BR112020009960A2 - método para a inativação de vírus zika e métodos relacionados - Google Patents
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Abstract
A presente divulgação refere-se a métodos para inativar um vírus Zika que pode ser usado em vacinas e composições imunogênicas. A presente divulgação também se refere a um método para determinar a integridade da inativação de uma preparação de arbovírus e a um método para determinar o teor residual de formaldeído em uma composição farmacêutica compreendendo um vírus inativado.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTO- DO PARA A INATIVAÇÃO DE VÍRUS ZIKA E MÉTODOS RELACIO- NADOS". DECLARAÇÃO SOBRE PESQUISA PATROCINADA PELO GOVER-
[0001] Esta invenção foi feita com apoio do governo de acordo com o Contrato N.º HHSO100201600015C com o Departamento de Saúde e Serviços Humanos, Gabinete do Secretário Adjunto de Prepa- ração e Resposta, Biomedical Advanced Research e Development Au- thority. Esta invenção foi criada no desempenho de um Acordo Coope- rativo de Pesquisa e Desenvolvimento com os Centros de Controle e Prevenção de Doenças, uma agência do Departamento de Saúde e Serviços Humanos. O governo dos Estados Unidos tem certos direitos na invenção.
[0002] A presente divulgação refere-se a métodos para inativar um vírus Zika que pode ser usado em vacinas e composições imunogêni- cas. A presente divulgação também se refere a um método para de- terminar a integridade da inativação de uma preparação de arbovírus e a um método para determinar o teor residual de formaldeído em uma composição farmacêutica compreendendo um vírus inativado.
[0003] O vírus Zika, um flavivírus classificado com outros vírus transmitidos por mosquitos (por exemplo, vírus da febre amarela, den- gue, Nilo Ocidental e encefalite japonesa) dentro da família Flaviviridae se espalhou rapidamente em uma epidemia no hemisfério desde que o vírus foi introduzido no Brasil em 2013. O vírus chegou às Américas Central e do Norte, incluindo territórios dos Estados Unidos, conse- quentemente agora ameaçando os EUA continentais. Na verdade, a cepa do vírus zika PRVABCS59 foi isolada do soro de uma pessoa que viajou para Porto Rico em 2015. O genoma dessa cepa foi sequenciado pelo menos três vezes (Ver Lanciotti et al. Emerg. Infect. Dis. 2016 May; 22(5):933-5 and GenBank Accession Number KU501215.1; GenBank Accession Number KX087101.3; and Yun et al. Genome Announc. 2016 Aug 18;4(4) and GenBank Accession Number ANK57897.1).
[0004] Inicialmente isolado em 1947 em Uganda, o vírus foi primei- ro associado a doenças humanas em 1952 e foi reconhecido espora- dicamente como causa de doença febril leve e autolimitada na África e no Sudeste Asiático (Weaver et al. (2016) Antiviral Res. 130:69-80; Faria et al. (2016) Science. 352(6283):345-349). No entanto, em 2007, um surto apareceu na ilha de Yap, no Pacífico Norte, e depois se dis- seminou de ilha em ilha pelo Pacífico, levando a um surto extenso em 2013-2014 na Polinésia Francesa, que se espalhou para a Nova Cale- dônia, Ilhas Cook, e, finalmente, para a Ilha de Páscoa. Um vírus da linhagem asiática foi posteriormente transferido para o Hemisfério Oci- dental por rotas que permanecem indeterminadas (Faria et al. (2016) Science. 352(6283):345-349). O vírus pode ser transmitido zoonotica- mente por Aedes aegypti, A. albopictus, e possivelmente por A. hensilli e A. polynieseinsis (Weaver et al. (2016) Antiviral Res. 130:69-80). Além disso, pensa-se que outros vetores de transmissão do vírus po- dem existir, e que o vírus pode ser transmitido por transfusão de san- gue, via transplacentária, e/ou através da transmissão sexual.
[0005] No final de 2015, um aumento significativo de anomalias fetais (por exemplo, microcefalia) e a síndrome de Guillain-Barre (GBS) em áreas de infecção generalizada pelo vírus Zika, alertaram que o vírus pode ser muito mais virulento do que se pensava, levando a Organização Mundial da Saúde (OMS) a declarar uma Emergência de Saúde Pública de Interesse Internacional (PHEIC) (Heymann et al. (2016) Lancet 387(10020): 719-21). Embora o vírus Zika represente uma ameaça substancial à saúde pública, atualmente não existe vaci-
na ou tratamento aprovado pela FDA, e as únicas medidas preventivas para controlar o vírus zika envolvem o gerenciamento de populações de mosquitos.
[0006] Em esforços recentes para caracterizar um vírus Zika re- combinante para o desenvolvimento de uma potencial vacina, foi iden- tificado um vírus Zika adaptado a células não humanas que abriga uma mutação na proteína Envelope viral na posição 330 (Weger- Lucarelli et al. 2017. Journal of Virology). Os autores deste estudo descobriram que os clones de cDNA infecciosos de comprimento total da cepa do vírus Zika PRVABC59 eram geneticamente instáveis quando amplificados durante a clonagem e optaram por dividir o ge- noma viral para resolver a instabilidade observada, desenvolvendo e aplicando um sistema de dois plasmídeos. No entanto, um sistema de dois plasmídeos para o desenvolvimento de uma vacina contra o Zika é menos desejável.
[0007] Assim, é necessário desenvolver vacinas e composições imunogênicas para tratar e/ou prevenir a infecção pelo vírus Zika que utiliza um vírus Zika geneticamente estável. Uma opção para o desen- volvimento de uma vacina é inativar um vírus inteiro e usar esse vírus inteiro inativado para a vacinação de sujeitos. No entanto, durante o desenvolvimento de uma vacina viral inativada, uma garantia de segu- rança essencial é garantir que nenhum vírus infeccioso permaneça no produto de fármaco ou na substância de fármaco. Desenvolver um processo de inativação eficaz e análises sensíveis para medir e de- terminar se os virions infecciosos permanecem é um aspecto essencial de segurança para o desenvolvimento de um vírus inativado purificado derivado de qualquer vírus do tipo selvagem, mas certamente com um vírus patogênico/encefalítico que pode causar anormalidades fetais. Além disso, o formaldeído que pode ser usado para inativar um vírus é conhecido por ser genotóxico e carcinogênico, de modo que é impor- tante monitorar os níveis residuais de formaldeído em substâncias de fármaco e produtos de fármaco e autoridades reguladoras e as autori- dades reguladoras exigem que os fabricantes que utilizem formaldeído como agente inativador, determinem o teor de formaldeído residual no produto de fármaco. Portanto, existe a necessidade de um método sensível para detectar formaldeído residual em um produto de fármaco ou composição farmacêutica contendo um vírus inativado, como um vírus Zika inativado.
[0008] A presente divulgação é baseada, pelo menos em parte, na surpreendente descoberta de que o vírus Zika pode ser inativado efici- entemente com uma baixa concentração de formaldeído que é aplica- da ao vírus por um tempo relativamente curto à temperatura ambiente. Além disso, foi desenvolvido um ensaio que permite determinar com alta sensibilidade se ainda estão presentes virions infecciosos após a inativação. Finalmente, foi desenvolvido um método que permite a de- tecção de níveis baixos de formaldeído residual no produto de fármaco ou composição farmacêutica final.
[0009] Por conseguinte, certos aspectos da presente divulgação referem-se a um método para inativar uma preparação de vírus Zika compreendendo: (a) isolar a preparação de vírus Zika a partir de uma ou mais células cultivadas in vitro, em que as células são utilizadas para produzir a preparação de vírus Zika, em que o isolamento da preparação de vírus Zika compreende uma ou mais etapas selecionadas de: (i) filtração em profundidade, (ii) troca de tampão e/ou diluição; (ili) cromatografia de troca iônica; e (b) tratar a preparação do vírus Zika com formaldeído, em que o resultado numérico da multiplicação da concentração de formal-
deído, medida em % (p/v), com o período de incubação com formalde- ído, medido em dias, é de 0,025 a 0,5.
[0010] Em algumas modalidades, as células são células não hu- manas ou células Vero.
[0011] Em algumas modalidades, a preparação do vírus Zika é ob- tida a partir de um inóculo contendo uma população heterogênea de vírus Zika.
[0012] Em algumas modalidades, a preparação do vírus Zika é ob- tida a partir de um isolado clínico.
[0013] Em algumas modalidades, a preparação do vírus Zika é ob- tida a partir de um isolado clonal do vírus Zika. O isolado clonal do ví- rus Zika pode ser obtido por purificação de placas. Antes da purifica- ção da placa, várias células podem ser inoculadas com um inóculo contendo uma população heterogênea de vírus Zika.
[0014] Alguns aspectos da presente divulgação referem-se a um método para inativar uma preparação de vírus Zika compreendendo: (a) obter uma preparação de vírus Zika a partir de um isola- do clínico; e (b) tratar a preparação do vírus Zika com formaldeído, em que o resultado numérico da multiplicação da concentração de formal- deído, medida em % (p/v), com o período de incubação com formalde- ído, medido em dias, é de 0,025 a 0,5.
[0015] Alguns aspectos da presente divulgação referem-se a um método para inativar uma preparação de vírus Zika compreendendo: (a) obter uma preparação do vírus Zika a partir de um inó- culo contendo uma população heterogênea de vírus Zika; e (b) tratar a preparação do vírus Zika com formaldeído, em que o resultado numérico da multiplicação da concentração de formal- deído, medida em % (p/v), com o período de incubação com formalde- ído, medido em dias, é de 0,025 a 0,5.
[0016] Em algumas modalidades, a preparação do vírus Zika é tra- tada com formaldeído a uma concentração de 0,005% (p/v) a 0,02% (pv).
[0017] Em algumas modalidades, a preparação do vírus Zika é tra- tada por oito a doze dias ou por dez dias.
[0018] Em algumas modalidades, a preparação do vírus Zika é tra- tada a uma temperatura de 15ºC a 30ºC ou de 22ºC.
[0019] O método pode ainda compreender uma etapa (c) para de- terminar a integridade da inativação.
[0020] Em algumas modalidades, a etapa (c) compreende: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma prepa- ração de vírus Zika tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as cé- lulas de inseto por um primeiro período de tempo, produzindo assim um sobrenadante de célula de inseto; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o so- brenadante de célula de inseto produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação do vírus Zika contém um vírus residual de replicação que produz um efeito citopático nas células dos mamíferos.
[0021] Em algumas modalidades, as células de inseto são selecio- nadas de células CCL-125, células Aag-2, células RML-12, células C6/36, células C7-10, células AP-61, células A.t. GRIP-1, células A-t. GRIP-2, células A.t. GRIP-3, células UM-AVE1, células Mos. 55, célu- las Sua1B, células 4a-3B, células Mos. 42, células MSQ43, células LSB-AAG95BB, células NIID-CTR e células TRA-171, como células C6/36.
[0022] Em algumas modalidades, o primeiro período de tempo é de 3 a 7 dias.
[0023] Em algumas modalidades, as células de mamífero são se-
lecionadas de células VERO, células LLC-MK2, células MDBK, células MDCK, células ATCC CCL34 MDCK (NBL2), células MDCK 33016 (número de depósito DSM ACC 2219, conforme descrito em WOS97/37001), células BHK21-F, células HKCC e células de ovário de hamster chinês (células CHO), como células VERO.
[0024] Em algumas modalidades, o segundo período de tempo é de 3 a 14 dias.
[0025] O método pode ainda compreender uma etapa (d) de neu- tralizar a preparação do vírus Zika tratado com formaldeído com meta- bissulfito de sódio, como neutralizar a preparação do vírus Zika tratado com formaldeído pelo menos cinco, pelo menos sete, pelo menos no- ve, pelo menos 11, ou pelo menos 14 dias após o tratamento com for- maldeído.
[0026] O método pode compreender ainda uma etapa (e) da pre- paração de uma composição farmacêutica compreendendo a prepara- ção do vírus Zika inativado.
[0027] Em algumas modalidades, a preparação de vírus Zika é misturada com um adjuvante. O adjuvante pode ser selecionado do grupo que consiste em sais de alumínio, agonistas de receptores se- melhantes a toll (TLR), lipídeos monofosforil A (MLA), lipídeos sintéti- cos A, miméticos ou análogos de lipídeo A, derivados de MLA, citoci- nas, saponinas, derivado de dipeptídeo muramil (MDP), oligos CpG, lipopolissacarídeo (LPS) de bactérias gram-negativas, polifosfazenos, emulsões, virossomas, cocleatos, micropartículas de poli(lactídeo-co- glicolídeos) (PLG), partículas de poloxâmero, micropartículas, lipos- somas, Adjuvante completo de Freund (CFA) e Adjuvante incompleto de Freund (IFA).
