BR112020010466A2 - composições imunogênicas e vacinas contra zika, métodos de uso das mesmas - Google Patents

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Hansi Dean
Htay Htay Han
Raman Rao
Jackie Marks
Gary Dubin
Laurence De Moerlooze
Hetal Patel
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Abstract

A presente invenção refere-se a vacinas contra o vírus Zika e composições imunogênicas que possuem um ou mais antígenos de um vírus de Zika (por exemplo, um Zika vírus isolado clonal, uma vírus Zika adaptado a uma célula não humana, etc.) e métodos de tratamento e usos destes.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COM- POSIÇÕES IMUNOGÊNICAS E VACINAS CONTRA ZIKA, MÉTO- DOS DE USO DAS MESMAS". DECLARAÇÃO SOBRE PESQUISA PATROCINADA PELO GO-
VERNO FEDERAL
[001] Esta invenção foi feita com o apoio do governo sob Contra- to Nº HHSO100201600015C com o Departamento de Saúde e Servi- ços Humanos, Gabinete do Secretário Adjunto de Preparação e Res- posta, Autoridade Responsável pelo Desenvolvimento e Pesquisa de Biomédica Avançada. Esta invenção foi criada no desempenho de um Acordo de Pesquisa e Desenvolvimento Cooperativo com os Centros de Controle e Prevenção de Doenças, uma agência do Departamento de Saúde e Serviços Humanos. O governo dos Estados Unidos tem determinados direitos na invenção.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002] A presente invenção refere-se a vacinas contra o Zika vírus e composições imunogênicas que possuem um ou mais antígenos de um vírus de Zika (por exemplo, um Zika vírus isolado clonal, uma Zika vírus adaptado a uma célula não humana, etc.) e métodos de trata- mento e utilizações dos mesmos.
ANTECEDENTES
[003] O Zika vírus, um flavivírus classificado com outros vírus transmitidos por mosquitos (por exemplo, vírus da febre amarela, den- gue, Nilo Ocidental e encefalite japonesa) na família Flaviviridae, se espalhou rapidamente em uma epidemia de escala hemisférica desde que o vírus foi introduzido no Brasil em 2013. O vírus atingiu as Améri- cas do Norte e Central, incluindo territórios nos Estados Unidos, con- sequentemente, ameaçando agora os EUA continental. De fato, a ce- pa do Zika vírus PRVABCS59 foi isolada do soro de uma pessoa que viajou para Porto Rico em 2015. O genoma desta cepa foi sequencia-
do, pelo menos, três vezes (consultar Lanciotti et al. Emerg. Infect. Dis. Maio de 2016; 22(5):933-5 e Número de Acesso do GenBank KU501215.1; Número de Acesso do GenBank KX087101.3; e Yun et al. Genome Announc. Agosto de 2016 18;4(4) e GenBank Número ANK57897.1).
[004] Inicialmente isolado em 1947 em Uganda, o vírus foi primei- ro ligado a doenças humanas em 1952 e foi reconhecido esporadica- mente como causa de doença febril leve e autolimitada na África e no Sudeste Asiático (et a/. (2016) Res. Antiviral 130:69-80; Faria et al. (2016) Science. 352(6283):345-349). No entanto, em 2007, um surto apareceu na ilha do Pacífico Norte de Yap, e depois disseminada de ilha para ilha através do Pacífico, levando a um extenso surto em 2013-2014 na Polinésia Francesa, espalhando-se depois para Nova Caledônia, Ilhas Cook, e, finalmente, na Ilha de Páscoa. Um vírus de linhagem asiática foi posteriormente transferido para o Hemisfério Oci- dental por rotas que permanecem indeterminados ((Faria et al. (2016) Science. 352(6283):345-349). O vírus pode ser transmitido zoonotica- mente por Aedes aegypti, A. albopictus, e, possivelmente, por por A. hensilli e A. polynieseinsis (Weaver et al. (2016) Res. Antiviral 130:69- 80). Além disso, pensa-se que outros vetores de transmissão do vírus podem existir, e que o vírus pode ser transmitido por transfusão de sangue, via transplacentária, e/ou através da transmissão sexual.
[005] No final de 2015, um aumento significativo em anomalias fetais (por exemplo, microcefalia) e síndrome de Guillain-Barre (GBS) em áreas de infecção generalizada Zika vírus levantou alarme que o Zika vírus pode ser muito mais virulento do que se pensava inicialmen- te, o que levou a Organização Mundial de Saúde (OMS) a declarar uma emergência de Saúde Pública de Importância Internacional (ES- PII) (Heymann et a/. (2016) Lancet 387 (10020): 719-21). Embora a OMS, desde então, declarou o fim da PHEIC, o Zika continua a repre-
sentar, em particular, uma ameaça significativa para as mulheres grá- vidas e seus bebês em gestação.
[006] Enquanto o Zika vírus representa uma ameaça substancial à saúde pública, o tratamento tual ou vacina aprovada pela FDA vaci- na existente, e as medidas só preventivas para controlar o Zika vírus envolvem a gestão das populações de mosquitos.
[007] Em recentes esforços para caracterizar um Zika vírus re- combinante para o desenvolvimento de uma vacina potencial, foi iden- tificado um Zika vírus adaptado a uma célula não humana que abriga uma mutação na proteína do Envelope viral na posição 330 (Weger- Lucarelli et al. (2017) Journal of Virology 91 (1): 1-10). Os autores des- te estudo constatram que os clones de cDNA infeccioso de compri- mento longo da cepa PRVABC59 do Zika vírus eram geneticamente instável quando amplificados durante a clonagem, e optou-se por divi- dir o genoma viral para tratar a instabilidade observada, desenvolven- do e aplicando um sistema de dois plasmídeos. No entanto, um siste- ma de dois plasmídeos para o desenvolvimento de uma vacina contra o Zika é menos desejável.
SUMÁRIO
[008] Assim, existe uma necessidade de desenvolver vacinas e composições imunogênicas para o tratamento e/ou impedindo do Zika vírus. Por conseguinte, certos aspectos da presente invenção relacio- nam uma vacina ou uma composição imunogênica que compreende uma dose de 1 ug a 40 ug de (um) antígeno de um Zika vírus, em que o antígeno é um vírus inteiro inativado.
[009] Por conseguinte, certos aspectos da presente invenção re- lacionam uma vacina ou composição imunogênica compreendendo uma dose de 1 ug a 40 ug de (um) antígeno de um Zika vírus, em que o Zika vírus compreende pelo menos uma mutação de adaptação celu- lar não humana.
[0010] Por conseguinte, certos aspectos da presente invenção re- lacionam uma vacina ou composição imunogênica compreendendo uma dose de 1 ug a 40 ug de (um) antígeno de um Zika vírus, sendo que o Zika vírus tem uma mutação na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1.
[0011] Para satisfazer as necessidades acima e outros, a presente invenção é dirigida, pelo menos em parte, a um Zika vírus adaptada à célula não humana geneticamente estável abrigando uma adaptação de proteína 1 não estrutura (com uma proteína Envelope tipo wild), permitindo a utilização de uma sistema de genoma de virus/viral único para produção de vacinas. A presente invenção também é dirigida, pe- lo menos em parte, para um isolado clonal de Zika vírus que seja ge- neticamente homogêneo e/ou foi purificado a partir de um ou mais agentes adventícios. Consequentemente, a presente invenção fornece vacinas e composições imunogênicas úteis para o tratamento e/ou prevenção da infecção pelo Zika vírus (em humanos) que incluem um ou mais antígenos de Zika vírus (por exemplo, um ou mais antígenos a partir de um Zika vírus inativado inteiro) a partir de um Zika vírus que abriga pelo menos uma mutação de adaptação celular não humana (por exemplo, uma mutação na proteína 1 não estrutural do Zika vírus) e/ou um isolado clonal de Zika vírus.
[0012] A presente invenção baseia-se, pelo menos em parte, na descoberta surpreendente de que ambas as doses altas e baixas das vacinas que compreendem um ou mais antígenos a partir das popula- ções de vírus clonal separadamente derivados do Zika vírus adaptado à célula não humana foram capazes de induzir respostas imunitárias robustas e fornecem uma protecção significativa contra a infecção do Zika vírus (consultar Exemplos 2 e o Exemplo 6 abaixo). O isolamento clonal das cepas do Zika vírus também permitiu: 1) a purificação bem- sucedida do vírus dos agentes contaminantes (por exemplo, agentes adventícios que podem ser copurificados com a cepa parental), e 2) a produção de uma população viral geneticamente homogênea.
Além disso, a presente invenção baseia-se, pelo menos em parte, na des- coberta de que os Zika vírus clonais isolados que abrigam uma muta- ção de adaptação na proteína NS1 cresceu bem e previsivelmente em células Vero em alta concentração, e surpreendentemente, foram ge- neticamente estável/geneticamente homogêneo, sem quaisquer muta- ções detectáveis na proteína do envelope viral (consultar Exemplos 1 e 2 abaixo). Enquanto uma mutação semelhante na proteína 1 não es- trutural do Zika vírus pode ter sido observada na análise de sequenci- ação genómica de 1 em 3 sequências publicadas da cepa PRVABC59 do Zika vírus (Yun et al.
Genome Announc.
Agosto de 2016 18;4(4)), esta referência é falha ao ensinar ou sugerir que uma mutação no NS1 pode melhorar a estabilidade do vírus; é falha ou sugere que um víus que abriga a mutação pode ser utilizada no desenvolvimento de uma vacina eficaz contra o Zika vírus; e é falha ou sugere que tal vacina pode ser eficaz na indução de uma resposta imune robusta e proporci- onar uma proteção significativa contra a infecção do Zika vírus, quan- do utilizado tanto em doses baixas quanto elevadas.
Assim, sem pre- tender estar limitado pela teoria, os inventores da presente invenção determinaram que a mutação de adaptação em proteína NS1 apare- ceu para aprimorar a estabilidade genética no interior do Zika vírus, resultando em eficiência de replicação aumentada/aprimorada.
Além disso, a cepa do Zika que abriga a mutação de adaptação na proteína NS1 foi capaz de ser passadas várias vezes sem o desenvolvimento adicional de mutações.
Tal cepa estável do Zika vírus é vantajosa co- mo uma semente-mãe viral ("Master Seed Virus" MVS), ou sementes subsequentes a partir dos MVS, para a produção e fabricação de vaci- nas, como o risco da semente-mãe viral desenvolver mutações indese- jáveis é reduzido.
Por outro lado, sem pretender a limitar-se pela teo-
ria, a mutação de adaptação em proteína NS1 da cepa Zika, na pre- sente invenção, pode também reduzir ou, de outra forma, inibir a ocor- rência de mutações indesejáveis, tais como uma mutação no interior da proteína do envelope E (env) da cepa do Zika vírus.
[0013] Por conseguinte, certos aspectos da presente invenção se referem a uma vacina ou composição imunogênica contendo um ou mais antígenos a partir de um Zika vírus, em que o Zika vírus contém pelo menos uma mutação de adaptação celular não humana. Em al- gumas modalidades, pelo menos uma mutação de adaptação celular não humana está na proteína 1 (NS1) não estrutual do Zika vírus. Em algumas modalidades, pelo menos uma mutação de adaptação ocorre na posição 98 da SEQ ID NO: 1, ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, pelo menos uma mutação de adaptação é uma mutação Trp98Gly.
[0014] Por conseguinte, certos aspectos da presente invenção se referem a uma vacina ou composição imunogênica compreendendo uma dose de 1 ug a 40 ug de (um) antígeno a partir do Zika vírus, em que o Zika vírus compreende pelo menos uma mutação de adaptação celular não humana.
[0015] Por conseguinte, certos aspectos da presente invenção re- lacionam uma vacina ou composição imunogênica compreendendo uma dose de 1 ug a 40 ug de (um) antígeno de um Zika vírus, sendo que o Zika vírus tem uma mutação na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1.
[0016] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer modalidades anteriores, pelo menos, a mutação de adapta- ção aprimora a estabilidade genética, em comparação com um Zika vírus que falta, pelo menos, uma mutação de adaptação. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer modalidades anteriores, pelo menos uma mutação de adaptação aprimora a repli-
cação viral em comparação com um Zika vírus que falta menos uma mutação de adaptação. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer das modalidades anteriores, o Zika vírus não compreende uma mutação na proteína do envelope E (Env).
[0017] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer formas das modalidades anteriores, a célula não humana é uma célula de mamífero. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a célula não humana é uma célula de macaco. Em algumas modalidades, a célula de macaco é de uma linhagem celular Vero. Em algumas moda- lides, a linhagem celular Vero é uma linhagem celular Vero OMS 10-
87.
[0018] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer das modalidades anteriores, o vírus é um Zika vírus de li- nhagem africana ou um vírus de linhagem asiática. Em algumas moda- lidades, o Zika vírus é um vírus de linhagem asiática. Em algumas mo- dalidades, o Zika vírus é da cepa PRVABCS59.
[0019] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer modalidades anteriores, a vacina ou composição imunogê- nica é uma vacina de antígeno purificada ou composição imunogênica, uma vacina de subunidade ou composição imunológica, uma vacina viral completamente inativada ou composição imunogênica, ou uma vacina viral atenuada ou composição imunogênica. Em algumas mo- dalidades, a vacina ou composição imunogênica é toda uma vacina viral completamente inativada ou composição imunogênica. Em algu- mas modalidades, a vacina ou composição imunogênica compreende um Zika vírus purificado completamente inativado. Em algumas moda- lidades, a vacina ou composição imunogênica compreende um Zika vírus purificado completamente inacivado compreendendo uma muta- ção na posição 98 de SEQ ID NO: 1, ou em uma posição correspon-
dente à posição 98 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a va- cina ou composição imunogênica compreende um Zika vírus purificado completamente inativado que compreende uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1, ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a vacina ou composição imunogênica compreende um Zika vírus purificado com- pletamente inativado que compreende uma mutação Trp98Gly na po- sição 98 da SEQ ID NO: 1, ou em uma posição correspondente à po- sição 98 da ID SEQ NO:1, em que o vírus é derivado a partir da cepa Zika PRVABC59. Em algumas modalidades, a vacina ou composição imunogênica compreende um Zika vírus purificado completamente ina- tivado que compreende uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, em que o Zika vírus é derivado da cepa PRVABC59 que com- preende a sequenciamento genômico, de acordo com a SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a vacina ou composição imunogênica com- preende um Zika purificado completamento inativado que difere da ce- pa PRVABC59 em uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1.
[0020] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o vírus foi inativado quimi- camente. Em algumas modalidades, o vírus foi inativado quimicamente com um ou mais de um detergente, formalina, beta-propiolactona (BPL), etilamina binária (BEI), acetil etilenoimina, azul de metileno, e psoraleno. Em algumas modalidades, o vírus foi quimicamente inativa- do com formalina.
[0021] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer modalidades anteriores, a vacina ou composição imunogê- nica contém adicionalmente um adjuvante. Em algumas modalidades, o adjuvante é selecionado a partir de sais de alumínio, agonistas de receptores toll-like (TLR), lipídios monofosforil A (MLA), lipídios sintéti- cos A, miméticos ou análogos de lipídios A, derivados de MLA, citoci- nas, saponinas, dipeptídeo muramil (MDP) derivados, oligos CpG, li- popolissacarídeo (LPS) de bactérias gram-negativas, polifosfazenos, emulsões, virossomas, cocleatos, micropartículas de poli(lactido-co- glicolidos) (PLG), partículas de poloxâmero, micropartículas, liposso- mas, adjuvante completo de Freund (CFA), e/ou adjuvante incompleto de Freund (IFA). Em algumas modalidades, o adjuvante é um sal de alumínio. Em algumas modalidades, o adjuvante é selecionado do grupo que consiste em alúmen, fosfato de alumínio, hidróxido de alu- mínio, sulfato de alumínio e potássio e Alhydrogel 85. Em algumas modalidades, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de um ou mais antígenos são adsor- vidos ao adjuvante.
[0022] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a vacina ou a composição imunogênica é uma vacina ou composição imunogênica de dose baixa ou média (por exemplo, contendo de cerca de 1 ug a cerca de 5 ug de antígeno ou 2 ug de antígeno ou 5 ug de antígeno). Em algumas mo- dalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modali- dades anteriores, a vacina ou composição imunogênica é uma vacina de alta dose ou composição imunogênica (por exemplo, contendo cer- ca de 10 ug de antígeno). Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a vacina ou composição imunogênica contém de cerca de 1 ug a cerca de 25 pg de um ou mais antígenos, em particular 2 ug, 5 ug ou 10 ug, ou em particular 10 ug de um ou mais antígenos. Em certas modalidades, o antígeno é um vírus purificado completamente inativado, como um Zika vírus com uma mutação que é um triptofano para substituição de glicina na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspon- dente à posição 98 da SEQ ID NO: 1 conforme descrito neste docu- mento. Em algumas modalidades, a vacina ou composição imunogêni- ca compreende um Zika vírus completamente inativado que compre- ende uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, em que o Zika vírus é derivado da cepa PRVABC59. Em algumas modalidades, a vacina ou composição imunogênica compreende um Zika vírus puri- ficado completamente inativado que compreende uma mutação Trp98GlIy na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição corres- pondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, em que o Zika vírus é deri- vado da cepa PRVABC59 que compreende o sequenciamento genô- mico, de acordo com a SEQ ID NO: 2. Em certas modalidades, o Zika vírus é um isolado clonal do Zika vírus purificado em placas. Em algu- mas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a vacina ou a composição imunogênica con- tém de cerca de 0,1 ug a cerca de 100 ug de antígeno do Zika vírus ou Env. Em algumas modalidades, a vacina ou a composição imunogêni- ca é sem adjuvante. Em algumas modalidades que podem ser combi- nadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o Zika vírus é um isolado clonal. Em algumas modalidades, o isolado clonal está substancialmente livre de um ou mais agentes adventícios (por exem- plo, livre de um ou mais agentes adventícios que podem ser copurifi- cados com a cepa parental).
[0023] Outros aspectos da presente invenção referem-se a uma vacina compreendendo um Zika vírus que possui uma mutação na po- sição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posi- ção 98 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a vacina compre- ende um Zika vírus purificado completamente inativado que compre- ende uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1, ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, em que o Zika vírus é derivado da cepa PRVABC59. Em algumas modalidades, a vacina ou composição imunogênica compreende um Zika vírus puri- ficado completamente inativado que compreende uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição corres- pondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, em que o Zika vírus é deri- vado da cepa PRVABC59 que compreende o sequenciamento genô- mico, de acordo com a SEQ ID NO: 2. Em certas modalidades, o Zika vírus é um isolado clonal do Zika vírus purificado em placas.
[0024] Outros aspectos da presente invenção referem-se a uma vacina ou composição imunogênica contendo: a) um adjuvante de sal de alumínio; e b) um Zika vírus purificado completamente inativado, em que o Zika vírus contém uma mutação de adaptação celular, e em que a mutação de adaptação celular não humana é uma mutação Trp98GIy na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição corres- pondendo à posição 98 da SEQ ID NO: 1.
[0025] Outros aspectos da presente invenção referem-se a um método de tratamento ou prevenção, em particular prevenção da in- fecção pelo Zika vírus em um sujeito humano que necessite do mes- mo, incluindo a administração ao sujeito humano de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das vacinas ou composições imunogênicas descritas neste documento.
[0026] Outros aspectos da presente invenção referem-se a um método para induzir uma resposta imune em um sujeito humano que necessite do mesmo, incluindo a administração ao sujeito humano de uma quantidade imunogênica de qualquer uma das vacinas ou com- posições imunogênicas descritas neste documento.
[0027] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um méto- do de tratamento ou prevenção, em particular a prevenção da infecção pelo Zika vírus em um sujeito humano que necessite do mesmo, com-
preendendo a administração ao sujeito humano da vacina ou composi- ção imunogênica.
[0028] Em um aspecto, a presente invenção se refere a um méto- do para induzir uma resposta imune contra um antígeno do Zika vírus em um sujeito humano que necessite do mesmo, compreendendo a administração ao sujeito humano da vacina ou composição imunogê- nica.
[0029] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um méto- do de tratamento ou prevenção contra a doença do Zika vírus em um sujeito humano que necessite do mesmo, compreendendo a adminis- tração ao sujeito humano da vacina ou composição imunogênica. Nes- se caso, a doença está relacionada à febre leve, exantema maculopa- pular, conjuntivite e artralgia. Além disso, o Zika vírus é um flavivírus neurotrópico que pode potencialmente causar doenças no interior do sistema nervoso central e na Síndrome de Guillain-Barré (GBS).
[0030] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um méto- do para prevenir a doença do Zika vírus em um feto ou recém-nascido que necessite do mesmo, compreendendo administrar ao sujeito hu- mano grávida ou a um sujeito humano que pretenda engravidar ou mu- lher com potencial para engravidar a vacina ou composição imunogê- nica. A doença do Zika, nesse caso, está relacionada a resultados sé- rios para o feto e o recém-nascido. O espectro de anomalias congêni- tas associadas à infecção pelo Zika vírus, conhecido como Síndrome do Zika Congênito (CZS), consiste em microcefalia grave com crânio parcialmente colapsado, córtices cerebrais com calcificações subcorti- cais, cicatrizes maculares e manchas na retina pigmentar focal, contra- turas congênitas e hipertonia precoce acentuada com sintomas de en- volvimento extrapiramidal.
[0031] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma vaci- na ou composição imunogênica para uso em um método de tratamen-
to ou prevenção, em particular prevenção da infecção pelo Zika vírus em um sujeito humano que necessite do mesmo, em um método para induzir uma resposta imune contra um antígeno do Zika vírus em um sujeito humano que necessite do mesmo, e em um método de preven- ção da doença pelo Zika vírus em um sujeito humano, feto ou recém- nascido que necessite do mesmo.
[0032] Em um aspecto, a presente invenção refere-se ao uso da vacina ou composição imunogênica na fabricação de um medicamento para um método de tratamento ou prevenção, em particular prevenção da infecção pelo Zika vírus em um ser humano que necessite do mesmo, um método para induzir uma resposta imune em um sujeito humano que necessite do mesmo e para um método de prevenção da doença do Zika vírus em um feto de sujeito humano ou recém-nascido que necessite do mesmo.
[0033] De acordo com o significado desta descrição, o tratamento inclui o tratamento de um único sujeito humano e o tratamento de uma população de seres humanos. Considera-se que uma população de seres humanos engloba o tratamento de mais de um indivíduo, por exemplo, 2 ou mais indivíduos.
[0034] Por conseguinte, certos aspectos da presente invenção re- ferem-se a um método de tratamento ou prevenção, em particular pre- venção da infecção pelo Zika vírus em uma população de seres hu- manos que necessite do mesmo, compreendendo administrar a seres humanos individuais da referida população de seres humanos uma vacina ou composição imunogênica compreendendo um antígeno de um Zika vírus, em que a vacina ou composição imunogênica é admi- nistrada como uma primeira (primária) e uma segunda (reforço) admi- nistração com uma distância de 1 a cerca de 16 semanas, e em que a administração da vacina ou composição imunogênica induz 14 e/ou 28 dias após a administração do reforço, uma média geométrica de títulos de anticorpos neutralizantes em uma população de pelo menos 20 se- res humanos não expostos ao flavivírus e/ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus de mais de 300, ou de mais de 500, ou mais de 1000, ou mais de 1500, ou mais de 2000, ou de mais de 3000, conforme determinado pelo teste de neutralização por redução de placas (PRNT).
[0035] Por conseguinte, certos aspectos da presente invenção re- ferem-se a um método de tratamento ou prevenção, em particular pre- venção da infecção pelo Zika vírus em uma população de seres hu- manos que necessite do mesmo, compreendendo administrar a seres humanos individuais da referida população de seres humanos uma vacina ou composição imunogênica compreendendo (um) antígeno a partir de um Zika vírus, em que a vacina ou a composição imunogêni- ca é administrada como uma primeira (primária) e uma segunda (re- forço) administração com cerca de 1 a 16 semanas de intervalo e em que a administração da vacina ou composição imunogênica induz 28 dias após a administração do reforço, uma média geométrica de títulos de anticorpos neutralizantes em uma população de pelo menos 20 se- res humanos não expostos ao flavivírus e/ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos do Zika vírus, que são pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 15 vezes, ou pelo menos 20 vezes, ou pelo menos 25 vezes superior à média geométrica dos títulos de anticorpos neutrali- zantes induzidos 28 dias após a administração primária determinada pelo teste de neutralização por redução de placa (PRNT). A adminis- tração de reforço fornece, portanto, uma média geométrica muita alta de títulos de anticorpos neutralizantes responsáveis por uma proteção a longo prazo
[0036] Por conseguinte, certos aspectos da presente invenção re- ferem-se a um método de tratamento ou prevenção, em particular pre- venção da infecção pelo Zika vírus em uma população de seres hu-
manos que necessite do mesmo, compreendendo administrar a seres humanos individuais da referida população de seres humanos uma vacina ou composição imunogênica compreendendo um antígeno de um Zika vírus, em que a vacina ou composição imunogênica é admi- nistrada como uma dose única uma administração primária, em que a administração da composição imunogênica ou vacina induz 14 e/ou 28 dias após a dose única ou administração primária, uma média geomé- trica de títulos de anticorpos neutralizantes em uma população de pelo menos 20 seres humanos não expostos ao flavivírus e/ou de pelo me- nos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus de mais de 10, ou de mais de 50, ou de mais de 100, ou de mais de 200, ou de mais de 250, conforme determinado pelo teste de neutralização por redução de placas (PRNT). A alta média geométrica de títulos de anticorpos neutralizantes indicam um início precoce de proteção, o que é benéfico em uma situação de surto ou um viajante que visita uma área endêmi- ca dentro de um curto período de tempo a partir da administração da vacina ou composição imunogênica.
[0037] Dentro do significado desta descrição, PRNT refere-se a títulos de anticorpos neutralizantes do zika vírus em seres humanos determinados por um teste de neutralização por redução de placa (PRNT), conforme descrito anteriormente (consultar Sun, W. et al. Pro- tection of Rhnesus monkeys against dengue virus challenge after tetra- valent live attenuated dengue virus vaccination. J Infect Dis. Dis. 193, 1658-1665 (2006). Muthumani K, Griffin BD, Agarwal S, et al. In vivo protection against ZIKV infection and pathogenesis through passive antibody transfer and active immunisation with a prMEnv DNA vaccine. Vaccines NPJ 2016; 1: 16021).
[0038] Dentro do significado desta descrição, os valores de GMT em seres humanos devem ser considerados, em particular, para se- rem medidos como a seguir. No ensaio de Zika PRNT, o soro humano foi diluído 2 vezes em série de 1:5 a 1:10,240 e misturado com um vo- lume igual de Zika vírus diluído (ZIKV) (PRVABCS59) para obter uma diluição final de 1:10 a 1:20,480. A neutralização foi deixada prosse- guir 20+2 horas a 2-8ºC, depois que a mistura de soro/vírus foi usada para inocular células Vero E6. A adsorção de vírus foi realizada a 37+ 2ºC com umidade e CO, por 60+10 minutos, em seguida foi adiciona- da uma sobrecamada de metilcelulose. As células infectadas foram incubadas a 37+2ºC com umidade e CO, por 72+2 horas. As placas foram visualizadas usando coloração com violeta de cristal e foram contadas usando um leitor CTL (Cellular Technology Limited). A de- terminação do título neutralizante de cinquenta por cento (PRNTs59) foi baseada na redução percentual de placas virais na presença de soro em comparação com a do controle de vírus sem soro e foi calculada por regressão linear. Os títulos representam o recíproco da maior dilui- ção, resultando em uma redução de 50% no número de placas. A acei- tação foi avaliada avaliando-se o controle de vírus (direcionado a -60 pfu/poço), controle celular, controle positivo (PRNT5so de 173-658) e controle negativo (PRNT5so <10) testados em paralelo com amostras clínicas. Amostras individuais e resultados de controle positivo foram aceitos se o coeficiente de correlação da curva de titulação gerado por regressão linear for 20,85. Critérios de aceitação adicionais foram ba- seados na qualidade da mancha violeta de cristal e nas placas gera- das para a placa ou corrida. Os resultados do PRNTs5o são relatados até a diluição inicial do ensaio (1:10). Os resultados do PRNT5o acima do ULOQ serão repetidos em uma pré-diluição para gerar um resulta- do dentro da faixa quantificável do ensaio. O resultado da amostra pré- diluída será multiplicado pelo fator de diluição para gerar um resultado final.
[0039] Dentro do significado desta descrição, a soropositividade é definida como um título > 10, conforme determinado pelo teste de neu-
tralização de redução de placa (PRNT); Os seres humanos soronega- tivos do Zika vírus são sujeitos com um título <10, conforme determi- nado pelo teste de neutralização da redução da placa (PRNT). A soro- conversão é definida como: seres humanos soronegativos para o Zika vírus (título <10) têm título = 10 após a vacinação, conforme determi- nado pelo teste de neutralização de redução de placa (PRNT); os re- sultados <10, conforme determinado pelo teste de neutralização de redução de placa (PRNT), recebem um título de 5; os títulos entre 10 (limite de detecção) e 26 (limite inferior de quantificação), conforme determinado pelo teste de neutralização de redução de placa (PRNT), recebem um valor de 13.
[0040] Os seres humanos ao expostos ao flavivírus para a presen- te invenção são definidos como seres humanos sem anticorpos séri- cos detectáveis contra um painel de flavivírus, conforme medido por um ensaio baseado em anticorpo reativo (Luminex). O teste de triagem de flavivírus é baseado em uma plataforma luminex para detectar si- multaneamente vários antígenos alvo na mesma amostra. Este ensaio baseado em esferas é sensível, específico e reproduzível. Para a pre- sente invenção, os antígenos alvo são Zika, dengue, febre amarela, JEV, USUV, SLEV e WNV. Devido à reatividade cruzada entre os fla- vivírus, o conjunto atual de antígenos ajudaria a detectar qualquer ex- posição anterior ao flavivírus. As referências para o conceito luminex são: Dias D, Van Doren J, Schlottmann S, Kelly S, Puchalski D, Ruiz W, Boerckel P, Kessler J, Antonello JM, Green T, Brown M, Smith J, Chirmule N, Barr E, Jansen KU, Esser MT. 2005. Otimização e valida- ção de um ensaio Luminex multiplexado para quantificar anticorpos para epítopos neutralizantes em vírus de papiloma humano 6, 11, 16 e
18. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 12: 959-—969 [Artigo livre do PMC] [Pu- bMed]. Ayouba A e cols. Desenvolvimento de um ensaio sorológico sensível e específico baseado na tecnologia Luminex para detecção de anticorpos contra o vírus Zaire Ebola. J Clin Microbiol. 28 de de- zembro de 2017; 55 (1): 165-176.doi: 10.1128/JCM.01979-16.
[0041] Dentro do significado desta descrição, endêmico é definida como áreas com risco de infecção, definidas pelos Centros de Contro- le e Prevenção de Doenças, como, por exemplo, em março de 2018, a saber: Ásia: Bangladesh, Birmânia (Mianmar), Camboja, Índia, Indoné- sia, Laos, Malásia, Maldivas, Paquistão, Filipinas, Cingapura, Tailân- dia, Timor-Leste (Timor Leste), Vietnã. As Ilhas do Pacífico: Fiji, Ilhas Marshall, Papua-Nova Guiné, Samoa, Ilhas Salomão, Tonga. O Cari- be: Anguilla; Antígua e Barbuda; Aruba; Barbados; Bonaire; Ilhas Vir- gens Britânicas; Cuba; Curaçau; Dominica; República Dominicana; Granada; Haiti; Jamaica; Monserrate; a Comunidade de Porto Rico, um território dos EUA; Saba; São Cristóvão e Nevis; Santa Lúcia; São Martinho; São Vicente e Granadinas; Santo Eustáquio; São Martinho; Trinidad e Tobago; Ilhas Turcas e Caicos; Ilhas Virgens Americanas. América do Norte: México América Central: Belize, Costa Rica, El Sal- vador, Guatemala, Honduras, Nicarágua, Panamá América do Sul: Ar- gentina, Bolívia, Brasil, Colômbia, Equador, Guiana Francesa, Guiana, Paraguai, Peru, Suriname, Venezuela África: Angola, Benim, Burkina- Faso, Burundi, Camarões, Cabo Verde, República Centro-Africana, Chade, Congo (Congo-Brazzaville), Costa do Marfim, República De- mocrática do Congo (Congo-Kinshasa), Guiné Equatorial, Gabão, Gâmbia, Gana, Guiné, Guiné-Bissau, Quênia, Libéria, Mali, Níger, Ni- géria, Ruanda, Senegal, Serra Leoa, Sudão do Sul, Sudão, Tanzânia, Togo, Uganda. Essas áreas podem mudar.
[0042] Por conseguinte, certos aspectos da presente invenção re- ferem-se a um método para induzir uma resposta imune em uma po- pulação de seres humanos que necessite do mesmo, compreendendo administrar a seres humanos individuais da referida população de se- res humanos uma vacina ou composição imunogênica compreenden-
do (um) antígeno a partir de um Zika vírus, em que a vacina ou com- posição imunogênica é administrada como uma primeira (primária) e uma segunda (reforço) administração com intervalo de 1 a cerca de 16 semanas, e em que a administração da vacina ou composição imuno- gênica induz 14 e/ou 28 dias após a administração de reforço da mé- dia geométrica dos títulos de anticorpos neutralizantes em uma popu- lação de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expos- tos ao flavivírus e/ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus de mais de 300 ou mais de 500 ou mais de 1000 ou mais de 1500, ou mais de 2000, ou mais de 3000, ou mais de 5000, ou mais de 10.000, determinado pelo ensaio de neutralização de partícula de vírus repórter (RVP).
[0043] Por conseguinte, certos aspectos da presente invenção re- ferem-se a um método de tratamento ou prevenção, em particular pre- venção da infecção pelo Zika vírus em uma população de seres hu- manos que necessite do mesmo, compreendendo administrar em se- res humanos individuais da referida população de seres humanos uma vacina ou composição imunogênica compreendendo (um) antígeno a partir de um Zika vírus, em que a vacina ou composição imunogênica é administrada como dose única ou administração primária, e em que a administração da vacina ou composição imunogênica induz 14 e/ou 28 dias após a dose única ou administração, uma média geométrica de títulos de anticorpos neutralizantes em uma população de pelo me- nos 20 seres humanos não expostos ao flavivírus e/ou de pelo menos seres humanos soronegativos para o Zika vírus de mais de 300 ou de mais de 500, de mais de 1000 ou de mais de 2000, conforme de- terminado pelo ensaio de neutralização de partículas virais repórter (RVP). A alta média geométrica de títulos de anticorpos neutralizantes indicam um início precoce de proteção, o que é benéfico em uma situ- ação de surto ou um viajante que visita uma área endêmica dentro de um curto período de tempo a partir da administração da vacina ou composição imunogênica.
[0044] Dentro do significado desta descrição, o ensaio de neutrali- zação de partículas de vírus Repórter (RVP) refere-se a títulos de anti- corpos neutralizantes de Zika que foram analisados por titulação de amostras de soro com uma quantidade constante de RVPs de Zika em células Vero cultivadas em placas de 96 poços. As RVPs continham as proteínas prME do Zika (cepa SPH2012) e um repórter de luciferase de Renilla baseado em dengue. Rapidamente, os soros foram inativa- dos pelo calor a 56ºC durante 30 min, diluídos e depois incubados a 37ºC com RVPs. A mistura de soro/RVP foi então misturada com célu- las Vero e incubada durante 72 horas a 37ºC + 2ºC/ 5% de CO,» antes da detecção com substrato de luciferase. Os dados foram analisados usando a análise de parâmetros não lineares 4 do JMP11, normaliza- dos para um controle de rastreamento positivo e a dose eficaz a 50% (ECB50) foi relatada.
[0045] Por conseguinte, certos aspectos da presente invenção re- ferem-se a um método de tratamento ou prevenção, em particular pre- venção da infecção pelo Zika vírus em uma população de seres hu- manos que necessite do mesmo, compreendendo a administração em seres humanos individuais da referida população de seres humanos uma vacina ou composição imunogênica compreendendo (um) antíge- no a partir de um Zika vírus, em que a vacina ou a composição imuno- gênica é administrada como uma primeira (primária) e uma segunda (reforço) administração com cerca de 1 a 16 semanas de intervalo e em que a administração da vacina ou composição imunogênica induz 14 e/ou 28 dias após a administração do reforço, uma taxa de soro- conversão de pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% em uma população de pelo menos 20 seres humanos soronega-
tivos, conforme determinado pelo teste de neutralização por redução de placa (PRNT).
[0046] Por conseguinte, certos aspectos da presente invenção re- ferem-se a um método de tratamento ou prevenção, em particular pre- venção da infecção pelo Zika vírus em uma população de seres hu- manos que necessite do mesmo, compreendendo administrar em se- res humanos individuais da referida população de seres humanos uma vacina ou composição imunogênica compreendendo (um) antígeno a partir de um Zika vírus, em que a vacina ou composição imunogênica é administrada como dose única ou administração primária, e em que a administração da vacina ou composição imunogênica induz 14 e/ou 28 dias após a dose única ou administração primária de uma taxa de soroconversão de 25%, 30%, 40%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85% ou 90% em uma população de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus, conforme determinado pelo teste de neutralização por redução de placa (PRNT). A alta taxa de sorocon- versão após administração única ou dose única indica um início preco- ce de proteção, o que é benéfico em uma situação de surto ou um via- jante que visita uma área endêmica dentro de um curto período de tempo após a administração da vacina ou composição imunogênica.
[0047] Por conseguinte, certos aspectos da presente invenção re- ferem-se a um método de tratamento ou prevenção, em particular pre- venção da infecção pelo Zika vírus em uma população de seres hu- manos que necessite do mesmo, compreendendo administrar em se- res humanos individuais da referida população de seres humanos uma vacina ou composição imunogênica compreendendo (um) antígeno a partir de um Zika vírus, em que a vacina ou composição imunogênica é administrada como dose única ou administração primária e em que a administração da vacina ou composição imunogênica induz 14 e/ou 28 dias após a administração única ou primária de uma taxa de soroposi-
tividade 25%, 30%, 40%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85% ou 90% em uma população de pelo menos 20 seres humanos não expos- tos ao flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos seronegativos do Zika vírus, conforme determinado pelo teste de neutralização por re- dução de placa (PRNT). A alta taxa de soroconversão após adminis- tração única ou dose única indica um início precoce de proteção, o que é benéfico em uma situação de surto ou um viajante que visita uma área endêmica dentro de um curto período de tempo após a adminis- tração da vacina ou composição imunogênica.
[0048] Certos aspectos da presente invenção referem-se a um mé- todo de tratamento ou prevenção, em particular prevenção da infecção pelo Zika vírus em uma população de seres humanos em necessida- de, compreendendo administrar a seres humanos individuais da referi- da população de seres humanos uma vacina ou composição imunogê- nica compreendendo (um) antígeno proveniente de um Zika vírus, em que a vacina ou a composição imunogênica é administrada como uma dose única ou como doses múltiplas, como por exemplo, em uma pri- meira administração (primária) e uma segunda (reforço) e em que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração induz efeitos colaterais sistêmicos em menos que 50% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos, em particular em uma população de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivífus ou em particular em uma popula- ção de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para Zika vírus. Os métodos acima devem ser entendidos como também a usos cor- respondentes de uma vacina ou composição imunogênica compreen- dendo (um) antígeno de um Zika vírus, conforme divulgado neste do- cumento, para fabricação de um medicamento para tratar ou prevenir a infecção pelo Zika vírus.
[0049] De acordo com o significado desta descrição, "efeitos cola-
terais sistêmicos" são, em particular, febre, dor de cabeça, fadiga, ar- tralgia, mialgia e mal-estar.
[0050] Os métodos acima devem ser entendidos como também relacionados a uma vacina ou composição imunogênica compreen- dendo (um) antígeno de um Zika vírus, como divulgado neste docu- mento, para uso no tratamento ou prevenção de infecção pelo Zika vírus.
[0051] Em algumas modalidades, a administração é subcutânea ou intramuscular. Em algumas modalidades, a administração inclui a administração de duas doses da vacina ou composição imunogênica, conforme descrito neste documento (por exemplo, 10 ug de vírus puri- ficado completamente inativado, tal como um Zika vírus com uma mu- tação que é um triptofano para substituição de glicina na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, conforme descrito neste documento), dado um intervalo de cerca de 1 a cerca de 16 semanas (primeira (primária) e uma se- gunda administração (reforço)). Em certas modalidades, o Zika vírus é um isolado clonal do Zika vírus purificado em placas, em particular conforme descrito neste documento.
[0052] Os aspectos acima da presente invenção se referem às va- cinas ou composições imunogênicas, conforme descrito neste docu- mento, para uso no tratamento ou prevenção da infecção pelo Zika vírus em um sujeito humano que necessite do mesmo, para uso na indução de uma resposta imune em um sujeito humano que necessite do mesmo e para uso na prevenção da doença do Zika vírus em seres humanos, fetos ou recém-nascidos que necessitem do mesmo. Em algumas modalidades, a administração é subcutânea ou intramuscular. Em algumas modalidades, a administração inclui a administração de duas doses da vacina ou composição imunogênica, conforme descrito neste documento (por exemplo, 10 ug de vírus purificado completa-
mente inativado, tal como um Zika vírus com uma mutação que é um triptofano para substituição de glicina na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 11, conforme descrito neste documento), dado um intervalo de cerca de 1 a cerca de 16 semanas (primeira (primária) e uma segunda adminis- tração (reforço)). Em certas modalidades, o Zika vírus é um isolado clonal do Zika vírus purificado em placas, em particular conforme des- crito neste documento.
[0053] Os aspectos acima da presente invenção se referem às va- cinas ou composições imunogênicas, conforme descrito neste docu- mento, na fabricação de um medicamento para tratamento ou preven- ção da infecção pelo Zika vírus em um sujeito humano que necessite do mesmo, para indução de uma resposta imune em um sujeito huma- no que necessite do mesmo e na prevenção da doença do Zika vírus em seres humanos, fetos ou recém-nascidos que necessitem do mesmo. Em algumas modalidades, a administração é subcutânea ou intramuscular. Em algumas modalidades, a administração inclui a ad- ministração de duas doses da vacina ou composição imunogênica, conforme descrito neste documento (por exemplo, 10 ug de vírus puri- ficado completamente inativado, tal como um Zika vírus com uma mu- tação que é um triptofano para substituição de glicina na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, conforme descrito neste documento), dado um intervalo de cerca de 1 a cerca de 16 semanas (primeira (primária) e uma se- gunda administração (reforço)). Em certas modalidades, o Zika vírus é um isolado clonal do Zika vírus purificado em placas, em particular conforme descrito neste documento.
[0054] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o sujeito humano está grá- vida ou pretende engravidar ou é uma mulher com potencial para en-
gravidar.
[0055] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a administração da vacina ou composição imunogênica induz uma resposta imune protetora no sujeito humano. Em algumas modalidades, a resposta imune protetora induzida no sujeito humano é mais do que uma resposta imune prote- tora induzida em um sujeito humano correspondente administrado uma vacina ou composição imunogênica contendo um ou mais antígenos de um Zika vírus faltando pelo menos uma mutação de adaptação ce- lular não humana. Em algumas modalidades que podem ser combina- das com qualquer uma das modalidades anteriores, a administração da vacina ou composição imunogênica induz a geração de anticorpos neutralizantes ao Zika vírus no sujeito humano. Em algumas modali- dades, a concentração de anticorpos neutralizantes gerados no sujeito humano é maior do que uma concentração de anticorpos neutralizan- tes gerados em um sujeito humano correspondente administrado uma vacina ou composição imunogênica compreendendo um ou mais antí- genos de um Zika vírus faltando pelo menos uma mutação de adapta- ção celular não mutação.
[0056] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a vacina ou composição imunogênica é administrada por uma via selecionada a partir de admi- nistração subcutânea, administração transcutânea, administração in- tradérmica, administração subdérmica, administração intramuscular, administração por via oral, administração intranasal, administração bu- cal, administração intraperitoneal, administração intravaginal, adminis- tração anal e/ou administração intracraniana. Em algumas modalida- des que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a vacina ou a composição imunogênica é administrada uma ou mais vezes. Em algumas modalidades, a vacina ou composição imunogênica é administrada como uma primeira (primária) e uma se- gunda (reforço) administração. Em algumas modalidades, a segunda administração (reforço) é administrada pelo menos 28 dias após a pri- meira administração (primária). Em algumas modalidades, a adminis- tração inclui a administração de duas doses da vacina ou composição imunogênica, conforme descrito neste documento (por exemplo, 10 ug de vírus purificado completamente inativado, tal como um Zika vírus com uma mutação que é um triptofano para substituição de glicina na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, conforme descrito neste documento), dado um intervalo de cerca de 1 a cerca de 16 semanas (primeira (primária) e uma segunda administração (reforço)). Em certas modali- dades, o Zika vírus é um isolado clonal do Zika vírus purificado em placas.
[0057] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a preparação do vírus é misturada com um adjuvante. Em algumas modalidades, o adjuvante é selecionado a partir de sais de alumínio, agonistas de receptores toll- like (TLR), lipídios monofosforil A (MLA), lipídios sintéticos A, miméti- cos ou análogos de lipídios A, derivados de MLA, citocinas, saponinas, dipeptídeo muramil (MDP) derivados, oligos CpG, lipopolissacarídeo (LPS) de bactérias gram-negativas, polifosfazenos, emulsões, viros- somas, cocleatos, micropartículas de poli(lactido-co-glicolidos) (PLG), partículas de poloxâmero, micropartículas, lipossomas, adjuvante completo de Freund (CFA), e/ou adjuvante incompleto de Freund (IFA). Em algumas modalidades, o adjuvante é um sal de alumínio. Em algumas modalidades, o adjuvante é selecionado a partir alúmen, fos- fato de alumínio, hidróxido de alumínio, sulfato de alumínio e potássio e Alhydrogel 85. Em algumas modalidades, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pe-
lo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% desse ou mais antígenos na preparação de vírus são adsorvidos no adjuvante.
[0058] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, pelo menos uma mutação de adaptação celular não humana está no Zika vírus NS1. Em algu- mas modalidades, pelo menos uma mutação de adaptação ocorre na posição 98 da SEQ ID NO: 1, ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, pelo menos uma mutação de adaptação é uma mutação Trp98Gly. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer modalidades anteriores, pelo menos, a mutação de adaptação aprimora a estabili- dade genética, em comparação com um Zika vírus que falta, pelo me- nos, uma mutação de adaptação. Em algumas modalidades que po- dem ser combinadas com quaisquer modalidades anteriores, pelo me- nos uma mutação de adaptação aprimora a replicação viral em compa- ração com um Zika vírus que falta menos uma mutação de adaptação. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer das modalidades anteriores, o Zika vírus não compreende uma muta- ção na proteína do envelope E (Env).
[0059] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a população de Zika vírus é heterogênea. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a população de Zika vírus compreende um isolado clínico de Zika vírus. Em algumas moda- lidades, o isolado clínico de Zika vírus é da cepa PRVABC59. Em al- gumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a população de Zika vírus compreende um Zika vírus que foi previamente passado uma ou mais vezes em cul- tura de células. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o inóculo compreende soro humano. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o inóculo compreende um ou mais agentes adventícios. Em algumas modalidades, o isolado clonal do Zika vírus está substancialmente livre dos um ou mais agen- tes adventícios.
[0060] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, os métodos incluem adicio- nalmente uma ou mais purificações adicionais em placa do isolado clonal do Zika vírus. Em algumas modalidades, o isolado clonal do Zika vírus é purificado adicionalmente em placas duas ou mais vezes. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, os métodos incluem adicionalmente a passagem do isolado clonal do Zika vírus uma ou mais vezes em cultura de células. Em algumas modalidades, o isolado clonal do Zika vírus é passado duas ou mais vezes.
[0061] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, os métodos incluem adicio- nalmente a formulação de uma vacina ou composição imunogênica compreendendo um ou mais antígenos do isolado clonal do Zika vírus. Em algumas modalidades, a vacina ou composição imunogênica é uma vacina de antígeno purificada ou composição imunogênica, uma vacina de subunidade ou composição imunológica, uma vacina viral completamente inativada ou composição imunogênica, ou uma vacina viral atenuada ou composição imunogênica. Em algumas modalidades, a vacina ou composição imunogênica é toda uma vacina viral purifica- da completamente inativada ou composição imunogênica. Em algumas modalidades, o isolado clonal do Zika vírus foi inativado quimicamente. Em algumas modalidades, o isolado clonal de Zika vírus foi inativado quimicamente com um ou mais dentre um detergente, formalina, beta- propiolactona (BPL), etilamina binária (BEI), acetil etilenoimina, azul de metileno, e psoraleno. Em algumas modalidades, o isolado clonal do Zika vírus foi quimicamente inativado com formalina.
[0062] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, os métodos incluem adicio- nalmente a mistura da vacina ou composição imunogênica com um adjuvante. Em algumas modalidades, o adjuvante é selecionado a par- tir de sais de alumínio, agonistas de receptores toll-like (TLR), lipídios monofosforil A (MLA), lipídios sintéticos A, miméticos ou análogos de lipídios A, derivados de MLA, citocinas, saponinas, dipeptídeo muramil (MDP) derivados, oligos CpG, lipopolissacarídeo (LPS) de bactérias gram-negativas, polifosfazenos, emulsões, virossomas, cocleatos, mi- cropartículas de poli(lactido-co-glicolidos) (PLG), partículas de po- loxâmero, micropartículas, lipossomas, adjuvante completo de Freund (CFA), e Adjuvante de Freund incompleto (IFA). Em algumas modali- dades, o adjuvante é um sal de alumínio. Em algumas modalidades, o adjuvante é selecionado a partir alúmen, fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio, sulfato de alumínio e potássio e Alhydrogel 85. Em algu- mas modalidades, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo me- nos 98%, pelo menos 99% ou 100% de um ou mais antígenos são ad- sorvidos ao adjuvante. Em algumas modalidades que podem ser com- binadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a vacina ou composição imunogênica compreende 1 ug a cerca de 40 ug do vírus purificado completamente inativado ou 1 ug a cerca de 30 ug do vírus purificado completamente inativado ou 1 ug a cerca de 20 ug do vírus purificado completamente inativado, em particular 2 ug ou 5 ug ou 10 pg ou 15 ug ou 20 ug ou em particular 10 ug de vírus purificado com- pletamente inativado, tal como um Zika vírus com uma mutação que é um triptofano para substituição de glicina na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou numa posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO:
1, conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades, a vacina ou composição imunogênica compreende 1 ug a cerca de 30 ug do vírus purificado completamente inativado, em particular 2 ug, 5 ug ou 10 ug, ou em particular 10 ug de um Zika vírus purificado com- pletamente inativado compreendendo uma mutação Trp98Gly na posi- ção 98 da SEQ ID NO: 1, ou numa posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, em que o Zika vírus é derivado da cepa PRVABC59. Em algumas modalidades, a vacina ou composição imu- nogênica compreende 1 ug a cerca de 30 ug do vírus purificado com- pletamente inativado, em particular 2 ug, 5 ug ou 10 ug, ou em particu- lar 10 ug de um Zika vírus purificado completamente inativado com- preendendo uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1, ou numa posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, em que o Zika vírus é derivado da cepa PRVABC59 compreendendo o sequenciamento genômico, de acordo com a SEQ ID NO: 2.
[0063] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a vacina ou a composição imunogênica compreende de 0,1 ug de Env a cerca de 100 ug de Env. Em certas modalidades, o Zika vírus é um isolado clonal de Zika vírus purificado em placa. Em algumas modalidades, a vacina ou a compo- sição imunogênica é sem adjuvante.
[0064] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o isolado clonal do Zika ví- rus é uma população genética homogênea. Em algumas modalidades, o isolado clonal do Zika vírus não contém uma mutação na proteína do Envelope E (Env). Em algumas modalidades, o isolado clonal do Zika vírus contém pelo menos uma mutação. Em algumas modalidades, pelo menos uma mutação está na proteína 1 (NS1) não estrutural do Zika vírus. Em algumas modalidades, pelo menos uma mutação ocorre na posição 98 da SEQ ID NO: 1, ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, pelo menos uma mutação é uma mutação Trp98Gly. Em algumas modalidades, pelo menos uma mutação não está na proteína Envelope E (Env). Em algumas modalidades, pelo menos uma mutação aprimora a estabili- dade genética em comparação com um Zika vírus faltando pelo menos uma mutação. Em algumas modalidades, pelo menos uma mutação aprimora a replicação viral em comparação com um Zika vírus faltando pelo menos uma mutação.
[0065] Outros aspectos da presente invenção referem-se a uma vacina ou composição imunogênica contendo um ou mais antígenos de um isolado clonal de Zika vírus purificado em placas. Em algumas modalidades, o isolado clonal do Zika vírus purificado em placas foi purificado em placas a partir de células contatadas com um inóculo compreendendo uma população de Zika vírus. Em algumas modalida- des, as células são células não humanas. Em algumas modalidades, as células são células de inseto. Em algumas modalidades, as células de inseto são células de mosquito. Em algumas modalidades, as célu- las são células de mamíferos Em algumas modalidades, as células de mamífero são células de macaco. Em algumas modalidades, as célu- las de macaco são de uma linhagem celular Vero. Em algumas moda- lides, a linhagem celular Vero é uma linhagem celular Vero OMS 10-
87.
