쿠알렌은 콜레스테롤의 생합성에서 중간체(intermediate)라는 사실 때문에 대사 가능한 오일이다(Merck index, 10th Edition, entry no.8619).
예시적인 오일 에멀젼은 수중유 에멀젼, 특히 수중 에멀젼의 스쿠알렌이다.
또한, 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물과 함께 사용하기 위한 오일 에멀젼 어쥬번트는 오일 α-토코페롤(비타민 E, EP 0 382 271 B1)과 같은 항산화제를 포함할 수 있다.
WO 95/17210 및 WO 99/11241은 임의로 면역 자극제 QS21 및/또는 3D-MLA와 함께 제형화된, 스쿠알렌, α-토코페롤 및 TWEEN 80 (TM)에 기초한 에멀젼 보조제를 개시한다. WO 99/12565는 오일 상(phase)에 스테롤을 첨가함으로써, 이들 스쿠알렌 에멀젼의 개선을 개시하고 있다. 추가로, 에멀젼을 안정화시키기 위해, 트리카프릴린 (C27H50O6)과 같은 트리글리세리드가 오일 상에 첨가될 수 있다 (WO 98/56414).
안정한 수중유 에멀젼 내에서 발견되는 오일 방울의 크기는 1 미크론(micron) 미만일 수 있고, 실질적으로 직경이 30-600 nm, 실질적으로 대략 30-500 nm, 또는 실질적으로 150-500 nm의 범위일 수 있고, 특히 광자 상관 분광법(photon correlation spectroscopy)에 의해 측정시 직경이 약 150 nm일 수 있다. 이와 관련하여, 숫자로(by number) 오일 방울의 80%는 이들 범위 내에 있을 수 있고, 번호로 오일 방울의 90% 초과 또는 95% 초과는 정의된 크기 범위 내에 있다. 오일 에멀젼에 존재하는 성분의 양은 통상적으로 스쿠알렌과 같은 오일의 2 내지 10% 범위; 존재하는 경우 2 내지 10%의 알파 토코페롤; 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트와 같은 0.3 내지 3%의 계면 활성제 안에 있다. 오일:알파 토코페롤의 비율은 보다 안정한 에멀젼을 제공하기 때문에 1에 대등하거나, 또는 미만일 수 있다. SPAN 85 (TM)는 또한 약 1%의 수준으로 존재할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물은 안정화제를 추가로 함유하는 것이 유리할 수 있다.
수중유 에멀젼의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 일반적으로, 상기 방법은 오일 상을 PBS/TWEEN80®용액과 같은 계면 활성제와 혼합한 후, 균질화기를 사용하여 균질화하는 단계를 포함하며, 당업자에게 혼합물을 주사기 바늘을 통하여 두 번 통과시키는 방법이 소량의 액체를 균질화하는데 적합할 것이라는 것은 명백할 것이다. 마찬가지로, 미세유동화기(microfluidizer) (M110S 미세유체 기계, 최대 50 회 통과, 최대 6 바(bar)의 진입 압력(약 850 바(bar)의 진출 압력)에서 2 분 동안)의 유화 공정은 더 작거나 많은 양의 에멀젼을 만들기 위하여 당업자가 용이하게 조정할 수 있다. 이러한 개작(adaptation)은 조제물이 필요한 직경의 오일 비말(droplets)을 얻을 때까지 생성된 에멀젼의 계측을 포함하는 일상적인 실험에 의해 달성될 수 있다.
대안으로 상기 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물은 키토산 (상기 기재된 바와 같은) 또는 다른 폴리양이온성 중합체, 폴리락티드와 폴리락티드-코글리콜라이드 입자, 폴리-N-아세틸 글루코사민-기반 중합체 매트릭스, 다당류 또는 화학적으로 변형된 다당류로 구성된 입자, 리포좀 및 지질-기반의 입자, 글리세롤 모노에스테르 등으로 구성된 입자로 구성된 백신 비이클과 복합될 수 있다. 상기 사포닌은 또한 콜레스테롤의 존재 하에 제형화되어 리포좀 또는 ISCOMs과 같은 입자 구조를 형성할 수 있다. 더욱이, 사포닌은 비-입자 용액 또는 현탁액, 또는 파우클라멜라(paucilamelar) 리포좀 또는 ISCOM과 같은 입자 구조로 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 에스테르와 함께 제형화될 수 있다.
본원에 기술된 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물에 사용하기 위한 추가의 예시적인 어쥬번트는 다음을 포함한다:SAF (Chiron, Calif., United States), MF-59 (Chiron, 가령, Granoff 외. (1997) Infect Immun. 65 (5):1710-1715 참고), SBAS 시리즈 어쥬번트 (가령, SB-AS2 (MLA 및 QS21을 함유하는 수중유 에멀젼); SBAS-4 (백반 및 MLA을 함유하는 어쥬번트 시스템), SmithKline Beecham, Rixensart, Belgium에서 이용가능), Detox (Enhanzyn®(GlaxoSmithKline), RC-512, RC-522, RC-527, RC-529, RC-544, 그리고 RC-560 (GlaxoSmithKline) 및 기타 아미노알킬 글루코사미니드 4-포스페이트 (AGPs), 이를 테면 계류중인 U.S. 특허 출원 일련 번호 08/853,826 및 09/074,720에서 기술된 것들.
다른 예시적인 어쥬번트에는 다음을 포함하나, 이에 국한되지 않는다: Hunter의 TiterMax®어쥬번트 (CytRx Corp., Norcross, Ga.); Gerbu 어쥬번트 (Gerbu Biotechnik GmbH, Gaiberg, Germany); 니트로셀룰로오스 (Nilsson and Larsson (1992) Res. Immunol. 143:553-557); 백반 (가령, 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄) 미네랄 오일, 비-미네랄 오일, 유중수 또는 수중유 에멀젼을 포함한 에멀젼 기반 제형, 이를 테면 Seppic ISA 시리즈의 Montamide 어쥬번트 (가령, ISA-51, ISA-57, ISA-720, ISA-151, 등; Seppic, Paris, France); 그리고 PROVAX®(IDEC Pharmaceuticals); OM-174 (지질 A와 관련된 글루코사민 이당류); Leishmania 신장 인자; 미셀을 형성하는 비-이온성 블록 공중합체, 이를 테면 CRL 1005; 그리고 Syntex 어쥬번트 제형. 가령, O'Hagan 외. (2001) Biomol Eng. 18(3):69-85; 그리고 "Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols" D. O'Hagan, ed. (2000) Humana Press 참고.
다른 예시적인 어쥬번트에는 하기 일반식의 어쥬번트 분자가 포함된다: HO(CH2CH2O)n-A-R, (I) 이때, n은 1-50이며, A는 결합이거나 또는 --C(O)--이며, R은 C1-50 알킬 또는 페닐 C1-50 알킬이다.
한 구체예는 일반식(I)의 폴리옥시에틸렌 에테르를 포함하는 백신 제형으로 구성되는데, 이때 n은 1 내지 50, 4-24, 또는 9이며; R 성분은 C1-50, C4-C20 알킬, 또는 C12 알킬이며, 그리고 A는 결합이다. 폴리옥시에틸렌 에테르의 농도는 0.1-20% 범위, 0.1-10%, 또는 0.1-1% 범위 안에 있어야 한다. 예시적인 폴리옥시에틸렌 에테르는 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-9-스테오릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-8-스테오릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-4-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-35-라우릴 에테르, 그리고 폴리옥시에틸렌-23-라우릴 에테르의 군에서 선택된다. 폴리옥시에틸렌 에테르 이를 테면, 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르는 Merck index (12th edition: 앤트리 7717)에 기술되어 있다. 이들 어쥬번트 분자는 WO 99/52549에 기술된다.
상기 일반식(I)에 따른 폴리옥시에틸렌 에테르는 바람직한 경우, 또다른 어쥬번트와 복합된다. 예를 들면, 어쥬번트 조합은 상기와 같이 CpG를 함유할 수 있다.
지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물에 사용하는데 적합한 제약학적으로 수용가능한 부형제들의 추가 예로는 물, 인산염 완충된 염수, 등장성 완충액을 포함한다.
바이러스 정제
본 발명의 추가 측면들은 지카 바이러스를 정제하는 방법에 관계한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 복수의 세포를 지카 바이러스의 집단을 내포하는 접종물로 접종하고, 그리고 접종된 세포 중에서 하나 또는 그 이상으로부터 지카 바이러스 클론 분리주를 플라크 정제에 의해 획득하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 비-인간 세포 (가령, 곤충 세포, 포유류 세포, 등)이다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 곤충 세포(예컨대, 본원에서 설명된 임의의 모기 세포/세포주)이다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 포유류 세포 (예컨대, 본 명세서에서 설명된 임의의 포유류 세포/세포주)이다. 일부 구체예들에서, 상기 포유류 세포는 원숭이 세포이다. 일부 구체예들에서, 상기 포유류 세포는 Vero 세포이다.
일부 구체예에서, 지카 바이러스의 집단은 이질성 (예를 들면, 2가지 또는 그 이상의 유전자형을 포함)이다. 적어도 하나의 뉴클레오티드에서 2가지 또는 그 이상의 유전자형은 서로 상이하다. 일부 구체예들에서, 지카 바이러스의 집단은 지카 바이러스 임상 분리주 (예를 들면, 계열 PRVABC59로부터) 및/또는 세포 배양 동안 이전에 계대된 하나 또는 그 이상의 지카 바이러스를 포함한다. 상기 지카 바이러스의 임상 분리주는 지카 바이러스에 감염된 환자의 표본로부터 획득된다.　 일부 구체예들에서, 플라크 정제 (예를 들면, 본원에서 설명된 바와 같은)는 이질성 바이러스 집단으로부터 (유전적으로 균질한) 클론 분리주의 실제적인 및/또는 완전한 분리를 허용한다. 일부 구체예들에서, 원숭이 세포는 VERO 세포주 (예를 들면, VERO 10-87 세포)로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 접종물은 인간 혈청을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 접종물은 한 가지 또는 그 이상의 외래성 오염인자 (예를 들면, 한 가지 또는 그 이상의 오염 바이러스)를 포함한다. 일부 구체예들에서, 플라크 정제 (예를 들면, 본원에서 설명된 바와 같은)는 한 가지 또는 그 이상의 외래성 오염인자로부터 멀리, (유전적으로 균질한) 클론 분리주의 실제적인 및/또는 완전한 정제를 허용한다.
일부 구체예들에서, 지카 바이러스 클론을 단리하고 및/또는 정제하기 위한 설명된 방법은 지카 바이러스 클론 분리주의 1회 또는 그 이상 (예를 들면, 1회 또는 그 이상, 2회 또는 그 이상, 3회 또는 그 이상, 4회 또는 그 이상, 5회 또는 그 이상 등)의 추가 플라크 정제를 포함한다. 일부 구체예들에서, 지카 바이러스 클론 분리주를 단리하고 및/또는 정제하기 위한 설명된 방법은 지카 바이러스 클론 분리주를 1회 또는 그 이상 (예를 들면, 1회 또는 그 이상, 2회 또는 그 이상, 3회 또는 그 이상, 4회 또는 그 이상, 5회 또는 그 이상 등) 세포 배양액에서 (예를 들면, 곤충 세포, 예컨대 모기 세포주에서 및/또는 포유류 세포, 예컨대 VERO 세포주에서) 계대하는 것을 포함한다.
본 발명의 추가 측면들은 백신 또는 면역원성 조성물의 제조를 위해 지카 바이러스를 정제하는 방법에 관계한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 하기 단계 중에서 하나 또는 그 이상 (예를 들면, 하나 또는 그 이상, 2개 또는 그 이상, 3개 또는 그 이상, 4개 또는 그 이상, 5개 또는 그 이상, 또는 6개)을 포함한다 (하기 순서를 비롯한 임의의 순서로): 지카 바이러스를 내포하는 표본 또는 조직표본의 심층 여과를 수행하는 단계; 완충제 교체하고 및/또는 지카 바이러스를 내포하는 표본을 희석하여 (예를 들면, 직교류 여과 (CFF)에 의해) 농축물을 생산하는 단계; 지카 바이러스를 포함하는 표본을 이온 교환 막 (예를 들면, 음이온 교환 막, 양이온 교환 막)에 결합시켜 결합된 분획물 (여기서 결합된 분획물은 지카 바이러스를 포함한다)을 생산하고, 그리고 결합된 분획물을 이온 교환 막으로부터 용리하는 단계; 지카 바이러스를 내포하는 표본을 본원에서 설명된 임의의 화학적 불활성화 물질의 유효량으로 처리하는 단계; 화학적으로 비활성화된 지카 바이러스를 내포하는 표본을 메타중아황산나트륨으로 중화하는 단계; 및/또는 화학적으로 비활성화된 지카 바이러스를 포함하는 중화된 표본을 정제하는 단계 (예를 들면, 직교류 여과 (CFF)에 의해). 일부 구체예들에서, 일부 구체예에서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 지카 바이러스를 내포하는 표본을 제 1 심층 필터에 통과시켜 제 1 용출물 (여기서 제 1 용출물은 지카 바이러스를 내포한다)을 생산하는 단계; (b) 완충제 교체하고 및/또는 제 1 용출물을 직교류 여과 (CFF)에 의해 희석하여 제 1 농축물 (여기서 제 1 농축물은 지카 바이러스를 내포한다)을 생산하는 단계; (c) 제 1 농축물을 이온 교환 막에 결합시켜 제 1 결합된 분획물 (여기서 제 1 결합된 분획물은 지카 바이러스를 내포한다)을 생산하고, 그리고 제 1 결합된 분획물을 이온 교환 막으로부터 용리하여 제 2 용출물 (여기서 제 2 용출물은 지카 바이러스를 내포한다)을 생산하는 단계; (d) 제 2 용출물을 제 2 심층 필터에 통과시켜 제 2 농축물 (여기서 제 2 농축물은 지카 바이러스를 내포한다)을 생산하는 단계; (e) 제 2 농축물을 화학적 불활성화 물질의 유효량으로 처리하는 단계; (f) 처리된 제 2 농축물을 메타중아황산나트륨으로 중화하는 단계; 그리고 (g) 중화된 제 2 농축물을 직교류 여과 (CFF)에 의해 정제하는 단계.
심층 필터는 Bio 20 SEITZ®심층 필터 시트를 사용하는 SUPRACAP™ 시리즈 심층 필터 캡슐 (Pall Corporation)과 같은 카트리지 또는 캡슐 형식으로 적용될 수 있다. 다른 적합한 심층 여과 기술 및 장치는 당업계에 공지되어 있으며, Sartorius PP3 필터를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 심층 필터는 약 0.2μm 내지 약 3μm의 공극(pore) 크기를 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 심층 필터의 공극 크기는 다음의 임의의 공극 크기(μm)보다 더 적다: 3, 2.8, 2.6, 2.4, 2.2, 2.0, 1.8, 1.6, 1.4, 1.2, 1.0, 0.8, 0.6, 그리고 0.4. 일부 구체예들에서, 상기 심층 필터의 공극 크기는 다음의 임의의 공극 크기(μm)보다 더 크다: 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0, 2.2, 2.4, 2.6, 또는 2.8. 즉, 상기 심층 필터의 공극 크기는 3, 2.8, 2.6, 2.4, 2.2, 2.0, 1.8, 1.6, 1.4, 1.2, 1.0, 0.8, 0.6, 그리고 0.4의 상한 및 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0, 2.2, 2.4, 2.6, 또는 2.8의 독립적으로 선택된 하한을 갖는 임의의 공극 크기 범위(μm)이며, 이때 상기 하한은 상한보다 적다.
본원에 기술된 바와 같이, 양이온 교환 및 음이온 교환 크로마토그래피는 본 발명의 세포로부터 수확된 지카 바이러스를 정제하기 위해 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 예를 들면, 정제된(clarified) 바이러스 수확물은 염기성화되고, 음이온 교환 막 상에 로딩되고, 염 또는 pH로 용리되고, 여과되고, 비활성화될 수 있다. 이는 예시적인 방식일 뿐이며, 당업자는 단계들의 대체, 삭제, 삽입 또는 재배열을 갖는 이의 변형을 용이하게 고려할 수 있다.
음이온 및 양이온 교환 크로마토그래피는 이동 상(mobile phase)에서 하전된 관심대상의 거대 분자 (예를 들어, 바이러스)를 반대 전하를 갖는 기질로 끌어당기는 것에 의존한다. 양이온 교환 크로마토그래피에서, 음으로 하전된 기질 또는 막은 양으로 하전된 거대 분자를 끌어 당긴다. 음이온 교환 크로마토그래피에서, 음으로 하전된 기질 또는 막은 양으로 하전된 거대 분자를 끌어 당긴다. 일단 거대 분자가 기질 상에 결합되거나, 또는 로딩되면, 그것들은 그들의 특성에 의존하는 방식으로 기질로부터 선형 또는 단계별(step-wise)-방식으로 용리될 수 있으며, 이에 의해 상이하게 하전된 분자들이 분리될 수 있다. 이 원리는 다른 고분자로부터 바이러스를 정제하는데 사용될 수 있다. 이동 상 완충제의 pH 또는 염 함량을 변화시킴으로써, 용리를 수행할 수 있다. 용출은 구배(gradient) 또는 단계별(step-wise)일 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 용리는 이동 상의 pH 변화를 사용하거나 또는 이동상의 이온 강도 변화를 사용하여 (예를 들어, 염의 첨가를 통해) 수행될 수 있다. 염화나트륨, 염화칼륨, 황산나트륨, 황산 칼륨, 황산 암모늄, 아세트산 나트륨, 인산 칼륨, 염화 칼슘 및 염화 마그네슘을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 염이 용리에 사용된다. 특정 구체예들에서, 상기 염은 NaCl이다. 다양한 적합한 완충제가 당업계에 공지되어 있고, 본원에 기재되어 있다. 이온 교환 크로마토그래피를 이용한 바이러스 정제 방법도 일반적으로 알려져 있다; 가령, www.pall.com/pdfs/Biopharmaceuticals/MustangQXT_AcroPrep_USD2916.pdf.에서 온라인으로 이용가능한 인플루엔자 바이러스의 정제.
당업계에 공지된 다양한 장치는 0.65μm 공극 크기를 갖는 양이온 교환 막을 사용하는 Mustang®S 시스템 (Pall Corporation)과 같은 양이온 교환 크로마토그래피 (임의선택적으로 여과 포함)에 적합하다. 가교된-중합체 코팅에서 펜던트(pendant) 술폰 작용기를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 작용기가 양이온 교환 막에 사용된다. 본 명세서의 지카 바이러스를 함유하는 용출액을 양이온 교환 막에 결합시키기 위해, 다양한 완충제가 사용될 수 있다. 예시적인 완충제는 시트레이트 및 포스페이트 완충제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다 (추가 완충제는 하기에 기재됨). 일부 구체예들에서, 양이온 교환 크로마토그래피에 이용되는 (가령, 로딩 및/또는 용리에 이용되는) 완충제는 폴리소르베이트 (가령, TWEEN®-80, 0.05%, 0.1%, 0.25%, 또는 0.5%에서)를 함유한다.
당업계에 공지된 다양한 장치는 0.8μm 공극 크기를 갖는 음이온 교환 막을 사용하는 Mustang®Q 시스템 (Pall Corporation)과 같은 음이온 교환 크로마토그래피 (임의선택적으로 여과 포함)에 적합하다. 또다른 적합한 음이온 교환 막은 SartobindQ IEXNano이다. 가교된-중합체 코팅에서 펜던트 4가 아민 작용기를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 작용기가 음이온 교환 막에 사용된다. 본 명세서의 지카 바이러스를 함유하는 용출액을 음이온 교환 막에 결합시키기 위해, 다양한 완충제가 사용될 수 있다. 예시적인 완충제는 포스페이트 완충제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다 (추가 완충제는 하기에 기재됨). 일부 구체예들에서, 음이온 교환 크로마토그래피에 이용되는 (가령, 로딩 및/또는 용리에 이용되는) 완충제는 폴리소르베이트 (가령, TWEEN®-80, 0.05%, 0.1%, 0.25%, 또는 0.5%에서)를 함유한다. 일부 구체예들에서, 상기 바이러스는 가령, 250 mM NaCl, 500 mM NaCl 및 750 mM NaCl을 이용한 용리 단계로부터 용리된다.
백신 및/또는 면역원성 조성물의 제형 및 투여량
본 발명의 추가 측면들은 본원에서 설명된 지카 바이러스로부터 한 가지 또는 그 이상의 항원을 내포하는 본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물의 제형에 관계한다.
본 명세서에서 설명된 지카 바이러스로부터 한 가지 또는 그 이상의 항원을 내포하는 본 발명의 이런 백신 및/또는 면역원성 조성물은 치료가 필요한 인간 대상에서 지카 바이러스 감염을 치료하거나 예방하고 및/또는 치료가 필요한 인간 대상에서 지카 바이러스에 대한 면역 반응, 예컨대 보호 면역 반응을 유도하는데 유용할 수 있다.
전형적으로, 본 명세서의 백신 및/또는 면역원성 조성물은 액체 용액 또는 현탁액 중에서 어느 한 가지로서 주사가능물질로서 제조된다; 주사에 앞서 액체에서 용해, 또는 액체에서 현탁에 적합한 고체 형태 또한 제조될 수 있다. 이런 제조물(preparations)은 또한, 유화되거나 또는 건성 분말로서 생산될 수 있다. 활성 면역원성 성분은 종종, 제약학적으로 허용되고, 활성 성분과 양립하는 부형제와 혼합된다. 적합한 부형제는 예를 들면, 물, 식염수, 덱스트로스, 수크로오스, 글리세롤, 에탄올, 또는 기타 유사한 것, 그리고 이들의 조합이다. 이에 더하여, 원하는 경우에, 백신 또는 면역원성 조성물은 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 또는 백신 또는 면역원성 조성물의 유용성을 증강하는 어쥬번트를 내포할 수 있다.
백신 또는 면역원성 조성물은 전통적으로, 예를 들면, 피하, 경피, 피내, 피하 또는 근육내 주사 중에서 어느 한 가지에 의해 비경구 투여될 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 조성물은 근육내 또는 피하로 투여된다. 다른 투여 방식에 적합한 추가 제형(formulations)는 좌약, 그리고 일부 사례에서, 입, 경구, 비내, 협측(buccal), 설하, 복막내, 질내, 항문 및 두개내(intracranial) 제형를 포함한다. 좌제(suppositories)의 경우, 전통적인 결합제 및 담체는 예를 들어, 폴리알칼렌 글리콜 또는 트리글리세리드를 함유할 수 있고; 이러한 좌제는 0.5% 내지 10%, 또는 심지어 1-2%의 범위의 활성 성분을 함유하는 혼합물로부터 형성될 수 있다.특정 구체예들에서, 낮은 용융 왁스, 예컨대 지방산 글리세리드 또는 코코아 버터의 혼합물이 먼저 용융되고, 그리고 본원에서 설명된 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물이 예를 들면, 교반에 의해 균질하게 분산된다. 용융된 균질한 혼합물은 이후, 편리한 크기의 주형 내로 부어지고, 그리고 냉각되고 굳어지도록 둔다.
비강 내 전달에 적합한 제형은 액체 (예를 들어, 에어로졸 또는 비말로 투여하기 위한 수용액) 및 건조 분말 (예를 들어, 코 통로 내에서의 빠른 침착)을 포함한다. 제형은 예를 들어, 제약 등급의 만니톨, 락토스, 수크로스, 트레할로스, 자일리톨 및 키토산과 같은 통상적으로 사용되는 부형제를 포함한다. 키토산과 같은 점막 접착제는 비강내-투여된 제형의 점액성섬모(mucociliary) 제거를 지연시키기 위해 액체 또는 분말 제형으로 사용될 수 있다. 만니톨, 소르비톨, 트레할로스 및/또는 수크로스와 같은 당은 액체 제형에서 안정성 제형으로서 그리고 건조 분말 제형에서 안정성, 벌킹(bulking) 또는 분말 유동제 및 크기 물질(agents)로서 사용될 수 있다. 또한, 모노포스포릴 지질 A (MLA) 또는 이의 유도체와 같은 어쥬번트 또는 CpG 올리고뉴클레오티드는 면역 자극 어쥬번트로서 액체 및 건조 분말 제형 둘 다에 사용될 수 있다.
경구 전달에 적합한 제형은 액체, 고체, 반-고체, 겔, 정제, 캡슐, 마름모꼴 등을 포함한다. 경구 전달에 적합한 제형은 정제, 마름모꼴, 캡슐, 겔, 액체, 식품, 음료, 기능 식품 및 이와 유사한 것을 포함한다. 제형은 예를 들어 제약 등급의 만니톨, 소르비톨, 트레할로스, 폴리올 이를 테면 수크로스와 같은 당, 락토스, 전분, 스테아르산 마그네슘, 사카린 나트륨, 셀룰로오스, 탄산 마그네슘 및 이와 유사한 것과 같은 통상적으로 사용되는 부형제를 포함한다. 다른 지카 바이러스 백신 및 면역원성 조성물은 용액, 현탁액, 환제, 서방형 제형 또는 분말의 형태를 취할 수 있으며. 활성 성분의 10-95% 또는 25-70%를 함유할 수 있다. 경구 제형의 경우, 콜레라 독소는 흥미로운 제형 파트너 (또한 가능한 접합 파트너)이다.
질 투여용으로 제형화될 때, 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물은 페서리(pessaries), 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 폼(foams) 또는 스프레이의 형태일 수 있다. 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물 이외에, 전술한 임의의 제형은 예를 들어, 당업계에 적합한 담체를 함유할 수 있다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물은 전신 또는 국소 전달을 위해 제형화될 수 있다. 이러한 제형은 당업계에 잘 알려져 있다. 비경구 비히클에는 염화나트륨 용액, Ringer 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 젖산화된 Ringer 또는 고정된(fixed) 오일 포함된다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양 보충제, 전해질 보충제 (예를 들어, 링거 덱스트로스에 기초한 것) 및 이와 유사한 것을 포함한다. 전신 및 국소 투여 경로는 예를 들어 피내(intradermal), 국소 적용, 정맥내, 근육내 등을 포함한다.
본 명세서의 백신 및/또는 면역원성 조성물은 투약 제형과 양립하는 방식으로, 그리고 치료적으로 효과적이고 면역원성일 그러한 양으로 투여될 수 있다. 상기 항원의 용량(dosage)은 특히, 약 1μg 내지 약 100μg, 약 1μg 내지 약 40μg, 약 1μg 내지 약 30μg, 약 1μg 내지 약 20μg, 약 1μg 내지 약 15μg, 또는 약 2μg 내지 약 15μg, 또는 약 5μg 내지 약 15μg, 또는 약 10μg 내지 약 15μg 범위일 수 있다. 상기 용량은 특히, 약 2μg, 약 5μg, 약 10μg, 약 15μg 또는 약 20μg, 특히 약 10μg일 수 있다. 상기 항원, 가령, 상기 정제된 비활성화된 지카 바이러스의 양은 표준 곡선을 확립하기 위하여, 특정된 양의 재조합 지카 외피 단백질을 이용한 Bradford 검정 (Bradford 외 (1976) Anal. Biochem. 72: 248-254)에 의해 결정될 수 있다. 따라서, 항원의 용량은 또한 지카 외피 단백질 E (μg Env)의 마이크로그램 (μg)으로 지칭될 수 있다.μg 항원 및μg Env는 본 개시의 의미 내에서 동일을 의미한다. 일부 구체예들에서, 상기 백신 및/또는 면역원성 조성물은 정제된 비활성화된 온전체 지카 바이러스 형태, 이를 테면 본원에서 설명된 바와 같이 서열 번호: 1의 위치 98에서 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 트립토판에서 글리신으로 치환인 돌연변이를 갖는 지카 바이러스와 같은 형태의 항원을 1μg 내지 15μg, 또는 2μg, 5μg 또는 10μg의 투여량으로 함유한다.
일부 구체예들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 정제된 비활성화된 온전체 지카 바이러스 에서열 번호:1의 위치 98 또는 서열 번호:1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는 지카 바이러스와 같은 형태의 항원을 1μg 내지 15μg, 또는 2μg, 5μg 또는 10μg의 투여량으로 함유하며, 이때 상기 지카 바이러스는 계열 PRVABC59로부터 유래된다.
일부 구체예들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 정제된 비활성화된 온전체 지카 바이러스 에서열 번호:1의 위치 98 또는 서열 번호:1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는 지카 바이러스와 같은 형태의 항원을 1μg 내지 15μg, 또는 2μg, 5μg 또는 10μg의 투여량으로 함유하며, 이때 상기 지카 바이러스는 서열 번호: 2에 따른 게놈 서열을 포함하는 계열 PRVABC59로부터 유래된다.
일부 구체예들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 정제된 비활성화된 온전체 지카 바이러스 에서열 번호:1의 위치 98 또는 서열 번호:1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는 정제된 비활성화된 온전체 플라크 정제된 지카 바이러스 분리주와 같은 형태의 항원을 1μg 내지 15μg, 또는 2μg, 5μg 또는 10μg의 투여량으로 함유하며, 이때 상기 지카 바이러스는 서열 번호: 2에 따른 게놈 서열을 포함하는 계열 PRVABC59로부터 유래된다.
이러한 특정 구체예들에서 상기 백신 또는 면역원성 조성물은
약 10μg 투여량의 정제된 비활성화된 온전체 바이러스
약 200μg 수산화 알루미늄,
완충제; 그리고 임의선택적으로
당 이를 테면, 수크로오스를 포함한다.
초기 투여 및 추가 접종(booster shots)을 위한 적합한 섭생 역시 가변적이지만, 초기 투여, 그 이후에 후속 접종 또는 다른 투여에 의해 특징화된다.