[0028] Em algumas modalidades, o adjuvante é um sal de alumí- nio, como fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio, sulfato de alumí- nio e potássio ou Alhydrogel 85.
[0029] Em algumas modalidades, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo me- nos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de um ou mais antígenos na preparação do vírus Zika são adsorvidos no adjuvante.
[0030] Em algumas modalidades, o vírus Zika compreende uma mutação na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição corres- pondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, como uma mutação Trp98GIly na SEQ ID NO: 1.
[0031] Em algumas modalidades, o vírus Zika não compreende uma mutação na proteína de envelope (E). Em algumas modalidades, a sequência que codifica a proteína de envelope é a mesma que a se- quência correspondente na SEQ ID NO: 2.
[0032] Alguns aspectos da presente divulgação também se refe- rem a uma composição farmacêutica compreendendo um vírus Zika inativado que pode ser obtido por qualquer um dos métodos aqui des- critos.
[0033] Alguns aspectos da presente divulgação também se refe- rem a uma composição farmacêutica compreendendo um vírus Zika inativado e com um teor residual de formaldeído inferior a 50 ug/ml. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é obtida pelo método de qualquer uma das reivindicações 1 a 28.
[0034] Alguns aspectos da presente divulgação também se relaci- onam com um método para determinar a integridade da inativação de uma preparação de arbovírus, compreendendo as etapas de: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma prepa- ração de arbovírus que foi submetida a uma etapa de inativação e in- cubar as células de inseto por um primeiro período de tempo, produ- zindo assim um sobrenadante de célula de inseto; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o so- brenadante de célula de inseto produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação do arbovírus contém um vírus residual de replicação que produz um efeito citopático nas célu- las dos mamíferos.
[0035] Em algumas modalidades, o arbovírus é um flavivírus ou um alfavírus. Em algumas modalidades, o arbovírus é um vírus Zika, um vírus do Nilo Ocidental, um vírus da Febre Amarela, um vírus da Encefalite japonesa, um vírus de encefalite transmitida por carrapato, um vírus da dengue, vírus da encefalite de St. Louis, vírus da Chikun- gunya, vírus da O'nyong'nyong ou vírus da Mayaro.
[0036] Em algumas modalidades, a preparação do arbovírus foi submetida a um tratamento com detergente, formalina, peróxido de hidrogênio, beta-propiolactona (BPL), etilamina binária (BEI), acetil eti- lenoimina, azul de metileno ou psoraleno.
[0037] Em algumas modalidades, as células de inseto são selecio- nadas de células CCL-125, células Aag-2, células RML-12, células C6/36, células C7-10, células AP-61, células A.t. GRIP-1, células A-t. GRIP-2, células A.t. GRIP-3, células UM-AVE1, células Mos. 55, célu- las Sua1B, células 4a-3B, células Mos. 42, células MSQ43, células LSB-AAG95BB, células NIID-CTR e células TRA-171, como células C6/36.
[0038] Em algumas modalidades, o primeiro período de tempo é de 3 a 7 dias.
[0039] Em algumas modalidades, as células de mamífero são se- lecionadas de células VERO, células LLC-MK2, células MDBK, células MDCK, células ATCC CCL34 MDCK (NBL2), células MDCK 33016 (número de depósito DSM ACC 2219, conforme descrito em WOS97/37001), células BHK21-F, células HKCC e células de ovário de hamster chinês (células CHO), como células VERO.
[0040] Em algumas modalidades, o segundo período de tempo é de 3 a 14 dias.
[0041] Em algumas modalidades, o método é capaz de detectar menos que 1,0 TCID5o do arbovírus.
[0042] Alguns aspectos da presente divulgação também se relaci- onam com um método para determinar o teor residual de formaldeído em uma composição farmacêutica compreendendo um vírus inativado, compreendendo as etapas de: (a) proporcionar uma composição compreendendo um vírus que foi tratado com formaldeído; (b) misturar a composição de (a) com ácido fosfórico e 2,4- dinitrofenil-hidrazina (DNPH), proporcionando assim uma mistura; (c) incubar a mistura de (b) sob condições adequadas; e (d) analisar a mistura para a presença de formaldeído resi- dual.
[0043] Em algumas modalidades, a composição de (a) contém um adjuvante que pode ser hidróxido de alumínio. Em algumas modalida- des, a composição de (a) contém 0,1 mg/ml a 1,0 mg/ml de hidróxido de alumínio como adjuvante.
[0044] Em algumas modalidades, a etapa (b) compreende misturar 50 partes da composição de (a) com 1 parte de 15 a 25% (v/v) de áci- do fosfórico e 2,5 partes de 0,9 a 1,1 mg/ml de DNPH.
[0045] Em algumas modalidades, a mistura da composição de (a) com ácido fosfórico e 2,4-dinitrofenil-hidrazina (DNPH) é incubada à temperatura ambiente. Em algumas modalidades, a mistura da com- posição de (a) com ácido fosfórico e 2,4-dinitrofenil-hidrazina (DNPH) é incubada por 10 a 30 minutos.
[0046] Em algumas modalidades, a mistura da composição de (a) com ácido fosfórico e 2,4-dinitrofenil-hidrazina (DNPH) é analisada por HPLC que pode ser HPLC de fase reversa. Em algumas modalidades, uma mistura de água e acetonitrila (1:1, v/v) é usada como uma fase móvel em HPLC.
[0047] Em algumas modalidades, o vírus é um vírus Zika inativa- do. Em algumas modalidades, o vírus Zika inativado foi tratado com formaldeído a 0,01% (p/v) por 10 dias a 22ºC. Em algumas modalida- des, o vírus Zika compreende uma mutação na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, como uma mutação Trp98GlIy na SEQ ID NO: 1.
[0048] FIG. 1 mostra imagens de microscopia de campo claro de monocamadas de células Vero simuladas infectadas (superior) ou in- fectadas com a cepa ZIKAV PRVABCSB59 (inferior).
[0049] FIG. 2 mostra a cinética de crescimento de ZIKAV PRVABC59 P1 em monocamadas de células Vero, conforme determi- nado por TCIDso.
[0050] FIG. 3 mostra teste de ensaio de potência (TCIDso) dos clo- nes de vírus Zika PRVABC59 P5 a-f.
[0051] FIG. 4 mostra imagens de microscopia de campo claro que descrevem o efeito citopático (CPE) do crescimento dos clones PRVABCS59 P6 do vírus zika a-f em monocamadas de células Vero.
[0052] FIG. 5 mostra o teste de ensaio de potência (TCIDs5so) dos clones do vírus Zika PRVABCS59 P6 a-f
[0053] FIG. 6 mostra um alinhamento da sequência de aminoáci- dos comparando a sequência da glicoproteína do envelope do vírus Zika próximo ao resíduo 330 das cepas do vírus Zika PRVABC59 P6e (SEQ ID NO: 8) e PRVABC59 (SEQ ID NO: 9) com vários outros flavi- vírus (WNV (SEQ ID NO: 10); JEV (SEQ ID NO: 11); SLEV (SEQ ID NO: 12); YFV (SEQ ID NO: 13); DENV 1 16007 (SEQ ID NO: 14); DENV 2 16681 (SEQ ID NO: 15); DENV 3 16562 (SEQ IDNO: 16); e DENV 4 1036 (SEQ ID NO: 17)).
[0054] FIG. 7 mostra um alinhamento da sequência de aminoáci-
dos comparando a sequência da proteína NS1 do vírus Zika próximo ao resíduo 98 das cepas do vírus Zika PRVABC59 P6e (SEQ ID NO: 18) e PRVABC59 (SEQ ID NO: 19) com vários outros flavivírus (WNV (SEQ ID NO: 20); JEV (SEQ ID NO: 21); SLEV (SEQ ID NO: 22); YFV (SEQ ID NO: 23); DENV 1 16007 (SEQ ID NO: 24); DENV 2 16681 (SEQ ID NO: 25); DENV 3 16562 (SEQ IDNO: 26); e DENV 4 1036 (SEQ ID NO: 27)).
[0055] FIG. 8 mostra o fenótipo de placa dos clones do vírus ZIKAV PRVABC59 P6 a-f em comparação com o vírus ZIKAV PRVABCS59 P1.
[0056] FIG. 9 mostra o tamanho médio da placa dos clones do ví- rus ZIKAV PRVABC59 P6 em comparação com o vírus ZIKAV PRVABCS59 P1.
[0057] FIG. 10 mostra a cinética de crescimento dos clones ZIKAV PRVABCS59 P6 a-f em células Vero em condições de crescimento sem soro.
[0058] FIG. 11 mostra um esquema das etapas adotadas para preparar o produto de fármaco formulado com PRVABC59 P6b e P6e para as experiências de imunização.
[0059] FIG. 12A mostra a programação da dosagem de camun- dongos CD-1 com formulações de vacina derivadas dos clones ZIKAV PRVABCS59 P6b e P6e. PBS foi usado como placebo.
[0060] FIG. 12B mostra os títulos séricos de anticorpos neutrali- zantes de ZIKAV de camundongos CD-1 imunizados como descrito na FIG. 12A usando formulações de vacina derivadas dos clones ZIKAV PRVABC59 P6b e P6e. Os títulos de anticorpos neutralizantes de ZIKAV foram determinados pelo ensaio de neutralização de Partícula de Vírus Repórter (RVP). As linhas sólidas representam a média geo- métrica de um grupo. O limite de detecção (1,93 log1o) é representado por uma linha tracejada.
[0061] FIG. 13A mostra a programação da dosagem de camun- dongos AG129 com formulações de vacina derivadas dos clones ZIKAV PRVABC59 P6b e P6e. PBS foi usado como um placebo.
[0062] FIG. 13B mostra os títulos séricos de anticorpos neutrali- zantes de ZIKAV de camundongos AG129 imunizados como descrito na FIG. 13A usando formulações de vacina derivadas dos clones ZIKAV PRVABC59 P6b e P6e. As linhas sólidas representam a média geométrica de um grupo. O limite de detecção (1,30 log1o) é represen- tado por uma linha tracejada. Aos animais sem título detectável (<1,30) foi atribuído um título de 0,5.
[0063] FIG. 14 mostra o peso médio dos grupos de teste AG129 pós-desafio, representado como uma porcentagem do peso inicial. As barras de erro representam desvio padrão.
[0064] FIG. 15 mostra a viremia soro de camundongos AG129 in- dividuais dois dias pós-desafio, relatado como PFU/mL. As linhas sóli- das representam a média de um grupo. O limite de detecção (2,0 log1o) é representado por uma linha tracejada.
[0065] FIG. 16 mostra a análise de sobrevida dos grupos de teste AG129 pós-desafio.
[0066] FIG. 17 mostra os títulos de anticorpos neutralizantes do ZIKAV em circulação no soro antes do desafio (Nab) após a transfe- rência passiva de soros combinados de camundongos AG129 vacina- dos e desafiados.
[0067] FIG. 18 mostra o peso corporal médio dos camundongos de transferência passiva e de controle desafiados com vírus Zika.
[0068] FIG. 19 mostra a viremia soro de camundongos AG129 in- dividuais três dias pós-desafio, relatado como PFU/mL.
[0069] FIG. 20 mostra a análise de sobrevida dos camundongos de transferência passiva e de controle desafiados com vírus Zika.
[0070] FIG. 21 mostra a correlação entre os títulos de anticorpos neutralizantes do ZIKAV e a viremia observada em camundongos com transferência passiva.
[0071] FIG. 22 mostra a análise de sobrevida de camundongos AG129 após infecção por estoques de P6a e P6e de vírus Zika preMVS usando uma curva de sobrevida de Kaplan Meier.
[0072] FIG. 23 mostra o peso corporal médio, expresso em por- centagem do peso inicial no momento da invenção após a infecção com os estoques preMVS do vírus Zika de P6a e P6e. A linha traceja- da representa 100% de peso de partida para referência.
[0073] FIG. 24 mostra a viremia sérica de camundongos AG129 individuais três dias após a infecção com estoques de P6a e P6e preMVS do vírus Zika, relatados como PFU/mL. A linha tracejada re- presenta o limite de detecção do ensaio.
[0074] FIG. 25 mostra cinética compilada de dados de inativação. Os dados comparam a potência infecciosa (TCID50) à cópia do RNA e a integridade da inativação (COI) para amostras dos quatro lotes de toxicologia. Estes dados indicam que a sensibilidade do ensaio COI é maior que TCID50.