[0066] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a população de Zika vírus é heterogênea. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a população dos Zika vírus compreende um isolado clínico de Zika vírus. Em algumas moda- lidades, o isolado clínico de Zika vírus é da cepa PRVABC59. Em al- gumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a população de Zika vírus compreende um Zika vírus que foi previamente passado uma ou mais vezes em cul- tura de células. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o inóculo compreende soro humano. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o inóculo compreende um ou mais agentes adventícios. Em algumas modalidades, o isolado clonal do Zika vírus está substancialmente livre dos um ou mais agen- tes adventícios.
[0067] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o isolado clonal do Zika ví- rus purificado em placas é modificado em comparação com um Zika vírus do tipo selvagem. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o isolado clonal do Zika vírus é uma população genética homogênea. Em algu- mas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer das mo- dalidades anteriores, o isolado clonal do Zika vírus purificado em pla- cas não inclui compreende uma mutação na proteína do envelope E (Env). Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o isolado clonal do Zika ví- rus purificado em placas compreende pelo menos uma mutação. Em algumas modalidades, pelo menos uma mutação está na proteína 1 (NS1) não estrutural do Zika vírus. Em algumas modalidades, pelo menos uma mutação ocorre na posição 98 da SEQ ID NO: 1, ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1. Em al- gumas modalidades, pelo menos uma mutação é uma mutação Trp98Gly. Em algumas modalidades, pelo menos uma mutação não está na proteína Envelope E (Env) do Zika vírus. Em algumas modali- dades, pelo menos uma mutação aprimora a estabilidade genética em comparação com um Zika vírus faltando pelo menos uma mutação. Em algumas modalidades, pelo menos uma mutação aprimora a repli-
cação viral em comparação com um Zika vírus faltando pelo menos uma mutação. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer das modalidades anteriores, o vírus é um Zika vírus de linhagem africana ou um vírus de linhagem asiática. Em algumas mo- dalidades, o isolado clonal do Zika vírus purificado em placas é um ví- rus da linhagem asiática.
[0068] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer modalidades anteriores, a vacina ou composição imunogê- nica é uma vacina de antígeno purificada ou composição imunogênica, uma vacina de subunidade ou composição imunológica, uma vacina viral completamente inativada ou composição imunogênica, ou uma vacina viral atenuada ou composição imunogênica. Em algumas mo- dalidades, a vacina ou composição imunogênica é toda uma vacina viral completamente inativada ou composição imunogênica. Em algu- mas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o isolado clonal do Zika vírus purificado foi quimicamente inativado. Em algumas modalidades, o Zika vírus purifi- cado em placas foi quimicamente inativado com um ou mais de um detergente, formalina, beta-propiolactona (BPL), etilamina binária (BEI), acetil etilenoimina, azul de metileno e psoraleno. Em algumas modalidades, o isolado clonal do Zika vírus purificado em placas foi quimicamente inativado com formalina.
[0069] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer modalidades anteriores, a vacina ou composição imunogê- nica compreende adicionalmente um adjuvante. Em algumas modali- dades, o adjuvante é selecionado a partir de sais de alumínio, agonis- tas de receptores toll-like (TLR), lipídios monofosforil A (MLA), lipídios sintéticos A, miméticos ou análogos de lipídios A, derivados de MLA, citocinas, saponinas, dipeptídeo muramil (MDP) derivados, oligos CpG, lipopolissacarídeo (LPS) de bactérias gram-negativas, polifosfa-
zenos, emulsões, virossomas, cocleatos, micropartículas de po- li(lactido-co-glicolidos) (PLG), partículas de poloxâmero, micropartícu- las, lipossomas, adjuvante completo de Freund (CFA), e Adjuvante de Freund incompleto (IFA). Em algumas modalidades, o adjuvante é um sal de alumínio. Em algumas modalidades, o adjuvante é selecionado a partir alúmen, fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio, sulfato de alumínio e potássio e Alhydrogel 85. Em algumas modalidades, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pe- lo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de um ou mais antígenos são adsorvidos ao adjuvante. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a vacina ou composição imunogênica contém de 0,1 ug a cerca de 25 ug do vírus purificado completamente inativado, como um Zika vírus com uma mutação que é um triptofano para substituição de glicina em posição 98 da SEQ ID NO: 1, conforme descrito neste documento, em particular 2 ug, 5 ug ou 10 ug, ou em particular 10 ug de vírus purificado completamente inativado ou cerca de 0,1 ug de Env a cerca de 100 ug de Env. Em certas modalidades, o Zika vírus é um isolado clonal do Zika vírus purificado em placas. Em algumas modalidades, a vacina ou a composição imunogênica é sem adjuvante.
[0070] Deve-se entender que uma, algumas, ou todas as proprie- dades das várias modalidades descritas neste documento podem ser combinadas para formar outras modalidades da presente invenção. Estes e outros aspectos da presente invenção se tornarão evidentes para um especialista na técnica. Estas e outras modalidades da pre- sente invenção são adicionalmente descritas pela descrição detalhada a seguir.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0071] A Figura 1 mostra imagens de microscopia de campo claro de monocamadas de células Vero simuladas infectadas (topo) ou in- fectadas com a cepa ZIKAV PRVABCS59 (abaixo).
[0072] A Figura 2 mostra a cinética de crescimento de ZIKAV PRVABC59 P1 em monocamadas de células Vero, conforme determi- nado por TCID50.
[0073] A Figura 3 mostra o teste de ensaio de potência (TCID50) dos clones a-f do Zika vírus PRVABC59 P5.
[0074] A Figura 4 mostra imagens de microscopia de campo claro que descrevem o efeito citopático (CPE) do crescimento dos clones a-f do Zika vírus PRVABC59 P6 em monocamadas de células Vero.
[0075] A Figura 5 mostra o teste de ensaio de potência (TCID50) dos clones a-f do Zika vírus PRVABC59 P6.
[0076] A Figura 6 mostra um alinhamento da sequência de amino- ácidos comparando a sequência da glicoproteína do envelope do Zika vírus próximo ao resíduo 330 das cepas do Zika vírus PRVABC59 P6e (SEQ ID NO: 8) e PRVABC59 (SEQ ID NO: 9) com vários outros flavi- vírus (WNV (SEQ ID NO: 10); JEV (SEQ ID NO: 11); SLEV (SEQ ID NO: 12); YFV (SEQ ID NO: 13); DENV 1 16007 (SEQ ID NO: 14); DENV 2 16681 (SEQ ID NO: 15); DENV 3 16562 (SEQ IDNO: 16); e DENV 4 1036 (SEQ ID NO: 17)).
[0077] A Figura 7 mostra um alinhamento da sequência de amino- ácidos comparando a sequência da proteína NS1 do Zika vírus próxi- mo ao resíduo 98 das cepas do Zika vírus PRVABC59 P6e (SEQ ID NO:18) e PRVABC59 (SEQ ID NO:19) com vários outros flavivírus (WNV (SEQ ID NO: 20); JEV (SEQ ID NO: 21); SLEV (SEQ ID NO: 22); YFV (SEQ ID NO: 23); DENV 1 16007 (SEQ ID NO: 24); DENV 2 16681 (SEQ ID NO: 25); DENV 3 16562 (SEQ IDNO: 26); e DENV 4 1036 (SEQ ID NO: 27)).
[0078] A Figura 8 mostra o fenótipo de placa dos clones do Zika vírusV PRVABC59 P6 em comparação com o Zika vírusV PRVABC59
P1.
[0079] A Figura 9 mostra o tamanho de placa médio dos clones do Zika vírusV PRVABC59 P6 em comparação com o Zika vírusV PRVABCS59 P1.
[0080] A Figura 10 mostra a cinética de crescimento de clones a-f ZIKAV PRVABC59 P6 em células Vero sob condições de crescimento isentas de soro.
[0081] A Figura 11 mostra um esquema das etapas tomadas para preparar o o produto fármaco formulado com PRVABC59 P6b e Pôêe para os experimentos de imunização.
[0082] A Figura 12A mostra a programação da dosagem de ca- mundongos CD-1 com formulações de vacina derivadas dos clones ZIKAV PRVABCS59 P6b e P6e. PBS foi usado como placebo.
[0083] A Figura 12B mostra os títulos séricos de anticorpos neutra- lizantes de ZIKAV de camundongos CD-1 imunizados conforme descri- tos na Figura 12A usando formulações de vacina derivadas dos clones ZIKAV PRVABCS59 P6b e Põe. Os títulos de anticorpos neutralizantes de ZIKAV foram determinados pelo ensaio de neutralização de Partí- cula de Vírus Réporter (RVP). Linhas sólidas representam a média ge- ométrica de um grupo. O limite de detecção (1,93io0g1o) é representado por uma linha tracejada.
[0084] A Figura 13A mostra a programação da dosagem de ca- mundongos CD-129 com formulações de vacina derivadas dos clones ZIKAV PRVABC59 P6b e P6e. PBS foi usado como placebo.
[0085] A Figura 13B mostra os títulos séricos de anticorpos neutra- lizantes de ZIKAV de camundongos CD-129 imunizados conforme descritos na Figura 13A usando formulações de vacina derivadas dos clones ZIKAV PRVABC59 P6b e P6e. Linhas sólidas representam a média geométrica de um grupo. O limite de detecção (1,3015910) é re- presentado por uma linha tracejada. Foram atribuídos em animais sem título detectável (<1,30) um título de 0,5.
[0086] A Figura 14 mostra o peso médio dos grupos de teste AG129 pós-exposição, representado como uma porcentagem do peso inicial. As barras de erro representam o desvio padrão.
[0087] A Figura 15 mostra a viremia sérica de camundongos AG129 individuais dois dias após a exposição, relatados como PFU/mL. Linhas sólidas representam a média geométrica de um gru- po. O limite de detecção (2,0156910) é representado por uma linha trace- jada.
[0088] A Figura 16 mostra a análise de sobrevivência de grupos de teste AG129 pós-exposição.
[0089] A Figura 17 mostra os títulos de anticorpos neutralizantes de ZIKAV em circulação no soro antes da exposição (Nab), após a transferência passiva de soros combinados de camundongos AG129 vacinados e expostos.
[0090] A Figura 18 mostra o peso corporal médio de camundongos de transferência e controle passivos exposto ao Zika vírus.
[0091] A Figura 19 mostra a viremia sérica de camundongos AG129 individuais três dias após a exposição, relatados como PFU/mL.
[0092] A Figura 20 mostra a análise de sobrevivência de camun- dongos de transferência e controle passivos desafiados com o Zika vírus.
[0093] A Figura 21 mostra a correlação entre os títulos de anticor- pos neutralizantes do ZIKAV e a viremia observada em camundongos de transferência passiva.
[0094] A Figura 22 mostra a análise de sobrevivência de camun- dongos AG129 após exposição com estoques de preMVS de P6a e P6e usando uma curva de sobrevivência de Kaplan Meier.
[0095] A Figura 23 mostra o peso corporal médio, expresso em porcentagem do peso inicial no momento da invenção após a exposi- ção com os estoques preMVS de P6a e P6e. A linha tracejada repre- senta 100% do peso inicial para referência.
[0096] A Figura 24 mostra a viremia sérica de camundongos AG129 individuais três dias após a exposição com estoques preMVS de P6a e P6e, relatados como PFU/mL. A linha tracejada representa o limite de detecção do ensaio.
[0097] A Figura 25 mostra cinética compilada de dados de inativa- ção. Os dados comparam a potência infecciosa (TCID50) à cópia do RNA e a completude da inativação (COI) para amostras dos quatro lotes de toxicologia. Estes dados indicam que a sensibilidade do en- saio CO! é superior a TCID50.
[0098] A Figura 26 mostra uma comparação da sensibilidade de C6/36 e Vero no ensaio, como demonstrado com um título de vírus de entrada de 0,31 TCID50.
[0099] A Figura 27 mostra uma análise de regressão logística de CPE versus TCID50 log usando local de células C6/36 que inclui inter- valos de confiança de 99% em torno de um valor alvo de 0,01 TCID50/poço (-2 log TCID50/poço); o modelo prevê que 0,85% dos poços serão positivos.
[00100] A Figura 28 mostra cromatogramas de soluções de PBS (a) e PBS contendo 0,049 ug/mL (b), 0,098 ug/mL (c), 0,196 po/mL (d), 0,491 ug/mL (e), 0,982 ug/mL (f) e 1,964 pg/mL (g) de formaldeído.
[00101] A Figura 29 mostra um resumo do desenho do estudo clíni- co para o exemplo 6.
[00102] A Figura 30 mostra os títulos médios geométricos (GMTs) determinados usando PRNT dos seres humanos no exemplo 6
[00103] A Figura 31 mostra a porcentagem de seres humanos que alcançam soroconversão determinada usando PRNT no dia 29 (dia 28 após a dose principal) e no dia 57 (28 dias após a dose de reforço) do estudo descrito no Exemplo 6.
[00104] A Figura 32 mostra o gráfico da porcentagem de seres hu- manos que atingem um título médio geométrico específico (determina- do usando PRNT) no dia 29 (dia 28 após a dose principal) do estudo descrito no Exemplo 6.
[00105] A Figura 33 mostra o gráfico da porcentagem de seres hu- manos que atingem um título médio geométrico específico (determina- do usando PRNT) no dia 57 (dia 56 após a dose principal) do estudo descrito no Exemplo 6.
DESCRIÇÃO DETALHADA Técnicas Gerais
[00106] As técnicas e procedimentos descritos ou referenciados neste documentos são geralmente bem compreendidos e comumente empregados usando metodologia convencional pelos especialistas na técnica, como, por exemplo, as metodologias amplamente utilizadas descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): POR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames e G.R. Taylor eds. (1995)), Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow e Lane, eds. (1988), and Animal Cell Culture (R.l. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology (J. M. Walker, ed. Humana Press (1983)); Cell Biology: A La- boratory Notebook (J.E. Celis, ed., Academic Press (1998)) Academic Press; Animal Cell Culture (R.l. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather e P.E. Roberts, eds. Plenum Press (1998)); Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, e D.G. Newell, eds., J. Wiley and Sons (1993-8)); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir e C.C. Blackwell,
eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller e M.P. Calos, eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1987)); PCR: The Polyme- rase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., Springer (1994)); Current Pro- tocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., Wiley (1991)); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway e P. Travers, (1997)); Antibodies (P. Finch, 1997); Anti- bodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, (1988-1989)); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd e C. Dean, eds., Oxford University Press, (2000)); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow e D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1999)); e The Antibodies (M. Zanetti e J. D. Capra, eds., Harnwood Academic Publishers, (1995)). Zika Vírus
[00107] Certos aspectos da presente invenção referem-se a pelo menos um Zika vírus (por exemplo, um isolado clonal do Zika vírus, um Zika vírus purificado pelos métodos descritos neste documento, um Zika vírus compreendendo uma ou mais mutações de adaptação celu- lar não humanas, etc.) que pode ser útil em vacinas e/ou composições imunogênicas, incluindo, sem limitação, vírus purificados, vírus inati- vados, vírus atenuados, vírus recombinantes ou proteínas virais purifi- cadas e/ou recombinantes para vacinas de subunidades.
[00108] O Zika vírus (ZIKV)é um flavivírus transmitido por mosquito isolado pela primeira vez a partir de um macaco rhesus sentinela, na floresta Zika, em Uganda em 1947. Desde então, foram feitos isola- mentos de seres humanos na África e na Ásia e, mais recentemente, nas Américas. O ZIKV é encontrado em duas (possivelmente três) li- nhagens: uma linhagem africana (possivelmente linhagens da África Oriental e Ocidental) e uma linha asiática. Por conseguinte, exemplos de Zika vírus adequados da presente invenção incluem, sem limitação, vírus das linhagens africanas e/ou asiáticas. Em algumas modalida-
des, o Zika vírus é um vírus de linhagem asiática. Em algumas modali- dades, o Zika vírus é um vírus de linhagem asiática. Além disso, várias cepas nas linhagens africanas e asiáticas do Zika vírus foram previa- mente identificadas. Qualquer uma ou mais cepas adequadas do Zika vírus conhecidas na técnica podem ser utilizadas na presente inven- ção, incluindo, por exemplo, cepas Mr 766, ArD 41519, IbH 30656, P6- 740, EC Yap, FSS13025, ArD 7117, ArD 9957, ArD 30101, ArD 30156, ArD 30332, HD 78788, ArD 127707, ArD 127710, ArD 127984, ArD 127988, ArD 127994, ArD 128000, ArD 132912, 132915, ArD 141170, ArD 142623, ArD 149917, ArD 149810, ArD 149938, ArD 157995, ArD 158084, ArD 165522, ArD 165531, ArA 1465, ArA 27101, ArA 27290, ArA 27106, ArA 27096, ArA 27407, ArA 27433, ArA 506/96, ArA 975- 99, Ara 982-99, ArA 986-99, ArA 2718, ArB 1362, Nigeria68, Ma- laysia66, Kedougou84, Suriname, MR1429, PRVABC59, ECMN2007, DakAr41524, H/PF/2013, R103451, 103344, 8375, JMB-185, ZIKV/H, sapiens/Brazil/Natal/2015, SPH2015, ZIKV/Hu/Chiba/S36/2016, e/ou Cuba2017. Em algumas modalidades, a cepa PRVABCS59 é usada na presente invenção.
[00109] Em algumas modalidades, um exemplo de um sequencia- mento genômico do Zika vírus é estabelecido abaixo como SEQ ID NO: 2: 1 gttgttgatc tgtgtgaate agactgcgac agttegagtt tgaagcgaaa gctagcaaca 61 gtatcaacag gttttatttt ggatttggaa acgagagttt ctggtcatga aaaacccaaa 121 aaagaaatcc ggaggattce ggattgtcaa tatgctaaaa cgcggagtag ccegtgtgag 181 cecetttggg ggcttgaaga ggctgccage cagactteta ctaggteatg ggcccatcag 241 gatggtcttg gegattetag cetttttgag attcacggca atcaagecat cactgggtet 301 catcaataga tggggttcag tggggaaaaa agaggctatg gaaacaataa agaagttcaa 361 gaaagatctg gctgccatgec tgagaataat caatgctagg aaggagaaga agagacgagg 421 cgcagatact agtgtcggaa ttgttggcet cetgetgace acagectatgg cageggaggt 481 cactagacgt gggagtgcat actatatgta cttggacaga aacgatgctg gggaggccat 541 atcttttcca accacattgg ggatgaataa gtgttatata cagatcatgg atcttggaca 601 catgtgtgat gccaccatga gctatgaatg ccetatgctg gatgaggggg tggaaccaga 661 tgacgtegat tgttggtgca acacgacgtc aacttgggtt gtgtacggaa cctgccatca 721 caaaaaaggt gaagcacgga gatctagaag agctgtgacg cteceetece attecaccag 781 gaagctgcaa acgcggtege aaacctggtt ggaatcaaga gaatacacaa agcacttgat
841 tagagtcgaa aattggatat tcaggaaccc tggcttegeg ttagcageag ctgccatege
901 ttggcttttg ggaagctcaa cgagccaaaa agtcatatac ttggtcatga tactgctgat
961 tgccceggca tacagcatca ggtgcatagg agtcagcaat agggacttto tggaaggtat 1021 gtcaggtggg acttgggttg atgttgtctt ggaacatgga ggttgtatea cegtaatgge 1081 acaggacaaa ccgactgteg acatagaget ggttacaaca acagtcagca acatggcgga 1141 ggtaagatce tactgctatg aggcatcaat atcagacatg gcttetgaca geegetgece 1201 aacacaaggt gaagcetace ttgacaageca atcagacact caatatgtct gcaaaagaac 1261 gttagtggac agaggctggg gaaatggatg tggacttttt ggcaaaggga gcctggtgac 1321 atgcgctaag tttgcatgct ccaagaaaat gaccgggaag agcatccage cagagaatet 1381 ggagtaccgg ataatgctgt cagttcatgg ctcccageac agtgggatga tegttaatga 1441 cacaggacat gaaactgatg agaatagagc gaaagttgag ataacgccca attcaccegag 1501 agcegaagec accetggggg gttttagaag cctaggactt gattgtgaac cgaggacagg 1561 ccttgacttt tcagatttgt attacttgac tatgaataac aagcactggt tggttcacaa 1621 ggagtggtte cacgacatte cattaccttg gcacgetggg gcagacaceg gaactecaca 1681 ctggaacaac aaagaagcac tggtagagtt caaggacgca catgccaaaa ggcaaactgt 1741 cgtggttcta gggagtcaag aaggagcagt tcacacggec cttgctagag ctetggagge 1801 tgagatggat ggtgcaaagg gaaggctgte ctetggecac ttgaaatgte gectgaaaat 1861 ggataaactt agattgaagg gcgtgtcata ctecttgtgt actgcagegt teacatteac 1921 caagatcceg gctgaaacac tgcacgggac agtcacagtg gaggtacagt acgcagggac 1981 agatggacct tgcaaggttc cagctcagat ggcggtggac atgcaaacte tgaccccagt 2041 tgggaggttg ataaccgcta acccegtaat cactgaaagc actgagaact ctaagatgat 2101 gctggaactt gatccaccat ttggggacte ttacattgte ataggagteg gggagaagaa 2161 gatcacccac cactggcaca ggagtggcag caccattgga aaagcattto aagccactgt 2221 gagaggtgcc aagagaatgg cagtettggg agacacagec tgggacttto gatcagttgag 2281 aggcgetete aacteattgg gcaagggcat ccateaaatt tttggagcag ctttcaaate 2341 attgtttgga ggaatgtect ggttcteaca aatteteatt ggaacgttge tgatgtggtt 2401 gggtctgaac acaaagaatg gatctattte cettatgtgc ttggcettag ggggagtgtt 2461 gatcttetta tecacagecg tetetgetga tgtggggtgc teggtggact tetcaaagaa 2521 ggagacgaga tgcggtacag gggtgttegt ctataacgac gttgaagcct ggagggacag 2581 gtacaagtac catcctgact cceceegtag attggcagca gcagtcaage aagcctggga 2641 agatggtatc tgcgggatet cctotgtttc aagaatggaa aacatcatgt ggagatcagt 2701 agaaggggag ctcaacgcaa tcctggaaga gaatggagtt caactgacgg tegttatago 2761 atctgtaaaa aaccccatgt ggagaggtce acagagattg ccegtgecta tgaacgaget 2821 gccccacgge tggaaggett gggggaaate gtatttegte agagcageaa agacaaataa 2881 cagctttgte gtggatggtag acacactgaa ggaatgccca ctcraaacata gagcatggaa 2941 cagctttett grogaggate atgggttegg ggtatttcac actagtgtct ggctcaaggt 3001 tagagaagat tattcattag agtgtgatce agcegttatt ggaacagetg ttaagggaaa 3061 ggaggctgta cacagtgatc taggctactg gattgagagt gagaagaatg acacatggag 3121 gctgaagagg gcccatetga tegagatgaa aacatgtgaa tggccaaagt cccacacatt 3181 gtggacagat ggaatagaag agagtgatct gatcataccc aagtetttag ctgggccact 3241 cagccatcac aataccagag agggctacag gacccaaatg aaagggccat ggcacagtga 3301 agagcttgaa attcggtttg aggaatgccc aggcactaag gtccacgtgg aggaaacato 3361 tggaacaaga ggaccatctc tgagatcaac cactgcaage ggaagagtga tegaggaato 3421 gtgctgcagg gagtgcacaa tgcccccact gtegtteegg getaaagatg getgttagta 3481 tggaatggag ataaggccca ggaaagaace agaaagecaac ttagtaaggt caatggtgac
3541 tgcaggatca actgatcaca tggaccactt ctcccttgga gtgcttgtga tectgcteat 3601 ggtgcaggaa gggctgaaga agagaatgac cacaaagatc atcataagca catcaatggc 3661 agtgctggta gctatgatcc tgggaggatt ttcaatgagt gacctggcc agettgcaat
3721 tttgatgggt gccacetteg cggaaatgaa cactggagga gatgtagete atectggeget 3781 gatageggca ttcaaagtea gaccagegtt getggtatet ttcatettea gagetaatto 3841 gacaccecegt gaaagcatge tgctaggectt ggcetegtgt cttttgcaaa ctgegatete 3901 cgccttagaa ggegacetga tagtteteat caatggtttt gotttggcet ggttggcaat 3961 acgagcgatg gttgttccac gcactgataa catcacettg gcaatectgg ctgctetgac 4021 accactggce cggggeacac tgcttgtgge gtggagagea ggcettgeta cttgcggggg 4081 gtttatgctec ctetetetga agggaaaagg cagtgtgaag aagaacttac catttgtcat 4141 ggccctggga ctaacegctg tgaggctggt cgaccecate aacgtggtgg gactgctgtt 4201 gctcacaagg agtgggaage ggagetggee ccctagegaa gtacteacag ctgttggcet 4261 gatatgcgca ttggctagag ggttegecaa ggcagatata gagatggctg ggcccatgge 4321 cgcggteggt ctgctaattg tcagttacgt ggtctcagga aagagtgtgg acatgtacat 4381 tgaaagagca ggtgacatca catgggaaaa agatgcggaa gtcactggaa acagtccceg 4441 getegatgta gegetagata agagtagtga tttctecetg gtogaggata acggtecece 4501 catgagagag atcatactca aggtggtcct gatgaccate tgtggcatga acccaatage 4561 cataccettt gcagetggag cgtggtacgt atacgtgaag actggaaaaa ggagtggtge 4621 tctatgggat gtgcctgcte ccraaggaagt aaaaaagggg gagaccacag atggagtgta 4681 cagagtaatg actcgtagac tgctaggttc aacacaagtt ggagtgggag ttatgcaaga 4741 gggggtcttt cacactatgt ggcacgtcac aaaaggatce gegetgagaa geggtgaaga 4801 gagacttgat ccatactggg gagatgtcaa gcaggatctg gtgtcatact gtagtecata 4861 gaagctagat gcegectggg atgggcacag cgaggtgcag ctettggeeg tgcccecagg 4921 agagagagcg aggaacatce agactetgce cggaatattt aagacaaago atggggacat 4981 tggageggtt gegetagatt acccagcagg aacttcagga tetecaatee tagacaagto 5041 tgggagagtg ataggacttt atggcaatgg ggtegtgate aaaaacggga gttatgttag 5101 tgccatcace caagggagga gggaggaaga gactectgtt gagtgctteg agecetegat 5161 gctgaagaag aagcagetaa ctgtettaga cttgcatect ggagctggga aaaccaggag 5221 agttcttcct gaaatagtcc gtgaagccat aaaaacaaga ctcegtactg tgatcttage 5281 tccaaccagg gttgtegetg ctgaaatgga ggaggccctt agagggette cagtgegtta 5341 tatgacaaca gcagtcaatg tcacccacte tggaacagaa atcgtegact taatgtgcca 5401 tgccacctte acttcacgte tactacagecec aatcagagtec cccaactata atctgtatat 5461 tatggatgag gcccacttca cagateccte aagtatagca gcaagaggat acatttcaac 5521 aagggttgag ataggcgagg cggctgccat cttcatgace gecacgecae caggaacecg 5581 tgacgcattt ceggacteca actcaccaat tatggacace gaagtggaag teccagagag 5641 agcctggage teaggetttg attgggtgac ggatcattet ggaaaaacag tttggtttgt 5701 tccaagegto aggaacggca atgagatege agettgtetg acaaaggetg gaaaacgggt 5761 catacagctc agcagaaaga cttttgagac agagttccag aaaacaaaac atcaagagto 5821 ggactttgtc gtgacaactg acatttcaga gatgggegcc aactttaaag ctgaccegtgt 5881 catagattcc aggagatgcc taaagceggt catacttgat ggcgagagag tcattctgge 5941 tggacccatg cctgtcacac atgccagege tgcccagagg agggggegca taggcaggaa 6001 tcccaacaaa cctggagatg agtatctgta tggaggtagg tgcgcagaga ctgacgaaga 6061 ccatgcacac tggcttgaag caagaatgct ccttgacaat atttacctcc aagatggcet 6121 catagceteg ctetategac ctgaggeega caaagtagea gecattgagg gagagttcaa 6181 gcttaggacg gagcaaagga agacctttgt ggaactcatg aaaagaggag atcttectgt
6241 ttggctagce tatcaggttg catctgcogg aataacctac acagatagaa gatggtgctt 6301 tgatggcacg accaacaaca ccataatgga agacagtgtg ccggcagagg tgtggaccag 6361 acacggagag aaaagagtgc tcaaaccgag gtagatggac gccagagttt gttcagatea 6421 tgeggccctg aagtcattca aggagtttgc cgctgggaaa agaggagegg cttttggagt 6481 gatggaagce ctgggaacac tgccaggaca catgacagag agattccagg aagccattga 6541 caaccteget gtgcteatge gggcagagac tggaageagg ccttacaaag cegeggegge 6601 ccaattgceg gagaccetag agaccataat gcttttaggg ttgctgggaa cagteteget 6661 gggaatette ttegtettga tgaggaacaa gggcataggg aagatggget tiggaatagt 6721 gactettggg gccagegeat ggctratgtg goteteggaa attgagecag ccagaattge 6781 atgtgtccte attgttgtgt tcctattgct ggtggtgcte atacctgage cagaaaagea 6841 aagatctcce caggacaace aaatggcaat catcatcatg gtagcagtag gtcttctgagg 6901 cttgattacc gccaatgaac tcggatggtt ggagagaaca aagagtgacc taagccatet 6961 aatgggaagg agagaggagg gggcaaccat aggattctca atggacattg acctgcggee 7021 agccteaget tgggccatet atgctgcctt gacaacttte attaccecag cegtecaaca 7081 tgcagtgacc acctcataca acaactacte cttaatggcg atggccacge aagetggagt 7141 gttgtttgge atgggcaaag ggatgccatt ctacgcatgg gactttggag tecegetget 7201 aatgataggt tgctactcac aattaacace cetgacecta atagtggeca teattttgot 7261 cgtggegeac tacatgtact tgatcecagg getgcaggea gcagetgege gtgctgecca 7321 gaagagaacg gcagctggca tcatgaagaa ccctgttgtg gatggaatag tggtgactga 7381 cattgacaca atgacaattg acccccaagt ggagaaaaag atgggacagg tgctactcat 7441 agcagtagce gtetecageg ceatactgte geggacegec taggggtagg gagaggctgg 7501 ggctetgate acagcegeaa cttecacttt gtgggaagge tetcegaaca agtactggaa 7561 ctectetaca gecactteac tgtgtaacat ttttagggga agttacttgg ctggagette 7621 tctaatctac acagtaacaa gaaacgctgg cttggtcaag agacgtgggg gtggaacagoa 7681 agagaccctg ggagagaaat ggaaggcceg cttgaaccag atgteggece taggagtteta 7741 ctectacaaa aagtcaggca tcacegaggt gtgcagagaa gaggcceges gegeceteaa 7801 ggacggtgtg gcaacgggag gccatgctgt gtecegagga agtgcaaage tgagatggtt 7861 ggtggagegg ggatacctgec agccctatgg aaaggteatt gatcttggat gtggcagagg 7921 gggctagagt tactacgtcg ccaccatceg caaagttcaa gaagtgaaag gatacacaaa 7981 aggaggccct ggtcatgaag aacccgtgtt ggtgcaaagec tatgggtgga acatagtceg 8041 tcttaagagt ggggtagacg tctttcatat ggcggctgag cegtgtgaca cgttgctgta 8101 tgacataggt gagtcatcat ctagtcctga agtggaagaa gcacggacgc tcagagtect 8161 ctccatagtg gaggattgge ttgaaaaaag accaggagec ttttgtataa aagtgttgto 8221 cccatacace agcactatga tggaaaccct ggagcgactg cagegtaggt atgggggaga 8281 actggtcaga gtgccactet ccegeaacte tacacatgag atgtactggg tctetggage 8341 gaaaagcaac accataaaaa gtgtgtccac cacgagecag ctectettgg ggcegcatgga 8401 cgggcctagg aggccagtga aatatgagga ggatgtgaat cteggetetg gcacgeggge 8461 tgtggtaagc tgcegctgaag cteccaacat gaagatcatt ggtaaccgca ttgaaaggat 8521 ccgcagtgag cacgcggaaa cgtggttctt tgacgagaac cacccatata ggacatgggc 8581 ttaccatgga agctatgagg cccccacaca agggtcageg tectetetaa taaacggggt 8641 tgtcaggcte ctgtcaaaac cctgggatgt ggtgactgga gtcacaggaa tagccatgac 8701 cgacaccaca ccgtatggte agcaaagagt tttcaaggaa aaagtggaca ctagggtgce 8761 agacccccaa gaaggcacte gtcaggttat gagcatagte tettcctagt tgtggaaaga 8821 gctaggcaaa cacaaacggc cacgagtetg caccaaagaa gagttcatca acaaggtteg 8881 tagcaatgca gcattagggg caatatttga agaggaaaaa gagtggaaga ctgcagtgga
8941 agctgtgaac gatccaaggt tetgggetet agtggacaag gaaagagage accacetgag 9001 aggagagtgc cagagctgtg tgtacaacat gatgggaaaa agagaaaaga aacaagggga 9061 atttggaaag gccaagggeca geegegecat ctagtatatg tagctagggg ctagatttet 9121 agagttegaa gceccettagat tettgaacga ggatcactgg atggggagag agaactcagg 9181 aggtggtgtt gaaggactgg gattacaaag actceggatat gtcctagaag agatgagteg 9241 tataccagga ggaaggatgt atgcagatga cactgctgge tgggacacee geattageag 9301 gtttgatctg gagaatgaag ctetaatcac caaccaaatg gagaaaggge acagggeett 9361 ggcattggce ataatcaagt acacatacca aaacaaagto gtaaaggtce ttagaccage 9421 tgaaaaaggg aaaacagtta tggacattat ttegagacaa gaccaaaggg ggagcggaca 9481 agttgtcact tacgctetta acacatttac caacctagtg gtgcaactca ttceggaatat 9541 ggaggctgag gaagttctag agatgcaaga cttgtggctg ctgcggaggt cagagaaagt 9601 gaccaactgg ttgcagagca acggatggga taggctcaaa cgaatggce tcagtggaga 9661 tgattgegtt gtgaagecaa ttgatgatag gtttgcacat goceteaggt tettgaatga 9721 tatgggaaaa gttaggaagg acacacaaga gtaggaaacce tcaactggat gggacaacta 9781 ggaagaagtt cegttttgct cecaceactt caacaagecte cateteaagg acgggaggte 9841 cattgtggtt ccctgeegec accaagatga actgattggec cgggecegeg tetetecagg 9901 ggcegggatgg agcatceggg agactgcttg cctagcaaaa tcatatgege aaatgtagca 9961 gctectttat ttecacagaa gggaceteeg actgatggce aatgccattt grtcatetgt 10021 gccagttgac tgggttecaa ctaggagaac tacctggtca atccatggaa agggagaato 10081 gatgaccact gaagacatgc ttgtggtgtg gaacagagtg taggattgagg agaacgacca 10141 catggaagac aagaccccag ttacgaaatg gacagacatt ccectatttgg gaaaaaggga 10201 agacttgtgg tagtggatcete teatagggea cagacegege accacetggg ctgagaacat 10261 taaaaacaca gtcaacatgg tgcgcaggat cataggtgat gaagaaaagt acatggacta 10321 cetatecace caagtteget acttgggtga agaagggtet acacctaggag tgctgtaage 10381 accaatctta atgttgtcag gcctgctagt cagccacage ttagggaaag ctgtgcagee 10441 tgtgacccece ccaggagaag ctgggaaace aagcectatag tcaggeegag aacgeccatgg 10501 cacggaagaa gccatgectge ctatgagece cteagaggac actgagtcaa aaaaccecac 10561 gegettagag gcgcaggatg ggaaaagaag gtggegacet tececacect teaatetggo 10621 gcctgaactg gagatcagect gtagatcteco agaagaggga ctagtoggtta gagga
[00110] Em algumas modalidades, o Zika vírus pode compreender sequenciamento genômico do número de acesso ao GenBank KU501215.1. Em algumas modalidades, o Zika vírus é da cepa PRVABC59. Em algumas modalidades, o sequenciamento genômico do número de acesso ao GenBank KU501215.1 compreende a se- quência da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o Zika vírus po- de compreender um sequenciamento genômico que tem pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo me- nos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pe- lo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%,
pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo me- nos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identida- de de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 2.
[00111] Em algumas modalidades, o Zika vírus pode compreender pelo menos um polipeptídeo codificado pela sequência da SEQ ID NO:
2. Em algumas modalidades, o Zika vírus pode compreender pelo me- nos um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85%, em pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, em pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência da SEQ ID NO: 2.
[00112] Por conseguinte, em algumas modalidades, o Zika vírus da presente invenção pode ser utilizado em qualquer uma das vacinas e/ou composições imunogênicas divulgadas neste documento. Por exemplo, o Zika vírus da presente invenção pode ser usado para for- necer um ou mais antígenos úteis para o tratamento ou prevenção da infecção pelo Zika vírus em um sujeito humano que necessite do mesmo e/ou para induzir uma resposta imune, como uma resposta imune protetora, contra Zika vírus em um ser humano que necessite do mesmo. Antígenos Virais
[00113] Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se a um ou mais antígenos de qualquer Zika vírus útil descrito neste docu- mento, em vacinas e/ou composições imunogênicas, incluindo, sem limitação, vírus purificados, vírus inativados, vírus atenuados, vírus re- combinantes ou purificados e/ou recombinantes proteínas virais para vacinas de subunidades. Em algumas modalidades, as vacinas e/ou composições imunogênicas incluem vírus completamente inativados.
[00114] Os antígenos da presente invenção podem ser qualquer substância capaz de provocar uma resposta imune. Exemplos de antí- genos adequados incluem, mas não estão limitados a, vírus comple- tos, vírus atenuado, vírus inativado, proteínas, polipeptídeos (incluindo proteínas ativas e epítopos de polipeptídeos individuais dentro das proteínas), glicopolipeptídeos, lipopolipeptídeos, peptídeos, polissaca- rídeos, conjugados de polissacarídeos, mímicos de peptídeos e não peptídeo de polissacarídeos e outras moléculas, moléculas pequenas, lipídios, glicolipídios e carboidratos.
[00115] Os antígenos da presente invenção podem ser de qualquer Zika vírus (por exemplo, um isolado clonal do Zika vírus) produzido a partir de uma ou mais células na cultura de células (por exemplo, via purificação de placa). Quaisquer células adequadas conhecidas na técnica para a produção do Zika vírus podem ser utilizadas, incluindo, por exemplo, células de insetos (por exemplo, células de mosquito, como células CCL-125, células Aag-2, células RML-12, células C6/36, células 07-10, células AP-61, A.t. células GRIP-1, A.t. células GRIP-2, A-t. células GRIP-3, células UM-AVE1, células Mos.55, células Sua1B, células 4a-3B, células Mos.42, células MSQ43, células LSB-AA695BB, células NIID-CTR, TRA-171, células e células adicionais ou linhas ce- lulares de espécies de mosquitos, como Aedes aegypti, Aedes albopic- tus, Aedes pseudoscutellaris, Aedes triseriatus, Aedes vexans, Anopheles gambiae, Anopheles stephensi, Anopheles albimus, Culex quinquefasciatus, Culex theileri, Culex tritaeniorhynchus, Culex tritae- niorhynchus, Culex tritaeniorhynchus, e células de mamíferos (por exemplo, células VERO (de rins de macaco), células LLO-MK?2 (de rins de macaco), células MDBK, células MDCK, células ATCC CCL34 MDCK (NBL2), MDCK 33016 (número de depósito DSM ACC 2219,
conforme descrito em WOS97/37001), BHK21-F, HKCC ou células de ovário de hamster chinês (células CHO). Em algumas modalidades, os antígenos da presente invenção são de um Zika vírus (por exemplo, um isolado clonal do Zika vírus) produzido a partir de uma célula não humana (por exemplo, via purificação de placa). Em algumas modali- dades, os antígenos da presente invenção são de um Zika vírus (por exemplo, um isolado clonal do Zika vírus) produzido a partir de uma célula de inseto (por exemplo, via purificação de placa). Em algumas modalidades, os antígenos da presente invenção são de um Zika vírus (por exemplo, um isolado clonal do Zika vírus) produzido a partir de uma célula não humana (por exemplo, via purificação de placa). Em algumas modalidades, os antígenos da presente invenção são de um Zika vírus (por exemplo, um isolado clonal do Zika vírus) produzido a partir de uma célula de mamífero (por exemplo, via purificação de pla- ca). Em algumas modalidades, os antígenos da presente invenção são de um Zika vírus (por exemplo, um isolado clonal do Zika vírus) produ- zido a partir de uma célula VERO (por exemplo, via purificação de pla- ca). Os métodos de purificação de um vírus realizando a purificação de placas são conhecidos por um alguém de conhecimento comum na técnica (consultar, por exemplo, Exemplo 1 abaixo).
[00116] Os antígenos da presente invenção podem incluir pelo me- nos uma mutação de adaptação celular não humana. Mutações de adaptação podem ser geradas adaptando um vírus ao crescimento em uma linhagem celular específica. Por exemplo, uma célula pode ser transfectada ou eletroporada com um vírus, RNA transcrito de um ví- rus (por exemplo, um vírus infeccioso ou clone infeccioso) e/ou RNA purificado de um vírus completo e passado de maneira que o vírus e/ou RNA viral replica e seu ácido nucleico sofre mutação. As muta- ções de ácido nucleico podem ser mutações pontuais, mutações de inserção ou mutações de exclusão. Mutações no ácido nucleico po-
dem levar a alterações de aminoácidos nas proteínas virais que facili- tam o crescimento do vírus em uma célula não humana. Mutações de adaptação podem facilitar alterações fenotípicas no vírus, incluindo tamanho alterado da placa, cinética de crescimento, sensibilidade à temperatura, resistência ao fármaco, virulência e o rendimento de vírus na cultura de células. Essas mutações adaptativas podem ser úteis na fabricação de vacinas, aumentando a velocidade, o rendimento e a consistência do vírus cultivado em uma linhagem celular. Mutações adaptativas podem alterar (por exemplo, potencializar ou diminuir) a imunogenicidade dos antígenos virais, alterando a estrutura dos epíto- pos imunogênicos. Além disso, mutações adaptativas também podem aumentar a estabilidade genética do vírus e/ou reduzir ou, de outro modo, inibir o desenvolvimento de mutações indesejáveis no vírus por meio de múltiplas (por exemplo, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20 ou mais) passagens.
[00117] Por conseguinte, em certas modalidades, os antígenos da presente invenção incluem pelo menos uma mutação de adaptação celular não humana. Em certas modalidades, a mutação de adaptação é uma mutação de um antígeno viral para uma célula não humana. Em algumas modalidades, a célula não humana é uma célula de mamiífe- ro. Qualquer célula de mamífero adequada conhecida na técnica pode ser utilizada, incluindo, sem limitação, células VERO (de rins de maca- co), células LLC-MK2 (de rins de macaco), células MDBK, células MDCK, células ATCC CCL34 MDCK (NBL2), MDCK 33016 (número de depósito DSM ACC 2219 como descrito em WOS97/37001), células BHK21-F, células HKCC ou células de ovário de hamster chinês (célu- las CHO). Em algumas modalidades, a célula não humana é uma célu-
la de macaco. Em algumas modalidades, a célula de macaco é de uma linhagem celular Vero. Qualquer linha cecular Vero adequada co- nhecida na técnica pode ser usada, incluindo, sem limitação, WHO Ve- ro 10-87, ATCC CCL-81, Vero 76 (número de acesso ATCC CRL- 1587) ou Vero C1008 (número de acesso ATCC CRL -1586). Em al- gumas modalidades, a linhagem celular Vero é WHO Vero 10-87.
[00118] Os Zikavíruspossuem um genoma de RNA de fita simples de sentido positivo que codifica polipeptídeos estruturais e não estrutu- rais. O genoma também contém sequências não codificantes nas regi- ões terminais 5' e 3' que desempenham um papel na replicação do ví- rus. Os polipeptídeos estruturais codificados por esses vírus incluem, sem limitação, capsídeo (C), membrana precursora (prM) e envelope (E). Os polipeptídeos não estruturais (NS) codificados por esses vírus incluem, sem limitação, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5.
[00119] Em certas modalidades, os antígenos da presente invenção podem conter pelo menos um (por exemplo, pelo menos um, pelo me- nos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos pelo me- nos nove, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, etc.) mutações de adaptação celular não humana em uma ou mais (por exemplo, uma ou mais, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, ou todos os dez) antígenos/polipeptídeos virais, incluindo, sem limitação, C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5. Em algumas modalida- des, pelo menos uma mutação de adaptação celular não humana está na proteína 1 (NS1) não estrutural do Zika vírus. Em algumas modali- dades, os antígenos da presente invenção incluem vírus completos e inativados que podem conter pelo menos um (por exemplo, pelo me-
nos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos três, pelo me- nos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos 10, etc.) mutações de adap- tação celular não humanas. Em algumas modalidades, os antígenos da presente invenção incluem vírus completos, inativados que podem conter pelo menos uma mutação de adaptação celular não humana na proteína não estrutural 1 (NS1) do Zika vírus.
[00120] Em algumas modalidades, pelo menos uma mutação de adaptação celular não humana está dentro do polipeptídeo NS1. A se- quência de aminoácidos de um polipeptídeo NS1 do tipo selvagem e não adaptado a células de uma cepa exemplar do Zika vírus é estabe- lecida como:
DVGCSVDFSKKETRCGTGVFVYNDVEAWRDRYKYHPDSPRRLAAA VKQAWEDGICGISSVSRMENIMWRSVEGELNAILEENGVQLTVVVGS VKNPMWRGPQRLPVPVNELPHGWKAWGKSYFVRAAKTNNSFVVD GDTLKECPLKHRAWNSFLVEDHGFGVFHTSVWLKVREDYSLECDPA VIGTAVKGKEAVHSDLGYWIESEKNDTWRLKRAHLIEMKTCEWPKSH TLWTDGIEESDLIIPKSLAGPLSHHNTREGYRTQMKGPWHSEELEIRF
EECPGTKVHVEETCGTRGPSLRSTTASGRVIEEWCCRECTMPPLSF RAKDGCWYGMEIRPRKEPESNLVRSMVT (SEQ ID NO: 1).
[00121] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo NS1 tem pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo me- nos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pe- lo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequên- cia com a sequência da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo NS1 pode ser da sequência de aminoácidos codificada pelo sequência do número de acesso ao
GenBank KU501215.1 (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo NS1 pode estar nas posi- ções de aminoácidos 795 a 1145 da sequência de aminoácidos codifi- cada pela sequência do número de acesso ao GenBank KU501215.1. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos do polipeptí- deo NS1 pode ser da cepa PRVABCS59 do Zika vírus.
[00122] "Identidade de sequência", "% de identidade de sequência", "% de identidade", "% de idêntico" ou "alinhamento de sequência" sig- nifica uma comparação de uma primeira sequência de aminoácidos com uma segunda sequência de aminoácidos ou uma comparação de uma primeira sequência de ácidos nucleicos para uma segunda se- quência de ácido nucleico e é calculada como uma porcentagem com base na comparação. O resultado desse cálculo pode ser descrito co- mo "porcentagem idêntica" ou "porcentagem de ID".
[00123] Geralmente, um alinhamento de sequência pode ser usado para calcular a identidade da sequência por uma de duas abordagens diferentes. Na primeira abordagem, ambas as incompatibilidades em uma única posição e as lacunas em uma única posição são contadas como posições não idênticas no cálculo final da identidade de sequên- cia. Na segunda abordagem, as incompatibilidades em uma única po- sição são contadas como posições não idênticas no cálculo final da identidade da sequência; no entanto, as lacunas em uma única posi- ção não são contadas (ignoradas) como posições não idênticas no cálculo final da identidade da sequência. Em outras palavras, na se- gunda abordagem, as lacunas são ignoradas no cálculo final da identi- dade da sequência. A diferença entre essas duas abordagens, ou seja, contar lacunas como posições não idênticas versus ignorar lacunas, em uma única posição, pode levar a uma variabilidade no valor da identidade da sequência entre duas sequências.
[00124] Uma identidade de sequência é determinada por um pro-
grama que produz um alinhamento e calcula a identidade contando ambas as incompatibilidades em uma única posição e as lacunas em uma única posição como posições não idênticas no cálculo final da identidade de sequência. Por exemplo, o programa Needle (EMBOS), que implementou o algoritmo de Needleman e Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), e que calcula a identidade da sequência por configurações padrão produzindo primeiro um ali- nhamento entre uma primeira sequência e uma segunda sequência, contando o número de posições idênticas ao longo do comprimento do alinhamento e dividindo o número de resíduos idênticos pelo compri- mento de um alinhamento, multiplicando esse número por 100 para gerar o % de identidade de sequência [% de identidade de sequência = (4 de resíduos idênticos/comprimento de alinhamento) x 100)].
[00125] Uma identidade de sequência pode ser calculada a partir de um alinhamento em pares, mostrando as duas sequências em todo o comprimento, mostrando a primeira e a segunda sequência em todo o seu comprimento ("Identidade de sequência global"). Por exemplo, o programa Needle (EMBOSS) produz esses alinhamentos;% de identi- dade de sequência = (ft de resíduos idênticos/comprimento do alinha- mento) x 100)].
[00126] Uma identidade de sequência pode ser calculada a partir de um alinhamento em pares, mostrando apenas uma região local da primeira sequência ou da segunda sequência ("Identidade local"). Por exemplo, o programa Blast (NCBI) produz esses alinhamentos;% de identidade de sequência = (ft de resíduos idênticos/comprimento do alinhamento) x 100)].
[00127] O alinhamento da sequência é de preferência gerado usan- do o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. (1979) 48, p. 443-453). De preferência, o programa "NEEDLE" (Conjunto Europeu de Software Aberto para Biologia Molecular (EMBOSS)) é usado com o parâmetro padrão dos programas (intervalo aberto = 10,0, intervalo estendido = 0,5 e matriz = EBLOSUMG6?2 para proteínas e matriz = EDNAFULL para nucleotídeos). Logo, uma identidade de sequência pode ser calculada a partir de um alinhamento mostrando ambas as sequências em todo o comprimento, de modo a mostrar a primeira se- quência e a segunda sequência em todo o seu comprimento ("ldenti- dade de sequência global"). Por exemplo:% de identidade da sequên- cia = (%4 de resíduos idênticos/comprimento do alinhamento) x 100)].
[00128] Em algumas modalidades, pelo menos uma mutação de adaptação celular não humana ocorre em uma ou mais posições de aminoácidos dentro do polipeptídeo NS1. Em algumas modalidades, a mutação ocorre na posição 98 da SEQ ID NO: 1, ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1 quando alinhada à SEQ ID NO: 1 usando um algoritmo de alinhamento em pares. Em al- gumas modalidades, a mutação na posição 98 é um triptofano para substituição de glicina.
[00129] Em algumas modalidades, o Zika vírus compreende uma mutação na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição corres- pondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1. Uma posição corresponden- te à posição 98 da SEQ ID NO: 1 pode ser determinada alinhando a sequência de aminoácidos de uma proteína NS-1 com a SEQ ID NO: 1 usando um algoritmo de alinhamento em pares. Os resíduos de ami- noácidos em vírus que não o Zika vírus, que correspondem ao resíduo de triptofano na posição 98 da SEQ ID NO: 1, são mostrados na Figu- ra 7 do presente pedido em que esses resíduos são embalados em caixas. Em algumas modalidades, a mutação na posição 98 é um trip- tofano para substituição de glicina. Em algumas modalidades, a muta- ção na posição 98 é um triptofano para substituição de glicina na posi- ção 98 da SEQ ID NO: 1.
[00130] Em algumas modalidades, os antígenos da presente inven-
ção contêm pelo menos uma mutação de adaptação celular não hu- mana dentro da proteína NS1 e contêm pelo menos uma mutação (por exemplo, pelo menos uma mutação de adaptação) dentro de um ou mais dentre as proteínas virais C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5. Em algumas modalidades, os antígenos da pre- sente invenção contêm uma ou mais mutações de adaptação celular não humanas dentro da proteína NS1 e não contêm pelo menos uma mutação (por exemplo, pelo menos uma mutação de adaptação celular não humana) dentro de um ou mais dentre as proteínas virais C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5. Em algumas modali- dades, os antígenos da presente invenção contêm pelo menos uma mutação de adaptação celular não humana dentro da proteína NS1 e não contêm pelo menos uma mutação (por exemplo, pelo menos uma mutação de adaptação celular não humana) dentro da proteína do en- velope E.
Em algumas modalidades, os antígenos da presente inven- ção incluem vírus completos, inativados que contêm pelo menos uma mutação de adaptação celular não humana na proteína não estrutural 1 (NS1) do Zika vírus e não incluem uma mutação na proteína do en- velope E (Env) do Zika vírus.
Em algumas modalidades, os antígenos da presente invenção contêm uma mutação na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1 e não contêm nenhuma mutação dentro da proteína do envelo- pe E.
Em algumas modalidades, os antígenos da presente invenção incluem vírus completos, inativados que contêm uma mutação na po- sição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posi- ção 98 da SEQ ID NO: 1 e não incluem uma mutação na proteína do envelope E (Env) do Zika vírus.
Em algumas modalidades, o vírus completamente inativado contém pelo menos uma mutação na proteí- na 1 (NS1) não estrutural do Zika vírus e a sequência que codifica a proteína do envelope é a mesma que a sequência correspondente na
SEQ ID No. 2. Em algumas modalidades, o Zika vírus contém uma mu- tação na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou numa posição corresponden- te à posição 98 da SEQ ID NO: 1 e a sequência que codifica a proteí- na do envelope é a mesma que a sequência correspondente na SEQ ID Nº 2. Em algumas modalidades, o Zika vírus completamente inati- vado contém uma mutação na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1 e a se- quência que codifica a proteína do envelope é a mesma que a se- quência correspondente na SEQ ID No. 2.