적용의 방식은 폭넓게 변할 수 있다. 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하기 위한 임의의 전통적인 방법이 적용가능하다. 이들은 생리학적으로 허용되는 고형의 베이스(base)에서, 또는 생리학적으로 허용되는 분산액에서 경구 적용, 비경구적으로, 주사에 의해, 또는 기타 유사한 것, 가령, 근육내 또는 피하 투여를 포함한다. 백신 또는 면역원성 조성물의 용량은 투여 루트에 의존할 것이고, 그리고 예방접종받게 되는 대상의 연령 및 항원의 제형에 따라서 변할 수 있다. 백신 또는 면역원성 조성물은 본원에서 설명된 바와 같이, 0.5mL 이상, 0.5mL 또는 0.5mL 이하의 단위 용량 체적을 가질 수 있다. 예를 들면, 조성물은 0.25mL의 체적에서 투여될 수 있다. 근육 내 또는 피하 투여에 0.5mL의 체적이 적합하다.
점막접착성(mucoadhesion)을 개선시키는 전달제는 또한 특히 비강 내, 경구 또는 폐 기반 전달 제형에 대한 전달 및 면역원성을 개선하는데 사용될 수 있다. 키틴의 N-탈아세틸화 형태인 키토산과 같은 하나의 화합물이 많은 제약학적 제형에 사용된다. 점액성섬모 제거를 지연시키고, 점막 항원 취입(uptake) 및 처리에 더 많은 시간을 허용하는 능력으로 인하여, 비강 내 백신 전달을 위한 매력적인 점막접착제이다. 또한, 그것은 NALT로의 항원의 경상피(transepithelial) 수송을 향상시킬 수 있는 단단한 접합부(junctions)를 일시적으로 개방할 수 있다. 최근의 인간 시험에서, 키토산과 함께 비강내로 투여되었지만 추가적인 어쥬번트가 없는 3가(trivalent) 비활성화된 인플루엔자 백신은 근육 내 접종 후 얻은 것보다 미미하게(marginally) 더 낮은 혈청 전환 및 HI 역가를 산출하였다.
키토산은 또한 유전적으로 해독된(detoxified) 대장균 열-불안정한 장내독소 돌연변이체 LTK63과 같이 비강내에서 기능을 잘 하는 어쥬번트와 함께 제형화될 수 있다. 이것은 키토산에 의해 부여된 전달 및 접착 이점 외에 면역 자극 효과를 추가함으로써, 점막 및 전신 반응을 향상시킨다.
마지막으로, 키토산 제형은 또한 백신 안정성을 개선시키고, 액체 제형에 비해 점액성섬모 제거를 추가로 지연시키는 것으로 보이는 건조 분말 형태로 제조될 수 있음에 주목해야 한다. 이것은 키토산으로 제형화된 비강내 건조 분말 디프테리아 톡소이드 백신에 관련된 최근 인간의 임상 시험에서 볼 수 있었는데, 이때 비강내 경로가 분비성 IgA 반응의 부가적인 이점과 함께, 전통적인 근육내 경로 만큼 효과적이었다. 상기 백신 또한 매우 내약성(tolerated)이 좋았다. 키토산 및 MLA 또는 이의 유도체를 함유하는 탄저병에 대한 비강내 건조 분말 백신은 토끼에서 근육내 접종보다 더 강한 반응을 유도하고, 또한 에어로졸 포자 공격접종에 대항하여 또한 보호성이다.
비강내 백신은 이들이 하부 호흡기에 영향을 미치는데 있어서 더 우수한 비경구적으로 투여된 백신과 대조적으로, 상부 호흡기 및 하부 호흡기에 영향을 줄 수 있는 예시적인 제형을 나타낸다. 이것은 알레르겐-기반 백신에 대한 내성을 유도하고, 병원체-기반 백신에 대한 면역을 유도하는데 유리할 수 있다.
비강내 백신은 상부 및 하부 호흡기 보호를 제공할 뿐만 아니라 니들(needle) 접종의 합병증을 피하고, 입자 및/또는 가용성 항원과 비인두-연합된 림프절 조직(NALT)의 상호 작용을 통해 점막 및 전신 체액 및 세포 반응을 유도하는 수단을 제공한다.
본 명세서의 백신 및/또는 면역원성 조성물은 제약학적으로 수용가능하다. 이들은 항원 및 어쥬번트 이외에 성분, 예를 들어, 전형적으로 하나 또는 그 이상의 제약학적 담체(들) 및/또는 부형제(들)을 포함할 것이다. 이러한 성분들에 대한 심도있는 토론은 Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472에서 이용가능하다.
긴장성(tonicity)을 제어하기 위해, 생리학적 염, 예컨대 나트륨 염을 포함하는 것이 바람직하다. 염화나트륨 (NaCl)이 선호되는데, 1 내지 20 mg/ml 사이에서 존재할 수 있다. 존재할 수 있는 다른 염은 염화칼륨, 인산이수소칼륨, 인산이나트륨 건조물, 염화마그네슘, 염화칼슘 등을 포함한다.
본 명세서의 백신 및/또는 면역원성 조성물은 한 가지 또는 그 이상의 완충제를 포함할 수 있다. 전형적인 완충제는 하기를 포함한다: 인산염 완충제; Tris 완충제; 붕산염 완충제; 숙신산염 완충제; 히스티딘 완충제 (특히, 수산화알루미늄 어쥬번트와 함께); 또는 구연산염 완충제. 완충제는 전형적으로, 5-20mM 범위에서 포함될 것이다.
백신 또는 면역원성 조성물의 pH는 일반적으로, 5.0 및 8.5 사이 또는 5.0 및 8.1 사이, 그리고 더 전형적으로, 6.0 및 8.5 사이, 예를 들면, 6.0 및 8.0 사이, 6.5 및 8.0 사이, 6.5 및 7.5 사이, 7.0 및 8.5 사이, 7.0 및 8.0 사이, 또는 7.0 및 7.8 사이일 것이다. 본 명세서의 제조 공정은 이런 이유로, 포장에 앞서, 벌크(bulk) 백신의 pH를 조정하는 단계를 포함할 수 있다.
백신 또는 면역원성 조성물은 바람직하게는 무균이다. 이것은 바람직하게는 비-발열성, 예를 들면, 용량당 <1 EU (내독소 단위, 표준 척도), 그리고 바람직하게는 용량당 <0.1 EU를 내포한다. 이것은 바람직하게는 글루텐이 없다.
특정 구체예들에서, 본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물은 세정제를 효과적인 농도에서 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 세정제의 유효량은 약 0.00005% v/v 내지 약 5% v/v 또는 약 0.0001% v/v 내지 약 1% v/v를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 세정제의 유효량은 약 0.001% v/v, 약 0.002% v/v, 약 0.003% v/v, 약 0.004% v/v, 약 0.005% v/v, 약 0.006% v/v, 약 0.007% v/v, 약 0.008% v/v, 약 0.009% v/v, 또는 약 0.01% v/v이나, 이에 국한되지 않는다. 이론에 구속되지 않고, 세정제는 본 명세서의 백신 및/또는 면역원성 조성물을 용액으로 유지하는 데 도움이 되고, 백신 및/또는 면역원성 조성물이 응집하는 것을 방지하는 것을 돕는다.
적합한 세정제는 예를 들면, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제 ('Tweens'으로 알려져 있음), 옥톡시놀 (예컨대, 옥톡시놀-9 (Triton X 100) 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올), 세틸 트리메틸 암모늄 브롬화물 ('CTAB'), 그리고 특히, 스필트(split) 또는 표면 항원 백신의 경우 데옥시콜레이트 나트륨을 포함한다. 상기 세정제는 소량으로만 또한 존재할 수 있다. 소량의 다른 잔여 성분은 항생제 (예를 들면, 네오마이신, 카나마이신, 폴리믹신 B)일 수 있다. 일부 구체예들에서, 세정제는 폴리소르베이트를 내포한다. 일부 구체예들에서, 세정제의 효과적인 농도는 약 0.00005% v/v 내지 약 5% v/v의 범위를 포함한다.
백신 및/또는 면역원성 조성물은 바람직하게는, 2℃ 내지 8℃ 사이에서 보관된다. 이들은 이상적으로는, 직사광이 닿지 않아야 한다. 항원 및 에멀션은 비록 이들이 즉석 혼합을 위한 별개 성분의 키트의 형태로 초기에 제공될 수 있긴 하지만, 전형적으로는 혼합물 형태로 있을 것이다. 백신 및/또는 면역원성 조성물은 일반적으로 인간 대상에게 투여될 때 수성 형태로 있을 것이다.
본 명세서의 방법
본 발명은 특히 지카 바이러스 감염을 치료 또는 예방, 특히 예방하고 및/또는 지카 바이러스 질환의 예방을 요하는 인간 대상에서 이를 위한 방법에 관계하는데, 이들 방법은 인간 대상 또는 인간 대상 집단에게 본원에서 기술된 백신 또는 면역원성 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
상기 질환은 일반적으로 경증이며, 단기간 지속된다. 일부 임상적 현시는 미열, 반구진성 발진, 결막염 및 관절통을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 임산부의 경미한 임상 증상에도 불구하고, 임신 중 지카 바이러스 감염은 태아와 신생아에게 심각한 결과와 관련이 있다. 이 질병의 중증도는 임신 중에 지카 바이러스 감염 여성의 태아와 신생아의 결과와 관련이 있다. 선천적 지카 증후군 (CZS)으로 알려진, 지카 바이러스 감염과 연합된 선천적 기형의 범주는 부분적으로 붕괴된 두개골을 갖는 심각한 소두, 피질하부 석회화를 동반한 대뇌 피질, 황반 반흔 및 국소 색소성 망막 반점, 선천성 경축 및 추체외 관련 증상이 있는 두드러진 조기 기능항진으로 구성된다. 더욱이, 상기 지카 바이러스는 중추 신경계 내에서 잠재적 질환을 야기할 수 있는 향신경성 플라비바이러스이다. 추가적으로
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증후군 (GBS)을 유발하는 지카 바이러스에 대한 전세계적인 우려가 있다.
따라서, 지카 바이러스 질병의 예방은 치료될 인간 대상에 관한 것일 뿐만 아니라, 치료될 인간 대상이 임신 중이거나 임신할 경우에 태아 및 신생아까지 확장된다. 따라서 본 발명에 따른 방법은 상기 인간 대상에게 상기 백신 또는 면역원성 조성물을 투여함으로써 당해 인간 대상을 치료하고, 임신한 인간 대상 또는 임신 의향이 있는 인간 대상 또는 가임기 여성에게 상기 백신 또는 면역원성 조성물을 투여함으로써 태아 및 신생아 치료를 포함한다.
본 명세서의 추가 측면은 지카 바이러스를 치료하거나 예방 및/또는 치료를 요하는 인간 대상에서 이를 치료 또는 예방하고 및.또는 지카 바이러스에 대한 면역 반응 유도를 요하는 인간 대상에서 이를 유도하기 위해, 적어도 하나의 지카 바이러스(가령, 클론 지카 바이러스 분리주, 비-인간 세포 개작 돌연변이 이를 테면 비-인간 세포 단백질 NS1에서 개작 돌연변이를 포함하는 지카 바이러스)의 하나 또는 그 이상의 항원을 함유하는 백신 및/또는 면역원성 조성물을 이용하는 방법에 관계한다.
이러한 특정 방법들에서, 상기 백신 및/또는 면역원성 조성물은 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 어쥬번트, 이를 테면 100μg 내지 약 300μg 또는 약 150μg 내지 약 250μg 또는 약 200μg 백반, 이를 테면 수산화 알루미늄과 복합하여, 정제된 비활성화된 온전체 지카 바이러스, 이를 테면 본원에서 설명된 바와 같이 서열 번호: 1의 위치 98에서 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 트립토판에서 글리신으로 치환인 돌연변이를 갖는 지카 바이러스의 1μg 내지 15μg, 또는 2μg, 또는 5μg, 또는 10μg 투여량을 함유한다.
이러한 특정 방법들에서, 일부 구체예들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 어쥬번트, 이를 테면 100μg 내지 약 600μg 또는 약 150μg 내지 약 250μg 또는 약 200μg 백반, 이를 테면 수산화 알루미늄과 복합하여, 에서열 번호:1의 위치 98 또는 서열 번호:1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는 정제된 비활성화된 온전체 지카 바이러스를 1μg 내지 15μg, 또는 2μg, 5μg 또는 10μg 투여량으로 함유하고, 이때 상기 지카 바이러스는 계열 PRVABC59로부터 유래된다.
이러한 특정 방법들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 하나 또는 그 이상의 어쥬번트, 이를 테면 100μg 내지 약 600μg 또는 약 150μg 내지 약 250μg 또는 약 200μg 백반, 이를 테면 수산화 알루미늄과 임의선택적으로 복합하여, 에서열 번호:1의 위치 98 또는 서열 번호:1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는 정제된 비활성화된 온전체 지카 바이러스를 1μg 내지 15μg, 또는 2μg, 5μg 또는 10μg 투여량으로 함유하고, 이때 상기 지카 바이러스는 서열 번호: 2에 따른 게놈 서열을 포함하는 계열 PRVABC59로부터 유래된다.
이러한 특정 방법들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 하나 또는 그 이상의 어쥬번트, 이를 테면 100μg 내지 약 600μg 또는 약 150μg 내지 약 250μg 또는 약 200μg 백반, 이를 테면 수산화 알루미늄과 임의선택적으로 복합하여, 에서열 번호:1의 위치 98 또는 서열 번호:1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는 정제된 비활성화된 온전체 플라크 정제된 지카 바이러스 분리주를 1μg 내지 15μg, 또는 2μg, 5μg 또는 10μg 투여량으로 함유하고, 이때 상기 지카 바이러스는 서열 번호: 2에 따른 게놈 서열을 포함하는 계열 PRVABC59로부터 유래된다.
일부 구체예들에서, 본 명세서는 지카 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 것이 필요한 인간 대상에서 이를 치료 또는 예방하는 방법에 관계하는데, 이 방법은 상기 인간 대상에게 적어도 하나의 지카 바이러스(가령, 클론 지카 바이러스 분리주, 비-인간 세포 개작 돌연변이, 이를 테면, 비-인간 세포 단백질 NS1에서 개작 돌연변이를 포함하는 지카 바이러스)의 하나 또는 그 이상의 항원들을 함유하는 치료요법적으로 유효량의 본 명세서의 백신 및/또는 면역원성 조성물을 투여함으로써 이루어진다. 일부 구체예들에서, 본 명세서는 지카 바이러스에 대한 면역 반응 유도를 요하는 인간 대상에서 이를 유도하는 방법에 관계하는데, 이 방법은 상기 인간 대상에게 적어도 하나의 지카 바이러스(가령, 클론 지카 바이러스 분리주, 비-인간 세포 개작 돌연변이, 이를 테면, 비-인간 세포 단백질 NS1에서 개작 돌연변이를 포함하는 지카 바이러스)의 하나 또는 그 이상의 항원들을 함유하는 치료요법적으로 유효량의 본 명세서의 백신 및/또는 면역원성 조성물을 투여함으로써 이루어진다. 일부 구체예들에서, 투여하는 단계는 인간 대상에서 지카 바이러스에 대한 보호 면역 반응을 유도한다. 일부 구체예들에서, 상기 인간 대상은 임신하거나, 임신 의향이 있거나, 또는 가임기 여성이다.
본원에 개시된 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물은 당해 백신을 비강내, 경구, 협측, 설하, 근육내, 복막내, 피내, 경피, 피하, 질내, 항문 및 두개내(intracranial), 정맥내, 경피부경구, 협측, 설하, 근육 내, 복강 내, 피내, 경피, 피하, 질내, 항문, 두개 내, 정맥 내, 경피부(transcutaneous) 또는 피하지방(subcutaneous)으로 투여, 특히 근육내 투여함으로써 바이러스 감염에 취약하거나 바이러스 감염을 앓고 있는 인간 대상을 보호 또는 치료하는데 사용될 수 있다. 상기 본 명세서의 백신 및/또는 면역원성 조성물의 전신 투여 방법은 통상적인 주사기 및 바늘, 또는 고체 백신의 탄도학적(ballistic) 전달을 위해 설계된 장치(WO 99/27961), 또는 니들리스(needleless) 압력 액체 분사 장치(U.S. 특허 번호. 4,596,556; U.S. 특허 번호. 5,993,412), 또는 경피 패치(WO 97/48440; WO 98/28037)를 포함할 수 있다. 본 명세서의 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물은 피부에 적용될 수 있다 (경피(transdermal) 또는 경피부(transcutaneous) 수송 WO 98/20734; WO 98/28037). 본 명세서의 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물은 따라서 상기 지카 바이러스 백신 또는 면역원성 조성물로 사전-채워진 전신 투여용 전달 장치를 포함할 수 있다. 따라서, 인간 대상에서 지카 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법 및/또는 면역 반응을 유도하는 방법들이 제공되는데, 이 방법은 본 명세서의 백신 또는 면역원성 조성물(임의선택적으로 어쥬번트 및/또는 담체를 함유하는)을 상기 인간 대상에게 투여하는 단계를 포함하며, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 비경구 또는 전신 경로를 통하여 투여된다.
상기 본 명세서의 백신 및/또는 면역원성 조성물은 바이러스 감염에 민감한, 또는 바이러스 감염을 앓고 있는 인간 대상을 보호 또는 치료하는데 이용될 수 있는데, 이는 상기 백신 또는 면역원성 조성물을 점막 경로, 이를 테면, 경구/소화 경로 또는 비강 경로를 통하여 투여함으로써 이루어진다. 대체 점막 경로는 질내 및 직장내 경로다. 점막 투여 경로는 비강내 백신 접종으로 지칭되는 코를 통한 경로일 수 있다. 비강내 백신 접종 방법은 면역화될 개체의 비인두에 백신의 비말(droplet) 투여, 분무 또는 건조 분말 형태의 투여를 포함하여, 당업계에 잘 알려져 있다. 분무(nebulized) 또는 에어로졸화된(aerosolized) 백신 제형은 본원에 개시된 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물의 잠재적 형태이다. 경구 투여용 위 내성 캡슐 및 과립, 직장 또는 질 투여용 좌약과 같은 장용(enteric) 제형은 또한 본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물의 제형이다.
본 명세서의 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물은 경구 경로를 통하여 또한 투여될 수 있다. 이러한 경우에, 제약학적으로 수용가능한 부형제는 또한 알칼리성 완충제, 또는 장용 캡슐 또는 미립자(microgranules)를 포함할 수 있다. 본 명세서의 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물은 질 경로에 의해 또한 투여될 수 있다. 이러한 경우, 상기 제약학적으로 수용가능한 부형제들은 또한 유화제, CARBOPOL®과 같은 중합체, 및 질 크림 및 좌제의 다른 공지된 안정제를 포함할 수 있다. 상기 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물은 직장 경로에 의해 또한 투여될 수 있다. 이러한 경우에, 상기 부형제들은 또한 직장 좌약을 형성하기 위해 당업계에 공지된 왁스 및 중합체를 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 투여하는 단계는 1회 또는 그 이상의 투여를 포함한다. 투여는 단일 투약 일정 또는 복수 투약 (일차접종-추가 접종) 일정에 의할 수 있다. 복수 투약 일정에서, 다양한 용량이 동일하거나 또는 상이한 루트, 예를 들면, 비경구 일차 접종 및 점막 추가 접종, 점막 일차 접종 및 비경구 추가 접종, 기타 등등에 의해 제공될 수 있다. 전형적으로, 이들은 동일한 경로, 이를 테면 근육내 또는 피하 투여에 의해 제공될 것이다. 다중 투여는 전형적으로 적어도 1 주 간격 (가령, 약 1 주, 약 2 주, 약 3 주, 약 4 주, 약 5 주, 약 6 주, 약 7 주, 약 8 주, 약 9 주, 약 10 주, 약 11 주, 약 12 주, 약 16 주, 등., 이를 테면 1 내지 16 주 간격으로)을 두고 투여될 것이다. 25-30 일 (예를 들면, 28 일, 4주)에 의해 분리된 2회 투약을 제공하는 것이 특히 유용하다. 이러한 특정 구체예들에서, 투여 방식은 근육내 또는 피하 투여다.
본 명세서의 방법은 본 명세서의 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물의 치료 유효량 또는 면역원성 양의 투여를 포함한다. 치료 유효량 또는 면역원성 양은 본 명세서의 백신 및/또는 면역원성 조성물이 투여되는 감염되지 않은, 감염된 또는 노출되지 않은 인간 대상에서 보호 면역학적 반응을 유도할 이들의 양일 수 있다. 이런 반응은 일반적으로 인간 대상에서 백신에 대한 분비성, 세포성 및/또는 항체-매개된 면역 반응의 발달을 유발할 것이다. 통상적으로, 이런 반응은 하기 효과 중에서 한 가지 또는 그 이상을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다; 면역학적 부류, 예컨대 면역글로불린 A, D, E, G 또는 M 중에서 어느 것으로부터 항체의 생산; B와 T 림프구의 증식; 면역학적 세포에 활성화, 성장 및 분화 신호의 제공; 보조 T 세포, 억제 T 세포 및/또는 세포독성 T 세포의 확대.
이러한 특정 방법들에서, 상기 백신 및/또는 면역원성 조성물은 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 어쥬번트, 이를 테면 100μg 내지 약 600μg 또는 약 150μg 내지 약 250μg 또는 약 200μg 백반, 이를 테면 수산화 알루미늄과 복합하여, 정제된 비활성화된 온전체 지카 바이러스, 이를 테면 본원에서 설명된 바와 같이 서열 번호: 1의 위치 98에서 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 트립토판에서 글리신으로 치환인 돌연변이를 갖는 지카 바이러스의 1μg 내지 15μg, 또는 2μg, 5μg, 또는 10μg 투여량을 함유한다.
이러한 특정 방법들에서, 일부 구체예들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 어쥬번트, 이를 테면 100μg 내지 약 600μg 또는 약 150μg 내지 약 250μg 또는 약 200μg 백반, 이를 테면 수산화 알루미늄과 복합하여, 에서열 번호:1의 위치 98 또는 서열 번호:1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는 정제된 비활성화된 온전체 지카 바이러스를 1μg 내지 15μg, 또는 2μg, 5μg 또는 10μg 투여량으로 함유하고, 이때 상기 지카 바이러스는 계열 PRVABC59로부터 유래된다.
이러한 특정 방법들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 하나 또는 그 이상의 어쥬번트, 이를 테면 100μg 내지 약 600μg 또는 약 150μg 내지 약 250μg 또는 약 200μg 백반, 이를 테면 수산화 알루미늄과 임의선택적으로 복합하여, 에서열 번호:1의 위치 98 또는 서열 번호:1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는 정제된 비활성화된 온전체 지카 바이러스를 1μg 내지 15μg, 또는 2μg, 5μg 또는 10μg 투여량으로 함유하고, 이때 상기 지카 바이러스는 서열 번호: 2에 따른 게놈 서열을 포함하는 계열 PRVABC59로부터 유래된다.
이러한 특정 방법들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 하나 또는 그 이상의 어쥬번트, 이를 테면 100μg 내지 약 600μg 또는 약 150μg 내지 약 250μg 또는 약 200μg 백반, 이를 테면 수산화 알루미늄과 임의선택적으로 복합하여, 서열 번호:1의 위치 98 또는 서열 번호:1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는 정제된 비활성화된 온전체 플라크 정제된 지카 바이러스 분리주를 1μg 내지 15μg, 또는 2μg, 또는 5μg 또는 10μg 투여량으로 함유하고, 이때 상기 지카 바이러스는 서열 번호: 2에 따른 게놈 서열을 포함하는 계열 PRVABC59로부터 유래된다.
이러한 특정 방법들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 플라크 환원 중화 검사 (PRNT)에 의해 결정될 때, 인간 대상에서 지카 바이러스에 대한 중화 항체 역가를 10 이상, 또는 50 이상, 또는 100 이상, 또는 200 이상 또는 1000 이상, 또는 1500 이상, 또는 2000 이상, 또는 2000 이상, 또는 3000 이상으로 유도한다.
이러한 특정 방법들에서 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 리포트 바이러스 입자 중화 검정 (RVP)에 의해 결정될 때, 인간 대상에서 지카 바이러스에 대한 중화 항체 역가를 300 이상 또는 500 이상, 또는 1000 이상, 또는 1500 이상, 또는 2000 이상, 또는 2000 이상, 또는 3000 이상, 또는 5000 이상, 또는 10,000 이상으로 유도한다.
이러한 특정 방법들에서, 상기 중화 항체 역가는 투여 후 14일 및/또는 28
Figure pct00004
시점에 획득된다.
이러한 특정 방법들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여 후 14일 및/또는 28
Figure pct00005
시점에서 플라크 환원 중화 검사 (PRNT)에 의해 결정될 때, 인간 대상에서 지카 바이러스에 대한 중화 항체 역가 생성은 250 이상이다.
이러한 특정 방법들에서 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여 후 14일 및/또는 28
Figure pct00006
시점에서 리포트 바이러스 입자 중화 검정 (RVP)에 의해 결정될 때, 인간 대상에서 지카 바이러스에 대한 중화 항체 역가 생성은 1000 이상이다.
이러한 특정 방법들에서, 이러한 역가는 투여 후 14 일 및/또는 28 일 시점에 획득된다. 이러한 중화 항체 생성은 적어도 20명의 인간 대상 지카 바이러스 혈청음성 집단에서 높은 혈청전환율을 제공한다. 이러한 특정 구체예들에서, 상기 혈청전환율은 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 적어도 95% 또는 100%이다.
이러한 특정 방법들에서, 이러한 역가는 투여 후 14 일 및/또는 28 일 시점에 획득된다. 이러한 중화 항체 생성은 집단, 특히 적어도 20명의 인간 대상 지카 바이러스 혈청음성 집단에서 높은 상기 혈청양성율을 제공한다. 이러한 특정 구체예들에서, 상기 혈청양성율은 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%이다.
본 발명의 방법에 따르면 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 단일 투여량 또는 다중 투여량으로 투여되는데 가령, 제1 투여 (일차접종)와 가령, 1주 내지 16주 간격을 두고 제2 투여 (추가접종)으로 투여된다. 이러한 특정 방법들에서, 상기 제 2 (추가접종) 투여는 상기 제 1 (일차접종) 투여후 적어도 28일 후에 투여된다.
이러한 특정 방법들에서, 단일 투여량의 투여 후, 또는 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)의 다중 투여(dose) 14일 및/또는 28일 후 가령, 적어도 20명의 인간 대상 지카 바이러스 혈청음성 집단에서 높은 혈청전환율이 획득된다. 이러한 특정 구체예들에서 상기 혈청전환율은 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%이다.
제1(일차접종) 투여와 제2(추가접종) 투여를 포함하는 이러한 특정 방법들에서, 제2(추가접종) 후 14 일 및/또는 28 일 시점에서 적어도 20명의 인간 대상 지카 바이러스 혈청음성 집단에서 높은 혈청전환율이 획득된다. 이러한 특정 구체예들에서 상기 혈청전환율은 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%이다.
이러한 특정 방법들에서, 단일 투여량으로 투여 또는 제1(일차투여) 투여 후 14일 및/또는 28일 후 시점에서 적어도 20명의 인간 대상 지카 바이러스 혈청음성 집단에서 높은 혈청전환율이 획득된다. 이러한 특정 구체예들에서 상기 혈청전환율은 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%,적어도 60%, 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다.
이러한 특정 방법들에서, 단일 투여량의 투여 후, 또는 다중 투여, 가령, 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)의 후 14일 및/또는 28일 후 시점에서 집단, 특히 적어도 20명의 인간 대상 지카 바이러스 혈청음성 집단 또는 플라비바이러스 나이브 집단에서 높은 상기 혈청양성율이 획득된다. 이러한 특정 구체예들에서, 상기 혈청양성율은 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%이다.
제1(일차접종) 투여와 제2(추가접종) 투여를 포함하는 이러한 특정 방법들에서, 제2(추가접종) 후 14 일 및/또는 28 일 시점에서 적어도 20명의 인간 대상 지카 바이러스 혈청음성 집단에서 높은 상기 혈청양성율이 획득된다. 이러한 특정 구체예들에서, 상기 혈청양성율은 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%이다.
이러한 특정 방법들에서, 단일 투여량으로 투여 또는 제1(일차투여) 투여 후 14일 및/또는 28일 후 시점에서 집단, 특히 적어도 20명의 인간 대상 지카 바이러스 혈청음성 집단 또는 플라비바이러스 나이브 집단에서 높은 혈청양성율이 획득된다. 이러한 특정 구체예들에서, 상기 혈청양성율은 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다.
이러한 특정 방법들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 단일 투여 또는 일차접종 투여 후 14 일 및/또는 28 일에 인간 대상, 특히 플라비바이러스 나이브 인간 대상, 또는 특히 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상에서 지카 바이러스에 대한 중화 항체 역가는 플라크 환원 중화 검사 (PRNT)에 의해 결정될 때, 200 이상이다.
이러한 특정 방법들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 단일 투여 또는 일차접종 투여 후 14 일 및/또는 28 일에 특히 적어도 20명의인간 대상의 플라비바이러스 나이브 집단 또는 특히 지카 바이러스 혈청음성 집단에서 지카 바이러스에 대한 기하학적 평균 중화 항체 역가는 플라크 환원 중화 검사 (PRNT)에 의해 결정될 때, 200 이상이다.
이러한 특정 방법들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 단일 투여 또는 일차접종 투여 후 14 일 및/또는 28 일에 인간 대상, 특히 플라비바이러스 나이브 인간 대상, 또는 특히 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상에서 지카 바이러스에 대한 중화 항체 역가는 리포트 바이러스 입자 중화 검정 (RVP)에 의해 결정될 때, 1000 이상이다.