[0075] FIG. 26 mostra uma comparação da sensibilidade C6/36 e Vero no ensaio, como demonstrado com um título de entrada de vírus de 0,31 TCID50.
[0076] FIG. 27 mostra uma análise de regressão logística de CPE vs. TCID50 log usando sítio de células C6/36 que inclui intervalos de confiança de 99% em torno de um valor alvo de 0,01 TCID50/poço (-2 log TCID50/poço); o modelo prevê que 0,85% dos poços serão positi- vos.
[0077] FIG. 28 mostra cromatogramas de soluções de PBS (a) e PBS contendo 0,049 ug/mL (b), 0,098 ug/mL (c), 0,196 pg/mL (d), 0,491 pug/mL (e), 0,982 ug/mL (f) e 1,964 puo/mL (g) de formaldeído.
Técnicas Gerais
[0078] As técnicas e procedimentos descritos ou referenciados aqui são geralmente bem entendidos e comumente empregados usando a metodologia convencional por aqueles versados na técnica, como, por exemplo, as metodologias amplamente utilizadas descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edi- tion (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Labo- ratory Manual, and Animal Cell Culture (R.|l. Freshney, ed. (1987)); Oli- gonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cel- lis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.l. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Tra- vers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Ap- proach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford Univer- sity Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); and The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Pub-
lishers, 1995). Vírus Zika
[0079] Certos aspectos da presente divulgação referem-se a um vírus Zika inteiro inativado purificado que pode ser útil em vacinas e/ou composições imunogênicas.
[0080] O vírus Zika (ZIKV) é um flavivírus transmitido por mosquito isolado pela primeira vez a partir de um macaco rhesus sentinela na floresta do Zika em Uganda em 1947. Desde aquela época, foram fei- tos isolamentos de seres humanos na África e na Ásia e, mais recen- temente, nas Américas. ZIKV é encontrado em duas (possivelmente três) linhagens: uma linhagem africana (possivelmente linhagens da África Oriental e Ocidental) e uma linhagem asiática. Por conseguinte, exemplos de vírus Zika adequados da presente invenção incluem, sem limitação, vírus das linhagens Africanas e/ou Asiáticas. Em algumas modalidades, o vírus Zika é um vírus da linhagem Africana. Em algu- mas modalidades, o vírus Zika é um vírus de linhagem Asiática. Além disso, várias cepas das linhagens Africanas e Asiáticas de vírus Zika foram previamente identificadas. Qualquer uma ou mais cepas ade- quadas do vírus Zika conhecidas na técnica podem ser utilizadas na presente divulgação, incluindo, por exemplo, cepas Mr 766, ArD 41519, IbH 30656, P6-740, EC Yap, FSS13025, ArD 7117, ArD 9957, ArD 30101, ArD 30156, ArD 30332, HD 78788, ArD 127707, ArD 127710, ArD 127984, ArD 127988, ArD 127994, ArD 128000, ArD 132912, 132915, ArD 141170, ArD 142623, ArD 149917, ArD 149810, ArD 149938, ArD 157995, ArD 158084, ArD 165522, ArD 165531, ArA 1465, ArA 27101, ArA 27290, ArA 27106, ArA 27096, ArA 27407, ArA 27433, ArA 506/96, ArA 975-99, Ara 982-99, ArA 986-99, ArA 2718, ArB 1362, Nigeria68, Malaysia66, Kedougou84, Suriname, MR1429, PRVABC59, ECMN2007, DakAr41524, H/PF/2013, R103451, 103344, 8375, JMB-185, ZIKV/H, sapiens/Brazil/Natal/2015, SPH2015, ZIKV/
Hu/Chiba/S36/2016, e/ou Cuba2017. Em algumas modalidades, a ce- pa PRVABCS59 é usada na presente divulgação.
[0081] Em algumas modalidades, um exemplo de uma sequência do genoma do vírus Zika é apresentado abaixo como SEQ ID NO: 2: 1 gttgttgatc tgtgtgaate agactgegac agttegagtt tgaagcgaaa gctagcaaca 61 gtatcaacag gttttatttt ggatttggaa acgagagttt ctggtcatga aaaacccaaa 121 aaagaaatcc ggaggattce ggattgtcaa tatgctaaaa cgcggagtag ccegtgtgag 181 ccecetttggg ggcttgaaga ggctgccage cggactteta ctgggteatg ggcecatcag 241 gatggtcttg gegattetag cctttttgag attcacggca atcaagccat cactgggtct 301 catcaataga tggggttcag tggggaaaaa agaggctatg gaaacaataa agaagttcaa 361 gaaagatctg gctgccatgc tgagaataat caatgctagg aaggagaaga agagacgagg 421 cgcagatact agtgtcggaa ttgttggcct cetgetgace acagectatgg cageggaggt 481 cactagacgt gggagtgcat actatatgta cttggacaga aacgatgctg gggaggccat 541 atcttttcca accacattgg ggatgaataa gtgttatata cagatcatgg atcttggaca 601 catgtgtgat gccaccatga gctatgaatg ccetatgctg gatgaggggg tggaaccaga 661 tgacgtegat tgttggtgca acacgacgtc aacttgggtt gtgtacggaa cctgccatca 721 caaaaaaggt gaagcacgga gatctagaag agctgtgacg ctecectece attecaceag 781 gaagctgcaa acgcggtegec aaacctggtt ggaatcaaga gaatacacaa agcacttgat 841 tagagtcgaa aattggatat tcaggaaccec tggcttegeg ttagcageag ctgecatege 901 ttggcttttg ggaagctcaa cgagccaaaa agtcatatac ttggtcatga tactgctgat 961 tgccceggca tacagcatca ggtgcatagg agtcagcaat agggactttg tggaaggtat 1021 gtcaggtggg acttgggttg atgttgtctt ggaacatgga ggttgtatca cegtaatage 1081 acaggacaaa ccgactgtcg acatagagct ggttacaaca acagtcagca acatggcgga 1141 ggtaagatcc tactgctatg aggcatcaat atcagacatg gcttctgaca gcegetgece 1201 aacacaaggt gaagcctacc ttgacaagca atcagacact caatatgtct gcaaaagaac 1261 gttagtggac agaggctggg gaaatggatg tggacttttt ggcaaaggga gcctggtgac 1321 atgcgctaag tttgcatgct ccaagaaaat gaccgggaag agcatccage cagagaatet 1381 ggagtaccgg ataatgctgt cagttcatgg ctcccageac agtgggatga tegttaatga 1441 cacaggacat gaaactgatg agaatagagc gaaagttgag ataacgccca attcaccgag 1501 agcegaagec accetggggg gttttggaag cctaggactt gattgtgaac cgaggacagg 1561 ccttgacttt tcagatttgt attacttgac tatgaataac aagcactggt tggttcacaa 1621 ggagtggttc cacgacatte cattaccttg gcacgctggg gcagacaceg gaactecaca 1681 ctggaacaac aaagaagcac tggtagagtt caaggacgca catgccaaaa ggcaaactot 1741 cgtggttcta gggagtcaag aaggagcagt tcacacggce cttgctagag ctetggagge 1801 tgagatggat ggtgcaaagg gaaggctgte ctetggecac ttgaaatgte gectgaaaat 1861 ggataaactt agattgaagg gcgtgtceata ctecttgtgt actgcagegt tcacattcac 1921 caagatcceg gctgaaacac tgcacgggac agtcacagtg gaggtacagt acgcagggac 1981 agatggacct tgcaaggttc cagctcagat ggcggtggac atgcaaacte tgaccccagt 2041 tgggaggttg ataaccgcta acccegtaat cactgaaagc actgagaact ctaagatgat 2101 gctggaactt gatccaccat ttggggacte ttacattgtc ataggagteg gggagaagaa 2161 gatcacccac cactggcaca ggagtggcag caccattgga aaagcatttg aagccactgt 2221 gagaggtgcc aagagaatagg cagtcttggg agacacagece tgggactttg gatcagttgg 2281 aggcgctete aactceattgg gcaagggcat ccatcaaatt tttggagcag ctttcaaate
2341 attgtttgga ggaatgtcct ggttctcaca aattetcatt ggaacgttgc tgatgtggtt 2401 gggtctgaac acaaagaatg gatctatttc ccttatgtgc ttagccttag ggggagtatt 2461 gatcttctta tccacageeg tetetgctga tatggggtgc teggtggact tctcaaagaa 2521 ggagacgaga tgcggtacag gggtgttcgt ctataacgac gttgaagcct ggagggacag 2581 gtacaagtac catcctgact cccccegtag attggcagca gcagtcaage aagectggga 2641 agatggtatc tgcgggatct cctetgttte aagaatggaa aacatcatgt ggagatcagt 2701 agaaggggag ctcaacgcaa tcctggaaga gaatggagtt caactgacgg tegttgtagg 2761 atctgtaaaa aaccccatgt ggagaggtcc acagagattg ccegtgcctg tgaacgaget 2821 gccccacgge tggaaggctt gggggaaate gtatttoegte agagcagcaa agacaaataa 2881 cagctttgtc gtggatggtg acacactgaa ggaatgccca ctcaaacata gagcatggaa 2941 cagctttctt gtggaggate atgggttcgg ggtatttcac actagtgtct ggctcaaggt 3001 tagagaagat tattcattag agtgtgatcc agcegttatt ggaacagctg ttaagggaaa 3061 ggaggctgta cacagtgatc taggctactg gattgagagt gagaagaatg acacatggag 3121 gctgaagagg gcccatctga tegagatgaa aacatgtgaa tggccaaagt cccacacatt 3181 gtggacagat ggaatagaag agagtgatct gatcataccc aagtctttag ctgggccact 3241 cagccatcac aataccagag agggctacag gacccaaatg aaagggccat ggcacagtga 3301 agagcttgaa attcggtttg aggaatgccc aggcactaag gtccacgtgg aggaaacato 3361 tggaacaaga ggaccatctc tgagatcaac cactgcaagc ggaagggtga tcgaggaatga 3421 gtgctgcagg gagtgcacaa tgcccccact gtegttecgg gctaaagatg gctattggta 3481 tggaatggag ataaggccca ggaaagaacc agaaagcaac ttagtaaggt caatggtgac 3541 tgcaggatca actgatcaca tggaccactt ctcccttgga gtgcttgtga tcctgctcat 3601 ggtgcaggaa gggctgaaga agagaatgac cacaaagatc atcataagca catcaatggc 3661 agtgctggta gctatgatcc tgggaggatt ttcaatgagt gacctggcta agcttgcaat 3721 tttgatgggt gccacctteg cggaaatgaa cactggagga gatgtagcte atctggeget 3781 gatagcggca ttcaaagtca gaccagegtt getggtatct ttcatettca gagctaatto 3841 gacacccegt gaaagcatgc tgctggectt ggcctegtgt cttttgcaaa ctgegatete 3901 cgccttggaa ggegacctga tggttctcat caatggtttt gctttggcct ggttggcaat 3961 acgagcgatg gttgttccac gcactgataa catcaccttg gcaatectgg ctgctetgac 4021 accactggcc cggggcacac tgcttgtgge gtggagagea ggccttgcta cttgcggggg 4081 gtttatgctc ctetetetga agggaaaagg cagtgtgaag aagaacttac catttgtcat 4141 ggccctggga ctaaccgetg tgaggctggt cgaccecate aacgtagtag gactgctatt 4201 gctcacaagg agtgggaage ggagctggce ccctagegaa gtacteacag ctgttggcct 4261 gatatgcgca ttggctggag ggttcgccaa ggcagatata gagatggctg ggcccatgge 4321 cgcggteggt ctgctaattg tcagttacgt ggtctcagga aagagtgtgg acatgtacat 4381 tgaaagagca ggtgacatca catgggaaaa agatgcggaa gtcactggaa acagtccceg 4441 gctegatgtg gegetagatg agagtagtga tttctecctg gtagaggatg acggtecece 4501 catgagagag atcatactca aggtggtcct gatgaccatc tgtggcatga acccaatage 4561 catacccttt gcagctggag cgtggtacgt atacgtgaag actggaaaaa ggagtggtgc 4621 tctatgggat gtgcctgcte ccaaggaagt aaaaaagggg gagaccacag atggagtgta 4681 cagagtaatg actcgtagac tgctaggttc aacacaagtt ggagtgggag ttatgcaaga 4741 gggggtcttt cacactatgt ggcacgtcac aaaaggatcc gegetgagaa gceggtgaaga 4801 gagacttgat ccatactggg gagatgtcaa gcaggatctg gtgtcatact gtggtccatg 4861 gaagctagat gcegectagg atgggcacag cgaggtgcag ctettggcog tgcceceegg 4921 agagagagecg aggaacatcc agactctgcc cggaatattt aagacaaagg atggggacat 4981 tggagcggtt gegetggatt acccagcagg aacttcagga tetecaatec tagacaagto