[00131] Em algumas modalidades, os antígenos da presente inven- ção, como o Zika vírus, contêm pelo menos uma mutação de adapta- ção celular não humana que potencializa a estabilidade genética em comparação com um Zika vírus faltando pelo menos uma mutação de adaptação. Em algumas modalidades, os antígenos da presente in- venção, como o Zika vírus, contêm pelo menos uma mutação de adap- tação celular não humana que potencializa a replicação viral em com- paração com um Zika vírus faltando pelo menos uma mutação de adaptação. Em algumas modalidades, os antígenos da presente in- venção, como o Zika vírus, contêm pelo menos uma mutação de adap- tação celular não humana que reduz ou, de outro modo, inibe a ocor- rência de mutações indesejáveis, tais como dentro da proteína do en- velope E (Env) do Zika vírus.
[00132] Nas modalidades acima da presente invenção, um algorit- mo de alinhamento em pares exemplar é o algoritmo de alinhamento global Needleman-Wunsch, usando parâmetros padrão (por exemplo, com penalidade de intervalo aberto = 10,0 e com penalidade de inter- valo estendido = 0,5, usando a matriz de pontuação EBLOSUM6?2). Esse algoritmo é convenientemente implementado na ferramenta de agulha no pacote EMBOSS.
[00133] Em algumas modalidades, os antígenos da presente inven-
ção de um Zika vírus podem ser utilizados em qualquer uma das vaci- nas e composições imunogênicas da presente invenção. Por exemplo, os antígenos da presente invenção podem ser úteis para o tratamento ou prevenção da infecção pelo Zika vírus em um sujeito humano que necessite do mesmo e/ou para induzir uma resposta imune, como uma resposta imune protetora contra o Zika vírus em um sujeito humano que necessite do mesmo. Produção de vacinas e composições imunogênicas
[00134] Outros aspectos da presente invenção referem-se a vaci- nas contra o Zika vírus e composições imunogênicas contendo um ou mais antígenos da presente invenção de pelo menos um Zika vírus. Tais vacinas e composições imunogênicas podem ser úteis, por exemplo, para tratar ou prevenir a infecção pelo Zika vírus em um su- jeito humano que necessite do mesmo e/ou induzir uma resposta imu- ne, como uma resposta imune protetora contra o Zika vírus em um su- jeito humano que necessite do mesmo. As vacinas e/ou composições imunogênicas da presente invenção podem incluir, sem limitação, vií- rus purificados, vírus inativados, vírus atenuados, vírus recombinantes, proteínas virais purificadas e/ou recombinantes para vacinas de subu- nidades. As vacinas e/ou composições imunogênicas da presente in- venção podem incluir adicionalmente uma vacina de antígeno purifica- da ou composição imunogênica, uma vacina de subunidade ou com- posição imunogênica, uma vacina de vírus completamente inativado ou composição imunogênica, ou uma vacina de vírus purificada com- pletamente inativada ou composição imunogênica, ou uma composi- ção imunogênica ou uma vacina atenuada contra vírus ou composição imunogênica.
[00135] A produção de vacinas e/ou composições imunogênicas da presente invenção inclui o crescimento do Zika vírus com antígenos sendo preparados a partir do vírus cultivado. O crescimento em cultura de células é um método para preparar vacinas e/ou composições imu- nogênicas da presente invenção. As células para crescimento viral po- dem ser cultivadas em suspensão ou em condições aderentes.
[00136] As linhas celulares adequadas para o crescimento de pelo menos um vírus da presente invenção são preferencialmente de ori- gem mamiífera e incluem, mas não estão limitadas a: células de inseto (por exemplo, células de mosquito, conforme descrito neste documen- to, células VERO (de rins de macaco), cavalo, vaca (por exemplo, cé- lulas MDBK), ovelha, cachorro (por exemplo, células MDCK de rins de cães, ATCC CCL34 MDCK (NBL2) ou MDCK 33016, número de depó- sito DSM ACC 2219 como descrito em WOS97/37001), gato e roedor (por exemplo, células de hamster, tais como células BHK21-F, células HKCC ou células de ovário de hamster chinês (células CHO)) e podem ser obtidas a partir de uma ampla variedade de estágios de desenvol- vimento, incluindo, por exemplo, adulto, neonatal, fetal e embrião. Em certas modalidades, as células são imortalizadas (por exemplo, células PERC.6, como descrito nos documentos WO 01/38362 e WO 02/40665 e depositadas sob o número de depósito ECACC 96022940). Em modalidades preferenciais, as células de mamíferos são utilizadas e podem ser selecionadas a partir de e/ou derivadas de um ou mais dos seguintes tipos de células não limitantes: células de fibroblasto (por exemplo, dérmica, pulmão), células endoteliais (por exemplo, aórtica, coronária, pulmonar, vascular, microvascular dérmi- ca, umbilical), hepatócitos, queratinócitos, células imunes (por exem- plo, célula T, célula B, macrófago, NK, dendrítico), células mamárias (por exemplo, epitelial), células musculares lisas (por exemplo vascu- lar, aórtica, coronária, arterial, uterina, pericitos brônquicos, cervicais, da retina), melanócitos, células neurais (por exemplo, astrócitos), célu- las da próstata (por exemplo, epitelial, músculo liso), células renais (por exemplo, epitelial, mesangial, túbulo proximal), células esqueléti-
cas (por exemplo, condrócitos, osteoclastos, osteoblastos), células musculares (por exemplo, mioblasto, esquelético, liso, brônquico), cé- lulas hepáticas, retinoblastos e células estromais. Os documentos WOS97/37000 e WOS97/37001 descrevem a produção de células e |li- nhas de células animais que são capazes de crescer em suspensão e em meio isento de soro e são úteis na produção e replicação de vírus.
[00137] As condições de cultura para os tipos de células acima são conhecidas e descritas em uma variedade de publicações. Alternati- vamente, meio de cultura, suplementos e condições podem ser adqui- ridos comercialmente, como por exemplo, descritos no catálogo e lite- ratura adicional da Cambrex Bioproducts (East Rutherford, NJ).
[00138] Em certas modalidades, as células usadas nos métodos descritos neste documento são cultivadas em meios isento de soro e/ou isentos de proteínas. Um meio é referido como um meio isento de soro no contexto da presente invenção em que não há aditivos do soro de origem humana ou origem animal. Entende-se por isento de proteí- nas as culturas nas quais a multiplicação das células ocorre com ex- clusão de proteínas, fatores de crescimento, outros aditivos de proteí- nas e proteínas não séricas, mas pode incluir opcionalmente proteínas como tripsina ou outras proteases que possam ser necessárias para o crescimento viral. As células que crescem nessas culturas contêm na- turalmente as próprias proteínas.
[00139] Os meios isentos de soro conhecidos incluem o meio de Iscove, o meio Ultra-CHO (BioWhittaker) ou o EX-CELL (JRH Biosci- ence). Os meios comuns que contêm soro incluem o Meio Basal de Eagle (BME) ou o Meio Essencial Mínimo (MEM) (Eagle, Science, 130, 432 (1959)) ou o Meio de Águia Modificado da Dulbecco (DMEM ou EDM), que são normalmente usados com até 10% de soro fetal de vi- telo ou aditivos similares. Opcionalmente, o Meio Essencial Mínimo (MEM) (Eagle, Science, 130, 432 (1959)) ou o Meio Águia Modificado da Dulbecco (DMEM ou EDM) podem ser usados sem qualquer su- plemento que contenha soro. Meios livres de proteínas como PF-CHO (JHR Bioscience), meios quimicamente definidos como ProCHO 4CDM (BioWhittaker) ou SMIF 7 (Gibco/BRL Life Technologies) e peptídeos mitogênicos como Primactone, Pepticase ou HyPep.TM. (todos da Quest International) ou hidrolisado de lactalbumina (Gibco e outros fa- bricantes) também são adequadamente conhecidos na técnica anteri- or. Os aditivos de meios à base de hidrolisados de plantas têm a van- tagem especial de excluir a contaminação por vírus, micoplasma ou agentes infecciosos desconhecidos.
[00140] As condições de cultura celular (temperatura, densidade celular, valor de pH, etc.) são variáveis em uma faixa muito ampla de- vido à adequação da linhagem celular empregada de acordo com a presente invenção e podem ser adaptadas aos requisitos de cepas virais específicas.
[00141] O método para propagar o vírus nas células cultivadas ge- ralmente inclui as etapas de inoculação das células cultivadas com a cepa a ser cultivada, cultivando as células infectadas por um período de tempo desejado para a propagação do vírus, como por exemplo, conforme determinado pelo título do vírus ou pela expressão do antí- geno (por exemplo, entre 24 e 168 horas após a inoculação) e coleta do vírus propagado. Em algumas modalidades, o vírus é coletado através da purificação da placa. As células cultivadas são inoculadas com um vírus (medido por PFU ou TCID50) para a razão celular de 1:500 a 1:1, preferencialmente 1:100 a 1:5. O vírus é adicionado a uma suspensão das células ou aplicado a uma monocamada das célu- las, e o vírus é absorvido pelas células por pelo menos 10 minutos, pelo menos 20 minutos, pelo menos 30 minutos, pelo menos 40 minu- tos, pelo menos pelo menos 50 minutos, pelo menos 60 minutos, mas geralmente menos de 300 minutos a 25ºC a 40ºC, preferencialmente
28ºC a 38ºC. A cultura de células infectadas (por exemplo, monoca- madas) pode ser removida por congelamento-descongelamento ou por ação enzimática para aumentar o conteúdo viral dos sobrenadantes da cultura colhida. Os fluidos colhidos são então inativados ou armazena- dos congelados. As células cultivadas podem ser infectadas com uma multiplicidade de infecção ("MOI") de cerca de 0,0001 a 10, de prefe- rência 0,002 a 5, mais preferencialmente de 0,001 a 2. Ainda mais pre- ferencialmente, as células são infectadas com uma MOI de cerca de 0,01. As células infectadas podem ser colhidas 30 a 60 horas após a infecção ou 3 a 10 dias após a infecção. Em certas formas de realiza- ção preferidas, as células são colhidas 3 a 7 dias após a infecção. Mais preferencialmente, as células são colhidas 3 a 5 dias após a in- fecção. Em algumas modalidades, as proteases (por exemplo, tripsina) podem ser adicionadas durante a cultura celular para permitir a libera- ção viral, e as proteases podem ser adicionadas em qualquer estágio adequado durante a cultura. Alternativamente, em certas modalidades, o sobrenadante de culturas de células infectadas pode ser colhido e o vírus pode ser isolado ou purificado de outro modo a partir do sobre- nadante.
[00142] O inóculo viral e a cultura viral são preferencialmente isen- tos de (isto é, foram testados e tiveram um resultado negativo para contaminação por) vírus do herpes simplex, vírus sincicial respiratório, vírus da parainfluenza 3, coronavírus SARS, adenovírus, rinovírus, re- ovírus, — poliomavírus, — birnavírus, —circovírus e/ou parvovírus [WO2006/027698].
[00143] Onde o vírus foi cultivado em uma linhagem celular, é práti- ca padrão minimizar a quantidade de DNA residual da linhagem celular na vacina final, a fim de minimizar qualquer atividade oncogênica do DNA da célula hospedeira. O DNA contaminante pode ser removido durante a preparação da vacina usando procedimentos padrão de puri-
ficação, por exemplo, cromatografia, etc. A remoção do DNA residual da célula hospedeira pode ser potencializado por tratamento com nu- clease, por exemplo, usando uma DNase. Um método conveniente para reduzir a contaminação do DNA da célula hospedeira divulgado nas referências (Lundblad (2001) Biotechnology and Applied Bioqu- hemistry 34: 195-197, Guidance for Industry: Validation Method Bioa- nalytical Validation. Centro de Administração de Alimentos e Medica- mentos do Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA pa- ra Avaliação e Pesquisa de Medicamentos (CDER) Centro de Medici- na Veterinária (CVM). Maio de 2001.) envolve um tratamento em duas etapas, primeiro usando uma DNase (por exemplo, Benzonase), que pode ser usada durante o crescimento viral, e depois um detergente catiônico (por exemplo, CTAB), que pode ser usado durante a inter- rupção do virion. A remoção por tratamento com B-propiolactona tam- bém pode ser usada. Numa modalidade, o DNA contaminante é remo- vido por tratamento com benzonase do sobrenadante da cultura. Produção de antígeno
[00144] Os antígenos da presente invenção para uso em vacinas e/ou composições imunogênicas, incluindo, sem limitação, vírus purifi- cados, vírus inativados, vírus completamente inativados, vírus atenua- dos, vírus recombinantes ou proteínas virais purificadas e/ou recombi- nantes para vacinas de subunidade para tratar e/ou impedir a infecção pelo Zika vírus e/ou induzir uma resposta imune, como uma resposta imune protetora, contra o Zika vírus, podem ser produzidos e/ou purifi- cados ou, de outro modo, isolados por qualquer método adequado co- nhecido na técnica. Os antígenos da presente invenção podem incluir, sem limitação, vírus completo, vírus atenuado, vírus inativado, vírus completamente inativados, proteínas, polipeptídeos (incluindo proteí- nas ativas e epítopos de polipeptídeos individuais dentro das proteí- nas), glicopolipeptídeos, lipopolipeptídeos, peptídeos, polissacarídeos,
conjugados de polissacarídeos, imitações peptídicas e não peptídicas de polissacarídeos e outras moléculas, moléculas pequenas, lipídios, glicolipídios e carboidratos produzidos, derivados, purificados e/ou iso- lados de um Zika vírus. Por exemplo, antígenos adequados podem incluir, sem limitação, polipeptídeos estruturais como C, prM e/ou E e polipeptídeos não estruturais, como NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e/ou NS5 do Zika vírus.
[00145] Numa modalidade, o antígeno da presente invenção é um Zika vírus purificado completamente inativado.
[00146] O antígeno da presente invenção pode ser sintetizado qui- micamente ou enzimaticamente, produzido de forma recombinante, isolado de uma fonte natural ou de uma combinação dos anteriores. Em certas modalidades, os antígenos da presente invenção são pro- duzidos, purificados, isolados e/ou derivados de pelo menos um Zika vírus da presente invenção. Os antígenos da presente invenção po- dem ser purificados, parcialmente purificados ou um extrato bruto. Em algumas modalidades, os antígenos da presente invenção são vírus, como vírus inativados, produzidos conforme descrito na seção acima, intitulada "Produção de vacinas e composições imunogênicas".
[00147] Em certas modalidades, um ou mais antígenos da presente invenção podem ser produzidos cultivando uma célula não humana. As linhas celulares adequadas para a produção de um ou mais antíge- nos da presente invenção podem incluir células de inseto (por exem- plo, qualquer uma das células de mosquito descritas neste documen- to). As linhas celulares adequadas para produção de um ou mais antí- genos da presente invenção podem ser células de origem mamiífera e incluem, mas não estão limitadas a: células VERO (de rins de maca- co), cavalo, vaca (por exemplo, células MDBK), ovelha, cachorro (por exemplo, células MDCK de rins de cães, ATCC CCL34 MDCK (NBL2) ou MDCK 33016, número de depósito DSM ACC 2219 como descrito em WOS7/37001), gato e roedor (por exemplo, células de hamster, tais como células BHK21-F, células HKCC ou células de ovário de hamster chinês (células CHO)) e podem ser obtidas a partir de uma ampla vari- edade de estágios de desenvolvimento, incluindo, por exemplo, adulto, neonatal, fetal e embrião. Em certas modalidades, as células são imor- talizadas (por exemplo, células PERC.6, como descrito nos documen- tos WO 01/38362 e WO 02/40665 e depositadas sob o número de de- pósito ECACC 96022940). Em modalidades preferenciais, as células de mamíferos são utilizadas e podem ser selecionadas a partir de e/ou derivadas de um ou mais dos seguintes tipos de células não limitantes: células de fibroblasto (por exemplo, dérmica, pulmão), células endote- liais (por exemplo, aórtica, coronária, pulmonar, vascular, microvascu- lar dérmica, umbilical), hepatócitos, queratinócitos, células imunes (por exemplo, célula T, célula B, macrófago, NK, dendrítico), células mamá- rias (por exemplo, epitelial), células musculares lisas (por exemplo vascular, aórtica, coronária, arterial, uterina, pericitos brônquicos, cer- vicais, da retina), melanócitos, células neurais (por exemplo, astróci- tos), células da próstata (por exemplo, epitelial, músculo liso), células renais (por exemplo, epitelial, mesangial, túbulo proximal), células es- queléticas (por exemplo, condrócitos, osteoclastos, osteoblastos), cé- lulas musculares (por exemplo, mioblasto, esquelético, liso, brônqui- co), células hepáticas, retinoblastos e células estromais. WOS97/37000 e WOS97/37001 descrevem a produção de células animais e linhas ce- lulares que são capazes de crescer em suspensão e em meio isento de soro e são úteis na produção e antígenos virais. Em certas modali- dades, a célula não humana é cultivada em meio isento de soro.
[00148] Os antígenos polipeptídicos podem ser isolados de fontes naturais usando métodos padrão de purificação de proteínas conheci- dos na técnica, incluindo, entre outros, cromatografia líquida (por exemplo, cromatografia líquida de alto desempenho, cromatografia lí-
quida de proteína rápida, etc.), cromatografia de exclusão por tama- nho, eletroforese em gel (incluindo eletroforese em gel unidimensional, eletroforese em gel bidimensional), cromatografia de afinidade ou ou- tra técnica de purificação. Em muitas modalidades, o antígeno é um antígeno purificado, por exemplo, de cerca de 50% a cerca de 75% puro, de cerca de 75% a cerca de 85% puro, de cerca de 85% a cerca de 90% puro, de cerca de 90% a cerca de 95% puro, de cerca de 95% a cerca de 98% puro, de cerca de 98% a cerca de 99% puro ou supe- rior a 99% puro. A pureza do antígeno purificado pode ser determinada por cromatografia de exclusão por tamanho e a % de pureza corres- ponde à % do pico principal da área total sob a curva. O pico principal do antígeno purificado na cromatografia de exclusão por tamanho po- de ser superior a 85% da área total sob a curva na cromatografia de exclusão por tamanho ou mais de 90% da área total sob a curva na cromatografia de exclusão por tamanho, ou superior a 95% ou superior a 98% ou superior a 99% da área total sob a curva da cromatografia de exclusão por tamanho. Tais resultados são considerados como an- tígeno "purificado" dentro do significado desta invenção.
[00149] De acordo com a descrição acima em relação à pureza, o termo "Zika vírus purificado" significa que o pico principal do Zika vírus purificado na cromatografia de exclusão por tamanho é superior a 85% da área total sob a curva na cromatografia de exclusão por tamanho, ou mais de 90% da área total sob a curva na cromatografia de exclu- são por tamanho ou mais de 95%, mais de 98% ou mais de 99% da área total sob a curva na cromatografia de exclusão por tamanho.
[00150] De acordo com a descrição acima em relação à pureza, o termo "Zika vírus purificado completamente inativado" significa que o pico principal do zika vírus purificado completamente inativado na cromatografia de exclusão por tamanho é superior a 85% da área total sob a curva na cromatografia de exclusão por tamanho, ou mais de
90% da área total sob a curva na cromatografia de exclusão por tama- nho, ou mais de 95%, mais de 98% ou mais de 99% da área total sob a curva na cromatografia de exclusão por tamanho.
[00151] Pode-se empregar técnicas de síntese de peptídeos em fase sólida, onde tais técnicas são conhecidas dos especialistas na técnica. Consultar Jones, The Chemical Synthesis of Peptides (Cla- rendon Press, Oxford) (1994). Geralmente, nesses métodos, um pep- tídeo é produzido através da adição sequencial de unidades monomé- ricas ativadas a uma cadeia peptídica crescente ligada à fase sólida.
[00152] Técnicas de DNA recombinante bem estabelecidas podem ser empregadas para a produção de polipeptídeos, em que, por exem- plo, um construto de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo é introduzida em uma célula hospedeira apropriada (por exemplo, uma célula hospedeira eucarióti- ca crescida como uma entidade unicelular em cultura de células in vi- tro, por exemplo, uma célula de levedura, uma célula de inseto, uma célula de mamífero, etc.) ou uma célula procariótica (por exemplo, crescida em cultura de células in vitro), gerando uma célula hospedeira geneticamente modificada; sob condições de cultura apropriadas, a proteína é produzida pela célula hospedeira geneticamente modifica- da.
[00153] Além das composições imunogênicas de vírus mortas e atenuadas, pode-se usar uma composição imunogênica de subunida- de ou outro tipo de composição imunogênica que apresente ao animal os componentes antigênicos do Zika vírus. O componente antigênico pode ser uma proteína, glicoproteína, proteína conjugada com lipídios ou glicoproteína, uma fração lipídica modificada ou outro componente viral que, quando injetado em um humano, estimula uma resposta imune no ser humano, de modo que o humano desenvolva imunidade protetora contra o zika vírus. Para uma composição imunogênica de subunidade, o vírus pode ser cultivado em células de mamíferos, como descrito acima. A cultura de células pode ser homogeneizada e uma composição imunogênica pode ser isolada por passagem do homoge- nato de cultura de células sobre a coluna apropriada ou através do fil- tro de tamanho de poro apropriado ou por centrifugação do homogena- to de cultura de células.
[00154] Se o componente antigênico é uma proteína, pode-se iso- lar o ácido nucleico que codifica essa proteína e gerar uma composi- ção imunogênica que contém esse ácido nucleico isolado. O ácido nu- cleico que codifica o componente antigênico pode ser colocado em um plasmídeo a jusante de uma sequência de sinal de um promotor euca- riótico. Esse plasmídeo pode conter um ou mais marcadores selecio- náveis e ser transfectado para um organismo procariótico atenuado, como Salmonella spp., Shigella spp. ou outras bactérias adequadas. À bactéria pode então ser administrada ao ser humano de modo que ele possa gerar uma resposta imune protetora ao componente antigênico. Alternativamente, o ácido nucleico que codifica o componente antigê- nico pode ser colocado a jusante de um promotor procariótico, ter um ou mais marcadores selecionáveis e ser transfectado para um orga- nismo procariótico atenuado, como Salmonella spp., Shigella spp. ou outras bactérias adequadas. A bactéria pode então ser administrada ao sujeito humano eucariótico para o qual é desejada a resposta imu- ne ao antígeno de interesse. Consultar, por exemplo, Pat. No.
6.500.419.
[00155] Para uma composição imunogênica de subunidade, o ácido nucleico que codifica um componente antigênico proteico de um Zika vírus pode ser clonado em um plasmídeo, como os descritos no Nú- mero da Publicação do Pedido Internacional de Patente WO 00/32047 (Galen) e no Número da Publicação do Pedido Internacional de Paten- te WO 02/083890 (Galen). Em seguida, o plasmídeo pode ser trans-
fectado para bactérias e as bactérias podem produzir a proteína anti- gênica desejada. Pode-se isolar e purificar a proteína antigênica dese- jada por uma variedade de métodos descritos em ambos os pedidos de patente. Inativação de vírus
[00156] Certos aspectos da presente invenção referem-se a vacinas contra o Zika vírus e composições imunogênicas contendo um ou mais antígenos de um Zika vírus. As vacinas e/ou composições imunogêni- cas da presente invenção podem incluir um vírus purificado, um vírus completo, um vírus recombinante, um vírus vivo completamente ate- nuado ou, preferencialmente, um vírus completamente inativado ou subunidades, polipeptídeos e/ou antígenos de um vírus inativado. Co- mo tal, certas modalidades da presente invenção se referem a vacinas contra o Zika vírus e/ou composições imunogênicas contendo um ou mais antígenos de pelo menos um Zika vírus inativado.
[00157] Os métodos para inativar ou matar vírus para destruir sua capacidade de infectar células de mamíferos, mas não destruir a estru- tura do vírus, são conhecidos na técnica. Tais métodos incluem meios químicos e físicos. Os meios adequados para inativar um vírus inclu- em, sem limitação, tratamento com uma quantidade eficaz de um ou mais agentes selecionados a partir de detergentes, formalina (também referida neste documento como "formaldeído"), beta-propiolactona (BPL), etilamina binária (BEI), acetil etilenoimina, calor, radiação ele- tromagnética, radiação de raios-x, radiação gama, radiação ultravioleta (radiação UV), radiação UV-A, radiação UV-B, radiação UV-C, azul de metileno, psoraleno, carboxifullereno (C60) e qualquer combinação de qualquer um deles. Quando é feita referência neste documento a uma concentração de formaldeído, refere-se à concentração de formaldeído (e não à concentração de formalina). Por conseguinte, uma "concen- tração de formaldeído de 0,01% (p/v)" refere-se a 0,01% (p/v) de for-
maldeído, e nenhuma correção adicional dessa concentração para a concentração de formaldeído na solução estoque de formalina (que normalmente contém 37% de formaldeído por massa) deve ser feita. Por exemplo, essa concentração de formaldeído na preparação de ví- rus pode ser obtida diluindo formalina a uma solução de trabalho com um teor de formaldeído de 1,85% (p/v), que é adicionalmente diluído para a concentração necessária quando é misturado com a prepara- ção de vírus como a preparação do Zika vírus.
[00158] Em certas modalidades da presente invenção, pelo menos um vírus é quimicamente inativado. Os agentes para inativação quími- ca e métodos de inativação química são bem conhecidos na técnica e descritos neste documento. Em algumas modalidades, pelo menos um vírus é quimicamente inativado com um ou mais de BPL, formalina ou BEI. Em certas modalidades em que pelo menos um vírus é quimica- mente inativado com BPL, o vírus pode conter uma ou mais modifica- ções. Em algumas modalidades, uma ou mais modificações podem incluir um ácido nucleico modificado. Em algumas modalidades, o áci- do nucleico modificado é um ácido nucleico alquilado. Em outras mo- dalidades, uma ou mais modificações podem incluir um polipeptídeo modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo modificado con- tém um resíduo de aminoácido modificado, incluindo um ou mais de uma cisteína modificada, metionina, histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, tirosina, lisina, serina e treonina.
[00159] Em certas modalidades em que pelo menos um vírus é quimicamente inativado com formalina, o vírus pode conter uma ou mais modificações. Em algumas modalidades, uma ou mais modifica- ções podem incluir um polipeptídeo modificado. Em algumas modali- dades, uma ou mais modificações podem incluir um polipeptídeo reti- culado. Em algumas modalidades em que pelo menos um vírus é qui- micamente inativado com formalina, a vacina ou composição imuno-
gênica inclui adicionalmente formalina. Em certas modalidades em que pelo menos um vírus é quimicamente inativado com BEI, o vírus pode conter uma ou mais modificações. Em algumas modalidades, uma ou mais modificações podem incluir um ácido nucleico modificado. Em algumas modalidades, o ácido nucleico modificado é um ácido nuclei- co alquilado.
[00160] Em algumas modalidades em que pelo menos um vírus é quimicamente inativado com formalina, qualquer formalina residual que não reagiu pode ser neutralizada com metabissulfito de sódio, po- de ser dialisada e/ou pode ser trocada de tampão para remover a for- malina residual que não reagiu. Em algumas modalidades, o metabis- sulfito de sódio é adicionado em excesso. Em algumas modalidades, as soluções podem ser misturadas usando um misturador, como um misturador estático em linha, e subsequentemente filtradas ou purifi- cadas adicionalmente (por exemplo, usando um sistema de filtração de fluxo cruzado).
[00161] Certas modalidades da presente invenção referem-se a um método para inativar uma preparação de Zika vírus. Em algumas mo- dalidades, o método envolve (a) isolar, seguido pela purificação da preparação do Zika vírus de uma ou mais células não humanas que são usadas para produzir a preparação do vírus e (b) tratar a prepara- ção do vírus com uma quantidade eficaz de formalina.
[00162] Certas modalidades da presente invenção referem-se a um método para inativar uma preparação de Zika vírus. Em algumas mo- dalidades, o método compreende: (a) isolar a preparação do Zika vírus de uma ou mais célu- las cultivadas in vitro, em que as células são usadas para produzir a preparação do Zika vírus, em que o isolamento da preparação do Zika vírus compreende uma ou mais etapas selecionadas dentre: (i) filtra- ção em profundidade, (ii) troca de tampão e/ou diluição; (iii) cromato-
grafia de troca iônica; e (b) tratamento da preparação do Zika vírus com formaldeí- do, em que o resultado numérico da multiplicação da concentração de formaldeído conforme medido em % (p/v) com o período de incubação com formaldeído, medido em dias, é de 0,025 a 0,5.
[00163] Em certas modalidades, o tratamento com uma quantidade eficaz de formalina inclui, sem limitação, o tratamento com formalina em uma quantidade que varia de cerca de 0,001% v/v a cerca de 3,0% vlv. Por exemplo, o tratamento com uma quantidade eficaz de formali- na pode incluir o tratamento com formalina em uma quantidade que varia de cerca de 0,001% a cerca de 3,0% v/v, cerca de 0,005% a cer- ca de 2,0% v/v ou cerca de 0,01% a cerca de 1,0% v/v, ou numa quan- tidade de cerca de 0,001%, cerca de 0,0025%, cerca de 0,005%, cerca de 0,0075%, cerca de 0,01%, cerca de 0,02%, cerca de 0,03%, cerca de 0,04%, cerca de 0,05%, cerca de 0,06%, cerca de 0,07%, cerca de 0,08%, cerca de 0,09%, cerca de 0,1%, cerca de 0,2%, cerca de 0,3%, cerca de 0,4%, cerca de 0,5%, cerca de 0,6%, cerca de 0,7%, cerca de 0,8%, cerca de 0,9%, cerca de 1,0%, cerca de 1,25%, cerca de 1,5%, cerca de 1,75%, cerca de 2,0%, cerca de 2,25%, cerca de 2,5%, cerca de 2,75% ou cerca de 3,0% v/v.
[00164] Em certas modalidades do método, a preparação do Zika vírus é tratada com formalina a uma temperatura que varia de cerca de 2ºC a cerca de 42ºC. Por exemplo, a preparação do Zika vírus pode ser tratada com formalina a uma temperatura que varia de cerca de 2ºC a cerca de 42ºC, cerca de 2ºC a cerca de 8ºC, cerca de 15ºC a cerca de 37ºC, cerca de 17ºC a cerca de 27ºC, cerca de 20ºC a cerca de 25ºC, ou a uma temperatura de cerca de 2ºC, cerca de 4ºC, cerca de 8ºC, cerca de 10ºC, cerca de 15ºC, cerca de 17ºC, cerca de 18ºC, cerca de 19ºC, cerca de 20ºC, cerca de 21ºC, cerca de 22ºC, cerca de 23ºC, cerca de 24ºC, cerca de 25ºC, cerca de 26ºC, cerca de 27ºC,
cerca de 28ºC, cerca de 29ºC, cerca de 30ºC, cerca de 37ºC ou cerca de 42ºC. Em algumas modalidades, a preparação do Zika vírus é tra- tada com formalina à temperatura ambiente.
[00165] Em algumas modalidades, a preparação do Zika vírus é tra- tada com formalina por pelo menos cerca de 1 dia. Por exemplo, a preparação do Zika vírus pode ser tratada com formalina por pelo me- nos cerca de 1 dia, pelo menos cerca de 2 dias, pelo menos cerca de 3 dias, pelo menos cerca de 4 dias, pelo menos cerca de 5 dias, pelo menos cerca de 6 dias, e por exemplo, por não mais de 15 dias, por exemplo, de 5 a 15 dias. Por exemplo, a preparação do Zika vírus po- de ser tratada com formalina por pelo menos cerca de 7 dias, pelo menos cerca de 8 dias, pelo menos cerca de 9 dias, pelo menos cerca de 10 dias, pelo menos cerca de 11 dias, pelo menos cerca de 12 dias, pelo menos pelo menos cerca de 13 dias, pelo menos cerca de 14 di- as, pelo menos cerca de 15 dias, pelo menos cerca de 16 dias, pelo menos cerca de 17 dias, pelo menos cerca de 18 dias, pelo menos cerca de 19 dias, pelo menos cerca de 20 dias, pelo menos cerca de 21 dias, pelo menos cerca de 22 dias, pelo menos cerca de 23 dias, pelo menos cerca de 24 dias, pelo menos cerca de 25 dias, pelo me- nos cerca de 26 dias, pelo menos cerca de 27 dias, pelo menos cerca de 28 dias, pelo menos cerca de 29 dias, pelo menos cerca de 30 dias ou mais. Em algumas modalidades, a preparação do Zika vírus é tra- tada com formalina por pelo menos cerca de 9 dias. Em algumas mo- dalidades, a preparação do Zika vírus é tratada com formalina por pelo menos cerca de 11 dias. Em algumas modalidades, a preparação do Zika vírus é tratada com formalina por pelo menos cerca de 14 dias. Em algumas modalidades, a preparação do Zika vírus é tratada com formalina por pelo menos cerca de 20 dias. Em algumas modalidades, a preparação do Zika vírus é tratada com formalina por pelo menos cerca de 30 dias.
[00166] Em algumas modalidades, a preparação do Zika vírus é tra- tada com formalina 0,005 a 0,02% (p/v) por oito a doze dias a uma temperatura de 15ºC a 30ºC. Em algumas modalidades, a preparação do Zika vírus é tratada com formalina 0,005 a 0,02% (p/v) por nove a onze dias a uma temperatura de 15ºC a 30ºC. Em algumas modalida- des, a preparação do Zika vírus é tratada com formalina 0,005 a 0,02% (p/v) por dez a dez dias a uma temperatura de 15ºC a 30ºC. Em algu- mas modalidades, a preparação do Zika vírus é tratada com formalina 0,008 a 0,015% (p/v) por oito a doze dias a uma temperatura de 15ºC a 30ºC. Em algumas modalidades, a preparação do Zika vírus é trata- da com formalina 0,008 a 0,015% (p/v) por nove a onze dias a uma temperatura de 15ºC a 30ºC. Em algumas modalidades, a preparação do Zika vírus é tratada com formalina 0,008 a 0,015% (p/v) por dez a dez dias a uma temperatura de 15ºC a 30ºC. Em algumas modalida- des, a preparação do Zika vírus é tratada com formalina 0,01% (p/v) por oito a doze dias a uma temperatura de 15ºC a 30ºC. Em algumas modalidades, a preparação do Zika vírus é tratada com formalina 0,01% (p/v) por nove a onze dias a uma temperatura de 15ºC a 30ºC. Em algumas modalidades, a preparação do Zika vírus é tratada com formalina 0,01% (p/v) por dez dias a uma temperatura de 15ºC a 30ºC.
[00167] Em algumas modalidades, a preparação do Zika vírus é tra- tada com formalina 0,005 a 0,02% (p/v) por oito a doze dias a uma temperatura de 18ºC a 25ºC. Em algumas modalidades, a preparação do Zika vírus é tratada com formalina 0,005 a 0,02% (p/v) por nove a onze dias a uma temperatura de 18ºC a 25ºC. Em algumas modalida- des, a preparação do Zika vírus é tratada com formalina 0,005 a 0,02% (p/v) por dez dias a uma temperatura de 18ºC a 25ºC. Em algumas modalidades, a preparação do Zika vírus é tratada com formalina 0,008 a 0,015% (p/v) por oito a doze dias a uma temperatura de 18ºC a 25ºC. Em algumas modalidades, a preparação do Zika vírus é trata-
da com formalina 0,008 a 0,015% (p/v) por nove a onze dias a uma temperatura de 18ºC a 25ºC. Em algumas modalidades, a preparação do Zika vírus é tratada com formalina 0,008 a 0,015% (p/v) por dez di- as a uma temperatura de 18ºC a 25ºC. Em algumas modalidades, a preparação do Zika vírus é tratada com formalina 0,01% (p/v) por oito a doze dias a uma temperatura de 18ºC a 25ºC. Em algumas modali- dades, a preparação do Zika vírus é tratada com formalina 0,01% (p/v) por nove a onze dias a uma temperatura de 18ºC a 25ºC. Em algumas modalidades, a preparação do Zika vírus é tratada com formalina 0,01% (p/v) por dez dias a uma temperatura de 18ºC a 25ºC.
[00168] Em algumas modalidades, a preparação do Zika vírus é tra- tada com formalina 0,005 a 0,02% (p/v) por oito a doze dias a uma temperatura de 22ºC. Em algumas modalidades, a preparação do Zika vírus é tratada com formalina 0,005 a 0,02% (p/v) por nove a onze dias a uma temperatura de 22ºC. Em algumas modalidades, a preparação do Zika vírus é tratada com formalina 0,005 a 0,02% (p/v) por dez dias a uma temperatura de 22ºC. Em algumas modalidades, a preparação do Zika vírus é tratada com formalina 0,008 a 0,015% (p/v) por oito a doze dias a uma temperatura de 22ºC. Em algumas modalidades, a preparação do Zika vírus é tratada com formalina 0,008 a 0,015% (p/v) por nove a onze dias a uma temperatura de 22ºC. Em algumas moda- lidades, a preparação do Zika vírus é tratada com formalina 0,008 a 0,015% (p/v) por dez dias a uma temperatura de 22ºC. Em algumas modalidades, a preparação do Zika vírus é tratada com formalina 0,01% (p/v) por oito a doze dias a uma temperatura de 22ºC. Em al- gumas modalidades, a preparação do Zika vírus é tratada com forma- lina 0,01% (p/v) por nove a onze dias a uma temperatura de 22ºC. Em algumas modalidades, a preparação do Zika vírus é tratada com for- malina 0,01% (p/v) por dez dias a uma temperatura de 22ºC.
[00169] Em algumas modalidades, o resultado numérico da multipli-
cação da concentração de formaldeído com o período de incubação com formaldeído é de 0,05 a 0,25. Em algumas modalidades, o resul- tado numérico da multiplicação da concentração de formaldeído, me- dida em% (p/v), com o período de incubação com formaldeído, medida em dias, é de 0,075 a 0,15. Em algumas modalidades, o resultado numérico da multiplicação da concentração de formaldeído com o pe- ríodo de incubação com formaldeído é de 0,1.
[00170] Em algumas modalidades, a concentração de formaldeído é de 0,005% (p/v) a 0,02% (p/v). Em algumas modalidades, a concen- tração de formaldeído é de 0,0075% (p/v) a 0,015% (p/v). Em algumas modalidades, a concentração de formaldeído é de 0,01% (p/v).
[00171] Em algumas modalidades, o resultado numérico da multipli- cação da concentração de formaldeído medida em % (p/v) com o perí- odo de incubação com formaldeído medido em dias é de 0,025a0,5e a concentração de formaldeído é de 0,005% (p/v) a 0,02% (p/v). Em algumas modalidades, o resultado numérico da multiplicação da con- centração de formaldeído medida com o período de incubação com formaldeído é de 0,025 a 0,5 e a concentração de formaldeído é de 0,0075% (p/v) a 0,015% (p/v). Em algumas modalidades, o resultado numérico da multiplicação da concentração de formaldeído com o pe- ríodo de incubação com formaldeído é de 0,025 a 0,5 e a concentra- ção de formaldeído é de 0,01% (p/v).
[00172] Em algumas modalidades, o resultado numérico da multipli- cação da concentração de formaldeído medida em % (p/v) com o perí- odo de incubação com formaldeído medido em dias é de 0,05 a 0,25 e a concentração de formaldeído é de 0,005% (p/v) a 0,02% (p/v). Em algumas modalidades, o resultado numérico da multiplicação da con- centração de formaldeído medida com o período de incubação com formaldeído é de 0,05 a 0,25 e a concentração de formaldeído é de 0,0075% (p/v) a 0,015% (p/v). Em algumas modalidades, o resultado numérico da multiplicação da concentração de formaldeído com o pe- ríodo de incubação com formaldeído é de 0,05 a 0,25 e a concentra- ção de formaldeído é de 0,01% (p/v).
[00173] Em algumas modalidades, o resultado numérico da multipli- cação da concentração de formaldeído medida em % (p/v) com o perí- odo de incubação com formaldeído medido em dias é de 0,075 a 0,15 e a concentração de formaldeído é de 0,005% (p/v) a 0,02% (p/v). Em algumas modalidades, o resultado numérico da multiplicação da con- centração de formaldeído medida com o período de incubação com formaldeído é de 0,075 a 0,15 e a concentração de formaldeído é de 0,0075% (p/v) a 0,015% (p/v). Em algumas modalidades, o resultado numérico da multiplicação da concentração de formaldeído com o pe- ríodo de incubação com formaldeído é de 0,075 a 0,15 e a concentra- ção de formaldeído é de 0,01% (p/v).
[00174] Em algumas modalidades, o resultado numérico da multipli- cação da concentração de formaldeído medida em % (p/v) com o perí- odo de incubação com formaldeído medido em dias é de 0,1 e a con- centração de formaldeído é de 0,005% (p/v) a 0,02% (p/v). Em algu- mas modalidades, o resultado numérico da multiplicação da concen- tração de formaldeído com o período de incubação com formaldeído é de 0,1 e a concentração de formaldeído é de 0,0075% (p/v) a 0,015% (p/v). Em algumas modalidades, o resultado numérico da multiplicação da concentração de formaldeído com o período de incubação com formaldeído é de 0,1 e a concentração de formaldeído é de 0,01% (pv).
[00175] Em algumas modalidades, o resultado numérico da multipli- cação da concentração de formaldeído medida em% (p/v) com o perí- odo de incubação com formaldeído medido em dias é de 0,025a0,5 e o período de incubação com formaldeído é de oito a doze dias. Em algumas modalidades, o resultado numérico da multiplicação da con-
centração de formaldeído com o período de incubação com formaldeí- do é de 0,025 a 0,5 e o período de incubação com formaldeído é de nove a onze dias. Em algumas modalidades, o resultado numérico da multiplicação da concentração de formaldeído com o período de incu- bação com formaldeído é de 0,025 a 0,5 e o período de incubação com formaldeído é de dez dias.
[00176] Em algumas modalidades, o resultado numérico da multipli- cação da concentração de formaldeído medida em% (p/v) com o perí- odo de incubação com formaldeído medido em dias é de 0,05 a 0,25 e o período de incubação com formaldeído é de oito a doze dias. Em algumas modalidades, o resultado numérico da multiplicação da con- centração de formaldeído com o período de incubação com formaldeí- do é de 0,05 a 0,25 e o período de incubação com formaldeído é de nove a onze dias. Em algumas modalidades, o resultado numérico da multiplicação da concentração de formaldeído com o período de incu- bação com formaldeído é de 0,05 a 0,25 e o período de incubação com formaldeído é de dez dias.
[00177] Em algumas modalidades, o resultado numérico da multipli- cação da concentração de formaldeído medida em% (p/v) com o perí- odo de incubação com formaldeído medido em dias é de 0,075 a 0,15 e o período de incubação com formaldeído é de oito a doze dias. Em algumas modalidades, o resultado numérico da multiplicação da con- centração de formaldeído com o período de incubação com formaldeí- do é de 0,075 a 0,15 e o período de incubação com formaldeído é de nove a onze dias. Em algumas modalidades, o resultado numérico da multiplicação da concentração de formaldeído com o período de incu- bação com formaldeído é de 0,075 a 0,15 e o período de incubação com formaldeído é de dez dias.
[00178] Em algumas modalidades, o resultado numérico da multipli- cação da concentração de formaldeído medida em % (p/v) com o perí-
odo de incubação com formaldeído medido em dias é de 0,1 e o perí- odo de incubação com formaldeído é de oito a doze dias. Em algumas modalidades, o resultado numérico da multiplicação da concentração de formaldeído com o período de incubação com formaldeído é de 0,1 e o período de incubação com formaldeído é de nove a onze dias. Em algumas modalidades, o resultado numérico da multiplicação da con- centração de formaldeído com o período de incubação com formaldeí- do é de 0,1 e o período de incubação com formaldeído é de dez dias.
[00179] Em algumas modalidades, o método envolve adicionalmen- te a neutralização de formalina não reagida com uma quantidade efi- caz de metabissulfito de sódio. Em algumas modalidades, a quantida- de eficaz de metabissulfito de sódio varia de cerca de 0,01 mM a cerca de 100 mM. Por exemplo, o metabissulfito de sódio pode ser adiciona- do a uma concentração eficaz de cerca de 0,01 mM a cerca de 100 MM, de cerca de 0,1 mM a cerca de 50 mM, de cerca de 0,5 mM a cerca de 20 mM ou de cerca de 1 mM a cerca de 10 mM, ou a uma concentração de cerca de 0,01mMM, cerca de 0,05mM, cerca de 0,1mMM, cerca de 0,25mM, cerca de 0,9mM, cerca de 0,75mM, cerca de 1ImM, cerca de 2mM, cerca de 3mM, cerca de 4mM, cerca de 5SMM, cerca de 6mM, cerca de 7mM, cerca de 8mM, cerca de 9mM, cerca de 10mM, cerca de 20mM, cerca de 30mM cerca de 40mM, cerca de 5OmM, cerca de 75mM ou cerca de 100mM. Em algumas modalida- des, a formalina é neutralizada com cerca de 2 mM de metabissulfito de sódio.
[00180] Em algumas modalidades, o método envolve (a) isolamento seguido pela purificação da preparação do Zika vírus de uma ou mais células não humanas que são usadas para produzir a preparação do vírus; (b) tratar a preparação de vírus com uma quantidade eficaz de formalina; (c) neutralizar a preparação do vírus com uma quantidade eficaz de metabissulfito de sódio; e (d) purificação da preparação de vírus neutralizado. Qualquer método de purificação de uma prepara- ção de vírus conhecida na técnica pode ser empregado, incluindo, sem limitação, o uso de filtração por fluxo cruzado (CFF), cromatografia multimodal, cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia de troca catiônica e/ou cromatografia de troca aniônica. Em algumas mo- dalidades, a preparação do vírus neutralizado é purificada por filtração por fluxo cruzado (CFF). Em algumas modalidades, a preparação de vírus é purificada em um alto grau em uma quantidade que é de cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95% cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou mais.
[00181] Certas modalidades da presente invenção se referem, por- tanto, a vacinas contra o Zika vírus e/ou composições imunogênicas contendo um Zika vírus purificado completamente inativado. O termo "Zika vírus completamente inativado", conforme utilizado neste docu- mento, pretende compreender um Zika vírus, que foi tratado com um método de inativação, como tratamento com uma quantidade eficaz de formalina. Considera-se que esse tratamento não destrói a estrutura do vírus, ou seja, não destrói a estrutura secundária, terciária ou qua- ternária e os epítopos imunogênicos do vírus, mas o Zika vírus inativa- do não é mais capaz de infectar células hospedeiras que podem ser infectadas com um Zika vírus que não foi inativado. Numa modalidade, o Zika vírus inativado não é mais capaz de infectar células VERO e exercer um efeito citopático nas células VERO.
[00182] O método para determinar a integridade da inativação de uma preparação para o Zika vírus compreende as etapas de: (i) inocular células de inseto com uma preparação do Zika vírus que foi submetido a uma etapa de inativação e incubar as células de inseto por um primeiro período de tempo, produzindo assim um so-
brenadante de célula de inseto; (ii) inocular células de mamífero com o sobrenadante de célula de inseto produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação do vírus contém um vírus residual de replicação que produz um efeito citopático nas células dos mamíferos.
[00183] Em algumas modalidades, o método para determinar a completude da inativação de uma preparação para o Zika vírus com- preende as etapas de: (i) inocular células C6/36 com uma preparação do Zika ví- rus que foi submetido a uma etapa de inativação e incubar as células C6/36 por um primeiro período de tempo, produzindo assim um sobre- nadante de células C6/36; (ii) inocular células Vero com o sobrenadante de células C6/36 produzido em (i) e incubar as células Vero por um segundo pe- ríodo de tempo; e (iii) determinar se a preparação do vírus contém um vírus residual de replicação que produz um efeito citopático nas células Ve- ro.
[00184] No final do segundo período de tempo, é determinado se a preparação do vírus tem um efeito citopático nas células dos mamiífe- ros. Um efeito citopático é qualquer alteração na estrutura celular cau- sada por invasão viral, infecção e germinação das células durante a replicação viral. No método da presente invenção, o efeito citopático é determinado por uma mudança na cor do meio de rosa para laranja ou amarelo, se as células são cultivadas em um meio contendo vermelho de fenol ou por um exame microscópico das células de mamíferos. Se o exame microscópico das células dos mamíferos mostrar que as célu- las se arredondam, começam a se afastar do vaso de cultura de teci-
dos (placa, poço ou frasco) ou desaparecem do prato/frasco de cultura de tecidos, considera-se que existe um efeito citopático presente. Ou- tros indícios de um efeito citopático incluem a fusão de células adja- centes para formar sincícios e o aparecimento de corpos de inclusão nuclear ou citoplasmática.
[00185] — Como discutido acima, o método divulgado neste documen- to tem um limite muito baixo de detecção. Com esse método, um con- teúdo de vírus menor que 1,0 TCID50 pode ser detectado. Em algu- mas modalidades, um conteúdo de vírus inferior a 0,8 TCID50 pode ser detectado. Em algumas modalidades, um conteúdo de vírus inferi- or a 0,5 TCID50 pode ser detectado. Em algumas modalidades, um conteúdo de vírus inferior a 0,2 TCID50 pode ser detectado. Em algu- mas modalidades, um conteúdo de vírus de menos que 0,1 TCID50 pode ser detectado.
[00186] Para a presente invenção, o termo "Zika vírus completa- mente inativado" refere-se, portanto, em particular a um Zika vírus ob- tido a partir de um método em que o Zika vírus é tratado com formalina em uma quantidade que varia de cerca de 0,001% v/v a cerca de 3,0% vv de 5 a 15 dias a uma temperatura que varia de cerca de 15ºC a cerca de 37ºC, em particular 0,02% v/v formaldeído por 10 dias a 22ºC ou em particular 0,01% v/v formaldeído por 10 dias a 22ºC. A definição visa abranger o Zika vírus obtido a partir de um método em que o Zika vírus é tratado com formalina em uma quantidade que varia de cerca de 0,001% v/v a cerca de 3,0% v/v de 5 a 15 dias a uma temperatura que varia de cerca de 15ºC a cerca de 37ºC, em particular 0,02% v/v formaldeído por 10 dias a 22ºC ou em particular 0,01% v/v formaldeído por 10 dias a 22ºC, mas não deve ser entendido como limitado a es- ses, já que outros métodos podem levar ao mesmo Zika vírus comple- tamente inativado. Em certas modalidades, no entanto, o Zika vírus é obtido a partir de um método em que o Zika vírus é tratado com forma-
lina em uma quantidade que varia de cerca de 0,001% v/v a cerca de 3,0% v/v de 5 a 15 dias a uma temperatura que varia de cerca de 15ºC a cerca de 37ºC, em particular 0,02% v/v formaldeído por 10 dias a 22ºC ou em particular 0,01% v/v formaldeído por 10 dias a 22ºC.
[00187] Alternativamente, dentro da presente invenção "Zika vírus completamente inativado" refere-se, assim, a um Zika vírus que foi tes- tado pelo método que compreende as etapas (i) a (iii) e não mostra nenhuma formação de placa na etapa (iii): (i) inocular células de inseto com uma preparação do Zika vírus que foi submetido a uma etapa de inativação e incubar as células de inseto por um primeiro período de tempo, produzindo assim um so- brenadante de célula de inseto; (ii) inocular células de mamífero com o sobrenadante de célula de inseto produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (ili) determinar se a preparação do vírus contém um vírus residual de replicação que produz um efeito citopático nas células dos mamíferos.
[00188] O termo "Zika vírus purificado completamente inativado" refere-se, assim, a um Zika vírus que pode ser obtido ou obtido a partir de um método em que o Zika vírus é tratado com formalina em uma quantidade que varia de cerca de 0,001% v/v a cerca de 3,0% v/v de 5 a 15 dias a uma temperatura que varia de cerca de 15ºC a cerca de 37ºC, em particular 0,02% v/v formaldeído por 10 dias a 22ºC ou em particular 0,01% v/v formaldeído por 10 dias a 22ºC, ou alternativa- mente por o método acima mencionado para determinar a completude da inativação e, se necessário, foi submetido a um processo de purifi- cação. O Zika vírus purificado tem, portanto, um conteúdo mais baixo de proteínas da célula hospedeira, como proteínas da célula Vero, e DNA da célula hospedeira, como o DNA da célula Vero, do que um
Zika vírus não purificado. O termo "Zika vírus purificado completamen- te inteiro inativado" refere-se, assim, a um Zika vírus que pode ser ob- tido ou obtido a partir de um método em que o Zika vírus é tratado com formalina em uma quantidade que varia de cerca de 0,001% v/v a cer- ca de 3,0% v/v de 5 a 15 dias a uma temperatura que varia de cerca de 15ºC a cerca de 37ºC, em particular 0,02% v/v formaldeído por 10 dias a 22ºC ou em particular 0,01% v/v formaldeído por 10 dias a 22ºC, ou alternativamente por o método acima mencionado para de- terminar a completude da inativação e fornece um pico principal de pelo menos 85% da área total sob a curva na cromatografia de exclu- são por tamanho.
[00189] Em certas modalides, o Zika vírus purificado completamen- te inativado é adicionalmente um isolado clonal obtido ou obtido por purificação de placas.
[00190] Em certas dessas modalidades, o Zika vírus purificado completamente inativado, que é opcionalmente além disso um isolado clonal obtido ou obtido por purificação de placa, contém uma mutação na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou na posição correspondente à posi- ção 98 da SEQ ID NO:1 e não contém nenhuma mutação dentro da proteína do envelope E. Em certas modalidades, a mutação é uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou na posição cor- respondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, o Zika vírus é derivado da cepa PRVABCS59. Em certas modalidades, o Zika vírus é derivado da cepa PRVABC59 compreendendo o sequen- ciamento genômico de acordo com a SEQ ID NO: 2.