이러한 특정 방법들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 단일 투여 또는 일차접종 투여 후 14 일 및/또는 28 일에 특히 적어도 20명의 인간 대상 플라비바이러스 나이브 집단 또는 특히 지카 바이러스 혈청음성 집단에서 지카 바이러스에 대한 기하학적 평균 중화 항체 역가는 리포트 바이러스 입자 중화 검정 (RVP)에 의해 결정될 때, 1000 이상이다.
이러한 중화 항체 생성은 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 집단 또는 특히 지카 바이러스 혈청음성 집단에서 단일 투여 또는 일차접종 투여 후 높은 혈청전환율을 제공한다. 이러한 특정 구체예들에서, 상기 혈청전환율은 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%이다.
이러한 중화 항체 생성은 집단, 특히 적어도 20명의 인간 대상 플라비바이러스 나이브 집단 또는 특히 지카 바이러스 혈청음성 집단은 단일 투여 또는 일차접종 투여 후 높은 혈청양성율을 제공한다. 이러한 특정 구체예들에서, 상기 혈청양성율은 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%이다.
특정 방법들에서, 투여는 일차접종 및 추가접종 투여를 포함하며, 이때 상기 일차접종 및 추가접종 투여는 1 내지 약 16주 간격을 두고 실행된다. 이러한 특정 방법들에서, 상기 제 2 (추가접종) 투여는 상기 제 1 (일차접종) 투여 후 적어도 28 일 후에 투여된다.
이러한 특정 방법들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 추가접종 투여 후 14일 및/또는 28일 시점에서 인간 대상, 특히 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 특히 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상에서 지카 바이러스에 대한 중화 항체 역가는 플라크 환원 중화 검사 (PRNT)에 의해 결정될 때, 1000 이상, 또는 1500 이상, 또는 3000 이상이다.
이러한 특정 방법들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 추가접종 투여 후 14일 및/또는 28일 시점에서 특히 적어도 20명의 인간 대상 플라비바이러스 나이브 집단 또는 특히 지카 바이러스 혈청음성 집단에서 지카 바이러스에 대한 기하학적 평균 중화 항체 역가는 플라크 환원 중화 검사 (PRNT)에 의해 결정될 때, 1000 이상, 또는 1500 이상, 또는 3000 이상이다.
이러한 특정 방법들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 추가접종 투여 후 14일 및/또는 28일 시점에서 인간 대상, 특히 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 특히 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상에서 지카 바이러스에 대한 중화 항체 역가는 리포트 바이러스 입자 중화 검정 (RVP)에 의해 결정될 때, 3000 이상, 또는 5000 이상, 또는 10000 이상이다.
이러한 특정 방법들에서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 추가접종 투여 후 14일 및/또는 28일 시점에서 특히 적어도 20명의 인간 대상 플라비바이러스 나이브 집단 또는 특히 지카 바이러스 혈청음성 집단에서 지카 바이러스에 대한 기하학적 평균 중화 항체 역가는 리포트 바이러스 입자 중화 검정 (RVP)에 의해 결정될 때, 3000 이상, 또는 5000 이상, 또는 10000 이상이다.
이러한 중화 항체 생성은 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 집단 또는 특히 지카 바이러스 혈청음성 집단에서 추가접종 투여 후 높은 혈청전환율을 제공한다. 이러한 특정 구체예들에서, 상기 혈청전환율은 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%이다.
이러한 중화 항체 생성은 집단, 특히 적어도 20명의 인간 대상 플라비바이러스 나이브 집단에서 상기 추가접종 투여 후 높은 혈청양성율을 제공한다. 이러한 특정 구체예들에서, 상기 혈청양성율은 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%이다.
이러한 중화 항체 생성은 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 집단 또는 특히 지카 바이러스 혈청음성 집단에서 단일 투여 또는 일차접종 투여 후 높은 혈청전환율을 제공한다. 이러한 특정 구체예들에서, 상기 혈청전환율은 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%이다.
이러한 중화 항체 생성은 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 집단 또는 특히 지카 바이러스 혈청음성 집단에서 단일 투여 또는 일차접종 투여 후 높은 혈청전환율을 제공한다. 이러한 특정 구체예들에서, 상기 혈청양성율은 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%이다.
더욱이, 본 명세서의 특정 측면들은 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 요하는 인간 대상 집단에서 이를 치료 또는 예방하는, 특히 예방하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 전술한 인간 대상 집단의 개별 인간 대상에게 지카 바이러스의 (하나의) 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 가령, 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)에서 단일 투여량 또는 다중 투여량으로 투여되며, 그리고 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 투여 후 7일까지 적어도 20명의 인간 대상의 인간 대상 집단, 특히 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상의 집단, 또는 특히, 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 집단의 50% 미만에서 전신 부작용을 유도한다.
본 명세서의 특정 측면들에 따르면, 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 29% 미만에서 투여 후 7일까지 두통 증상이 유도된다.
본 명세서의 특정 측면들에 따르면, 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단에 있어서 열(4% 또는 그 미만), 및/또는 피로(33% 또는 그 미만), 및/또는 관절통(10% 또는 그 미만), 및/또는 근육통(17% 또는 그 미만) 및/또는 불안감(15% 또는 그 미만)이 투여 후 7일까지 유도된다.
본 명세서의 특정 측면들에 따르면, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)의 다중 투여로 투여되며, 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 인간 대상 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 40% 또는 그 미만에서 전신 부작용이 추가접종 투여 후 7일까지 유도된다.
본 명세서의 특정 측면들에 따르면, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)의 다중 투여로 투여되며, 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단에서 일차접종 투여 후 7일차와 비교하였을 때, 추가접종 투여 후 7일 까지
- 적어도 40% 미만, 또는 적어도 45% 미만 피로가 유도되거나, 및/또는
- 더 이상의 열은 없고, 및/또는
- 적어도 10% 미만, 또는 적어도 20% 미만, 또는 적어도 25% 미만의 근육통이 유도되거나 또는 더 이상의 근육통은 없고, 및/또는
- 적어도 10% 미만, 또는 적어도 20% 미만의 불안감이 유도되거나 또는 더 이상의 근육통은 없다.
"일차접종 투여 후와 비교하여 추가접종 투여 후 부작용(AEs)의 감소-%”는 다음의 식으로 정의된다:
Figure pct00007
본 명세서의 특정 측면들에 따르면, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)의 다중 투여로 투여되며, 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 인간 대상 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 4% 미만에서 또는 0%에서 열이 추가접종 투여 후 7일까지 유도된다.
본 명세서의 특정 측면들에 따르면, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)의 다중 투여로 투여되며, 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 인간 대상 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 19% 미만에서 피로가 추가접종 투여 후 7일까지 유도된다.
본 명세서의 특정 측면들에 따르면, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)의 다중 투여로 투여되며, 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 인간 대상 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 12% 또는 8% 미만에서 근육통이 추가접종 투여 후 7일까지 유도된다.
본 명세서의 특정 측면들에 따르면, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)의 다중 투여로 투여되며, 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 인간 대상 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 13% 또는 10% 미만에서 불안감이 추가접종 투여 후 7일까지 유도된다.
본 명세서의 특정 측면들에 따르면, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)의 다중 투여로 투여되며, 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 인간 대상 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 20% 또는 그 미만에서 두통, 8% 또는 그 미만에서 관절통, 4% 미만에서 열, 19% 미만에서 피로, 그리고 12% 미만에서 근육통, 그리고 13% 미만에서 불안감이 추가접종 투여 후 7일까지 유도된다.
본 명세서의 특정 측면들에 따르면, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 1μg 내지 40μg 투여량의 (하나의) 항원을 포함하고, 이때 상기 항원은 비활성화된 온전체 바이러스이다.
본 명세서의 특정 측면들에 따르면, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 단일 투여량 투여, 또는 적어도 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)를 포함하는 다중 투여량 투여되며, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 약 5μg 투여량의 정제된 비활성화된 온전체 바이러스를 포함한다.
본 명세서의 특정 측면들에 따르면, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7 일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단에서 50% 미만, 45% 미만, 또는 40% 미만의 전신 부작용이 유도되고, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일 까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 40% 미만, 또는 35% 미만, 또는 30% 미만, 또는 25% 미만, 또는 20% 미만, 또는 15% 미만에서 전신 부작용이 유도된다.
본 명세서의 특정 측면들에 따르면, 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 3% 미만, 또는 0%에서 열이 유도되고, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 4% 미만, 또는 3% 미만, 또는 0%에서 열이 유도된다.
본 명세서의 특정 측면들에 따르면, 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 29% 미만에서 두통이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 20% 미만, 또는 15% 미만, 또는 10% 미만, 또는 5% 미만에서 두통이 유도된다.
본 명세서의 특정 측면들에 따르면, 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 30% 미만, 또는 25% 미만, 또는 20% 미만에서 피로가 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 20% 미만, 또는 15% 미만, 또는 10% 미만에서 피로가 유도된다.
본 명세서의 특정 측면들에 따르면, 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 4% 미만에서 관절통이 유도되고, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 5% 미만, 또는 2% 미만, 또는 0%에서 관절통이 유도된다.
본 명세서의 특정 측면들에 따르면, 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 17% 또는 그 미만에서 근육통이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 12% 미만, 또는 10% 미만, 또는 5% 미만에서 근육통이 유도된다.
본 명세서의 특정 측면들에 따르면, 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 10% 미만에서 불안감이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 14% 미만, 또는 10% 미만, 또는 5% 미만, 또는 0% 미만에서 불안감이 유도된다.
본 명세서의 특정 측면들에 따르면, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)의 다중 투여로 투여되며, 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단에서 일차접종 후 7일차와 비교하였을 때,
-적어도 70% 미만, 또는 적어도 60% 미만, 또는 적어도 50% 미만, 또는 적어도 40% 미만, 또는 적어도 35% 미만, 또는 적어도 30% 미만의 전신 부작용, 및/또는
-열의 증가는 없고, 및/또는
-적어도 80% 미만, 또는 적어도 70% 미만, 또는 적어도 60% 미만, 또는 적어도 50% 미만, 또는 적어도 45% 미만의 두통, 및/또는
-적어도 60% 미만, 또는 적어도 55% 미만, 또는 적어도 50% 미만, 또는 적어도 45% 미만, 또는 적어도 40% 미만의 피로, 및/또는
-관절통의 증가는 없거나, 또는 적어도 80% 미만, 또는 적어도 60% 미만, 또는 적어도 40% 미만, 또는 적어도 20% 미만, 또는 적어도 10% 미만의 관절통, 및/또는
-근육통의 증가는 없거나, 또는 적어도 70% 미만, 또는 적어도 60% 미만, 또는 적어도 40% 미만, 또는 적어도 20% 미만, 또는 적어도 10% 미만의 근육통, 및/또는
-불안감의 증가는 없거나, 또는 적어도 80% 미만, 또는 적어도 60% 미만, 또는 적어도 40% 미만, 또는 적어도 20% 미만, 또는 적어도 10% 미만의 불안감이 유도된다.
본 명세서의 특정 측면들에 따르면, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 단일 투여량 투여, 또는 적어도 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)을 내포하는 다중 투여로 투여되며, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 약 10μg 투여량의 정제된 비활성화된 온전체 바이러스를 포함한다.
본 명세서의 이러한 특정 측면들에 따르면 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 50% 미만에서 전신 부작용이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 40% 미만, 또는 35% 미만, 또는 30% 미만에서 전신 부작용이 유도된다.
본 명세서의 이러한 특정 측면들에 따르면, 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 4% 미만에서 열이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 4% 미만, 또는 3% 미만, 또는 0%에서 열이 유도된다.
본 명세서의 이러한 특정 측면들에 따르면, 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 29% 미만, 또는 25% 미만, 또는 20% 미만, 또는 15% 미만에서 두통이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 20% 또는 그 미만에서 두통이 유도된다.
본 명세서의 이러한 특정 측면들에 따르면 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 33% 또는 그 미만에서 피로가 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 20% 미만에서 피로가 유도된다.
본 명세서의 이러한 특정 측면들에 따르면 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 10% 또는 그 미만에서 관절통이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 5% 미만에서 관절통이 유도된다.
본 명세서의 이러한 특정 측면들에 따르면 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 17% 또는 그 미만에서 근육통이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 12% 미만, 또는 10% 미만에서 근육통이 유도된다.
본 명세서의 이러한 특정 측면들에 따르면 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 15% 또는 그 미만에서 불안감이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 13% 미만, 또는 10% 또는 그 미만에서 불안감이 유도된다.
본 명세서의 이러한 특정 측면들에 따르면 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)의 다중 투여로 투여되며, 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단에서 일차접종 후 7일차와 비교하였을 때,
-적어도 40% 미만, 또는 적어도 35% 미만, 또는 적어도 30% 미만, 또는 적어도 25% 미만의 전신 부작용이 유도되거나, 및/또는
-열의 증가는 없거나, 또는 적어도 80% 미만, 또는 적어도 60% 미만, 또는 적어도 40% 미만, 또는 적어도 20% 미만, 또는 적어도 10% 미만의 열이 유도되거나, 및/또는
-적어도 45% 미만, 또는 적어도 40% 미만의 피로가 유도되거나, 및/또는
-관절통의 증가는 없거나, 또는 적어도 65% 미만, 또는 적어도 60% 미만, 또는 적어도 40% 미만, 또는 적어도 20% 미만, 또는 적어도 10% 미만의 관절통이 유도되거나, 및/또는
- 근육통의 증가는 없거나, 또는 적어도 45% 미만, 또는 적어도 40% 미만, 또는 적어도 20% 미만, 또는 적어도 10% 미만의 근육통이 유도되거나, 및/또는
- 불안감의 증가는 없거나, 또는 적어도 20% 미만, 또는 적어도 10% 미만의 불안감이 유도된다.
본 명세서의 특정 측면들에 따르면, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 단일 투여량 투여, 또는 적어도 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)을 내포하는 다중 투여로 투여되며, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 약 2μg 투여량의 정제된 비활성화된 온전체 바이러스를 포함한다.
본 명세서의 이러한 특정 측면들에 따르면 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 50% 미만, 또는 45% 미만, 또는 40% 미만, 또는 35% 미만에서 전신 부작용이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 40% 미만, 또는 35% 미만에서 전신 부작용이 유도된다.
본 명세서의 이러한 특정 측면들에 따르면, 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 3% 미만, 또는 0%에서 열이 유도되고, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 4% 미만, 또는 3% 미만, 또는 0%에서 열이 유도된다.
본 명세서의 특정 측면들에 따르면, 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 29% 미만, 또는 25% 미만, 또는 20% 미만에서 두통이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 20% 미만, 또는 15% 미만에서 두통이 유도된다.
본 명세서의 이러한 특정 측면들에 따르면, 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 30% 미만, 또는 25% 미만에서 피로가 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 20% 미만, 또는 15% 미만에서 피로가 유도된다.
본 명세서의 이러한 특정 측면들에 따르면 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 4% 또는 그 미만에서 관절통이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 8% 미만에서 관절통이 유도된다.
본 명세서의 이러한 특정 측면들에 따르면 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 17% 또는 그 미만에서 근육통이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 12% 미만, 또는 10% 미만에서 근육통이 유도된다.
본 명세서의 이러한 특정 측면들에 따르면, 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 10% 미만에서 불안감이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 13% 미만, 또는 10% 미만, 또는 5% 미만, 또는 0% 미만에서 불안감이 유도된다.
본 명세서의 이러한 특정 측면들에 따르면 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)의 다중 투여로 투여되며, 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단에서 일차접종 후 7일차와 비교하였을 때,
-열의 증가는 없고, 및/또는
-적어도 50% 미만, 또는 적어도 45% 미만, 또는 적어도 40% 미만의 피로가 유도되며, 및/또는
-근육통의 증가는 없거나, 또는 적어도 20% 미만, 또는 적어도 10% 미만의 근육통이 유도되며, 및/또는
-불안감의 증가는 없거나, 또는 적어도 80% 미만, 또는 적어도 60% 미만, 또는 적어도 40% 미만, 또는 적어도 20% 미만, 또는 적어도 10% 미만의 불안감이 유도된다.
특정 방법에 따르면, 상기 인간 대상 또는 인간 대상 집단은 지카 풍토성 지역 출신이다. 이러한 특정 방법에 따르면, 상기 인간 대상 또는 인간 대상 집단은 발병 대상지가 되는 지카 풍토성 지역 출신이다. 이러한 특정 방법에 따르면, 상기 인간 대상 또는 인간 대상 집단은 플라비바이러스 나이브이다.
특정 방법에 따르면, 상기 인간 대상 또는 인간 대상 집단은 지카 비-풍토성 지역 출신이다. 이러한 특정 방법에 따르면, 상기 인간 대상 또는 인간 대상 집단은 발병 지역으로 여행하는 지카 비-풍토성 지역 출신이다. 이러한 특정 방법에 따르면, 상기 인간 대상 또는 인간 대상 집단은 플라비바이러스 나이브이다.
특정 방법에 따르면, 상기 인간 대상 또는 인간 대상 집단은 히스패닉, 라틴계, 아메리카 인디언, 알래스카 원주민, 아시아인, 흑인 또는 아프리카계 미국인, 하와이 원주민 또는 백인 또는 이들의 혼성이다.
특정 방법에 따르면, 상기 인간 대상 또는 인간 대상 집단의 연령은 18세 내지 29세이다.
특정 방법에 따르면, 상기 인간 대상 또는 인간 대상 집단의 연령은 30세 내지 49세이다.
본원에 개시된 백신 또는 면역원성 조성물은 본원에 개시된 방법의 용도로 또한 개시된다.
본원에 개시된 바와 같은 방법의 약제의 제조에서 본원에 개시된 바와 같은 백신 또는 면역 원성 조성물의 용도가 또한 본원에 개시된다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 비-인간 세포 개작된 지카 바이러스를 함유하는 백신 및/또는 면역원성 조성물을 투여한 후, 인간 대상에서 유도되는 보호성 면역학적 반응은 비-인간 세포 성장에 대하여 개작되지 않은 지카 바이러스를 함유하는 및/또는 상이한 비-인간 세포 개작 돌연변이를 포함하는 백신 및/또는 면역원성 조성물이 투여된 대응 인간 대상에서 유도된 면역학적 반응보다 더 크다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 비-인간 세포 개작된 지카 바이러스를 함유하는 백신 및/또는 면역원성 조성물을 투여한 후 인간 대상에서 유도된 보호성 면역학적 반응은 비-인간 세포 성장에 대하여 개작되지 않은 지카 바이러스를 함유하는 및/또는 상이한 비-인간 세포 개작 돌연변이를 포함하는 백신 및/또는 면역원성 조성물이 투여된 대응 인간 대상에서 유도된 면역학적 반응보다 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%,적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 더 크다. 보호성 면역학적 반응을 측정하는 방법은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 비-인간 세포 개작된 지카 바이러스를 함유하는 백신 및/또는 면역원성 조성물을 투여하면 당해 인간 대상에서 지카 바이러스에 대한 중화 항체 생성이 유도된다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 비-인간 세포 개작된 지카 바이러스를 함유하는 백신 및/또는 면역원성 조성물을 투여하면 당해 인간 대상에서 지카 바이러스에 대한 중화 항체 생성이 유도되는데, 이때 이 양은 개작되지 않은 지카 바이러스를 함유하는 및/또는 상이한 비-인간 세포 개작 돌연변이를 포함하는 백신 및/또는 면역원성 조성물이 투여된 대응 인간 대상에서 유도된 중화 항체의 양보다 더 많다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 비-인간 세포 개작된 지카 바이러스를 함유하는 백신 및/또는 면역원성 조성물을 투여하면 개작되지 않은 지카 바이러스를 함유하는 및/또는 상이한 비-인간 세포 개작 돌연변이를 포함하는 백신 및/또는 면역원성 조성물이 투여된 대응 인간 대상에서 유도된 중화 항체의 양보다 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%,적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 더 많은 양의 지카 바이러스에 대한 중화 항체 생성이 당해 인간 대상에서 유도된다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 비-인간 세포 개작된 지카 바이러스를 함유하는 백신 및/또는 면역원성 조성물을 투여하면 개작되지 않은 지카 바이러스를 함유하는 및/또는 상이한 비-인간 세포 개작 돌연변이를 포함하는 백신 및/또는 면역원성 조성물이 투여된 대응 인간 대상에서 유도된 중화 항체의 양보다 적어도 약 1-배, 적어도 약 2-배, 적어도 약 3-배, 적어도 약 4-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 6-배, 적어도 약 7-배, 적어도 약 8-배, 적어도 약 9-배, 적어도 약 10-배, 적어도 약 100-배, 또는 적어도 약 1000-배 더 큰 양으로 지카 바이러스에 대한 중화 항체 생성이 당해 인간 대상에서 유도된다. 인간 대상에서 중화 항체를 측정하는 방법은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다.
바람직하게는, 치료 유효량 또는 면역원성 양은 질환 증상의 치료 또는 예방을 야기하는데 충분하다. 적합한 용량은 약 2μg, 약 5μg 또는 약 10μg, 특히 약 10μg이다.
본 명세서는 하기 실시예들을 참조하면 더욱 충분히 이해될 것이다. 이들은 하지만, 본 발명의 임의의 양상 또는 범위를 어떤 방식으로든 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예
실시예 1: 클론 지카 바이러스 계열 생성
본 실시예에서는 공지된 연구 이력을 갖는 지카 바이러스 (ZIKAV) 계열의 생산을 설명한다.
재료와 방법
Vero 세포 유지
한 바이알의 WHO Vero 10-87 세포가 수조에서 신속하게 해동되고, 그리고 36℃+/2℃, 5% CO2에서 T-75cm2 플라스크에서 페니실린-스트렙토마이신, L-글루타민 40mM 및 10% FBS를 내포하는 19mL 사전-가온된(pre-warmed) DMEM (Dulbecco의 변형된 최소 필수 배지) 내로 직접적으로 접종되었다. 세포는 합류까지 성장하도록 허용되고 TryplE를 이용하여 계대배양되었다. 이러한 플라스크는 2개의 T-185cm2 플라스크로 확대되고, 합류까지 성장되고, 그리고 31 x T-185cm2 플라스크로 계대배양되고, 세포가 100% 합류에 도달할 때까지 성장되었다. 세포는 트립신처리에 의해 수확되고, 800 x g에서 10 분 동안 원심분리되고, 그리고 10% FBS 및 10% DMSO를 내포하는 DMEM에서 1.9x107 세포/mL의 농도로 재현탁되었다. 한 바이알의 Vero 세포가 신속하게 해동되고, 전술된 바와 같이 T-75cm2 플라스크 내로 소생되었다. 이들은 13 x T-185cm2 플라스크에서 세포 은행을 생산하기 위해 2회 계대배양되었다. 트립신처리 후, 이들 세포는 800 x g에서 원심분리되고, 그리고 동결 배지 (10% FBS 및 10% DMSO를 내포하는 DMEM)에서 4.68x105 세포/mL의 농도로 재현탁되었다. 이러한 세포 은행은 저온바이알 내로 분취되었다.
이들 Vero 세포는 페니실린-스트렙토마이신, L-글루타민 및 10% FBS를 내포하는 DMEM (cDMEM-10%-FBS)에서 성장되고 유지되었다. 세포를 유지하고 트립신화하는데 TryplExpress가 이용되었다. 바이러스 흡착 전 2 일 시점에, 6-웰 평판이 3 mL의 cDMEM-10%-FBS에서 4-5 x 105 세포/웰, 또는 T-25cm2 플라스크에서 5 mL cDMEM-10%-FBS에서 7 x 105 세포, 또는 96-웰 평판에서 0.1mL cDMEM-10%-FBS에서 1 x 104 세포/웰로 파종되었다. 지시된 온도가 유지되는 지 인큐베이터를 매일 모니터링하였다. VERO 세포주는 액체 질소에서 보관되었다.
플라크 검정
바이러스 역가는 6-웰 평판에서 성장된 Vero 세포의 새로운 합류성 단층에서 플라크 적정에 의해 결정되었다. 동결된 분취량은 해동되었고, 그리고 이들 분취량의 10 배 연속 희석액이 96-웰 평판에서 cDMEM-0%-FBS에서 만들어졌다. 희석된 바이러스는 Vero 세포 단층의 접종에 앞서 얼음 위에 유지되었다. 검정 시점에서, 성장 배지가 6-웰 평판으로부터 흡인되었고, 그리고 100 μL의 각 바이러스 희석액이 웰에 첨가되었다. 바이러스는 세포 시트의 건조를 예방하기 위해 평판을 빈번하게 (10 분 마다) 흔들면서, 36℃±2℃, 5% CO2에서 60 분 동안 흡착되었다. 바이러스 흡착 이후에, 40-41℃에서 유지된 4 mL의 제 1 아가로오스 오버레이 (1X cDMEM-2%-FBS + 0.8% 아가로스)가 각 웰에 첨가되었다. 아가로오스는 실온에서 30 분 동안 굳어지도록 두었고, 그리고 평판은 이후, 36℃+/2℃, 5% CO2에서 4-6 일 동안 뒤집어 배양되었다. 160μg/mL의 중성 적색 생체 염료를 내포하는 2 mL의 제 2 아가로오스 오버레이가 4 일 시점에서 첨가되었다. 플라크는 5 일자 및 6 일 시점에서 시각화되었다.
TCID50 검정에 의한 바이러스 정량
바이러스 역가는 또한, 96-웰 평판에서 성장된 Vero 세포의 새로운 합류성 단층에서 적정에 의해 결정되었다. 동결된 분취량은 해동되었고, 그리고 이들 분취량의 10 배 연속 희석액이 96-웰 평판에서 cDMEM-2%-FBS 희석제에서 만들어졌다. 희석된 바이러스는 Vero 세포 단층의 접종에 앞서 얼음 위에 유지되었다. 검정 시점에서, 성장 배지가 96-웰 평판으로부터 흡인되었고, 그리고 100 μL의 각 바이러스 희석액이 웰에 첨가되었다. 평판은 36℃+/2℃, 5% CO2에서 5 일 동안 배양되었다. 50% 조직 배양 감염 용량 (TCID50) 역가는 Reed/Muench 계산기를 이용하여 계산되었다.
검사 물품
지카 바이러스 계열 PRVABC59 (드라이아이스 위에서 하나의 0.5 mL 바이알)는 미국 질병통제예방센터 (CDC)로부터 제공받았다. 지카 바이러스 식별은 RT-PCR을 통해 확증되었다. 상기 계열은 PCR에 의해 알파바이러스(Alphavirus)와 미코플라스마 오염에 대해 음성으로 검사되었다. 이 정보는 표 1에서 요약된다.
Figure pct00008
염기서열결정
QIAampViral RNA Mini Spin 키트가 제조업체 프로토콜에 따라서, 각 분리주의 안정된 바이러스 수확물로부터 RNA를 추출하는데 이용되었다. 각 분리주로부터 추출된 RNA는 온전체 지카 바이러스 게놈을 포괄하는 6개의 cDNA 단편을 창출하고 증폭하는데 이용되었다. 증폭된 cDNA 단편은 1% 아가로스/TBE 겔에서 크기와 순도에 대해 분석되고, 그리고 차후에, Qiagen Quick Gel Extraction Kit를 이용하여 겔 정제되었다. ABI 3130XL Genetic Analyzer 서열분석기가 자동 염기서열결정 반응을 수행하는데 이용되었다. Lasergene SeqMan 소프트웨어가 염기서열결정 데이터를 분석하는데 이용되었다.
결과
아메리카에서 현재 ZIKAV 발병과 유관한 공지된 연구 이력을 갖는 ZIKAV 계열이 찾았다. 이런 이유로, ZIKAV 계열 PRVABC59가 선택되었다. Vero 세포에서 성장에 대해 적응된 충분히-특징화된 바이러스를 산출하기 위해, ZIKAV PRVABC59는 우선적으로 Vero 세포 (P1)에서 증폭되었다.
Vero 세포의 100% 합류성 플라스크 (T-175cm2)는 4mL의 cDMEM-0%-FBS에서 0.01의 MOI로 감염되었다. 바이러스는 36℃±2℃, 5% CO2에서 60 분 동안 단층에 흡착되었고, 이후 바이러스 증폭을 위해 20 mL의 cDMEM-0%-FBS가 36℃±2℃, 5% CO2에서 적용되었다. 세포 층은 접종 이후에 세포변성 효과 (CPE)에 대해 매일 모니터링되었다 (도 1). 96 시간 후, 배지를 수집하고 원심분리 (600 x g, 4℃, 10 분)에 의해 투명하게 함으로써 상청액이 수확되었다. 수확물은 트레할로스를 18% w/v의 최종 농도로 첨가함으로써 안정되었다. 벌크를 0.5mL 저온유리병(cryovials)에 분취하고 -80℃에서 보관하였다.
안정된 P1 수확물은 TCID50 검정에 의해, Vero 세포 단층에서 감염성 바이러스의 존재에 대해 분석되었다. 성장 동역학은 0 시각에서 시작하여, 매일 분취량을 채취함으로써 모니터링되었다. 피크 역가는 72 시각에 도달되었다 (도 2).
P1 물질은 Vero 세포의 6-웰 단층에서 3 일자부터 수확물을 적정함으로써 플라크-정제되었다. 플라크는 6 일 시점에서 가시화되었고, 그리고 단리되는 10개의 플라크는 플라스틱 평판의 바닥에서 상이한 별개의 플라크 주변에 원을 그림으로써 확인되었다. 플라크는 웰의 바닥을 긁어내고 cDMEM-10%-FBS로 헹구면서, 무균 넓은 보어(bore) 피펫을 이용하여 아가로스의 플러그를 추출함으로써 선발되었다. 아가로오스 플러그는 0.5 mL의 cDMEM-10%-FBS에 첨가되고, 와동되고(vortexed), PRVABC59 P2a-j로서 라벨되고, 그리고 36℃±2℃, 5% CO2에서 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배치되었다.