5041 tgggagagtg ataggacttt atggcaatgg ggtcgtgatc aaaaacggga gttatgttag 5101 tgccatcacc caagggagga gggaggaaga gactectgtt gagtgcttog agccetegat 5161 gctgaagaag aagcagctaa ctgtcttaga cttgcatcct ggagctggga aaaccaggag 5221 agttcttcct gaaatagtcc gtgaagccat aaaaacaaga ctcegtactg tgatcttage 5281 tccaaccagg gttgtegetg ctgaaatgga ggaggccctt agagggctte cagtgegtta 5341 tatgacaaca gcagtcaatg tcacccactec tggaacagaa atcgtegact taatgtgcca 5401 tgccacctte acttcacgte tactacagcc aatcagagtec cccaactata atctgtatat 5461 tatggatgag gcccacttca cagatecete aagtatagca gcaagaggat acatttcaac 5521 aagggttgag atgggcgagg cggctgccat cttcatgacc gccacgecac caggaaceeg 5581 tgacgcattt ccggactecca actcaccaat tatggacacc gaagtggaag tcccagagag 5641 agccetggage tcaggctttg attgggtgac ggatcattct ggaaaaacag tttagtttgt 5701 tccaagegtg aggaacggca atgagategc agcttgtctg acaaaggctg gaaaacgggt 5761 catacagctc agcagaaaga cttttgagac agagttccag aaaacaaaac atcaagagtg 5821 ggactttgtc gtgacaactg acatttcaga gatgggegcc aactttaaag ctgaccgtgt 5881 catagattcc aggagatgcc taaagceggt catacttgat ggcgagagag tcattctgge 5941 tggacccatg cctgtcacac atgccagege tgcccagagg agggggegca taggcaggaa 6001 tcccaacaaa cctggagatg agtatctgta tggaggtggg tgcgcagaga ctgacgaaga 6061 ccatgcacac tggcttgaag caagaatgct ccttgacaat atttacctcc aagatggcct 6121 catagccteg ctetategac ctgaggcega caaagtagca gccattgagg gagagttcaa 6181 gcttaggacg gagcaaagga agacctttgt ggaactcatg aaaagaggag atcttcctgt 6241 ttggctagce tatcaggttg catctgcegg aataacctac acagatagaa gatagtgctt 6301 tgatggcacg accaacaaca ccataatgga agacagtgtg ccggcagagg tgtggaccag 6361 acacggagag aaaagagtgc tcaaaccgag gtggatggac gccagagttt gttcagatca 6421 tgcggccctg aagtcattca aggagtttgc cgctgggaaa agaggagegg cttttggagt 6481 gatggaagcc ctgggaacac tgccaggaca catgacagag agattccagg aagccattga 6541 caaccteget gtgctcatgc gggcagagac tggaagcagg ccttacaaag cegeggegge 6601 ccaattgceg gagaccctag agaccataat gcttttgggg ttgctgggaa cagteteget 6661 gggaatcttec ttegtettga tgaggaacaa gggcataggg aagatgggct ttggaatggt 6721 gactcttggg gccagegeat ggctcatgtg gcteteggaa attgagccag ccagaattge 6781 atgtgtccte attgttgtgt tcctattgct ggtggtgcte atacctgagc cagaaaagea 6841 aagatctccc caggacaacc aaatggcaat catcatcatg gtagcagtag gtcttctggg 6901 cttgattacc gccaatgaac teggatggtt ggagagaaca aagagtgacc taagccatct 6961 aatgggaagg agagaggagg gggcaaccat aggattctca atggacattg acctgeggce 7021 agccteaget tgggccatet atgctgcctt gacaacttte attaccccag cegtecaaca 7081 tgcagtgacc acctcataca acaactactc cttaatggcg atggccacgc aagetggagt 7141 gttgtttggc atgggcaaag ggatgccatt ctacgcatgg gactttagag tccegetget 7201 aatgataggt tgctactcac aattaacacc cctgacccta atagtggcca tcattttgct 7261 cgtggegcac tacatgtact tgatcccagg gctgcaggca gcagetgege gtgetgeeca 7321 gaagagaacg gcagctggca tcatgaagaa ccctgttgtg gatggaatag tggtgactga 7381 cattgacaca atgacaattg acccccaagt ggagaaaaag atgggacagg tgctactcat 7441 agcagtagce gtetecageg ccatactgte geggacegee taggggtAgg ggAgaggctag 7501 ggctctgate acagcegcaa cttecacttt gtaggaagge tetecgaaca agtactggaa 7561 ctcctetaca gccacttcac tgtgtaacat ttttagggga agttacttgg ctggagctte 7621 tctaatctac acagtaacaa gaaacgctag cttggtcaag agacgtgggg gtggaacagg 7681 agagaccctg ggagagaaat ggaaggcceg cttgaaccag atgteggcce tggagtteta
7741 ctcctacaaa aagtcaggca tcaccegaggt gtgcagagaa gaggccegee gegeceteaa 7801 ggacggtgtg gcaacgggag gccatgctgt gtccegagga agtgcaaage tgagatggtt 7861 ggtggagegg ggatacctgc agcccetatag aaaggtcatt gatcttggat gtggcagagg 7921 gggctggagt tactacgtcg ccaccatceg caaagttcaa gaagtgaaag gatacacaaa 7981 aggaggccct ggtcatgaag aaccegtgtt ggtgcaaage tatgggtaga acatagtceg 8041 tcttaagagt ggggtggacg tetttcatat ggeggctgag cegtgtgaca cgttgctgta 8101 tgacataggt gagtcatcat ctagtcctga agtggaagaa gcacggacgc tcagagtect 8161 ctccatggtg ggggattggc ttgaaaaaag accaggagcc ttttgtataa aagtgttgtg 8221 cccatacace agcactatga tggaaaccct ggagegactg cagegtaggt atgggggaga 8281 actggtcaga gtgccactet ccegcaacte tacacatgag atgtactggg tctetggage 8341 gaaaagcaac accataaaaa gtgtgtccac cacgagecag ctectettag ggcgcatgga 8401 cgggcctagg aggccagtga aatatgagga ggatgtgaat cteggetetg gcacgeggge 8461 tgtggtaagc tgcgctgaag cteccaacat gaagatcatt ggtaacegca ttgaaaggat 8521 ccgcagtgag cacgcggaaa cgtggttctt tgacgagaac cacccatata ggacatgggc 8581 ttaccatgga agctatgagg cccccacaca agggtcageg tectetetaa taaacggggt 8641 tgtcaggcte ctgtcaaaac cctgggatgt ggtgactgga gtcacaggaa tagccatgac 8701 cgacaccaca cecgtatggtc agcaaagagt tttcaaggaa aaagtggaca ctagggtgcc 8761 agacccccaa gaaggcacte gtcaggttat gagcatggte tettectagt tgtgagaaaga 8821 gctaggcaaa cacaaacggc cacgagtctg caccaaagaa gagttcatca acaaggttcg 8881 tagcaatgca gcattagggg caatatttga agaggaaaaa gagtggaaga ctgcagtgga 8941 agctgtgaac gatccaaggt tctgggctct agtggacaag gaaagagage accacctgag 9001 aggagagtgc cagagctgtg tgtacaacat gatgggaaaa agagaaaaga aacaagggga 9061 atttggaaag gccaagggca gcegegecat ctagtatatg tggctagggg ctagatttct 9121 agagttcgaa gcccttggat tettgaacga ggatcactgg atggggagag agaactcagg 9181 aggtggtgtt gaagggctgg gattacaaag actcggatat gtcctagaag agatgagtcg 9241 tataccagga ggaaggatgt atgcagatga cactgctggc tgggacaccc gcattagcag 9301 gtttgatctg gagaatgaag ctctaatcac caaccaaatg gagaaagggc acagggcctt 9361 ggcattggcc ataatcaagt acacatacca aaacaaagtg gtaaaggtcc ttagaccage 9421 tgaaaaaggg aaaacagtta tggacattat ttcgagacaa gaccaaaggg ggageggaca 9481 agttgtcact tacgctctta acacatttac caacctagtg gtgcaactca ttcggaatat 9541 ggaggctgag gaagttctag agatgcaaga cttgtagctg ctgcggaggt cagagaaagt 9601 gaccaactgg ttgcagagca acggatggga taggctcaaa cgaatggcag tcagtggaga 9661 tgattgcgtt gtgaagccaa ttgatgatag gtttgcacat gcccteaggt tcttgaatga 9721 tatgggaaaa gttaggaagg acacacaaga gtggaaaccc tcaactggat gggacaactg 9781 ggaagaagtt cecgttttgct cccaccactt caacaagete catcteaagg acgggaggte 9841 cattgtggtt ccctgcegec accaagatga actgattggc cgggecegeg tetetecagg 9901 ggcgggatgg agcatceggg agactgcttg cctagcaaaa tcatatgcgc aaatgtggca 9961 gctectttat ttccacagaa gggaccteeg actgatggcc aatgccattt gttcatctgt 10021 gccagttgac tgggttccaa ctgggagaac tacctggtca atccatggaa agggagaato 10081 gatgaccact gaagacatgc ttgtggtgtg gaacagagtg tggattgagg agaacgacca 10141 catggaagac aagaccccag ttacgaaatg gacagacatt ccctatttgg gaaaaagaga 10201 agacttgtgg tgtggatctc tcatagggca cagacegege accacctagg ctgagaacat 10261 taaaaacaca gtcaacatgg tgcgcaggat cataggtgat gaagaaaagt acatggacta 10321 cctateccace caagtteget acttaggtga agaagggtct acacctggag tgctgtaage 10381 accaatctta atgttgtcag gcctgctagt cagccacage ttggggaaag ctgtgcagec
10441 tgtgacccce ccaggagaag ctgggaaace aagcetatag tcaggcegag aacgcecatgg 10501 cacggaagaa gccatgctgc ctgtgagcce ctcagaggac actgagtcaa aaaaccccac 10561 gcgcttggag gegcaggatg ggaaaagaag gtggegacet tececacect teaatetggg 10621 gcctgaactg gagatcagect gtggatctec agaagaggga ctagtggtta gagga
[0082] Em algumas modalidades, o vírus Zika pode compreender a sequência do genoma do número de Acessão ao GenBank KU501215.1. Em algumas modalidades, o vírus Zika é da cepa PRVABC59. Em algumas modalidades, a sequência do genoma do número de Acessão ao GenBank KU501215.1 compreende a sequên- cia da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o vírus Zika pode compreender uma sequência genômica que possui pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo me- nos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pe- lo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo me- nos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 2.
[0083] Em algumas modalidades, o vírus Zika pode compreender pelo menos um polipeptídeo codificado pela sequência da SEQ ID NO:
2. Em algumas modalidades, o vírus Zika pode compreender pelo me- nos um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência da SEQ ID NO: 2.
[0084] Por conseguinte, em algumas modalidades, o vírus Zika inativado da presente divulgação pode ser usado em qualquer uma das vacinas e/ou composições imunogênicas aqui divulgadas. Por exemplo, o vírus Zika inativado da presente divulgação pode ser usado para fornecer um ou mais antígenos úteis para tratar ou prevenir a in- fecção pelo vírus Zika em um sujeito em necessidade do mesmo e/ou para induzir uma resposta imune, como uma resposta imune protetora, contra o vírus Zika em um sujeito em necessidade do mesmo.
[0085] O vírus Zika usado na presente divulgação pode ser obtido de uma ou mais células em cultura de células (por exemplo, via purifi- cação de placas). Quaisquer células adequadas conhecidas na técnica para a produção do vírus Zika podem ser usadas, incluindo, por exem- plo, células de insetos (por exemplo, células de mosquito, como célu- las CCL-125, células Aag-2, células RML-12, células C6/36, células C7-10 células, células AP-61, células A.t. GRIP-1, células A.t. GRIP-2, células A.t. GRIP-3, células UM-AVE1, células Mos. 55, células Sua1B, células 4a-3B, células Mos. 42, células MSQ43, células LSB- AAG695BB, células NIID-CTR, células TRA-171, e células ou linhagens celulares adicionais de espécies de mosquitos, comoA4edes aegypti, Aedes albopictus, Aedes pseudoscutellaris, Aedes triseriatus, Aedes vexans, Anopheles gambiae, Anopheles stephensi, Anopheles albi- mus, Culex quinquefasciatus, Culex theileri, Culex tritaeniorhynchus, Culex bitaeniorhynchus, e/ou Toxorhynchites amboinensis), e células de mamíferos (por exemplo, células VERO (dos rins de macaco), célu- las LLC-MK2 (dos rins de macaco), células MDBK, células MDCK, cé- lulas ATOCC CCL34 MDCK (NBL2), células MDCK 33016 (número de depósito DSM ACC 2219 como descrito em WOS97/37001), células BHK21-F, células HKCC ou células de ovário de hamster Chinês (célu- las CHO). Em algumas modalidades, o vírus Zika (por exemplo, um isolado clonal do vírus Zika) é produzido a partir de uma célula não humana. Em algumas modalidades, o vírus Zika (por exemplo, um iso- lado clonal do vírus Zika) é produzido a partir de uma célula de inseto.