[00191] Tais vacinas e/ou composições imunogênicas da presente invenção contendo um ou mais antígenos provenientes de um Zika vírus inativado descrito neste documento podem ser úteis para tratar ou prevenir a infecção pelo Zika vírus em um sujeito humano que ne- cessite do mesmo e/ou induzir uma resposta imune, como uma res-
posta imune protetora, contra o Zika vírus em um sujeito humano que necessite do mesmo.
[00192] Outros aspectos da presente invenção referem-se à vacina ou composição imunogênica compreendendo um Zika vírus inativado que é obtido pelos métodos divulgados neste documento. Estas vaci- nas ou composições imunogênicas têm um conteúdo particularmente baixo de formaldeído residual.
[00193] O termo "teor residual de formaldeído" refere-se à quanti- dade de formaldeído que ainda está presente na vacina ou na compo- sição imunogênica após o Zika vírus ter sido inativado e a preparação ter sido neutralizada e opcionalmente sujeita a uma ou mais etapas adicionais de purificação ou filtração. De acordo com a farmacopeia dos EUA, o limite superior para formaldeído residual em vacinas com- preendendo bactérias ou vírus inativados é de 0,02%, o que equivale a 100 ug/ml de formaldeído.
[00194] O teor residual de formaldeído pode ser determinado por qualquer método conhecido daquele versado na técnica. Um método adequado é descrito em EMEA, VICH Topic GL25, Biologicals: Testing of formaldehy residual, 30 de abril de 2002 e envolve o uso de cloridra- to de metilbenzotiazolona hidrazona (MBTH). Outros métodos incluem titulação de acetil acetona, titulação de cloreto férrico e o teste básico de fucsina. Um método particularmente adequado é descrito neste do- cumento.
[00195] A vacina ou composição imunogênica está em uma forma que pode ser administrada a um sujeito e tipicamente contém um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[00196] O conteúdo de formaldeído residual na vacina ou na com- posição imunogênica é inferior a 50 pg/ml. Em uma modalidade, o teor residual de formaldeído na vacina ou na composição imunogênica é de menos que 45 ug/ml, menos que 40 pg/ml, menos que 35 pg/ml, me-
nos que 30 pg/ml, menos que 25 pg/ml, menos que 20 pg/ml, menos que 15 pg/ml ou menos que 10 pg/ml. Em uma modalidade, o teor re- sidual de formaldeído na vacina ou na composição imunogênica é me- nos que 9,5 ug/ml, menos que 9 ug/ml, menos que 8,5 ug/ml, menos que 8 ug/ml, menos que 7,5 ug/ml, menos que 7 ug/ml, menos que 6,5 pg/ml, menos que 6 pg/ml, menos que 5,5 ug ml, menos que 5 pg/ml, menos que 4,5 pg/ml, menos que 4 pg/ml, menos que a 3,5 pg/ml, menos que 3 ug/ml, menos que 2,5 pg/ml, menos que 2 ug/ml, menos que 1,5 ug/ml, menos que 1 ug/ml ou menos que 0,5 ug/ml. Numa modalidade, o conteúdo residual de formaldeído na vacina ou na com- posição imunogênica é menos que 0,5 pg/ml. Métodos para determinar o teor residual de formaldeído
[00197] Em outros aspectos, a presente invenção refere-se um mé- todo para determinar o teor residual de formaldeído em uma vacina ou composição imunogênica compreendendo um vírus inativado, com- preendendo as etapas de: (a) fornecer uma composição compreendendo um vírus que foi tratado com formaldeído; (b) mistura da composição de (a) com ácido fosfórico e 2,4- dinitrofenil-hidrazina (DNPH), fornecendo assim uma mistura; (c) incubar a mistura de (b) sob condições adequadas; e (d) analisar a mistura quanto à presença de formaldeído residual.
[00198] OusodoDNPH como reagente de detecção oferece as se- guintes vantagens: (1) alta sensibilidade, (2) detecção por UV do for- maldeído derivado e (3) preparação de amostra em uma etapa sem aquecimento. O presente método é particularmente adequado para detectar formaldeído residual em vacinas contendo um adjuvante co- mo o hidróxido de alumínio. O método foi validado em termos de es- pecificidade, linearidade, precisão, repetibilidade, robustez e estabili-
dade, de acordo com as diretrizes Q2 da Conferência Internacional sobre Harmonização (ICH). Em algumas modalidades, 50 partes da composição compreendendo um vírus que foi tratado com formaldeído são misturadas com 1 parte de 15 a 25% (v/v) de ácido fosfórico e 2,5 partes de 0,9 a 1,1 mg/ml de DNPH. Em algumas modalidades, 50 partes da composição compreendendo um vírus que foi tratada com formaldeído são misturadas com 1 parte de ácido fosfórico 20% (v/v) e 2,5 partes de 1,0 mg/ml de DNPH.
[00199] Em algumas modalidades, a mistura da composição com- preendendo um vírus que foi tratada com formaldeído com ácido fosfó- rico e DNPH é incubada a uma temperatura de 18ºC a 30ºC. Em al- gumas modalidades, a mistura da composição compreendendo um vírus que foi tratada com formaldeído com ácido fosfórico e DNPH é incubada a uma temperatura de 20ºC a 25ºC. Em algumas modalida- des, a mistura da composição compreendendo um vírus que foi tratada com formaldeído com ácido fosfórico e DNPH é incubada a uma tem- peratura de 22ºC.
[00200] Em algumas modalidades, a mistura da composição com- preendendo um vírus que foi tratado com formaldeído com ácido fosfó- rico e DNPH é incubada durante 10 a 30 minutos. Em algumas moda- lidades, a mistura da composição compreendendo um vírus que foi tratado com formaldeído com ácido fosfórico e DNPH é incubada du- rante 15 a 25 minutos. Em algumas modalidades, a mistura da compo- sição compreendendo um vírus que foi tratado com formaldeído com ácido fosfórico e DNPH é incubada durante 20 minutos.
[00201] Em algumas modalidades, a mistura da composição com- preendendo um vírus que foi tratada com formaldeído com ácido fosfó- rico e DNPH é incubada a uma temperatura de 18ºC a 30ºC durante a 30 minutos. Em algumas modalidades, a mistura da composição compreendendo um vírus que foi tratada com formaldeído com ácido fosfórico e DNPH é incubada a uma temperatura de 18ºC a 30ºC du- rante 15 a 25 minutos. Em algumas modalidades, a mistura da compo- sição compreendendo um vírus que foi tratada com formaldeído com ácido fosfórico e DNPH é incubada a uma temperatura de 18ºC a 30ºC durante 20 minutos.
[00202] Em algumas modalidades, a mistura da composição com- preendendo um vírus que foi tratada com formaldeído com ácido fosfó- rico e DNPH é incubada a uma temperatura de 20ºC a 25ºC durante a 30 minutos. Em algumas modalidades, a mistura da composição compreendendo um vírus que foi tratada com formaldeído com ácido fosfórico e DNPH é incubada a uma temperatura de 20ºC a 25ºC du- rante 15 a 25 minutos. Em algumas modalidades, a mistura da compo- sição compreendendo um vírus que foi tratada com formaldeído com ácido fosfórico e DNPH é incubada a uma temperatura de 20ºC a 25ºC durante 20 minutos.
[00203] Em algumas modalidades, a mistura da composição com- preendendo um vírus que foi tratada com formaldeído com ácido fosfó- rico e DNPH é incubada a uma temperatura de 22ºC durante 10 a 30 minutos. Em algumas modalidades, a mistura da composição compre- endendo um vírus que foi tratada com formaldeído com ácido fosfórico e DNPH é incubada a uma temperatura de 22ºC durante 15 a 25 minu- tos. Em algumas modalidades, a mistura da composição compreen- dendo um vírus que foi tratada com formaldeído com ácido fosfórico e DNPH é incubada a uma temperatura de 22ºC durante 20 minutos.
[00204] Em algumas modalidades, a mistura de 50 partes da com- posição compreendendo um vírus que foi tratado com formaldeído com 1 parte de ácido fosfórico a 20% e 2,5 partes de 1,0 mg/ml de DNPH é incubada a uma temperatura de 18ºC a 30ºC durante 10 a 30 minutos. Em algumas modalidades, a mistura de 50 partes da compo- sição compreendendo um vírus que foi tratado com formaldeído com 1 parte de ácido fosfórico a 20% e 2,5 partes de 1,0 mg/ml de DNPH é incubada a uma temperatura de 18ºC a 30ºC durante 15 a 25 minutos. Em algumas modalidades, a mistura de 50 partes da composição compreendendo um vírus que foi tratado com formaldeído com 1 parte de ácido fosfórico a 20% e 2,5 partes de 1,0 mg/ml de DNPH é incu- bada a uma temperatura de 18ºC a 30ºC durante 20 minutos.
[00205] Em algumas modalidades, a mistura de 50 partes da com- posição compreendendo um vírus que foi tratado com formaldeído com 1 parte de ácido fosfórico a 20% e 2,5 partes de 1,0 mg/ml de DNPH é incubada a uma temperatura de 20ºC a 25ºC durante 10 a 30 minutos. Em algumas modalidades, a mistura de 50 partes da compo- sição compreendendo um vírus que foi tratado com formaldeído com 1 parte de ácido fosfórico a 20% e 2,5 partes de 1,0 mg/ml de DNPH é incubada a uma temperatura de 20ºC a 25ºC durante 15 a 25 minutos. Em algumas modalidades, a mistura de 50 partes da composição compreendendo um vírus que foi tratado com formaldeído com 1 parte de ácido fosfórico a 20% e 2,5 partes de 1,0 mg/ml de DNPH é incu- bada a uma temperatura de 20ºC a 25ºC durante 20 minutos.
[00206] Em algumas modalidades, a mistura de 50 partes da com- posição compreendendo um vírus que foi tratado com formaldeído com 1 parte de ácido fosfórico a 20% e 2,5 partes de 1,0 mg/ml de DNPH é incubada a uma temperatura de 22ºC durante 10 a 30 minu- tos. Em algumas modalidades, a mistura de 50 partes da composição compreendendo um vírus que foi tratado com formaldeído com 1 parte de ácido fosfórico a 20% e 2,5 partes de 1,0 mg/ml de DNPH é incu- bada a uma temperatura de 22ºC durante 15 a 25 minutos. Em algu- mas modalidades, a mistura de 50 partes da composição compreen- dendo um vírus que foi tratado com formaldeído com 1 parte de ácido fosfórico a 20% e 2,5 partes de 1,0 mg/ml de DNPH é incubada a uma temperatura de 22ºC durante 20 minutos.
[00207] Após a incubação, a mistura da composição compreenden- do um vírus que foi tratado com formaldeído com ácido fosfórico e DNPH pode ser analisada por qualquer método adequado. Numa mo- dalidade, após a incubação, a mistura da composição compreendendo um vírus que foi tratado com formaldeído com ácido fosfórico e DNPH é analisada por HPLC. Numa modalidade, após a incubação, a mistura da composição compreendendo um vírus que foi tratado com formal- deído com ácido fosfórico e DNPH é analisada por HPLC de fase re- versa. Numa modalidade, o ligante da coluna HPLC de fase reversa é selecionado dentre C18, n-butal, n-octil, fenil e cianopropil. Numa mo- dalidade, o ligante da coluna HPLC de fase reversa é C18. Numa mo- dalidade, uma mistura de água e acetonitrila (1:1, v/v) é usada como a fase móvel na HPLC de fase reversa. Numa modalidade, o compri- mento de onda de detecção é de 360 nm.
[00208] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um mé- todo para determinar o conteúdo residual de formaldeído em uma va- cina ou composição imunogênica compreendendo um vírus inativado, compreendendo as etapas de: (a) fornecer uma composição compreendendo um vírus que foi tratado com formaldeído; (b) mistura de 50 partes da composição de (a) com 1 parte de ácido fosfórico a 20% e 2,5 partes de 1 mg/ml de 2,4-dinitrofenil- hidrazina (DNPH), fornecendo assim uma mistura; (c) incubar a mistura de (b) por 20 minutos em temperatura ambiente; e (d) analisar a mistura quanto à presença de formaldeído residual por HPLC de fase reversa usando uma coluna C18 e uma mistura de água e acetonitrila (1:1, v/v) como fase móvel.
[00209] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um mé- todo para determinar o conteúdo residual de formaldeído em uma va-
cina ou composição imunogênica compreendendo um Zika vírus inati- vado, compreendendo as etapas de: (a) fornecer uma composição compreendendo um Zika ví- rus que foi tratado com formaldeído; (b) mistura de 50 partes da composição de (a) com 1 parte de ácido fosfórico a 20% e 2,5 partes de 1 mg/ml de 2,4-dinitrofenil- hidrazina (DNPH), fornecendo assim uma mistura; (c) incubar a mistura de (b) por 20 minutos em temperatura ambiente; e (d) analisar a mistura quanto à presença de formaldeído residual por HPLC de fase reversa usando uma coluna C18 e uma mistura de água e acetonitrila (1:1, v/v) como fase móvel.
Adjuvantes
[00210] Outros aspectos da presente invenção referem-se a vaci- nas contra o Zika vírus e/ou composições imunogênicas contendo um ou mais antígenos de pelo menos um Zika vírus descrito neste docu- mento em combinação com um ou mais adjuvantes. Tais vacinas e/ou composições imunogênicas com adjuvantes da presente invenção po- dem ser úteis para tratar ou prevenir a infecção pelo Zika vírus em um sujeito humano em necessidade e/ou induzir uma resposta imune, co- mo uma resposta imune protetora, contra o Zika vírus em um sujeito humano em necessidade.
[00211] Vários métodos para obter um efeito adjuvante para vaci- nas são conhecidos e podem ser utilizados em conjunto com as vaci- nas contra o Zika vírus e/ou composições imunogênicas divulgadas neste documento. Os princípios e métodos gerais estão detalhados em "The Theory and Practical Application of Adjuvants", 1995, Duncan ES Stewart-Tull (ed.), John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6, e também em "Vaccines: New Generation Immunological Adjuvants ", 1995, Gregoriadis G et al. (eds.), Plenum Press, Nova York, ISBN 0-
306-45283-9.
[00212] Em algumas modalidades, uma vacina ou composição imu- nogênica contra o Zika vírus inclui os antígenos e um adjuvante. Os antígenos podem estar em uma mistura com pelo menos um adjuvan- te, em uma proporção baseada em peso de cerca de 10:1 a cerca de 10º:1 de antígeno:adjuvante, por exemplo, de cerca de 10: 1 a cerca de 100:1, de cerca de 100:1 a 10%:1, de cerca de 10º:1 a cerca de 10%:1, de cerca de 10%*:1 a cerca de 10º:1, de cerca de 105:1 a cerca de 108:1, de cerca de 10º:1 a cerca de 107:1, de cerca de 107:1 a cerca de 108:1, de cerca de 108:1 a cerca de 10º:1, ou de cerca de 10º:1 a cerca de 10*º:1 antígeno:adjuvante. Um especialista na técnica pode deter- minar rapidamente a proporção apropriada através de informações so- bre o adjuvante e a experimentação de rotina para determinar as pro- porções ideais.
[00213] Exemplos de adjuvantes podem incluir, entre outros, sais de alumínio, fosfato de cálcio, agonistas de receptores do tipo toll (TLR), monofosforil lipídio A (MLA), derivados de MLA, lipídios sintéti- cos A, miméticos ou análogos de lipídios A, citocinas, saponinas, deri- vados de dipeptídeo muramil (MDP), oligos CpG, lipopolissacarídeo (LPS) de bactérias gram-negativas, polifosfazenos, emulsões (emul- sões oleosas), quitosana, vitamina D, estearil ou octadecil tirosina, vi- rossomas, cocleatos, micropartículas de poli(lactídeos-co-glicolidos) (PLG), partículas de poloxâmero, micropartículas, lipossomas, Adju- vante Completo de Freund (CFA) e Adjuvante Incompleto de Freund (IFA). Em algumas modalidades, o adjuvante é um sal de alumínio.
[00214] Em algumas modalidades, o adjuvante inclui pelo menos um dentre alúmen, fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio, sulfato de alumínio e potássio e Alhydrogel 85. Em algumas modalidades, ve- rificou-se que os adjuvantes de sal de alumínio da presente invenção aumentam a adsorção dos antígenos das vacinas contra o Zika vírus e/ou composições imunogênicas da presente invenção. Por conse- guinte, em algumas modalidades, pelo menos cerca de 75%, pelo me- nos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo me- nos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo me- nos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou cerca de 100% do antígeno são adsorvidos no adjuvante de sal de alumínio.
[00215] Em algumas modalidades, a vacina ou composição imuno- gênica inclui um adjuvante de sal de alumínio (por exemplo, alúmen) de cerca de 100 ug a cerca de 600 ug, de cerca de 100 ug a cerca de 500 ug, de cerca de 125 ug a cerca de 500 ug, de cerca de 150 ug a cerca de 500 ug, de cerca de 175 ug a cerca de 500 ug, de cerca de 100 ug a cerca de 450 ug, de cerca de 125 ug a cerca de 450 ug, de cerca de 150 ug a cerca de 450 ug, de cerca de 175 ug a cerca de 450 Ug, de cerca de 100 ug a cerca de 400 ug, de cerca de 125 ug a cerca de 400 ug, de cerca de 150 ug a cerca de 400 ug, de cerca de 175 ug a cerca de 400 ug, de cerca de 100 ug a cerca de 350 ug, de cerca de 125 ug a cerca de 350 ug, de cerca de 150 ug a cerca de 350 ug, de cerca de 175 ug a cerca de 350 ug, de cerca de 100 ug a cerca de 300 Vg, de cerca de 125 ug a cerca de 300 ug, de cerca de 150 ug a cerca de 300 ug, de cerca de 175 ug a cerca de 300 ug, de cerca de 100 ug a cerca de 250 ug, de cerca de 125 ug a cerca de 250 ug, de cerca de 150 ug a cerca de 250 ug, de cerca de 175 ug a cerca de 250 ug, de cerca de 100 ug a cerca de 225 ug, de cerca de 125 ug a cerca de 225 Vg, de cerca de 150 ug a cerca de 225 ug, de cerca de 175 ug a cerca de 225 ug ou cerca de 200 ug. Em algumas modalidades, a vacina ou composição imunogênica inclui um adjuvante de sal de alumínio (por exemplo, alúmen, como hidróxido de alumínio) de cerca de 100 ug a cerca de 600 ug a cerca de 100 ug a cerca de 300 ug ou cerca de 150
Vjg a cerca de 250 ug ou cerca de 200 ug.
[00216] Em algumas modalidades, as vacinas e/ou composições imunogênicas contêm uma dose de 1 ug a 15 ug ou 2 ug, 5 ug ou 10 ug de um Zika vírus inteiro inativado purificado, como um Zika vírus com uma mutação que é um triptofano para substituição de glicina na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, conforme descrito neste documento em combinação com um ou mais adjuvantes, como 100 ug a cerca de 600 jpg ou cerca de 150 ug a cerca de 250 ug ou cerca de 200 ug de alú- men, como hidróxido de alumínio.
[00217] Em algumas modalidades, a vacina ou composição imuno- gênica contém uma dose de 1 ug a 15 ug, ou 2 ug, 5 ug ou 10 ug de um Zika vírus inteiro inativado purificado compreendendo uma muta- ção Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição cor- respondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, em que o Zika vírus é de- rivado da cepa PRVABC59 em combinação com um ou mais adjuvan- tes, como 100 ug a cerca de 600 ug ou cerca de 150 ug a cerca de 250 ug ou cerca de 200 ug de alúmen, como hidróxido de alumínio.
[00218] Em algumas modalidades, a vacina ou composição imuno- gênica contém uma dose de 1 ug a 15 ug, ou 2 ug, 5 ug ou 10 ug de um Zika vírus inteiro inativado purificado compreendendo uma muta- ção Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição cor- respondente a posição 98 da SEQ ID NO: 1, em que o Zika vírus é de- rivado da cepa PRVABC59 compreendendo a sequência genômica de acordo com a SEQ ID NO: 2 em combinação com um ou mais adju- vantes, como 100 ug a cerca de 600 ug ou cerca de 150 ug a cerca de 250 ug ou cerca de 200 ug de alúmen, como hidróxido de alumínio.
[00219] Em algumas modalidades, a vacina ou composição imuno- gênica contém uma dose de 1 ug a 15 ug, ou 2 ug, 5 ug ou 10 ug de um isolado de Zika vírus inteiro inativado com placa purificada com-
preendendo uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 11, em que o Zika vírus é derivado da cepa PRVABC59 compreendendo a sequência genômica de acordo com a SEQ ID NO: 2 em combinação com um ou mais adjuvantes, como 100 ug a cerca de 600 ug ou cerca de 150 ug a cerca de 250 ug ou cerca de 200 ug de alúmen, como hi- dróxido de alumínio.
[00220] Certas modalidades da presente invenção incluem um mé- todo para preparar uma vacina ou composição imunogênica contra o Zika vírus com adjuvantes, que envolve (a) misturar a vacina ou com- posição imunogênica com um adjuvante de sal de alumínio, com a va- cina ou composição imunogênica incluindo um ou mais antígenos deri- vada de pelo menos um Zika vírus descrito neste documento e (b) in- cubar a mistura em condições adequadas por um período de tempo que varia de cerca de 1 hora a cerca de 24 horas (por exemplo, cerca de 16 horas a cerca de 24 horas), com pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo me- nos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo me- nos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou cerca de 100% do antígeno adsorvido no adjuvante de sal de alumínio. Em certas moda- lidades do método, o pelo menos um Zika vírus é um Zika vírus com- preendendo uma mutação de adaptação celular não humana (por exemplo, uma mutação de adaptação celular não humana na proteína NS1, como uma mutação Trp98Gly.
[00221] Em algumas modalidades do método, a mistura é incubada a uma temperatura que varia de cerca de 2ºC a cerca de 8ºC. Em al- gumas modalidades do método, a mistura é incubada sob mistura constante usando qualquer misturador adequado conhecido na técni-
ca. Em algumas modalidades do método, a mistura é incubada em pH que varia em valor de cerca de 6,5 a cerca de 8,5, de cerca de 6,5 a cerca de 8, de cerca de 6,8 a cerca de 7,8, de cerca de 6,9 a cerca de 7,6, de cerca de 7 a cerca de 7,5, de cerca de 6,8 a cerca de 8,5, de cerca de 6,9 a cerca de 8,5 ou de cerca de 7 a cerca de 8,5. Em certas modalidades preferenciais, a mistura é incubada a um pH neutro. Em algumas modalidades do método, o adjuvante de sal de alumínio é se- lecionado dentre alúmen, fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio, sulfato de alumínio e potássio e Alhydrogel 85.
[00222] O monofosforil lipídio A (MLA), um derivado não tóxico do lipídio A de Salmonella, é um potente agonista do TLR-4 que foi de- senvolvido como um adjuvante de vacina (Evans et al. (2003) Expert Rev. Vaccines 2(2): 219-229). Nos estudos pré-clínicos em murinos, o MLA intranasal demonstrou aprimorar as respostas humorais secreto- ras, bem como as sistêmicas (Baldridge et al. (2000) Vaccine 18(22): 2416-2425; Yang et al. (2002) Infect. Immun. 70(7): 3557-3565). Tam- bém foi provado ser seguro e eficaz como um adjuvante de vacina em estudos clínicos com mais de 120.000 pacientes (Baldrick et al. (2002) Regul. Toxicol. Pharmacol. 35(3): 398-413; Baldrick et al. (2004) J. Appl. Toxicol. 24(4): 261-268). O MLA estimula a indução de imunida- de inata através do receptor TLR-4 e, portanto, é capaz de provocar respostas imunes inespecíficas contra uma ampla gama de patógenos infecciosos, incluindo bactérias, vírus e parasitas gram-negativos e gram-positivos (Baldrick et al. (2004) J. Appl. Toxicol. 24(4): 261-268; Persing et al. (2002) Trends Microbiol. 10(10 Supl): S32-37). A inclu- são de MLA em formulações intranasais deve fornecer rápida indução de respostas inatas, provocando respostas imunes inespecíficas a par- tir da exposição viral, aprimorando as respostas específicas geradas pelos componentes antigênicos da vacina.
[00223] Por conseguinte, em uma modalidade, a presente invenção fornece uma composição compreendendo monofosforil lipídio A (MLA), monofosforil lipídio A 3 De-O-acilado (3D-MLA), ou um derivado destes como um intensificador da imunidade adaptativa e inata. Quimicamen- te, 3D-MLA é uma mistura de monofosforil lipídio A 3 De-O-acilado com 4, 5 ou 6 cadeias aciladas. Uma forma preferencial de monofosfo- ril-lípido A 3 De-O-acilado é divulgada na Patente Europeia O 689 454 B1 (SmithKline Beecham Biologicals SA). Em outra modalidade, a pre- sente invenção fornece uma composição compreendendo lipídio A sin- tético, miméticos ou análogos do lipídio A, como PET Lipídio A da Bi- oMira, ou derivados sintéticos projetados para funcionar como agonis- tas do TLR-4.
[00224] —Adjuvantes exemplares adicionais incluem, sem limitação, adjuvantes polipeptídicos que podem ser facilmente adicionados aos antígenos descritos neste documento por co-expressão com os com- ponentes polipeptídicos ou fusão com os componentes polipeptídicos para produzir polipeptídeos quiméricos. A flagelina bacteriana, o prin- cipal constituinte proteico dos flagelos, é um adjuvante que tem rece- bido crescente atenção como proteína adjuvante devido ao seu reco- nhecimento pelo sistema imunológico inato pelo receptor TLR5 do tipo toll. A sinalização da flagelina através do TLR5 tem efeitos nas fun- ções imunológicas inata e adaptativa, induzindo a maturação e migra- ção de DC, bem como a ativação de macrófagos, neutrófilos e células epiteliais intestinais, resultando na produção de mediadores pró- inflamatórios.
[00225] O TLR5 reconhece uma estrutura conservada dentro dos monômeros de flagelina que é única para esta proteína e é necessária para a função flagelar, impedindo sua mutação em resposta à pressão imunológica. O receptor é sensível a uma concentração de 100 fM, mas não reconhece filamentos intactos. A desmontagem flagelar em monômeros é necessária para ligação e estimulação.
[00226] Como adjuvante, a flagelina possui atividade potente para indução de respostas protetoras para antígenos heterólogos adminis- trados parentericamente ou intranasalmente e também foram relatados efeitos adjuvantes para vacinas de DNA. Observa-se um viés de Th2 quando a flagelina é empregada, o que seria apropriado para um vírus respiratório, como a gripe, mas nenhuma evidência de indução de IgE em camundongos ou macacos foi observada. Além disso, nenhuma resposta inflamatória local ou sistêmica foi relatada após administra- ção intranasal ou sistêmica em macacos. O caráter Th2 das respostas desencadeadas após o uso da flagelina é um tanto surpreendente, uma vez que os sinais da flagelina através do TLR5 de uma maneira dependente de MyD88 e todos os outros sinais dependentes de MyD88 através de TLRs demonstraram resultar em um viés de Th1. É importante ressaltar que os anticorpos preexistentes à flagelina não têm efeito apreciável na eficácia do adjuvante, tornando-o atraente como adjuvante multiuso.
[00227] Um tema comum em muitos ensaios recentes de vacina intranasal é o uso de adjuvantes e/ou sistemas de administração para melhorar a eficácia da vacina. Em um desses estudos, uma vacina contra influenza H3 contendo um adjuvante de enterotoxina lábil ao calor geneticamente desintoxicada de E. coli (LT R192G) resultou em proteção heterossubtípica contra exposição ao H5, mas apenas após a administração intranasal. A proteção foi baseada na indução de anti- corpos neutralizantes cruzados e demonstrou implicações importantes para a via intranasal no desenvolvimento de novas vacinas.
[00228] Citocinas, fatores estimuladores de colônias (por exemplo, GM-CSF, CSF e similares); fator de necrose tumoral; interleucina-2, -7, -12, interferons e outros factores de crescimento similares, também podem ser utilizados como adjuvantes, uma vez que podem ser facil- mente incluídos nas vacinas contra o Zika vírus ou nas composições imunogênicas por mistura ou fusão com o componente polipeptídico.
[00229] Em algumas modalidades, a vacina contra o Zika vírus e/ou composições imunogênicas divulgadas neste documento podem incluir outros adjuvantes que atuam através de um receptor do tipo toll, como um ligante TLR9 de ácido nucleico compreendendo uma sequência 5'- TCG-3'; um ligante de imidazoquinolina TLR7; um ligante de guanina TLR7/8 substituído; outros ligantes de TLR7, como Loxoribina, 7- desazadeoxiganosanos, 7-tia-B-oxodesoxiganosanos, Imiquimod (R- 837) e Resiquimod (R-848).
[00230] Certos adjuvantes facilitam a captação das moléculas da vacina pelas APCs, como as células dendríticas, e as ativam. Exem- plos não limitativos são selecionados do grupo que consiste em um adjuvante de direcionamento imunológico; um adjuvante imunomodu- lador, tal como uma toxina, uma citocina e um derivado micobacteria- no; uma formulação de óleo; um polímero; um adjuvante formador de micelas; uma saponina; uma matriz complexa imunoestimulante (ma- triz ISCOM); uma partícula; DDA; adjuvantes de alumínio; Adjuvantes de DNA; MLA; e um adjuvante encapsulante.
[00231] Exemplos adicionais de adjuvantes incluem agentes como sais de alumínio, como hidróxido ou fosfato (alúmen), comumente usados como solução de 0,05 a 0,1 porcento em solução salina tam- ponada (ver, por exemplo, Nicklas (1992) Res. Immunol. 143: 489- 493), mistura com polímeros sintéticos de açúcares (por exemplo, CarbopolO) usados como solução a 0,25 porcento, agregação da pro- teína na vacina por tratamento térmico com temperaturas variando en- tre 70ºC a 101ºC por 30 segundos a 2 minutos, respectivamente, e também agregação por meios de agentes de reticulação são possí- veis. Agregação por reativação com anticorpos tratados com pepsina (fragmentos Fab) à albumina, mistura com células bacterianas como C. parvum ou endotoxinas ou componentes de lipopolissacarídeos de bactérias gram-negativas, emulsão em veículos oleosos fisiologica- mente aceitáveis, como mono-oleato de maneto (Aracel A) ou emulsão com solução a 20 porcento de um perfluorocarbono (Fluosol-DA) usa- do como substituto em bloco também pode ser empregada. A mistura com óleos como esqualeno e IFA também pode ser usada.
[00232] O DDA (brometo de dimetildioctadecilamônio) é um candi- dato interessante para um adjuvante, mas também são interessantes os adjuvantes completos e incompletos de Freund, bem como as sa- poninas de quillaja como QuilA e QS21. Outras possibilidades incluem derivados de polildi(earboxilatofenoxi)fosfazeno (PCPP) de lipopolis- sacarídeos, tais como monofosforil lipídio A (MLA), dipeptídeo muramil (MDP) e dipeptídeo muronil muramil (tMDP). Os adjuvantes à base de lipopolissacarídeo também podem ser utilizados para produzir uma resposta predominantemente do tipo Th1 incluindo, por exemplo, uma combinação de monofosforil lipídeo A, tal como monofosforil lipídeo À 3-de-O-acilado, juntamente com um sal de alumínio.
[00233] Sabe-se também que as formulações de lipossomas confe- rem efeitos adjuvantes e, portanto, adjuvantes lipossômicos podem ser utilizados em conjunto com as vacinas contra o Zika vírus e/ou compo- sições imunogênicas.
[00234] Os adjuvantes do tipo matriz complexo imunoestimulador (matriz ISCOMO) também podem ser usados com os antígenos da va- cina contra o Zika vírus e as composições imunogênicas, principal- mente porque foi demonstrado que esse tipo de adjuvante é capaz de regular a expressão do MHC Classe Il pelas APCs. Uma matriz |IS- COM consiste em saponinas (opcionalmente fracionadas) (triterpenoi- des) de Quillaja saponaria, colesterol e fosfolipídios. Quando mistura- da com a proteína imunogênica, como a vacina do Zika vírus ou antí- genos da composição imunogênica, a formulação particulada resultan- te é o que é conhecido como partícula ISCOM, na qual a saponina po-
de constituir 60-70% p/p, colesterol! e fosfolipídios 10-15% p/p, e a pro- teína 10-15% p/p. Detalhes relacionados à composição e uso de com- plexos imunoestimulantes podem, por exemplo, ser encontrados nos livros de texto mencionados acima, que tratam de adjuvantes, mas também em Morein B et al. (1995) Clin. Inmunother. 3: 461-475, bem como Barr IG e Mitchell GF (1996) Immunol. e Cell Biol. 74: 8-25 for- necem instruções úteis para a preparação de complexos imunoestimu- lantes completos.
[00235] As saponinas, quer ou não na forma de iscoms, que podem ser usadas nas combinações adjuvantes com as vacinas e composi- ções imunogênicas contra o Zika vírus divulgadas neste documento incluem aquelas derivadas da casca de Quillaja Saponaria Molina, de- nominada Quil A, e frações destas, descritas na Pat. No. 5.057.540 e "Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, CR (1996) Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 12 (1-2):1-55; e EP 0 362 279 B1. Frações exemplares de Quil A são QS21, QS7 e QS17.
[00236] Bp-Escina é outra saponina hemolítica para uso nas compo- sições adjuvantes das vacinas e/ou composições imunogênicas contra o Zika vírus. A Escina é descrita no índice Merck (12º ed: entrada 3737) como uma mistura de saponinas que ocorrem nas sementes do castanheiro, Lat: Aesculus hippocastanum. O seu isolamento é des- crito por cromatografia e purificação (Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4, 213 (1953)) e por resinas de permuta iônica (Erbring et al., Patente US No. 3.238.190). As frações de escina foram purificadas e demonstra- ram ser biologicamente ativas (Yoshikawa M, et al. (Chem Pharm Bull (Tóquio) agosto de 1996; 44(8):1454-1464)). B-escina também é co- nhecida como aescina.
[00237] Outra saponina hemolítica para uso nas vacinas e/ou com- posições imunogênicas contra o Zika vírus é a Digitonina. A Digitonina é descrita no índice Merck (12º edição, entrada 3204) como uma sa-
ponina, derivada das sementes de Digitalis purpurea e purificada de acordo com o procedimento descrito por Gisvold et al. (1934) J.Am.Pharm.Assoc. 23: 664; e Ruhenstroth-Bauer (1955) Physiol. Chem., 301, 621. Seu uso é descrito como um reagente clínico para a determinação do colesterol.
[00238] Outra possibilidade interessante para obter um efeito adju- vante é empregar a técnica descrita em Gosselin et al., 1992. Em re- sumo, a apresentação de um antígeno relevante como um antígeno em uma vacina e/ou composição imunogênica contra o Zika vírus da presente invenção pode ser aprimorada conjugando o antígeno a anti- corpos (ou fragmentos de anticorpo de ligação a antígeno) contra os receptores FC em monócitos/macrófagos. Demonstrou-se que especi- almente conjugados entre antígeno e anti-FCRI aprimoram a imuno- genicidade para fins de vacinação. O anticorpo pode ser conjugado com os antígenos da vacina ou composição imunogênica contra o Zika vírus após a geração ou como parte da geração, incluindo a expressão como fusão a qualquer um dos componentes polipeptídicos dos antí- genos da vacina e/ou composição imunogênica contra o Zika vírus. Outras possibilidades envolvem o uso de substâncias direcionadoras e imunomoduladoras (por exemplo, citocinas). Além disso, também po- dem ser utilizados indutores sintéticos de citocinas, como poli 1:C.
[00239] Os derivados micobacterianos adequados podem ser sele- cionados do grupo que consiste em dipeptídeo muramil, adjuvante completo de Freund, RIBI (Ribi ImmunoChem Research Inc., Hamilton, Mont.) e um diéster de trealose, como TDM e TDE.
[00240] Exemplos de adjuvantes de direcionamento imunológico adequados incluem o ligante CD40 e os anticorpos CD40 ou seus fra- gmentos de ligação específica (cf. discussão acima), manose, um fra- gmento Fab e CTLA-A4.
[00241] Exemplos de adjuvantes poliméricos adequados incluem um carboidrato, como dextrano, PEG, amido, manano e manose; um polímero plástico; e látex, como grânulos de látex.
[00242] Ainda outra maneira interessante de modular uma resposta imune é incluir o imunogênio (opcionalmente junto com adjuvantes e veículos e veículos farmaceuticamente aceitáveis) em um "linfonodo virtual" (VLN) (um dispositivo médico proprietário desenvolvido pela ImmunoTherapy, Inc., 360 Lexington Avenue, Nova York, NY 10017- 6501). O VLN (um dispositivo tubular fino) imita a estrutura e a função de um linfonodo. A inserção de um VLN sob a pele cria um local de inflamação estéril com um aumento de citocinas e quimiocinas. As cé- lulas T e B, bem como as APCs, respondem rapidamente aos sinais de perigo, abrigam o local inflamado e se acumulam dentro da matriz porosa do VLN. Foi demonstrado que a dose de antígeno necessária para montar uma resposta imune a um antígeno é reduzida ao usar o VLN, e que a proteção imune conferida pela vacinação usando um VLN superou a imunização convencional usando Ribi como adjuvante. A tecnologia é descrita brevemente em Gelber C et al., 1998, "Elicita- tion of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Small Amounts of Immunogens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Node", em: "From the Laboratory to the Clinic, Book of Abstracts, 12 a 15 de outubro de 1998, Seascape Resort, Aptos, Califórnia ".
[00243] Os oligonucleotídeos podem ser usados como adjuvantes em conjunto com os antígenos da vacina e/ou composição imunogêni- ca contra o Zika vírus e podem conter dois ou mais motivos de CpG de dinucleotídeo separados por pelo menos três ou mais ou mesmo pelo menos seis ou mais nucleotídeos. Os oligonucleotídeos contendo CpG (nos quais o dinucleotídeo CpG não está metilado) induzem uma res- posta predominantemente Th1. Tais oligonucleótidos são bem conhe- cidos e são descritos, por exemplo, nos documentos WO 96/02555,
WO 99/33488 e Pat. US 6.008.200 e 5.856.462.
[00244] Tais adjuvantes oligonucleotídicos podem ser desoxinucleo- tídeos. Em certas modalidades, a estrutura nucleotídica no oligonucle- otídeo é fosforoditioato, ou uma ligação fosforotioato, embora o fosfo- diéster e outras estruturas nucleotídicas, como o PNA, incluindo oligo- nucleotídeos com ligações de estruturas mistas também possam ser utilizados. Os métodos para a produção de oligonucleotídeos ou fosfo- rotioato de fosforotioato são descritos na Patente US No. 5.666.153, Pat. US 5.278.302 e WO 95/26204.
[00245] —Oligonucleotídeos exemplares têm as seguintes sequên- cias. As sequências podem conter estruturas nucleotídicas modifica- das com fosforotioato: (SEQ ID NO: 3) OLIGO 1: TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826); (SEQ ID NO: 4) OLIGO 2: TOT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758); (SEQ ID NO: 5) OLIGO 3: ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG; (SEQ ID NO: 6) OLIGO 4: TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006); e (SEQ ID NO: 7) OLIGO 5: TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)
[00246] Os oligonucleotídeos CpG alternativos incluem as sequên- cias acima com deleções ou adições inconsequentes. Os oligonucleo- tídeos CpG como adjuvantes podem ser sintetizados por qualquer mé- todo conhecido na técnica (por exemplo, EP 468520). Por exemplo, esses oligonucleotídeos podem ser sintetizados utilizando um sinteti- zador automático. Tais adjuvantes oligonucleotídicos podem ter entre 10-50 bases de comprimento. Outro sistema adjuvante envolve a combinação de um oligonucleotídeo contendo CpG e um derivado de saponina, particularmente a combinação de CpG e QS21 é divulgada no documento WO 00/09159.
[00247] Muitos sistemas de emulsão monofásicos ou multifásicos foram descritos. Um versado na técnica pode adaptar prontamente es- ses sistemas de emulsão para uso com os antígenos de uma vacina e/ou composição imunogênica contra o Zika vírus, de modo que a emulsão não desfaça a estrutura do antígeno. Foi sugerido que adju- vantes de emulsão de óleo em água por si só são úteis como compo- sições adjuvantes (EP 399 843B), também foram descritas combina- ções de emulsões de óleo em água e outros agentes ativos como ad- juvantes de vacinas (WO 95/17210; WO 98/56414; WO 99/12565; WO 99/11241). Outros adjuvantes de emulsão de óleo foram descritos, como emulsões de água em óleo (Patente US 5.422.109; EP O 480 982 B2) e emulsões de água em óleo em água (Patente US 5.424.067; EP 0480 981 B).
[00248] Os adjuvantes da emulsão de óleo para uso com as vaci- nas e/ou composições imunogênicas contra o Zika vírus descritas nes- te documento podem ser naturais ou sintéticos e podem ser minerais ou orgânicos. Exemplos de óleos minerais e orgânicos serão facilmen- te aparentes para os versados na técnica.
[00249] “Para que qualquer composição de óleo em água seja ade- quada para administração humana, a fase oleosa do sistema de emul- são pode incluir um óleo metabolizável. O significado do termo óleo metabolizável é bem conhecido na técnica. Metabolizável pode ser de- finido como "capaz de ser transformado pelo metabolismo" (Dorland's Illustrated Medical Dictionary, WB Sanders Company, 25º edição (1974)). O óleo pode ser qualquer óleo vegetal, óleo de peixe, óleo animal ou óleo sintético, que não seja tóxico para o receptor e possa ser transformado pelo metabolismo. Nozes (como óleo de amendoim), sementes e grãos são fontes comuns de óleos vegetais. Óleos sintéti- cos também podem ser usados e podem incluir óleos disponíveis co-
mercialmente, “como NEOBEEO e outros O esqualeno (2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno) é um óleo insaturado encontrado em grandes quantidades no óleo de fígado de tubarão e em quantidades menores em azeite, óleo de gérmen de trigo, óleo de farelo de arroz e levedura, e pode ser usado com a vaci- na e/ou composições imunogênicas contra o Zika vírus. O esqualeno é um óleo metabolizável pelo fato de ser um intermediário na biossíntese do colesterol (Merck index, 10a Edição, entrada no.8619).
[00250] Emulsões de óleo exemplares são emulsões de óleo em água e, em particular, esqualeno em emulsões de água.
[00251] Além disso, os adjuvantes da emulsão de óleo para uso com a vacina e/ou composições imunogênicas contra o Zika vírus po- dem incluir um antioxidante, como o óleo a-tocofero!l (vitamina E, EP O 382 271 B1).
[00252] Os documentos WO 95/17210 e WO 99/11241 divulgam adjuvantes de emulsão baseados em esqualeno, a-tocoferol e TWEEN 80 (TM), opcionalmente formulados com os imunoestimulantes QS21 e/ou 3D-MLA. O documento WO 99/12565 divulga uma melhoria des- tas emulsões de esqualeno com a adição de um esterol na fase ole- osa. Além disso, um triglicerídeo, como a tricaprilina (C27H5006), po- de ser adicionado à fase oleosa para estabilizar a emulsão (WO 98/56414).
[00253] O tamanho das gotículas de óleo encontradas na emulsão estável de óleo em água pode ser menor que 1 mícron, pode estar na faixa de substancialmente 30-600 nm, substancialmente em torno de 30-500 nm de diâmetro ou substancialmente 150-500 nm de diâmetro, e em particular cerca de 150 nm de diâmetro, medidos por espectros- copia de correlação de fótons. Nesse sentido, 80% das gotículas de óleo em número podem estar dentro dessas faixas, mais de 90% ou mais de 95% das gotículas de óleo em número estão dentro das faixas de tamanho definidas. As quantidades dos componentes presentes nas emulsões de óleo estão convencionalmente na faixa de 2 a 10% de óleo, como esqualeno; e quando presente, de 2 a 10% de alfa toco- ferol; e de 0,3 a 3% de surfactante, tal como monooleato de polioxieti- leno sorbitano. A proporção de óleo:alfa-tocoferol pode ser igual ou menor que 1, pois isso fornece uma emulsão mais estável. O SPAN 85 (TM) também pode estar presente a um nível de cerca de 1%. Em al- guns casos, pode ser vantajoso que as vacinas e/ou composições imunogênicas contra o Zika vírus divulgadas neste documento conte- nham ainda um estabilizador.
[00254] O método de produção de emulsões de óleo em água é bem conhecido pelos versados na técnica. Geralmente, o método in- clui a etapa de misturar a fase oleosa com um surfactante, como uma solução de PBS/TWEEN806, seguida de homogeneização usando um homogeneizador, seria claro para um versado na técnica que um mé- todo que compreende passar a mistura duas vezes através uma agu- lha de seringa seria adequada para homogeneizar pequenos volumes de líquido. Da mesma forma, o processo de emulsificação no microflu- idizador (máquina microfluídica M1108S, no máximo 50 passagens, por um período de 2 minutos na pressão máxima de entrada de 6 bar (pressão de saída de cerca de 850 bar)) pode ser adaptado por um versado na técnica para produzir volumes menores ou maiores de emulsão. Esta adaptação pode ser alcançada por experimentação de rotina, compreendendo a medição da emulsão resultante até que uma preparação seja alcançada com gotículas de óleo do diâmetro exigido.
[00255] —Alternativamente, as vacinas e/ou composições imunogêni- cas contra o Zika vírus podem ser combinadas com veículos vacinais compostos de quitosana (conforme descrito acima) ou outros políme- ros policatiônicos, partículas de polilactídeo e polilactídeo-coglicolídeo, matriz polimérica à base de poli-N-acetil-glucosamina, partículas com-
postas de polissacarídeos ou polissacarídeos quimicamente modifica- dos, lipossomas e partículas à base de lipídios, partículas compostas por monoésteres de glicerol, etc. As saponinas também podem ser formuladas na presença de colesterol para formar estruturas particula- das, como lipossomas ou ISCOMs. Além disso, as saponinas podem ser formuladas em conjunto com um éter ou éster de polioxietileno, em uma solução ou suspensão não particulada, ou em uma estrutura par- ticulada, como um lipossoma paucilamelar ou ISCOM.
[00256] —Adjuvantes ilustrativos adicionais para uso nas vacinas e/ou composições imunogênicas contra o Zika vírus conforme descrito nes- te documento incluem SAF (Chiron, Califórnia, Estados Unidos), MF- 59 (Chiron, ver, por exemplo, Granoff et al. (1997) Infect Immun. 65 (5): 1710-1715), a série de adjuvantes SBAS (por exemplo, SB-AS2 (uma emulsão de óleo em água contendo MLA e QS21); SBAS+ (sis- tema adjuvante que contém alúmen e MLA), disponível na SmithKline Beecham, Rixensart, Bélgica), Detox (EnhanzynO) (GlaxoSmithKline), RC-512, RC-522, RC-527, RC-529, RC-544 e RC-560 (GlaxoSmithKli- ne) e outros 4-fosfatos de aminoalquil glucosaminida (AGPs), como os descritos no pedido de patente pendente US Ser. Nos. 08/853.826 e 09/074.720.
[00257] Outros exemplos de adjuvantes incluem, mas não estão limitados a, adjuvantes Hunter's TiterMaxO (CytRx Corp., Norcross, Ga.); adjuvantes de Gerbu (Gerbu Biotechnik GmbH, Gaiberg, Alema- nha); nitrocelulose (Nilsson e Larsson (1992) Res. Immunol. 143: 553- 557); formulações à base de emulsão de alúmen (por exemplo, hidró- xido de alumínio, fosfato de alumínio), incluindo óleo mineral, óleo não mineral, emulsões de água em óleo ou óleo em água, como a série Seppic ISA de adjuvantes de Montamida (por exemplo, ISA-51, ISA- 57, ISA-720, ISA-151, etc.; Seppic, Paris, França); e PROVAXO (IDEC Pharmaceuticals); OM-174 (um dissacarídeo de glucosamina relacio-
nado ao lipídeo A); Fator de alongamento de Leishmania; copolímeros em bloco não iônicos que formam micelas como CRL 1005; e Formu- lação Adjuvante Syntex. Ver, por exemplo, O'Hagan et al. (2001) Bio- mol Eng. 18(3):69-85; e "Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols" D. O'Hagan, ed. (2000) Humana Press.
[00258] “Outros adjuvantes exemplares incluem moléculas adjuvan- tes da fórmula geral: HO(CH2CH20)n-A-R, (1) onde, n é 1-50, A é uma ligação ou --C(O)--, R é C1-50 alquil ou Fenil C1-50 alquil.
[00259] Uma modalidade consiste em uma formulação de vacina compreendendo um éter polioxietileno de fórmula geral (|), em que n está entre 1 e 50, 4-24 ou 9; o componente R é C1-50, C4-C20 alquil ou C12 alquil, e A é uma ligação. A concentração dos éteres de poli- oxietileno deve situar-se entre 0,1 e 20%, entre 0,1 e 10% ou entre 0,1 e 1%. Éteres de polioxietileno exemplares são selecionados do seguin- te grupo: polioxietileno-9-lauril éter, polioxietileno-9-esteoril éter, poli- oxietileno-8-esteoril éter, polioxietileno-4-lauril éter, polioxietileno-35- lauril éter e polioxietileno-23-lauril éter. Os éteres de polioxietileno, como o polioxietileno-lauril éter, são descritos no índice Merck (12º edição: entrada 7717). Estas moléculas adjuvantes são descritas em WO 99/52549.
[00260] O éter de polioxietileno de acordo com a fórmula geral (1) acima pode, se desejado, ser combinado com outro adjuvante. Por exemplo, uma combinação de adjuvantes pode incluir a CpG conforme descrito acima.
[00261] Outros exemplos de excipientes farmaceuticamente aceitá- veis adequados para uso com as vacinas e/ou composições imunogê- nicas contra o Zika vírus divulgadas neste documento incluem água, solução salina tamponada com fosfato, soluções tampão isotônicas. Purificação de vírus
[00262] Outros aspectos da presente invenção referem-se a méto-
dos de purificação do Zika vírus. Em algumas modalidades, o método inclui inocular uma pluralidade de células com um inóculo contendo uma população de Zika vírus e obter de uma ou mais das células ino- culadas um isolado clonal do Zika vírus por purificação da placa. Em algumas modalidades, as células são células não humanas (por exemplo, células de inseto, células de mamífero, etc.). Em algumas modalidades, as células são células de inseto (como qualquer uma das células/linhagens celulares de mosquito descritas neste documen- to). Em algumas modalidades, as células são células de mamífero (como qualquer uma das células/linhagens celulares de mamífero des- critas neste documento). Em algumas modalidades, as células de mamífero são células de macaco. Em algumas modalidades, as célu- las de mamífero são células Vero.
[00263] Em algumas modalidades, a população do Zika vírus é he- terogênea (por exemplo, compreendendo dois ou mais genótipos). Os dois ou mais genótipos diferem entre si em pelo menos um nucleotí- deo. Em algumas modalidades, a população de Zika vírus compreende um isolado clínico de Zika vírus (por exemplo, da cepa PRVABC59) e/ou um ou mais Zika vírus que foram previamente passados em cultu- ra de células. Um isolado clínico do Zika vírus é obtido a partir de uma amostra de um paciente infectado pelo Zika vírus. Em algumas moda- lidades, a purificação da placa (por exemplo, conforme descrito neste documento) permite a separação substancial e/ou completa de um iso- lado clonal (geneticamente homogêneo) de uma população viral hete- rogênea. Em algumas modalidades, as células de macaco são de uma linhagem celular VERO (por exemplo, células VERO 10-87). Em algu- mas modalidades, o inóculo compreende soro humano. Em algumas modalidades, o inóculo compreende um ou mais agentes adventícios (por exemplo, um ou mais vírus de contaminação). Em algumas moda- lidades, a purificação da placa (por exemplo, conforme descrito neste documento) permite a purificação substancial e/ou completa de um isolado clonal (geneticamente homogêneo) longe de um ou mais agen- tes adventícios.
[00264] Em algumas modalidades, os métodos descritos para isolar e/ou purificar um isolado clonal do Zika vírus incluem uma ou mais (por exemplo, uma ou mais, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, etc.) purificações adicionais de placa do isolado clonal do Zika vírus. Em algumas modalidades, os métodos descritos para isolar e/ou purificar um isolado clonal do Zika vírus incluem a passa- gem do isolado clonal do Zika vírus um ou mais (por exemplo, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, etc.) vezes na cultura de células (por exemplo, em células de inseto, como uma linhagem celular de mosquito e/ou em células de mamífero, como uma linhagem celular VERO).