3개의 플라크 (PRVABC59 P2a-c)가 추가 정제를 위해 이행되었다. 각 분리주는 Vero 세포의 새로운 6-웰 단층 위에 이중으로 말끔하게 도말되었다. 이러한 P2/P3 이행(transition)은 플라크 정제되고, 그리고 PRVABC59 P3a-j로서 라벨되었다.
6개의 플라크 (PRVABC59 P3a-f)가 최종 라운드의 정제를 위해 이행되었다. 각 분리주는 Vero 세포의 새로운 6-웰 단층 위에 이중으로 말끔하게 도말되었다. 이러한 P3/P4 이행(transition)은 플라크 정제되고, 그리고 PRVABC59 P4a-j로서 라벨되었다.
P4 플라크 정제로부터 6개의 플라크 (PRVABC59 P4a-f)가 T-25 cm2 플라스크에서 Vero 세포의 단층에서 블라인드 계대되었다. 각 플라크 선발은 2 mL cDMEM-0%-FBS에서 희석되었고 - 1 mL는 36℃±2℃, 5% CO2에서 1 시간 동안 흡착되었고; 다른 1 mL은 트레할로스 (18% v/v 최종)로 안정되고 <-60℃에서 보관되었다. 바이러스 흡착 이후에, cDMEM-0%-FBS가 각 플라스크에 첨가되고 36℃±2℃, 5% CO2에서 4 일 동안 성장하도록 두었다. 바이러스 상청액은 수확되고, 원심분리 (600 x g, 4C, 10 분)에 의해 투명해지고, 18% 트레할로스에서 안정되고, 분취되고, 그리고 <-60℃에서 보관되었다. 이러한 P5 씨드(seed)는 TCID50에 의해 지카 바이러스 효능에 대해 검사되었다 (도 3).
Vero 세포의 T-175cm2 플라스크의 합류성 단층은 4mL cDMEM-0%-FBS에서 0.01의 MOI로 PRVABC59의 6개 클론 (P5a-f) 각각으로 감염되었다. 상기 바이러스는 36℃+/2℃, 5% CO2에서 60 분 동안 흡착하도록 두었고, 그 후 20 mL의 cDMEM-0%-FBS가 각 플라스크에 첨가되고 36℃+/2℃, 5% CO2에서 성장하도록 두었다. Vero 세포 단층 건강과 CPE는 매일 모니터링되었다. 바이러스는 지시된 바와 같이 3 일 시점과 5 일 시점에서 수확되었다 (도 4). 3 일 시점 및 5 일 시점으로부터 P6 계열 수확물은 모아지고, 18% 트레할로스로 안정되고, 분취되고, 그리고 <-60℃에서 보관되었다.
PRVABC59의 6개 클론 (P6a-f) 각각은 지카 바이러스 시험관내 효능에 대해 검사되었다 (도 5). 상기 효능은 2가지 상이한 방법, TCID50 및 플라크 적정에 의해 결정되었다. TCID50은 CPE의 시각적 검사 (현미경)에 의해, 그리고 적색 (CPE 없음)과 비교하여 CPE (황색 칼라)를 전시하는 웰의 흡광도에서 차이 (A560-A420)를 계측함으로써 계산되었다. 평판은 평판 판독기에서 판독되고, 그리고 현미경적으로 판독-평판 (흡광도)과 동일한 계산기에 적용되었다. 이들 2가지 채점 기술 사이에 TCID50에서 값은 상당히 유사한 반면, 플라크 적정에 의해 획득된 값은 더욱 낮다.
P6 바이러스의 산출 및 특징화의 요약은 아래의 표 2에서 도시된다.
Figure pct00009
본래 분리주의 외피 당단백질 서열과 매우 유사한 단리된 지카 바이러스 클론이 추구되었는데, 그 이유는 플라비바이러스의 외피 단백질이 상기 바이러스의 지배적인 면역원성 부분이기 때문이다. PRVABC59 클론 P6a, P6c, P6d와 P6f는 외피 잔기 330에서 Val→Leu의 아미노산 돌연변이를 유발하는, 외피 영역 내에 뉴클레오티드 990에서 G→T돌연변이 (G990T)를 내포하였고, 반면 PRVABC59 클론 P6b와 P6e의 외피 유전자는 표준 계열과 비교하여 동일하였다 (GenBank 참조 KU501215.1) (표 3 및 도 6).
Figure pct00010
상기 외피 서열에서 돌연변이가 결여된 2개의 클론은 이후, 전체 게놈 염기서열결정에 종속되었다. 염기서열결정 결과는 상기 표 3에서 요약된다. 서열 분석에서 양쪽 클론에 대한 NS1 영역 내에 뉴클레오티드 292에서 T→G치환은 NS1 잔기 98에서 Trp→Gly돌연변이를 유발하였던 것으로 나타났다. 이러한 돌연변이는 또한, 심층(deep) 염기서열결정을 통해 추후 확증되었다. NS1 W98G 돌연변이는 막 연관, 외피 단백질과의 상호작용 및 잠재적으로 육합체(hexameric) NS1 형성에 연루된, ZIKAV NS1의 날개(wing) 도메인의 뒤얽힌(intertwined) 루프에서 위치된다. 다른 트립토판 잔기 (W115, W118)는 플라비바이러스의 전역에서 고도로 보존되는 반면, W98은 그렇지 않다 (도 7). 그러나, 흥미롭게도, 아프리카와 아시아 계통으로부터 것들을 비롯한, 11가지 상이한 ZIKAV 계열의 전역에서 W98 잔기의 100% 보존이 관찰된다. 각 계열에서 확인된 돌연변이는 표 4에서 요약된다.
Figure pct00011
이들 ZIKAV 클론을 특징짓기 위해 ZIKAV PRVABC59 P6 스톡의 표현형 분석이 수행되었다. 도 8에서 예시되고, 도 9에서 정량된 바와 같이, 각 클론 분리주는 크고 작은 플라크의 혼합된 집단을 가진 P1 바이러스와 비교하여, 큰-크기의 플라크의 상대적으로 균질한 집단으로 구성되었다. 이들 데이터는 단일 ZIKAV 클론의 성공적인 단리를 암시한다.
그 다음, ZIKAV PRVABC59 P6 클론의 Vero 세포에서 성장 동역학 분석물이 분석되었다. Vero 세포는 혈청 없는 성장 배지에서 0.01 TCID50/세포의 각 ZIKAV P6 클론으로 감염되었다. 바이러스 상청액 표본이 매일 채취되고, 그리고 TCID50 검정에 의해 감염성 역가에 대해 동시에 검정되었다. 모든 P6 클론의 경우에, 피크 역가가 3 일과 4 일 시점 사이에 발생하였다 (~9.0 log10 TCID50/mL). 다양한 P6 클론의 성장 동역학에서 어떤 유의미한 차이도 없었다 (도 10).
종합하면, 이들 결과는 지카 바이러스 씨드가 성공적으로 산출되었다는 것을 지시한다. 이러한 씨드 선별은 상기 바이러스의 성장 이력, 동역학, 수율, 유전자형 및 표현형에 관한 이해를 요구하였다. 중요한 것은, 지카 바이러스 계열의 클론 단리는 오염 작용제 (예를 들면, 부모 인간 분리주 내에 있을 수 있는 외래성 오염인자)로부터 멀리, 상기 바이러스의 성공적인 정제를 허용하였다. 흥미롭게도, 3번의 순차적 플라크 정제에서 Vero-세포 적응된 바이러스 (계열 P6a-f)가 성공적으로 빠르게 선별되었고, 여기서 이들 계열은 혈청 없는 Vero 세포 배양액에서 충분히 복제될 수 있었는데, 계열 P6a, c, d와 f는 바이러스 외피 단백질에서 돌연변이를 품는 반면, 계열 p6b와 p6e는 바이러스 NS1 단백질에서 돌연변이를 획득하였다 (바이러스 외피에 대한 변형 없음). 추가적으로, Vero-적응된 계열은 이들 계열로부터 증식된 차후 바이러스 계대의 효율적이고 재현 가능한 성장과 제조가 가능하였다. 이론에 결부됨 없이, 계열 P6a, c, d와 f에서 관찰된 Env-V330L 돌연변이는 잠재적으로, 시험관내 적응의 결과일 수 있는데, 그 이유는 Env 330에서 돌연변이가 Vero 세포에서 계대 시에도 관찰되었기 때문이다 (Weger-Lucarelli 외. 2017. Journal of Virology). 외피 단백질이 지카 바이러스의 지배적인 면역원성 에피토프이기 때문에, Env에서 Vero 적응성 돌연변이를 내포하는 계열은 백신 면역원성에 부정적인 충격을 줄 수 있다. 이론에 결부됨 없이, 단백질 NS1에서 적응 돌연변이는 바이러스 복제를 증강할 뿐만 아니라 예컨대, 지카 바이러스의 외피 단백질 E (Env)에서 바람직하지 않은 돌연변이의 발생을 감소시키거나 또는 만약 그렇지 않으면 저해할 수 있는 것처럼 보인다. 이에 더하여, NS1은 상기 바이러스의 살아있는 주기 동안 외피 단백질에 결합하는 것으로 알려질 수도 있다. 이 돌연변이 (NS1 W98G)는 상기 바이러스와 상종하고, 그리고 아마도 하류 처리 동안 상기 바이러스와 공동-정제되는(co-purify) NS1의 능력을 변화시키는 것에 연루될 수 있다. NS1은 또한, 면역원성인 것으로 알려져 있고, 그리고 백신에 대한 면역 반응에 연루될 수 있었다.
실시예 2: P6b와 P6e 계열로부터 유래된 정제된 비활성화된 지카 바이러스 백신 (PIZV)의 전임상 면역원성과 효력
다음 실시예는 CD1과 AG129 마우스에서, P6b와 P6e 계열로부터 유래된 비활성화된 지카 바이러스 백신 (PIZV)의 전임상 면역원성과 효력을 설명한다. 실시예 1에서 설명된 바와 같이, 6개의 클론이 유행병적으로 유관한 PRVABC59 계열로부터 생산되었고, 그리고 2개 (P6b와 P6e)가 추가 전임상 면역원성과 효력 연구를 위해 선택되었다.
재료와 방법
정제, 비활성화 및 지카 바이러스 백신의 조제
전임상 면역원성과 효력 연구에서 이용에 적합한 비활성화된 ZIKAV 백신이 많이 만들어졌고, 특징화되었다. 바이러스는 합류성 Vero 세포의 플라스크를 0.01의 MOI로 감염시킴으로써, P6b와 P6e 계열로부터 증폭되었다. 바이러스는 36℃± 2℃/5% CO2에서 1 시간 동안 흡착되었다. 흡착 이후에, 20 mL의 cDMEM-0%-FBS가 각 플라스크에 첨가되고, 그리고 36℃±2℃/5% CO2에서 5 일 동안 배양되었다. 세포 상청액이 감염 후 3 일 시점 및 5 일 시점에서 수확되었고, 그리고 세포 조직파편이 원심분리에 의해 투명해졌다.
각 분리주에 대해, 투명해진 상청액은 모아지고, 18% 트레할로스를 내포하는 DMEM에서 안정되고, <-60℃에서 보관되었다. 모아지고, 투명해진 바이러스 상청액은 37℃ 수조에서 해동되고 4℃에서 하룻밤 동안 벤조나아제로 처리되었다. 벤조나아제 처리 이후에, 각 표본은 Sartorius PP3 심층 필터에 적용되었다. 심층 여과 이후에, 각 표본은 Centricon Plus-70 접선 유동 여과 (TFF) 장치에 적용되었다. 농축물(Retentate)을 완충제 교환되었고, 희석되었고, 그리고 Sartorius SartobindQ IEXNano에 적용되었다. 각 표본은 제 2 Sartorius SartobindQ IEXNano에 적용되고, 그리고 250 mM, 500 mM 및 750 mM NaCl로 3 단계-용리 과정을 이용하여 용리되었다. MonoQ 크로마토그래피 및 희석 이후에, 각 250 mM 용출물은 완충제 교체을 위해 Centricon Plus-70 직교류 여과 (CFF) 장치에 적용되고, PBS로 35 mL로 희석되고, 2-8℃에서 보관되었다.
포르말린 비활성화를 위해, 부드럽게 돌리면서 0.02%의 최종 포름알데히드 농도를 획득하기 위하여, 갓(freshly) 제조된 1% 포름알데히드가 각 정제된 표본에 방울방울 첨가되었다. 표본은 실온 (~22℃)에서 14 일 동안 매일 역위(inversion)시키면서 배양되었다. 포름알데히드는 Centricon Plus-70 접선 유동 여과 (TFF) 장치에 적용되기 전, 실온에서 15' 동안 메타중아황산나트륨으로 중화되었다. 완충제 교체는 50 mL 원료의약품(Drug Substance) 완충제 (10 mM NaH2PO4, 50 mM NaCl, 6% 수크로스, pH 7.4)의 첨가에 의해 4회 수행되었다. 각 표본은 이후, 원료의약품 완충제(Drug Substance Buffer)로 15 mL로 희석되고, 0.2m 주입기 필터를 이용하여 살균되고, 마개로 막은 무균 유리 바이알 내로 분취되고 (바이알마다 0.5 mL), <-60℃에서 동결되었다.
바이러스 비활성화는 TCID50 검정 및 이중 감염성 검정(double infectivity assay)에 의해 확증되었다. 간단히 말하면, 원료의약품 표본이 C6/36 세포에 적용되고, 6 일 동안 증폭되도록 두었다. C6/36 세포로부터 상청액이 Vero 세포에 적용되었고, 그리고 CPE가 8 일 동안 모니터링되었다. 의약품 제형의 경우, PIZV 원료의약품의 바이알이 해동되고, 표본 유형에 따라 모아지고(pooled), 알하이드로겔 (Brenntag; 0.5 mg/mL 최종, 0.050 mg/용량)이 있거나 또는 없는 PBS에서 1μg/mL 또는 10μg/mL로 희석되고, 그리고 온건하게 교반하면서 2-8℃에서 하룻밤 동안 배양되었다. 생성 의약품 로트는 그 다음, 마개로 막힌 무균 유리 바이알 내로 분취되고, 이용될 때까지 2-8℃에서 보관되었다. 도 11은 의약품을 제조하는데 이용된 단계별 요약을 제공한다.
마우스 면역화와 공격접종(challenge)
면역원성 연구를 위해, 6-주령 수컷과 암컷 Swiss-ICR (CD-1) 마우스를 6개 군 (n = 10/군)으로 나누어졌다. 0 일자에서, 군 1-5에서 마우스에게 근육내 (i.m.) 루트 (2 x 0.05 mL 주사)를 통하여 0.1 mL의 백신이 접종되었다. 군 6에서 마우스는 위약 대조군으로서 PBS가 접종되었다. 마우스에게 0 일자와 동일한 용량과 백신 유형을 이용하여 28 일자 및 56 일자에서 추가접종되었다. 혈액 표본은 -1 일자 (면역-전), 27 일자 (일차 접종), 42 일자 (추가접종 1) 및 70 일자 (추가접종 2)에서 수집되었다.
면역원성과 효력 연구를 위해, 4-주령 수컷과 암컷 AG129 마우스를 7개 군 (n = 5/군)으로 나누었다. 0 일자에서, 군 1-6에서 마우스에게 근육내 (i.m.) 루트 (2 x 0.05 mL 주사)에 의해 0.1 mL의 백신이 접종되었다. 군 7에서 마우스는 위약 대조군로서 PBS가 접종되었다. 마우스는 0 일자에서와 동일한 용량과 백신 유형을 이용하여 28 일자에서 추가 접종되었다. 혈액 표본은 -1 일자 (면역-전), 27 일자 (일차 접종) 및 55 일자 (추가 접종)에서 꼬리 정맥으로부터 수집되었다. 안락사의 시점에서, 마우스는 이소플루란으로 깊은 마취 하에 심장 천자를 통해 채혈되었다 (최종). 56 일자에서, 마우스에게 104 플라크 형성 단위 (PFU)의 ZIKAV PRVABC59가 복막내로 공격접종되었다.
혈청 전달
혈청은 PIZV-예방접종된, 그리고 공격접종된 AG129 마우스로부터 수집되었고, 그리고 풀링 후 동결되었다 (표 6의 군 1, 2, 4 및 5). 혈청 풀(pool)은 해동되었고, 그리고 검사 물품은 PBS에서 혈청 풀의 3 배 희석에 의해 산출되었다. 위약은 PBS에서 AG129 정상 마우스 혈청의 3-배 희석을 이용하여 산출되었다.
검사 물품은 AG129 마우스 내로 0.1 mL 복막내 주사로서 투여되었다 (동등 체적의 위약 물품이 대조군 마우스에게 투여되었다). 동물은 그 다음, 100μL에서 104 플라크 형성 단위의 지카 바이러스 계열 PRVABC59로 복막내 공격접종되었다.
중량으로 허용가능 혈액량이 -11 일자 (면역화-전)에 10마리 마우스로부터 꼬리 출혈에 의해 전혈로서 수집되었다. 전혈은 꼬리 출혈에 의해 1 일자 (일차, 순환 Nab) 및 4 일자 (바이러스혈증)에서 각 마우스로부터 수집되었다. 치명적인 공격접종 후 최종 출혈은 경부 탈구에 의한 안락사 전, 더욱 큰 체적을 위한 깊은 마취 하에 심장 천자에 의해 수행되었다. 혈액 표본은 마이크로테이너 SST 혈청 분리 겔 튜브에서 수집되고, 원심분리 (10,000 x g 2 분 동안)에 의한 혈청의 분리 전 적어도 30 분 동안 응고하도록 허용되고, -80℃에서 동결되었다.
플라크 환원 중화 검사
중화 항체 역가는 기존 문헌에서 설명된 바와 같은 플라크 환원 중화 검사 (PRNT)에 의해 결정되었다 (참조: 예를 들면, Osorio 외. Lancet Infect Dis. 2014 Sep;14(9):830-8).
리포터 바이러스 입자 (RVP) 중화 검정
중화 항체 역가는 96-웰 평판에서 성장된 Vero 세포에서 일정한 양의 지카 RVPs를 갖는 혈청 표본의 적정에 의해 분석되었다. RVPs는 지카 (계열 SPH2012)의 prME 단백질 및 뎅기(Dengue)-기반의 레닐라 루시페라아제 리포터를 내포하였다. 간단히 말하면, 혈청은 56℃에서 30 분 동안 열에 의해 비활성화되고, 희석되고, 그리고 이후, 37℃에서 RVPs와 함께 배양되었다. 혈청/RVP 혼합물은 이후, Vero 세포와 혼합되고, 그리고 루시페라아제 기질(substrate)로 검출 전, 37℃± 2℃/5% CO2에서 72 시간 동안 배양되었다. 데이터는 양성 추적 대조에 대해 표준화된 JMP11 비-선형 4 매개변수 분석을 이용하여 분석되었고, 그리고 유효 용량 50% (EC50)이 보고되었다.
반대 지시가 없는 한, 모든 추가 실험 방법은 상기 실시예 1에서 설명된 바와 같이 실행되었다.
결과
6 주령 수컷과 암컷 CD-1 마우스에서 PIZV 후보의 면역원성을 사정하기 위해, CD-1 마우스 군 (N=10/군)은 i.m. 루트에 의해, ZIKAV PRVABC69 P6b 또는 P6e 바이러스 계열 중에서 어느 한 가지로부터 유래된 0.1μg (+ 백반), 1.0μg (+ 백반) 용량의 백신 중에서 어느 한 가지로 면역화되었다. 어쥬번트에 대한 필요성을 평가하기 위해, 하나의 동물 군은 P6e으로부터 유래되고, 백반 어쥬번트가 결여된 0.1μg의 백신으로 예방접종되었다. 예방접종은 0, 28 및 56 일자에 일어났는데, 군 6은 위약 대조로서 PBS를 제공받았다 (도 12a 및 표 5).
Figure pct00012
예방접종 이후에, 일차 (27 일자), 이차 (40 일자) 및 삼차 (70 일자) 면역화 후 수집된 혈청 표본은 RVP 중화 검정에 의해 ZIKAV-특이적 중화 항체에 대해 검사되었다 (도 12b). 제 1 투약을 제공받은 후 27 일에, 약간의 중화 항체 반응이 PBS 위약 대조군과 비교하여, 백반을 내포하는, 어느 한쪽 클론으로부터 유래된 PIZV로 예방접종된 마우스에서 관찰되었다. 중요한 것은, 이러한 반응은 제 2 면역화 (40 일자) 시에는 유의미하게 증가하였지만, 제3 투약 (70 일자)으로 면역화 시에는 추가적으로 강화되지 않았다. 비-어쥬번트화된 백신으로 예방접종된 마우스에서는 어떤 중화 항체 반응도 관찰되지 않았다 (도 12b).
PIZV 후보의 면역원성 및 보호 효력을 사정하기 위해, 4 주령 AG129 마우스(n=5/군)는 i.m. 루트에 의해 1 일자 및 28 일자에 ZIKAV PRVABC59 P6b 또는 P6e 스톡 중에서 어느 한 가지로부터 유래된 0.1μg 용량 (+백반), 1.0μg 용량 (+백반) 또는 0.1μg 용량 (-백반)의 백신 중에서 어느 한 가지로 면역화되었다 (도 13a 및 표 6).
Figure pct00013
예방접종 이후에, 예방접종된 마우스 및 대조군 마우스는 56 일자에서 104 PFU의 ZIKAV PRVABC59 (낮은 계대)로 복막내 공격접종되었다. 일차 (D27) 및 이차 (D55) 면역화 후 수집된 혈청 표본은 ZIKAV-특이적 중화 항체 반응에 대해 검사되었다 (도 13b 및 표 7). 높은 용량의 백반-어쥬번트화된 백신만을 제공받는 군 (군 2와 5)만 단일 면역화 후 중화 항체 반응을 이끌어 냈는데, 상기 반응은 추가 접종한 후 극적으로 증가하였다. 대조적으로, 낮은 또는 높은 용량 중에서 어느 한 가지의 백반-어쥬번트화된 백신을 제공받는 군은 제 2 투약 후 높은 중화 항체 반응을 만들었다. 백신의 2회 투약을 제공받을 시에, 용량 또는 P6 클론으로부터 파생과 상관없이, 백반-어쥬번트화된 백신을 제공받는 마우스 군 사이에는 통계학적 차이가 없었다.
Figure pct00014
모든 군은 공격접종후 21 일 동안 사망률, 이환율 및 체중 감소에 대해 또한 모니터링되었다. 공격접종 이후에 바이러스혈증은 플라크 적정에 의해 검출되고 정량되었다. 백반으로 제형화된 낮은 또는 높은 용량의 PIZV 후보로 예방접종된 마우스 (군 1, 2, 4 및 5)는 플라크 환원 중화 검사 (PRNT) 검정뿐만 아니라 필적하는 이차 중화 검정에 의해 사정될 때, 치명적인 ZIKAV 공격접종으로부터 완전히 보호되었다 (표 8). 예방접종된 마우스에서 체중 감소 또는 질병의 임상적 징후가 전혀 관찰되지 않았고, 공격접종후 3 일에 이들 마우스에서 감염성 바이러스혈증이 전혀 검출되지 않았고, 그리고 낮은 또는 높은 용량 항원+백반 어쥬번트 중에서 어느 한 가지로 예방접종된 모든 마우스는 공격접종-후 21 일까지 생존하였다 (도 14-16). 대조적으로, 모든 나이브 마우스의 공격접종은 공격접종후 2 일자에서 높은 바이러스혈증, 그리고 공격접종후 10 일자 및 18 일자 사이에 이환/사망 (중앙 생존 = D13)을 유발하였다. 추가적으로, 계열 P6b로부터 유래된 비-백반-어쥬번트화된 낮은 용량 백신으로 예방접종된 마우스의 공격접종은 공격접종후 2 일자에서 높은 바이러스혈증 및 위약 대조군과 유사한 중앙 생존 일을 유발하였고, 반면 클론 e로부터 유래된 비-백반-어쥬번트화된 낮은 용량으로 예방접종된 마우스는 19 일의 중앙 생존으로, 부분적으로 보호된 상태로 있었다. 이들 결과는 백반이 함께 있을 때 면역화가 더욱 효과적이고, 이차 면역화가 필요할 수도 있고, 그리고 낮은 용량이 높은 용량만큼 효과적이라는 것을 지시한다.
Figure pct00015
추가적으로, 전체 비활성화된 P7b와 P7e 바이러스 (각각, P6b와 P6e 계열로부터 1회 추가 계대)로부터 생산된 백신 원료의약품 (DS)에서 NS1의 존재가 검사되었다. 지카 바이러스 NS1의 아시아와 아프리카 계통 둘 모두에 반응성이지만, 뎅기 NS1에 비-교차-반응성인 단일클론 항체로 사전-피복된 평판을 이용하여 샌드위치 ELISA가 수행되었다. DS의 2-배, 4-배, 8-배, 16-배 및 32-배 희석 복제물(duplicate)이 제조되고, 그리고 재조합 정제된 NS1을 0-8 ng/mL의 농도에서 이중으로 이용하여 표준 곡선과 비교되었다. DS 완충제 단독의 희석 복제물이 음성 대조군로서 준비되었다. 결합된 NS1은 항-NS1 HRP-접합체로 검출되었고, 그리고 DS 완충제 단독을 포함하는 웰의 흡광도 (A450-A630)가 정합 DS 표본을 내포하는 웰에서 계측된 흡광도로부터 감산되었다. 샌드위치 ELISA의 결과는 아래의 표 9에서 도시된다. 흥미로운 것은, NS1은 백신 원료의약품 제조물과 동시 정제되는 것으로 관찰되었는데, 이것은 바이러스 NS1이 비활성화된 온전체 바이러스 백신의 면역원성 성분일 수 있다는 것을 암시한다.
Figure pct00016
항체의 수동 전달 후 야생형 지카 바이러스 공격접종으로부터 보호를 부여하는데 필요한 중화 항체 (Nab)의 역치가 그 다음 검사되었다. (표 10A와 B).
[표 10A]
Figure pct00017
[표 10B]
Figure pct00018
예방접종된 및 공격접종된 AG129 마우스로부터 혈청 풀은 PBS에서 3-배 연속 희석되고 5-6 주령 AG129 마우스의 7개 군 (N=5/군) 내로 복막내 주사되었다. 면역-전 AG129 마우스 혈청은 위약 대조군 (군 8)로서 이용되었다. 수동 전달 이후에 (~16-19 시간 후), 전혈이 수집되었고, 그리고 순환하는 중화 항체 역가의 결정을 위해 바이러스 공격접종에 앞서 각 마우스로부터 혈청이 원심분리에 의해 분리되었다 (도 17). 바이러스 공격접종 직전에, 마우스의 군 (군 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8로서 지정됨)은 각각, 2.69, 2.26, 1.72, 1.30, <1.30, <1.30, <1.30, <1.30의 평균 log10 중화 항체 역가를 가졌다.
ZIKV nAbs의 수동 전달 후 24 시에, 마우스는 104 pfu의 ZIKV PRVABC59로 복막내 공격접종되었다. 공격접종 이후에, 동물은 매일 칭량(weighed)되고, 그리고 질병의 징후에 대해 28 일 동안 하루 1-3회 모니터링되었다. 증상에 근거하여 각 동물에 임상적 점수가 매겨졌다 (표 11). 빈사 상태(moribund)이고 및/또는 명백한 신경학적 징후 (임상적 점수 ≥2) 를 보여주는 동물은 인도적으로 안락사되고, 비-생존개체로서 계수되었다.
Figure pct00019
질환 징후는 대조군 (군 8) 및 군 5-7에서 공격접종 후 9 일에, 체중에서 상응하는 상실로 나타나기 시작하였다 (도 18). 전혈이 수집되었고, 그리고 혈청이 공격접종후 3 일에 각 동물로부터 원심분리에 의해 분리되었다. 혈청 표본은 플라크 적정 검정을 이용하여 감염성 ZIKV의 존재에 대해 분석되었다 (도 19). 군 1-8에서 마우스에 대한 평균 감염성 역가 (log10 pfu/mL)는 각각, 1.66, 2.74, 4.70, 4.92, 7.24, 7.54, 7.54 및 7.46이었다. 중요한 것은, 검출가능한 수준의 ZIKV 중화 항체 (≥1.30 log10)를 갖는 군 1-4의 마우스는 대조군 마우스보다 통계학적으로 유의적으로 더 낮은 수준 (102.5-배 내지 106.0-배 더 낮은 역가)의 바이러스혈증 (p = 0.0001, 0.0003, 0.0007 및 0.0374)을 가졌다. 이들 결과는 검출가능한 수준의 ZIKV 중화 항체 (≥1.30 log10)가 바이러스혈증을 용량 의존성 방식으로 감소시킨다는 것을 암시하였다.
군 1-8의 마우스의 중앙 생존 일은 차례로 다음과 같다: 측정되지 않음, 17 일, 17 일, 13 일, 11 일, 11 일, 11 일, 그리고 10 일 (도 20). 중요한 것은, 검출가능한 ZIKV 중화 항체 역가를 갖는 마우스 군 (군 1-4)에 대한 생존 곡선은 대조군 (군 8)과 비교하여 통계학적으로 상이하였다 (각각, p = 0.0019, 0.0019, 0.0019, 0.0153). 이들 결과는 검출가능한 수준 (≥1.30 log10)의 ZIKV 중화 항체가 질환의 발병을 용량 의존성 방식으로 지연시킨다는 것을 암시하였다.
끝으로, 최종적으로, 각 동물의 ZIKV 중화 항체 역가가 이의 상응하는 바이러스혈증 역가에 대해 도표화되었고, 그리고 선형 회귀 분석이 수행되었다. 공격접종후 3 일자에서 ZIKV 중화 항체 역가 및 바이러스혈증 수준 사이에 역으로 매우 상관된 관계가 관찰되었다 (도 21). 수동 전달 연구로부터 결과의 요약은 아래의 표 12에서 도시된다.