Em algumas modalidades, o vírus Zika (por exemplo, um isolado clo- nal do vírus Zika) é produzido a partir de uma célula de mosquito. Em algumas modalidades, o vírus Zika (por exemplo, um isolado clonal do vírus Zika) é produzido a partir de uma célula de mamífero. Em algu- mas modalidades, o vírus Zika (por exemplo, um isolado clonal do ví- rus Zika) é produzido a partir de uma célula VERO.
[0086] Os vírus zika possuem um genoma de RNA de fita simples de sentido positivo que codifica polipeptídeos estruturais e não estrutu- rais. O genoma também contém sequências não codificantes nas regi- ões 5' e 3' terminais que desempenham um papel na replicação do ví- rus. Os polipeptídeos estruturais codificados por esses vírus incluem, sem limitação, capsídeo (C), membrana precursora (prM) e envelope (E). Os polipeptídeos não estruturais (NS) codificados por esses vírus incluem, sem limitação, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5.
[0087] Em certas modalidades, o vírus Zika inclui uma mutação na proteína não estrutural 1 do vírus Zika (NS1). Em algumas modalida- des, o vírus Zika contém uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1.
[0088] Em algumas modalidades, a mutação está dentro do poli- peptídeo NS1. A sequência de aminoácidos de um polipeptídeo NS1 de tipo selvagem de uma cepa exemplificativa do vírus Zika é estabe- lecida como:
RAKDGCWYGMEIRPRKEPESNLVRSMVT (SEQ ID NO: 1).
[0089] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo NS1 tem pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo me- nos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pe- lo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequên- cia com a sequência da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo NS1 pode ser da sequência de aminoácidos codificada pela sequência do número de Acessão ao GenBank KU501215.1 (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo NS1 pode estar nas posições de aminoácidos 795 a 1145 da sequência de aminoácidos codificada pe- la sequência do número de Acessão ao GenBank KU501215.1. Em al- gumas modalidades, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo NS1 pode ser da cepa do vírus Zika PRVABC59.
[0090] "Identidade de sequência", "% de identidade de sequência", "% de identidade", "% idêntica" ou "alinhamento de sequência" signifi- ca uma comparação de uma primeira sequência de aminoácidos com uma segunda sequência de aminoácidos ou uma comparação de uma primeira sequência de ácidos nucleicos para uma segunda sequência de ácido nucleico e é calculada como uma porcentagem com base na comparação. O resultado deste cálculo pode ser descrito como "por- centagem idêntica" ou "porcentagem de ID".
[0091] Geralmente, um alinhamento de sequência pode ser usado para calcular a identidade da sequência por uma de duas abordagens diferentes. Na primeira abordagem, as incompatibilidades em uma úni- ca posição e as lacunas em uma única posição são contadas como posições não idênticas no cálculo final da identidade de sequência. Na segunda abordagem, as incompatibilidades em uma única posição são contadas como posições não idênticas no cálculo final da identidade da sequência; no entanto, as lacunas em uma única posição não são contadas (ignoradas) como posições não idênticas no cálculo final da identidade da sequência. Em outras palavras, na segunda abordagem, as lacunas são ignoradas no cálculo final da identidade da sequência. A diferença entre essas duas abordagens, isto é, contar lacunas como posições não idênticas versus ignorar lacunas, em uma única posição pode levar a variabilidade no valor da identidade de sequência entre duas sequências.
[0092] Em algumas modalidades, uma identidade de sequência é determinada por um programa, que produz um alinhamento e calcula a identidade contando as incompatibilidades em uma única posição e as lacunas em uma única posição como posições não idênticas no cálcu- lo final da identidade de sequência. Por exemplo, o programa Needle (EMBOS), que implementou o algoritmo de Needleman and Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), e que cal- cula a identidade da sequência por configurações padrão produzindo primeiro um alinhamento entre uma primeira sequência e uma segun- da sequência, depois contando o número de posições idênticas ao longo do comprimento do alinhamento e dividindo o número de resí- duos idênticos pelo comprimento de um alinhamento, multiplicando esse número por 100 para gerar a % de identidade de sequência [% de identidade de sequência = (% de resíduos idênticos/comprimento do alinhamento) x 100)].
[0093] Uma identidade de sequência pode ser calculada a partir de um alinhamento em pares, mostrando as duas sequências em todo o comprimento, mostrando a primeira e a segunda sequência em todo o seu comprimento ("Identidade global da sequência"). Por exemplo, o programa Needle (EMBOSS) produz esses alinhamentos; % de identi-
dade de sequência = (% de resíduos idênticos/comprimento do alinha- mento) x 100)].
[0094] Uma identidade de sequência pode ser calculada a partir de um alinhamento em pares, mostrando apenas uma região local da primeira ou da segunda sequência ("Identidade local"). Por exemplo, o programa Blast (NCBI) produz esses alinhamentos; % de identidade de sequência = (número de resíduos idênticos/comprimento do ali- nhamento) x 100)].
[0095] O alinhamento da sequência é de preferência gerado usan- do o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. (1979) 48, p. 443-453). De preferência, o programa "NEEDLE" (Conjunto Europeu de Software Aberto para Biologia Molecular (EMBOSS)) é usado com o parâmetro padrão dos programas (intervalo aberto = 10,0, intervalo estendido = 0,5 e matriz = EBLOSUMG6?2 para proteínas e matriz = EDNAFULL para nucleotídeos). Então, uma identidade de sequência pode ser calculada a partir do alinhamento mostrando as duas se- quências em todo o comprimento, mostrando a primeira e a segunda sequência em todo o seu comprimento ("Identidade global da sequên- cia"). Por exemplo: % de identidade da sequência = (4 de resíduos idênticos/comprimento do alinhamento) x 100)].
[0096] Em algumas modalidades, uma mutação ocorre em uma ou mais posições de aminoácidos dentro do polipeptídeo NS1. Em algu- mas modalidades, a mutação ocorre na posição 98 da SEQ ID NO: 1, ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1 quando alinhada à SEQ ID NO: 1 usando um algoritmo de alinhamento em pares. Em algumas modalidades, a mutação na posição 98 é um triptofano para substituição de glicina.
[0097] Em algumas modalidades, o vírus Zika compreende uma mutação na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição corres- pondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1. Uma posição corresponden-
te à posição 98 da SEQ ID NO: 1 pode ser determinada alinhando a sequência de aminoácidos de uma proteína NS1 à SEQ ID NO: 1 usando um algoritmo de alinhamento em pares. Os resíduos de ami- noácidos em vírus que não o vírus Zika, que correspondem ao resíduo de triptofano na posição 98 da SEQ ID NO: 1, são mostrados na Figu- ra 7 do presente pedido, onde esses resíduos são embalados em cai- xas. Em algumas modalidades, a mutação na posição 98 é um tripto- fano para substituição de glicina. Em algumas modalidades, a mutação na posição 98 é uma substituição de triptofano por glicina na posição 98 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a mutação na posição 98 é um triptofano para substituição de glicina em uma posição cor- respondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1 quando alinhada à SEQ ID NO: 1 usando um algoritmo de alinhamento pareado.
[0098] Em algumas modalidades, o vírus Zika contém uma muta- ção dentro da proteína NS1 e pelo menos uma mutação dentro de uma ou mais das proteínas virais C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5. Em algumas modalidades, o vírus Zika contém uma ou mais mutações dentro da proteína NS1 e não contém pelo menos uma mutação dentro de uma ou mais das proteínas virais C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5. Em algumas modalidades, o vírus Zika contém uma mutação na proteína NS1 e não contém pelo menos uma mutação na proteína E do envelope. Em algumas modalidades, o vírus inativado inteiro contém pelo menos uma mutação na proteína não estrutural 1 do vírus Zika (NS1) e não inclui uma mutação na proteína E (Env) de envelope do vírus Zika. Em algumas modalidades, o vírus Zika contém uma mutação na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1 e não contém nenhuma mutação dentro da proteína de envelope E. Em algumas modalidades, o vírus Zika inativado com- pleto contém uma mutação na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1 e não in- clui uma mutação na proteína E (Env) de envelope do vírus Zika. Em algumas modalidades, o vírus inteiro e inativado contém pelo menos uma mutação na proteína não estrutural 1 do vírus Zika (NS1) e a se- quência que codifica a proteína de envelope é a mesma que a se- quência correspondente na SEQ ID No. 2. Em algumas modalidades, o vírus Zika contém uma mutação na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou numa posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1 e a se- quência que codifica a proteína do envelope é a mesma que a se- quência correspondente na SEQ ID NO. 2. Em algumas modalidades, o vírus Zika inteiro inativado contém uma mutação na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1 e a sequência que codifica a proteína do envelope é a mesma que a sequência correspondente na SEQ ID NO: 2. Em algu- mas modalidades, o vírus Zika inteiro, inativado contém uma substitui- ção triptofano para glicina na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou numa posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1 e a sequência que codifica a proteína do envelope é a mesma que a sequência cor- respondente na SEQ ID NO: 2.
[0099] Em algumas modalidades, o vírus Zika contém pelo menos uma mutação que intensifica a estabilidade genética em comparação com um vírus Zika sem a pelo menos uma mutação. Em algumas mo- dalidades, o vírus Zika contém pelo menos uma mutação que intensifi- ca a replicação viral em comparação com um vírus Zika sem a pelo menos uma mutação. Em algumas modalidades, o vírus Zika contém pelo menos uma mutação que reduz ou inibe a ocorrência de muta- ções indesejáveis, como dentro da proteína de envelope E (Env) do vírus Zika.
[00100] Nas modalidades acima da presente divulgação, um algo- ritmo de alinhamento pareado exemplificativo é o algoritmo de alinha-
mento global Needleman-Wunsch, usando parâmetros padrão (por exemplo, com penalidade de abertura Gap = 10,0 e com penalidade de extensão Gap = 0,5, usando a matriz de pontuação EBLOSUM62). Es- se algoritmo é convenientemente implementado na ferramenta needle no pacote EMBOSS.
[00101] Em algumas modalidades, o vírus Zika inativado pode ser usado em vacinas e composições imunogênicas. Por exemplo, o vírus Zika inativado pode ser útil para tratar ou prevenir a infecção pelo vírus Zika em um sujeito em necessidade do mesmo e/ou induzir uma res- posta imune, como uma resposta imune protetora, contra o vírus Zika em um sujeito em necessidade do mesmo. Produção de vacinas e composições imunogênicas
[00102] Outros aspectos da presente divulgação referem-se a vaci- nas do vírus Zika e composições imunogênicas contendo um vírus in- teiro inativado purificado, como um vírus Zika com uma mutação que é uma substituição de triptofano por glicina na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, como aqui descrito. Em algumas modalidades, a vacina ou composição imunogênica compreende um vírus Zika inteiro inativado purificado compreendendo uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, em que o vírus Zika é derivado da cepa PRVABCS59. Em algumas modalidades, a vacina ou composição imunogênica com- preende um vírus Zika inteiro inativado purificado compreendendo uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posi- ção correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, em que o vírus Zika é derivado da cepa PRVABC59 compreendendo a sequência ge- nômica de acordo com a SEQ ID NO: 2. Numa modalidade, as vacinas e composições imunogênicas contêm um isolado de vírus de Zika clo- nal purificado em placa. Tais vacinas e composições imunogênicas podem ser úteis, por exemplo, para tratar ou prevenir a infecção pelo vírus Zika em um indivíduo em necessidade do mesmo e/ou induzir uma resposta imune, como uma resposta imune protetora, contra o vírus Zika em um sujeito em necessidade do mesmo.
[00103] A produção de vacinas e/ou composições imunogênicas da presente divulgação inclui o crescimento do vírus Zika. O crescimento em cultura de células é um método para preparar vacinas e/ou compo- sições imunogênicas da presente divulgação. As células para cresci- mento viral podem ser cultivadas em suspensão ou em condições ade- rentes.