[00265] Outros aspectos da presente invenção referem-se a méto- dos de purificação do Zika vírus para a preparação de uma vacina ou composição imunogênica. Em algumas modalidades, os métodos in- cluem uma ou mais (por exemplo, uma ou mais, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais ou seis) etapas de (em qualquer ordem, incluindo a seguinte ordem): executar filtragem em profundida- de de uma amostra ou preparação contendo um Zika vírus; troca de tampão e/ou diluição de uma amostra contendo um Zika vírus (por exemplo, por filtração por fluxo cruzado (CFF)) para produzir um reten- tado; ligar uma amostra que compreende um Zika vírus a uma mem- brana de troca iônica (por exemplo, uma membrana de troca aniônica, uma membrana de troca catiônica) para produzir uma fração ligada, em que a fração ligada compreende o Zika vírus e eluir a fração ligada da membrana de troca iônica; tratar uma amostra contendo um Zika vírus com uma quantidade eficaz de qualquer um dos inativadores químicos descritos neste documento; neutralizar uma amostra conten-
do um Zika vírus inativado quimicamente com metabissulfito de sódio; e/ou purificação de uma amostra neutralizada compreendendo um Zika vírus inativado quimicamente (por exemplo, por filtração por fluxo cruzado (CFF)). Em algumas modalidades, o método inclui as etapas de (a) passar uma amostra contendo um Zika vírus através de um pri- meiro filtro de profundidade para produzir um primeiro eluato, onde o primeiro eluato contém o Zika vírus; (b) troca de tampão e/ou diluição do primeiro eluído por filtração por fluxo cruzado (CFF) para produzir um primeiro retentado, onde o primeiro retentado contém o Zika vírus; (c) ligar o primeiro retido a uma membrana de troca iônica para produ- zir uma primeira fração ligada, onde a primeira fração ligada contém o Zika vírus, e eluir a primeira fração ligada da membrana de troca iônica para produzir um segundo eluato, onde o segundo eluato contém o Zika vírus; (d) passar o segundo eluato através de um segundo filtro de profundidade para produzir um segundo retentado, em que o se- gundo retentado contém o Zika vírus; (e) tratar o segundo retido com uma quantidade eficaz de um inativador químico; (f) neutralização do segundo retido tratado com metabissulfito de sódio; e (g) purificação do segundo retido neutralizado por filtração por fluxo cruzado (CFF).
[00266] Os filtros de profundidade podem ser aplicados em um for- mato de cartucho ou cápsula, como na série SUPRACAP'Y de cápsu- las de filtro de profundidade (Pall Corporation) usando uma folha de filtro de profundidade Bio 20 SEITZO. Outras técnicas e aparelhos de filtração em profundidade adequados são conhecidos na técnica e in- cluem filtros Sartorius PP3. Em algumas modalidades, o filtro de pro- fundidade tem um tamanho de poro entre cerca de 0,2 um e cerca de 3 um. Em algumas modalidades, o tamanho do poro do filtro de pro- fundidade é menor que qualquer um dos seguintes tamanhos de poro (em um): 3, 2,8, 2,6, 2,4, 2,2, 2,0, 1,8, 1,6, 1,4, 1,2, 1,0, 0,8, 0,6 e 0,4. Em algumas modalidades, o tamanho do poro do filtro de profundidade é maior que qualquer um dos seguintes tamanhos de poro (em um): 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2,0, 2,2, 2,4, 2,6 ou 2,8. Ou se- ja, o tamanho do poro do filtro de profundidade pode ser de vários ta- manhos (em um) com um limite superior de 3, 2,8, 2,6, 2,4, 2,2, 2,0, 1,8, 1,6, 1,4, 1,2, 1,0, 0,8, 0,6 e 0,4 e um limite inferior selecionado in- dependentemente de 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2,0, 2,2, 2,4, 2,6 ou 2,8; em que o limite inferior é menor que o limite superior.
[00267] Conforme descrito neste documento, a cromatografia de troca catiônica e de troca aniônica pode ser usada nos métodos da presente invenção para purificar um Zika vírus colhido a partir de uma célula da presente invenção. Por exemplo, a colheita viral clarificada pode ser basificada, carregada em uma membrana de troca aniônica, eluída por sal ou pH, filtrada e inativada. Este é apenas um esquema exemplar, e um versado na técnica pode prontamente contemplar va- riantes do mesmo com etapas substituídas, excluídas, inseridas ou reordenadas.
[00268] A cromatografia de troca de ânions e cátions depende da atração de macromoléculas carregadas de interesse (por exemplo, um vírus) em uma fase móvel para um substrato com uma carga oposta. Na cromatografia de troca catiônica, o substrato ou membrana com carga negativa atrai macromoléculas com carga positiva. Na cromato- grafia de troca aniônica, o substrato ou membrana com carga positiva atrai macromoléculas com carga negativa. Uma vez que as macromo- léculas são ligadas ou carregadas no substrato, elas podem ser eluí- das de maneira linear ou gradual do substrato de uma maneira depen- dente de suas características, promovendo assim uma separação de moléculas com cargas diferentes. Este princípio pode ser usado para purificar vírus a partir de outras macromoléculas. A eluição pode ser efetuada variando o pH ou o teor de sal do tampão da fase móvel. À eluição pode ser gradiente ou gradual. Conforme descrito neste docu-
mento, a eluição pode ser efetuada usando uma mudança no pH da fase móvel ou usando uma mudança na força iônica da fase móvel (por exemplo, através da adição de um sal). Uma variedade de sais é usada para eluição, incluindo, sem limitação, cloreto de sódio, cloreto de potássio, sulfato de sódio, sulfato de potássio, sulfato de amônio, acetato de sódio, fosfato de potássio, cloreto de cálcio e cloreto de magnésio. Em certas modalidades, o sal é NaCl. Uma variedade de tampões adequados é conhecida na técnica e descrita neste docu- mento. Métodos de purificação viral usando cromatografia de troca iô- nica também são geralmente conhecidos; ver, por exemplo, a purifica- ção do vírus influenza disponível on-line em www .pall.com/pdfs/Biopharmaceuticals/MustangQAXT AcroPrep USD2
916.pdf.
[00269] Uma variedade de dispositivos conhecidos na técnica é adequada para cromatografia de troca catiônica (opcionalmente inclu- indo filtração), como o sistema MustangO S (Pall Corporation), que uti- liza uma membrana de troca catiônica com um tamanho de poro de 0,65 um. Uma variedade de grupos funcionais é usada para membra- nas de troca catiônica, incluindo, sem limitação, grupos funcionais sul- fônicos pendentes em um revestimento polimérico reticulado. Uma va- riedade de tampões pode ser usada para ligar um eluato contendo um Zika vírus da presente invenção a uma membrana de troca catiônica. Os tampões exemplares incluem, sem limitação, tampões de citrato e fosfato (os tampões adicionais são descritos abaixo) Em algumas modalidades, um tampão usado na cromatografia de troca catiônica (por exemplo, em carga e/ou eluição) contém polissorbato (por exem- plo, TWEENQ-8O0 a 0,05%, 0,1%, 0,25% ou 0,5%).
[00270] Uma variedade de dispositivos conhecidos na técnica é adequada para cromatografia de troca aniônica (opcionalmente inclu- indo filtração), como o sistema Mustang& Q (Pall Corporation), que utiliza uma membrana de troca aniônica com um tamanho de poro de 0,8 um. Outra membrana de troca aniônica adequada é o SartobindQ IEXNano. Uma variedade de grupos funcionais é usada para membra- nas de troca aniônica, incluindo, sem limitação, grupos funcionais sul- fônicos pendentes em um revestimento polimérico reticulado. Uma va- riedade de tampões pode ser usada para ligar um eluato contendo um Zika vírus da presente invenção a uma membrana de troca aniônica. Os tampões exemplares incluem, sem limitação, tampão de fosfato (os tampões adicionais são descritos abaixo). Em algumas modalidades, um tampão usado na cromatografia de troca aniônica (por exemplo, em carga e/ou eluição) contém polissorbato (por exemplo, TWEENQG- 80 a 0,05%, 0,1%, 0,25% ou 0,5%). Em algumas modalidades, o vírus é eluído por eluição em etapas, por exemplo, usando NaCl 250 mM, NaCl 500 mM e NaCl 750 mM. Formulações e dose de vacinas e/ou composições imunogênicas
[00271] Outros aspectos da presente invenção referem-se a formu- lações de vacinas e/ou composições imunogênicas da presente inven- ção contendo um ou mais antígenos de um Zika vírus descrito neste documento.
[00272] Tais vacinas e/ou composições imunogênicas da presente invenção contendo um ou mais antígenos provenientes de um Zika vírus descrito neste documento podem ser úteis para tratar ou prevenir a infecção pelo Zika vírus em um sujeito humano em necessidade e/ou induzir uma resposta imune, como uma resposta imune protetora, con- tra o Zika vírus em um sujeito humano em necessidade.
[00273] Tipicamente, as vacinas e/ou composições imunogênicas da presente invenção são preparadas como injetáveis, como soluções líquidas ou suspensões; também podem ser preparadas formas sóli- das adequadas para solução ou suspensão em líquido antes da inje- ção. Tais preparações também podem ser emulsionadas ou produzi-
das como um pó seco. O ingrediente imunogênico ativo é frequente- mente misturado com excipientes que são farmaceuticamente aceitá- veis e compatíveis com o ingrediente ativo. Os excipientes adequados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, sacarose, glicerol, etanol ou similares e combinações dos mesmos. Além disso, se dese- jado, a vacina ou composição imunogênica pode conter substâncias auxiliares, como agentes umectantes ou emulsificantes, agentes tam- ponantes de pH ou adjuvantes que aumentam a eficácia da vacina ou composição imunogênica.
[00274] Vacinas ou composições imunogênicas podem ser conven- cionalmente administradas parentericamente, por injeção, por exem- plo, subcutânea, transcutânea, intradérmica, subdérmica ou intramus- cular. Em certas modalidades, a composição é administrada por via intramuscular ou subcutânea. Formulações adicionais que são ade- quadas para outros modos de administração incluem supositórios e, em alguns casos, formulações orais, perorais, intranasais, bucais, sub- linguais, intraperitoneais, intravaginais, anais e intracranianas. Para supositórios, ligantes e veículos tradicionais podem incluir, por exem- plo, polialcalaleno glicóis ou triglicerídeos; tais supositórios podem ser formados a partir de misturas que contêm o ingrediente ativo na faixa de 0,5% a 10%, ou mesmo 1-2%. Em certas modalidades, uma cera de baixo ponto de fusão, como uma mistura de glicéridos de ácidos graxos ou manteiga de cacau, é primeiro fundida e a vacina contra o Zika vírus e/ou a composição imunogênica descrita neste documento é dispersa homogeneamente, por exemplo, por agitação. A mistura ho- mogênea derretida é então derramada em moldes de tamanhos con- venientes e deixada resfriando e solidificando.
[00275] As formulações adequadas para administração intranasal incluem líquidos (por exemplo, solução aquosa para administração como aerossol| ou gotas nasais) e pós secos (por exemplo, para rápida deposição dentro da passagem nasal). As formulações incluem excipi- entes normalmente utilizados como, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, sacarose, trealose, xilitol e quitosana. Agentes mucosadesivos como a quitosana podem ser utilizados em formula- ções líquidas ou em pó para retardar a depuração mucociliar das for- mulações administradas por via intranasal. Açúcares como manitol, sorbitol, trealose e/ou sacarose podem ser utilizados como agentes de estabilidade em formulações líquidas e como agentes de estabilidade, volume ou fluxo de pó e tamanho em formulações de pó seco. Além disso, adjuvantes tais como monofosforil lipídio A (MLA), ou seus deri- vados, ou oligonucleotídeos CpG podem ser utilizados em formulações em pó líquido e seco como um adjuvante imunoestimulante.
[00276] As formulações adequadas para administração oral incluem líquidos, sólidos, semi-sólidos, géis, comprimidos, cápsulas, pastilhas e similares. As formulações adequadas para administração oral inclu- em comprimidos, pastilhas, cápsulas, géis, líquidos, produtos alimenta- res, bebidas, nutracêuticos e similares. As formulações incluem excipi- entes frequentemente empregados como, por exemplo, graus farma- cêuticos de manitol, sorbitol, trealose, polióis, tais como açúcares co- mo sacarose, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio e similares. Outras vacinas e compo- sições imunogênicas contra o Zika vírus podem assumir a forma de soluções, suspensões, pílulas, formulações ou pós de liberação sus- tentada e conter 10-95% do ingrediente ativo ou 25-70%. Para formu- lações orais, a toxina do cólera é um parceiro de formulação interes- sante (e também um possível parceiro de conjugação).
[00277] As vacinas e/ou composições imunogênicas contra o Zika vírus quando formuladas para administração vaginal podem estar na forma de pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ou sprays. Qualquer uma das formulações anteriores pode conter agentes além da vacina e/ou composições imunogênicas contra o Zika vírus, tais como veículos, conhecidos na técnica como apropriados.
[00278] Em algumas modalidades, as vacinas e/ou composições imunogênicas contra o Zika vírus da presente invenção podem ser formuladas para distribuição sistêmica ou localizada. Tais formulações são bem conhecidas na técnica. Os veículos parenterais incluem solu- ção de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de só- dio, solução lática de Ringer ou óleos fixos. Veículos intravenosos in- cluem repositores de fluido e nutrientes, repositores de eletrólitos (tais como aqueles baseados na dextrose de Ringer) e similares. As vias de administração sistêmica e localizada incluem, por exemplo, aplicação intradérmica, tópica, intravenosa, intramuscular, etc.
[00279] As vacinas e/ou composições imunogênicas da presente invenção podem ser administradas de uma maneira compatível com a formulação de dosagem e na quantidade que será terapeuticamente eficaz e imunogênica. A dosagem do antígeno pode variar em particu- lar de cerca de 1 ug a cerca de 100 ug, de cerca de 1 ug a cerca de 40 Vg, de cerca de 1 ug a cerca de 30 ug, de cerca de 1 ug a cerca de 20 Vg, de cerca de 1 ug a cerca de 15 ug, ou de cerca de 2 ug a cerca de ug, ou de cerca de 5 ug a cerca de 15 ug, ou de cerca de 10 ug à cerca de 15 ug. A dosagem pode, em particular, ser de cerca de 2 ug, cerca de 5 ug, cerca de 10 ug, cerca de 15 ug ou cerca de 20 ug, em particular cerca de 10 ug. A quantidade do antígeno, ou seja, do Zika vírus inativado purificado, pode ser determinada por um ensaio de Bradford (Bradford et al. (1976) Anal. Biochem. 72: 248-254) usando quantidades definidas da proteína recombinante do envelope do Zika para estabelecer a curva padrão. Assim, a dosagem do antígeno tam- bém pode ser referida como microgramas (ug) de proteína E do enve- lope do zika (ug Env). ug de antígeno e ug de Env significam o mesmo no significado desta descrição. Em algumas modalidades, as vacinas e/ou composições imunogênicas contêm uma dose de 1 ug a 15 ug, ou 2 ug, 5 ug ou 10 ug de antígeno na forma de um Zika vírus inteiro inativado purificado, como um Zika vírus com uma mutação que é um triptofano para substituição de glicina na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou numa posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, con- forme descrito neste documento.
[00280] Em algumas modalidades, a vacina ou composição imuno- gênica contém uma dose de 1 ug a 15 ug, ou 2 ug, 5 ug ou 10 ug do antígeno na forma de um Zika vírus inteiro inativado purificado com- preendendo uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 11, em que o Zika vírus é derivado da cepa PRVABCS59.
[00281] Em algumas modalidades, a vacina ou composição imuno- gênica contém uma dose de 1 ug a 15 ug, ou 2 pg, 5 ug ou 10 ug de antígeno na forma de um Zika vírus inteiro inativado purificado com- preendendo uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1, ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 11, em que o Zika vírus é derivado da cepa PRVABC59 compreendendo a sequência genômica de acordo com a SEQ ID NO: 2.
[00282] Em algumas modalidades, a vacina ou composição imuno- gênica contém uma dose de 1 ug a 15 ug, ou 2 ug, 5 ug ou 10 ug do antígeno na forma de um isolado de Zika vírus inteiro inativado com placa purificada compreendendo uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, em que o Zika vírus é derivado da cepa PRVABC59 compreendendo a sequência genômica de acordo com a SEQ ID NO:2.
[00283] Em certas modalidades, a vacina ou a composição imuno- gênica compreende uma dose de cerca de 10 ug de vírus inteiro inativado puri-
ficado cerca de 200 ug de hidróxido de alumínio, um tampão; e opcionalmente um açúcar como sacarose.
[00284] Os regimes adequados para administração inicial e doses de reforço também são variáveis, mas são tipificados por uma adminis- tração inicial seguida de inoculações subsequentes ou outras adminis- trações.
[00285] A maneira de aplicação pode variar amplamente. Qualquer um dos métodos convencionais para administração de uma vacina ou composição imunogênica é aplicável. Isto incluem a aplicação oral numa base sólida fisiologicamente aceitável ou numa dispersão fisio- logicamente aceitável, parentericamente, por injeção ou semelhante, por exemplo, administração intramuscular ou subcutânea. A dosagem da vacina ou composição imunogênica dependerá da via de adminis- tração e pode variar de acordo com a idade da pessoa a ser vacinada e a formulação do antígeno. A vacina ou composição imunogênica po- de ter um volume de dosagem unitária superior a 0,5 mL, de 0,5 mL ou inferior a 0,5 mL, conforme descrito neste documento. Por exemplo, pode ser administrado em um volume de 0,25 ml. Um volume de 0,5 mL é adequado para administração intramuscular ou subcutânea.
[00286] Os agentes de distribuição que melhoram a mucoaderência também podem ser utilizados para melhorar a distribuição e imunoge- nicidade, especialmente para formulações de entrega intranasais, orais ou pulmonares. Um desses compostos, a quitosana, a forma de quitina N-desacetilada, é usada em muitas formulações farmacêuticas. É um agente mucoadesivo atraente para a administração de vacina intranasal devido à sua capacidade de retardar a depuração mucociliar e permitir mais tempo para captação e processamento de antígeno da mucosa. Além disso, pode abrir transitoriamente junções estreitas que podem aprimorar o transporte transepitelial do antígeno para o NALT. Em um estudo recente em humanos, uma vacina trivalente inativada contra influenza administrada por via intranasal com quitosana, mas sem nenhum adjuvante adicional, produziu soroconversão e títulos de HI que eram apenas marginalmente inferiores aos obtidos após a ino- culação intramuscular.
[00287] A quitosana também pode ser formulada com adjuvantes que funcionam bem por via intranasal, como o mutante LTK63 de ente- rotoxina lábil ao calor geneticamente desintoxicado de E. coli. Isto adi- ciona um efeito imunoestimulante sobre os benefícios de distribuição e aderência conferidos pela quitosana, resultando em respostas sistêmi- cas e mucosas aprimoradas.
[00288] Finalmente, deve-se notar que as formulações de quitosana também podem ser preparadas em um formato de pó seco que de- monstrou melhorar a estabilidade da vacina e resultar em um atraso adicional na depuração mucociliar sobre formulações líquidas. Isso foi observado em um recente ensaio clínico em humanos envolvendo uma vacina intranasal para o toxoide da difteria em pó seco formulada com quitosana, na qual a via intranasal era tão eficaz quanto a via in- tramuscular tradicional, com o benefício adicional de respostas secre- toras de IgA. A vacina também foi muito bem tolerada. As vacinas in- tranasais em pó seco para antraz contendo quitosana e MLA, ou deri- vados destas, induzem respostas mais fortes em coelhos do que a inoculação intramuscular e também protegem contra exposição a es- poros de aerossóis.
[00289] As vacinas intranasais representam uma formulação exem- plar, pois podem afetar o trato respiratório superior e inferior, em con- traste com as vacinas administradas por via parentérica, que são me- lhores para afetar o trato respiratório inferior. Isso pode ser benéfico para induzir tolerância a vacinas baseadas em alergênios e induzir imunidade a vacinas baseadas em patógenos.
[00290] Além de fornecer proteção no trato respiratório superior e inferior, as vacinas intranasais evitam as complicações das inocula- ções com agulha e fornecem um meio de induzir respostas humorais e celulares mucosas e sistêmicas por meio da interação de antígenos particulados e/ou solúveis com tecidos linfoides associados à nasofa- ringe (NALT).
[00291] As vacinas e/ou composições imunogênicas da presente invenção são farmaceuticamente aceitáveis. Eles podem incluir com- ponentes além do antígeno e adjuvante, por exemplo, incluirão tipica- mente um ou mais carreador(es) e/ou excipiente(s) farmacêutico(s). Uma discussão aprofundada desses componentes está disponível em Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20º edição, ISBN: 0683306472.
[00292] Para controlar a tonicidade, é preferível incluir um sal fisio- lógico, como um sal de sódio. É preferido o cloreto de sódio (NaCl), que pode estar presente entre 1 e 20 mg/ml. Outros sais que podem estar presentes incluem cloreto de potássio, di-hidrogenofosfato de potássio, fosfato dissódico desidratado, cloreto de magnésio, cloreto de cálcio, etc.
[00293] As vacinas e/ou composições imunogênicas da presente invenção podem incluir um ou mais tampões. Os tampões típicos in- cluem: um tampão de fosfato; um tampão de Tris; um tampão de bora- to; um tampão de succinato; um tampão de histidina (particularmente com um adjuvante de hidróxido de alumínio); ou um tampão de citrato. Os tampões normalmente serão incluídos na faixa de 5 a 20 mM.
[00294] O pH de uma vacina ou composição imunogênica geral- mente estará entre 5,0 e 8,5 ou 5,0 e 8,1 e mais tipicamente entre 6,0 e 8,5, por exemplo, entre 6,0 e 8,0, entre 6,5 e 8,0, entre 6,5 e 7,5, en- tre 7,0 e 8,5, entre 7,0 e 8,0 ou entre 7,0 e 7,8. Um processo de fabri-
cação da presente invenção pode, portanto, incluir uma etapa de ajus- te do pH da vacina a granel antes da embalagem.
[00295] A vacina ou composição imunogênica é preferencialmente estéril. É preferencialmente não pirogênico, por exemplo, contendo <1 UE (unidade de endotoxina, uma medida padrão) por dose e, prefe- rencialmente, <0,1 UE por dose. É preferencialmente sem glúten.
[00296] Em certas modalidades, as vacinas e/ou composições imu- nogênicas da presente invenção podem incluir um detergente em uma concentração eficaz. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de detergente pode incluir, sem limitação, cerca de 0,00005% v/v a cerca de 5% v/v ou cerca de 0,0001% v/v a cerca de 1% v/v. Em cer- tas modalidades, uma quantidade eficaz de detergente é de cerca de 0,001% v/v, cerca de 0,002% v/v, cerca de 0,003% v/v, cerca de 0,004% v/v, cerca de 0,005% v/v, cerca de 0,006% v/v, cerca de 0,007% v/v, cerca de 0,008% v/v, cerca de 0,009% v/v ou cerca de 0,01% v/v. Sem querer estar limitado pela teoria, os detergentes aju- dam a manter as vacinas e/ou composições imunogênicas da presente invenção em solução e ajudam a impedir que as vacinas e/ou compo- sições imunogênicas se agreguem.
[00297] Detergentes adequados incluem, por exemplo, surfactante de éster de polioxietileno sorbitano (conhecido como 'Tweens'), octoxi- nol (como octoxinol-9 (Triton X 100) ou t-octilfenoxipolietoxietanol), brometo de cetil trimetil amônio ((CTAB') e desoxicolato de sódio, parti- cularmente para uma vacina antígena dividida ou superficial. O deter- gente pode estar presente apenas em pequenas quantidades. Outros componentes residuais em pequenas quantidades poderiam ser anti- bióticos (por exemplo, neomicina, canamicina, polimixina B). Em algu- mas modalidades, o detergente contém polissorbato. Em algumas mo- dalidades, a concentração eficaz de detergente inclui faixas de cerca de 0,00005% v/v a cerca de 5% v/v.
[00298] As vacinas e/ou composições imunogênicas são preferen- cialmente armazenadas entre 2ºC e 8ºC. Idealmente, eles devem ser mantidos fora da luz direta. O antígeno e a emulsão estarão tipicamen- te em mistura, embora possam inicialmente ser apresentados na forma de um kit de componentes separados para mistura extemporânea. As vacinas e/ou composições imunogênicas geralmente estarão na forma aquosa quando administradas a um sujeito humano. Métodos da presente invenção
[00299] A presente invenção é, em particular, também direcionada a um método de tratamento ou prevenção, em particular prevenção da infecção pelo Zika vírus e/ou prevenção da doença pelo Zika vírus em um sujeito humano em necessidade, compreendendo a administração a um sujeito humano ou a uma população de seres humanos de uma quantidade terapêutica eficaz de uma vacina ou composição imunogê- nica conforme descrito neste documento.
[00300] A doença é geralmente leve e de curta duração. Algumas manifestações clínicas incluem, entre outras, febre leve, erupção cutâ- nea maculopapular, conjuntivite e artralgia. Apesar de sintomas clíni- cos leves em mulheres grávidas, a infecção pelo Zika vírus durante a gravidez tem sido associada a resultados graves para o feto e o re- cém-nascido. A gravidade da doença está relacionada às consequên- cias no feto e no recém-nascido de mulheres com infecção pelo Zika vírus durante a gravidez. O espectro de anomalias congênitas associ- adas à infecção pelo Zika vírus, conhecido como Síndrome do Zika Congênito (CZS), consiste em microcefalia grave com crânio parcial- mente colapsado, córtices cerebrais com calcificações subcorticais, cicatrizes maculares e manchas na retina pigmentar focal, contraturas congênitas e hipertonia precoce acentuada com sintomas de envolvi- mento extrapiramidal. Além disso, o Zika vírus é um flavivírus neuro- trópico que pode causar doenças no sistema nervoso central. Além disso, existe uma preocupação mundial com o Zika vírus que causa a Síndrome de Guillain-Barré (GBS).
[00301] A prevenção da doença do Zika vírus, portanto, não diz respeito apenas ao sujeito humano em tratamento, mas se estende ao feto e ao recém-nascido, caso o sujeito humano em tratamento esteja ou venha a ficar grávida. O método de acordo com a invenção com- preende, assim, tratar o sujeito humano, administrando ao sujeito hu- mano a vacina ou composição imunogênica e o tratamento do feto e do recém-nascido, administrando a um sujeito humano grávida ou um sujeito humano que pretenda engravidar ou mulher com potencial para engravidar a vacina ou a composição imunogênica.
[00302] Outros aspectos da presente invenção referem-se a méto- dos para o uso de vacinas e/ou composições imunogênicas descritas neste documento contendo um ou mais antígenos de pelo menos um Zika vírus (por exemplo, um isolado clonal do Zika vírus, um Zika vírus compreendendo uma mutação de adaptação celular não humana tal como uma mutação de adaptação celular não humana na proteína NS1) para tratar ou prevenir o Zika vírus em um sujeito humano em necessidade e/ou para induzir uma resposta imune ao Zika vírus em um sujeito humano em necessidade.
[00303] Em alguns desses métodos, as vacinas e/ou composições imunogênicas contêm uma dose de 1 ug a 15 ug, ou 2 ug, 5 ug ou 10 pg de um Zika vírus inteiro inativado purificado, como um Zika vírus com uma mutação que é uma substituição de triptofano por glicina na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, conforme descrito neste documento, op- cionalmente em combinação com um ou mais adjuvantes, como 100 Vg a cerca de 300 ug ou cerca de 150 ug a cerca de 250 ug ou cerca de 200 ug de alúmen, como hidróxido de alumínio.
[00304] Em alguns desses métodos, a vacina ou composição imu-
nogênica contém uma dose de 1 ug a 15 ug, ou 2 ug, 5 ug ou 10 ug de um Zika vírus inteiro inativado purificado compreendendo uma muta- ção Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição cor- respondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, em que o Zika vírus é de- rivado da cepa PRVABC59 opcionalmente em combinação com um ou mais adjuvantes, como 100 ug a cerca de 600 ug ou cerca de 150 ug a cerca de 250 ug ou cerca de 200 ug de alúmen, como hidróxido de alumínio.
[00305] Em alguns dessas métodos, a vacina ou composição imu- nogênica contém uma dose de 1 ug a 15 ug, ou 2 ug, 5 ug ou 10 ug de um Zika vírus inteiro inativado purificado compreendendo uma muta- ção Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição cor- respondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, em que o Zika vírus é de- rivado da cepa PRVABC59 compreendendo a sequência genômica de acordo com a SEQ ID NO: 2 opcionalmente em combinação com um ou mais adjuvantes, como 100 ug a cerca de 600 ug ou cerca de 150 jpg a cerca de 250 ug ou cerca de 200 ug de alúmen, como hidróxido de alumínio.
[00306] Em alguns desses métodos, a vacina ou composição imu- nogênica contém uma dose de 1 ug a 15 ug, ou 2 ug, 5 ug ou 10 ug de um isolado de Zika vírus inteiro inativado com placa purificada com- preendendo uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 11, em que o Zika vírus é derivado da cepa PRVABC59 compreendendo a sequência genômica de acordo com a SEQ ID NO: 2 opcionalmente em combinação com um ou mais adjuvantes, como 100 ug a cerca de 600 ug ou cerca de 150 ug a cerca de 250 ug ou cerca de 200 ug de alúmen, como hidróxido de alumínio.
[00307] Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se a métodos para tratar ou prevenir a infecção pelo Zika vírus em um su-
jeito humano em necessidade, administrando ao sujeito humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina e/ou composição imunogênica da presente invenção contendo um ou mais antígenos provenientes de pelo menos um Zika vírus (por exemplo, um isolado clonal do Zika vírus, um Zika vírus compreendendo uma mutação de adaptação celular não humana, como uma mutação de adaptação ce- lular não humana na proteína NS1). Em algumas modalidades, a pre- sente invenção refere-se a métodos para induzir uma resposta imune ao Zika vírus em um sujeito humano em necessidade, administrando ao sujeito humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina e/ou composição imunogênica da presente invenção contendo um ou mais antígenos de pelo menos um Zika vírus (por exemplo, um isolado clonal do Zika vírus, um Zika vírus compreendendo uma muta- ção de adaptação celular não humana, como uma mutação de adapta- ção celular não humana na proteína NS1). Em algumas modalidades, a etapa de administração induz uma resposta imune protetora contra o Zika vírus no sujeito humano. Em algumas modalidades, o sujeito hu- mano está grávida ou pretende engravidar ou é uma mulher com po- tencial para engravidar.
[00308] As vacinas contra o Zika vírus e/ou composições imunogê- nicas divulgadas neste documento podem ser usadas para proteger ou tratar um sujeito humano suscetível a, ou sofrendo de uma infecção viral, por meio da administração da vacina por via intranasal, peroral, oral, bucal, sublingual, intramuscular, administração intraperitoneal, intradérmica, transdérmica, subdérmica, intravaginal, anal, intracrania- na, intravenosa, transcutânea ou subcutânea, em particular adminis- tração intramuscular. Os métodos de administração sistêmica das va- cinas e/ou composições imunogênicas da presente invenção podem incluir seringas e agulhas convencionais, ou dispositivos projetados para distribuição balística de vacinas sólidas (WO 99/27961) ou dispo-
sitivo de jato de líquido sem pressão (Pat. US Nº 4.596.556; Pat. US Nº 5.993.412) ou adesivos transdérmicos (WO 97/48440; WO 98/28037). As vacinas contra o Zika vírus e/ou composições imunogê- nicas da presente invenção também podem ser aplicadas à pele (dis- tribuição transdérmica ou transcutânea WO 98/20734; WO 98/28037). As vacinas contra o Zika vírus e/ou composições imunogênicas da presente invenção, portanto, podem incluir um dispositivo de adminis- tração para administração sistêmica, pré-carregado com a vacina ou composições imunogênicas contra o Zika vírus. Por conseguinte, são fornecidos métodos para tratar ou prevenir a infecção pelo Zika vírus e/ou para induzir uma resposta imune em um sujeito humano, incluin- do a etapa de administrar uma vacina ou composição imunogênica da presente invenção e, opcionalmente, incluindo um adjuvante e/ou um carreador, ao sujeito humano, onde a vacina ou a composição imuno- gênica é administrada por via parentérica ou sistêmica.
[00309] As vacinas e/ou composições imunogênicas da presente invenção podem ser usadas para proteger ou tratar um sujeito humano suscetível a, ou sofrendo de uma infecção viral, por meio da adminis- tração da vacina ou composição imunogênica por via mucosa, como a via oral/alimentar ou nasal. As vias mucosas alternativas são intrava- ginais e intrarretais. A via de administração da mucosa pode ser por via nasal, denominada vacinação intranasal. Os métodos de vacinação intranasal são bem conhecidos na técnica, incluindo a administração de uma forma de gota, spray ou pó seco da vacina na nasofaringe do indivíduo a ser imunizado. Formulações de vacina nebulizadas ou em aerossol| são formas potenciais das vacinas e/ou composições imuno- gênicas contra o Zika vírus divulgadas neste documento. Formulações entéricas, como cápsulas e grânulos gastrorresistentes para adminis- tração oral, supositórios para administração retal ou vaginal, também são formulações das vacinas e/ou composições imunogênicas da pre-
sente invenção.
[00310] As vacinas contra o Zika vírus e/ou composições imunogê- nicas da presente invenção também podem ser administradas por via oral. Nesses casos, o excipiente farmaceuticamente aceitável também pode incluir tampões alcalinos ou cápsulas entéricas ou microgrânulos. As vacinas contra o Zika vírus e/ou composições imunogênicas da presente invenção também podem ser administradas pela via vaginal. Nesses casos, os excipientes farmaceuticamente aceitáveis também podem incluir emulsificantes, polímeros como CARBOPOLO e outros estabilizadores conhecidos de cremes e supositórios vaginais. As va- cinas contra o Zika vírus e/ou composições imunogênicas também po- dem ser administradas pela via retal. Nesses casos, os excipientes também podem incluir ceras e polímeros conhecidos na técnica para formar supositórios retais.
[00311] Em algumas modalidades, a etapa de administração inclui uma ou mais administrações. A administração pode ser feita por um esquema de dose única ou um esquema de doses múltiplas (primária- reforço). Em um esquema de doses múltiplas, as várias doses podem ser administradas pela mesma ou por diferentes vias, por exemplo, um estímulo primário e mucoso parenteral, um estímulo primário e mucoso parenteral, etc. Normalmente, elas são administrados pela mesma via, como por administração intramuscular ou subcutânea. Normalmente, doses múltiplas serão administradas com intervalo de pelo menos 1 semana (por exemplo, cerca de | semana, cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 4 semanas, cerca de 5 semanas, cerca de 6 semanas, cerca de 7 semanas, cerca de 8 semanas, cerca de 9 se- manas, aproximadamente 10 semanas, cerca de 11 semanas, cerca de 12 semanas, cerca de 16 semanas etc., como intervalos de 1 a 16 semanas). Dar duas doses separadas por 25 a 30 dias (por exemplo, 28 dias, 4 semanas) é particularmente útil. Em certas modalidades, o modo de administração é a administração intramuscular ou subcutâ- nea.
[00312] Os métodos da presente invenção incluem administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz ou uma quantidade imu- nogênica das vacinas contra o Zika vírus e/ou composições imunogê- nicas da presente invenção. Uma quantidade terapeuticamente eficaz ou uma quantidade imunogênica pode ser uma quantidade das vaci- nas e/ou composições imunogênicas da presente invenção que induzi- rão uma resposta imunológica protetora no sujeito humano não infec- tado, infectado ou não exposto ao qual é administrado. Essa resposta geralmente resultará no desenvolvimento no sujeito humano de uma resposta imune secretora, celular e/ou mediada por anticorpos à vaci- na. Geralmente, essa resposta inclui, mas não se limita a, um ou mais dos seguintes efeitos; a produção de anticorpos de qualquer uma das classes imunológicas, tais como imunoglobulinas A, D, E GouM; a proliferação de linfócitos B e T; o fornecimento de sinais de ativação, crescimento e diferenciação para células imunológicas; expansão da célula T auxiliar, célula T supressora e/ou célula T citotóxica.
[00313] Em alguns desses métodos, as vacinas e/ou composições imunogênicas contêm uma dose de 1 ug a 15 ug, ou 2 ug, 5 ug ou 10 pg de um Zika vírus inteiro inativado purificado, como um Zika vírus com uma mutação que é uma substituição de triptofano por glicina na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, conforme descrito neste documento, op- cionalmente em combinação com um ou mais adjuvantes, como 100 Vg a cerca de 600 ug ou cerca de 150 ug a cerca de 250 ug ou cerca de 200 ug de alúmen, como hidróxido de alumínio.
[00314] Em alguns desses métodos, a vacina ou composição imu- nogênica contém uma dose de 1 ug a 15 ug, ou 2 ug, 5 ug ou 10 ug de um Zika vírus inteiro inativado purificado compreendendo uma muta-
ção Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição cor- respondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, em que o Zika vírus é de- rivado da cepa PRVABC59 opcionalmente em combinação com um ou mais adjuvantes, como 100 ug a cerca de 600 ug ou cerca de 150 ug a cerca de 250 ug ou cerca de 200 ug de alúmen, como hidróxido de alumínio.
[00315] Em alguns dessas métodos, a vacina ou composição imu- nogênica contém uma dose de 1 ug a 15 ug, ou 2 ug, 5 ug ou 10 ug de um Zika vírus inteiro inativado purificado compreendendo uma muta- ção Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição cor- respondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, em que o Zika vírus é de- rivado da cepa PRVABC59 compreendendo a sequência genômica de acordo com a SEQ ID NO: 2 opcionalmente em combinação com um ou mais adjuvantes, como 100 ug a cerca de 600 ug ou cerca de 150 Vg a cerca de 250 ug ou cerca de 200 ug de alúmen, como hidróxido de alumínio.
[00316] Em alguns desses métodos, a vacina ou composição imu- nogênica contém uma dose de 1 ug a 15 ug, ou 2 ug, 5 ug ou 10 ug de um isolado de Zika vírus inteiro inativado com placa purificada com- preendendo uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, em que o Zika vírus é derivado da cepa PRVABC59 compreendendo a sequência genômica de acordo com a SEQ ID NO: 2 opcionalmente em combinação com um ou mais adjuvantes, como 100 ug a cerca de 600 ug ou cerca de 150 ug a cerca de 250 ug ou cerca de 200 ug de alúmen, como hidróxido de alumínio.
[00317] Em certos métodos, a administração da vacina ou composi- ção imunogênica induz a geração de títulos de anticorpos neutralizan- tes do Zika vírus em um sujeito humano maior que 10, ou maior que 50, ou maior que 100, ou maior que 200 ou maior que 1000, ou maior que 1500, ou maior que 2000, ou maior que 2000, ou maior que 3000, conforme determinado pelo teste de neutralização por redução de pla- cas (PRNT).
[00318] Em certos métodos, a administração da vacina ou composi- ção imunogênica induz a geração de títulos de anticorpos neutralizan- tes para o Zika vírus em um sujeito humano maior que 300 ou maior que 500, ou maior que 1000, ou maior que 1500, ou maior que 2000, ou maior que 2000, ou maior que 3000, ou maior que 5000, ou maior que 10.000, conforme determinado pelo ensaio de neutralização de partículas virais repórteres (RVP).
[00319] Em certos métodos, os títulos de anticorpos neutralizantes acima são obtidos 14 e/ou 28 dias após a administração.
[00320] Em certos métodos, 14 e/ou 28 dias após a administração da vacina ou composição imunogênica, a geração de títulos de anti- corpos neutralizantes para o Zika vírus em um ser humano é maior que 250, conforme determinado pelo teste de neutralização por redu- ção de placa (PRNT).
[00321] Em certos métodos, 14 e/ou 28 dias após a administração da vacina ou composição imunogênica, a geração de títulos de anti- corpos neutralizantes do Zika vírus em um sujeito humano é maior que 1000, conforme determinado pelo ensaio de neutralização de partícu- las virais repórteres (RVP).
[00322] Em certos métodos, esses títulos são obtidos 14 e/ou 28 dias após a administração. Essa geração de anticorpos neutralizantes fornece altas taxas de soroconversão em uma população soronegativa para o Zika vírus de pelo menos 20 seres humanos. Em certas moda- lidades, a taxa de soroconversão é de pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100%.
[00323] Em certos métodos, esses títulos são obtidos 14 e/ou 28 dias após a administração. Essa geração de anticorpos naturalizado-
res proporciona altas taxas de soropositividade em uma população, em particular em uma população soronegativa para o Zika vírus, de pelo menos 20 seres humanos. Em certas modalidades, a taxa de so- ropositividade é de pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo me- nos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pe- lo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%.
[00324] De acordo com o método da invenção, a vacina ou a com- posição imunogênica é administrada como uma dose única ou como doses múltiplas, como por exemplo, em uma primeira administração (primária) e uma segunda (reforço), como, por exemplo, administradas com 1 a 16 semanas de intervalo. Em alguns desses métodos, a se- gunda administração (reforço) é administrada pelo menos 28 dias após a primeira administração (primária).
[00325] Em alguns desses métodos, 14 e/ou 28 dias após a admi- nistração de uma dose única ou de doses múltiplas, como por exem- plo, em uma primeira administração (primária) e após uma segunda administração (reforço), é obtida uma alta taxa de soroconversão em uma população soronegativa para o Zika vírus, de pelo menos 20 se- res humanos. Em algumas dessas modalidades, a taxa de sorocon- versão é de pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pe- lo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo me- nos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%.
[00326] Em alguns desses métodos, incluindo a administração co- mo a primeira (primária) e a segunda (reforço) administração 14 e/ou 28 dias após a segunda (reforço) administração, é obtida uma alta taxa de soroconversão em uma população soronegativa para o Zika vírus, de pelo menos 20 indivíduos humanos. Em algumas dessas modalida- des, a taxa de soroconversão é de pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo me- nos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pe- lo menos 99% ou 100%.
[00327] Em alguns desses métodos, 14 e/ou 28 dias após a admi- nistração em dose única ou após a primeira administração (primária), é obtida uma alta taxa de soroconversão em uma população soronegati- va para o Zika vírus, de pelo menos 20 seres humanos. Em algumas dessas modalidades, a taxa de soroconversão é de pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.
[00328] Em alguns desses métodos, 14 e/ou 28 dias após a admi- nistração de uma dose única ou de doses múltiplas, como por exem- plo, em uma primeira administração (primária) e após uma segunda administração (reforço), é obtida uma alta taxa de soropositividade em uma população, em particular, em uma população soronegativa para o Zika vírus ou em uma população não-exposta a Flavivírus, de pelo menos 20 seres humanos. Em certas modalidades, a taxa de soroposi- tividade é de pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pe- lo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo me-
nos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pe- lo menos 99% ou 100%.
[00329] Em alguns desses métodos, incluindo a administração co- mo a primeira (primária) e a segunda (reforço) administração 14 e/ou 28 dias após a segunda (reforço) administração, é obtida uma alta taxa de soropositividade em uma população, em particular em uma popula- ção soronegativa para o Zika vírus, de pelo menos 20 seres humanos. Em algumas dessas modalidades, a taxa de soropositividade é de pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pe- lo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo me- nos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%.
[00330] Em alguns desses métodos, 14 e/ou 28 dias após a admi- nistração como uma dose única ou após a primeira (primária) adminis- tração é obtida uma alta taxa de soropositividade em uma população, em particular, em uma população soronegativa para o Zika vírus ou em uma população não-exposta a Flavivírus, de pelo menos 20 seres humanos. Em algumas dessas modalidades, a taxa de soropositivida- de é de 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.
[00331] Em alguns desses métodos, 14 e/ou 28 dias após a admi- nistração de dose única ou primária da vacina ou composição imuno- gênica, os títulos de anticorpos neutralizantes do Zika vírus em um su- jeito humano, em particular um sujeito humano não exposto a flavivírus ou em particular em um sujeito humano soronegativo para Zika vírus, são maiores que 200, conforme determinado pelo teste de neutraliza-
ção por redução de placas (PRNT).
[00332] Em alguns desses métodos, 14 e/ou 28 dias após a admi- nistração de dose única ou primária vacina ou composição imunogêni- ca, os títulos geométricos médios de anticorpos neutralizantes do Zika vírus, em particular em uma população não-exposta a flavivírus ou em particular em uma população soronegativa para o Zika vírus de pelo menos 20 seres humanos são maiores que 200, conforme determina- do pelo teste de neutralização por redução de placas (PRNT).
[00333] Em alguns desses métodos, 14 e/ou 28 dias após a admi- nistração de dose única ou primária da vacina ou composição imuno- gênica, os títulos de anticorpos neutralizantes do Zika vírus em um su- jeito humano, em particular um sujeito humano não exposto a flavivírus ou em particular em um sujeito humano soronegativo para Zika vírus, são maiores que 1000, conforme determinado pelo ensaio de neutrali- zação de partículas virais repórteres (RVP).
[00334] Em alguns desses métodos, 14 e/ou 28 dias após a admi- nistração de dose única ou primária da vacina ou composição imuno- gênica, os títulos geométricos médios de anticorpos neutralizantes do Zika vírus, em particular em uma população não-exposta a flavivírus ou em particular em uma população soronegativa para o Zika vírus de pelo menos 20 seres humanos são maiores que 1000, conforme de- terminado pelo ensaio de neutralização de partículas virais repórteres (RVP).
[00335] Essa geração de anticorpos neutralizantes fornece altas taxas de soroconversão em uma população não-exposta a flavivírus ou em particular em uma população soronegativa para o Zika vírus de pelo menos 20 seres humanos após a administração de dose única ou primária. Em algumas dessas modalidades, a taxa de soroconversão é de 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pe-
lo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo me- nos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%.
[00336] Essa geração de anticorpos neutralizantes fornece altas taxas de soropositividade em uma população, em particular em uma população não-exposta a flavivírus ou em particular em uma popula- ção soronegativa para o Zika vírus de pelo menos 20 seres humanos após a administração de dose única ou primária. Em algumas dessas modalidades, a taxa de soropositividade é de 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo me- nos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pe- lo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%.
[00337] Em alguns desses métodos, a administração compreende administração primária e de reforço, em que a administração primária e de reforço ocorre de cerca de 1 a cerca de 16 semanas. Em alguns desses métodos, a segunda administração (reforço) é administrada pelo menos 28 dias após a primeira administração (primária).
[00338] Em alguns desses métodos, 14 e/ou 28 dias após a admi- nistração de reforço da vacina ou composição imunogênica, os títulos de anticorpos neutralizantes do Zika vírus em um sujeito humano, em particular um sujeito humano não exposto a flavivírus ou em particular em um sujeito humano soronegativo para Zika vírus, são maiores que 1000, ou maiores que 1500 ou maiores que 3000, conforme determi- nado pelo teste de neutralização por redução de placas (PRNT).
[00339] Em alguns desses métodos, 14 e/ou 28 dias após a admi-
nistração de reforço da vacina ou composição imunogênica, os títulos geométricos médios de anticorpos neutralizantes do Zika vírus, em particular em uma população não-exposta a flavivírus ou em particular em uma população soronegativa para o Zika vírus de pelo menos 20 seres humanos são maiores que 1000, ou maiores que 1500 ou maio- res que 3000, conforme determinado pelo teste de neutralização por redução de placas (PRNT).
[00340] Em alguns desses métodos, 14 e/ou 28 dias após a admi- nistração de reforço da vacina ou composição imunogênica, os títulos de anticorpos neutralizantes do Zika vírus em um sujeito humano, em particular um sujeito humano não exposto a flavivírus ou em particular em um sujeito humano soronegativo para Zika vírus, são maiores que 3000, ou maiores que 5000, ou maiores que 10000, conforme determi- nado pelo ensaio de neutralização de partículas virais repórteres (RVP).
[00341] Em alguns desses métodos, 14 e/ou 28 dias após a admi- nistração de reforço da vacina ou composição imunogênica, os títulos geométricos médios de anticorpos neutralizantes do Zika vírus, em particular em uma população não-exposta a flavivírus ou em particular em uma população soronegativa para o Zika vírus de pelo menos 20 seres humanos são maiores que 3000, ou maiores que 5000 ou maio- res que 10000, conforme determinado pelo ensaio de neutralização de partículas virais repórteres (RVP).
[00342] Essa geração de anticorpos neutralizantes fornece altas taxas de soroconversão em uma população não-exposta a flavivírus ou em particular em uma população soronegativa para o Zika vírus de pelo menos 20 seres humanos após a administração de reforço. Em certas modalidades, a taxa de soroconversão é de pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo me-
nos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pe- lo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%.
[00343] Essa geração de anticorpos neutralizantes fornece altas taxas de soropositividade em uma população, em particular em uma população não-exposta a flavivírus, de pelo menos 20 seres humanos após a administração de reforço. Em certas modalidades, a taxa de soropositividade é de 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pe- lo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo me- nos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%.
[00344] Essa geração de anticorpos neutralizantes fornece altas taxas de soroconversão em uma população não-exposta a flavivírus ou em particular em uma população soronegativa para o Zika vírus de pelo menos 20 seres humanos após a administração de dose única ou primária. Em certas modalidades, a taxa de soroconversão é de pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pe- lo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%.
[00345] Essa geração de anticorpos neutralizantes fornece altas taxas de soroconversão em uma população não-exposta a flavivírus ou em particular em uma população soronegativa para o Zika vírus de pelo menos 20 seres humanos após a administração de dose única ou primária. Em algumas dessas modalidades, a taxa de soropositividade é de pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo me- nos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pe- lo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%.
[00346] Além disso, certos aspectos da presente invenção referem- se a um método de tratamento ou prevenção, em particular prevenção da infecção pelo Zika vírus em uma população de seres humanos em necessidade, compreendendo administrar a seres humanos individuais da referida população de seres humanos uma vacina ou composição imunogênica compreendendo antígeno proveniente de um Zika vírus, em que a vacina ou a composição imunogênica é administrada como uma dose única ou como doses múltiplas, como por exemplo, em uma primeira administração (primária) e uma segunda (reforço) e em que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração induz efeitos colaterais sistêmicos em menos de 50% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres huma- nos, em particular em uma população de pelo menos 20 seres huma- nos não expostos a flavivírus ou em particular em uma população de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para Zika vírus.
[00347] De acordo com certos aspectos da presente invenção, a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração induz sintomas de dor de cabeça em menos de 29% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres huma- nos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos so- ronegativos para Zika vírus.
[00348] De acordo com certos aspectos da presente invenção, a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração induz febre em 4% ou menos e/ou fadiga em 33% ou menos e/ou artralgia em 10% ou menos, e/ou mialgia em 17% ou me- nos, e/ou mal-estar em 15% ou menos de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para Zika vírus.
[00349] De acordo com certos aspectos da presente invenção, a vacina ou composição imunogênica é administrada como doses múlti- plas em uma primeira administração (primária) e uma segunda (refor- ço) e a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 di- as após a administração de reforço induz efeitos colaterais sistêmicos em menos de 40% de uma população de seres humanos de pelo me- nos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para Zika vírus.
[00350] De acordo com certos aspectos da presente invenção, a vacina ou a composição imunogênica é administrada como doses múl- tiplas em uma primeira administração (primária) e uma segunda (refor- ço) e a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 di- as após a administração de reforço induz — pelomenos 40% menos ou 45% menos fadiga e/ou — nenhuma febre e/ou — nenhuma, ou pelo menos 10% menos, ou pelo menos 20% menos, ou pelo menos 25% menos mialgia, e/ou — nenhuma, ou pelo menos 10% menos, ou pelo menos 20% menos mal-estar comparado com 7 dias após a administração primária em uma população de seres humanos de pelo menos 20 se- res humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00351] A'"% de redução de eventos adversos (EAs) após a admi-
nistração de reforço em comparação com a administração inicial" é definida pela seguinte equação: Foca ans. Do — Eaieadnloarma EAR in So A astaaa vr TT aa EAE EDMO 69 rrcmgidioomechttaiominríánia cs
EX
[00352] De acordo com certos aspectos da presente invenção, a vacina ou composição imunogênica é administrada como doses múlti- plas em uma primeira administração (primária) e uma segunda (refor- ço) e a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 di- as após a administração de reforço induz febre em menos de 4% ou 0% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres huma- nos soronegativos para Zika vírus.
[00353] De acordo com certos aspectos da presente invenção, a vacina ou composição imunogênica é administrada como doses múlti- plas em uma primeira administração (primária) e uma segunda (refor- ço) e a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 di- as após a administração de reforço induz efeitos fadiga em menos de 19% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres huma- nos soronegativos para Zika vírus.
[00354] De acordo com certos aspectos da presente invenção, a vacina ou composição imunogênica é administrada como doses múlti- plas em uma primeira administração (primária) e uma segunda (refor- ço) e a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 di- as após a administração de reforço induz mialgia em menos de 12% ou menos de 8% de uma população de seres humanos de pelo menos seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 se- res humanos soronegativos para Zika vírus.
[00355] De acordo com certos aspectos da presente invenção, a vacina ou composição imunogênica é administrada como doses múlti- plas em uma primeira administração (primária) e uma segunda (refor- ço) e a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 di- as após a administração de reforço induz mal-estar em menos de 13% ou 10% ou menos de uma população de seres humanos de pelo me- nos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para Zika vírus.
[00356] De acordo com certos aspectos da presente invenção, a vacina ou a composição imunogênica é administrada como doses múl- tiplas em uma primeira administração (primária) e uma segunda (refor- ço) e a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 di- as após a administração de reforço induz sintomas de dor de cabeça em 20% ou menos, e artralgia em 8% ou menos, febre em menos de 4% e fadiga em menos de 19%, mialgia em menos de 12% e mal-estar em menos de 13% de uma população de seres humanos de pelo me- nos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00357] De acordo com certos aspectos da presente invenção, a vacina ou composição imunogênica compreende uma dose de 1 uga 40 ug do (um) antígeno, em que o antígeno é um vírus inteiro inativa- do.
[00358] De acordo com certos aspectos da presente invenção, a vacina ou a composição imunogênica é administrada como uma admi- nistração de dose única ou administração de doses múltiplas, incluindo pelo menos uma primeira administração (primária) e uma segunda (re- forço) em que a vacina ou composição imunogênica compreende uma dose de cerca de 5 ug de vírus inteiro inativado purificado.