Figure pct00020
ZIKAV 중화 항체를 제공받는 마우스 군 중에서 어느 것도 이러한 실험에서 치명적인 ZIKAV 공격접종으로부터 완전히 보호되지는 않았지만, 검출가능한 수준의 순환하는 ZIKAV 중화 항체 역가를 갖는 마우스 군 사이에 투여량-의존성 방식으로, 감소된 바이러스혈증 수준 및 질환의 지연된 발병이 증명되었다.
종합하면, CD-1과 AG129 마우스 연구의 둘 모두로부터 전임상 데이터는 별개의 충분히(well)-특징화된 바이러스 클론으로부터 유래된 PIZV가 면역원성이고, 그리고 야생형 ZIKAV로 공격접종에 대항한 보호를 제공할 수 있다는 것을 지시한다. 중요한 것은, 낮은 백신 용량 및 높은 백신 투여량은 2회 투약 후 유사한 중화 항체 반응을 유도하였고, 그리고 치명적인 ZIKAV 공격접종에 대항한 유사한 수준의 보호를 제공하였다. 흥미로운 것은, 어쥬번트화되지 않았던 PIZV 후보로 예방접종된 마우스는 또한, ZIKAV 공격접종으로부터 부분적인 보호를 보여주었다. 백신 항혈청은 수동적으로 면역화된 AG129 마우스에서 바이러스혈증을 유의미적으로 축소시키고, 그리고 치명적인 ZIKAV 공격접종에 대항하여 생존을 연장시켰다. 이들 결과는 또한, 충분히-특징화된 PIZV 후보가 ZIKAV-감수성이 매우 큰(susceptible) AG129 마우스 모델에서 ZIKAV 감염에 대항하여 매우 유효하다는 것을 증명한다.
추가적으로, 계대 7에서 PRVABC59의 서열 (PRVABC59 P6e로부터)은 계대 6의 것과 유전적으로 동일한 것으로 밝혀졌다. 플라비바이러스가 일반적으로, 유전적으로 불안정한(labile) 것으로 간주된다는 점을 고려하면, 이것은 놀라운 것이다. PRVABC59 P6e는 부분적으로, 7 계대에 걸친 이의 유전적 안정성으로 인해 마스터(master) 바이러스 씨드로서 선별되었다. 이론에 결부되지 않고, 이러한 증강된 유전적 안정성은 NS1의 날개 도메인에서 단일 아미노산 치환 (W98G)에 기인할 수 있는 것으로 생각되는데, 그 이유는 이것이 Vero 세포-개작된(adapted) PRVABC59 P6 게놈에서 관찰되는 유일한 돌연변이이었기 때문이다. 추가적으로, 유전적 안정성과 균질성은 백신 제형에 이용될 수 있는 후속(subsequent) 계열의 가변성을 감소시키고, 이들 계열의 재현가능한 생산을 증가시킨다는 점에서 유리하다.
실시예 3: P6a와 P6e 계열의 표현형의 전임상(preclinical) 평가
재료와 방법
AG129 마우스 (인터페론 α/β 및 γ 수용체를 결여)는 ZIKV 감염 및 뇌에서 심각한 병리를 비롯한 질환에 감수성이다. 14-주령(week-old) AG129 마우스에게 104와 103 pfu의 ZIKV 계대 6개의 클론 a(P6a)와 e(P6e)를 복막내 감염시켰다.
마우스는 칭량되고, 그리고 질병의 임상적 징후 (체중 감소, 헝클어진 털, 웅크린 자세, 기면, 사지 허약, 부분적인/완전 마비)에 대해 매일 모니터링되었다 (28 일까지). 추가적으로, 실시예 1에서 설명된 바와 같이, 공격접종-후 3 일에 수집된 혈청 표본의 플라크 적정에 의해, 바이러스혈증의 분석이 수행되었다.
결과
P6e로 감염은 100% 사망 (중앙 생존 시간 = 12.5 일)을 유발하였고, 반면 P6a로 감염은 단지 33% 사망 (중앙 생존 시간 = 결정안됨)만을 유발하였다 (도 22). 이것과 합치하게, preMVS P6e 감염된 마우스는 PRVABC59 P6a 감염된 마우스와 비교하였을 때, 더 큰 체중 감소를 보여주었다 (3). PRVABC59 P6a 또는 P6e으로 감염된 마우스 군 사이에 평균 군(group) 바이러스혈증 수준에서 어떤 통계학적 차이도 발견되지 않았다 (도 24). 이들 데이터는 성장 동역학이 단독으로 핵심 결정인자일 수 없고 (그 이유는 양쪽 계열이 유사한 바이러스혈증, 그리고 시험관내에서 유사한 피크 역가를 발생시켰기 때문에), 그리고 외피 단백질의 특징이 독력 (야생형 계열의) 및 면역원성 (비활성화된 후보의)에 중요할 수 있다는 것을 암시한다.
실시예 4: 비활성화의 유용성을 결정하기 위한 비활성화의 완결도 검정
정제된 비활성화된 지카 바이러스 (PIZV) 벌크 원료의약품 (BDS)의 포르말린-비활성화 (0.01% 포름알데히드) 및 잠재적인 잔여 감염성 바이러스 활성의 유용성을 결정하기 위해, 비활성화의 완결도 (COI) 검정으로 또한 불리는 이중-감염성 검정이 개발되었다.
표본 준비(Sample preparation): 전술된 바와 같은 클론 e의 4개의 정제된 비활성화된 지카 백신 (PIZV) 로트 (Tox 로트 1-4)가 Vero 세포에서 성장에 의해 제조되었다. 4개의 일일 수확물로부터 상청액 (합계는 약 4000 mL에 달함)이 크로마토그래피에 의해 정제되고, 그 이후에 0.01% w/v의 최종 농도로 포름알데히드가 첨가되었다. 비활성화는 22℃에서 10 일 동안 진행되었다. 공정 중 제어 (IPC) 표본이 특징화 및 분석을 위해 비활성화 동안 벌크 원료의약품 (BDS)으로부터 매일 이전되었다. 일일 IPC 표본은 메타중아황산나트륨으로 중화되고, DMEM (바이러스 성장 배지) 내로 투석되었다. 이들 표본은 정제된 비활성화된 지카 바이러스를 내포한다. 비활성화의 최종 일에, BDS 표본의 나머지 체적은 중화되지 않지만, 포름알데히드를 제거하기 위해 TFF로 처리되고 PBS 내로 완충제 교체되었다.
비활성화 검정의 완결도(COI): COI 검정은 비활성화의 동역학 및 최종 BDS를 이해하기 위한, 일일 IPC 표본에서 비활성화의 유용성의 분석에 이용되었다. 최대 민감도의 경우, 2가지 세포주, Vero 및 C6/36이 IPC와 DS 표본에서 잠재적인 살아있는 바이러스를 검출하기 위해 이러한 검정에서 초기에 활용되었다. 지카 바이러스가 페놀 레드를 내포하는 성장 배지의 존재에서 Vero 세포를 감염시킬 때, 세포 사멸의 부-산물은 pH를 떨어뜨린다. 결과적으로, 배지 컬러가 적색/핑크색으로부터 황색으로 변하는데, 이것은 배지 pH가 산성으로 이동되었음을 나타낸다. 이러한 현상은 아폽토시스(apoptosis) 및 세포변성 효과 (CPE)에 의해 유발되는데, 상기 효과는 바이러스 침습, 감염, 그리고 바이러스 복제 동안 세포로부터 발아에 의해 유발되는 숙주 세포의 세포 구조에서 관찰된 변화를 지칭한다. 궁극적으로, C6/36 모기 세포 및 Vero 세포 둘 모두 감염에 대해 관용적(permissive) 세포주이지만, 지카 바이러스 감염은 시험관내에서 Vero 세포만을 사멸시킨다. 따라서, Vero 세포가 상기 검정에 대한 지표 세포주로서 이용되었다. 대조적으로, 지카 바이러스에 대한 자연 숙주 벡터로부터 유래되는 C6/36 세포는 지카 감염 시에 CPE를 전시하지 않고 용해되지 않는다. 배지 컬러에서 변화가 없고, 그리고 C6/36 세포의 생존력은 변하지 않는다.
따라서, 분석은 두 부분으로 나뉜다: 상기 검정의 제 1 부분은 6 일 동안, 이들 2가지 감수성(susceptible) 세포주의 96-웰 평판 상에서 잠재적으로 살아있는 바이러스 입자의 병렬 증폭을 허용한다. 상기 검정의 제 2 단계는 Vero 세포의 단층을 내포하는 6-웰 평판 위에 96-웰 평판의 상청액 (잠재적으로 증폭된 입자 포함)의 전달, 그리고 바이러스 감염 및 세포변성 효과가 Vero 세포에서 발달하도록 허용하기 위한 다른 8 일 동안 배양을 수반한다. 관찰된 임의의 CPE는 광학 현미경을 이용하여 확증되었다.
비록 상기 검정의 제 1 부분, 다시 말하면, C6/36 세포에서 배양 동안 96 웰 평판, 그리고 상기 검정의 제 2 부분, 다시 말하면, 세포변성 효과를 관찰하기 위한 Vero 세포의 배양 동안 6 웰 평판의 이용에 대하여 상세하게 설명되긴 하지만, 상기 검정은 하기의 표에 따라서 쉽게 정률증가(scaled up)될 수 있다:
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
정률증가 동안, 용기의 cm2당 표본의 체적이 부분 1에 경우에 계속 일정하고, 그리고 동일한 바이러스 감염 조건이 부분 2에서 유지된다는 것은 분명하다.
COI 검정 대조: 이러한 검정을 위한 역가 및 역적정 대조는 Vero 지표 세포를 이용하여 수행되고, 그리고 TCID50 96-웰 형식에서 채점되었는데, 여기서 웰은 세포 사멸, 또는 CPE의 존재에 대한 대용물로서, 핑크색으로부터 황색으로의 배지 컬러 변화에 근거하여 양성으로 채점되었다.
바이러스 역가 대조 검사: 공지된 역가의 대조군 바이러스 (PRVABC59)의 2개의 독립된 레플리케이트(replicates)가 2% FBS를 내포하는 배지에서 10-배 연속 희석에 종속되었고, 그리고 100 μL의 각 희석액이 Vero 세포를 내포하는 96-웰 평판의 4개 웰에 첨가되었다. 평판이 5 일 동안 배양되었고, 이후 CPE를 내포하는 웰이 기록되었고, 그리고 바이러스 역가가 Reed-Meunch 계산기를 이용하여 계산되었다.
바이러스 역적정(back titration) 대조 검사: 공지된 역가의 대조 바이러스가 200 TCID50까지 연속 희석되었다. 200 TCID50 대조 바이러스의 2개의 독립된 레플리케이트(replicates)가 2% FBS를 내포하는 배지에서 2-배 연속 희석에 종속되었고, 그리고 100 μL의 각 희석액이 Vero 세포를 내포하는 96-웰 평판의 4개 웰에 첨가되었다. 세포가 5 일 동안 배양되었고, 이후 CPE를 내포하는 웰이 기록되었고, 그리고 바이러스 역가가 Reed-Meunch 계산기를 이용하여 계산되었다.
COI 상세 프로토콜:
1. 상기 검정의 제 1 부분: Vero (1.4E+05 세포/mL) 및 아에데스 아에집티 (Aedes aegypti) 모기 C6/36 (4E+05 세포/mL) 세포가 표본의 첨가 전 2 일에 96-웰 평판에서 파종되었다. Vero 세포는 37℃에서 DMEM + 10% 최종 FBS + 2% L-글루타민 + 1% 페니실린/스트렙토마이신에서 배양되었다. C6/36 세포는 28℃에서 DMEM + 10% FBS + 2% L-글루타민 + 1% 페니실린/스트렙토마이신 + 1% 비필수적인 아미노산에서 배양되었다.
2. 200 TCID50 대조 바이러스 (바이러스 역적정 대조 검사에서 제조됨) 또는 DS 표본의 3개의 독립된 레플리케이트가 2% FBS를 내포하는 배지 내로 희석되었다 (5-배와 10-배 희석).
3. 96-웰 평판에서 세포가 표본으로 접종되었다. 96-웰 평판에서 세포 단층의 감염에 앞서, 임의의 가능한 응집을 파괴하기 위해 표본이 와동되었다. 100 μL의 각 희석액이 각각, Vero 세포 및 C6/36 세포를 내포하는 2개의 별개의 96-웰 평판 내로 5 웰 각각에 적용되었다.
4. 배지 단독이 각 세포 유형에 대해 음성 CPE 대조군으로서 다른 웰 내에 포함되었다.
5. 평판이 세포주에 대한 적당한 온도에서 6 일 동안 배양되었다.
6. 상기 검정의 제 2 부분: 살아있는 바이러스가 더 증폭되고, 관용적 세포주 상에서 CPE에 의해 가시화를 허용하기 위해, Vero와 C6/36 세포 둘 모두로부터 각 96-웰 상청액의 전체 체적이 Vero 세포의 6-웰 평판의 개별 웰로 이전되었다. 15 분 간격을 두고 흔들면서, 접종이 90 분 동안 진행되었다.
7. 2% FBS를 내포하는 배지가 웰에 첨가되었고, 그리고 CPE의 함수로서, 증폭된 표본의 차후 검출을 위해 평판이 추가로 8 일 동안 배양되었다. 만약 DS의 임의의 레플리케이트가 8 일자의 종결 시점에서 CPE를 보여주면, 비활성화는 불완전한 것으로 간주되었다.
7. 6-웰 평판으로 이전 후, 감수성 세포 단층 상에서 플라크 또는 CPE의 형성 및 바이러스 복제를 허용하기 위한 8 일 동안 배양에 의해 살아있는/복제 비리온(virions)의 존재가 가시화되었다. 상기 검정의 종결 시점에서 6-웰 평판에서% CPE 점수는 하기와 같이 계산되었다:
-Vero 세포의 각 6-웰 평판은 비색(colorimetric) 변화의 가시화에 의해 CPE에 대해 조사되고, 그 이후에 도립 광학 현미경(inverted light microscope) 하에 검사에 의해 CPE가 확증되었다.
-각 6-웰 평판은 전술된 5-배 및 10-배 희석에서 제조된 DS 희석액의 레플리케이트 중에서 한 가지를 나타냈다 (5개 웰, 플러스 배지 단독을 내포하는 1개 웰).
이런 이유로, 각 레플레케이트에 대한% CPE는 표본마다 총 5개 웰 중에서 CPE를 갖는 웰의 숫자를 반영하였다 (검정마다 총 120개 웰이 이용된다). 평균% CPE 및 표준 편차는 각 희석액의 3개 레플리케이트에 근거하여 계산되었다.
결과: 이들 일일 표본은 하기의 표에서 도시된 바와 같이, Tox 로트 #1-4 각각에서 분석되었다.
[표 A]
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
[표 B]
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
[표 C]
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
[표 D]
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
비활성화 데이터의 편집된 동역학 이들 4개의 독성학 로트로부터 표본에 대한 COI 데이터는 전술된 바와 같이 결정된 감염력 (TCID50) 및 RNA 사본(copy)과 비교되었다. RNA 사본은 표본으로부터 핵산을 정제하고, 그리고 RT-PCR 키트를 이용하여, 혈청형 특이적 프라이머로 지카 RNA를 증폭함으로써 결정되었다. 도 25에서 도시된 결과는 COI 검정의 민감도가 TCID50의 것보다 훨씬 크다는 것을 증명한다.
COI 검정의 성과 특징 - 정확도: 목표 희석액 (TCID50/웰) 및 이들의 개별 CPE 비율이 상대적 정확도를 결정하는데 이용되었다. Vero 세포의 경우에, 양성 CPE의 관찰된 비율 및 예상된 비율 사이에 통계학적으로 유의한 선형 관계가 있었다. 관찰된 결과 및 예상된 결과를 관련시키는 상기 라인의 기울기는 1에 겹쳐지는 0.83 내지 1.01의 95% 신뢰 구간 (CI)에서 0.92인데, 이것은 100% 정확도를 지시한다. C6/36 세포의 경우에, 양성 CPE의 관찰된 비율 및 예상된 비율 사이에 통계학적으로 유의적인 선형 관계가 있다. 관찰된 결과 및 예상된 결과를 관련시키는 상기 라인의 기울기는 0.80 내지 0.95의 95% 신뢰 구간 (CI)에서 0.88인데, 이것은 이러한 세포주에서 약간의 편향(bias) (5-20%)이 목격된다는 것을 지시한다. 양쪽 세포주는 만족스러운 (상대적) 정확도를 보여준다.
COI 검정의 성과 특징 - 검출 한계 (LoD): 상기 검정의 민감도는 C6/36에서 Vero로 평판 및 Vero에서 Vero로의 평판 둘 모두에 대해 사정되었다. 전술된 바와 같이, 데이터는 10.00 TCID50/웰에서 시작하여 0.08 TCID50의 더 낮은 역가에까지 이르는 도말된 역가 희석액으로 도말된 전체 웰마다 관찰된 +ve CPE의 비율의 최소 자승 회귀를 이용하여 적합되었다. 게다가, 각 희석액에 대해 음성 대조군 (0.00 TCID50/웰)이 평판 내에 포함되었다. C6/36에서-Vero로 평판 및 Vero에서-Vero로 평판 둘 모두의 전역에서 각 희석액에 대해 CPE 채점이 수행되었다. CPE 및 로그 입력 바이러스 역가 사이에 명백한 관계가 목격되었다. 이것은 하한과 상한 99% 신뢰 한계와 함께 TCID50/웰의 log10 농도에 비하여 CPE 양성 웰의 비율 사이에 로지스틱 (S자 모양) 관계를 전시한다. -2 log10 농도 (= 0.01 TCID50/웰)에서, 자격 데이터에서 모든 고정된 및 무작위 소스 변이에 근거되고 이들을 설명하는 모형은 0.42%의 하한 99% 신뢰 한계에서 0.85%, 또는 0.01 TCID50/웰에서 반올림될 때 0.01을 예측하였다. 하한 99% 신뢰 한계가 제로(0)를 포함하지 않기 때문에, 0.85% CPE 웰이 0 TCID50/웰로부터 발생할 수 있는 매우 작은 정량가능한 (< 1%) 가능성이 있다 (다시 말하면, 노이즈(noise)에 기인). 이것은 상기 검정에 대한 적어도 0.01 TCID50/웰의 검출 한계(가령, 이 표본 내에서 검출될 수 있는 최저량의 살아있는 지카 입자이다)를 확립한다. 다시 말하면, 반올림될 때, 60개 중에서 1개의 웰이 CPE 양성일 것이고, 또는 이들 파라미터를 고려할 때, 60개 웰에서 검출될 수 있는 CPE +ve의 이론적 최저 비율이 1.67%, 또는 0.0167일 것이다.
세포 유형 (C363 및 Vero)은 상대적 민감도에 대해 비교되었는데, C6/36은 도 26에서 도시된 바와 같이 Vero 세포와 비교하여 바이러스 역가의 더욱 낮은 희석이 검출될 수 있다는 것을 보여주었다; 동일한 바이러스 입력 수준 (0.31 TCID50)에서, CPE 양성 웰의 비율은 Vero 세포에 비하여 C6/36의 경우에 더욱 높다.
이러한 검정의 자격 인정 동안 이용되는 바이러스의 최저 입력 값은 0.02 TCID50 (-1.61 로그 TCID50)이었다. C6/36 세포에 대한 피팅된 곡선을 이용하면, 이것은 0.035 또는 3.5%의 CPE 양성 득점 웰 (28개 중에서 1개의 웰)을 결과한다. 만약 상기 곡선이 0.167 또는 1.6%의 실질적인 최저 수준을 향해 외삽되면, 이것은 0.015 TCID50 (-1.82 로그 TCID50)의 바이러스 입력 수준에 해당한다. 하지만, +ve CPE 결과에서 반영된 바와 같이, 검출될 수 있는 감염성 바이러스의 가장 낮은 수준을 결정할 때, 전송된 검정 편차의 충격이 고려되어야 한다. 이러한 노이즈는 입력 바이러스의 작업 스톡(stock)의 산출로부터 발생한다. 목표 TCID50 및 역-적정(back-titration) 계산의 비교는 작업 스톡 바이러스의 TCID50이 200의 스톡 TCID50/mL 농도를 목표로 할 때 213의 평균으로부터 도출되는, 85 TCID50/mL의 표준 편차 (SD)를 전시하였다는 것을 보여준다. %CV는 약 +7%의 바이어스에서 ~40%로 계산된다. 이러한 노이즈는 바이러스 희석에 대한 목표 값 주변에서 신뢰 구간을 산출하기 위해, 로지스틱 회귀 모형에 반영되었다. 0.01 TCID50/웰의 목표 값에서, 이들 두 위치의 전역에서 자격 데이터에서 변이의 모든 고정된(fixed) 및 무작위(random) 소스에 근거되고 이들을 설명하는 모형은 0.86%의 웰이 CPE 양성일 것으로 예측한다 (60개 중에서 1개 웰). 하한 99% 신뢰 한계가 제로를 포함하지 않기 때문에, 잡음으로 인해 0.85% CPE-양성 웰이 0 TCID50/웰로부터 발생할 수 있는 매우 작은 정량가능한 (< 1%) 가능성이 있다 (도 27). 이것은 상기 검정에 대한 검출 한계를 확립한다: 0.01 TCID50/웰이 표본 내에서 검출될 수 있는 최저량의 살아있는 지카 입자이다.
COI 검정의 성과 특징 - 범위: 상기 검정의 범위는 0.01 TCID50/웰 내지 4.5 TCID50/웰이었고, 그리고 0% 이상, 하지만 100% 이하의 CPE +ve 비율 채점을 유발한 입력 바이러스의 범위로서 규정된다.
결론: 이들 4개의 Tox의 분석은 실온에서 10 일 동안 0.01% 포름알데히드에서 배양 후 비활성화가 완전하다는 것을 드러냈다. 비활성화는 COI 검정에 의해 계측될 때, 생산된 모든 로트에서 3-4 일자에 달성되었다. COI 검정은 TCID50 효능 또는 RNA 계측보다 더욱 민감하다; 이러한 증가된 민감도는 또한, LoD에 의해 관찰되었다.
실시예 5: 제약학적 조성물에서 잔여 포르말린 함량 결정
재료 및 방법
재료들
포름알데히드 표준 용액 (메탄올에서) (982μg/mL), DNPH, HPLC-등급 아세토니트릴, 그리고 인산은 Wako Pure Chemicals Co. (Tokyo, Japan)로부터 구입하였다. 인산을 희석하는데 이용된 증류수는 Otsuka Pharmaceutical (Tokushima, Japan)로부터 구하였다. 수산화알루미늄 겔로서 이용된 Alhydrogel® 2% (10 mg/mL 알루미늄에 상응)는 Brenntag (Frederikssund, Denmark)로부터 획득되었다. PBS는 자체(in-house) 제조되었고, 그리고 수산화알루미늄 겔을 내포하는 지카 백신 의약품은 아래에 설명된 바와 같이 제조되었다. 지카 바이러스는 수확 후, 다양한 기술로 정제되었다. 포름알데히드로 비활성화 후, 상기 바이러스는 농축되었고, 그리고 완충제가 여과에 의해 PBS로 교체되었다. 벌크 원료의약품은 PBS로 희석되고 수산화알루미늄 겔 (0.4 mg/mL 알루미늄)로 조제되어, 최종 의약품이 형성되었다.
HPLC 조건
UV 검출기 (Milford, USA) 및 역상 칼럼 (YMC-Pack ODS-A, 4.6 mm x 250 mm, 5 μm (Kyoto, Japan))이 구비된 Waters HPLC 얼라이언스(alliance) 시스템이 이용되었다. 물 및 아세토니트릴의 혼합물 (1:1, v/v)이 이동상으로서 이용되었고, 검출 파장이 360 nm에서 세팅되었고, 그리고 유속이 1.0 mL/분이었다. 컬럼 온도 및 주입 부피는 각각 25℃ 및 50μL였다.
표본 준비(Sample preparation):
백신 의약품 (1.2 mL)이 15000 rpm에서 10 분 동안 원심분리되었고, 그리고 상청액 (1 mL)이 Waters (Milford, USA)로부터 구입된 2-mL HPLC 유리 바이알 내로 이전되었다. 그 다음, 아세토니트릴에서 20 μL의 20% (v/v) 인산 및 50 μL의 1.0 mg/mL DNPH 용액이 첨가되었고, 그리고 혼합물은 교반되고 주입 전 20 분 동안 실온에서 방치되었다.
방법 검증
ICH Q2 지침에 따라서, 상기 방법은 표본의 특이성, 선형성, 정확도, 반복성, 중간 정밀도, 견고성 및 안정성의 면에서 검증되었다. 정확도 연구에서, 지카 백신 의약품 및 수산화알루미늄 겔 용액은 특정한 양의 포름알데히드로 스파이킹되었고(spiked), 그리고 표본은 섹션 2.3에서 설명된 절차를 따르기 전, 와동에 의해 충분히 혼합되었다.
결과 및 논의
선형성 및 특이성
포름알데히드의 6개 표준 용액 (0.049, 0.098, 0.196, 0.491, 0.982 및 1.964μg/mL)이 PBS로 희석에 의해 제조되었다. 그 다음, 아세토니트릴에서 20% (v/v) 인산 및 1 mg/mL DNPH 용액이 각 용액에 첨가되었고, 그리고 상응하는 크로마토그램은 도 28에서 도시된다. 명백히, 10.4-분 피크 면적은 회귀 방정식: y = 1075730x + 11731 (여기서 y는 10.4-분 피크의 면적이고, 그리고 x는 μg/mL에서 포름알데히드의 농도이다) (상관 계수: 0.9998)으로 선형성을 보여주고, 이것이 HCHO-DNPH (다시 말하면, DNPH로 유도체화된 포름알데히드)에 기인한다는 것을 보여주었다. 게다가, 5.8 분에서 피크는 DNPH에 기인하였는데, 그 이유는 이것이 DNPH가 첨가된 모든 표본에서 검출되었기 때문이다. 이런 이유로, HCHO-DNPH 피크 면적은 PBS에서 배경 피크 면적을 감산한 후, 선형성 및 정확도의 평가에 이용되었다.
정확도 및 정밀도 (반복성)
수산화알루미늄 어쥬번트의 효과는 회수 연구에 의해 평가되었는데, 이들 연구는 백신 원료의약품의 부재에서, PBS에서 수산화알루미늄의 3개 표본 (0.1, 0.4 및 1.0 mg/mL 알루미늄)을 0.05μg/mL의 포름알데히드로 스파이킹함으로써 실행되었다. 평균 회수(recoveries)는 낮은 상대적 표준 편차 (RSD) 값에서, 각각 102% (n = 3), 100% (n = 3) 및 100% (n = 3)이었다 (표 13). 정확도 데이터의 RSD가 반복성을 평가하기 위해 계산되었고, 그리고 1.0%인 것으로 밝혀졌는데, 이것은 1.0 mg/mL까지의 알루미늄 양이 포름알데히드의 회수를 간섭하지 않는다는 것을 나타내었다.
Figure pct00036
상기 방법의 정확도가 회수 연구에 의해 평가되었는데, 이들 연구는 수산화알루미늄 어쥬번트를 내포하는 지카 백신 의약품을 3가지 농도의 포름알데히드 (0.05, 0.10 및 1.00μg/mL)로 스파이킹함으로써 실행되었고, 그리고 평균 회수 결과는 표 14에서 도시된다. 정확도 데이터의 RSD가 반복성을 평가하기 위해 계산되었고, 그리고 3.7%인 것으로 밝혀졌는데, 이것은 수산화알루미늄으로 조제된 지카 백신 의약품이 0.05 내지 1.00μg/mL 사이에서 포름알데히드의 회수를 간섭하지 않는다는 것을 지시하였다.
Figure pct00037
견고성(Robustness)
표본 내에 포름알데히드의 농도가 표본 준비 동안 실험적 파라미터에서 변이에 의해 얼마나 영향을 받을 지를 결정하기 위해, 상기 방법의 견고성이 평가되었다. 유도체화 효력에 대한 충격을 고려하여, DNPH 및 인산의 농도가 본 연구에서 모니터링되는 매개변수로서 선별되었다. 이러한 효과는 DNPH 및 인산의 농도를 각각 ±0.1 mg/mL 및 ±5% 변경함으로써 조사되었다. 포름알데히드가 각 조건 하에 2개의 개발 의약품 로트에서 결정되었고, 그리고 결과가 표 15에서 도시되는데, 이들 결과는 DNPH 및 인산 농도에서 변이가 포름알데히드의 결정에 대한 어떤 유의미한 충격도 주지 않는다는 것을 암시하였다.
Figure pct00038
실시예 6: P6e 계열로부터 유래된 정제된 비활성화된 지카 바이러스 백신 (PIZV)의 임상 면역원성과 효능
표본 준비(Sample preparation):
전술된 바와 같은 Vero 세포에서 성장에 의해 4개의 정제된 비활성화된 지카 백신 (PIZV) 로트 (Tox 로트 1-4)가 제조되었다. 4개의 일일 수확물 (각각 매일 1000mL의 수확물, 총 약 4000mL)의 상청액을 여과 및 크로마토그래피로 정제하고, 포르말린을 0.01%의 최종 농도로 첨가하여 농축시키고, 비활성화시켰다. 상기 표본은 원료의약품 완충제 (10 mM NaH2PO4, 50 mM NaCl, 6% 수크로스, pH 7.4)로 완충제 교체하기 전, 10 일 동안 22℃에서 비활성화가 진행되도록 두었다.
상기 비활성화된 지카 바이러스 활성제는 비활성화되지 않은 지카 바이러스에 감염될 수 있는 숙주 세포를 더 이상 감염시킬 수 없다. 비활성화는 다음 검사 프로토콜에 의해 결정된다. 플라크가 탐지되지 않는 경우 비활성화로 인정된다.