[00104] As linhagens celulares adequadas para o crescimento de pelo menos um vírus da presente divulgação incluem, mas não estão limitadas a: células de inseto (por exemplo, células de mosquito, con- forme descrito aqui, células VERO (de rins de macaco), cavalo, vaca (por exemplo, células MDBK), ovelha, cachorro (por exemplo, células MDCK de rins de cães, ATCC CCL34 MDCK (NBL2) ou MDCK 33016, número de depósito DSM ACC 2219 como descrito em WOS97/37001), gato e roedor (por exemplo, células de hamster, como células BHK21- F, HKCC ou células de ovário de hamster chinês (células CHO)), e po- dem ser obtidas a partir de uma ampla variedade de estágios de de- senvolvimento, incluindo, por exemplo, adulto, neonatal, fetal e embrião. Em certas modalidades, as células são imortalizadas (por exemplo, célu- las PERC. 6, como descrito em WO 01/38362 e WO 02/40665 e depo- sitados sob o número de depósito ECACC 96022940). Em modalida- des preferidas, as células de mamífero são utilizadas e podem ser se- lecionadas de e/ou derivadas de um ou mais dos seguintes tipos de células não limitativas: células de fibroblastos (por exemplo, dérmicas, de pulmão), células endoteliais (por exemplo, aórticas, coronárias, pulmonares, vasculares, microvasculares dérmicas, umbilicais), hepa- tócitos, queratinócitos, células imunes (por exemplo, células T, células
B, macrófagos, NK, dendríticas), células mamárias (por exemplo, epi- teliais), células musculares lisas (por exemplo, vasculares, aórticas, coronárias, arteriais, uterinas, brônquicas, cervicais, periícitos da reti- na), melanócitos, células neurais (por exemplo, astrócitos), células da próstata (por exemplo, epiteliais, do músculo liso), células renais (por exemplo, epitelial, mesangiais, do túbulo proximal), células esqueléti- cas (por exemplo, condrócitos, osteoclastos, osteoblastos), células musculares (por exemplo, de mioblasto, esqueléticas, lisas, brônquicas), células hepáticas, retinoblastos e células estromais. WO 97/37000 e WO 97/37001 descrevem a produção de células e linhagens celulares ani- mais que são capazes de crescer em suspensão e em meio isento de soro e são úteis na produção e replicação de vírus. Numa modalidade, as células usadas para cultivar o pelo menos um vírus são células Vero.
[00105] As condições de cultura para os tipos de células acima são conhecidas e descritas em uma variedade de publicações. Alternati- vamente, meio de cultura, suplementos e condições podem ser adqui- ridos comercialmente, como por exemplo, descritos no catálogo e lite- ratura adicional da Cambrex Bioproducts (East Rutherford, N.J.).
[00106] Em certas modalidades, as células usadas nos métodos descritos neste documento são cultivadas em meio livre de soro e/ou livre de proteína. Um meio é referido como um meio sem soro no con- texto da presente divulgação, se não contiver nenhum aditivo do soro de origem humana ou animal. Entende-se por livre de proteínas as cul- turas nas quais a multiplicação das células ocorre com exclusão de proteínas, fatores de crescimento, outros aditivos de proteínas e prote- Ínas não séricas, mas pode incluir opcionalmente proteínas como trip- sina ou outras proteases que possam ser necessárias para o cresci- mento viral. As células que crescem nessas culturas contêm natural- mente as próprias proteínas.
[00107] Os meios isentos de soro conhecidos incluem o meio de
Iscove, o meio Ultra-CHO (BioWhittaker) ou o EX-CELL (JRH Biosci- ence). Os meios comuns que contêm soro incluem o Meio Basal de Eagle (BME) ou o Meio Essencial Mínimo (MEM) (Eagle, Science, 130, 432 (1959)) ou o Meio de Águia Modificado da Dulbecco (DMEM ou EDM), que são normalmente usados com até 10% de soro fetal de be- zerro ou aditivos similares. Opcionalmente, o Meio Essencial Mínimo (MEM) (Eagle, Science, 130, 432 (1959)) ou o Meio de Águia Modifi- cado da Dulbecco (DMEM ou EDM) podem ser usados sem qualquer suplemento que contenha soro. Meios livres de proteína como PF- CHO (JHR Bioscience), meios quimicamente definidos como ProCHO 4CDM (BioWhittaker) ou SMIF 7 (Gibco/BRL Life Technologies) e pep- tídeos mitogênicos como Primactone, Pepticase ou HyPep.TM. (todos da Quest International) ou hidrolisado de lactalbumina (Gibco e outros fabricantes) também são adequadamente conhecidos na técnica ante- rior. Os aditivos de meio à base de hidrolisados de plantas têm a van- tagem especial de excluir a contaminação por vírus, micoplasma ou agentes infecciosos desconhecidos.
[00108] As condições de cultura celular (temperatura, densidade celular, valor de pH, etc.) são variáveis em uma faixa muito ampla de- vido à adequação da linhagem celular utilizada de acordo com a pre- sente divulgação e podem ser adaptadas aos requisitos de cepas vi- rais específicas.
[00109] O método para propagar o vírus nas células cultivadas ge- ralmente inclui as etapas de inoculação das células cultivadas com a cepa a ser cultivada, cultivar as células infectadas por um período de tempo desejado para a propagação do vírus, como por exemplo, con- forme determinado pelo título do vírus ou pela expressão do antígeno (por exemplo, entre 24 e 168 horas após a inoculação) e coletar o ví- rus propagado. Em algumas modalidades, o vírus é coletado através da purificação da placa. As células cultivadas são inoculadas com uma razão de vírus (medida por PFU ou TCID50)/célula de 1:500 a 1:1, pre- ferencialmente 1:100 a 1:5. O vírus é adicionado a uma suspensão das células ou é aplicado a uma monocamada das células, e o vírus é absorvido pelas células por pelo menos 10 minutos, pelo menos 20 minutos, pelo menos 30 minutos, pelo menos 40 minutos, pelo menos pelo menos 50 minutos, pelo menos 60 minutos, mas geralmente me- nos de 300 minutos a 25ºC a 40ºC, preferencialmente 28ºC a 38ºC.
À cultura de células infectada (por exemplo monocamadas) pode ser re- movida tanto pela colheita do sobrenadante (livre de células), descon- gelamento por congelamento ou por ação enzimática para aumentar o teor viral dos sobrenadantes da cultura colhida.
Os fluidos colhidos são então inativados ou armazenados congelados.
As células cultivadas podem ser infectadas com uma multiplicidade de infecção ("MOI") de cerca de 0,0001 a 10, de preferência 0,002 a 5, mais preferencialmen- te de 0,001 a 2. Ainda mais preferencialmente, as células são infecta- das com um MOI de cerca de 0,01. Durante a infecção a razão de meio de cultura para a área do recipiente de cultura de células pode ser mais baixa do que durante a cultura das células.
Manter essa ra- zão baixa maximiza a probabilidade de o vírus infectar as células.
O sobrenadante das células infectadas pode ser colhido 30 a 60 horas após a infecção ou 3 a 10 dias após a infecção.
Em certas modalida- des preferidas, o sobrenadante das células infectadas é colhido 3 a 7 dias após a infecção.
Mais preferencialmente, o sobrenadante das cé- lulas infectadas é colhido 3 a 5 dias após a infecção.
Em algumas mo- dalidades, proteases (por exemplo, tripsina) pode ser adicionado du- rante a cultura de células para permitir a liberação viral, e as proteases podem ser adicionadas em qualquer estágio adequado durante a cul- tura.
Alternativamente, em certas modalidades, o sobrenadante das culturas celulares infectadas pode ser colhido e o vírus pode ser isola- do ou purificado de outro modo a partir do sobrenadante.
[00110] O inóculo viral e a cultura viral são preferencialmente livres de (i.e. terão sido testados e obtiveram resultado negativo para conta- minação por) vírus do herpes simplex, vírus sincicial respiratório, vírus da para influenza 3, coronavírus SARS, adenovírus, rinovírus, reovírus, po- liomavírus, birnavírus, circovírus e/ou parvovírus (WO 2006/027698).
[00111] Onde o vírus foi cultivado em uma linhagem celular, é práti- ca padrão minimizar a quantidade de DNA residual da linhagem celular na vacina final, a fim de minimizar qualquer atividade oncogênica do DNA da célula hospedeira. O DNA contaminante pode ser removido durante a preparação da vacina usando procedimentos padrão de puri- ficação, por exemplo, cromatografia, etc. A remoção do DNA residual da célula hospedeira pode ser aprimorada por tratamento com nu- clease, por exemplo, usando uma DNase. Um método conveniente para reduzir a contaminação do DNA da célula hospedeira divulgado nas referências (Lundblad (2001) Biotechnology and Applied Bioche- mistry 34:195-197, Guidance for Industry: Bioanalytical Method Valida- tion. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER) Cen- ter for Veterinary Medicine (CVM). May 2001.) envolve um tratamento em duas etapas, primeiro usando um DNase (por exemplo Benzo- nase),que pode ser usado durante o crescimento viral e, em seguida, um detergente catiônico (por exemplo CTAB), que pode ser usado du- rante a interrupção do virion. A remoção por tratamento com B- propiolactona também pode ser usada. Numa modalidade, o DNA con- taminante é removido por tratamento com benzonase do sobrenadante da cultura. Produção de Antígenos
[00112] O vírus Zika pode ser produzido e/ou purificado ou isolado por qualquer método adequado conhecido na técnica. Numa modali- dade, o antígeno da presente divulgação é um vírus Zika inteiro inati-
vado purificado.
[00113] Em algumas modalidades, vírus inativados podem ser pro- duzidos como descrito na seção acima, intitulada “Production of Vacci- nes and Immunogenic Compositions.”
[00114] Em certas modalidades, o vírus Zika da presente divulga- ção pode ser produzido cultivando uma célula não humana. As linha- gens celulares adequadas para produção do vírus Zika da presente divulgação podem incluir células de insetos (por exemplo, qualquer uma das células do mosquito aqui descritas). As linhagens celulares adequadas para a produção do vírus Zika da presente divulgação também podem ser células de origem mamiífera e incluem, mas não estão limitadas a: células VERO (de rins de macaco), cavalo, vaca (por exemplo, células MDBK), ovelha, cachorro (por exemplo, células MDCK de rins de cães, ATCC CCL34 MDCK (NBL2) ou MDCK 33016, número de depósito DSM ACC 2219 como descrito em WO 97/37001), gato e roedor (por exemplo, células de hamster como células BHK21- F, HKCC ou células de ovário de hamster chinês (células CHO)) e po- dem ser obtidas em uma ampla variedade de estágios de desenvolvi- mento, incluindo, por exemplo, adulto, neonatal, fetal e embrionário. Em certas modalidades, as células são imortalizadas (por exemplo, células PERC. 6, como descrito em WO 01/38362 e WO 02/40665 e depositados sob o número de depósito ECACC 96022940). Em moda- lidades preferidas, as células de mamífero são utilizadas e podem ser selecionadas de e/ou derivadas de um ou mais dos seguintes tipos de células não limitativas: células de fibroblastos (por exemplo, dérmicas, de pulmão), células endoteliais (por exemplo, aórticas, coronárias, pulmonares, vasculares, microvasculares dérmicas, umbilicais), hepa- tócitos, queratinócitos, células imunes (por exemplo, células T, células B, macrófagos, NK, dendríticas), células mamárias (por exemplo, epi- teliais), células musculares lisas (por exemplo, vasculares, aórticas,
coronárias, arteriais, uterinas, brônquicas, cervicais, pericitos da reti- na), melanócitos, células neurais (por exemplo, astrócitos), células da próstata (por exemplo, epiteliais, do músculo liso), células renais (por exemplo, epitelial, mesangiais, do túbulo proximal), células esqueléti- cas (por exemplo, condrócitos, osteoclastos, osteoblastos), células musculares (por exemplo, de mioblasto, esqueléticas, lisas, brônquicas), células hepáticas, retinoblastos e células estromais. WO 97/37000 e WO 97/37001 descrevem produção de células e linhagens celulares ani- mais que são capazes de crescer em suspensão e em meio isento de soro e são úteis na produção de antígenos virais. Em certas modalida- des, a célula não humana é cultivada em meio sem soro. Em certas modalidades, o vírus Zika da presente divulgação pode ser produzido pela cultura de células Vero. Inativação do vírus.