[00359] De acordo com certos aspectos da presente invenção, a vacina ou a composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz efeitos colaterais sistêmicos em me-
nos de 50%, ou em menos de 45% ou em menos de 40% de um sujei- to humano população de pelo menos 20 seres humanos ingênuos de flavivírus ou de pelo menos 20 indivíduos humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou a administração da vacina ou composição imunogê- nica até 7 dias após a administração de reforço induz efeitos colaterais sistêmicos em menos de 40% ou em menos de 35%, ou em menos de 30%, ou em menos de 25%, ou em menos de 20%, ou em menos de 15% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 indiví- duos humanos ingênuos de flavivírus ou de pelo menos 20 zika seres humanos soronegativos de vírus.
[00360] De acordo com certos aspectos da presente invenção, a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz febre em menos de 3% ou 0% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou pelo menos 20 seres hu- manos soronegativos para o Zika vírus e/ou administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de refor- ço induz febre em menos de 4%, ou em menos de 3% ou 0% de um ser humano população de pelo menos 20 seres humanos não expos- tos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos pa- ra o Zika vírus.
[00361] De acordo com certos aspectos da presente invenção, a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz dor de cabeça em menos de 29% de uma população de seres humanos de pelo menos seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 se- res humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz dor de cabeça em menos de 20%, ou em menos de 15%, ou em menos de 10%, ou em menos de 5% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00362] De acordo com certos aspectos da presente invenção, a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz fadiga em menos de 30%, ou em menos de 25% ou em menos de 20% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivítus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz fadiga em menos de 20%, ou em menos de 15% ou em menos de 10% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivífus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00363] De acordo com certos aspectos da presente invenção, a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz artralgia em menos de 4% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou administração da vacina ou com- posição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz artralgia em menos de 5%, ou em menos de 2% ou em 0% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegati- vos para o Zika vírus.
[00364] De acordo com certos aspectos da presente invenção, a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz mialgia em menos de 17% ou menos de uma população de seres humanos de pelo menos seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 se- res humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz mialgia em menos de 12%, ou em menos de 10% ou em menos de 5% de uma população de seres humanos de pelo me- nos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00365] De acordo com certos aspectos da presente invenção, a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz mal-estar em menos de 10% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres huma- nos soronegativos para o Zika vírus e/ou a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz mal-estar em menos de 14%, ou em menos de 10%, ou em me- nos de 5% ou em 0% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00366] De acordo com certos aspectos da presente invenção, a vacina ou a composição imunogênica é administrada como doses múl- tiplas em uma primeira administração (primária) e uma segunda (refor- ço) e a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 di- as após a administração de reforço induz - pelo menos 70% menos, ou pelo menos 60% menos, ou pelo menos 50% menos, ou pelo menos 40% menos, ou pelo menos 35% menos, ou pelo menos 30% menos efeitos colaterais sistêmicos e/ou - nenhum aumento na febre e/ou - pelo menos 80% menos, ou pelo menos 70% menos, ou pelo menos 60% menos, ou pelo menos 50% menos, ou pelo menos
45% menos dor de cabeça e/ou - pelo menos 60% menos, ou pelo menos 55% menos, ou pelo menos 50% menos, ou pelo menos 45% menos ou pelo menos 40% menos fadiga e/ou - nenhum aumento na artralgia, ou pelo menos 80% me- nos, ou pelo menos 60% menos, ou pelo menos 40% menos, ou pelo menos 20% menos, ou pelo menos 10% menos artralgia e/ou - nenhum aumento na mialgia, ou pelo menos 70% a me- nos, ou pelo menos 60% a menos, ou pelo menos 40% a menos, ou pelo menos 20% a menos, ou pelo menos 10% a menos de mialgia e/ou - nenhum aumento no mal-estar, ou pelo menos 80% me- nos, ou pelo menos 60% menos, ou pelo menos 40% menos, ou pelo menos 20% menos, ou pelo menos 10% menos mal-estar comparado com 7 dias após a administração primária em uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00367] De acordo com certos aspectos da presente invenção, a vacina ou a composição imunogênica é administrada como uma admi- nistração de dose única ou administração de doses múltiplas, incluindo pelo menos uma primeira administração (primária) e uma segunda (re- forço) em que a vacina ou composição imunogênica compreende uma dose de cerca de 10 ug de vírus inteiro inativado purificado.
[00368] “De acordo com alguns desses aspectos da presente inven- ção, a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz efeitos colate- rais sistêmicos em menos de 50% de uma população de seres huma- nos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz efeitos colaterais sistêmicos em me- nos de 40%, ou em menos de 35%, ou em menos de 30% de uma po- pulação de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não ex- postos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00369] De acordo com alguns desses aspectos da presente inven- ção, a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz febre em menos de 4% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou administração da vacina ou com- posição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz febre em menos de 4%, ou em menos de 3% ou 0% de um ser huma- no população de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flaviví- rus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00370] De acordo com alguns desses aspectos da presente inven- ção, a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz dor de cabeça em menos de 29%, ou em menos de 25%, ou em menos de 20% ou em menos de 15% de uma população de seres humanos de pelo me- nos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administra- ção de reforço induz dor de cabeça em 20% ou menos de uma popu- lação de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expos- tos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos pa- ra o Zika vírus.
[00371] De acordo com alguns desses aspectos da presente inven- ção, a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz fadiga em 33% ou menos de uma população de seres humanos de pelo menos 20 se- res humanos não expostos a flavivírus ou pelo menos 20 seres huma- nos soronegativos para o Zika vírus e/ou administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz febre em menos de 20% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00372] De acordo com alguns desses aspectos da presente inven- ção, a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz artralgia em 10% ou menos de uma população de seres humanos de pelo menos seres humanos não expostos a flavivírus ou pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou administração da vaci- na ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz artralgia em menos de 5% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00373] De acordo com alguns desses aspectos da presente inven- ção, a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz mialgia em 17% ou menos de uma população de seres humanos de pelo menos 20 se- res humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou a administração da va- cina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz mialgia em menos de 12% ou em menos de 10% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegati- vos para o Zika vírus.
[00374] De acordo com alguns desses aspectos da presente inven-
ção, a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz mal-estar em 15% ou menos de uma população de seres humanos de pelo menos seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 se- res humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz mal-estar em menos de 13%, ou em 10% de uma po- pulação de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não ex- postos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00375] De acordo com alguns desses aspectos da presente inven- ção, a vacina ou a composição imunogênica é administrada como do- ses múltiplas em uma primeira administração (primária) e uma segun- da (reforço) e a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz - pelo menos 40% menos, ou pelo menos 35% menos, ou pelo menos 30% menos, ou pelo menos 25% menos efeitos colaterais sistêmicos e/ou - nenhum aumento na febre, ou pelo menos 80% menos, ou pelo menos 60% menos, ou pelo menos 40% menos, ou pelo me- nos 20% menos, ou pelo menos 10% menos febre, e/ou - pelo menos 45% menos ou pelo menos 40% menos fadi- ga e/ou - nenhum aumento na artralgia, ou pelo menos 65% me- nos, ou pelo menos 60% menos, ou pelo menos 40% menos, ou pelo menos 20% menos, ou pelo menos 10% menos artralgia e/ou - nenhum aumento na mialgia, ou pelo menos 45% a me- nos, ou pelo menos 40% a menos, ou pelo menos 20% a menos, ou pelo menos 10% a menos de mialgia e/ou - nenhum aumento no mal-estar, ou pelo menos 20% me-
nos ou pelo menos 10% menos mal-estar comparado com 7 dias após a administração primária em uma população de seres humanos de pe- lo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo me- nos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00376] De acordo com alguns desses aspectos da presente inven- ção, a vacina ou a composição imunogênica é administrada como uma administração de dose única ou administração de doses múltiplas, in- cluindo pelo menos uma primeira administração (primária) e uma se- gunda (reforço) em que a vacina ou composição imunogênica compre- ende uma dose de cerca de 2 ug de vírus inteiro inativado purificado.
[00377] De acordo com alguns desses aspectos da presente inven- ção, a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz efeitos colate- rais sistêmicos em menos de 50%, ou em menos de 45%, ou em me- nos de 40% ou em menos de 35% de uma população de seres huma- nos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz efeitos colaterais sistêmicos em me- nos de 40% ou em menos de 35% de uma população de seres huma- nos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00378] De acordo com alguns desses aspectos da presente inven- ção, a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz febre em menos de 3% ou em 0% de uma população de seres humanos de pelo menos seres humanos não expostos a flavivírus ou pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou administração da vaci- na ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz febre em menos de 4%, ou em menos de 3% ou em 0%
de um ser humano população de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegati- vos para o Zika vírus.
[00379] “De acordo com alguns desses aspectos da presente inven- ção, a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz dor de cabeça em menos de 29%, ou em menos de 25%, ou em menos de 20% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soro- negativos para o Zika vírus e/ou a administração da vacina ou compo- sição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz dor de cabeça em menos de 20% ou em menos de 15% de uma popu- lação de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expos- tos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos pa- ra o Zika vírus.
[00380] De acordo com alguns desses aspectos da presente inven- ção, a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz fadiga em me- nos de 30% ou em menos de 25% de uma população de seres huma- nos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz fadiga em menos de 20% ou em me- nos de 15% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00381] De acordo com alguns desses aspectos da presente inven- ção, a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz artralgia em menos de 4% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou pelo menos 20 seres hu- manos soronegativos para o Zika vírus e/ou administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de refor- ço induz artralgia em menos de 8% de uma população de seres hu- manos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00382] De acordo com alguns desses aspectos da presente inven- ção, a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz mialgia em 17% ou menos de uma população de seres humanos de pelo menos 20 se- res humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou a administração da va- cina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz mialgia em menos de 12% ou em menos de 10% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegati- vos para o Zika vírus.
[00383] De acordo com alguns desses aspectos da presente inven- ção, a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz mal-estar em menos de 10% de uma população de seres humanos de pelo menos seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 se- res humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz mal-estar em menos de 13%, ou em menos de 10%, ou em menos de 5% ou em 0% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00384] De acordo com alguns desses aspectos da presente inven- ção, a vacina ou a composição imunogênica é administrada como do-
ses múltiplas em uma primeira administração (primária) e uma segun- da (reforço) e a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz - nenhum aumento na febre e/ou - pelo menos 50% menos, ou pelo menos 45% menos, ou pelo menos 40% menos fadiga e/pu - nenhum aumento na mialgia, ou pelo menos 20% menos, ou pelo menos 10% menos mialgia, e/ou - nenhum aumento no mal-estar, ou pelo menos 80% me- nos, ou pelo menos 60% menos, ou pelo menos 40% menos, ou pelo menos 20% menos, ou pelo menos 10% menos mal-estar comparado com 7 dias após a administração primária em uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00385] De acordo com um determinado método, o sujeito humano ou a população de seres humanos é de uma região endêmica do Zika. De acordo com um determinado método, o sujeito humano ou a popu- lação de seres humanos é de uma região endêmica do Zika sujeita a um surto. De acordo com um determinado método, o sujeito humano ou a população de seres humanos não foi exposta ao flavivírus.
[00386] De acordo com um determinado método, o sujeito humano ou a população de seres humanos é de uma região não-endêmica do Zika. De acordo com um determinado método, o sujeito humano ou a população de seres humanos é de uma região não-endêmica do Zika que viajou para uma região endêmica. De acordo com um determinado método, o sujeito humano ou a população de seres humanos não foi exposta ao flavivírus.
[00387] De acordo com um determinado método, o sujeito humano ou a população de seres humanos é hispânica, latina, indígena ameri- cana, nativa do Alasca, asiática, negra ou afro-americana, nativa do
Havaí ou branca ou uma mistura destas.
[00388] De acordo com um determinado método, o sujeito humano ou a população de seres humanos tem de 18 a 29 anos de idade.
[00389] De acordo com um determinado método, o sujeito humano ou a população de seres humanos tem de 30 a 49 anos de idade.
[00390] A vacina ou composição imunogênica conforme divulgado neste documento também é divulgada para uso em um método con- forme divulgado neste documento.
[00391] Também é divulgado neste documento o uso da vacina ou composição imunogênica conforme divulgado neste documento na fa- bricação de um medicamento para o método conforme divulgado neste documento.
[00392] Em algumas modalidades, a resposta imunológica protetora induzida no sujeito humano após a administração de uma vacina e/ou composição imunogênica contendo um Zika vírus adaptado a células não humanas da presente invenção é maior que a resposta imunológi- ca induzida em um sujeito humano correspondente administrado com uma vacina e/ou composição imunogênica contendo um Zika vírus que não está adaptado ao crescimento celular não humano e/ou compre- ende uma mutação de adaptação celular não humana diferente. Em algumas modalidades, a resposta imunológica protetora induzida no sujeito humano após a administração da vacina e/ou composição imu- nogênica contendo um Zika vírus adaptado a células não humanas da presente invenção é de pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, em pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo me- nos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo me- nos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de
85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 99% maior que a resposta imunológica induzida em um sujeito humano correspondente administrado com uma vacina e/ou composição imunogênica contendo um Zika vírus que não está adap- tado ao crescimento celular não humano e/ou compreende uma muta- ção de adaptação celular não humana diferente. Os métodos para medir as respostas imunológicas protetoras são geralmente conheci- dos pelos versados na técnica.
[00393] Em algumas modalidades, a administração de uma vacina e/ou composição imunogênica contendo um Zika vírus adaptado a cé- lulas não humanas da presente invenção induz a geração de anticor- pos neutralizantes do Zika vírus no sujeito humano. Em algumas mo- dalidades, a administração de uma vacina e/ou composição imunogê- nica contendo um Zika vírus adaptado a células não humanas da pre- sente invenção induz a geração de anticorpos neutralizantes do Zika vírus no sujeito humano em uma quantidade que é maior que a quan- tidade de anticorpos neutralizantes induzida em um sujeito humano correspondente administrado com uma vacina e/ou composição imu- nogênica contendo um Zika vírus que não está adaptado ao cresci- mento celular não humano e/ou compreende uma mutação de adapta- ção celular não humana diferente. Em algumas modalidades, a admi- nistração da vacina e/ou composição imunogênica contendo um Zika vírus adaptado a células não humanas da presente invenção induz ge- ração de anticorpos neutralizantes do Zika vírus no sujeito humano em uma quantidade que é de pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, em pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pe- lo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo me-
nos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 99% maior que a quantidade de anticorpos neutrali- zantes induzida em um em um sujeito humano correspondente admi- nistrado com uma vacina e/ou composição imunogênica contendo um Zika vírus que não está adaptado ao crescimento celular não humano e/ou compreende uma mutação de adaptação celular não humana di- ferente. Em algumas modalidades, a administração de uma vacina e/ou composição imunogênica contendo um Zika vírus adaptado a cé- lulas não humanas da presente invenção induz a geração de anticor- pos neutralizantes do Zika vírus no sujeito humano em uma quantida- de que é pelo menos cerca de 1 vezes, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo me- nos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 6 vezes, pelo menos cerca de 7 vezes, pelo menos cerca de 8 vezes, em pelo menos cerca de 9 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes ou pelo menos cerca de 1000 vezes maior que a quantidade de anti- corpos neutralizantes induzidos em um sujeito humano corresponden- te administrado com uma vacina e/ou composição imunogênica con- tendo um Zika vírus que não está adaptado ao crescimento celular não humano e/ou compreende uma mutação de adaptação celular não humana diferente. Os métodos para medir anticorpos neutralizantes em um sujeito humano são geralmente conhecidos por um versado na técnica.
[00394] Preferencialmente, a quantidade terapeuticamente eficaz ou quantidade imunogênica é suficiente para provocar tratamento ou prevenção de sintomas da doença. Uma dosagem adequada é de cer- ca de 2 ug, cerca de 5 ug ou cerca de 10 ug, em particular cerca de 10 no,
[00395] A presente invenção será compreendida mais amplamente por meio de referência aos Exemplos a seguir. Eles não devem, no entanto, ser interpretados como limitantes de qualquer aspecto ou es- copo da presente invenção de forma alguma.
EXEMPLOS Exemplo 1: Geração de cepas clonais do Zika vírus
[00396] Este exemplo descreve a produção de cepas de Zika vírus (ZIKAV) com um histórico de pesquisa conhecido. Materiais e Métodos Manutenção de células Vero
[00397] Um frasco de células Vero 10-87 da OMS foi descongelado rapidamente em banho-maria e inoculado diretamente em 19mL de DMEM pré-aquecido (meio essencial mínimo modificado de Dulbecco) contendo penicilina-estreptomicina, L-glutamina 40mM e 10% de FBS em um frasco de T-75 cm? a 36ºC +/2ºC, a 5% de CO». As células fo- ram deixadas crescendo até a confluência e subcultivadas usando o TryplE. Este frasco foi expandido para dois frascos de T-185cm?, culti- vados até a confluência e subcultivados em frascos de 31 x T-185cm?e cultivados até as células atingirem 100% de confluência. As células foram colhidas por tripsinização, centrifugadas a 800 xg durante 10 minutos e ressuspensas em DMEM contendo 10% de FBS e 10% de DMSO a uma concentração de 1,9 x 107 células/mL. Um frasco das células Vero foi rapidamente descongelado e ressuscitado conforme descrito acima em um frasco de T-75 cm?. Estes foram subcultivados duas vezes para produzir um banco de células em frascos de 13 x T- 185 cm?. Após tripsinização, as células foram centrifugadas a 800 xg e ressuspensas em meio de congelamento (DMEM contendo 10% de FBS e 10% de DMSO) a uma concentração de 4,68 x 10º células/mL. Este banco de células foi separado em alíquotas para criotubos.
[00398] As células Vero foram cultivadas e mantidas em DMEM contendo penicilina-estreptomicina, L-glutamina e 10% de FBS
(CDOMEM-10%-FBS). Uma TryplExpress foi usada para manter e tripsi- nizar as células. Dois dias antes da adsorção viral, placas de 6 poços foram semeadas com 4-5 x 10 * células/poço em 3 mL de cDMEM- 10%-FBS ou 7 x 10 * células em frascos de T-25 cm? de 5 mL de CDMEM-10%-FBS, ou 1 x 10º células/poço em placas de 96 poços em 0,1 mL cDMEM-10%-FBS. Incubadoras foram monitoradas diariamen- te para manter as temperaturas indicadas. As linhagens celulares Vero foram armazenadas em nitrogênio líquido. Ensaio de Placas
[00399] Os títulos virais foram determinados por titulação de placas em monocamadas recentemente confluentes de células Vero cultiva- das em placas de 6 poços. Alíquotas congeladas foram descongeladas e uma série de diluições em dez vezes das alíquotas foi feita em CDMEM-0%-FBS em placas de 96 poços. Os vírus diluídos foram man- tidos em gelo antes da inoculação das monocamadas de células Vero. No momento do ensaio, o meio de cultivo foi aspirado da placa de 6 poços, e 100 uL de cada diluição do vírus foram adicionados aos po- ços. O vírus foi adsorvido durante 60 min a 36ºC+2ºC, a 5% de CO >, com balanços frequentes (a cada 10 minutos) das placas para evitar a secagem das folhas de células. Após adsorção virai, 4 ml de uma pri- meira camada de agarose (1X cDMEM-2%-FBS + 0,8% de agarose) mantida a 40-41ºC foram adicionados a cada poço. A agarose foi dei- xada solidificando durante 30 minutos em temperatura ambiente, e as placas foram então incubadas de cabeça para baixo durante 4-6 dias a 36ºC+/2ºC, em 5% de CO. Dois mL de uma segunda camada de aga- rose contendo 160 ug/mL de corante vital vermelho neutro foram adi- cionados no dia 4. As placas foram visualizadas nos dias 5e 6. Quantificação do vírus pelo ensaio de DICT50
[00400] Os títulos virais também foram determinados por titulação em monocamadas recentemente confluentes de células Vero cultiva-
das em placas de 96 poços. Alíquotas congeladas foram descongela- das e uma série de diluições em dez vezes das alíquotas foi feita em diluente de CDMEM-2%-FBS em placas de 96 poços. Os vírus diluídos foram mantidos em gelo antes da inoculação das monocamadas de células Vero. No momento do ensaio, o meio de cultivo foi aspirado da placa de 96 poços, e 100 uL de cada diluição do vírus foram adiciona- dos aos poços. As placas foram incubadas durante 5 dias a 36ºC+/2ºC, em 5% CO». O título da Dose Infecciosa em Cultura de Tecidos a 50% (DICT50) foi calculado utilizando a calculadora Re- ed/Muench. Artigos de Teste
[00401] A cepa do Zika vírus PRVABC59 (um frasco de 0,5 mL em gelo seco) foi recebida dos Centers for Disease Control and Prevention (CDC). A identificação do Zika foi confirmada através de RT-PCR. A testagem da cepa por PCR deu negativo para Alphavirus e contamina- ção por micoplasma. Esta informação está resumida na Tabela 1. Tabela 1: Informações sobre a cepa PRVABC59 Informa- Informa- Informações Cepa ções de ção do Preparató- Isolamento | paciente rias - Sequencia- mento por tor- rente de íons: entrada no Banco de Ge- P. : nes ve PT AKUS01215 PRVABE | Soo a o, ro(2)C6/36(1) | - PFU poren- | 59 (Asiá- no; viagem en uma Prep: saio de placa ,/ log t a Porto Ri- | fornecida ; pfu/ml ica) co em 2015 29Jan2016 * Identidade por Hospedeiro: RT-PCR C6/36 “ (-) Para alfa- vírus por PCR “ (-) para mico- plasma por ATCC e ABM
PCR
Sequenciamento
[00402] Um kit QIAampViral RNA Mini Spin foi usado para extrair o RNA de colheitas de vírus estabilizadas de cada isolado de acordo com os protocolos do fabricante. O RNA extraído de cada isolado foi utilizado para criar e amplificar 6 fragmentos de cDNA abrangendo a totalidade do genoma viral do Zika. Os fragmentos de cDNA amplifica- dos foram analisados quanto ao tamanho e pureza em um gel de 1% Agarose/TBE e subsequentemente purificados em gel usando um Qia- gen Quick Gel Extraction Kit. Um sequenciador ABI 3130XL Genetic Analyzer foi usado para realizar as reações de sequenciamento auto- mático. O software SeqgMan Lasergene foi usado para analisar dados de sequenciamento. Resultados
[00403] Procurava-se uma cepa de ZIKAV com um histórico de pesquisa conhecido que fosse relevante para o surto atual do ZIKAV nas Américas. Por esta razão, a cepa PRVABCB59 do ZIKAV foi esco- lhida. Para gerar um vírus bem caracterizado adaptado para cultivo em células Vero, o ZIKAV PRVABCS59 foi primeiro amplificado em células Vero (P1).
[00404] Os frascos de células Vero (T-175 cm?), 100% confluentes, foram infectados a uma MOI de 0,01 em 4 mL de cDMEM-0%-FBS. O vírus foi adsorvido à monocamada durante 60 minutos a 36ºC+2 ºC, a 5% de CO>, em seguida, 20 mL de cDMEM-0%-FBS foram aplicados para amplificação viral a 36ºC+2ºC, a 5% de CO». A camada de célu- las foi monitorada diariamente para efeito citopático (CPE) após a ino- culação (Fig. 1). O sobrenadante foi coletado depois de 96 horas, re- colhendo os meios de comunicação e clarificação por centrifugação (600 x g, 4ºC, 10 min). A colheita foi estabilizada pela adição de trealo- se a uma concentração final de 18% w/v. O volume foi dividido em alí- quotas em criotubos de 0,5 mL e armazenado a -80ºC.
[00405] A colheita P1 estabilizada foi analisada quanto à presença de vírus infeccioso em monocamadas de células Vero através de um ensaio de DICT50. A cinética de crescimento foi monitorada tomando alíquotas diárias a partir da hora O. O título máximo foi atingido na hora 72 (Fig. 2).
[00406] O material P1 foi purificado em placa por titulação da co- lheita do dia 3 em monocamadas de 6 poços de células Vero. As pla- cas foram visualizadas no dia 6, e 10 placas a serem isoladas foram identificadas desenhando um círculo em torno de uma placa separada e distinta na parte inferior da placa de plástico. As placas foram colhi- das por extração do tampão de agarose usando uma pipeta com aber- tura larga estéril enquanto raspava-se o fundo do poço e enxaguava- se com cDMEM-10%-FBS. O tampão de agarose foi adicionado a 0,5 mL de cDMEM-10%-FBS, agitado em vórtice, rotulado como PRVABC59 P2a-j e colocado em uma incubadora durante a noite a 36ºC+2ºC, em 5% de CO».
[00407] Três placas (PRVABC59 P2a-c) prosseguiram para purifi- cação adicional. Cada isolado foi plaqueado puro, em duplicado, em uma nova monocamada de 6 poços de células Vero. Esta transição P2/P3 foi purificada em placa, e rotulada PRVABC59 P3a-.
[00408] Seis placas (PRVABC59 P3a-f) prosseguiram para uma ro- dada final de purificação. Cada isolado foi plaqueado puro, em dupli- cado, em uma nova monocamada de 6 poços de células Vero. Esta transição P3/P4 foi purificada em placas e rotulada como PRVABC59 P4a-.
[00409] Seis placas (PRVABC59 P4a-f) da purificação de placas P4 foram passadas às cegas em monocamadas de células Vero em fras- cos de T-25 cm?. Cada placa colhida foi diluída em 2 mL de cDMEM- 0%-FBS — 1 mL foi adsorvido durante 1 hora a 36ºC+2ºC, a 5% de CO;>; o outro 1 mL foi estabilizado com trealose (18% v/v final) e arma-
zenado a <-60ºC. Após a adsorção do vírus, CDOMEM-0%-FBS Foi adi- cionado a cada frasco e deixado crescendo a 36º C+2ºC, a 5% de CO, durante 4 dias. Os sobrenadantes virais foram colhidos, clarificados por centrifugação (600 x g, 4C, 10 min), estabilizados em 18% de trea- lose e divididos em alíquotas e armazenados a <-60ºC. Esta semente P5 foi testada por DICT50 quanto à potência do Zika vírus (FIG. 3).
[00410] Monocamadas confluentes de frascos de T-175 cm? de cé- lulas Vero foram infectadas com cada um dos seis clones de PRVABCS59 (P5a-f) a uma MOI de 0,01 em 4mlL cDMEM-0%-FBS. O vírus foi deixado adsorvendo durante 60 minutos a 36ºC+/2ºC, a 5% de CO;,, e logo depois 20 mL de cDMEM-O0%-FBS foram adicionados a cada frasco e deixados crescendo a 36ºC+/2ºC, a 5% de CO 2. A saú- de e CPE da monocamada de células Vero foram monitorados diaria- mente. O vírus foi colhido nos dias 3 e 5, conforme indicado (FIG. 4). As colheitas de cepas P6 dos dias 3 e 5 foram agrupadas, estabiliza- das com 18% de trealose, divididas em alíquotas e armazenadas a <- 60ºC.
[00411] Cada um dos seis clones de PRVABC59 (P6a-f) foram tes- tados quanto à potência in vitro do Zika vírus (FIG. 5). A potência foi determinada por dois métodos diferentes, DICT50 e titulação em pla- ca. O DICT50 foi calculado por inspeção visual de CPE (microscópio) e medindo-se a diferença na absorvência (AS60-A420) dos poços que apresentam CPE (de cor amarela) em comparação com os vermelhos (sem CPE). As placas foram lidas num leitor de placas, e aplicadas à mesma calculadora que as placas lidas microscopicamente (absorvên- cia). Os valores em DICT50 entre as duas técnicas de pontuação são bastante semelhantes, enquanto que os valores obtidos pela titulação de placas são mais baixos.
[00412] Um resumo da geração do vírus P6 e caracterização é mostrado na Tabela 2 abaixo.
Tabela 2: Resumo da passagem de vírus e caracterização para a geração de cepas clonais de ZIKAV gem sementes [TO meme am | ee Vero de placas gem do ensaio de placas P2 gem do ensaio de placas P3 o esgmos de placa, genótipo, cinética de crescimento
[00413] Procurava-se um clone de Zika vírus isolado que se asse- melhasse à sequência glicoproteica do envelope do isolado original, uma vez que a proteína de envelope dos flavivírus é a porção imuno- gênica dominante do vírus. Os clones PRVABC59 P6a, P6c, P6d e P6f continham uma mutação G—T no nucleotídeo 990 na região do enve- lope (G990T), resultando em uma mutação de aminoácidos de Val->Leu no resíduo de envelope 330, ao passo que o gene de enve- lope ds clones PRVABC59 P6b e P6e eram idênticos em relação à ce- pa de referência (ref GenBank KU501215.1) (Tabela 3 e FIG. 6).
Tabela 3: Sequenciamento dos clones PRVABC59 P6 Sequenciamento de envelope (gene de referência de PRVABC59; PRVABC59 | Env-990: Env-330: Val/Leu | Mutação em 3 Cú Pe | Gt qvansete o asia | PRVABCS59 | Env-1404: [Tipo selvagem) Tipo selva- | Tipo selvagem P6b T—G silen- gem em relação à gue e eae PRVABC59 | Env-990: Env-330: ValíLeu | Mutação em 3 Cú Po | ot vasta o das ficas | PRVABC59 | Env-990: Env-330: Val/íLeu | Mutação em 2 Cú Pos | Gt vasta o deztves | PRVABCS59 | Tipo selva- (Tipo PESA ancas P6e gem gem em relação à referência. PRVABC59 | Env-990: Env-330: Val/Leu | Mutação em 2 P6f GT Val330—-Leu de 2 leituras. 190 pb não se- quenciados (aa 421 — 484). Sequenciamento completo do genoma (gene de referência de PRVABCS59 | Env-1404 [Tipo selvagem| Silencioso | Mutação em 2 NS1-292 NS1-98 Trp/Gly | Mutação em 2 TIS meeecay | o Gazeta | PRVABC59 | NS1-292 NS1-98 Trp/Gly | Mutação em 2 ºgos | ro meesay | oo) degelo |
[00414] Os doisclonessem as mutações na sequência de envelope foram então sujeitos a sequenciamento do genoma completo. Os re- sultados do sequenciamento estão resumidos na Tabela 3 acima. À análise da sequência revelou uma substituição T>G no nucleotídeo 292 na região NS1 para ambos os clones, resultando numa mutação
Trp—>Gly no resíduo NS1 98. Esta mutação também foi posteriormente confirmada através de sequenciamento profundo. A mutação NS1 W98G está localizada na alça entrelaçada do domínio asa de ZIKAV NS1, que tem sido implicada na associação à membrana, na interação com a proteína de envelope e potencialmente na formação de NS1 hexamérica. Embora outros resíduos de triptofano (W115, W118) se- jam altamente conservados nos flavivírus, W98 não é (FIG. 7). É inte- ressante notar, no entanto, que 100% de conservação do resíduo W98 é observada em 11 cepas diferentes de ZIKAV, incluindo aquelas pro- venientes de linhagens asiáticas e africanas. As mutações identifica- das em cada cepa estão resumidas na Tabela 4.
Tabela 4: Resumo das mutações identificadas em clones PRVABC59 P6
A E E [Pe [rose [tensos | [Pa esor vaso [Pe renmum — [| renmum — [rw [O Ns | nstweso | [Pe TO Ns | Nnsrmeso |
[00415] A análise fenotípica dos estoques PRVABC59 P6 de ZIKAV foi realizada para caracterizar os clones ZIKAV. Conforme ilustrado na FIG. 8 e quantificado na FIG. 9, cada isolado clonal consistia de uma população relativamente homogênea de placas grandes em compara- ção com o vírus P1, que tinha uma população mista de placas grandes e pequenas. Estes dados sugerem que o isolamento dos clones ZIKAV individuais foi bem sucedido.
[00416] Em seguida, analisaram-se análises cinéticas de cresci- mento em células Vero dos clones ZIKAV PRVABC59 P6. Células Ve- ro foram infectadas com 0,01 DICT50/célula de cada um dos clones de ZIKAV P6 em meio de cultivo sem soro. Amostras de sobrenadantes virais foram retiradas diariamente e simultaneamente analisadas quan- to ao título infeccioso por ensaio de DICT50. Para todos os clones P6, o título máximo ocorreu entre os dias 3 e 4 (-9,0 logio DICT50/mL). Não houve diferença significativa na cinética de crescimento dos vá- rios clones P6 (FIG. 10).
[00417] Tomados em conjunto, os resultados indicam que uma se- mente do Zika vírus foi gerada com sucesso. Esta seleção de semen- tes exigia compreensão da história, cinética, rendimento, genótipo e fenótipo de crescimento do vírus. É importante notar que o isolamento clonal das cepas de Zika vírus permitiu a purificação com sucesso do vírus afastado de agentes contaminantes (por exemplo, agentes ad- ventícios que possam estar no isolado humano parental). Curiosamen- te, três purificações placas sequenciais conseguiram selecionar rapi- damente vírus adaptados a células Vero (cepas P6a-f), onde estas ce- pas foram capazes de se replicarem bem em culturas de células Vero sem soro, com as cepas P6a, c, d, e f abrigando uma mutação na pro- teína do envelope viral, enquanto que as cepas P6b e p6e obtiveram uma mutação na proteína NS1 viral (sem modificação para o envelope viral). Além disso, as cepas adaptadas a células Vero permitiram o crescimento e produção de passagens subsequentes virais propaga- das a partir destas cepas de forma eficiente e reproduzível. Sem que- rer estar limitado pela teoria, a mutação Env-V330L observada nas ce- pas P6a, c, d, e f pode, potencialmente, ser um resultado de uma adaptação in vitro, já que uma mutação no Env 330 também foi obser-
vada após a passagem em células Vero (Weger-Lucarelli et al. 2017. Journal of Virology). Uma vez que a proteína de envelope é o epítopo imunogênico dominante do Zika vírus, as cepas que contêm uma mu- tação de adaptação a células Vero em Env pode impactar negativa- mente a imunogenicidade da vacina. Sem querer estar limitado à teo- ria, a mutação de adaptação na proteína NS1 parece não apenas me- lhorar a replicação viral, mas também pode reduzir ou inibir a ocorrên- cia de mutações indesejáveis, como a proteína de envelope E (Env) do Zika vírus. Além disso, NS1 pode ser conhecido por se ligar à proteína de envelope durante o ciclo de vida do vírus. Esta mutação (NS1 W98G) pode estar envolvida na alteração da capacidade da NS1 para associar-se a, e possivelmente copurificar, o vírus durante o proces- samento a jusante. NS1 também é conhecido por ser imunogênico, e pode estar envolvido na resposta imune à vacina. Exemplo 2: Imunogenicidade pré-clínica e eficácia de uma vacina de Zika vírus inativado purificado (PIZV) derivada das cepas P6b e p6e
[00418] O exemplo a seguir descreve a imunogenicidade e a eficá- cia pré-clínica em camundongos CD1 e AG129 de uma vacina de Zika vírus inativado (PIZV) derivada das cepas P6b e P6e. Conforme des- crito no Exemplo 1, seis clones foram gerados a partir da cepa epide- micamente relevante PRVABCS59, e dois (P6b e P6e) foram escolhidos para mais estudos de imunogenicidade e eficácia pré-clínicos. Materiais e Métodos A purificação, a inativação e a formulação de uma vacina de Zika vírus
[00419] Um lote de vacina de ZIKAV inativado, adequado para uso em estudos de imunogenicidade e eficácia pré-clínicos, foi gerado e caracterizado. O vírus foi amplificado a partir das cepas P6b e P6e in- fectando frascos de células Vero confluentes, a uma MOI de 0,01. O vírus foi adsorvido durante 1 hora a 36ºC+2ºC/5% de CO». Após ad-
sorção, 20 mL de cDMEM-0%-FBS foram adicionados a cada frasco e incubados a 36ºC + 2ºC/5% de CO» durante cinco dias. Os sobrena- dantes celulares foram colhidos no dia 3 e 5 pós-infecção, e detritos celulares foram clarificados por centrifugação.
[00420] Para cada isolado, os sobrenadantes clarificados foram agrupados, estabilizados em DMEM contendo 18% de trealose e ar- mazenados a <-60ºC. Os sobrenadantes virais agrupados e clarifica- dos foram descongelados num banho de água a 37ºC e tratados com benzonase durante a noite a 4ºC. Após o tratamento com benzonase, cada amostra foi aplicada a um filtro de profundidade Sartorius PP3. Após a filtração de profundidade, cada amostra foi aplicada a um dis- positivo de filtração de fluxo tangencial (TFF) Centricon Plus-70. O ma- terial retido foi trocada de tampão, diluído e aplicado a um Sartorius SartobindQ IEXNano. Cada amostra foi aplicada a um segundo Sarto- rius SartobindQ IEXNano e eluída usando um processo de eluição em 3 etapas com 250 mM, 500 mM e 750 mM de NaCl. Após cromatogra- fia em MonoQ e diluição, cada eluato de 250 mM foi aplicado a um dispositivo de filtração de fluxo cruzado (CFF) Centricon Plus-70 para a troca de tampão, diluído até 35 mL com PBS e armazenado a 2-8ºC.
[00421] Para inativação de formalina, 1% de formaldeído recente- mente preparado foi adicionado gota a gota a cada amostra purificada com agitação suave para obter-se uma concentração final de formal- deído de 0,02%. Amostras foram incubadas em temperatura ambiente (-22ºC) durante 14 dias, com inversão diária. O formaldeído foi neutra- lizado com metabissulfito de sódio durante 15' em temperatura ambi- ente antes de ser aplicado a um dispositivo filtração de fluxo tangencial (TFF) Centricon Plus-70. A troca de tampão foi realizada quatro vezes pela adição de 50 mL de Tampão de Princípio Ativo (10 MM de NaH2PO,, 50 mM de NaCl, 6% de sacarose, pH 7,4). Cada amostra foi então diluída até 15 mL com Tampão de Princípio Ativo, esterilizada usando um filtro de seringa de 0,2 m, dividida em alíquotas em frascos de vidro com rolha estéreis (0,5 ml por frasco) e congelada a <-60ºC.
[00422] A inativação do vírus foi confirmada por ensaio de DICT50 e ensaio de infecciosidade duplo. Rapidamente, uma amostra de prin- cípio ativo foi aplicada às céluals C6/36 e deixada amplificando duran- te 6 dias. O sobrenadante de células C6/36 foi aplicado a células Vero e o CPE foi monitorado durante 8 dias. Para a formulação do produto farmacêutico, frascos do princípio ativo de PIZV foram descongelados, agrupados de acordo com o tipo de amostra e diluídos até 1 ug/mL ou 10 ug/mL em PBS com ou sem Alhydrogel (Brenntag; 0,5 mg/mL final, 0,050 mg/dose) e incubados durante a noite a 2-8ºC com agitação su- ave. Os lotes resultantes de produtos farmacêuticos foram então divi- didos em alíquotas em frascos de vidro com rolha estéreis e armaze- nados a 2-8ºC até o uso. A FIG. 11 fornece um resumo das etapas usadas para preparar o produto farmacêutico. Imunização e exposição em camundongos
[00423] Para o estudo de imunogenicidade, camundongos machos e fêmeas Swiss-ICR (CD-1) de seis semanas de idade foram divididos em 6 grupos (n = 10/grupo). No Dia O, os camundongos nos grupos 1- foram inoculados com 0,1 ml de vacina por via intramuscular (i.m.) (2 x injeções de 0,05 mL). Os camundongos no grupo 6 foram inoculados com PBS como um controle de placebo. Os camundongos foram re- forçados nos dias 28 e 56 usando a mesma dosagem e tipo de vacina que no dia O. Amostras de sangue foram colhidas no dia -1 (pré- imunização), dia 27 (primeira), dia 42 (reforço 1) e no dia 70 (reforço 2).
[00424] Para o estudo de imunogenicidade e eficácia, camundon- gos AG129 machos e fêmeas com quatro semanas de idade foram divididos em 7 grupos (n = 5/grupo). No Dia O, os camundongos nos grupos 1-6 foram inoculados com 0,1 ml de vacina por via intramuscu-
lar (i.m.) (2 x injeções de 0,05 mL). Os camundongos no grupo 7 foram inoculados com PBS como um controle de placebo. Os camundongos foram reforçados no dia 28 usando a mesma dosagem e tipo de vacina que no dia O. As amostras de sangue foram coletadas da veia da cau- da no dia -1 (pré-imuninzação), dia 27 (primeira) e dia 55 (reforço). No momento da eutanásia, os camundongos foram sangrados através de punção cardíaca sob anestesia profunda com isofluorano (terminal). No dia 56, os camundongos foram expostos por via intraperitoneal com 10º unidades formadoras de placas (PFU) de ZIKAV PRVABC59. Transferência sérica
[00425] Foi coletado soro de camundongos AG129 vacinados e ex- postos a PIZV, que foi congelado após agrupamento (grupos 1,2,4 e da Tabela 6). O pool de soro foi descongelado, e os artigos de teste foram gerados por diluições em três vezes do pool de soro em PBS. Um placebo foi gerado usando diluições em 3 vezes de soro normal de camundongo AG129 em PBS.
[00426] Os artigos de teste foram administrados como injeções in- traperitoneais de 0,1 ml em camundongos AG129 (um volume equiva- lente do artigo de placebo foi administrado a camundongos de contro- le). Os animais foram então expostos por via intraperitoneal a 10º uni- dades formadoras de placas da cepa PRVABCS59 de Zika vírus em 100 uL.
[00427] Um volume de sangue admissível, em peso, foi coletado como sangue total por sangramento da cauda de dez camundongos no dia -11 (pre-imunização). O sangue total foi coletado de cada ca- mundongo no dia 1 (primário, Nab circulante) e dia 4 (viremia) por sangramento da cauda. O sangramento terminal após a exposição le- tal foi realizado por punção cardíaca sob anestesia profunda para mai- or volume antes da eutanásia por deslocamento cervical. As amostras de sangue foram recolhidas em tubos de gel de separação de soro mi-
crotainer SST e deixadas coagulando durante, pelo menos, 30 minutos antes da separação do soro por centrifugação (10.000 x g durante 2 min) e congeladas a -80ºC. Teste de neutralização de redução de placas
[00428] Títulos de anticorpos neutralizantes foram determinados por um teste de neutralização de redução de placas (PRNT) conforme descrito anteriormente (Ver, por exemplo, Osorio et al. Lancet Infect Dis. 2014 Sep;14(9):830-8). Ensaio de neutralização de partícula de vírus repórter (RVP)
[00429] Os títulos de anticorpos neutralizantes foram analisados por titulação de amostras de soro com uma quantidade constante de RVPs de Zika em células Vero cultivadas em placas de 96 poços. As RVPs continham as proteínas prME do Zika (cepa SPH2012) e um repórter de luciferase de Renilla baseado em dengue. Rapidamente, os soros foram inativados pelo calor a 56ºC durante 30 min, diluídos e depois incubados a 37ºC com RVPs. A mistura de soro/RVP foi então mistu- rada com células Vero e incubada durante 72 horas a 37ºC + 2ºC/ 5% de CO, antes da detecção com substrato de luciferase. Os dados fo- ram analisados usando a análise de parâmetros não lineares 4 do JMP11, normalizados para um controle de rastreamento positivo e a dose eficaz a 50% (EC50) foi relatada.
[00430] A menos que indicado em contrário, todos os métodos ex- perimentais adicionais foram levados a cabo conforme descrito no Exemplo 1 acima. Resultados
[00431] Para avaliar a imunogenicidade dos candidatos PIZV em camundongos CD-1 machos e fêmeas de 6 semanas de idade, grupos de camundongos CD-1 (N=10/grupo) foram imunizados por via i.m. com uma dose de 0,1 ug (+ alúmen) ou 1,0 ug (+ alúmen) de uma va- cina derivada das cepas virais ZIKAV PRVABC69 P6b ou pêe. Para avaliar a necessidade de adjuvante, um grupo de animais foi vacinado com 0,1 ug de vacina derivada de põe e sem adjuvante de alúmen. Vacinas ocorreram nos dias O, 28 e 56, com o grupo 6 recebendo PBS como um controle de placebo (FIG. 12A e Tabela 5). Tabela 5: Formulações de PIZV e exposições em camundongos CD-1 [Gempo | Copa —] Dose(uo) [Alúmentaa)] N | 1 Ps | om 1 os To) 2 | rw [| 1 | ow [1 a Pe [| on | om | 1 4 [Pe o [eso o] se a o [6 PeeotPBs| cc = [1
[00432] Após a vacinação, amostras séricas coletadas após as imunizações primária (dia 27), secundária (dia 40) e terciária (dia 70) foram testadas quanto a anticorpos neutralizantes específicos para ZIKAV por ensaio de neutralização de RVP (FIG. 12B). Vinte e sete dias após receberem a primeira dose, uma ligeira resposta de anticor- pos neutralizantes foi observada em camundongos vacinados com PIZV derivado de um clone contendo alúmen, em comparação com o grupo de controle de placebo com PBS. É importante notar que esta resposta aumentou significativamente após uma segunda imunização (dia 40), mas não foi aprimorada ainda mais por imunização com uma terceira dose (dia 70). Nenhuma resposta de anticorpos neutralizantes foi observada em camundongos vacinados com vacina sem adjuvan- tes (FIG. 12B).
[00433] Para avaliar a imunogenicidade e eficácia protetora dos candidatos PIZV, grupos de camundongosde AG129 de 4 semanas de idade (n=5/grupo) foram imunizados por via i.m. com uma dose de 0,1 Vg (+ alúmen) ou uma dose de 1,0 ug (+ alúmen) ou uma dose de 0,1 vg (- alúmen) de uma vacina derivada do estoque ZIKAV PRVABC59
P6b ou p6e nos dias 1 e 28 (FIG. 13A e Tabela 6). Tabela 6: Formulações de PIZV e exposições em camundongos AG129 1 | Fr | PB or | os | 5 | 2 3 a [MN Pe Tor [os Ts s | mM [Pe (1 | os |] e LM [Pe on = 11 [7 | mM aeee - | - ||
[00434] Após a vacinação, os camundongos vacinados e de contro- le foram expostos por via intraperitoneal no dia 56 com 10º PFU de ZIKAV PRVABCS59 (baixa passagem). As amostras séricas coletadas após as imunizações primária (D27) e (D55) secundária foram testa- das quanto à resposta de anticorpos neutralizantes específica para ZIKAV (FIG. 13B e Tabela 7). Apenas os grupos que receberam a do- se elevada de vacinas com adjuvante de alúmen (grupos 2 e 5) susci- tou uma resposta de anticorpos neutralizantes, após uma única imuni- zação, que aumentou drasticamente após o reforço. Em contraste, os grupos que receberam a dose baixa ou elevada de vacina com adju- vante de alúmen produziram uma resposta de anticorpos neutralizan- tes elevada após a segunda dose. Ao receber duas doses da vacina, não houve diferença estatística entre os grupos de camundongos que receberam vacina com adjuvante de alúmen, independentemente da dose ou da derivação do clone P6.
Tabela 7: Resposta de anticorpos neutralizantes específica para
ZIKAV o Fla To pssteasa alúmen alúmen o see SS alúmen alúmen O same | om alúmen alúmen [7 [| * [<= o TT | o)
[00435] Todos os grupos também foram monitorados quanto a mor- talidade, morbidade e perda de peso por 21 dias após a exposição. À viremia após a exposição foi detectada e quantificada por titulação da placa. Os camundongos vacinados com uma dose baixa ou alta de candidatos de PIZV formulados com alúmen (grupos 1, 2, 4 e 5) foram totalmente protegidos da exposição letal de ZIKAV, avaliado pelo teste do teste de neutralização da placa bacteriana (PRNT), bem como por um teste comparável ensaio de neutralização secundária (Tabela 8). Nenhuma perda de peso ou sinais clínicos de doença foram observa- dos em camundongos vacinados, nenhum teve viremia infecciosa de- tectável três dias após a exposição e todos os camundongos vacina- dos com antígeno de dose baixa ou alta + adjuvante de alúmen sobre- viveram aos 21 dias após a exposição (FIGS. 14- 16). Por outro lado, o desafio de todos os camundongos ingênuos resultou em alta viremia no dia 2 após a exposição e morbimortalidade entre os dias 10 e 18 pós-desafio (sobrevida média = D13). Além disso, o desafio de ca- mundongos vacinados com uma vacina de dose baixa sem adjuvante derivada da cepa P6b resultou em alta viremia no dia 2 após o desafio e em um dia médio de sobrevivência semelhante ao grupo controle placebo, enquanto camundongos vacinados com uma dose baixa não alúmen adjuvante derivada do clone e permaneceram paricialmente protegidos com uma sobrevida média de 19 dias. Esses resultados indicam que a imunização é mais eficaz com alume, a imunização se- cundária pode ser um requisito e que a dose baixa foi tão eficaz quan- to a dose alta.
Tabela 8: Títulos de Anticorpos Neutralizantes Séricos
[00436] Além disso, foi testada a presença de NS1 na substância medicamentosa da vacina (DS) produzida a partir do vírus P7b e P7e inteiro inativado (uma passagem adicional das cepas P6b e P6e, res- pectivamente). Um ELISA sanduíche foi realizado usando placas pré- revestidas com um anticorpo monoclonal reativo para linhagens asiáti- cas e africanas do Zika vírus NS1, mas não reativo para Dengue NS1. As diluições de DS duplicadas de 2, 4, 8, 16 e 32 vezes foram prepa- radas e foram comparadas com uma curva padrão usando NS1 purifi- cado recombinante em duplicado a uma concentração de 0-8 ng/mL. As diluições duplicadas de tampão DS isoladamente foram preparadas como controles negativos. O NS1 ligado foi detectado com conjugado anti-NS1 HRP e a absorvância (A450-A630) dos poços apenas com tampão DS foi subtraída da absorvância medida nos poços contendo as amostras correspondentes de DS. Os resultados do ELISA sanduí- che são mostrados na Tabela 9 abaixo. Curiosamente, observou-se que o NS1 copurifica com as preparações de substâncias medicamen- tosas da vacina, sugerindo que o NS1 viral pode ser um componente imunogênico de toda a vacina inativada contra vírus. Tabela 9: ELISA NS1 prepara-| Amos- | previs- padrão | a 95% | ora | debDi- | tração ção da tra to 95% |luição |prevista vacina ng/mL (ng/mL)
[00437] O limite de anticorpos neutralizantes (Nab) necessário para conferir proteção contra a exposição do Zika vírus do tipo selvagem após a transferência passiva de anticorpos foi testado em seguida. (Tabelas 10A e B). Tabela 10A: Concepção do Estudo de Transferência Passiva em Camundongos AG129 NA ia ta te visto antes de IP [6 en Tm ans
E E ES
Tabela 10B: Tempo do Estudo de Transferência Passiva em Ca- mundongos AG129 [O Tansterênciapassva — | meo
[00438] O soro agrupado de camundongos AG129 vacinados e ex- postos foi diluído em série 3 vezes em PBS e injetado intraperitoneal- mente em 7 grupos (N= 5/grupo) de camundongos AG129 com 5-6 semanas de idade. O soro de camundongo AG129 pré-imune foi usa- do como controle placebo (grupo 8). Após transferência passiva (- 16- 19 horas depois), o sangue total foi coletado e o soro foi separado por centrifugação de cada camundongo antes da exposição do vírus para determinação do título de anticorpos neutralizantes circulantes (FIG. 17). Anteriormente à exposição do vírus, os grupos de camundongos (designados como grupos 1, 2 3, 4, 5, 6, 7, 8) teve títulos de anticorpos neutralizantes de logio de 2,69, 2,26, 1,72, 1,30, <1,30, <1,30, <1,30, <1,30, respectivamente.
[00439] Vinte e quatro horas após a transferência passiva de nAbs de ZIKV, os camundongos foram expostos por via intraperitoneal com 10º pfu de ZIKV PRVABCS59. Após a exposição, os animais foram pe- sados diariamente e monitorados 1-3 vezes por dia durante 28 dias quanto a sinais de doença. Uma pontuação clínica foi dada a cada animal com base nos sintomas (Tabela 11). Os animais moribundos e/ou com sinais neurológicos claros (escore clínico 22) foram sacrifica- dos humanamente e contados como não sobreviventes.
Tabela 11: Descrição das Pontuações Clínicas Dadas Durante o Monitoramento da Morbidade e Mortalidade [o — aparêncizecomporiamentomamais ção respiratórias, espasmos, comportamento antissocial.
curvada, paralisia parcial (imobilidade, andar instável, patas flácidas, espasmos graves) ou paralisia total ou 3 primeiro
[00440] Os sinais da doença começaram a aparecer nove dias após a exposição no grupo controle (grupo 8) e nos grupos 5-7, com uma correspondente perda de peso (FIG. 18). O sangue total foi coletado e o soro foi separado por centrifugação de cada animal três dias após a exposição. As amostras séricas foram analisadas quanto à presença de ZIKV infeccioso usando um ensaio de titulação em placa (FIG. 19). O título infeccioso médio (log10 pfu/mL) para camundongos nos gru- pos 1-8 foram: 1,66, 2,74, 4,70, 4,92, 7,24, 7,54, 7,54 e 7,46, respecti- vamente. É importante ressaltar que os camundongos dos grupos 1-4 com níveis detectáveis de anticorpos neutralizantes para ZIKV (21,30 log10) apresentaram níveis estatisticamente mais baixos (títulos entre 102,5 e 106,0 vezes menores) de viremia (p = 0,0001, 0,0003, 0,0007 e 0,0374) do que os camundongos de controle. Estes resultados suge- riram que os níveis detectáveis de anticorpos neutralizantes de ZIKV (21,30 log1o) reduziram a viremia de maneira dependente da dose.