COI (비활성화 완결도) 상세 프로토콜:
1. 상기 검정의 제 1 부분: Vero (1.4E+05 세포/mL) 및 아에데스 아에집티 (Aedes aegypti) 모기 C6/36 (4E+05 세포/mL) 세포가 표본의 첨가 전 2 일에 96-웰 평판에서 파종되었다. Vero 세포는 37℃에서 DMEM + 10% 최종 FBS + 2% L-글루타민 + 1% 페니실린/스트렙토마이신에서 배양되었다. C636 세포는 28℃에서 DMEM + 10% FBS + 2% L-글루타민 + 1% 페니실린/스트렙토마이신 + 1% 비필수적인 아미노산에서 배양되었다.
2. 200 TCID50 대조 바이러스 (바이러스 역적정 대조 검사에서 제조됨) 또는 DS 표본의 3개의 독립된 레플리케이트가 2% FBS를 내포하는 배지 내로 희석되었다 (5-배와 10-배 희석).
3. 96-웰 평판에서 세포가 표본으로 접종되었다. 96-웰 평판에서 세포 단층의 감염에 앞서, 임의의 가능한 응집을 파괴하기 위해 표본이 와동되었다. 100 μL의 각 희석액이 각각, Vero 세포 및 C636 세포를 내포하는 2개의 별개의 96-웰 평판 내로 5 웰 각각에 적용되었다.
4. 배지 단독이 각 세포 유형에 대해 음성 CPE 대조군으로서 다른 웰 내에 포함되었다.
5. 평판이 세포주에 대한 적당한 온도에서 6 일 동안 배양되었다.
6. 상기 검정의 제 2 부분: 살아있는 바이러스가 더 증폭되고, 관용적 세포주 상에서 CPE에 의해 가시화를 허용하기 위해, Vero와 C636 세포 둘 모두로부터 각 96-웰 상청액의 전체 체적이 Vero 세포의 6-웰 평판의 개별 웰로 이전되었다. 15 분 간격을 두고 흔들면서, 접종이 90 분 동안 진행되었다.
7. 2% FBS를 내포하는 배지가 웰에 첨가되었고, 그리고 CPE의 함수로서, 증폭된 표본의 차후 검출을 위해 평판이 추가로 8 일 동안 배양되었다. 만약 DS의 임의의 레플리케이트가 8 일자의 종결 시점에서 CPE를 보여주면, 비활성화는 불완전한 것으로 간주되었다.
7. 6-웰 평판으로 이전 후, 감수성 세포 단층 상에서 플라크 또는 CPE의 형성, 그리고 바이러스 복제를 허용하기 위한 8 일 동안 배양에 의해 살아있는/복제 비리온의 존재가 가시화되었다. 상기 검정의 종결 시점에서 6-웰 평판에서% CPE 점수는 하기와 같이 계산되었다:
-Vero 세포의 각 6-웰 평판은 비색 변화의 가시화에 의해 CPE에 대해 조사되고, 그 이후에 도립 광학 현미경 하에 검사에 의해 CPE가 확증되었다.
-각 6-웰 평판은 전술된 5-배 및 10-배 희석에서 제조된 DS 희석액의 레플리케이트 중에서 한 가지를 나타냈다 (5개 웰, 플러스 배지 단독을 내포하는 1개 웰).
이런 이유로, 각 레플레케이트에 대한% CPE는 표본마다 총 5개 웰 중에서 CPE를 갖는 웰의 숫자를 반영하였다 (검정마다 총 120개 웰이 이용된다). 평균% CPE 및 표준 편차는 각 희석액의 3개 레플리케이트에 근거하여 계산되었다.
정제된 비활성화된 지카 바이러스의 양은 표준 곡선을 확립하기 위한 규정된 양의 재조합 지카 외피 단백질을 이용하여, Bradford 검정 (Bradford 외 (1976) Anal. Biochem. 72: 248-254)에 의해 결정될 수 있다.
정제된 지카 바이러스의 순도는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정될 수 있다. 현재 실시예에서, 크기 배제 크로마토그래피에서 정제된 지카 바이러스의 주요 피크는 크기 배제 크로마토그래피에서 곡선 아래 총면적의 85% 이상이었다.
연구 백신 (PIZV)은 인산염 완충된 염수 용액(PBS)에서 어쥬번트로 200μg 수산화 알루미늄, Al(OH)3으로 제형화된 지카 정제된 포르말린-비활성화된 바이러스를 지칭한다. 최종 액체 제형화된 제품은 일회-용 바이알에 채워지고 개봉-흔적을 알 수 있는(tamper-evident) 씰(seal)로 밀봉된다. 연구 백신은 28 일 간격으로 투여분량 당 2, 5, 또는 10μg 항원의 0.5 mL의 2-투여량 요법으로서 IM (근육 내)으로 투여된다.
주사용 염화나트륨 (NaCl) 0.9% 용액이 위약으로 사용되고 있다. 이것은 일회용-바이알로 공급된다. 오직 비경구용으로만 사용되는 방부제-없는 멸균된 무색의 염화나트륨 용액이다. 상기 위약은 28 일 간격으로, 투여량 당 0.5 mL의 2- 투여량 요법으로 IM으로 투여한다.
시험 방법
PRNT 검정: 중화 항체 역가는 기존 문헌 (Protection of Rhesus monkeys against dengue virus challenge after tetravalent live attenuated dengue virus vaccination. J. Infect. Dis. 193, 1658-1665 (2006). Muthumani K, Griffin BD, Agarwal S, 외. In vivo protection against ZIKV infection and pathogenesis through passive antibody transfer and active immunisation with a prMEnv DNA vaccine. NPJ Vaccines 2016; 1: 16021 참고)에서 설명된 바와 같은 플라크 환원 중화 검사 (PRNT)에 의해 결정되었다. 간략하게 설명하자면, 지카 PRNT 검정은 하기 기술된 바와 같이 Q2 Lab Solutions Vaccines에 의해 개발된 프로토콜에 따라 수행되었다.
지카 PRNT 검정에서, 인간 혈청을 1:5 내지 1:10,240으로 2-배 연속 희석하고, 동일한 용적의 희석된 지카 바이러스 (ZIKV) (PRVABC59)와 혼합하여 1:10 내지 1:20,480의 최종 희석액을 수득하였다. 2-8℃에서 20 ± 2 시간 동안 중화를 진행시킨 후, 혈청/바이러스 혼합물을 사용하여 Vero E6 세포에 접종하였다. 바이러스 흡착은 습도와 CO2로 37 ± 2℃에서 60 ± 10 분 동안 수행한 다음 메틸셀룰로스 오버레이(overlay)를 추가했다. 감염된 세포를 37±2℃에서 72 ± 2 시간 동안 습도 및 CO2에서 함께 배양하였다. 크리스탈 바이올렛 착색을 사용하여, 플라크를 시각화하고 CTL (Cellular Technology Limited) 판독기를 사용하여 계수하였다. 50% 중화 역가 (PRNT50)의 결정은 혈청-없는 바이러스 대조군의 것과 비교하여, 혈청 존재 하에서 바이러스 플라크의 감소 백분율에 기초하고, 선형 회귀에 의해 산출되었다. 상기 역가는 최고 희석의 역(reciprocal)을 나타내며, 그 결과 플라크 수는 50% 감소된다. 임상 표본과 병행하여 시험된 바이러스 대조군 (~60 pfu/웰을 표적으로 함), 세포 대조군, 양성 대조군 (173-658의 PRNT50) 및 음성 대조군 (PRNT50 <10)을 평가하여 수용성을 평가하였다. 선형 회귀에 의해 생성된 적정 곡선의 상관 계수가 ≥0.85 인 경우, 개별 표본 및 양성 대조군 결과는 수용되었다. 추가 수용 기준은 평판 또는 런(run)에 대해 생성된 크리스탈 바이올렛 착색 및 플라크의 질에 기초하였다. PRNT50 결과는 상기 검정의 출발 희석 (1:10)까지 보고된다. ULOQ보다 높은 PRNT50 결과는 사전-희석(pre-dilution)에서 반복되어, 상기 검정의 정량화 가능한 범위 내에서 결과를 생성한다. 사전-희석된 표본의 결과에 희석 인자를 곱하면 최종 결과가 생성될 것이다.
PRNT 검정 개발에 사용된 Zika 균주는 PRVABC59이었다.
면역 결과 측정:
정의:
혈청 양성 (PRNT): 역가 ≥LOD (검출 한계)
혈청-음성 (PRNT): 역가 <LOD (검출 한계)
혈청전환 (PRNT): 최초 혈청음성 대상에서 면역접종후 역가 ≥LOD
LOD (PRNT) = 10
LOD = 5 미만에 할당된 값
LLoQ (정량화의 하한, PRNT) = 26
LLoQ (정량화의 하한) = 13 미만에 할당된 값
역가의 상한 한계 (ULOQ)를 초과하는 역가를 갖는 인간 대상은 역가가 검정 안에서 정량화된 탐지 한계를 수득될 때까지 추가 희석 후에 재시험될 것이다.
리포터 바이러스 입자 (RVP) 중화 검정: 중화 항체 역가는 96-웰 평판에서 성장된 Vero 세포에서 일정한 양의 지카 RVPs를 갖는 혈청 표본의 적정에 의해 분석되었다. RVPs는 지카 (계열 SPH2012)의 prME 단백질 및 뎅기(Dengue)-기반의 레닐라 루시페라아제 리포터를 내포하였다. 간단히 말하면, 혈청은 56℃에서 30 분 동안 열에 의해 비활성화되고, 희석되고, 그리고 이후, 37℃에서 RVPs와 함께 배양되었다. 상기 혈청/RVP 혼합물은 이후, Vero 세포와 혼합되었고, 그리고 루시페라아제 기질(substrate)로 검출 전 37℃± 2℃/5% CO2에서 72 시간 동안 배양되었다. 데이터는 양성 추적 대조에 대해 표준화된 JMP11 비-선형 4 매개변수 분석을 이용하여 분석되었고, 그리고 유효 용량 50% (EC50)이 보고되었다.
연구 설명
플라비바이러스 나이브 및 일차접종된(Primed) 건강한 성인(연령대 18-49세)에서 정제된 비활성화된 지카 바이러스 백신 (PIZV)의 단계(Phase) 1, 무작위, 관찰자-블라인드(Blind), 위약-대조, 안전성, 면역 원성 및 투여량 범위 연구
연구 기획은 도 29에 나와 있다. 본 연구는 플라비바이러스-나이브 및 플라비바이러스-일차접종된 건강한 성인(연령대 18-49세)을 순차적으로 등록하도록 기획되었다. 2 개의 순차적 코호트(cohorts)는 각 120 명의 인간 대상(계획된)으로 구성되며, 3 가지 용량의 PIZV 백신 또는 염수 위약 중 하나를 수용하도록, 각각 30 명의 인단 대상 중 4 개의 그룹 중 하나에 무작위로 할당된다. 예방접종(vaccination) 요법은 28 일 간격으로, 2 회 용량으로 구성된다. 이 실시예의 데이터는 플라비바이러스 나이브 인간 대상 (n = 124)에만 관련되며, 플라비바이러스 일차접종된 인간 대상에 대한 추가 데이터로 예상된다. 이 실시예는 "플라비바이러스-나이브 코호트"에 대해 57 일자(투여(dose) 2 이후 28 일자) 후 첫 번째 임시 분석(interim)의 데이터를 제공한다. 플라비바이러스-일차접종된 코호트의 데이터는 이 임시 분석의 일부분은 아닌데, 이 그룹에 대한 모집은 여전히 초기 임시 분석 당시에 진행되었기 때문이다.
요약하면, 인간 대상을 위약 (염수) 또는 정제된 비활성화된 지카 백신 (PIZV)을 2μg, 5μg 및 10μg 농도의 2 개의 투여량을 제공받은 4 개의 연구군에 무작위 배정하였다. 이 연구는 1 일자 및 29 일자에 백신 (또는 위약)의 근육 주사를 포함하였고, 혈액 표본은 연구의 -15, 1, 8, 29, 36, 57, 211, 393, 767 일자에 채취되었다. -15 일자에 혈액 표본을 사용하여, 플라비바이러스 혈청 상태 스크리닝 및 적격성(eligibility) 스크리닝을 결정하였다. 1 일자, 29 일자, 57 일자의 표본은 면역원성 평가를 위한 것이었다. 안전 실험실(lab) 테스트는 8 일자와 36 일자에 수행되었다. 면역력의 지속성은 211 일자, 393 일자 및 767 일자에 평가될 것이다.
투여(dose) 2 이후 28 일자로부터의 데이터에 기초하여, 정제된 비활성화된 지카 바이러스 백신 (PIZV)은 18-49 세 사이의 플라비바이러스-나이브 성인(연령대 18-49세)에서 안전하고 면역 원성이었다.
일차 목적
이 연구의 주요 목표는 28 일 간격을 두고, 2 회 투여한 PIZV의 안전성을 설명하고, 차후 임상 연구에 사용하기 위해 3 가지 다른 항원 농도 (2, 5 또는 10μg)에서 투여량 수준을 선택하는 것이었다. 일차 평가 종점(endpoints)은 다음과 같다: PIZV 또는 위약의 각 투여량을 투여한 후, 7-일 기간 동안 응답형(solicited) 국소 및 전신 이상 반응 (AE)을 경험한 인간 대상의 백분율, 그리고 면역접종 후28-일 기간 동안 심각하지-않은 비응답형(unsolicited) AEs 및 심각한 부작용 (SAEs)을 경험한 인간 대상의 백분율.
이차 목적
이차 목적은 플라비바이러스 나이브 성인에서 투여(dose) 1 이후 28 일자 및 투여(dose) 2 이후 28 일자에 정제된 비활성화된 지카 바이러스 백신 (PIZV)에 대한 면역 반응을 설명하는 것이었다. 이들 목적과 관련된 이차 종점은 고려된 시점에서 중화 항-ZIKV 항체, 혈청 양성률 (SPR) 및 혈청 전환율 (SCR)의 기하 평균 역가 (GMTs)이다.
데이터의 분석은 개별 치료 할당에 액세스할 수 있는 자각하고 있는(unblinded) 통계학자와 프로그래머의 개별 팀에 의해 수행되었다. 시험 수행에 관련된 모든 인원은 개별 인간 대상의 할당 치료에 대해 알지 못하였다. 상기 연구팀은 집단 수준의 자각 결과에만 접근할 수 있었다.
연구 집단:
총 124 명의 인간 대상이 플라비바이러스-나이브 코호트에 등록되었고, 적어도 1 회 투여량의 PIZV 또는 위약을 제공받은 모든 무작위화된 인간 대상으로 구성된 안전 세트 (Safety Set: SS)에 포함되었다. 그중, 118 명 (상기 SS의 95.2%)은 최소한 1 회 투여의 시험용 백신 (PIZV)/위약을 투여 받은 무작위화된 인간 대상의 완전 분석 세트 (Full Analysis Set: FAS)에 포함되었으며, 기선에서 그리고 예방접종-후 적어도 한번 유효한 혈청학 결과를 제공했다. 면역원성 분석과 관련된 주요 프로토콜 위반이 없는 FAS에 있는 인간 대상의 프로토콜 당 세트 (Per Protocol Set: PPS)에 113 명의 인간 대상 (상기 SS의 91.1%)이 포함되었다. 상기 분석 세트는 표 16에 제시된다.
Figure pct00039
SS에서 인간 대상은 35.3 ± 8.91 세 (평균 ± 표준 편차)였으며, 18-29 세 범위에서 28.2%, 30-49 세 범위에서 71.8%로 분포되었다. 여성이 코호트의 54.8%를 차지했다. 연구 참가자는 인종과 민족성 관련 백인 (81.5%), 흑인 (14.5%) 및 "비-히스패닉"(93.5%)이었다. SS의 평균 BMI는 27.5 ± 4.05 (평균 ± 표준 편차)였다. 인구통계학적 특성 (연령, 성별, 신장, 체중, BMI 및 인종)은 4 개의 연구군에서 전반적으로 유사했다. 여성은 성별 분포가 더 균형 잡힌 다른 군에서보다 여성이 위약 그룹에서 더 많이 나타났으며, 여기 위약군에서 연구 참가자의 66%를 구성했다. 인구 통계 및 기준 특성이 표 17에 나와 있다.
안전성 실험실 파라미터 및 활력 징후를 포함 기준의 일부로서 연구 진입시 점검하였다. 이들은 활력 징후가 정상 한계 내에 있어야 한다고 규정하고 (즉, FDA 독성 등급 척도에 표시된 등급 1 미만), 안전 실험실 시험이 정상 한계 내에 있거나 FDA 독성 등급에 정의된 대로 등급 1 위에 있지 않아야 함을 명시했다.
Figure pct00040
Figure pct00041
안정성/반응성(reactogenicity)
응답형 국소 이상 반응 (AEs)의 전체 보고 발생률은 위약군 보다 백신 (PIZV)을 투여받은 군에서 더 높았다. 주사 부위에서 가장 빈번하게 보고된 응답형 AE는 통증이었다. 투여(dose) 1이후, 위약군의 13.8%와 비교하여, PIZV 군에서 30.0% 내지 38.7%의 인간 대상이 통증을 경험하였다. 투여(dose) 2 이후, 통증의 발생률은 투여(dose) 1과 유사하였다: PIZV 군에서 29.6% 내지 40%, 그리고 위약군에서 14.3%. 통증 강도는 투여(dose) 1 이후, 경증으로 보고되었으며, 투여(dose) 2 이후 경증 내지 중등증(moderate)으로 보고되었으며, 5μg PIZV 군의 2명 (6.7%) 인간 대상에서, 그리고 10μg PIZV 군의 1명(3.3%) 인간 대상에서 중등증 통증을 보고하였다. 다른 응답형 국소 AEs (홍반, 부기 및 경화)는 인간 대상의 9.7%를 넘지 않는 것으로 보고되었다.
통증의 발병은 1 일자에 90%의 인간 대상에서 발생하거나, 또는 2 일자에 (3 명의 인간 대상에서) 발생하였다. 위약 또는 PIZV 군의 인간 대상은 5 일 이후 통증을 보고하지 않았다.
임의의 성질의 응답형 전신성 AEs는 PIZV 군에 걸쳐 인간 대상의 30% 내지 48.4%, 그리고 투여(dose) 1 이후 위약군에서 41.4%로 보고되었다. 투여(dose) 2 이후, 발생률은 PIZV 군에서 10% 내지 33.3%이며, 위약군에서 27.6%이었다. 응답형 전신성 AEs에서 전반적으로 81.3% (투여(dose) 1) 및 75% (투여(dose) 2)는 연구 백신 접종과 관련된 것으로 판단하였다. 두 번의 투여 후 가장 많이 보고된 전신 사건은 두통, 피로 및 근육통이었다.
대부분의 전신 AEs는 경증인 것으로 보고되었고 즉, 일상 활동을 방해하지 않는다. 몇 번 발생은 강도가 중등증이었다.
투여(dose) 1 이후, PIZV 군의 인간 대상의 6.7-12.9% 및 위약군의 17.2%;
투여(dose) 2 이후, PIZV 군에서 인간 대상의 0 - 3.3%이며, 위약군에서 10.3%이었다.
심각한 AE에 대한 단일 보고가 있었다: 위약군의 한 명의 인간 대상이 발열을 경험하였다. 이 연구 참가자는 제 2 연구 백신 접종을 받은 후 4 일자 구강 측정된 체온이 39.4℃의 온도를 나타냈다. 이 발열은 연구자에 따르면, 본 연구-관련된 것으로 판단되지 않았다.
응답형 전신성 AEs는 4 개의 군에서 7-일 동안 다양하게 보고되었다. 열, 피로, 관절통 및 근육통에 대한 사건의 발병은 주로 면역접종-후 2 일 동안 이루어졌으며, 두통 및 불쾌감에 대해서는 가변적이었다. 4 일자 위약군에서 열이 심하게 보고된 인간 대상 경우를 제외하고, 면역접종 후 2 일 동안 열이 보고되었다.
면역접종 7 일 후 응답형 국소 및 전신 이상 반응의 발생률을 표 18에 나타내었다.
Figure pct00042
인간 대상의 총 30.6%에서, 임의의 투여 후 28 일에 비응답형 AEs (장기적 응답형 AEs는 포함되지 않음)가 보고되었다: PIZV 군에서 21.9-38.7%, 그리고 위약군에서 36.7%. 이 AEs는 주로 감염(infections), 감염(infestations) (13.7%) 및 신경계 장애 (3.2% : 두통, 편두통, 현기증)이었다. 강도는 모두 경증 내지 중등도였다.
비응답형 AEs는 3 명의 인간 대상 (2.4%)에 대한 연구 면역접종과 관련하여 고려되었다. 보고된 사건은 다음과 같다:
투여(dose) 1에서, 5μg PIZV 군에서 한 명의 인간 대상이 현기증을, 그리고 2μg PIZV 군에서 한 명의 인간 대상이 홍조를 보고하였다;
투약 2에서, 10μg PIZV 군에서 한 명의 인간 대상이 눈 가려움증 및 눈물샘 증가를 보고하였다.
이들은 강도가 경증이거나 중등증이었으며, 면역접종 후 1 일 또는 2 일에 시작하였고, 1 일 내지 3 일의 지속 기간을 가졌으며, 모두 해소되었다.
한 명의 인간 대상은 투여(dose) 1 이후 두통으로 인해 연구 면역접종을 중단했다. 이 인간 대상은 면역접종 1 일자 이후, PIZV를 받고 두통을 경험했다. 두통은 발병 36 일 후 해소되었다. 투여(dose) 1에서 시작하여 투여(dose) 2 후 28 일까지의 기간 동안 심각한 부작용 (SAE)이 보고되지 않았다.
면역접종 후 7 일 동안, 혈액 안전성 실험실 매개변수에 대해 관찰된 기선으로부터의 약간의 변화, 예를 들어, 정상에서 경증, 또는 경증에서 중등도의 AEs는 4개 군에 걸쳐 비슷한 비율의 인간 대상에서 발생했다. 소변 검사 매개 변수는 모든-시점에서 정상이거나, 채점 범주는 그룹 및 방문에서 비슷했다.
면역원성
표 19는 PRNT에 의해 측정된 지카 바이러스 중화 항체 (EC50)의 기하학적 항체 역가 뿐만 아니라 각 백신 투여 후 혈청 양성율 및 혈청 전환율을 제시한다.
PIZV 백신은 플라비바이러스-나이브 성인에서 면역원성이었다. 모든 인간 대상은 기선에서 혈청음성이었다. 지카 바이러스에 대한 항체에 대해 처음 혈청음성 인간 대상의 면역접종으로 임의의 용량의 PIZV 백신을 2 회 투여받은 후 모든 인간 대상에서 혈청양성이 유도되었다: 혈청 전환율은 투여(dose)-1 이후 69.23% 내지 96.43%의 범위이고, 투여(dose)-2 이후 100%였다. 위약군의 모든 인간 대상은 고려된 기간 동안 혈청음성이 유지되었다.
투여-범위 효과는 투여(dose)-1 이후 혈청 양성률 및 각각의 투여 후 GMT에서 관찰되었다. 첫번째 투여 이후, 10μg PIZV 투여를 받은 거의 모든 인간 대상 (96.4%)는 지카 바이러스에 대해 중화 항체를 장착하였다. 두 번째 투여는 세 가지 PIZV 군에서 투여(dose) 1보다 GMT가 10-배 이상 증가를 이끌었다.
Figure pct00043
표 19에 따라, PRNT를 사용하여 결정된 기하 평균 역가는 도 30에 그래프로 도시되어 있다. 표 19에 따라 PRNT를 사용하여 혈청전환 결정을 획득한 인간 대상의 백분율을 도 31에 그래픽으로 나타내었다.
투여(dose) 1 이후 및 투여(dose) 2 이후 중화 역가의 분포는 각각 도 32 및 33에 역 누적 분포 곡선(reverse cumulative distribution curves)으로 도시되어 있다.
PRNT 검정으로 면역 반응을 측정하는 것에 더하여, 표본은 또한 RVP 중화 검정으로 시험되었다. 표 20은 RVP 검정에 의해 측정된 지카 바이러스 중화 항체 (EC50)의 기하학적 항체 역가를 제시한다. RVP 검정 결과는 PRNT 데이터의 유사한 투여량-범위 효과를 나타내며, PIZV 투여량이 증가함에 따라, 점차적으로 GMTs가 높아진다.
Figure pct00044
결론:
PIZV 백신은 플라비바이러스-나이브 코호트에서 평가된 모든 항원 투여량에 대해 내약성이 우수하고, 안전하였다. 투여량 강도가 증가함에 따른 명백한 증가가 없는 모든 군에서 응답형 전신성 AEs가 보고되었고, 강도는 경증이거나 중등도였다. 보고된 국소 응답형 AEs는 또한 군에 걸쳐 경증 내지 중등도였다. 비응답형 증상이 4 개의 연구군에서 비슷한 빈도로 보고되었다. 전반적으로, 상기 백신은 플라비바이러스-나이브 인간 대상에서 면역원성이었으며, 투여량-범위 반응은 양성으로 관찰되었다.
발명의 추가 항목(items)
1. 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 요하는 인간 대상 집단에서 이를 치료 또는 예방하는, 특히 예방하는 방법에 사용을 위한 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 상기 방법은 전술한 인간 대상 집단의 개별 인간 대상에게 지카 바이러스의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 단일 투여량으로 투여되거나 또는 일차접종 투여되며, 그리고 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 단일 투여 또는 일차접종 투여 후 14 일 및/또는 28 일에 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상의 집단 및/또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 집단에서 플라크 환원 중화 검사 (PRNT)에 의해 측정될 때, 10 이상, 또는 50 이상, 또는 100 이상, 또는 200 이상, 또는 250 이상의 기하학적 평균 중화 항체 역가를 유도하는, 백신 또는 면역원성 조성물.
2. 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 요하는 인간 대상 집단에서 이를 치료 또는 예방하는, 특히 예방하는 방법에 사용을 위한 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 상기 방법은 전술한 인간 대상 집단의 개별 인간 대상에게 지카 바이러스의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하고, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 단일 투여량으로 투여되거나, 또는 일차접종 투여로 투여되며, 그리고 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 집단에서 단일 투여 또는 일차접종 투여 후 14 일 및/또는 28 일에 플라크 환원 중화 검사 (PRNT)에 의해 결정될 때 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 또는 적어도 90%의 혈청전환율을 유도하는 백신 또는 면역원성 조성물.
3. 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 요하는 인간 대상 집단에서 이를 치료 또는 예방하는, 특히 예방하는 방법에 사용을 위한 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 상기 방법은 전술한 인간 대상 집단의 개별 인간 대상에게 지카 바이러스의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하고, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 단일 투여량으로 투여되거나, 또는 일차접종 투여로 투여되며, 그리고 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 집단에서 또는 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상의 집단에서 단일 투여 또는 일차접종 투여 후, 14 일 및/또는 28 일에 플라크 환원 중화 검사 (PRNT)에 의해 결정될 때, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 또는 적어도 90%의 혈청양성율을 유도하는 백신 또는 면역원성 조성물.
4. 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 요하는 인간 대상 집단에서 이를 치료 또는 예방하는, 특히 예방하는 방법에 사용을 위한 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이 방법은 전술한 인간 대상 집단의 개별 인간 대상에게 지카 바이러스의 항원을 포함하는 상기 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하고, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 단일 투여량 투여로 투여되거나, 또는 적어도 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)을 내포하는 다중 투여로 투여되며, 그리고 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여 투여 후 7일까지 인간 대상 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상의 집단 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 집단에서 50% 미만의 전신 부작용을 유도하는, 백신 또는 면역원성 조성물.
5. 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 요하는 인간 대상 집단에서 이를 치료 또는 예방하는, 특히 예방하는 방법에 사용을 위한 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 전술한 인간 대상 집단의 개별 인간 대상에게 지카 바이러스 조직표본을 비활성화시키는 다음을 포함하는 방법에 의해 획득가능한, 지카 바이러스의 항원을 포함하는 상기 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 백신 또는 면역원성 조성물:
(a) 시험관내 배양된 하나 또는 그 이상의 세포로부터 지카 바이러스 조직표본을 단리시키고, 이때 상기 세포들을 이용하여 지카 바이러스 조직표본을 만들고, 이때 상기 지카 바이러스 조직표본의 단리는 다음으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 단계들을 포함하고: (i) 심층 여과, (ii) 완충제 교환 및/또는 희석; (iii) 이온 교환 크로마토그래피; 그리고
(b) 상기 지카 바이러스 조직표본을 포름알데히드, 임의선택적으로 포름알데히드로 처리하고, 이때 일단위로 측정된 포름알데히드와의 배양 기간에 포름알데히드 농도(% (w/v)로 측정됨)를 곱한 수치적 결과는 0.025 내지 0.5이다.