[00115] Certas modalidades da presente divulgação referem-se a vacinas contra o vírus do Zika e/ou composições imunogênicas con- tendo um vírus do Zika inativado purificado. O termo "vírus Zika inati- vado", como aqui utilizado, pretende compreender um vírus Zika que foi tratado com um método de inativação, como tratamento com uma quantidade eficaz de formalina. Em particular, o vírus Zika inativado é obtível/obtido a partir de um método em que o vírus Zika é tratado com formaldeído numa quantidade de cerca de 0,01% p/v por 10 dias a uma temperatura de 20 ºC a 24 ºC. O vírus Zika inativado não é mais capaz de infectar células hospedeiras que podem ser infectadas com um vírus Zika que não foi inativado. Numa modalidade, o vírus Zika inativado não é mais capaz de infectar células VERO e de exercer um efeito citopático nas células VERO.
[00116] O termo "vírus Zika purificado" significa que o vírus Zika foi submetido a um processo de purificação como descrito abaixo. O vírus Zika purificado tem um teor mais baixo de proteínas da célula hospe-
deira, como proteínas da célula Vero, e DNA da célula hospedeira, como o DNA da célula Vero, do que um vírus Zika não purificado. À pureza do vírus Zika purificado pode ser determinada por cromatogra- fia de exclusão por tamanho. O pico principal do vírus Zika purificado na cromatografia de exclusão por tamanho pode ser superior a 85% da área total sob a curva na cromatografia de exclusão por tamanho ou mais de 90% da área total sob a curva na cromatografia de exclusão por tamanho, ou mais de 95% da área total sob a curva na cromato- grafia de exclusão por tamanho. Esses resultados são considerados como vírus Zika “purificado”.
[00117] O termo "vírus Zika inteiro inativado purificado" refere-se, assim, a um vírus Zika obtível/obtido a partir de um método em que o vírus Zika purificado é tratado com formaldeído em uma quantidade de 0,01% p/v por 10 dias a uma temperatura de 20ºC a 24ºC e fornece um pico principal de pelo menos 85% da área total sob a curva na cromatografia de exclusão de tamanho. Em algumas modalidades, o termo "vírus Zika inteiro inativado purificado" refere-se, assim, a um vírus Zika obtível/obtido a partir de um método em que o vírus Zika pu- rificado é tratado com formaldeído numa quantidade de 0,01% p/v por dias a uma temperatura de 20 ºC a 24ºC e fornece um pico princi- pal de pelo menos 90% da área total sob a curva na cromatografia de exclusão de tamanho. Em algumas modalidades, o termo "vírus Zika inteiro inativado purificado" refere-se, assim, a um vírus Zika obtí- vel/obtido a partir de um método em que o vírus Zika purificado é tra- tado com formaldeído em uma quantidade de 0,01% p/v por 10 dias a uma temperatura de 20 ºC a 24ºC e fornece um pico principal de pelo menos 95% da área total sob a curva na cromatografia de exclusão de tamanho. Em certas modalidades, o vírus Zika inteiro inativado purifi- cado é um isolado clonal obtível/obtido por purificação de placas.
[00118] Os métodos de inativar ou matar vírus para destruir sua ca-
pacidade de infectar células de mamíferos, mas não destruir a estrutu- ra secundária, terciária ou quaternária e epítopos imunogênicos do ví- rus são conhecidos na técnica. Tais métodos incluem meios químicos e físicos. Os meios adequados para inativar um vírus incluem, sem limitação, tratamento com uma quantidade eficaz de um ou mais agen- tes selecionados de detergentes, formalina (também aqui referida co- mo "formaldeído"), peróxido de hidrogênio, beta-propiolactona (BPL), etilamina binária (BEI), acetil etilenoimina, calor, radiação eletromag- nética, radiação de raios X, radiação gama, radiação ultravioleta (radi- ação UV), radiação UV-A, radiação UV-B, radiação UV-C, azul de me- tileno, psoraleno, carboxifulereno (C60), peróxido de hidrogênio e qualquer combinação de qualquer um dos mesmos. Como já foi men- cionado acima, para a finalidade do presente pedido os termos “forma- lina” e formaldeído” são utilizados alternadamente. Quando é aqui fei- ta referência a uma concentração de formaldeído, refere-se a concen- tração de formaldeído e não com a concentração de formalina. Por conseguinte, uma "concentração de formaldeído de 0,01% (p/v)" refe- re-se a 0,01% (p/v) de formaldeído, e nenhuma correção adicional dessa concentração para a concentração de formaldeído na solução estoque de formalina (que normalmente contém 37% de formaldeído por massa) deve ser feita. Por exemplo, essa concentração de formal- deído na preparação de vírus pode ser obtida diluindo formalina a uma solução de trabalho com um teor de formaldeído de 1,85% (p/v), que é posteriormente diluído até a concentração necessária quando é mistu- rado com a preparação de vírus como a preparação do vírus Zika.
[00119] Em certas modalidades da presente divulgação, pelo me- nos um vírus é quimicamente inativado. Os agentes para inativação química e métodos de inativação química são bem conhecidos na téc- nica e aqui descritos. Em algumas modalidades, o pelo menos um ví- rus é quimicamente inativado com um ou mais de BPL, peróxido de hidrogênio, formalina ou BEI. Em certas modalidades em que o pelo menos um vírus é quimicamente inativado com BPL, o vírus pode con- ter uma ou mais modificações. Em algumas modalidades, as uma ou mais modificações podem incluir um ácido nucleico modificado. Em algumas modalidades, o ácido nucleico modificado é um ácido nuclei- co alquilado. Em outras modalidades, a uma ou mais modificações po- dem incluir um polipeptídeo modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo modificado contém um resíduo de aminoácido modificado, incluindo um ou mais de uma cisteína modificada, metionina, histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, tirosina, lisina, serina e treonina.
[00120] Em certas modalidades em que o pelo menos um vírus é quimicamente inativado com formalina, o vírus inativado pode conter uma ou mais modificações. Em algumas modalidades, a uma ou mais modificações podem incluir um polipeptídeo modificado. Em algumas modalidades, as uma ou mais modificações podem incluir um polipep- tídeo reticulado. Em algumas modalidades em que pelo menos um ví- rus é quimicamente inativado com formalina, a vacina ou composição imunogênica inclui ainda formalina. Em certas modalidades em que o pelo menos um vírus é quimicamente inativado com BEI, o vírus pode conter uma ou mais modificações. Em algumas modalidades, as uma ou mais modificações podem incluir um ácido nucleico modificado. Em algumas modalidades, o ácido nucleico modificado é um ácido nuclei- co alquilado.
[00121] Em algumas modalidades em que pelo menos um vírus é quimicamente inativado com formalina, qualquer formalina residual que não reagiu pode ser neutralizada com metabissulfito de sódio, po- de ser dialisada e/ou pode ser trocada de tampão para remover a for- malina residual que não reagiu. Em algumas modalidades, o metabis- sulfito de sódio é adicionado em excesso. Em algumas modalidades, as soluções podem ser misturadas usando um misturador, como um misturador estático em linha, e subsequentemente filtrado ou purifica- do (por exemplo, usando um sistema de filtração de fluxo cruzado).
[00122] Certas modalidades da presente divulgação referem-se a um método para inativar uma preparação de vírus Zika. Em algumas modalidades, o método compreende: (a) isolar a preparação de vírus de Zika partir de uma ou mais células cultivadas in vitro, em que as células são utilizadas para produzir a preparação de vírus de Zika, em que o isolamento da prepa- ração de vírus de Zika compreende uma ou mais etapas selecionadas de: (i) filtração em profundidade, (ii) troca de tampão e/ou diluição; (ili) cromatografia de troca iônica; e (b) tratar a preparação do vírus Zika com formaldeído, em que o resultado numérico da multiplicação da concentração de formal- deído, medida em % (p/v), com o período de incubação com formalde- ído, medido em dias, é de 0,025 a 0,5.
[00123] Por exemplo, quando a concentração de formaldeído é de 0,01% (p/v) e o período de tratamento com formaldeído é de 10 dias, o resultado numérico da multiplicação da concentração de formaldeído com o período de incubação com formaldeído é de 0,01 x 10=0,1.
[00124] Em algumas modalidades, o resultado numérico da multipli- cação da concentração de formaldeído medida em % (p/v) com o perí- odo de incubação com formaldeído medido em dias é de 0,05 a 0,25. Em algumas modalidades, o resultado numérico da multiplicação da concentração de formaldeído, medida em % (p/v), com o período de incubação com formaldeído, medida em dias, é de 0,075 a 0,15. Em algumas modalidades, o resultado numérico da multiplicação da con- centração de formaldeído medida em % (p/v) com o período de incu- bação com formaldeído medido em dias é de 0,1.
[00125] Em algumas modalidades, a concentração de formaldeído é de 0,005% (p/v) a 0,02% (p/v). Em algumas modalidades, a concen- tração de formaldeído é de 0,0075% (p/v) a 0,015% (p/v). Em algumas modalidades, a concentração de formaldeído é de 0,01% (p/v).
[00126] Em algumas modalidades, o resultado numérico da multipli- cação da concentração de formaldeído medida em % (p/v) com o perí- odo de incubação com formaldeído medida em dias é de 0,025 a 0,5 e a concentração de formaldeído é de 0,005% (p/v) a 0,02% (p/v). Em algumas modalidades, o resultado numérico da multiplicação da con- centração de formaldeído medida em % (p/v) com o período de incu- bação com formaldeído medido em dias é de 0,025 a 0,5 e a concen- tração de formaldeído é de 0,0075% (p/v) a 0,015% (p/v). Em algumas modalidades, o resultado numérico da multiplicação da concentração de formaldeído medida em % (p/v) com o período de incubação com formaldeído como medida em dias é de 0,025 a 0,5 e a concentração de formaldeído é de 0,01% (p/v).
[00127] Em algumas modalidades, o resultado numérico da multipli- cação da concentração de formaldeído medida em % (p/v) com o perí- odo de incubação com formaldeído como medida em dias é de 0,05 a 0,25 e a concentração de formaldeído é de 0,005% (p/v) a 0,02% (p/v). Em algumas modalidades, o resultado numérico da multiplicação da concentração de formaldeído medida em % (p/v) com o período de in- cubação com formaldeído como medida em dias é de 0,05 a 0,25e a concentração de formaldeído é de 0,0075% (p/v) a 0,015% (p/v). Em algumas modalidades, o resultado numérico da multiplicação da con- centração de formaldeído medida em % (p/v) com o período de incu- bação com formaldeído como medida em dias é de 0,05 a 0,25e a concentração de formaldeído é de 0,01% (p/v).
[00128] Em algumas modalidades, o resultado numérico da multipli- cação da concentração de formaldeído medida em % (p/v) com o perí-
odo de incubação com formaldeído medida em dias é de 0,075 a 0,15 e a concentração de formaldeído é de 0,005% (p/v) a 0,02% (p/v). Em algumas modalidades, o resultado numérico da multiplicação da con- centração de formaldeído medida em % (p/v) com o período de incu- bação com formaldeído como medida em dias é de 0,075 a 0,15e a concentração de formaldeído é de 0,0075% (p/v) a 0,015% (p/v). Em algumas modalidades, o resultado numérico da multiplicação da con- centração de formaldeído medida em % (p/v) com o período de incu- bação com formaldeído como medida em dias é de 0,075 a 0,15e a concentração de formaldeído é de 0,01% (p/v).
[00129] Em algumas modalidades, o resultado numérico da multipli- cação da concentração de formaldeído medida em % (p/v) com o perí- odo de incubação com formaldeído como medida em dias é de 0,1 e a concentração de formaldeído é de 0,005% (p/v) a 0,02% (p/v). Em al- gumas modalidades, o resultado numérico da multiplicação da concen- tração de formaldeído medida em % (p/v) com o período de incubação com formaldeído como medida em dias é de 0,1 e a concentração de formaldeído é de 0,0075% (p/v) a 0,015% (p/v). Em algumas modali- dades, o resultado numérico da multiplicação da concentração de for- maldeído medida em % (p/v) com o período de incubação com formal- deído como medida em dias é de 0,1 e a concentração de formaldeído é de 0,01% (p/v).
[00130] Em algumas modalidades, o resultado numérico da multipli- cação da concentração de formaldeído medida em % (p/v) com o perí- odo de incubação com formaldeído como medida em dias é de 0,025 a 0,5 e o período de incubação com formaldeído é de oito a doze dias. Em algumas modalidades, o resultado numérico da multiplicação da concentração de formaldeído medida em % (p/v) com o período de in- cubação com formaldeído como medida em dias é de 0,025 a 0,5e€ o período de incubação com formaldeído é de nove a onze dias. Em al-
gumas modalidades, o resultado numérico da multiplicação da concen- tração de formaldeído medida em % (p/v) com o período de incubação com formaldeído como medida em dias é de 0,025 a 0,5 e a concen- tração de formaldeído é de dez dias.