[00441] O diade sobrevida média dos camundongos nos grupos 1- 8 foi: não determinado, dia 17, dia 17, dia 13, dia 11, dia 11, dia 11 e dia 10, respectivamente (FIG. 20). É importante ressaltar que as cur- vas de sobrevida para grupos de camundongos com títulos de anticor-
pos neutralizantes detectáveis pelo ZIKV (grupos 1-4) foram estatisti- camente diferentes em comparação com o grupo controle (grupo 8) (p = 0,0019, 0,0019, 0,0019, 0,0153, respectivamente). Estes resultados sugeriram que níveis detectáveis (21,30 log1o) de anticorpos neutrali- zantes para ZIKV retardavam o início da doença de maneira depen- dente da dose.
[00442] Finalmente, o título de anticorpo neutralizante de ZIKV de cada animal foi representado graficamente contra o seu título de vire- mia correspondente e a análise de regressão linear foi realizada. Foi observada uma relação altamente inversamente correlacionada entre os títulos de anticorpos neutralizantes de ZIKV e os níveis de viremia no dia 3 após a exposição (FIG. 21). Um resumo dos resultados dos estudos de transferência passiva é mostrado na Tabela 12 abaixo. Tabela 12: Resumo dos Resultados de Transferência Passiva Us TR es e ção Sê-| circulante log10 brevida |da média rica GMT pfu/mL (D28) dia | 1 | 18) 269:017 166:062] 20 | 24 | Cr a [220 anmsos| o | mv a [vn as0rote ameniza | o | | 5 [1243] <130 |726:010) o | 1 | rode ao 7 o | o) Cs Pas] ão 70] o | 1
[00443] “Embora nenhum grupo de camundongos que receberam anticorpos neutralizantes de ZIKAV tenha sido totalmente protegido da exposição letal ao ZIKAV neste experimento, foram demonstrados ní- veis reduzidos de viremia e retardo no início da doença de maneira dependente da dose entre os grupos de camundongos com níveis de-
tectáveis de títulos de anticorpos neutralizantes de ZIKAV circulantes.
[00444] “Tomados em conjunto, os dados pré-clínicos dos estudos com camundongos CD-1 e AG129 indicam que um PIZV derivado de clones virais separados e bem caracterizados é imunogênico e capaz de fornecer proteção contra a exposição ao ZIKAV do tipo selvagem. É importante ressaltar que uma dose baixa e alta de vacina provocou uma resposta semelhante de anticorpos neutralizantes após duas do- ses e forneceu níveis semelhantes de proteção contra a exposição le- tal ao ZIKAV. Curiosamente, os camundongos vacinados com um candidato PIZV não adjuvado também mostraram proteção parcial da exposição ao ZIKAV. As vacinas antisséricas diminuíram significativa- mente viremia em camundongos AG129 imunizados passivamente e a sobrevida prolongada contra a exposição letal ao ZIKAV. Estes resul- tados também demonstram que os candidatos PIZV bem caracteriza- dos foram altamente eficazes contra a infecção por ZIKAV no modelo de camundongo AG129 altamente suscetível a ZIKAV.
[00445] — Adicionalmente, verificou-se que a sequência de um PRVABC59 (de PRVABC59 P6e) na passagem 7 era geneticamente idêntica à da passagem 6. Isso foi surpreendente, dado que os flaviví- rus são geralmente considerados geneticamente instáveis. O PRVABC59 P6e foi selecionado como a semente principal do vírus devido em parte à sua estabilidade genética em 7 passagens. Sem desejar estar vinculado à teoria, acredita-se que essa estabilidade ge- nética aprimorada possa ser devido à substituição de um único amino- ácido (W98G) no domínio da asa do NS1, pois essa foi a única muta- ção observada no genoma PRVABC59 P6 adaptado para células Ve- ro. Além disso, a estabilidade genética e a homogeneidade são vanta- josas, pois reduzem a variabilidade e aumentam a produção reprodu- zível de cepas subsequentes que podem ser usadas para a formula- ção de vacinas.
Exemplo 3: Avaliação Pré-Clínica do Fenótipo das Cepas P6a e P6e Materiais e Métodos
[00446] Os camundongos AG129 (sem receptores de interferon a/B e y) são suscetíveis à infecção e doença por ZIKV, incluindo patologias graves no cérebro. Os camundongos AG129 de 14 semanas de idade foram infectados intraperitonealmente com 10º e 10º pfu dos clones da passagem 6 a (P6a) e e (P6e) de ZIKV.
[00447] Os camundongos foram pesados e monitorados diariamen- te (até 28 dias) quanto a sinais clínicos de doença (perda de peso, pê- los com folhos, postura curvada, letargia, fraqueza nos membros, pa- ralisia parcial/total). Além disso, a análise da viremia foi realizada por titulação em placa de amostras séricas coletadas três dias após o de- safio, conforme descrito no Exemplo 1. Resultados
[00448] A infecção com P6e resultou em 100% de mortalidade (tempo médio de sobrevivência = 12,5 dias), enquanto a infecção com P6a resultou em apenas 33% de mortalidade (tempo de sobrevivência médio = indeterminado) (Figura 22). De acordo com isso, os camun- dongos infectados com preMVS P6e apresentaram maior perda de pe- so em comparação com os camundongos infectados com PRVABC59 P6a (3). Não foi encontrada diferença estatística nos níveis médios de viremia do grupo entre os grupos de camundongos infectados com PRVABCS59 P6a ou P6e (Figura 24). Esses dados sugerem que a ciné- tica do crescimento por si só pode não ser um determinante principal (uma vez que ambas as cepas produziram viremia semelhante e títu- los de pico semelhantes in vitro) e que uma característica da proteína Envelope pode ser importante para a virulência (de uma cepa do tipo selvagem) e imunogenicidade (de um candidato inativado). Exemplo 4: Teste completo de inativação para determinar a efi-
cácia da inativação
[00449] Foi desenvolvido um ensaio de dupla infecciosidade, tam- bém chamado de integridade da inativação (COI), para determinar a eficácia da inativação de formalina (formaldeído a 0,01%) e a potencial atividade viral infecciosa residual da substância medicamentosa a gra- nel purificada (BIZ) do vírus do zika inativado (PIZV).
[00450] “Preparação da amostra: Quatro lotes de Vacina Zika Inati- vada Purificada (PIZV) (lotes Tox 1-4) do clone e conforme descrito acima foram fabricados por crescimento em células Vero. Os sobrena- dantes de 4 coletas diárias (totalizando cerca de 4000 mL) foram puri- ficados por cromatografia seguida de adição de formaldeído a uma concentração final de 0,01%. p/v. A Inativação foi deixada prosseguir por 10 dias a 22ºC. As amostras em Controle de Processo (IPC) foram removidas diariamente da substância do medicamento a granel (BDS) durante a inativação para caracterização e análise. As amostras diá- rias de IPC foram neutralizadas com metabissulfito de sódio e dialisa- das em DMEM (meio de crescimento viral). As amostras contêm o Zika vírus inativado purificado. No último dia de inativação, o volume res- tante de amostras de BDS não foi neutralizado, mas foi processado com TFF para remover formaldeído e tampão trocado em PBS.
[00451] “Conclusão do ensaio de inativação (COI): O ensaio CO! foi usado para analisar a eficácia da inativação nas amostras diárias do IPC para entender a cinética da inativação e o BDS final. Para sensibi- lidade máxima, duas linhagens celulares, Vero e C6/36, foram inicial- mente usadas neste ensaio para detectar possíveis vírus vivos nas amostras de IPC e DS. Quando o Zika vírus infecta células Vero na presença de meio de crescimento contendo vermelho de fenol, os subprodutos da morte celular causam uma queda no pH. Consequen- temente, a cor do meio muda de vermelho/rosa para amarelo, indicati- vo dessa mudança ácida no pH do meio. Esse fenômeno é causado pela apoptose e efeitos citopáticos (CPE), que se refere às alterações observadas na estrutura celular das células hospedeiras causadas por invasão viral, infecção e brotamento das células durante a replicação viral. Por fim, enquanto as células Vero e mosquito C6/36 são uma linhagem celular permissiva para infecção, a infecção pelo Zika vírus mata apenas células Vero in vitro. Portanto, as células Vero foram usadas como linhagens celulares indicadoras para o ensaio. Em con- traste, as células C6/36, que são derivadas de um vetor hospedeiro natural para o Zika vírus, não exibem um CPE na infecção por Zika e não lisos. O meio não muda de cor e a viabilidade das células C6/36 não é alterada.
[00452] Oensaio é portanto dividido em duas partes: a primeira par- te do ensaio permite uma amplificação paralela de partículas virais po- tencialmente vivas em placas de 96 poços das duas linhagens celula- res suscetíveis por seis dias. A segunda etapa do ensaio envolve a transferência do sobrenadante das placas de 96 poços (incluindo par- tículas potencialmente amplificadas) para placas de 6 poços contendo monocamadas de células Vero e incubação por mais 8 dias para per- mitir a infecção viral e um efeito citopático para desenvolver nas célu- las Vero. Qualquer CPE observado foi confirmado usando um micros- cópio óptico.
[00453] Embora descrito em detalhes com relação ao uso de placas de 96 poços na primeira parte do ensaio, ou seja, a cultura em células C6/36 e seis placas de poço na segunda parte do ensaio, ou seja, a cultura de células Vero para observar efeito citofático, o teste pode ser facilmente ampliado de acordo com a tabela a seguir:
UN o ; x 36 seBEsss S cF<ELESGS To SAIS ZEE e lo la e e e ese Ss oP or = o = TT o E TES OS 2 a já dá 8 8 |= 28 SE PST o LOL vw js jr jo | |2 IS 888 S2o8S EGO o ETSSSE8 8 usorisoê e oro & ve2Sg os Ss CS OQLEE o o o o o o o elo o Ss NnãoNASS a Ss la Ia | QN la [aja a8 e ES ISSO w lo bw 6 6& bw 6 ooo ESSSERES Sé | já | jó |óá |jó | 8/4 geo o | o | o | o | o | o | o |lolojo o < qo E 7 õ o 288 É Fe oo = o se co o bx E o o 28 & [e 3 | S |& jêe | | S o ESPE = NI | es E 6 | o - SET vm e NM [Rg E É |& o 2 8 ços Fo v SOB r É É &
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[00454] Controle do ensaio COI: os controles de titulação e titulação reversa para este ensaio foram realizados usando células indicadoras Vero e pontuados em um formato de 96 poços de TCID50 com pontu- ação positiva com base na mudança de cor média de rosa para ama- relo, como um substituto para morte celular, ou a presença de CPE.
[00455] Teste de controle de título de vírus: duas réplicas indepen- dentes do vírus de controle (PRVABCB59) do título conhecido foram submetidas a uma série de diluições de 10 vezes em meio contendo 2% de FBS, e 100 uL de cada diluição foram adicionados a quatro po- ços de 96 poços placa contendo células Vero. As placas foram incu- badas por 5 dias, então os poços contendo CPE foram registrados e o título do vírus foi calculado usando a calculadora Reed-Meunch.
[00456] Teste de controle de titulação reversa do vírus: o vírus de controle de título conhecido foi diluído em série para 200 TCID50. Du- as réplicas independentes do vírus de controle 200 TCID50 foram submetidas a uma série de diluições de duas vezes em meios conten- do 2% de FBS, e 100 uL de cada diluição foram adicionados a quatro poços de uma placa de 96 poços contendo células Vero. As células foram incubadas por 5 dias, então os poços contendo CPE foram re- gistrados e o título do vírus foi calculado usando a calculadora Reed- Meunch. Protocolo CO! detalhado:
[00457] 1. Primeira parte do ensaio: as células Vero (1.4E+05 célu- las/mL) e mosquito Aedes aegypti C6/36 (4E +05 células/mL) foram semeadas em placas de 96 poços dois dias antes da adição das amostras. As células Vero foram cultivadas em DMEM + 10% de FBS final + 2% de L-glutamina + 1% de penicilina/estreptomicina a 37ºC. As células C6/36 foram cultivadas em DMEM + 10% de FBS + 2% de L- glutamina + 1% de penicilina/estreptomicina + 1% de aminoácidos não essenciais a 28ºC.
[00458] 2. Três réplicas independentes do vírus de controle 200 TCIDB50 (preparado no teste de controle de titulação reversa de vírus) ou as amostras de DS foram diluídas (diluições de 5 e 10 vezes) em meios contendo 2% de FBS.
[00459] 3.As célulasem placas de 96 poços foram inoculadas com as amostras. Antes da infecção das monocamadas celulares nas pla- cas de 96 poços, a amostra foi centrifugada para interromper qualquer possível agregação. 100 uL de cada diluição foram aplicados a cada um dos 5 poços em duas placas separadas de 96 poços contendo cé- lulas Vero e C6/36, respectivamente.
[00460] 4.O meio sozinho foi incluído em outro poço para cada tipo de célula como um controle de CPE negativo.
[00461] 5.As placas foram incubadas por 6 dias à temperatura apropriada para a linhagem celular.
[00462] 6. Segunda parte do ensaio: Para permitir que o vírus vivo seja ainda mais amplificado e visualizado por CPE em uma linhagem celular permissiva, todo o volume de cada sobrenadante de 96 poços das células Vero e C6/36 foi transferido para poços individuais de pla- cas de 6 poços de células Vero. A inoculação prosseguiu por 90 minu- tos com agitação a intervalos de 15 minutos.
[00463] 7.Foiadicionado meio contendo FBS a 2% aos poços e as placas foram incubadas durante 8 dias adicionais para detecção sub- sequente das amostras amplificadas em função da CPE. A inativação foi considerada incompleta se alguma das réplicas do DS apresentas- se CPE no final do dia 8.
[00464] 7.A presença de virions vivos/replicantes foi visualizada pela formação de placas ou CPE em monocamadas de células susce- tíveis após transferência para a placa de 6 poços e incubação por 8 dias para permitir a replicação viral. A pontuação da % de CPE nas placas de 6 poços no final do ensaio foi calculada como se segue:
- Cada placa de 6 poços de células Vero foi examinada quanto a CPE por visualização de alteração colorimétrica, seguida pe- la confirmação de CPE por inspeção sob um microscópio de luz inver- tida.
- Cada placa de 6 poços representou uma das réplicas das diluições de DS preparadas nas diluições de 5 e 10 vezes descritas acima (5 poços, mais um poço contendo apenas o meio).
[00465] Portanto, a % de CPE para cada réplica refletiu o número de poços com CPE de 5 poços totais por amostra (120 poços totais são usados por ensaio). A % de CPE média e o desvio padrão foram calculados com base em três repetições de cada diluição.
[00466] Resultados: as amostras diárias foram analisadas em cada um dos lotes Tox t1-4, conforme mostrado nas tabelas a seguir. Tabela A: Cinética de Inativação, lote de Toxicologia nº 1 [MODat [Veroparavero | oo o [110Diat [Veroparavero | — o | o | [11oDiad [Veroparavero | — o | o | [110Da7 [Veropaaveo| o | o [11oDia& [Veroparavero | — o | o | [ion [Veroparavero | — o | o | [TooTCID50mL [Veroparavero | do | o 1:10 Dia-1 C6/36 para Vero 100 o 1:10 Dia O C6/36 para Vero 100 o 1:10 Dia-1 C6/36 para Vero 6,7 12 1:10 Dia 2 C6/36 para Vero 13,3 12 1:10 Dia 3 C6/36 para Vero o o
[MoDia7 fosasparavero| — o | o | [T10Dia9 ceasparavero| — O o [ T10Diato fcesepaavero — o | o [ TooTcIDSOmE [66 paravero| too | o Tabela B: Cinética de Inativação, lote de Toxicologia nº 2 [ 11oDiao [Veroparavero | — 100 | o | [110Da2 [Veroparavero| — O | o [1MoDiar [Veroparavero | — o | o | [O T10Dia9 [Veroparavero o o [110Diato [Veroparavero | — o | o | [TooTCIDSOmE | Vero paravero too | o
1:10 Dia-1 C6/36 para Vero 100 o
1:10 Dia O C6/36 para Vero 100 o
1:10 Dia-1 C6/36 para Vero 100 12
1:10 Dia 2 C6/36 para Vero 13,3 12
1:10 Dia 3 C6/36 para Vero o o
1:10 Dia 4 C6/36 para Vero o o [T10DiaS ceasparavero| — O | o [ TooTcID5OmL [c&aS paravero| too | o
Tabela C: Cinética de inativação, lote de Toxicologia nº 3 T0Dat [Versparaves To 1 o [T10Dao [Veroparavero| 100 o TDi? [Veroparaveo o o TT0Dias [ver paraveo o [o TODA? [Veroparaveo o o TODAS fvewpaaveo o [o TODAS fVerpaaveo o [o T0Dato [Veroparaveo o o TO0TCIDSOmL [VeroparaVero | TOO o)
1:10 Dia-1 C6/36 para Vero 100 o
1:10 Dia O C6/36 para Vero 100 o
1:10 Dia-1 C6/36 para Vero 87 12
1:10 Dia 2 C6/36 para Vero 27 12
1:10 Dia 3 C6/36 para Vero o o
1:10 Dia 4 C6/36 para Vero o o TT0Da8 fcesepaavero o [o T10Dias fcosepaavero o o 10Diato [coasparavero| O o [TooTciDSImL (csaBparavero[ too o Tabela D: Cinética de Inativação, lote de Toxicologia nº 4 [ODet [Veroparavero | 100 o T10Das |[Veroparavero| O o [T10Diaa [Veroparaveo [o o
[MoDia7 [Veroparavers | —o | o | [11oDias [Veroparavero | — o | o | [140Diato [Veroparavero| O o 1:10 Dia-1 C6/36 para Vero 100 o 1:10 Dia O C6/36 para Vero 100 o 1:10 Dia-1 C6/36 para Vero 33 23 1:10 Dia 2 C6/36 para Vero 7 12 1:10 Dia 3 C6/36 para Vero o o [110Da7 cessparavero| — o o [11onias fcsasparavero — o | o | [TooTcID5O mL ceaBparaVvero| — too | o
[00467] Cinética compilada dos dados de inativação: Os dados de CO! para amostras dos quatro lotes de toxicologia foram comparados com a potência infecciosa (TCID50) determinada conforme descrito acima e com a cópia do RNA. A cópia do RNA foi determinada por pu- rificação de ácidos nucléicos da amostra e amplificação do RNA do zika com iniciadores específicos de sorotipo usando um kit de RT- PCR. O resultado mostrado na Figura 25 mostra que a sensibilidade do ensaio de CO! é significativamente maior que a do TCID50.
[00468] Características de desempenho do ensaio de COI - Preci- são: as diluições alvo (TCID50/poço) e suas respectivas proporções de CPE foram usadas para determinar a precisão relativa. Para as células Vero, houve uma relação linear estatisticamente significativa entre as proporções observadas e esperadas de CPE positivo. A inclinação da linha que relaciona os resultados observados e esperados é de 0,92, com um intervalo de confiança de 95% (IC) de 0,83 a 1,01 que se so-
brepõe a 1, indicando 100% de precisão. Para as células C6/36, exis- te uma relação linear estatisticamente significativa entre as proporções observadas e esperadas de CPE positivo. A inclinação da linha que relaciona os resultados observados e esperados é de 0,88, com um intervalo de confiança de 95% (IC) de 0,80 a 0,95, indicando que foi observada uma leve tendência (5-20%) nessa linhagem celular. Am- bas as linhagens celulares demonstram precisão satisfatória (relativa).
[00469] Características de desempenho do ensaio de COI - Limite de deftecção (LoD): a sensibilidade do ensaio foi avaliada para as pla- cas de C6/36 para Vero e Vero para Vero. Conforme descrito acima, os dados foram ajustados usando a regressão de mínimos quadrados da proporção de + ve CPE observada por total de poços semeados com diluições de título semeadas a partir de 10,00 TCID50/poço até um título mais baixo de 0,08 TCID50. Além disso, controles negativos (0,00 TCID50/poço) foram incluídos para cada diluição nas placas. A pontuação de CPE foi realizada para cada diluição nas placas de C6/36 para Vero e Vero para Vero. Foi observada uma relação clara entre o título viral de CPE e de entrada no perfil. Isso exibe a relação logística (sigmoidal) entre a proporção de poços positivos para CPE em relação à concentração de logo de TCID50/poço juntamente com um limite de confiança inferior e superior a 99%. Em uma concentra- ção de 2 logo (= 0,01 TCID50/poço), um modelo baseado em, e que considera todas as variações de fontes fixas e aleatórias nos dados de qualificação previu 0,85%, ou 0,01 quando arredondado para 0,01 TCID50/poço, com um valor menor do que 99% de limite de confiança de 0,42%. Uma vez que o limite de confiança inferior a 99% não inclui zero, há uma chance quantificável muito pequena (<1%) de que os poços CPE de 0,85% possam ter surgido a partir de O TCID50/poço (ou seja, devido ao ruído). Isso estabelece um limite de detecção para o ensaio de pelo menos 0,01 TCID50/poço (ou seja, a menor quanti-
dade de partículas vivas de zika na amostra que pode ser detectada). Ou seja, quando arredondado, 1 em 60 poços terá CPE positivo ou, dados esses parâmetros, a menor proporção teórica do CPE + ve que poderia ser detectada em 60 poços seria 1,67%, ou 0,0167.
[00470] Os tipos de células (C363 e Vero)foram comparados quan- to à sensibilidade relativa, com o C6/36 demonstrando que uma menor diluição do título de vírus poderia ser detectada em comparação com as células Vero, como mostrado na Figura 26; no mesmo nível de en- trada de vírus (0,31 TCID50), a proporção de poços positivos para CPE é maior para C6/36 em relação às células Vero.
[00471] O menor valor de entrada de vírus usado durante a qualifi- cação deste ensaio foi de 0,02 TCID50 (-1,61 log TCID50). Usando a curva ajustada para células C6/36, isso resulta em 0,035 ou 3,5% dos poços com resultado positivo de CPE (1 em 28 poços). Se a curva for extrapolada para o nível prático mais baixo de 0,167 ou 1,6%, isso equivale a um nível de entrada do vírus de 0,015 TCID50 (-1,82 log TCID50). No entanto, o impacto da variação transmitida do ensaio precisa ser considerado ao determinar os níveis mais baixos de vírus infeccioso que podem ser detectados conforme refletido nos resulta- dos de +ve CPE. Esse ruído surge da geração do estoque de trabalho do vírus de entrada. A comparação do TCID50 alvo e o cálculo da titu- lação retroativa mostram que o TCID50 do vírus do estoque de traba- lho exibiu um desvio padrão (SD) de 85 TCID50/mL, derivado de uma média de 213 ao atingir uma concentração de 200 de TCID50/mL de estoque. O% CV calcula para — 40% com um viés de cerca de +7%. Esse ruído foi levado em consideração no modelo de regressão logís- tica para gerar intervalos de confiança em torno dos valores desejados para as diluições do vírus. Com um valor alvo de 0,01 TCID50/poço, um modelo baseado em e contabilizando todas as fontes de variação fixas e aleatórias nos dados de qualificação nos dois locais prevê que
0,86% dos poços serão positivos para CPE (1 em 60 poços). Uma vez que o limite de confiança inferior a 99% não inclui zero, há uma chan- ce quantificável muito pequena (<1%) de que os poços CPE de 0,85% possam ter surgido a partir de O TCID50/poço (Figura 27). Isso esta- belece um limite de detecção para o ensaio: 0,01 TCID50/poço é a menor quantidade de partículas vivas de zika na amostra que pode ser detectada.
[00472] Características de desempenho do ensaio de COI - Interva- lo: o intervalo do ensaio foi de 0,01 TCID50/poço a 4,5 TCID50/poço e é definida como a faixa de vírus de entrada que resultou em uma pon- tuação de CPE + ve superior a 0%, mas menor que 100%.
[00473] Conclusão: A análise dos quatro Tox revelou que a inativa- ção estava completa após a incubação em formaldeído 0,01% por 10 dias em temperatura ambiente. A inativação foi alcançada pelos dias 3-4 em todos os lotes produzidos, conforme medido pelo ensaio COI. O ensaio CO! é mais sensível que a potência do TCID5O ou medições de RNA; o aumento da sensibilidade também foi observado pelo LoD. Exemplo 5: Determinando o conteúdo residual de formalina em uma composição farmacêutica Materiais e métodos Materiais
[00474] A solução padrão de formaldeído (em metanol) (982 v9g/mL), DNPH, acetonitrila de grau HPLC e ácido fosfórico foram ad- quiridos da Wako Pure Chemicals Co. (Tóquio, Japão). A água desti- lada usada para diluir o ácido fosfórico foi obtida da Otsuka Pharma- ceutical (Tokushima, Japão). Alhydrogel& 2% (correspondente a 10 mg/mL de alumínio) usado como gel de hidróxido de alumínio foi obti- do da Brenntag (Frederikssund, Dinamarca). O PBS foi preparado in- ternamente e o medicamento contra a vacina Zika contendo gel de hi- dróxido de alumínio foi fabricado conforme descrito abaixo. O Zika ví-
rus foi purificado com várias técnicas após a coleta. Após a inativação com formaldeído, o vírus foi concentrado e o tampão foi trocado com PBS por filtração. A substância farnacêutica a granel foi diluída com PBS e formulada com gel de hidróxido de alumínio (0,4 mg/mL de alumínio) para formar o medicamento final. Condições de HPLC
[00475] Utilizou-se um sistema de aliança Waters HPLC equipado com um detector de UV (Milford, EUA) e uma coluna de fase reversa (YMC-Pack ODS-A, 4,6 mm x 250 mm, 5 um (Kyoto, Japão)). Uma mistura de água e acetonitrila (1: 1, v/v) foi usada como fase móvel, o comprimento de onda de detecção foi estabelecido em 360 nm e a va- zão foi de 1,0 mL / min. A temperatura da coluna e o volume de inje- ção foram de 25ºC e 50 yuL, respectivamente. Preparação da amostra
[00476] O medicamento da vacina (1,2 mL) foi centrifugado a 15000 rpm por 10 min, e o sobrenadante (1 mL) foi transferido para um frasco de vidro de 2 mL para HPLC adquirido da Waters (Milford, EUA). Em seguida, foram adicionados 20 ul de ácido fosfórico a 20% (v/v) e 50 uL de solução de DNPH a 1,0 mg/mL em acetonitrila, e a mistura foi agitada e deixada à temperatura ambiente por 20 minutos antes da injeção. Validação do Método
[00477] De acordo com as diretrizes da ICH Q2, o método foi vali- dado em termos de especificidade, linearidade, precisão, repetibilida- de, precisão intermediária, robustez e estabilidade da amostra. No es- tudo de precisão, o medicamento da vacina contra o zika e a solução de gel de hidróxido de alumínio foram adicionados com uma quantida- de específica de formaldeído, e a amostra foi bem misturada com vór- tice antes de seguir o procedimento descrito na Seção 2.3. Resultados e Discussão
Linearidade e Especificidade
[00478] Seis soluções padrão de formaldeído (0,049, 0,098, 0,196, 0,491, 0,982 e 1,964 ug/mL) foram preparadas por diluição com PBS. Em seguida, 20% (v/v) de ácido fosfórico e 1 mg/mL de solução de DNPH em acetonitrila foram adicionados a cada solução, e os croma- togramas correspondentes são mostrados na Fig. 28. Claramente, a área do pico de 10,4 min mostrou linearidade com a equação de re- gressão: y = 1075730x + 11731 (onde y é a área do pico de 10,4 min ex x é a concentração de formaldeído em pug/mL) (coeficiente de corre- lação: 0,9998), indicando que era devido ao HCHO-DNPH (isto é, for- maldeído derivado com DNPH). Além disso, o pico em 5,8 min foi atri- buído ao DNPH, pois foi detectado em todas as amostras adicionadas ao DNPH. Portanto, a área do pico HCHO-DNPH foi usada para avali- ar a linearidade e a precisão após subtrair a área do pico de fundo em PBS. Exatidão e precisão (repetibilidade)
[00479] O efeito do adjuvante hidróxido de alumínio foi avaliado por estudos de recuperação, realizados três amostras de hidróxido de alumínio (0,1, 0,4 e 1,0 mg/mL de alumínio) em PBS com 0,05 ug/mL de formaldeído na ausência da substância farmacêutica em vacina. As recuperações médias foram de 102% (n = 3), 100% (n = 3) e 100% (n = 3), respectivamente, com valores baixos de desvio padrão relativo (RSD) (Tabela 13). O RSD dos dados de precisão foi calculado para avaliar a repetibilidade e foi de 1,0%, indicando que quantidades de alumínio de até 1,0 mg/mL não interferiram na recuperação do formal- deído.
Tabela 13 Precisão e repetibilidade avaliadas usando amostras de hi- dróxido de alumínio adicionadas com 0,05 pyg/mL de formaldeído Concentração de hidróxido de alumínio Média (n = 3) [%] [mg/mL de alumínio] % RSD 102 0,1 (0,2) 100 0,4 | (0,8) 100 1,0 (0,3) Reperbildade ln = 9) — | to
[00480] A precisão do método foi avaliada por estudos de recupera- ção, realizados com a injeção do medicamento contra a vacina Zika contendo adjuvante de hidróxido de alumínio com três concentrações de formaldeído (0,05, 0,10 e 1,00 ug/mL), e os resultados médios de recuperação são mostrados na Tabela 14. O RSD dos dados de preci- são foi calculado para avaliar a repetibilidade, e foi encontrado em 3,7%, indicando que os medicamentos da vacina contra o zika formu- lados com hidróxido de alumínio não interferem na recuperação do formaldeído entre 0,05 e 1,00 ug/mL. Tabela 14 Precisão e Repetibilidade Avaliadas Usando Medicamentos da Vacina contra o Zika Contendo Hidróxido de Alumínio com Adição de Formaldeído Concentração de formaldeído quantificada Média (n = 3) [%] [ug/mL] % RSD 102 0,05 (5,6) 97 0,10 (0,3) 98 1,00 (0,7) Repetibilidade [9] (n = 9)
Robustez
[00481] A robustez do método foi avaliada para determinar como a concentração de formaldeído nas amostras seria afetada por variações nos parâmetros experimentais durante a preparação da amostra. Con- siderando o impacto na eficácia da derivatização, a concentração de DNPH e ácido fosfórico foram selecionados como parâmetros monito- rados neste estudo. O efeito foi examinado variando as concentrações de DNPH e ácido fosfórico em + 0,1 mg/mL e + 5%, respectivamente. O formaldeído foi determinado em dois lotes de medicamentos de de- senvolvimento sob cada condição e os resultados, mostrados na Tabe- la 15, sugerem que variações nas concentrações de DNPH e ácido fosfórico não tiveram impacto significativo na determinação do formal- deído. Tabela 15 Robustez do método Condi- | Concentração | Concentração ção de DNPH de ácido fosfóri- ido [[Vg/mL] [E E PS E (*) Condições definidas do método Exemplo 6: Imunogenicidade clínica e eficácia de uma vacina ina- tivada purificada pelo Zika vírus (PIZV) derivada de cepas de P6e Preparação da amostra:
[00482] Quatro lotes de vacina contra o zika inativada purificada (PIZV) (lotes de Toxicologia 1-4) foram fabricados por crescimento em células Vero, conforme descrito acima. Os sobrenadantes de 4 colhei- tas diárias (cada colheita diária de 1000 mL diariamente, totalizando cerca de 4000 mL) foram purificados por filtração e cromatografia,
concentrados e inativados por adição de formalina a uma concentra- ção final de 0,01%. A inativação foi deixada prosseguir por 10 dias a 22ºC, antes da amostra ser trocada para tampão de substância medi- cinal (NaH2PO4 10 mM, NaCl 50 mM, sacarose a 6%, pH 7,4).
[00483] O agente ativo do Zika vírus inativado não é mais capaz de infectar células hospedeiras, que podem ser infectadas com um Zika vírus que não foi inativado. A inativação é determinada pelo seguinte protocolo de teste. A inativação é reconhecida caso nenhuma placa seja detectável. Protocolo detalhado de COI (Compleçãao de Inativação):
[00484] 1. Primeira parte do ensaio: as células Vero (1.4E+05 célu- las/mL) e mosquito Aedes aegypti C6/36 (4E +05 células/mL) foram semeadas em placas de 96 poços dois dias antes da adição das amostras. As células Vero foram cultivadas em DMEM + 10% de FBS final + 2% de L-glutamina + 1% de penicilina/estreptomicina a 37ºC. As células C636 foram cultivadas em DMEM + 10% de FBS + 2% de L- glutamina + 1% de penicilina/estreptomicina + 1% de aminoácidos não essenciais a 28ºC.
[00485] 2. Três réplicas independentes do vírus de controle 200 TCID50 (preparado no teste de controle de titulação reversa de vírus) ou as amostras de DS foram diluídas (diluições de 5 e 10 vezes) em meios contendo 2% de FBS.
[00486] 3.As célulasem placas de 96 poços foram inoculadas com as amostras. Antes da infecção das monocamadas celulares nas pla- cas de 96 poços, a amostra foi centrifugada para interromper qualquer possível agregação. 100 uL de cada diluição foram aplicados a cada um dos 5 poços em duas placas separadas de 96 poços contendo cé- lulas Vero e C636, respectivamente.
[00487] 4. O meio sozinho foi incluído em outro poço para cada tipo de célula como um controle de CPE negativo.
[00488] 5.As placas foram incubadas por 6 dias à temperatura apropriada para a linhagem celular.
[00489] 6. Segunda parte do ensaio: Para permitir que o vírus vivo seja ainda mais amplificado e visualizado por CPE em uma linhagem celular permissiva, todo o volume de cada sobrenadante de 96 poços das células Vero e C636 foi transferido para poços individuais de pla- cas de 6 poços de células Vero. A inoculação prosseguiu por 90 minu- tos com agitação a intervalos de 15 minutos.
[00490] 7.Foi adicionado meio contendo FBS a 2% aos poços e as placas foram incubadas durante 8 dias adicionais para detecção sub- sequente das amostras amplificadas em função da CPE. A inativação foi considerada incompleta se alguma das réplicas do DS apresentas- se CPE no final do dia 8.
[00491] 7.A presença de virions vivos/replicantes foi visualizada pela formação de placas ou CPE em monocamadas de células susce- tíveis após transferência para a placa de 6 poços e incubação por 8 dias para permitir a replicação viral. A pontuação da % de CPE nas placas de 6 poços no final do ensaio foi calculada como se segue: - Cada placa de 6 poços de células Vero foi examinada quanto a CPE por visualização de alteração colorimétrica, seguida pe- la confirmação de CPE por inspeção sob um microscópio de luz inver- tida.
- Cada placa de 6 poços representou uma das réplicas das diluições de DS preparadas nas diluições de 5 e 10 vezes descritas acima (5 poços, mais um poço contendo apenas o meio).
[00492] Portanto, a % de CPE para cada réplica refletiu o número de poços com CPE de 5 poços totais por amostra (120 poços totais são usados por ensaio). A % de CPE média e o desvio padrão foram calculados com base em três repetições de cada diluição.
[00493] A quantidade do Zika vírus inativado purificado pode ser determinada por um ensaio de Bradford (Bradford et al. (1976) Anal. Biochem. 72: 248-254) usando quantidades definidas da proteína re- combinante do envelope do Zika para estabelecer a curva padrão.
[00494] A pureza do Zika vírus purificado pode ser determinada por cromatografia de exclusão por tamanho. No exemplo atual, o pico principal do Zika vírus purificado na cromatografia de exclusão por ta- manho era mais de 85% da área total sob a curva na cromatografia de exclusão por tamanho.
[00495] A vacina experimental (PIZV) refere-se ao vírus inativado por formalina purificada por zika, formulado com 200 ug de hidróxido de alumínio, Al (OH) 3, como adjuvante, em solução salina tamponada com fosfato (PBS). O produto final líquido formulado é enchido em frascos de uso único e vedado com selos invioláveis. A vacina experi- mental é administrada IM (intramuscularmente) como um regime de 2 doses de 0,5 mL a 2, 5 ou 10 ug de antígeno por dose, com 28 dias de intervalo.
[00496] Solução injectável de cloreto de sódio (NaCl) a 0,9% está a ser utilizada como placebo. É fornecido em frascos de uso único. É uma solução líquida estéril, clara e incolor de cloreto de sódio sem conservante, projetada apenas para uso parenteral. O placebo é ad- ministrado IM como um regime de 2 doses de 0,5 mL por dose, com 28 dias de intervalo. Métodos de teste
[00497] Ensaio PRNT: Os títulos de anticorpos neutralizantes foram determinados por um teste de neutralização por redução de placa (PRNT), conforme descrito anteriormente (consulte Proteção de maca- cos Rhesus contra o desafio do vírus da dengue após a vacinação te- travalente ao vivo e atenuada do vírus da dengue. J Infect Dis. Dis. 193, 1658-1665 (2006). Muthumani K, Griffin BD, Agarwal S, et al. In vivo protection against ZIKV infection and pathogenesis through passi-
ve antibody transfer and active immunisation with a prMEnv DNA vac- cine. NPJ Vaccines 2016; 1: 16021). Resumidamente, o ensaio de Zika PRNT foi realizado de acordo com o protocolo desenvolvido pela Q2 Lab Solutions Vaccines, conforme descrito abaixo.
[00498] No ensaio de Zika PRNT, o soro humano foi diluído duas vezes em série de 1:5 a 1:10,240 e misturado com um volume igual de Zika vírus diluído (ZIKV) (PRVABC59) para obter uma diluição final de 1:10 a 1:20,480. A neutralização foi deixada prosseguir 20+2 horas a 2-8ºC, depois que a mistura de soro/vírus foi usada para inocular célu- las Vero E6. A adsorção de vírus foi realizada a 37+ 2ºC com umidade e CO, por 60+10 minutos, em seguida foi adicionada uma sobrecama- da de metilcelulose. As células infectadas foram incubadas a 37+2ºC com umidade e CO, por 72+2 horas. As placas foram visualizadas usando coloração com violeta de cristal e foram contadas usando um leitor CTL (Cellular Technology Limited). A determinação do título neu- tralizante de cinquenta por cento (PRNTso) foi baseada na redução percentual de placas virais na presença de soro em comparação com a do controle de vírus sem soro e foi calculada por regressão linear. Os títulos representam o recíproco da maior diluição, resultando em uma redução de 50% no número de placas. A aceitação foi avaliada avaliando-se o controle de vírus (direcionado a -60 pfu/poço), controle celular, controle positivo (PRNTso de 173-658) e controle negativo (PRNTs5so <10) testados em paralelo com amostras clínicas. Amostras individuais e resultados de controle positivo foram aceitos se o coefici- ente de correlação da curva de titulação gerado por regressão linear for 20,85. Critérios de aceitação adicionais foram baseados na quali- dade da mancha violeta de cristal e nas placas geradas para a placa ou corrida. Os resultados do PRNT 5º são relatados até a diluição inicial do ensaio (1:10). Os resultados do PRNT5o acima do ULOQ serão re- petidos em uma pré-diluição para gerar um resultado dentro da faixa quantificável do ensaio. O resultado da amostra pré-diluída será multi- plicado pelo fator de diluição para gerar um resultado final.
[00499] A estirpe de zika usada para o desenvolvimento do ensaio PRNT foi PRVABC59.
Medidas de resultado imunológico: Definições:
[00500] — Soropositividade (PRNT): títulos de 2LOD (limite de detec- ção)
[00501] —Soronegatividade (PRNT): títulos de <LOD (limite de detec- ção)
[00502] — Soroconversão (PRNT): títulos pós-vacinação de 2LOD em seres humanos inicialmente soronegativos
[00503] —LOD(PRNT)=10
[00504] Valor atribuído abaixo de LOD=5
[00505] —LLOQ (Limite inferior de qualificação, PRNT) = 26
[00506] Valor atribuído abaixo de LLOQ (Limite inferior de qualifica- ção) = 13
[00507] Os seres humanos com títulos acima do Limite Superior de Quantificação (ULOQ) serão testados novamente após diluição adicio- nal até que um título seja obtido dentro do limite qualificado de quanti- ficação do ensaio.
[00508] Ensaio de neutralização de partículas de vírus repórter (RVP): Os títulos de anticorpos neutralizantes foram analisados por titulação de amostras de soro com uma quantidade constante de RVPs de zika em células Vero crescidas em placas de 96 poços. As RVPs continham as proteínas prME do Zika (cepa SPH2012) e um repórter de luciferase de Renilla baseado em dengue. Rapidamente, os soros foram inativados pelo calor a 56ºC durante 30 min, diluídos e depois incubados a 37ºC com RVPs. A mistura de soro/RVP foi então mistu- rada com células Vero e incubada durante 72 horas a 37ºC + 2ºC/ 5%
de CO2 antes da detecção com substrato de luciferase. Os dados fo- ram analisados usando a análise de parâmetros não lineares 4 do JMP11, normalizados parau m controle de rastreamento positivo e a dose eficaz a 50% (EC50) foi relatada. Descrição do Estudo
[00509] Um Estudo de Fase 1, Randomizado, Cego para Observa- dores, Controlado por Placebo, de Segurança, Imunogenicidade e de Intervalo de Dose da Vacina de Zika vírus Inativado Purificado (PIZV) em Adultos Saudáveis, Preparados e Não Expostos ao Flavivírus, Com Idades Entre 18 e 49 Anos
[00510] O desenho do estudo é mostrado na Fig. 29. Este estudo foi elaborado para inscrever sequencialmente adultos saudáveis, sem ingestão de flavivírus e com flavivírus, entre 18 e 49 anos. As duas co- ortes sequenciais são cada uma composta por 120 seres humanos (planejados) alocados aleatoriamente em um dos 4 grupos de 30 seres humanos, para receber uma das três dosagens da vacina PIZV ou pla- cebo salino. O regime de vacinação consiste em 2 doses administra- das com 28 dias de intervalo. Os dados neste exemplo referem-se apenas aos seres humanos não expostos ao Flavivírus (n = 124), da- dos adicionais com seres humanos preparados com Flavivírus são es- perados. Este exemplo fornece dados de uma primeira análise interina após o dia 57 (28 dias após a dose 2) da "coorte ingênua de flavivírus". Os dados da coorte iniciada por flavivírus não fazem parte dessa aná- lise intermediária, pois o recrutamento para esse grupo ainda estava em andamento na primeira análise interina.
[00511] Em resumo, os seres humanos foram randomizados em quatro grupos de estudo, que receberam duas doses de placebo (so- lução salina) ou vacina contra o zika inativada purificada (PIZV) com uma concentração de 2 ug, 5 ug e 10 ug. O estudo envolveu injeção intramuscular da vacina (ou placebo) no dia 1 e no dia 29, com amos-
tras de sangue sendo coletadas nos dias 15, 1, 8, 29, 36, 57, 211, 393, 767 do estudo. Amostras de sangue no dia -15 foram usadas para de- terminar a triagem de seravados de Flavivirus e a triagem de elegibili- dade. As amostras no dia 1, 29, 57 foram para avaliação da imunoge- nicidade. Os testes de laboratório de segurança foram realizados nos dias 8 e 36. A persistência da imunidade será avaliada nos dias 211, 393 e 767.
[00512] Com base nos dados de 28 dias após a dose 2, a vacina inativada purificada contra o Zika vírus (PIZV) era segura e imunogêni- ca em adultos ingênuos ao flavivírus, com idades entre 18 e 49 anos. Objetivos Primários
[00513] O objetivo principal do estudo foi descrever a segurança de duas doses de PIZV com 28 dias de intervalo e selecionar um nível de dose entre três concentrações diferentes de antígeno (2, 5 ou 10 ug) para uso em estudos clínicos subsequentes. Os desfechos primários foram: as porcentagens de seres humanos que experimentaram even- tos adversos locais e sistêmicos (AEs) solicitados durante o período de 7 dias após a administração de cada dose de PIZV ou placebo, e as porcentagens de seres humanos que experimentaram AEs não solici- tados não graves e eventos adversos graves (AEGs) durante o perío- do de 28 dias após a vacinação. Objetivos secundários
[00514] Os objetivos secundários foram descrever a resposta imune à vacina inativada purificada pelo Zika vírus (PIZV) aos 28 dias após a dose 1 e 28 dias após a dose 2 em adultos não expostos ao flavivírus. Os desfechos secundários relacionados a esses objetivos são títulos médios geométricos (GMTs) de anticorpos anti-ZIKV neutralizantes, taxas de soropositividade (SPR) e taxas de soroconversão (SCR) nos pontos de tempo considerados.
[00515] A análise dos dados foi realizada por um conjunto separado de estatísticos e programadores não cegos, que tiveram acesso às atribuições individuais de tratamento. Todo o pessoal envolvido na condução do julgamento estava cego para as atribuições individuais de tratamento em seres humanos. A equipe de estudo teve acesso apenas aos resultados não cegos no nível do grupo. População do estudo:
[00516] Um total de 124 seres humanos foram incluídos na coorte não exposta ao flavivírus e incluídos no Conjunto de Segurança (SS), composto por todos os seres humanos randomizados que receberam pelo menos uma dose de PIZV ou placebo. Entre esses, 118 (95,2% dos SS) foram incluídos no Conjunto Completo de Análises (SAF) de seres humanos randomizados que haviam recebido pelo menos uma dose da vacina experimental (PIZV)/placebo, fornecendo resultados sorológicos válidos na referência e em pelo menos uma vez após a vacinação. Cento e treze (113) seres humanos (91,1% da SS) foram incluídos no Per Protocol Set (PPS) de seres humanos na SAF que não apresentavam grandes violações do protocolo relevantes para a análise de imunogenicidade. Os conjuntos de análise são apresenta- dos na Tabela 16. Tabela 16: Conjuntos de Análises [E Número de seres humanos (%) Placebo | 2ug de 5upug de | 10ug de Total
PIZV PIZV PIZV (N=30) | (N=31) | (N=31) | (N=32) |(N=124) Conjunto de/30 (100%) |31 (100%) [31 (100%) [32 (100%) 124 Segurança (100%)
SS Conjunto de/29 (96,7%)/28 (90,3%)|31 (100%) [30 (93,8%) 118 Análise (95,2%) Completa
FAS Conjunto /28 (93,3%)/26 (83,9%) 29 (93,5%) 30 (93,8%) 113 Por Proto- (91,1%) colo (PPS
Conjunto de Segurança = todos os seres humanos randomizados que receberam pelo menos uma (1) dose de PIZV ou placebo Conjunto Completo de Análises = todos os seres humanos randomiza- dos que receberam pelo menos uma dose de PIZV/placebo e fornece- ram valores basais válidos e pelo menos um resultado sorológico após a vacinação Conjunto por Protocolo = todos os seres humanos no FAS que não tiveram grandes violações de protocolo
[00517] Os seres humanos no SS tinham 35,3 + 8,91 anos (média + desvio padrão) e foram distribuídos em 28,2% na faixa etária de 18 a 29 anos e 71,8% na faixa etária de 30 a 49 anos. As mulheres repre- sentavam 54,8% da coorte. Os participantes do estudo foram brancos (81,5%), negros (14,5%) e "não hispânicos" (93,5%) em relação à raça e etnia. O IMC médio na ES foi de 27,5 + 4,05 (média + desvio pa- drão). As características demográficas (idade, sexo, altura, peso, IMC e etnia) foram similares entre os quatro grupos de estudo. As mulheres foram mais representadas no grupo placebo, onde constituíram 66% dos participantes do estudo, do que nos outros grupos, onde a distri- buição por gênero foi mais equilibrada. As características demográfi- cas e de referência são apresentadas na Tabela 17.
[00518] Os parâmetros do laboratório de segurança e os sinais vi- tais foram verificados na entrada do estudo como parte dos critérios de inclusão. Eles especificaram que os sinais vitais tinham que estar den- tro dos limites normais (ou seja, abaixo do Grau 1, conforme indicado na Escala de Classificação de Toxicidade do FDA) e que os testes la- boratoriais de segurança tinham que estar dentro dos limites normais ou não acima do Grau 1, conforme definido na Classificação de Toxi- cidade do FDA Escala.
Tabela 17: Características Demográficas e de Referência (Conjun- to de Segurança) [EL Namero de seres Fumanos (9) o SO Sa não asa nto (N=30) | (N=31) | (N=31) | (N=32) | (N=124) Madero [DD O (9,00) | (9,52) | (8,86) | (8,50) | (8,91) Medetno ma Tetra | Teen o Do nos Latinos (93,5) Ren Do Do nativo do Alasca
TE NC NC NC NC NC americanos
ESNMNMNNM de outras ilhas do Pacífico
[LL Número de seres humanos (9) — | Co SO SD ou) asa otro, (N=30) | (N=31) | (N=31) | (N=32) | (N=124) (81,5) [mma | o | o 265 167 sea) ame fame (4,0388) | (4,7632) | (3,7165) | (3,6511) | (4,0452) 34,64 34,83 34,14 34,37 34,83 IMC = Peso (kg)/altura? (m?). Nota 1: A idade é calculada usando a data do consentimento informa- Nota 2: Sujeito humano incluído na Categoria Multiracial somente se várias categorias de Raça forem selecionadas. Segurança/reatogenicidade
[00519] A incidência geral de notificação de eventos adversos locais solicitados (EAs) foi maior nos grupos que receberam a vacina (PIZV) do que no grupo placebo. A dor foi o EA solicitado mais frequentemen- te relatado no sítio da injeção. Após a dose 1, a dor foi sentida por 30,0% a 38,7% dos seres humanos nos grupos PIZV, em comparação com 13,8% no grupo placebo. Após a dose 2, as incidências de dor foram semelhantes às seguintes doses 1: 29,6% a 40% nos grupos PIZV e 14,3% no grupo placebo. A intensidade da dor foi relatada co- mo leve após a dose 1 e de leve a moderada após a dose 2, com 2 seres humanos no grupo PIZV 51ug (6,7%) e um sujeito humano no grupo PIZV 10ug (3,3%) relatando dor moderada. Outros EAs locais solicitados (eritema, inchaço e endurecimento) foram relatados por não mais de 9,7% dos seres humanos.
[00520] O início da dor ocorreu no dia 1 para 90% dos seres huma-
nos ou no dia 2 (para 3 seres humanos). A dor não foi relatada além do dia 5 por nenhum sujeito humano nos grupos placebo ou PIZV.
[00521] EAs sistêmicos solicitados de qualquer natureza foram rela- tados por 30% a 48,4% dos seres humanos nos grupos PIZV e por 41,4% no grupo placebo após a dose 1. Após a dose 2, as incidências foram de 10% a 33,3% nos grupos PIZV e 27,6% no grupo placebo. No geral, 81,3% (dose 1) e 75% (dose 2) dos EAs sistêmicos solicita- dos foram julgados como relacionados à vacinação em estudo. Após as duas doses, os eventos sistêmicos mais relatados foram dor de ca- beça, fadiga e mialgia.
[00522] A maioria dos EAs sistêmicos foram relatados como leves, ou seja, não interferindo na atividade diária. Algumas ocorrências fo- ram de intensidade moderada: após a dose 1, para 6,7-12,9% dos seres humanos nos grupos PIZV e 17,2% dos que receberam placebo; após a dose 2, para O - 3,3% dos seres humanos nos gru- pos PIZV e 10,3% no grupo placebo.
[00523] Houve um único relato de um EA grave: um sujeito humano no grupo placebo apresentou febre. O participante do estudo apresen- tou uma temperatura de 39,4ºC, medida por via oral, 4 dias após rece- ber a segunda vacinação do estudo. Esta febre não foi julgada como relacionada ao estudo pelo investigador.
[00524] Os EAs sistêmicos solicitados foram relatados de maneira variável ao longo do período de 7 dias nos quatro grupos. O início dos eventos de febre, fadiga, artralgia e mialgia ocorreu principalmente nos 2 dias após a vacinação e foi variável para dor de cabeça e mal-estar. Foi relatada febre durante os 2 dias após a vacinação, exceto no shu- jeito umano que relatou febre severa no grupo placebo no dia 4.
[00525] A incidência de eventos adversos locais e sistêmicos solici- tados 7 dias após a vacinação é mostrada na Tabela 18.
Tabela 18: Incidência de eventos adversos locais e sistêmicos so- licitados 7 dias após a vacinação (conjunto de segurança) Placebo 2ug PIZV/5pug PIZV| 10ug |Placebo 2ug PIZV5ug PIZ' 10ug (N=30) | (N=31) | (N=31) | PIZV | (N=30) | (N=31) | (N=31) | PlZV (N=32) (N=32) STra seco 4 (14,3) [8(29,6) [eme | o [| o [o [eai] o [165 (165) [nehaço | o [o To o o Toe o | Endureci- 3(9,7) | 2(6,5) 1(8,3) mento AEs sistêmicos n (%) Qualquer 8 (27,6) | 9 (33,3) [3 (10,0) | 8 (26,7) ça SBN [a Artralgia 164) | 274) Mialgia 269) | 2074) | 163) | 267) [marestar [40139 | 2667) [ 265) [4129 [269 [| 0 | o [3600] N = número de seres humanos com informações disponíveis; n (%) = número (porcentagem) de seres humanos que relatam um EA especí- fico.
[00526] No total, 30,6% dos seres humanos relataram AEs não soli- citados (não incluindo AEs solicitados prolongados) nos 28 dias após qualquer dose: 21,9-38,7% nos grupos PIZV e 36,7% no grupo place- bo. Esses EAs foram principalmente infecções, infestações (13,7%) e distúrbios do sistema nervoso (3,2%: dor de cabeça, enxaqueca, tontu- ra). Todos foram de intensidade leve a moderada.
[00527] EAs não solicitados foram considerados relacionados à va- cinação do estudo para três seres humanos (2,4%). Os eventos rela- tados foram: na pós-dose 1, tontura para um sujeito no grupo de 5upg de PIZV e rubor em um sujeito no grupo de 2ug de PIZV; na pós-dose 2, o prurido ocular e a lacrimação aumentaram para um sujeito no grupo de 10ug de PIZV.