6. 항목 1 내지 5중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 약 1 내지 약 16주 간격을 두고 제2 투여 (추가접종)로 투여되며, 그리고 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 후 14 일 및/또는 28 일 시점에서 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상의 집단 및/또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 집단에서 플라크 환원 중화 검사 (PRNT)에 의해 결정될 때, 300 이상, 또는 500 이상, 또는 1000 이상, 또는 1500 이상, 또는 2000 이상, 또는 3000 이상의 기하학적 평균 중화 항체 역가가 유도되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
7. 항목 1 내지 6중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 약 1 내지 약 16주 간격을 두고 제2 투여 (추가접종)로 투여되며, 그리고 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 플라크 환원 중화 검사 (PRNT)에 의해 결정될 때,
추가접종 후 14일 및/또는 28 일 시점에서 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 집단에서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 또는 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 혈청전환율이 유도되거나,
및/또는
플라크 환원 중화 검사 (PRNT)에 의해 결정될 때, 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 집단에서 또는 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상의 집단에서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 또는 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 혈청양성율이 유도되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
8. 항목 1 내지 7중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단에서 투여 후 7일까지 29% 미만의 두통 증상이 유도되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
9. 항목 1 내지 8중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단에 있어서 열(4% 또는 그 미만), 및/또는 피로(33% 또는 그 미만), 및/또는 관절통(10% 또는 그 미만), 근육통(17% 또는 그 미만) 및/또는 불안감(15% 또는 그 미만)이 투여 후 7일까지 유도되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
10. 항목 1 내지 9중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)의 다중 투여로 투여되며 그리고 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 인간 대상 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 40% 또는 그 미만에서 전신 부작용이 추가접종 투여 후 7일까지 유도되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
11. 항목 1 내지 10중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)의 다중 투여로 투여되며 그리고 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단에서 일차접종 투여 후 7일차와 비교하였을 때, 추가접종 투여 후 7일 까지
-적어도 40% 미만, 또는 적어도 45% 미만 피로가 유도되거나, 및/또는
-더 이상의 열은 없고, 및/또는
-적어도 10% 미만, 또는 적어도 20% 미만, 또는 적어도 25% 미만의 근육통이 유도되거나 또는 더 이상의 근육통은 없고, 및/또는
-적어도 10% 미만, 또는 적어도 20% 미만의 불안감이 유도되거나 또는 더 이상의 근육통은 없는, 백신 또는 면역원성 조성물.
12. 항목 1 내지 11중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)의 다중 투여로 투여되며, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 인간 대상 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 4% 미만에서 또는 0%에서 열이 추가접종 투여 후 7일까지 유도되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
13. 항목 1 내지 12중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)의 다중 투여로 투여되며 그리고 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 인간 대상 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 19% 미만에서 피로가 추가접종 투여 후 7일까지 유도되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
14. 항목 1 내지 13중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)의 다중 투여로 투여되며 그리고 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 인간 대상 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 12% 미만 또는 8% 미만에서 근육통이 추가접종 투여 후 7일까지 유도되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
15. 항목 1 내지 14중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)의 다중 투여로 투여되며 그리고 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 인간 대상 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 13% 미만 또는 10% 또는 그 미만에서 불안감이 추가접종 투여 후 7일까지 유도되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
16. 항목 1 내지 15중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)의 다중 투여로 투여되며, 그리고 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 인간 대상 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 20% 또는 그 미만에서 두통, 8% 또는 그 미만에서 관절통, 4% 미만에서 열, 19% 미만에서 피로, 그리고 12% 미만에서 근육통, 그리고 13% 미만에서 불안감이 추가접종 투여 후 7일까지 유도되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
17. 항목 1 내지 16중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 1μg 내지 40μg 투여량의 항원을 포함하고, 이때 상기 항원은 비활성화된 온전체 바이러스인, 백신 또는 면역원성 조성물.
18. 항목 17의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 상기 지카 바이러스는 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 돌연변이를 갖는, 백신 또는 면역원성 조성물.
19. 항목 1 내지 18중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 항원은 정제되며, 그리고 이때 크기 배제 크로마토그래피에서 정제된 지카 바이러스의 주요 피크는 크기 배제 크로마토그래피에서 곡선 아래 총면적의 85% 이상인, 백신 또는 면역원성 조성물.
20. 항목 1 내지 19중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 임의선택적으로 발병을 겪게 되는 지카 풍토성 지역으로부터의 인간 대상에게 투여되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
21. 항목 1 내지 20중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 풍토 지역으로 여행한 지카 비-풍토 지역의 인간 대상에게 투여되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
22. 항목 1 내지 21중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 18 내지 29세 연령대의, 특히 가임기 여성인 인간 대상에게 투여되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
23. 항목 1 내지 21중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 30 내지 49세 연령대의, 특히 가임기 여성인 인간 대상에게 투여되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
24. 항목 1 내지 23중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 단일 투여량 투여, 또는 적어도 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)을 내포하는 다중 투여로 투여되며, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 약 5μg 투여량의 정제된 비활성화된 온전체 바이러스를 포함하는, 백신 또는 면역원성 조성물.
25. 항복 24의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단에서 50% 미만, 45% 미만, 또는 40% 미만의 전신 부작용이 유도되고, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 40% 미만, 또는 35% 미만, 또는 30% 미만, 또는 25% 미만, 또는 20% 미만, 또는 15% 미만에서 전신 부작용이 유도되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
26. 항목 24 또는 25의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 3% 미만, 또는 0%에서 열이 유도되고, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 4% 미만, 또는 3% 미만, 또는 0%에서 열이 유도되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
27. 항목 24 내지 26중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 29% 미만에서 두통이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 20% 미만, 또는 15% 미만, 또는 10% 미만, 또는 5% 미만에서 두통이 유도되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
28. 항목 24 내지 27중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 30% 미만, 또는 25% 미만, 또는 20% 미만에서 피로가 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 20% 미만, 또는 15% 미만, 또는 10% 미만에서 피로가 유도되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
29. 항목 24 내지 28중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 4% 미만에서 관절통이 유도되고, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 5% 미만, 또는 2% 미만, 또는 0%에서 관절통이 유도되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
30. 항목 24 내지 29중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 17% 미만에서 근육통이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 12% 미만, 또는 10% 미만, 또는 5% 미만에서 근육통이 유도되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
31. 항목 24 내지 30중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 10% 미만에서 불안감이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 14% 미만, 또는 10% 미만, 또는 5% 미만, 또는 0% 미만에서 불안감이 유도되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
32. 항목 24 내지 31중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)의 다중 투여로 투여되며, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단에서 일차접종 후 7일차와 비교하였을 때,
-적어도 70% 미만, 또는 적어도 60% 미만, 또는 적어도 50% 미만, 또는 적어도 40% 미만, 또는 적어도 35% 미만, 또는 적어도 30% 미만의 전신 부작용, 및/또는
-열의 증가는 없고, 및/또는
-적어도 80% 미만, 또는 적어도 70% 미만, 또는 적어도 60% 미만, 또는 적어도 50% 미만, 또는 적어도 45% 미만의 두통, 및/또는
-적어도 60% 미만, 또는 적어도 55% 미만, 또는 적어도 50% 미만, 또는 적어도 45% 미만, 또는 적어도 40% 미만의 피로, 및/또는
-관절통의 증가는 없거나, 또는 적어도 80% 미만, 또는 적어도 60% 미만, 또는 적어도 40% 미만, 또는 적어도 20% 미만, 또는 적어도 10% 미만의 관절통, 및/또는
-근육통의 증가는 없거나, 또는 적어도 70% 미만, 또는 적어도 60% 미만, 또는 적어도 40% 미만, 또는 적어도 20% 미만, 또는 적어도 10% 미만의 근육통, 및/또는
-불안감의 증가는 없거나, 또는 적어도 80% 미만, 또는 적어도 60% 미만, 또는 적어도 40% 미만, 또는 적어도 20% 미만, 또는 적어도 10% 미만의 불안감이 유도되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
33. 항목 1 내지 23중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 단일 투여량 투여, 또는 적어도 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)을 내포하는 다중 투여로 투여되며, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 약 10μg 투여량의 정제된 비활성화된 온전체 바이러스를 포함하는, 백신 또는 면역원성 조성물.
34. 항목 33의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 50% 미만에서 전신 부작용이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 40% 미만, 또는 35% 미만, 또는 30% 미만에서 전신 부작용이 유도되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
35. 항목 33 또는 34의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 4% 미만에서 열이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 4% 미만, 또는 3% 미만, 또는 0%에서 열이 유도되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
36. 항목 33 내지 35중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 29% 미만, 또는 25% 미만, 또는 20% 미만, 또는 15% 미만에서 두통이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 20% 또는 그 미만에서 두통이 유도되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
37. 항목 33 내지 36중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 33% 미만에서 피로가 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 20% 또는 그 미만에서 피로가 유도되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
38. 항목 33 내지 37중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 10% 또는 그 미만에서 관절통이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 5% 미만에서 관절통이 유도되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
39. 항목 33 내지 38중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 17% 또는 그 미만에서 근육통이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 12% 미만, 또는 10% 미만에서 근육통이 유도되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
40. 항목 33 내지 39중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 15% 또는 그 미만에서 불안감이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 13% 미만, 또는 10% 또는 그 미만에서 불안감이 유도되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
41. 항목 33 내지 40중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)의 다중 투여로 투여되며, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단에서 일차접종 후 7일차와 비교하였을 때,
-적어도 40% 미만, 또는 적어도 35% 미만, 또는 적어도 30% 미만, 또는 적어도 25% 미만의 전신 부작용이 유도되거나, 및/또는
-열의 증가는 없거나, 또는 적어도 80% 미만, 또는 적어도 60% 미만, 또는 적어도 40% 미만, 또는 적어도 20% 미만, 또는 적어도 10% 미만의 열이 유도되거나, 및/또는
-적어도 45% 미만, 또는 적어도 40% 미만의 피로가 유도되거나, 및/또는
-관절통의 증가는 없거나, 또는 적어도 65% 미만, 또는 적어도 60% 미만, 또는 적어도 40% 미만, 또는 적어도 20% 미만, 또는 적어도 10% 미만의 관절통이 유도되거나, 및/또는
-근육통의 증가는 없거나, 또는 적어도 45% 미만, 또는 적어도 40% 미만, 또는 적어도 20% 미만, 또는 적어도 10% 미만의 근육통이 유도되거나, 및/또는
-불안감의 증가는 없거나, 또는 적어도 20% 미만, 또는 적어도 10% 미만의 불안감이 유도되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
42. 항목 1 내지 23중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 단일 투여량 투여, 또는 적어도 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)을 내포하는 다중 투여로 투여되며, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 약 2μg 투여량의 정제된 비활성화된 온전체 바이러스를 포함하는, 백신 또는 면역원성 조성물.
43. 항목 42의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 50% 미만, 또는 45% 미만, 또는 40% 미만, 또는 35% 미만에서 전신 부작용이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 40% 미만, 또는 35% 미만에서 전신 부작용이 유도되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
44. 항목 42 또는 43의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 3% 미만, 또는 0%에서 열이 유도되고, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 4% 미만, 또는 3% 미만, 또는 0%에서 열이 유도되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
45. 항목 42 내지 44중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 29% 미만, 또는 25% 미만, 또는 20% 미만에서 두통이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 20% 미만, 또는 15% 미만에서 두통이 유도되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
46. 항목 42 내지 45중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서,이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 30% 미만, 또는 25% 미만에서 피로가 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 20% 미만, 또는 15% 미만에서 피로가 유도되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
47. 항목 42 내지 46중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서,이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 4% 또는 그 미만에서 관절통이 유도되며, 및/또는 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 8% 미만에서 관절통이 유도된다.
48. 항목 42 내지 47중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 17% 또는 그 미만에서 근육통이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 12% 미만, 또는 10% 미만에서 근육통이 유도되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
49. 항목 42 내지 48중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 10% 미만에서 불안감이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 13% 미만, 또는 10% 미만, 또는 5% 미만, 또는 0% 미만에서 불안감이 유도되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
50. 항목 42 내지 49중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)의 다중 투여로 투여되며, 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단에서 일차접종 후 7일차와 비교하였을 때,
-열의 증가는 없고, 및/또는
-적어도 50% 미만, 또는 적어도 45% 미만, 또는 적어도 40% 미만의 피로가 유도되며, 및/또는
-근육통의 증가는 없거나, 또는 적어도 20% 미만, 또는 적어도 10% 미만의 근육통이 유도되며, 및/또는
-불안감의 증가는 없거나, 또는 적어도 80% 미만, 또는 적어도 60% 미만, 또는 적어도 40% 미만, 또는 적어도 20% 미만, 또는 적어도 10% 미만의 불안감이 유도되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
51. 항목 5 내지 50중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서,이때 상기 세포들은 비-인간 세포인, 백신 또는 면역원성 조성물.
52. 항목 51의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 세포들은 Vero 세포인, 백신 또는 면역원성 조성물.
53. 항목 5 내지 52중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 지카 바이러스 조직표본은 0.005% (w/v) 내지 0.02% (w/v)의 농도에서 포름알데히드로 처리되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
54. 항목 5 내지 53중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서,이때 상기 지카 바이러스 조직표본은 8일 내지 12일 동안 처리되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
55. 항목 54의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 지카 바이러스 조직표본은 10 일 동안 처리되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
56. 항목 5 내지 55중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 지카 바이러스 조직표본은 15℃ 내지 30℃의 온도에서 처리되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
57. 항목 56의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 지카 바이러스 조직표본은 22℃의 온도에서 처리되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
58. 항목 5 내지 57중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 비활성화의 완결도를 결정하는 단계 (c)를 더욱 포함하는, 백신 또는 면역원성 조성물.
59. 항목 58의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 단계 (c)는 다음을 포함하는,백신 또는 면역원성 조성물:
(i) 배양된 곤충 세포를 단계 (b)에 따라서 처리된 지카 바이러스 조직표본으로 접종하고, 그리고 이들 곤충 세포를 제 1 기간 동안 배양하고, 따라서 곤충 세포 상청액을 생산하고;
(ii) 배양된 포유류 세포를 (i)에서 생산된 곤충 세포 상청액으로 접종하고, 그리고 이들 포유류 세포를 두 번째 기간 동안 배양하고; 그리고
(iii) 지카 바이러스 조직표본이 포유류 세포에 대한 세포변성 효과를 발생시키는 잔여 복제 바이러스를 내포하는 지를 결정함.
60. 항목 59의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 곤충 세포는 CCL-125 세포, Aag-2 세포, RML-12 세포, C6/36 세포, C7-10 세포, AP-61 세포, A.t. GRIP-1 세포, A.t. GRIP-2 세포, A.t. GRIP-3 세포, UM-AVE1 세포, Mos.55 세포, Sua1B 세포, 4a-3B 세포, Mos.42 세포, MSQ43 세포, LSB-AA695BB 세포, NIID-CTR 세포 및 TRA-171 세포, 예컨대 C6/36 세포에서 선택되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
61. 항목 59 또는 60의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 제1 기간은 3 내지 7 일인, 백신 또는 면역원성 조성물.
62. 항목 59 내지 61중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 포유류 세포는 VERO 세포, LLC-MK2 세포, MDBK 세포, MDCK 세포, ATCC CCL34 MDCK (NBL2) 세포, MDCK 33016 (WO97/37001에서 설명된 바와 같은 수탁 번호 DSM ACC 2219) 세포, BHK21-F 세포, HKCC 세포, 그리고 중국 햄스터 난소 세포 (CHO 세포), 예컨대 VERO 세포에서 선택되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
63. 항목 59 내지 62중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 제2 기간은 3 내지 14 일인, 백신 또는 면역원성 조성물.
64. 항목 5 내지 63중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 포름알데히드-처리된 지카 바이러스 조직표본을 메타중아황산나트륨으로 중화하는 단계 (d)를 더욱 포함하는, 백신 또는 면역원성 조성물.
65. 항목더 보 64의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 포름알데히드-처리된 지카 바이러스 조직표본은 포름알데히드 처리 후 적어도 5일, 적어도 7일, 적어도 9일, 적어도 11일, 또는 적어도 14 일 시점에 중화되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
66.항목 1 내지 65중 임의의 하나의 백신 또는 면역원성 조성물에 있어서, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 50μg/ml 미만의 잔류 포름알데히드 함량을 갖는, 백신 또는 면역원성 조성물.
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<210> 2 <211> 10675 <212> DNA <213> Zika virus <400> 2 gttgttgatc tgtgtgaatc agactgcgac agttcgagtt tgaagcgaaa gctagcaaca 60 gtatcaacag gttttatttt ggatttggaa acgagagttt ctggtcatga aaaacccaaa 120 aaagaaatcc ggaggattcc ggattgtcaa tatgctaaaa cgcggagtag cccgtgtgag 180 cccctttggg ggcttgaaga ggctgccagc cggacttctg ctgggtcatg ggcccatcag 240 gatggtcttg gcgattctag cctttttgag attcacggca atcaagccat cactgggtct 300 catcaataga tggggttcag tggggaaaaa agaggctatg gaaacaataa agaagttcaa 360 gaaagatctg gctgccatgc tgagaataat caatgctagg aaggagaaga agagacgagg 420 cgcagatact agtgtcggaa ttgttggcct cctgctgacc acagctatgg cagcggaggt 480 cactagacgt gggagtgcat actatatgta cttggacaga aacgatgctg gggaggccat 540 atcttttcca accacattgg ggatgaataa gtgttatata cagatcatgg atcttggaca 600 catgtgtgat gccaccatga gctatgaatg ccctatgctg gatgaggggg tggaaccaga 660 tgacgtcgat tgttggtgca acacgacgtc aacttgggtt gtgtacggaa cctgccatca 720 caaaaaaggt gaagcacgga gatctagaag agctgtgacg ctcccctccc attccaccag 780 gaagctgcaa acgcggtcgc aaacctggtt ggaatcaaga gaatacacaa agcacttgat 840 tagagtcgaa aattggatat tcaggaaccc tggcttcgcg ttagcagcag ctgccatcgc 900 ttggcttttg ggaagctcaa cgagccaaaa agtcatatac ttggtcatga tactgctgat 960 tgccccggca tacagcatca ggtgcatagg agtcagcaat agggactttg tggaaggtat 1020 gtcaggtggg acttgggttg atgttgtctt ggaacatgga ggttgtgtca ccgtaatggc 1080 acaggacaaa ccgactgtcg acatagagct ggttacaaca acagtcagca acatggcgga 1140 ggtaagatcc tactgctatg aggcatcaat atcagacatg gcttctgaca gccgctgccc 1200 aacacaaggt gaagcctacc ttgacaagca atcagacact caatatgtct gcaaaagaac 1260 gttagtggac agaggctggg gaaatggatg tggacttttt ggcaaaggga gcctggtgac 1320 atgcgctaag tttgcatgct ccaagaaaat gaccgggaag agcatccagc cagagaatct 1380 ggagtaccgg ataatgctgt cagttcatgg ctcccagcac agtgggatga tcgttaatga 1440 cacaggacat gaaactgatg agaatagagc gaaagttgag ataacgccca attcaccgag 1500 agccgaagcc accctggggg gttttggaag cctaggactt gattgtgaac cgaggacagg 1560 ccttgacttt tcagatttgt attacttgac tatgaataac aagcactggt tggttcacaa 1620 ggagtggttc cacgacattc cattaccttg gcacgctggg gcagacaccg gaactccaca 1680 ctggaacaac aaagaagcac tggtagagtt caaggacgca catgccaaaa ggcaaactgt 1740 cgtggttcta gggagtcaag aaggagcagt tcacacggcc cttgctggag ctctggaggc 1800 tgagatggat ggtgcaaagg gaaggctgtc ctctggccac ttgaaatgtc gcctgaaaat 1860 ggataaactt agattgaagg gcgtgtcata ctccttgtgt actgcagcgt tcacattcac 1920 caagatcccg gctgaaacac tgcacgggac agtcacagtg gaggtacagt acgcagggac 1980 agatggacct tgcaaggttc cagctcagat ggcggtggac atgcaaactc tgaccccagt 2040 tgggaggttg ataaccgcta accccgtaat cactgaaagc actgagaact ctaagatgat 2100 gctggaactt gatccaccat ttggggactc ttacattgtc ataggagtcg gggagaagaa 2160 gatcacccac cactggcaca ggagtggcag caccattgga aaagcatttg aagccactgt 2220 gagaggtgcc aagagaatgg cagtcttggg agacacagcc tgggactttg gatcagttgg 2280 aggcgctctc aactcattgg gcaagggcat ccatcaaatt tttggagcag ctttcaaatc 2340 attgtttgga ggaatgtcct ggttctcaca aattctcatt ggaacgttgc tgatgtggtt 2400 gggtctgaac acaaagaatg gatctatttc ccttatgtgc ttggccttag ggggagtgtt 2460 gatcttctta tccacagccg tctctgctga tgtggggtgc tcggtggact tctcaaagaa 2520 ggagacgaga tgcggtacag gggtgttcgt ctataacgac gttgaagcct ggagggacag 2580 gtacaagtac catcctgact ccccccgtag attggcagca gcagtcaagc aagcctggga 2640 agatggtatc tgcgggatct cctctgtttc aagaatggaa aacatcatgt ggagatcagt 2700 agaaggggag ctcaacgcaa tcctggaaga gaatggagtt caactgacgg tcgttgtggg 2760 atctgtaaaa aaccccatgt ggagaggtcc acagagattg cccgtgcctg tgaacgagct 2820 gccccacggc tggaaggctt gggggaaatc gtatttcgtc agagcagcaa agacaaataa 2880 cagctttgtc gtggatggtg acacactgaa ggaatgccca ctcaaacata gagcatggaa 2940 cagctttctt gtggaggatc atgggttcgg ggtatttcac actagtgtct ggctcaaggt 3000 tagagaagat tattcattag agtgtgatcc agccgttatt ggaacagctg ttaagggaaa 3060 ggaggctgta cacagtgatc taggctactg gattgagagt gagaagaatg acacatggag 3120 gctgaagagg gcccatctga tcgagatgaa aacatgtgaa tggccaaagt cccacacatt 3180 gtggacagat ggaatagaag agagtgatct gatcataccc aagtctttag ctgggccact 3240 cagccatcac aataccagag agggctacag gacccaaatg aaagggccat ggcacagtga 3300 agagcttgaa attcggtttg aggaatgccc aggcactaag gtccacgtgg aggaaacatg 3360 tggaacaaga ggaccatctc tgagatcaac cactgcaagc ggaagggtga tcgaggaatg 3420 gtgctgcagg gagtgcacaa tgcccccact gtcgttccgg gctaaagatg gctgttggta 3480 tggaatggag ataaggccca ggaaagaacc agaaagcaac ttagtaaggt caatggtgac 3540 tgcaggatca actgatcaca tggaccactt ctcccttgga gtgcttgtga tcctgctcat 3600 ggtgcaggaa gggctgaaga agagaatgac cacaaagatc atcataagca catcaatggc 3660 agtgctggta gctatgatcc tgggaggatt ttcaatgagt gacctggcta agcttgcaat 3720 tttgatgggt gccaccttcg cggaaatgaa cactggagga gatgtagctc atctggcgct 3780 gatagcggca ttcaaagtca gaccagcgtt gctggtatct ttcatcttca gagctaattg 3840 gacaccccgt gaaagcatgc tgctggcctt ggcctcgtgt cttttgcaaa ctgcgatctc 3900 cgccttggaa ggcgacctga tggttctcat caatggtttt gctttggcct ggttggcaat 3960 acgagcgatg gttgttccac gcactgataa catcaccttg gcaatcctgg ctgctctgac 4020 accactggcc cggggcacac tgcttgtggc gtggagagca ggccttgcta cttgcggggg 4080 gtttatgctc ctctctctga agggaaaagg cagtgtgaag aagaacttac catttgtcat 4140 ggccctggga ctaaccgctg tgaggctggt cgaccccatc aacgtggtgg gactgctgtt 4200 gctcacaagg agtgggaagc ggagctggcc ccctagcgaa gtactcacag ctgttggcct 4260 gatatgcgca ttggctggag ggttcgccaa ggcagatata gagatggctg ggcccatggc 4320 cgcggtcggt ctgctaattg tcagttacgt ggtctcagga aagagtgtgg acatgtacat 4380 tgaaagagca ggtgacatca catgggaaaa agatgcggaa gtcactggaa acagtccccg 4440 gctcgatgtg gcgctagatg agagtggtga tttctccctg gtggaggatg acggtccccc 4500 catgagagag atcatactca aggtggtcct gatgaccatc tgtggcatga acccaatagc 4560 catacccttt gcagctggag cgtggtacgt atacgtgaag actggaaaaa ggagtggtgc 4620 tctatgggat gtgcctgctc ccaaggaagt aaaaaagggg gagaccacag atggagtgta 4680 cagagtaatg actcgtagac tgctaggttc aacacaagtt ggagtgggag ttatgcaaga 4740 gggggtcttt cacactatgt ggcacgtcac aaaaggatcc gcgctgagaa gcggtgaagg 4800 gagacttgat ccatactggg gagatgtcaa gcaggatctg gtgtcatact gtggtccatg 4860 gaagctagat gccgcctggg atgggcacag cgaggtgcag ctcttggccg tgccccccgg 4920 agagagagcg aggaacatcc agactctgcc cggaatattt aagacaaagg atggggacat 4980 tggagcggtt gcgctggatt acccagcagg aacttcagga tctccaatcc tagacaagtg 5040 tgggagagtg ataggacttt atggcaatgg ggtcgtgatc aaaaacggga gttatgttag 5100 tgccatcacc caagggagga gggaggaaga gactcctgtt gagtgcttcg agccctcgat 5160 gctgaagaag aagcagctaa ctgtcttaga cttgcatcct ggagctggga aaaccaggag 5220 agttcttcct gaaatagtcc gtgaagccat aaaaacaaga ctccgtactg tgatcttagc 5280 tccaaccagg gttgtcgctg ctgaaatgga ggaggccctt agagggcttc cagtgcgtta 5340 tatgacaaca gcagtcaatg tcacccactc tggaacagaa atcgtcgact taatgtgcca 5400 tgccaccttc acttcacgtc tactacagcc aatcagagtc cccaactata atctgtatat 5460 tatggatgag gcccacttca cagatccctc aagtatagca gcaagaggat acatttcaac 5520 aagggttgag atgggcgagg cggctgccat cttcatgacc gccacgccac caggaacccg 5580 tgacgcattt ccggactcca actcaccaat tatggacacc gaagtggaag tcccagagag 5640 agcctggagc tcaggctttg attgggtgac ggatcattct ggaaaaacag tttggtttgt 5700 tccaagcgtg aggaacggca atgagatcgc agcttgtctg acaaaggctg gaaaacgggt 5760 catacagctc agcagaaaga cttttgagac agagttccag aaaacaaaac atcaagagtg 5820 ggactttgtc gtgacaactg acatttcaga 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gggcataggg aagatgggct ttggaatggt 6720 gactcttggg gccagcgcat ggctcatgtg gctctcggaa attgagccag ccagaattgc 6780 atgtgtcctc attgttgtgt tcctattgct ggtggtgctc atacctgagc cagaaaagca 6840 aagatctccc caggacaacc aaatggcaat catcatcatg gtagcagtag gtcttctggg 6900 cttgattacc gccaatgaac tcggatggtt ggagagaaca aagagtgacc taagccatct 6960 aatgggaagg agagaggagg gggcaaccat aggattctca atggacattg acctgcggcc 7020 agcctcagct tgggccatct atgctgcctt gacaactttc attaccccag ccgtccaaca 7080 tgcagtgacc acctcataca acaactactc cttaatggcg atggccacgc aagctggagt 7140 gttgtttggc atgggcaaag ggatgccatt ctacgcatgg gactttggag tcccgctgct 7200 aatgataggt tgctactcac aattaacacc cctgacccta atagtggcca tcattttgct 7260 cgtggcgcac tacatgtact tgatcccagg gctgcaggca gcagctgcgc gtgctgccca 7320 gaagagaacg gcagctggca tcatgaagaa ccctgttgtg gatggaatag tggtgactga 7380 cattgacaca atgacaattg acccccaagt ggagaaaaag atgggacagg tgctactcat 7440 agcagtagcc gtctccagcg ccatactgtc gcggaccgcc tgggggtggg gggaggctgg 7500 ggctctgatc acagccgcaa cttccacttt gtgggaaggc tctccgaaca agtactggaa 7560 ctcctctaca gccacttcac tgtgtaacat ttttagggga agttacttgg ctggagcttc 7620 tctaatctac acagtaacaa gaaacgctgg cttggtcaag agacgtgggg gtggaacagg 7680 agagaccctg ggagagaaat ggaaggcccg cttgaaccag atgtcggccc tggagttcta 7740 ctcctacaaa aagtcaggca tcaccgaggt gtgcagagaa gaggcccgcc gcgccctcaa 7800 ggacggtgtg gcaacgggag gccatgctgt gtcccgagga agtgcaaagc tgagatggtt 7860 ggtggagcgg ggatacctgc agccctatgg aaaggtcatt gatcttggat gtggcagagg 7920 gggctggagt tactacgtcg ccaccatccg caaagttcaa gaagtgaaag gatacacaaa 7980 aggaggccct ggtcatgaag aacccgtgtt ggtgcaaagc tatgggtgga acatagtccg 8040 tcttaagagt ggggtggacg tctttcatat ggcggctgag ccgtgtgaca cgttgctgtg 8100 tgacataggt gagtcatcat ctagtcctga agtggaagaa gcacggacgc tcagagtcct 8160 ctccatggtg ggggattggc ttgaaaaaag accaggagcc ttttgtataa aagtgttgtg 8220 cccatacacc agcactatga tggaaaccct ggagcgactg cagcgtaggt atgggggagg 8280 actggtcaga gtgccactct cccgcaactc tacacatgag atgtactggg tctctggagc 8340 gaaaagcaac accataaaaa gtgtgtccac cacgagccag ctcctcttgg ggcgcatgga 8400 cgggcctagg aggccagtga aatatgagga ggatgtgaat ctcggctctg gcacgcgggc 8460 tgtggtaagc tgcgctgaag ctcccaacat gaagatcatt ggtaaccgca ttgaaaggat 8520 ccgcagtgag cacgcggaaa cgtggttctt tgacgagaac cacccatata ggacatgggc 8580 ttaccatgga agctatgagg cccccacaca agggtcagcg tcctctctaa taaacggggt 8640 tgtcaggctc ctgtcaaaac cctgggatgt ggtgactgga gtcacaggaa tagccatgac 8700 cgacaccaca ccgtatggtc agcaaagagt tttcaaggaa aaagtggaca ctagggtgcc 8760 agacccccaa gaaggcactc gtcaggttat gagcatggtc tcttcctggt tgtggaaaga 8820 gctaggcaaa cacaaacggc cacgagtctg caccaaagaa gagttcatca acaaggttcg 8880 tagcaatgca gcattagggg caatatttga agaggaaaaa gagtggaaga ctgcagtgga 8940 agctgtgaac gatccaaggt tctgggctct agtggacaag gaaagagagc accacctgag 9000 aggagagtgc cagagctgtg tgtacaacat gatgggaaaa agagaaaaga aacaagggga 9060 atttggaaag gccaagggca gccgcgccat ctggtatatg tggctagggg ctagatttct 9120 agagttcgaa gcccttggat tcttgaacga ggatcactgg atggggagag agaactcagg 9180 aggtggtgtt gaagggctgg gattacaaag actcggatat gtcctagaag agatgagtcg 9240 tataccagga ggaaggatgt atgcagatga cactgctggc tgggacaccc gcattagcag 9300 gtttgatctg gagaatgaag ctctaatcac caaccaaatg gagaaagggc acagggcctt 9360 ggcattggcc ataatcaagt acacatacca aaacaaagtg gtaaaggtcc ttagaccagc 9420 tgaaaaaggg aaaacagtta tggacattat ttcgagacaa gaccaaaggg ggagcggaca 9480 agttgtcact tacgctctta acacatttac caacctagtg gtgcaactca ttcggaatat 9540 ggaggctgag gaagttctag agatgcaaga cttgtggctg ctgcggaggt cagagaaagt 9600 gaccaactgg ttgcagagca acggatggga taggctcaaa cgaatggcag tcagtggaga 9660 tgattgcgtt gtgaagccaa ttgatgatag gtttgcacat gccctcaggt tcttgaatga 9720 tatgggaaaa gttaggaagg acacacaaga gtggaaaccc tcaactggat gggacaactg 9780 ggaagaagtt ccgttttgct cccaccactt caacaagctc catctcaagg acgggaggtc 9840 cattgtggtt ccctgccgcc accaagatga actgattggc cgggcccgcg tctctccagg 9900 ggcgggatgg agcatccggg agactgcttg cctagcaaaa tcatatgcgc aaatgtggca 9960 gctcctttat ttccacagaa gggacctccg actgatggcc aatgccattt gttcatctgt 10020 gccagttgac tgggttccaa ctgggagaac tacctggtca atccatggaa agggagaatg 10080 gatgaccact gaagacatgc ttgtggtgtg gaacagagtg tggattgagg agaacgacca 10140 catggaagac aagaccccag ttacgaaatg gacagacatt ccctatttgg gaaaaaggga 10200 agacttgtgg tgtggatctc tcatagggca cagaccgcgc accacctggg ctgagaacat 10260 taaaaacaca gtcaacatgg tgcgcaggat cataggtgat gaagaaaagt acatggacta 10320 cctatccacc caagttcgct acttgggtga agaagggtct acacctggag tgctgtaagc 10380 accaatctta atgttgtcag gcctgctagt cagccacagc ttggggaaag ctgtgcagcc 10440 tgtgaccccc ccaggagaag ctgggaaacc aagcctatag tcaggccgag aacgccatgg 10500 cacggaagaa gccatgctgc ctgtgagccc ctcagaggac actgagtcaa aaaaccccac 10560 gcgcttggag gcgcaggatg ggaaaagaag gtggcgacct tccccaccct tcaatctggg 10620 gcctgaactg gagatcagct gtggatctcc agaagaggga ctagtggtta gagga 10675 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligo 1 (CpG 1826) <400> 3 tccatgacgt tcctgacgtt 20 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligo 2 (CpG 1758) <400> 4 tctcccagcg tgcgccat 18 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligo 3 <400> 5 accgatgacg tcgccggtga cggcaccacg 30 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligo 4 (CpG 2006) <400> 6 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligo 5 (CpG 1668) <400> 7 tccatgacgt tcctgatgct 20 <210> 8 <211> 31 <212> PRT <213> Zika virus <400> 8 Phe Thr Lys Ile Pro Ala Glu Thr Leu His Gly Thr Val Thr Val Glu 1 5 10 15 Val Gln Tyr Ala Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ala Gln 20 25 30 <210> 9 <211> 31 <212> PRT <213> Zika virus <400> 9 Phe Thr Lys Ile Pro Ala Glu Thr Leu His Gly Thr Val Thr Val Glu 1 5 10 15 Val Gln Tyr Ala Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ala Gln 20 25 30 <210> 10 <211> 31 <212> PRT <213> West Nile Virus <400> 10 Phe Leu Gly Thr Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Leu Glu 1 5 10 15 Leu Gln Tyr Thr Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ile Ser 20 25 30 <210> 11 <211> 31 <212> PRT <213> Japanese Encephalitis Virus <400> 11 Phe Ala Lys Asn Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Ile Glu 1 5 10 15 Leu Thr Tyr Ser Gly Ser Asp Gly Pro Cys Lys Ile Pro Ile Val 20 25 30 <210> 12 <211> 31 <212> PRT <213> Saint Louis Encephalitis Virus <400> 12 Phe Ser Lys Asn Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Ile Val Glu 1 5 10 15 Leu Gln Tyr Thr Gly Ser Asn Gly Pro Cys Arg Val Pro Ile Ser 20 25 30 <210> 13 <211> 30 <212> PRT <213> Yellow Fever Virus <400> 13 Phe Val Lys Asn Pro Thr Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Met Gln 1 5 10 15 Val Lys Val Ser Lys Gly Ala Pro Cys Arg Ile Pro Val Ile 20 25 30 <210> 14 <211> 31 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 14 Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val Leu Val Gln 1 5 10 15 Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser 20 25 30 <210> 15 <211> 31 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 15 Val Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Val Ile Arg 1 5 10 15 Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro Phe Glu 20 25 30 <210> 16 <211> 31 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 16 Leu Lys Lys Glu Val Ser Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Leu Ile Lys 1 5 10 15 Val Glu Tyr Lys Gly Glu Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser 20 25 30 <210> 17 <211> 31 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 17 Ile Asp Lys Glu Met Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Thr Val Val Lys 1 5 10 15 Val Lys Tyr Glu Gly Ala Gly Ala Pro Cys Lys Val Pro Ile Glu 20 25 30 <210> 18 <211> 29 <212> PRT <213> Zika virus <400> 18 Ser Val Lys Asn Pro Met Gly Arg Gly Pro Gln Arg Leu Pro Val Pro 1 5 10 15 Val Asn Glu Leu Pro His Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys 20 25 <210> 19 <211> 29 <212> PRT <213> Zika virus <400> 19 Ser Val Lys Asn Pro Met Trp Arg Gly Pro Gln Arg Leu Pro Val Pro 1 5 10 15 Val Asn Glu Leu Pro His Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys 20 25 <210> 20 <211> 29 <212> PRT <213> West Nile Virus <400> 20 Lys Gln Glu Gly Met Tyr Lys Ser Ala Pro Lys Arg Leu Thr Ala Thr 1 5 10 15 Thr Glu Lys Leu Glu Ile Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys 20 25 <210> 21 <211> 29 <212> PRT <213> Japanese Encephalitis Virus <400> 21 Lys Pro Val Gly Arg Tyr Arg Ser Ala Pro Lys Arg Leu Ser Met Thr 1 5 10 15 Gln Glu Lys Phe Glu Met Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys 20 25 <210> 22 <211> 29 <212> PRT <213> Saint Louis Encephalitis Virus <400> 22 Glu Asp Pro Lys Tyr Tyr Lys Arg Ala Pro Arg Arg Leu Lys Lys Leu 1 5 10 15 Glu Asp Glu Leu Asn Tyr Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys 20 25 <210> 23 <211> 29 <212> PRT <213> Yellow Fever Virus <400> 23 Asp Pro Lys Asn Val Tyr Gln Arg Gly Thr His Pro Phe Ser Arg Ile 1 5 10 15 Arg Asp Gly Leu Gln Tyr Gly Trp Lys Thr Trp Gly Lys 20 25 <210> 24 <211> 29 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 24 Asp Val Ser Gly Ile Leu Ala Gln Gly Lys Lys Met Ile Arg Pro Gln 1 5 10 15 Pro Met Glu His Lys Tyr Ser Trp Lys Ser Trp Gly Lys 20 25 <210> 25 <211> 29 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 25 Asp Ile Lys Gly Ile Met Gln Ala Gly Lys Arg Ser Leu Arg Pro Gln 1 5 10 15 Pro Thr Glu Leu Lys Tyr Ser Trp Lys Thr Trp Gly Lys 20 25 <210> 26 <211> 29 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 26 Asp Ile Thr Gly Val Leu Glu Gln Gly Lys Arg Thr Leu Thr Pro Gln 1 5 10 15 Pro Met Glu Leu Lys Tyr Ser Trp Lys Thr Trp Gly Lys 20 25 <210> 27 <211> 29 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 27 Asp Val Lys Gly Val Leu Thr Lys Gly Lys Arg Ala Leu Thr Pro Pro 1 5 10 15 Val Asn Asp Leu Lys Tyr Ser Trp Lys Thr Trp Gly Lys 20 25

Claims (68)

  1. 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 요하는 인간 대상 집단에서 이를 치료 또는 예방하는, 특히 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 전술한 인간 대상 집단의 개별 인간 대상에게 지카 바이러스의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 단일 투여량으로 투여되거나 또는 일차접종 투여되며, 그리고 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 단일 투여 또는 일차접종 투여 후 14 일 및/또는 28 일에 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상의 집단 및/또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 집단에서 플라크 환원 중화 검사 (PRNT)에 의해 측정될 때, 10 이상, 또는 50 이상, 또는 100 이상, 또는 200 이상, 또는 250 이상의 기하학적 평균 중화 항체 역가를 유도하는, 방법.
  2. 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 요하는 인간 대상 집단에서 이를 치료 또는 예방하는, 특히 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 전술한 인간 대상 집단의 개별 인간 대상에게 지카 바이러스의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하고, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 단일 투여량으로 투여되거나, 또는 일차접종 투여로 투여되며, 그리고 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 집단에서 단일 투여 또는 일차접종 투여 후 14 일 및/또는 28 일에 플라크 환원 중화 검사 (PRNT)에 의해 결정될 때 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 또는 적어도 90%의 혈청전환율을 유도하는, 방법.
  3. 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 요하는 인간 대상 집단에서 이를 치료 또는 예방하는, 특히 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 전술한 인간 대상 집단의 개별 인간 대상에게 지카 바이러스의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하고, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 단일 투여량으로 투여되거나, 또는 일차접종 투여로 투여되며, 그리고 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 14일 및/또는 28일 후 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 집단에서 또는 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상의 집단, 플라크 환원 중화 검사 (PRNT)에 의해 결정될 때, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 또는 적어도 90%의 혈청양성율을 유도하는, 방법.
  4. 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 요하는 인간 대상 집단에서 이를 치료 또는 예방하는, 특히 예방하는 방법으로서, 이 방법은 전술한 인간 대상 집단의 개별 인간 대상에게 지카 바이러스의 항원을 포함하는 상기 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하고, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 단일 투여량 투여로 투여되거나, 또는 적어도 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)을 내포하는 다중 투여로 투여되며, 그리고 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 투여 후 7일까지 인간 대상 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상의 집단 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 집단에서 50% 미만의 전신 부작용이 유도되는, 방법.
  5. 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 요하는 인간 대상 집단에서 이를 치료 또는 예방하는, 특히 예방하는 방법으로서, 전술한 인간 대상 집단의 개별 인간 대상에게 지카 바이러스 조직표본을 비활성화시키는 다음을 포함하는 방법에 의해 획득가능한, 지카 바이러스의 항원을 포함하는 상기 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 방법:
    (a) 시험관내 배양된 하나 또는 그 이상의 세포로부터 지카 바이러스 조직표본을 단리시키고, 이때 상기 세포들을 이용하여 지카 바이러스 조직표본을 만들고, 이때 상기 지카 바이러스 조직표본의 단리는 다음으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 단계들을 포함하고: (ⅰ) 심층 여과, (ⅱ) 완충제 교환 및/또는 희석; (ⅲ) 이온 교환 크로마토그래피; 그리고
    (b) 상기 지카 바이러스 조직표본을 포름알데히드, 임의선택적으로 포름알데히드로 처리하고, 이때 일단위로 측정된 포름알데히드와의 배양 기간에 포름알데히드 농도(% (w/v)로 측정됨)를 곱한 수치적 결과는 0.025 내지 0.5이다.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 약 1 내지 약 16주 간격을 두고 제2 투여 (추가접종)로 투여되며, 그리고 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 후 14 일 및/또는 28 일 시점에서 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상의 집단 및/또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 집단에서 플라크 환원 중화 검사 (PRNT)에 의해 결정될 때, 300 이상, 또는 500 이상, 또는 1000 이상, 또는 1500 이상, 또는 2000 이상, 또는 3000 이상의 기하학적 평균 중화 항체 역가가 유도되는, 방법.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 약 1 내지 약 16주 간격을 두고 제2 투여 (추가접종)로 투여되며, 그리고 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여
    플라크 환원 중화 검사 (PRNT)에 의해 결정될 때, 추가접종 후 14일 및/또는 28일 시점에서 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 집단에서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 또는 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 혈청전환율이 유도되거나,
    및/또는
    플라크 환원 중화 검사 (PRNT)에 의해 결정될 때, 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 집단에서 또는 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상의 집단에서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 또는 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 혈청양성율이 유도되는, 방법.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단에서 투여 후 7일까지 29% 미만의 두통 증상이 유도되는, 방법.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단에 있어서 열(4% 또는 그 미만), 및/또는 피로(33% 또는 그 미만), 및/또는 관절통(10% 또는 그 미만), 및/또는 근육통(17% 또는 그 미만) 및/또는 불안감(15% 또는 그 미만)이 투여 후 7일까지 유도되는, 방법.
  10. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)의 다중 투여로 투여되며 그리고 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 인간 대상 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 40% 또는 그 미만에서 전신 부작용이 추가접종 투여 후 7일까지 유도되는, 방법.
  11. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)의 다중 투여로 투여되며 그리고 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단에서 일차접종 투여 후 7일차와 비교하였을 때, 추가접종 투여 후 7일 까지
    - 적어도 40% 미만, 또는 적어도 45% 미만 피로가 유도되거나, 및/또는
    - 더 이상의 열은 없고, 및/또는
    - 적어도 10% 미만, 또는 적어도 20% 미만, 또는 적어도 25% 미만의 근육통이 유도되거나 또는 더 이상의 근육통은 없고, 및/또는
    - 적어도 10% 미만, 또는 적어도 20% 미만의 불안감이 유도되거나 또는 더 이상의 근육통은 없는, 방법.
  12. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)의 다중 투여로 투여되며, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 인간 대상 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 4% 미만에서 또는 0%에서 열이 추가접종 투여 후 7일까지 유도되는, 방법.
  13. 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)의 다중 투여로 투여되며 그리고 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 인간 대상 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 19% 미만에서 피로가 추가접종 투여 후 7일까지 유도되는, 방법.
  14. 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)의 다중 투여로 투여되며 그리고 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 인간 대상 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 12% 미만 또는 8% 미만에서 근육통이 추가접종 투여 후 7일까지 유도되는, 방법.
  15. 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)의 다중 투여로 투여되며 그리고 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 인간 대상 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 13% 미만 또는 10% 미만에서 불안감이 추가접종 투여 후 7일까지 유도되는, 방법.
  16. 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)의 다중 투여로 투여되며, 그리고 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 인간 대상 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 20% 또는 그 미만에서 두통, 8% 또는 그 미만에서 관절통, 4% 미만에서 열, 19% 미만에서 피로, 그리고 12% 미만에서 근육통, 그리고 13% 미만에서 불안감이 추가접종 투여 후 7일까지 유도되는, 방법.
  17. 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물은 1μg 내지 40μg 투여량의 항원을 포함하고, 이때 상기 항원은 비활성화된 온전체 바이러스인, 방법.
  18. 청구항 17에 있어서,
    상기 지카 바이러스는 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 돌연변이를 갖는, 방법.
  19. 청구항 1 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원은 정제되며, 그리고 이때 크기 배제 크로마토그래피에서 정제된 지카 바이러스의 주요 피크는 크기 배제 크로마토그래피에서 곡선 아래 총면적의 85% 이상인, 방법.
  20. 청구항 1 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물은 임의선택적으로 발병을 겪게 되는 지카 풍토성 지역으로부터의 인간 대상에게 투여되는, 방법.
  21. 청구항 1 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물은 풍토 지역으로 여행한 지카 비-풍토 지역의 인간 대상에게 투여되는, 방법.
  22. 청구항 1 내지 청구항 21 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물은 18 내지 29세 연령대의, 특히 가임기 여성인 인간 대상에게 투여되는, 방법.
  23. 청구항 1 내지 청구항 21 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물은 30 내지 49세 연령대의, 특히 가임기 여성인 인간 대상에게 투여되는, 방법.
  24. 청구항 1 내지 청구항 23 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물은 단일 투여량 투여, 또는 적어도 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)을 내포하는 다중 투여로 투여되며, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 약 5μg 투여량의 정제된 비활성화된 온전체 바이러스를 포함하는, 방법.
  25. 청구항 24에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물은 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단에서 50% 미만, 45% 미만, 또는 40% 미만의 전신 부작용이 유도되고, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 추가접종 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 40% 미만, 또는 35% 미만, 또는 30% 미만, 또는 25% 미만, 또는 20% 미만, 또는 15% 미만에서 전신 부작용이 유도되는, 방법.
  26. 청구항 24 또는 청구항 25에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 3% 미만, 또는 0%에서 열이 유도되고, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 4% 미만, 또는 3% 미만, 또는 0%에서 열이 유도되는, 방법.
  27. 청구항 24 내지 청구항 26 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 29% 미만에서 두통이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 20% 미만, 또는 15% 미만, 또는 10% 미만, 또는 5% 미만에서 두통이 유도되는, 방법.
  28. 청구항 24 내지 청구항 27 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 30% 미만, 또는 25% 미만, 또는 20% 미만에서 피로가 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 20% 미만, 또는 15% 미만, 또는 10% 미만에서 피로가 유도되는, 방법.
  29. 청구항 24 내지 청구항 28 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 4% 미만에서 관절통이 유도되고, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 5% 미만, 또는 2% 미만, 또는 0%에서 관절통이 유도되는, 방법.
  30. 청구항 24 내지 청구항 29 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 17% 미만에서 근육통이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 12% 미만, 또는 10% 미만, 또는 5% 미만에서 근육통이 유도되는, 방법.
  31. 청구항 24 내지 청구항 30 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 10% 미만에서 불안감이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 14% 미만, 또는 10% 미만, 또는 5% 미만, 또는 0% 미만에서 불안감이 유도되는, 방법.
  32. 청구항 24 내지 청구항 31 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)의 다중 투여로 투여되며, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단에서 일차접종 후 7일차와 비교하였을 때,
    - 적어도 70% 미만, 또는 적어도 60% 미만, 또는 적어도 50% 미만, 또는 적어도 40% 미만, 또는 적어도 35% 미만, 또는 적어도 30% 미만의 전신 부작용, 및/또는
    - 열의 증가는 없고, 및/또는
    - 적어도 80% 미만, 또는 적어도 70% 미만, 또는 적어도 60% 미만, 또는 적어도 50% 미만, 또는 적어도 45% 미만의 두통, 및/또는
    - 적어도 60% 미만, 또는 적어도 55% 미만, 또는 적어도 50% 미만, 또는 적어도 45% 미만, 또는 적어도 40% 미만의 피로, 및/또는
    - 관절통의 증가는 없거나, 또는 적어도 80% 미만, 또는 적어도 60% 미만, 또는 적어도 40% 미만, 또는 적어도 20% 미만, 또는 적어도 10% 미만의 관절통, 및/또는
    - 근육통의 증가는 없거나, 또는 적어도 70% 미만, 또는 적어도 60% 미만, 또는 적어도 40% 미만, 또는 적어도 20% 미만, 또는 적어도 10% 미만의 근육통, 및/또는
    - 불안감의 증가는 없거나, 또는 적어도 80% 미만, 또는 적어도 60% 미만, 또는 적어도 40% 미만, 또는 적어도 20% 미만, 또는 적어도 10% 미만의 불안감이 유도되는, 방법.
  33. 청구항 1 내지 청구항 23 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물은 단일 투여량 투여, 또는 적어도 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)을 내포하는 다중 투여로 투여되며, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 약 10μg 투여량의 정제된 비활성화된 온전체 바이러스를 포함하는, 방법.
  34. 청구항 33에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 50% 미만에서 전신 부작용이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 40% 미만, 또는 35% 미만, 또는 30% 미만에서 전신 부작용이 유도되는, 방법.
  35. 청구항 33 또는 청구항 34에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 4% 미만에서 열이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 4% 미만, 또는 3% 미만, 또는 0%에서 열이 유도되는, 방법.
  36. 청구항 33 내지 청구항 35 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 29% 미만, 또는 25% 미만, 또는 20% 미만, 또는 15% 미만에서 두통이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 20% 또는 그 미만에서 두통이 유도되는, 방법.
  37. 청구항 33 내지 청구항 36 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 33% 또는 그 미만에서 피로가 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 20% 또는 그 미만에서 피로가 유도되는, 방법.
  38. 청구항 33 내지 청구항 37 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 10% 또는 그 미만에서 관절통이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 5% 미만에서 관절통이 유도되는, 방법.
  39. 청구항 33 내지 청구항 38 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 17% 또는 그 미만에서 근육통이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 12% 미만, 또는 10% 미만에서 근육통이 유도되는, 방법.
  40. 청구항 33 내지 청구항 39 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 15% 또는 그 미만에서 불안감이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 13% 미만, 또는 10% 또는 그 미만에서 불안감이 유도되는, 방법.
  41. 청구항 33 내지 청구항 40 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)의 다중 투여로 투여되며, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단에서 일차접종 후 7일차와 비교하였을 때,
    - 적어도 40% 미만, 또는 적어도 35% 미만, 또는 적어도 30% 미만, 또는 적어도 25% 미만의 전신 부작용이 유도되거나, 및/또는
    - 열의 증가는 없거나, 또는 적어도 80% 미만, 또는 적어도 60% 미만, 또는 적어도 40% 미만, 또는 적어도 20% 미만, 또는 적어도 10% 미만의 열이 유도되거나, 및/또는
    - 적어도 45% 미만, 또는 적어도 40% 미만의 피로가 유도되거나, 및/또는
    - 관절통의 증가는 없거나, 또는 적어도 65% 미만, 또는 적어도 60% 미만, 또는 적어도 40% 미만, 또는 적어도 20% 미만, 또는 적어도 10% 미만의 관절통이 유도되거나, 및/또는
    - 근육통의 증가는 없거나, 또는 적어도 45% 미만, 또는 적어도 40% 미만, 또는 적어도 20% 미만, 또는 적어도 10% 미만의 근육통이 유도되거나, 및/또는
    - 불안감의 증가는 없거나, 또는 적어도 20% 미만, 또는 적어도 10% 미만의 불안감이 유도되는, 방법.
  42. 청구항 1 내지 청구항 23 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물은 단일 투여량 투여, 또는 적어도 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)을 내포하는 다중 투여로 투여되며, 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 약 2μg 투여량의 정제된 비활성화된 온전체 바이러스를 포함하는, 방법.
  43. 청구항 42에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 50% 미만, 또는 45% 미만, 또는 40% 미만, 또는 35% 미만에서 전신 부작용이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 40% 미만, 또는 35% 미만에서 전신 부작용이 유도되는, 방법.
  44. 청구항 42 또는 청구항 43에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 3% 미만, 또는 0%에서 열이 유도되고, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 4% 미만, 또는 3% 미만, 또는 0%에서 열이 유도되는, 방법.
  45. 청구항 42 내지 청구항 44 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 29% 미만, 또는 25% 미만, 또는 20% 미만에서 두통이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 20% 미만, 또는 15% 미만에서 두통이 유도되는, 방법.
  46. 청구항 42 내지 청구항 45 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 30% 미만, 또는 25% 미만에서 피로가 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 20% 미만, 또는 15% 미만에서 피로가 유도되는, 방법.
  47. 청구항 42 내지 청구항 46 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 4% 또는 그 미만에서 관절통이 유도되며, 및/또는 이때 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 8% 미만에서 관절통이 유도되는, 방법.
  48. 청구항 42 내지 청구항 47 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 17% 또는 그 미만에서 근육통이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 12% 미만, 또는 10% 미만에서 근육통이 유도되는, 방법.
  49. 청구항 42 내지 청구항 48 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 단일 투여량 또는 일차접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 10% 미만에서 불안감이 유도되며, 및/또는 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단의 13% 미만, 또는 10% 미만, 또는 5% 미만, 또는 0% 미만에서 불안감이 유도되는, 방법.
  50. 청구항 42 내지 청구항 49 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물은 제1 투여 (일차접종) 및 제2 투여 (추가접종)의 다중 투여로 투여되며, 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 투여로 인하여 추가접종 투여 후 7일까지 적어도 20명의 플라비바이러스 나이브 인간 대상 또는 적어도 20명의 지카 바이러스 혈청음성 인간 대상의 인간 대상 집단에서 일차접종 후 7일차와 비교하였을 때,
    - 열의 증가는 없고, 및/또는
    - 적어도 50% 미만, 또는 적어도 45% 미만, 또는 적어도 40% 미만의 피로가 유도되며, 및/또는
    - 근육통의 증가는 없거나, 또는 적어도 20% 미만, 또는 적어도 10% 미만의 근육통이 유도되며, 및/또는
    - 불안감의 증가는 없거나, 또는 적어도 80% 미만, 또는 적어도 60% 미만, 또는 적어도 40% 미만, 또는 적어도 20% 미만, 또는 적어도 10% 미만의 불안감이 유도되는, 방법.
  51. 청구항 5 내지 청구항 50 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포들은 비-인간 세포인, 방법.
  52. 청구항 51에 있어서,
    상기 세포들은 Vero 세포인, 방법.
  53. 청구항 5 내지 청구항 52 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 지카 바이러스 조직표본은 0.005% (w/v) 내지 0.02% (w/v)의 농도에서 포름알데히드로 처리되는, 방법.
  54. 청구항 5 내지 청구항 53 중 어느 한 항에 있어서,
    지카 바이러스 조직표본은 8 내지 12 일 동안 처리되는, 방법.
  55. 청구항 54에 있어서,
    상기 지카 바이러스 조직표본은 10 일 동안 처리되는, 방법.
  56. 청구항 5 내지 청구항 55 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 지카 바이러스 조직표본은 15℃ 내지 30℃의 온도에서 처리되는, 방법.
  57. 청구항 56에 있어서,
    상기 지카 바이러스 조직표본은 22℃의 온도에서 처리되는, 방법.
  58. 청구항 5 내지 청구항 57 중 어느 한 항에 있어서,
    비활성화의 완결도를 결정하는 단계 (c)를 더욱 포함하는, 방법.
  59. 청구항 58에 있어서,
    단계 (c)는 다음을 포함하는 방법:
    (ⅰ) 배양된 곤충 세포를 단계 (b)에 따라서 처리된 지카 바이러스 조직표본으로 접종하고, 그리고 이들 곤충 세포를 제 1 기간 동안 배양하고, 따라서 곤충 세포 상청액을 생산하고;
    (ⅱ) 배양된 포유류 세포를 (ⅰ)에서 생산된 곤충 세포 상청액으로 접종하고, 그리고 이들 포유류 세포를 두 번째 기간 동안 배양하고; 그리고
    (ⅲ) 지카 바이러스 조직표본이 포유류 세포에 대한 세포변성 효과를 발생시키는 잔여 복제 바이러스를 내포하는 지를 결정함.
  60. 청구항 59에 있어서,
    상기 곤충 세포는 CCL-125 세포, Aag-2 세포, RML-12 세포, C6/36 세포, C7-10 세포, AP-61 세포, A.t. GRIP-1 세포, A.t. GRIP-2 세포, A.t. GRIP-3 세포, UM-AVE1 세포, Mos.55 세포, Sua1B 세포, 4a-3B 세포, Mos.42 세포, MSQ43 세포, LSB-AA695BB 세포, NIID-CTR 세포 및 TRA-171 세포, 예컨대 C6/36 세포에서 선택되는, 방법.
  61. 청구항 59 또는 청구항 60에 있어서,
    상기 제 1 기간은 3 내지 7 일인, 방법.
  62. 청구항 59 내지 청구항 61 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 포유류 세포는 VERO 세포, LLC-MK2 세포, MDBK 세포, MDCK 세포, ATCC CCL34 MDCK (NBL2) 세포, MDCK 33016 (WO97/37001에서 설명된 바와 같은 수탁 번호 DSM ACC 2219) 세포, BHK21-F 세포, HKCC 세포, 그리고 중국 햄스터 난소 세포 (CHO 세포), 예컨대 VERO 세포에서 선택되는, 방법.
  63. 청구항 59 내지 청구항 62 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 기간은 3 내지 14 일인, 방법.
  64. 청구항 5 내지 청구항 63 중 어느 한 항에 있어서,
    포름알데히드-처리된 지카 바이러스 조직표본을 메타중아황산나트륨으로 중화하는 단계 (d)를 더 포함하는, 방법.
  65. 청구항 64에 있어서,
    상기 포름알데히드-처리된 지카 바이러스 조직표본은 포름알데히드 처리 후 적어도 5일, 적어도 7일, 적어도 9일, 적어도 11일, 또는 적어도 14 일 시점에 중화되는, 방법.
  66. 청구항 1 내지 청구항 65 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물은 50μg/ml 미만의 잔류 포름알데히드 함량을 갖는, 방법.
  67. 청구항 1 내지 청구항 66 중 어느 한 항에 따른 방법에 사용을 위한 백신 또는 면역원성 조성물.
  68. 청구항 1 내지 청구항 67 중 어느 한 항에 따른 방법을 위한 약물 제조에 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 용도.
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