[00528] Estes eram de intensidade leve a moderada, iniciados no dia 1 ou 2 após a vacinação, tinham duração de 1 a 3 dias e foram to- dos resolvidos.
[00529] Um sujeito humano interrompeu a vacinação do estudo de- vido a uma dor de cabeça após a dose 1. Este sujeito humano recebeu PIZV e experimentou a dor de cabeça 1 dia após a vacinação. A dor de cabeça foi resolvida 36 dias após o início. Nenhum evento adverso grave (SAE) foi relatado durante o período desde a dose 1 até 28 dias após a dose 2.
[00530] As poucas mudanças desde a referência observadas para os parâmetros laboratoriais de segurança do sangue nos 7 dias após a vacinação, por exemplo, de EAs normais a leves ou de leves a mode- rados, ocorreram em porcentagens comparáveis de seres humanos nos quatro grupos. Os parâmetros de urinálise foram normais em to- dos os momentos ou a categoria de classificação foi semelhante entre OS grupos e as visitas. Imunogenicidade
[00531] A Tabela 19 apresenta os títulos geométricos de anticorpos dos anticorpos neutralizantes do Zika vírus (EC50), medidos por PRNT, bem como as taxas de soropositividade e taxas de soroconver- são após cada dose da vacina.
[00532] A vacina PIZV era imunogênica em adultos não expostos a flavivírus. Todos os seres humanos eram soronegativos na referência. A vacinação de seres humanos inicialmente soronegativos para anti- corpos contra o Zika vírus provocou soropositividade em todos os se- res humanos após duas doses da vacina PIZV de qualquer dosagem: as taxas de soroconversão variaram de 69,23% a 96,43% após a dose 1 e foram 100% após a dose 2. Todos seres humanos no grupo place- bo permaneceram soronegativos durante todo o período considerado.
[00533] Foi observado um efeito na variação da dose nas taxas de soropositividade pós-dose 1 e nos GMTs após cada dose.
Após a pri- meira dose, quase todos os seres humanos (96,4%) que receberam a dose de 10 ug de PIZV haviam montado anticorpos neutralizantes con- tra o Zika vírus.
A segunda dose levou a um aumento de mais de 10 vezes no GMT a partir da dose 1, nos três grupos de PIZV.
Tabela 19: Soropositividade, taxas de soroconversão e TMG (títu- los médios geométricos) dos anticorpos neutralizantes do Zika vírus (EC5so) (PRNT) antes e 28 dias após a administração de cada dose de PIZV (por conjunto de protocolos) 2u4g de 5ug de 10ug de MN =28) PIZV PIZV PIZV (N=26) N=29 (N=30) Soro.
Pós-dose 69,23 82,14 96,43 taxa de po- 1 (48,21, (63,11, (81,65, sitvidade eseT) | 9504 | 099) 95%C] Ós- S%EN) | Pós so o (85,75, | (87,66, | (87,66, 100,00) 100,00) 100,00) Pós-dose 69,23 82,14 96,43 Taxa de 1 (48,21, (63,11, (81,65, sorocon- 85,67) 93,94) 99,91) versão Pés-dose 100 100 100 (95%CI) 2 (85,75, (87,66, (87,66, 100,00) 100,00) 100,00) Pós-dose 38,06 93,76 291,41 GMTS 1 5,00 (17,53, (44,34, (161,74, 2 1 2 (95% CI) 82,66) 98,30) 525,06) Pós-dose 1100,75 1992,33 3689,89 2 5,00 (741,07, | (1401,28, | (2676,75, 1635,00) | 2832,70) | 5086,49) N = número de seres humanos no PPS com dados PRNT disponíveis;
A soropositividade é definida como título 2 10; A soroconversão é defi- nida como: seres humanos soronegativos na referência (título <10) têm título 210 após a vacinação; os resultados <10 recebem um título de 5; Os títulos 2 10 (limite de detecção) e< 26 (limite inferior de quan- tificação) recebem um valor de 13.
[00534] Os títulos médios geométricos determinados usando PRNT, de acordo com a Tabela 19, são mostrados graficamente na Fig 30. À porcentagem de seres humanos que atingem a soroconversão deter- mina o uso do PRNT de acordo com a Tabela 19, é mostrada grafica- mente na Figura 31.
[00535] A distribuição dos títulos de neutralização, após a dose 1 e após a dose 2, é mostrada nas curvas de distribuição cumulativa in- versa nas Figuras 32 e 33, respectivamente.
[00536] Além de medir a resposta imune com o ensaio PRNT, as amostras também foram testadas com o ensaio de neutralização RVP. A Tabela 20 apresenta os títulos geométricos de anticorpos dos anti- corpos neutralizantes do Zika vírus (EC50), medidos pelo ensaio RVP. Os resultados do ensaio RVP mostram um efeito semelhante de varia- ção da dose dos dados do PRNT, com GMTs gradualmente mais altos com doses crescentes de PIZV. Tabela 20: GMTs (títulos médios geométricos) dos anticorpos neutralizantes do Zika vírus (EC5so) (RVP) antes e 28 dias após a vacinação (Conjunto por Protocolo) em rem nr | rar ARO (95% de "feesbes E E Pós-dose 2/31 (25,40)| (1988, (4126, (9560, 4986) 9354) 19359) N = número de seres humanos no PPS com dados RVP disponíveis.
Conclusão
[00537] A vacina PIZV foi bem tolerada e segura para todas as do- ses de antígeno avaliadas na coorte não exposta ao flavivífus. AEs sistêmicos solicitados foram relatados em todos os grupos, sem au- mento aparente com o aumento da força e intensidade da dose, de leve a moderada. Os AEs solicitados locais relatados também foram de intensidade leve a moderada entre os grupos. Os sintomas não so- licitados foram relatados com frequências semelhantes nos quatro grupos de estudo. No geral, a vacina era imunogênica em seres hu- manos sem flavivírus e foi observada uma resposta positiva à variação da dose. Outros itens da invenção:
[00538] 1.A vacina ou composição imunogênica para uso em um método de tratamento ou prevenção, em particular prevenção da in- fecção pelo Zika vírus em uma população de seres humanos que ne- cessite do mesmo, compreendendo administrar a seres humanos indi- viduais da referida população de seres humanos uma vacina ou com- posição imunogênica compreendendo um antígeno de um Zika vírus, em que a vacina ou composição imunogênica é administrada como uma dose única uma administração primária, em que a administração da composição imunogênica ou vacina induz 14 e/ou 28 dias após a dose única ou administração primária, uma média geométrica de títu- los de anticorpos neutralizantes em uma população de pelo menos 20 seres humanos não expostos ao flavivírus e/ou de pelo menos 20 se- res humanos soronegativos para o Zika vírus de mais de 10, ou de mais de 50, ou de mais de 100, ou de mais de 200, ou de mais de 250, conforme determinado pelo teste de neutralização por redução de pla- cas (PRNT).
[00539] 2.A vacinaou composição imunogênica para uso em um método de tratamento ou prevenção, em particular prevenção da in-
fecção pelo Zika vírus em uma população de seres humanos em ne- cessidade, compreendendo administrar a seres humanos individuais da referida população de seres humanos a vacina ou composição imunogênica compreendendo antígeno de um zika vírus, em que a va- cina ou a composição imunogênica é administrada como dose única ou administração primária e em que a administração da vacina ou composição imunogênica induz 14 e/ou 28 dias após a administração da dose única ou primária, uma taxa de soroconversão de pelo menos 25%, em pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pe- lo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89% ou pelo menos 90% em uma população de pelo me- nos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus, conforme de- terminado pelo teste de neutralização de redução de placa (PRNT).
[00540] 3.A vacinaou composição imunogênica para uso em um método de tratamento ou prevenção, em particular prevenção da in- fecção pelo Zika vírus em uma população de seres humanos em ne- cessidade, compreendendo administrar a seres humanos individuais da referida população de seres humanos a vacina ou composição imunogênica compreendendo antígeno de um zika vírus, em que a va- cina ou a composição imunogênica é administrada como dose única ou administração primária e em que a administração da vacina ou composição imunogênica induz 14 e/ou 28 dias após a administração da dose única ou primária, uma taxa de soropositividade de pelo me- nos 25%, em pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo me- nos 88%, pelo menos 89% ou pelo menos 90% em uma população de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus ou em uma população de pelo menos 20 seres humanos não expostos ao flavivírus, conforme determinado pelo teste de neutralização de redu- ção de placa (PRNT).
[00541] 4.A vacina ou composição imunogênica para uso em um método de tratamento ou prevenção, em particular prevenção da in- fecção pelo Zika vírus em uma população de seres humanos em ne- cessidade, compreendendo administrar a seres humanos individuais da referida população de seres humanos a vacina ou composição imunogênica compreendendo antígeno de um zika vírus, em que a va- cina ou a composição imunogênica é administrada como uma adminis- tração de dose única ou administração de múltiplas doses, incluindo pelo menos uma primeira administração (primária) e uma segunda (re- forço) e em que a administração da vacina ou composição imunogêni- ca até 7 dias após a administração induz efeitos colaterais sistêmicos em menos de 50% de uma população de seres humanos de pelo me- nos 20 seres humanos não expostos ao flavivírus ou em uma popula- ção de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00542] 5. Vacina ou composição imunogênica para uso em um mé- todo de tratamento ou prevenção, em particular prevenção da infecção pelo Zika vírus em uma população de seres humanos em necessida- de, compreendendo administrar a seres humanos individuais da referi- da população de seres humanos a vacina ou composição imunogênica compreendendo antígeno de um Zika vírus obtido por um método para inativar uma preparação de Zika vírus, compreendendo: (a) isolar a preparação do Zika vírus de uma ou mais célu- las cultivadas in vitro, em que as células são usadas para produzir a preparação do Zika vírus, em que o isolamento da preparação do Zika vírus compreende uma ou mais etapas selecionadas dentre: (i) filtra- ção em profundidade, (ii) troca de tampão e/ou diluição; (iii) cromato- grafia de troca iônica; e
(b) tratamento da preparação do vírus Zika com formaldeí- do, em que o resultado numérico da multiplicação da concentração de formaldeído conforme medido em % (p/v) com o período de incubação com formaldeído, medido em dias, é de 0,025 a 0,5.
[00543] 6.A vacina ou composição imunogênica de qualquer um dos itens 1 a 5, em que a vacina ou composição imunogênica é admi- nistrada como uma primeira administração (primária) e uma segunda (reforço) de aproximadamente 1 a 16 semanas de intervalo e em que a administração da vacina ou composição imunogênica induz 14 e/ou 28 dias após a administração de reforço, títulos médios geométricos de anticorpos neutralizantes em uma população de pelo menos 20 seres humanos expostos ao flavivírus e/ou em uma população de pelo me- nos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus superiores a 300, ou maior que 500, ou maior que 1000, ou maior que 1500, ou maior que 2000, ou maior que 3000, conforme determinado pelo teste de neutralização de redução de placa (PRNT).
[00544] 7.A vacinaou composição imunogênica de qualquer um dos itens 1 a 6, em que a vacina ou composição imunogênica é admi- nistrada como uma primeira administração (primária) e uma segunda (reforço) de cerca de 1 a 16 semanas de intervalo e em que a adminis- tração da vacina ou composição imunogênica induz 14 e/ou 28 dias após a administração do reforço uma taxa de soroconversão de pelo menos 70%, pelo me- nos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89% ou pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo me- nos 98%, pelo menos 99% ou 100% em uma população de pelo me- nos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus, conforme de- terminado pelo teste de neutralização para redução de placa (PRNT),
e/ou uma taxa de soropositividade de pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pe- lo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89% ou pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo me- nos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% em uma população de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus ou em uma população de pelo menos 20 seres humanos não expostos ao flaviví- rus, conforme determinado pelo teste de neutralização de redução de placa (PRNT).
[00545] 8.A vacina ou composição imunogênica de qualquer um dos itens 1 a 7, em que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração induz sintomas de dor de cabeça em menos de 29% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos ao flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00546] 9. A vacinaou composição imunogênico, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 8, em que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração induz febre em 4% ou menos e/ou fadiga em 33% ou menos e/ou artralgia em 10% ou menos, e/ou mialgia em 17% ou menos, e/ou mal-estar em 15% ou menos de uma população de seres humanos de pelo menos seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 se- res humanos soronegativos para Zika vírus.
[00547] 10. A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 9, em que a vacina ou composição imuno- gênica é administrada como doses múltiplas em uma primeira adminis- tração (primária) e uma segunda (reforço) e a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de refor-
ço induz efeitos colaterais sistêmicos em menos de 40% de uma popu- lação de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expos- tos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos pa- ra Zika vírus.
[00548] 11.A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 10, em que a vacina ou composição imuno- gênica é administrada como doses múltiplas em uma primeira adminis- tração (primária) e uma segunda (reforço) e em que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administra- ção do impulso induz - pelo menos 40% menos ou 45% menos fadiga e/ou - nenhuma febre e/ou - nenhuma, ou pelo menos 10% menos, ou pelo menos 20% menos, ou pelo menos 25% menos mialgia, e/ou - nenhuma, ou pelo menos 10% menos, ou pelo menos 20% menos mal-estar comparado com 7 dias após a administração primária em uma população de seres humanos de pelo menos 20 se- res humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00549] 12.A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 11, em que a vacina ou composição imuno- gênica é administrada como doses múltiplas em uma primeira adminis- tração (primária) e uma segunda (reforço) e a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de refor- ço induz efeitos colaterais sistêmicos em menos de 4% ou em 0% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soro- negativos para Zika vírus.
[00550] 13. A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 12, em que a vacina ou composição imuno-
gênica é administrada como doses múltiplas em uma primeira adminis- tração (primária) e uma segunda (reforço) e a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de refor- ço induz fadiga em menos de 19% de uma população de seres huma- nos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para Zika vírus.
[00551] 14. A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 13, em que a vacina ou composição imuno- gênica é administrada como doses múltiplas em uma primeira adminis- tração (primária) e uma segunda (reforço) e a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de refor- ço induz mialgia em menos de 12% ou em menos de 8% de uma po- pulação de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não ex- postos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para Zika vírus.
[00552] 15. A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 14, em que a vacina ou composição imuno- gênica é administrada como doses múltiplas em uma primeira adminis- tração (primária) e uma segunda (reforço) e a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de refor- ço induz mal-estar em menos de 13% ou em 10% ou menos de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegati- vos para Zika vírus.
[00553] 16.A vacina ou composição imunogênico, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 15, em que a vacina ou a composição imu- nogênica é administrada como doses múltiplas em uma primeira admi- nistração (primária) e em que uma segunda (reforço) e a administra- ção da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a adminis- tração de reforço induz sintomas de dor de cabeça em 20% ou menos,
e artralgia em 8% ou menos, febre em menos de 4% e fadiga em me- nos de 19%, mialgia em menos de 12% e mal-estar em menos de 13% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres huma- nos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos so- ronegativos para o Zika vírus.
[00554] 17. A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, em que a vacina ou composi- ção imunogênica compreende uma dose de 1 ug a 40 ug do antígeno, em que o antígeno é um vírus inteiro inativado.
[00555] 18.A vacina ou composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 17, o Zika vírus tendo uma mutação na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou na posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1.
[00556] 19. A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, em que o antígeno é purifica- do e em que o pico principal do antígeno purificado na cromatografia por exclusão de tamanho é mais de 85% da área total sob a curva na cromatografia por exclusão de tamanho.
[00557] 20. A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, em que a vacina ou composi- ção imunogênica é administrada a seres humanos de uma região en- dêmica do zika, opcionalmente sujeita a um surto.
[00558] 21.A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, em que a vacina ou composi- ção imunogênica é administrada a seres humanos de uma região não endêmica do zika que viaja para uma região endêmica.
[00559] 22. A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, em que a vacina ou composi- ção imunogênica é administrada a seres humanos de 18 a 29 anos de idade, em particular mulheres com potencial para engravidar.
[00560] 23. A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, em que a vacina ou composi- ção imunogênica é administrada a seres humanos com 30 a 49 anos de idade, em particular mulheres com potencial para engravidar.
[00561] 24. A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 23, em que a vacina ou composição imuno- gênica é administrada como uma administração de dose única ou ad- ministração de doses múltiplas, incluindo pelo menos uma primeira administração (primária) e uma segunda (reforço) em que a vacina ou composição imunogênica compreende uma dose de cerca de 5 ug de vírus inteiro inativado purificado.
[00562] 25.A vacina ou composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 24, em que a vacina ou a composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz efeitos co- laterais sistêmicos em menos de 50%, ou em menos de 45% ou em menos de 40% de uma população de seres humanos de pelo menos seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 se- res humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz efeitos colaterais sistêmicos em menos de 40% ou em menos de 35%, ou em menos de 30%, ou em menos de 25%, ou em menos de 20%, ou em menos de 15% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00563] 26.A vacina ou composição imunogênico, de acordo com a reivindicação 24 ou 25, em que a administração da vacina ou compo- sição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz febre em menos de 3% ou em 0% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a fla- vivírus ou pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou em que administração da vacina ou composição imunogêni- ca até 7 dias após a administração de reforço induz febre em menos de 4%, ou em menos de 3% ou em 0% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00564] 27. A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer um dos itens 24 a 26, em que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz dor de cabeça em menos de 29% de uma po- pulação de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não ex- postos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou em que a administração da vacina ou composi- ção imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz dor de cabeça em menos de 20%, ou em menos de 15%, ou em menos de 10%, ou em menos de 5% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00565] 28.A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer um dos itens 24 a 27, em que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz fadiga em menos de 30%, ou em menos de 25% ou em menos de 20% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou em que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz fadiga em menos de 20%, ou em menos de 15% ou em menos de 10% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00566] 29. A vacina ou composição imunogênico, de acordo com qualquer um dos itens 24 ou 28, em que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz artalgia em menos de 4% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou em que administração da vacina ou composição imunogêni- ca até 7 dias após a administração de reforço induz artalgia em menos de 5%, ou em menos de 2% ou em 0% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00567] 30. A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer um dos itens 24 a 29, em que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz mialgia em 17% ou menos de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivífus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou em que a administração da vacina ou composição imu- nogênica até 7 dias após a administração de reforço induz dor de ca- beça em menos de 12%, ou em menos de 10%, ou em menos de 5%, de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres huma- nos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos so- ronegativos para o Zika vírus.
[00568] 31. A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer um dos itens 24 a 30, em que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz mal-estar em menos de 10% de uma popula- ção de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expos- tos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos pa- ra o Zika vírus e/ou em que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz mal- estar em menos de 14%, ou em menos de 10%, ou em menos de 5% ou 0% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres huma- nos soronegativos para o Zika vírus.
[00569] 32. A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer um dos itens 24 a 31, em que a vacina ou composição imu- nogênica é administrada como doses múltiplas em uma primeira admi- nistração (primária) e uma segunda (reforço) e em que a administra- ção da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a adminis- tração do impulso induz - pelo menos 70% menos, ou pelo menos 60% menos, ou pelo menos 50% menos, ou pelo menos 40% menos, ou pelo menos 35% menos, ou pelo menos 30% menos efeitos colaterais sistêmicos e/ou - nenhum aumento na febre e/ou - pelo menos 80% menos, ou pelo menos 70% menos, ou pelo menos 60% menos, ou pelo menos 50% menos, ou pelo menos 45% menos dor de cabeça e/ou - pelo menos 60% menos, ou pelo menos 55% menos, ou pelo menos 50% menos, ou pelo menos 45% menos ou pelo menos 40% menos fadiga e/ou - nenhum aumento na artralgia, ou pelo menos 80% menos, ou pelo menos 60% menos, ou pelo menos 40% menos, ou pelo me- nos 20% menos, ou pelo menos 10% menos artralgia e/ou - nenhum aumento na mialgia, ou pelo menos 70% a me- nos, ou pelo menos 60% a menos, ou pelo menos 40% a menos, ou pelo menos 20% a menos, ou pelo menos 10% a menos de mialgia e/ou
- nenhum aumento no mal-estar, ou pelo menos 80% me- nos, ou pelo menos 60% menos, ou pelo menos 40% menos, ou pelo menos 20% menos, ou pelo menos 10% menos mal-estar comparado com 7 dias após a administração primária em uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00570] 33.A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 23, em que a vacina ou composição imuno- gênica é administrada como uma administração de dose única ou ad- ministração de doses múltiplas, incluindo pelo menos uma primeira administração (primária) e uma segunda (reforço) em que a vacina ou composição imunogênica compreende uma dose de cerca de 10 ug de vírus inteiro inativado purificado.
[00571] 34.A vacina ou composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 33, em que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primá- ria induz efeitos colaterais sistêmicos em menos de 50%, de uma po- pulação de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não ex- postos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou em que a administração da vacina ou composi- ção imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz efeitos colaterais sistêmicos em menos de 40% ou em menos de 35%, ou em menos de 30% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00572] 35.A vacina ou composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 33 ou 34, em que a administração da vacina ou compo- sição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz febre em menos de 4% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou em que administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz febre em menos de 4%, ou em menos de 3% ou em 0% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00573] 36.A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer um dos itens 33 a 35, em que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz fadiga em menos de 29%, ou em menos de 25%, ou em menos de 20% ou menos de 15% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a fla- vivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou em que a administração da vacina ou composição imunogê- nica até 7 dias após a administração de reforço induz dor de cabeça em menos de 20% ou menos de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00574] 37.A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer um dos itens 33 a 36, em que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz fadiga em 33% ou menos de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos e/ou em que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz fadiga em menos de 20% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soro- negativos para o Zika vírus.
[00575] 38.A vacina ou composição imunogênico, de acordo com qualquer um dos itens 33 ou 37, em que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz artalgia em 10% ou menos de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou em que administração da vacina ou composição imunogêni- ca até 7 dias após a administração de reforço induz artalgia em menos de 5% de uma população de seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00576] 39. A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer um dos itens 33 a 38, em que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz mialgia em 17% ou menos de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou em que a administração da vacina ou composição imu- nogênica até 7 dias após a administração de reforço induz dor de ca- beça em menos de 12%, ou em menos de 10% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a fla- vivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00577] 40. A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer um dos itens 33 a 39, em que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz mal-estar em 15% ou menos de uma popula- ção de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expos- tos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos pa- ra o Zika vírus e/ou em que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz mal-
estar em menos de 13%, ou em menos de 10%, ou menos de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegati- vos para o Zika vírus.
[00578] 41.A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer um dos itens 33 a 40, em que a vacina ou composição imu- nogênica é administrada como doses múltiplas em uma primeira admi- nistração (primária) e uma segunda (reforço) e em que a administra- ção da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a adminis- tração do impulso induz - pelo menos 40% menos, ou pelo menos 35% menos, ou pelo menos 30% menos, ou pelo menos 25% menos efeitos colaterais sistêmicos e/ou - nenhum aumento na febre, ou pelo menos 80% menos, ou pelo menos 60% menos, ou pelo menos 40% menos, ou pelo menos 20% menos, ou pelo menos 10% menos febre, e/ou - pelo menos 45% menos ou pelo menos 40% menos fadi- ga e/ou - nenhum aumento na artralgia, ou pelo menos 65% menos, ou pelo menos 60% menos, ou pelo menos 40% menos, ou pelo me- nos 20% menos, ou pelo menos 10% menos artralgia e/ou - nenhum aumento na mialgia, ou pelo menos 45% a me- nos, ou pelo menos 40% a menos, ou pelo menos 20% a menos, ou pelo menos 10% a menos de mialgia e/ou - nenhum aumento no mal-estar, ou pelo menos 20% me- nos ou pelo menos 10% menos mal-estar comparado com 7 dias após a administração primária em uma população de seres humanos de pe- lo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo me- nos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00579] 42. A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 23, em que a vacina ou composição imuno- gênica é administrada como uma administração de dose única ou ad- ministração de doses múltiplas, incluindo pelo menos uma primeira administração (primária) e uma segunda (reforço) em que a vacina ou composição imunogênica compreende uma dose de cerca de 2 ug de vírus inteiro inativado purificado.
[00580] 43.A vacina ou composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 42, em que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primá- ria induz efeitos colaterais sistêmicos em menos de 50%, ou em me- nos de 45%, ou em menos de 40%, ou em menos de 35% de uma po- pulação de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não ex- postos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou em que a administração da vacina ou composi- ção imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz efeitos colaterais sistêmicos em menos de 40% ou em menos de 35% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres huma- nos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos so- ronegativos para o Zika vírus.
[00581] 44. A vacina ou composição imunogênico, de acordo com as reivindicaçõew 42 ou 43, em que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz febre em menos de 3% ou em 0% de uma po- pulação de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não ex- postos a flavivítus ou pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou em que administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz febre em menos de 4%, ou em menos de 3% ou em 0% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00582] 45.A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer um dos itens 42 a 44, em que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz fadiga em menos de 29%, ou em menos de 25%, ou em menos de 20% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou em que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz dor de cabeça em menos de 20% ou em menos de 15% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00583] 46. A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer um dos itens 42 a 45, em que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz fadiga em menos de 30%, ou em menos de 25% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres huma- nos soronegativos para o Zika vírus e/ou em que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz fadiga em menos de 20%, ou em menos de 15% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soro- negativos para o Zika vírus.
[00584] 47. A vacina ou composição imunogênico, de acordo com qualquer um dos itens 42 ou 46, em que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz artalgia em menos de 4% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou em que administração da vacina ou composição imunogêni- ca até 7 dias após a administração de reforço induz artalgia em menos de 8% de uma população de seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00585] 48.A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer um dos itens 42 a 47, em que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz mialgia em 17% ou menos de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou em que a administração da vacina ou composição imu- nogênica até 7 dias após a administração de reforço induz dor de ca- beça em menos de 12%, ou em menos de 10% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a fla- vivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00586] 49. A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer um dos itens 42 a 48, em que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz mal-estar em menos de 10% de uma popula- ção de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expos- tos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos pa- ra o Zika vírus e/ou em que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz mal- estar em menos de 13%, ou em menos de 10%, ou em menos de 5% ou 0% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres huma- nos soronegativos para o Zika vírus.
[00587] 50. A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer um dos itens 42 a 49, em que a vacina ou composição imu- nogênica é administrada como doses múltiplas em uma primeira admi- nistração (primária) e uma segunda (reforço) e em que a administra- ção da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a adminis- tração do impulso induz - nenhum aumento na febre e/ou - pelo menos 50% menos, ou pelo menos 45% menos, ou pelo menos 40% menos fadiga e/pu - nenhum aumento na mialgia, ou pelo menos 20% menos, ou pelo menos 10% menos mialgia, e/ou - nenhum aumento no mal-estar, ou pelo menos 80% me- nos, ou pelo menos 60% menos, ou pelo menos 40% menos, ou pelo menos 20% menos, ou pelo menos 10% menos mal-estar comparado com 7 dias após a administração primária em uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
[00588] 51.A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer um dos itens 5 a 50, em que as células são células não hu- manas.
[00589] 52.A vacina ou composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 51, em que as células são células Vero.
[00590] 53. A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer um dos itens 5 a 52, em que a preparação do Zika vírus é tratada com formaldeído a uma concentração de 0,005% (p/v) a 0,02% (p/v).
[00591] 54. A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer um dos itens 5 a 53, em que a preparação do vírus Zika é tratada por oito a doze dias.
[00592] 55.A vacina ou composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 54, em que a preparação do Zika vírus é tratada por dez dias.
[00593] 56.A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer um dos itens 5 a 55, em que a preparação do Zika vírus é tratada a uma temperatura de 15ºC a 30ºC.
[00594] 57.A vacina ou composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 56, em que a preparação do Zika vírus é tratada a uma temperatura de 22ºC.
[00595] 58. A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer um dos itens 5 a 57, compreendendo adicionalmente uma etapa (c) de determinar a integridade da inativação.
[00596] 59.A vacina ou composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 58, em que a etapa (c) compreende: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma prepara- ção de vírus Zika tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as célu- las de inseto por um primeiro período de tempo, produzindo assim um sobrenadante de célula de inseto; (ii) inocular células de mamífero com o sobrenadante de cé- lula de inseto produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação do vírus contém um vírus residual de replicação que produz um efeito citopático nas células dos mamíferos.
[00597] 60.A vacina ou composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 59, em que as células de inseto são selecionadas a partir de células CCL-125, células Aag-2, células RML-12, células C6/36, células C7-10, células AP-61, At. células GRIP-1, A.t. células GRIP-2, At. Células GRIP-3, células UM-AVE 1, células Mos.55, células Sua1B,
células 4a-3B, células Mos.42, células MSQ43, células LSB-AA695BB, células NIID-CTR e células TRA-171, como as células C6/36.
[00598] 61.A vacina ou composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 59 ou 60, em que o primeiro período de tempo é de 3a 7 dias.
[00599] 62. A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer um dos itens 59 a 61, em que as células de mamíferos são selecionadas a partir de células VERO, células LLC-MK2, células MDBK, células MDCK, células ATCC CCL34 MDCK (NBL2), MDCK 33016 (número de depósito DSM ACC 2219, como descrito em WOS97/37001), células BHK21-F, células HKCC e células de ovário de hamster chinês (células CHO), como células VERO.
[00600] 63. A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer um dos itens 59 a 62, em que o segundo período de tempo é de 3 a 14 dias.
[00601] 64.A vacina ou composição imunogênica de qualquer um dos itens 5 a 63, compreendendo adicionalmente uma etapa (d) de neutralizar a preparação do vírus Zika tratado com formaldeído com metabissulfito de sódio.
[00602] 65.A vacina ou composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 64, em que a preparação do vírus Zika tratado com for- maldeído é neutralizada pelo menos cinco, pelo menos sete, pelo me- nos nove, pelo menos 11 ou pelo menos 14 dias após o tratamento com formaldeído.
[00603] 66.A vacina ou composição imunogênica, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 65, em que a vacina ou composição imuno- gênica tem um teor residual de formaldeído inferior a 50 pug/ml.

Claims (68)

REIVINDICAÇÕES
1. Método de tratamento ou prevenção, em particular pre- venção da infecção pelo Zika vírus em uma população de seres hu- manos que necessite do mesmo, caracterizado pelo fato de que com- preende administrar a seres humanos individuais da referida popula- ção de seres humanos uma vacina ou composição imunogênica com- preendendo um antígeno de um Zika vírus, em que a vacina ou com- posição imunogênica é administrada como uma dose única uma admi- nistração primária, em que a administração da composição imunogêni- ca ou vacina induz 14 e/ou 28 dias após a dose única ou administra- ção primária, uma média geométrica de títulos de anticorpos neutrali- zantes em uma população de pelo menos 20 seres humanos não ex- postos ao flavivírus e/ou de pelo menos 20 seres humanos soronegati- vos para o Zika vírus de mais de 10, ou de mais de 50, ou de mais de 100, ou de mais de 200, ou de mais de 250, conforme determinado pelo teste de neutralização por redução de placas (PRNT).
2. Método de tratamento ou prevenção, em particular pre- venção da infecção pelo vírus Zika em uma população de seres hu- manos em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a seres humanos individuais da referida popu- lação de seres humanos uma vacina ou composição imunogênica compreendendo antígeno de um zika vírus, em que a vacina ou a composição imunogênica é administrada como dose única ou adminis- tração primária e em que a administração da vacina ou composição imunogênica induz 14 e/ou 28 dias após a administração da dose úni- ca ou primária, uma taxa de soroconversão de pelo menos 25%, em pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo me- nos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89% ou pelo menos 90% em uma população de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o vírus Zika, conforme determina- do pelo teste de neutralização de redução de placa (PRNT).
3. Método de tratamento ou prevenção, em particular pre- venção da infecção pelo vírus Zika em uma população de seres hu- manos em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a seres humanos individuais da referida popu- lação de seres humanos uma vacina ou composição imunogênica compreendendo antígeno de um zika vírus, em que a vacina ou a composição imunogênica é administrada como dose única ou adminis- tração primária e em que a administração da vacina ou composição imunogênica induz 14 e/ou 28 dias após a administração da dose úni- ca ou primária, uma taxa de soropositividade de pelo menos 25%, em pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo me- nos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89% ou pelo menos 90% em uma população de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o vírus Zika ou em uma população de pelo menos 20 seres humanos não expostos ao flavivírus, confor- me determinado pelo teste de neutralização de redução de placa (PRNT).
4. Método de tratamento ou prevenção, em particular pre- venção da infecção pelo vírus Zika em uma população de seres hu- manos em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a seres humanos individuais da referida popu- lação de seres humanos uma vacina ou composição imunogênica compreendendo antígeno de um zika vírus, em que a vacina ou a composição imunogênica é administrada como uma administração de dose única ou administração de múltiplas doses, incluindo pelo menos uma primeira administração (primária) e uma segunda (reforço) e em que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração induz efeitos colaterais sistêmicos em menos de 50% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos ao flavivífus ou em uma população de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o vírus Zika.
5. Método de tratamento ou prevenção, em particular pre- venção da infecção pelo vírus Zika em uma população de seres hu- manos em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a seres humanos individuais da referida popu- lação de seres humanos uma vacina ou composição imunogênica compreendendo antígeno de um vírus zika obtido por um método para inativar uma preparação de vírus Zika, compreendendo: (a) isolar a preparação do Zika vírus de uma ou mais célu- las cultivadas in vitro, em que as células são usadas para produzir a preparação do Zika vírus, em que o isolamento da preparação do Zika vírus compreende uma ou mais etapas selecionadas dentre: (i) filtra- ção em profundidade, (ii) troca de tampão e/ou diluição; (iii) cromato- grafia de troca iônica; e (b) tratamento da preparação do vírus Zika com formaldeí- do, em que o resultado numérico da multiplicação da concentração de formaldeído conforme medido em % (p/v) com o período de incubação com formaldeído, medido em dias, é de 0,025 a 0,5.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a vacina ou composição imunogênica é administrada como uma primeira administração (primá- ria) e uma segunda (reforço) de aproximadamente 1 a 16 semanas de intervalo e em que a administração da vacina ou composição imuno- gênica induz 14 e/ou 28 dias após a administração de reforço, títulos médios geométricos de anticorpos neutralizantes em uma população de pelo menos 20 seres humanos expostos ao flavivírus e/ou em uma população de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o vií-
rus Zika superiores a 300, ou maior que 500, ou maior que 1000, ou maior que 1500, ou maior que 2000, ou maior que 3000, conforme de- terminado pelo teste de neutralização de redução de placa (PRNT).
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a vacina ou composição imunogênica é administrada como uma primeira administração (primá- ria) e uma segunda (reforço) de cerca de 1 a 16 semanas de intervalo e em que a administração da vacina ou composição imunogênica in- duz 14 e/ou 28 dias após a administração do reforço uma taxa de soroconversão de pelo menos 70%, pelo me- nos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89% ou pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo me- nos 98%, pelo menos 99% ou 100% em uma população de pelo me- nos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus, conforme de- terminado pelo teste de neutralização para redução de placa (PRNT), e/ou uma taxa de soropositividade de pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pe- lo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89% ou pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo me- nos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% em uma população de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus ou em uma população de pelo menos 20 seres humanos não expostos ao flaviví- rus, conforme determinado pelo teste de neutralização de redução de placa (PRNT).
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração induz sintomas de dor de cabeça em menos de 29% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos ao flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o vírus zika.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração induz febre em 4% ou menos e/ou fadiga em 33% ou menos e/ou artralgia em 10% ou menos, e/ou mialgia em 17% ou menos, e/ou mal-estar em 15% ou menos de uma população de seres humanos de pelo menos seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 se- res humanos soronegativos para Zika vírus.
10. Método, de acordo com qualquer uma da reivindicações 1 a9, caracterizado pelo fato de que a vacina ou composição imuno- gênica é administrada como doses múltiplas em uma primeira adminis- tração (primária) e uma segunda (reforço) e a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de refor- ço induz efeitos colaterais sistêmicos em menos de 40% de uma popu- lação de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expos- tos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos pa- ra Zika vírus.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a vacina ou composição imunogênica é administrada como doses múltiplas em uma primeira administração (primária) e uma segunda (reforço) e em que a adminis- tração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a admi- nistração do impulso induz — — pelomenos 40% menos ou 45% menos fadiga e/ou — —nenhuma febre e/ou
— nenhuma, ou pelo menos 10% menos, ou pelo menos 20% menos, ou pelo menos 25% menos mialgia, e/ou — nenhuma, ou pelo menos 10% menos, ou pelo menos 20% menos mal-estar comparado com 7 dias após a administração primária em uma população de seres humanos de pelo menos 20 se- res humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a vacina ou composição imunogênica é administrada como doses múltiplas em uma primeira administração (primária) e uma segunda (reforço) e a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz febre em menos de 4% ou 0% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a fla- vivírus ou pelo menos 20 seres humanos soronegativos para Zika ví- rus.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a vacina ou composição imunogênica é administrada como doses múltiplas em uma primeira administração (primária) e uma segunda (reforço) e a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz fadiga em menos de 19% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para Zika vírus.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a vacina ou composição imunogênica é administrada como doses múltiplas em uma primeira administração (primária) e uma segunda (reforço) e a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz mialgia em menos de 12% ou em menos de 8% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soro- negativos para Zika vírus.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a vacina ou composição imunogênica é administrada como doses múltiplas em uma primeira administração (primária) e uma segunda (reforço) e a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz mal-estar em menos de 13% ou 10% ou menos de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou pelo menos 20 seres humanos soronega- tivos para Zika vírus.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a vacina ou a composição imunogênica é administrada como doses múltiplas em uma primeira administração (primária) e em que uma segunda (reforço) e a adminis- tração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a admi- nistração de reforço induz sintomas de dor de cabeça em 20% ou me- nos, e artralgia em 8% ou menos, febre em menos de 4% e fadiga em menos de 19%, mialgia em menos de 12% e mal-estar em menos de 13% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres huma- nos soronegativos para o Zika vírus.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 16, caracterizado pelo fato de que a vacina ou composição imunogênica compreende uma dose de 1 ug a 40 ug do antígeno, em que o antígeno é um vírus inteiro inativado.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracteriza- do pelo fato de que o Zika vírus tem uma mutação na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou na posição correspondente à posição 98 da SEQ ID
NO: 1.
19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 18, caracterizado pelo fato de que o antígeno é purificado e em que o pico principal do antígeno purificado na cromatografia por exclusão de tamanho é mais de 85% da área total sob a curva na cro- matografia por exclusão de tamanho.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 19, caracterizado pelo fato de que a vacina ou composição imunogênica é administrada a seres humanos de uma região endêmi- ca do zika, opcionalmente sujeita a um surto.
21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 20, caracterizado pelo fato de que a vacina ou composição imunogênica é administrada a seres humanos de uma região não en- dêmica do zika que viaja para uma região endêmica.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções | a 21, caracterizado pelo fato de que a vacina ou composição imunogênica é administrada a seres humanos de 18 a 29 anos de ida- de, em particular mulheres com potencial para engravidar.
23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1| a 21, caracterizado pelo fato de que a vacina ou composição imunogênica é administrada a seres humanos com 30 a 49 anos de idade, em particular mulheres com potencial para engravidar.
24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções | a 23, caracterizado pelo fato de que a vacina ou composição imunogênica é administrada como uma administração de dose única ou administração de doses múltiplas, incluindo pelo menos uma pri- meira administração (primária) e uma segunda (reforço) em que a va- cina ou composição imunogênica compreende uma dose de cerca de ug de vírus inteiro inativado purificado.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracteriza-
do pelo fato de que a administração da vacina ou composição imuno- gênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária in- duz efeitos colaterais sistêmicos em menos de 50%, ou em menos de 45% ou em menos de 40% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos ingênuos de flavivírus ou de pelo me- nos 20 isujeito humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou em que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz efeitos colaterais sistêmicos em menos de 40%, ou em menos de 35%, ou em menos de 30%, ou em menos de 25%, ou em menos de 20%, ou em menos de 15% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegati- vos para o Zika vírus.
26. Método, de acordo com a reivindicação 24 ou 25, carac- terizado pelo fato de que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primá- ria induz febre em menos de 3% ou em 0% de uma população de se- res humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flaviví- rus ou pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou em que administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz febre em menos de 4%, ou em menos de 3% ou em 0% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
27. Método, de acordo com qualquer uma da reivindicações 24 a 26, caracterizado pelo fato de que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz dor de cabeça em menos de 29% ou menos de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres huma- nos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos so-
ronegativos para o Zika vírus e/ou em que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de refor- ço induz dor de cabeça em menos de 20%, ou em menos de 15%, ou em menos de 10% ou em menos de 5% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 24 a 27, caracterizado pelo fato de que a administração da vaci- na ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz fadiga em menos de 30% ou em menos de 25%, ou em menos de 20% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou em que administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz febre em menos de 20%, ou em me- nos de 15% ou em 10% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 24 a 28, caracterizado pelo fato de que a administração da vaci- na ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz artralgia em menos de 4% de uma popu- lação de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expos- tos a flavivírus ou pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou em que administração da vacina ou composição imu- nogênica até 7 dias após a administração de reforço induz artralgia em menos de 5%, ou em menos de 2% ou em 0% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a fla- vivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
30. Método, de acordo com qualquer uma da reivindicações 24 a 29, caracterizado pelo fato de que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz mialgia em 17% ou menos de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou em que a administração da vacina ou composição imu- nogênica até 7 dias após a administração de reforço induz dor de ca- beça em menos de 12%, ou em menos de 10% ou em menos de 5% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres huma- nos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos so- ronegativos para o Zika vírus.
31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 24 a 30, caracterizado pelo fato de que a administração da vaci- na ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz mal-estar em menos de 10% de uma po- pulação de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não ex- postos a flavivítus ou pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou em que administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz mal- estar em menos de 14%, ou em menos de 10% ou em menos de 5% ou 0% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres huma- nos soronegativos para o Zika vírus.
32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 24 a 31, caracterizado pelo fato de que a vacina ou composição imunogênica é administrada como doses múltiplas em uma primeira administração (primária) e uma segunda (reforço) e em que a adminis- tração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a admi- nistração do impulso induz
- — pelomenos 70% menos, ou pelo menos 60% menos, ou pelo menos 50% menos, ou pelo menos 40% menos, ou pelo menos 35% menos, ou pelo menos 30% menos efeitos colaterais sistêmicos e/ou - —nenhum aumento na febre e/ou - —pelomenos 80% menos, ou pelo menos 70% menos, ou pelo menos 60% menos, ou pelo menos 50% menos, ou pelo menos 45% menos dor de cabeça e/ou - —pelomenos 60% menos, ou pelo menos 55% menos, ou pelo menos 50% menos, ou pelo menos 45% menos ou pelo menos 40% menos fadiga e/ou - “nenhum aumento na artralgia, ou pelo menos 80% me- nos, ou pelo menos 60% menos, ou pelo menos 40% menos, ou pelo menos 20% menos, ou pelo menos 10% menos artralgia e/ou - —nenhum aumento na mialgia, ou pelo menos 70% a me- nos, ou pelo menos 60% a menos, ou pelo menos 40% a menos, ou pelo menos 20% a menos, ou pelo menos 10% a menos de mialgia e/ou - nenhum aumento no mal-estar, ou pelo menos 80% menos, ou pelo menos 60% menos, ou pelo menos 40% menos, ou pelo menos 20% menos, ou pelo menos 10% menos mal-estar compa- rado com 7 dias após a administração primária em uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a fla- vivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 23, caracterizado pelo fato de que a vacina ou composição imunogênica é administrada como uma administração de dose única ou administração de doses múltiplas, incluindo pelo menos uma pri- meira administração (primária) e uma segunda (reforço) em que a va-
cina ou composição imunogênica compreende uma dose de cerca de ug de vírus inteiro inativado purificado.
34. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracteriza- do pelo fato de que a administração da vacina ou composição imuno- gênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária in- duz efeitos colaterais sistêmicos em menos de 50% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou em que administração da vacina ou composição imunogêni- ca até 7 dias após a administração de reforço induz efeitos colaterais em menos de 40%, ou em menos de 35% ou em menos de 30% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soro- negativos para o Zika vírus.
35. Método, de acordo com a reivindicação 33 ou 34, carac- terizado pelo fato de que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primá- ria induz febre em menos de 4% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou em que administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz febre em menos de 4%, ou em me- nos de 3% ou 0% de uma população de seres humanos de pelo me- nos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 33 a 35, caracterizado pelo fato de que a administração da vaci- na ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz dor de cabeça em menos de 29%, ou em menos de 25%, ou em menos de 20%, ou em menos de 15% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou em que administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz dor de cabeça em 20% ou menos de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 33 a 36, caracterizado pelo fato de que a administração da vaci- na ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz fadiga em 33% ou menos de uma popu- lação de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expos- tos a flavivítus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos e/ou em que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz fadiga em menos de 20% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres huma- nos soronegativos para o Zika vírus.
38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 33 a 37, caracterizado pelo fato de que a administração da vaci- na ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz artalgia em 10% ou menos de uma popu- lação de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expos- tos a flavivírus ou pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou em que administração da vacina ou composição imu- nogênica até 7 dias após a administração de reforço induz artalgia em menos de 5% de uma população de 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
39. Método, de acordo com qualquer uma da reivindicações
33 a 38, caracterizado pelo fato de que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz mialgia em 17% ou menos de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivítus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou em que a administração da vacina ou composição imu- nogênica até 7 dias após a administração de reforço induz dor de ca- beça em menos de 12%, ou em menos de 10% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a fla- vivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 33 a 39, caracterizado pelo fato de que a administração da vaci- na ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz mal-estar em 15% ou menos de uma po- pulação de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não ex- postos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou em que a administração da vacina ou composi- ção imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz mal-estar em menos de 13%, ou em menos de 10%, ou menos de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soro- negativos para o Zika vírus.
41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 33 a 40, caracterizado pelo fato de que a vacina ou composição imunogênica é administrada como doses múltiplas em uma primeira administração (primária) e uma segunda (reforço) e em que a adminis- tração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a admi- nistração do impulso induz - — pelomenos 40% menos, ou pelo menos 35% menos, ou pelo menos 30% menos, ou pelo menos 25% menos efeitos colaterais sistêmicos e/ou - “nenhum aumento na febre, ou pelo menos 80% menos, ou pelo menos 60% menos, ou pelo menos 40% menos, ou pelo me- nos 20% menos, ou pelo menos 10% menos febre, e/ou - “pelomenos 45% menos ou pelo menos 40% menos fa- diga e/ou - —nenhum aumento na artralgia, ou pelo menos 65% me- nos, ou pelo menos 60% menos, ou pelo menos 40% menos, ou pelo menos 20% menos, ou pelo menos 10% menos artralgia e/ou - —nenhum aumento na mialgia, ou pelo menos 45% a me- nos, ou pelo menos 40% a menos, ou pelo menos 20% a menos, ou pelo menos 10% a menos de mialgia e/ou - nenhum aumento no mal-estar, ou pelo menos 20% menos ou pelo menos 10% menos mal-estar comparado com 7 dias após a administração primária em uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soro- negativos para o Zika vírus.
42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 23, caracterizado pelo fato de que a vacina ou composição imunogênica é administrada como uma administração de dose única ou administração de doses múltiplas, incluindo pelo menos uma pri- meira administração (primária) e uma segunda (reforço) em que a va- cina ou composição imunogênica compreende uma dose de cerca de 2 ug de vírus inteiro inativado purificado.
43. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracteriza- do pelo fato de que a administração da vacina ou composição imuno- gênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária in- duz efeitos colaterais sistêmicos em menos de 50%, ou em menos de
45%, ou em menos de 40%, ou em menos de 35% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou em que administração da vacina ou composição imunogêni- ca até 7 dias após a administração de reforço induz efeitos colaterais em menos de 40%, ou em menos de 35% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
44, Método, de acordo com a reivindicação 42 ou 43, carac- terizado pelo fato de que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primá- ria induz febre em menos de 3% ou em 0% de uma população de se- res humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flaviví- rus ou pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou em que administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz febre em menos de 4%, ou em menos de 3% ou em 0% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 42 a 44, caracterizado pelo fato de que a administração da vaci- na ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz dor de cabeça em menos de 29%, ou em menos de 25%, ou em menos de 20% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou em que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz dor de cabeça em menos de 20%, ou em menos de 15% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 42 a 45, caracterizado pelo fato de que a administração da vaci- na ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz fadiga em 30% ou menos de 25% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soro- negativos e/ou em que a administração da vacina ou composição imu- nogênica até 7 dias após a administração de reforço induz fadiga em menos de 20%, ou em menos de 15% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 42 a 46, caracterizado pelo fato de que a administração da vaci- na ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz artalgia em 4% de uma população de se- res humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flaviví- rus ou pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou em que administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz artalgia em menos de 8% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres huma- nos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos so- ronegativos para o Zika vírus.
48. Método, de acordo com qualquer uma da reivindicações 42 a 47, caracterizado pelo fato de que a administração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz mialgia em 17% ou menos de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou em que a administração da vacina ou composição imu-
nogênica até 7 dias após a administração de reforço induz dor de ca- beça em menos de 12%, ou em menos de 10% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a fla- vivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
49. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 42 a 48, caracterizado pelo fato de que a administração da vaci- na ou composição imunogênica até 7 dias após a administração de dose única ou primária induz mal-estar em menos de 10% de uma po- pulação de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não ex- postos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus e/ou em que a administração da vacina ou composi- ção imunogênica até 7 dias após a administração de reforço induz mal-estar em menos de 13%, ou em menos de 10%, ou em menos 5%, ou 0% de uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a flavivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 42 a 49, caracterizado pelo fato de que a vacina ou composição imunogênica é administrada como doses múltiplas em uma primeira administração (primária) e uma segunda (reforço) e em que a adminis- tração da vacina ou composição imunogênica até 7 dias após a admi- nistração do impulso induz - —nenhum aumento na febre e/ou - —pelomenos 50% menos, ou pelo menos 45% menos, ou pelo menos 40% menos fadiga e/pu - —nenhum aumento na mialgia, ou pelo menos 20% me- nos, ou pelo menos 10% menos mialgia, e/ou - nenhum aumento no mal-estar, ou pelo menos 80% menos, ou pelo menos 60% menos, ou pelo menos 40% menos, ou pelo menos 20% menos, ou pelo menos 10% menos mal-estar compa- rado com 7 dias após a administração primária em uma população de seres humanos de pelo menos 20 seres humanos não expostos a fla- vivírus ou de pelo menos 20 seres humanos soronegativos para o Zika vírus.
51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 5 a 50, caracterizado pelo fato de que as células são células não humanas.
52. Método, de acordo com a reivindicação 51, caracteriza- do pelo fato de que as células são células Vero.
53. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 5 a 52, caracterizado pelo fato de que a preparação do Zika vírus é tratada com formaldeído a uma concentração de 0,005% (p/v) a 0,02% (p/v).
54. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 5 a 53, caracterizado pelo fato de que a preparação do Zika vírus é tratada por oito a doze dias.
55. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracteriza- do pelo fato de que a preparação do Zika vírus é tratada por dez dias.
56. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 5 a 55, caracterizado pelo fato de que a preparação do Zika vírus é tratada a uma temperatura de 15ºC a 30ºC.
57. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracteriza- do pelo fato de que a preparação do Zika vírus é tratada a uma tempe- ratura de 22ºC.
58. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 5 a 57, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmen- te uma etapa (c) de determinar a integridade da inativação.
59. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracteriza-
do pelo fato de que a etapa (c) compreende: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma prepa- ração de vírus Zika tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as cé- lulas de inseto por um primeiro período de tempo, produzindo assim um sobrenadante de célula de inseto; (ii) inocular células de mamífero com o sobrenadante de célula de inseto produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação do vírus contém um ví- rus residual de replicação que produz um efeito citopático nas células dos mamíferos.
60. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracteriza- do pelo fato de que as células de inseto são selecionadas a dentre cé- lulas CCL-125, células Aag-2, células RML-12, células C6/36, células C7-10, células AP-61, At. células GRIP-1, A-t. células GRIP-2, A-t. Cé- lulas GRIP-3, células UM-AVE1, células Mos.55, células Sua1B, célu- las 4a-3B, células Mos.42, células MSQ43, células LSB-AA695BB, cé- lulas NIID-CTR e células TRA-171, como as células C6/36.
61. Método, de acordo com a reivindicação 59 ou 60, carac- terizado pelo fato de que o primeiro período de tempo é de 3 a 7 dias.
62. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 59 a 61, caracterizado pelo fato de que as células de mamíferos são selecionadas a partir de células VERO, células LLC-MK2, células MDBK, células MDCK, células ATCC CCL34 MDCK (NBL2), MDCK 33016 (número de depósito DSM ACC 2219, como descrito em WOS97/37001), células BHK21-F, células HKCC e células de ovário de hamster chinês (células CHO), como células VERO.
63. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 59 a 62, caracterizado pelo fato de que o segundo período de tempo é de 3 a 14 dias.
64. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 5 a 63, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmen- te uma etapa (d) de neutralizar a preparação do Zika vírus tratado com formaldeído com metabissulfito de sódio.
65. Método, de acordo com a reivindicação 64, caracteriza- do pelo fato de que a preparação do Zika vírus tratado com formaldeí- do é neutralizada pelo menos cinco, pelo menos sete, pelo menos no- ve, pelo menos 11 ou pelo menos 14 dias após o tratamento com for- maldeído.
66. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 65, caracterizado pelo fato de que a vacina ou composição imunogênica tem um conteúdo residual de formaldeído inferior a 50 uo/ml.
67. Vacina ou composição imunogênica caracterizada pelo fato de que consiste no uso em um método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 66.
68. Uso da vacina ou composição imunogênica caracteriza- do pelo fato de que se dá na fabricação de um medicamento para o método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 67.
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