[00131] Em algumas modalidades, o resultado numérico da multipli- cação da concentração de formaldeído medida em % (p/v) com o perí- odo de incubação com formaldeído é de 0,05 a 0,25 e o período de incubação com formaldeído é de oito a doze dias. Em algumas moda- lidades, o resultado numérico da multiplicação da concentração de formaldeído medida em % (p/v) com o período de incubação com for- maldeído como medida em dias é de 0,05 a 0,25 e o período de incu- bação com formaldeído é de nove a onze dias. Em algumas modalida- des, o resultado numérico da multiplicação da concentração de for- maldeído medida em % (p/v) com o período de incubação com formal- deído como medida em dias é de 0,05 a 0,25 e a concentração de formaldeído é de dez dias.
[00132] Em algumas modalidades, o resultado numérico da multipli- cação da concentração de formaldeído medida em % (p/v) com o perí- odo de incubação com formaldeído como medida em dias é de 0,075 a 0,15 e o período de incubação com formaldeído é de oito a doze dias. Em algumas modalidades, o resultado numérico da multiplicação da concentração de formaldeído medida em % (p/v) com o período de in- cubação com formaldeído como medida em dias é de 0,075 a0,15e 0 período de incubação com formaldeído é de nove a onze dias. Em al- gumas modalidades, o resultado numérico da multiplicação da concen- tração de formaldeído medida em % (p/v) com o período de incubação com formaldeído como medida em dias é de 0,075 a 0,15 e a concen- tração de formaldeído é de dez dias.
[00133] Em algumas modalidades, o resultado numérico da multipli- cação da concentração de formaldeído medida em % (p/v) com o perí-
odo de incubação com formaldeído como medida em dias é de 0,1 e o período de incubação com formaldeído é de oito a doze dias. Em al- gumas modalidades, o resultado numérico da multiplicação da concen- tração de formaldeído medida em % (p/v) com o período de incubação com formaldeído como medida em dias é de 0,1 e o período de incu- bação com formaldeído é de nove a onze dias. Em algumas modalida- des, o resultado numérico da multiplicação da concentração de for- maldeído medida em % (p/v) com o período de incubação com formal- deído como medida em dias é de 0,1 e a concentração de formaldeído é de dez dias.
[00134] Em algumas modalidades, as células são células não hu- manas. As células de mamíferos não humanos adequadas incluem, mas não estão limitadas a células VERO, células LLC-MK2, células MDBK, células MDCK, células ATCC CCL34 MDCK (NBL2), células MDCK 33016 (número de depósito DSM ACC 2219, conforme descrito em WOS97/37001), células BHK21-F, células HKCC e células de ovário de hamster chinês (células CHO). Em algumas modalidades, as célu- las de mamíferos são células Vero.
[00135] Em certas modalidades do método, a preparação do vírus Zika é tratada com formalina a uma temperatura que varia de cerca de 2ºC a cerca de 42ºC. Por exemplo, a preparação do vírus Zika pode ser tratada com formalina a uma temperatura que varia de cerca de 2ºC a cerca de 42ºC, cerca de 2ºC a cerca de 8ºC, cerca de 15ºC a cerca de 37ºC, cerca de 17ºC a cerca de 27ºC, cerca de 20ºC a cerca de 25ºC, ou a uma temperatura de cerca de 2ºC, cerca de 4ºC, cerca de 8ºC, cerca de 10ºC, cerca de 15ºC, cerca de 17ºC, cerca de 18ºC, cerca de 19ºC, cerca de 20ºC, cerca de 21ºC, cerca de 22ºC, cerca de 23ºC, cerca de 24ºC, cerca de 25ºC, cerca de 26ºC, cerca de 27ºC, cerca de 28ºC, cerca de 29ºC, cerca de 30ºC, cerca de 37ºC ou cerca de 42ºC. Em algumas modalidades, a preparação do vírus Zika é tra-
tada com formalina a uma temperatura de 15ºC a 30ºC. Em algumas modalidades, a preparação do vírus Zika é tratada com formalina a uma temperatura de 18ºC a 25ºC. Em algumas modalidades, a prepa- ração do vírus Zika é tratada com formalina à temperatura ambiente. Em algumas modalidades, a preparação do vírus Zika é tratada com formalina a uma temperatura de 22ºC.
[00136] Em algumas modalidades, a preparação do vírus Zika é tra- tada com formalina por pelo menos cerca de 1 dia. Por exemplo, a preparação do vírus Zika pode ser tratada com formalina por pelo me- nos cerca de 1 dia, pelo menos cerca de 2 dias, pelo menos cerca de 3 dias, pelo menos cerca de 4 dias, pelo menos cerca de 5 dias, pelo menos cerca de 6 dias, pelo menos pelo menos cerca de 7 dias, pelo menos cerca de 8 dias, pelo menos cerca de 9 dias, pelo menos cerca de 10 dias, pelo menos cerca de 11 dias, pelo menos cerca de 12 dias, pelo menos cerca de 13 dias, pelo menos cerca de 14 dias, pelo me- nos cerca de 15 dias, pelo menos cerca de 16 dias, pelo menos cerca de 17 dias, pelo menos cerca de 18 dias, pelo menos cerca de 19 dias, pelo menos cerca de 20 dias, pelo menos cerca de 21 dias, pelo me- nos cerca de 22 dias, pelo menos cerca de 23 dias, pelo menos cerca de 24 dias, pelo menos cerca de 25 dias, pelo menos cerca de 26 dias, pelo menos cerca de 27 dias, pelo menos cerca de 28 dias, pelo me- nos cerca de 29 dias, pelo menos cerca de 30 dias ou mais. Em algu- mas modalidades, a preparação do vírus Zika é tratada com formalina por pelo menos cerca de 9 dias. Em algumas modalidades, a prepara- ção do vírus Zika é tratada com formalina por pelo menos cerca de 11 dias. Em algumas modalidades, a preparação do vírus Zika é tratada com formalina por pelo menos cerca de 14 dias. Em algumas modali- dades, a preparação do vírus Zika é tratada com formalina por pelo menos cerca de 20 dias. Em algumas modalidades, a preparação do vírus Zika é tratada com formalina por pelo menos cerca de 30 dias.
Em algumas modalidades, a preparação do vírus Zika é tratada com formalina por oito a doze dias. Em algumas modalidades, a prepara- ção do vírus Zika é tratada com formalina por nove a onze dias. Em algumas modalidades, a preparação do vírus Zika é tratada com for- malina por dez dias.
[00137] No meio do período de tratamento por inativação, a mistura da preparação do vírus e a formalina podem ser filtradas para remover agregados. Após a filtração, a mistura da preparação do vírus e da formalina é transferida para um novo recipiente e posteriormente trata- da com formalina até o final do período de tratamento por inativação. Em algumas modalidades, a mistura da preparação do vírus e da for- malina é filtrada após quatro a seis dias de tratamento com formalina, se o período geral de tratamento com formalina for de oito a doze dias. Em algumas modalidades, a mistura da preparação do vírus e da for- malina é filtrada após cinco a seis dias de tratamento com formalina, se o período geral de tratamento com formalina for de nove a onze di- as. Em algumas modalidades, a mistura da preparação do vírus e da formalina é filtrada após cinco dias de tratamento com formalina, se o período geral de tratamento com formalina for dez dias. Um filtro ade- quado para esta etapa é um filtro de 0,2 um.
[00138] Em algumas modalidades, a preparação do vírus Zika é tra- tada com formalina de 0,005 a 0,02% (p/v) por oito a doze dias a uma temperatura de 15ºC a 30ºC. Em algumas modalidades, a preparação do vírus Zika é tratada com formalina de 0,005 a 0,02% (p/v) por nove a onze dias a uma temperatura de 15ºC a 30ºC. Em algumas modali- dades, a preparação do vírus Zika é tratada com formalina de 0,005 a 0,02% (p/v) por dez dias a uma temperatura de 15ºC a 30ºC. Em al- gumas modalidades, a preparação do vírus Zika é tratada com forma- lina de 0,008 a 0,015% (p/v) por oito a doze dias a uma temperatura de 15ºC a 30ºC. Em algumas modalidades, a preparação do vírus Zika é tratada com formalina de 0,008 a 0,015% (p/v) por nove a onze dias a uma temperatura de 15ºC a 30ºC. Em algumas modalidades, a pre- paração do vírus Zika é tratada com formalina de 0,008 a 0,015% (p/v) por dez dias a uma temperatura de 15ºC a 30ºC. Em algumas modali- dades, a preparação do vírus Zika é tratada com formalina de 0,01% (p/v) por oito a doze dias a uma temperatura de 15ºC a 30ºC. Em al- gumas modalidades, a preparação do vírus Zika é tratada com forma- lina de 0,01% (p/v) por nove a onze dias a uma temperatura de 15ºC a 30ºC. Em algumas modalidades, a preparação do vírus Zika é tratada com formalina de 0,01% (p/v) por dez dias a uma temperatura de 15ºC a 30ºC.
[00139] Em algumas modalidades, a preparação do vírus Zika é tra- tada com formalina de 0,005 a 0,02% (p/v) por oito a doze dias a uma temperatura de 18ºC a 25ºC. Em algumas modalidades, a preparação do vírus Zika é tratada com formalina de 0,005 a 0,02% (p/v) por nove a onze dias a uma temperatura de 18ºC a 25ºC. Em algumas modali- dades, a preparação do vírus Zika é tratada com formalina de 0,005 a 0,02% (p/v) por dez dias a uma temperatura de 18ºC a 25ºC. Em al- gumas modalidades, a preparação do vírus Zika é tratada com forma- lina de 0,008 a 0,015% (p/v) por oito a doze dias a uma temperatura de 18ºC a 25ºC. Em algumas modalidades, a preparação do vírus Zika é tratada com formalina de 0,008 a 0,015% (p/v) por nove a onze dias a uma temperatura de 18ºC a 25ºC. Em algumas modalidades, a pre- paração do vírus Zika é tratada com formalina de 0,008 a 0,015% (p/v) por dez dias a uma temperatura de 18ºC a 25ºC. Em algumas modali- dades, a preparação do vírus Zika é tratada com formalina de 0,01% (p/v) por oito a doze dias a uma temperatura de 18ºC a 25ºC. Em al- gumas modalidades, a preparação do vírus Zika é tratada com forma- lina de 0,01% (p/v) por nove a onze dias a uma temperatura de 18ºC a 25ºC. Em algumas modalidades, a preparação do vírus Zika é tratada com formalina de 0,01% (p/v) por dez dias a uma temperatura de 18ºC a 25ºC.
[00140] Em algumas modalidades, a preparação do vírus Zika é tra- tada com formalina de 0,005 a 0,02% (p/v) por oito a doze dias a uma temperatura de 22ºC. Em algumas modalidades, a preparação do vírus Zika é tratada com formalina de 0,005 a 0,02% (p/v) por nove a onze dias a uma temperatura de 22ºC. Em algumas modalidades, a prepa- ração do vírus Zika é tratada com formalina de 0,005 a 0,02% (p/v) por dez dias a uma temperatura de 22ºC. Em algumas modalidades, a preparação do vírus Zika é tratada com formalina de 0,008 a 0,015% (p/v) por oito a doze dias a uma temperatura de 22ºC. Em algumas modalidades, a preparação do vírus Zika é tratada com formalina de 0,008 a 0,015% (p/v) por nove a onze dias a uma temperatura de 22ºC. Em algumas modalidades, a preparação do vírus Zika é tratada com formalina de 0,008 a 0,015% (p/v) por dez dias a uma temperatu- ra de 22ºC. Em algumas modalidades, a preparação do vírus Zika é tratada com formalina de 0,01% (p/v) por oito a doze dias a uma tem- peratura de 22ºC. Em algumas modalidades, a preparação do vírus Zika é tratada com formalina de 0,01% (p/v) por nove a onze dias a uma temperatura de 22ºC. Em algumas modalidades, a preparação do vírus Zika é tratada com formalina de 0,01% (p/v) por dez dias a uma temperatura de 22ºC.
[00141] Considera-se que uma preparação de vírus Zika inteiro ina- tivado é obtível/obtida a partir de um método em que o vírus Zika é tra- tado com formaldeído em uma quantidade que varia de cerca de 0,02% p/v por 14 dias a uma temperatura de 22ºC. Em algumas moda- lidades, considera-se que uma preparação de vírus Zika inteiro inati- vado é obtível/obtida a partir de um método em que o vírus Zika é tra- tado com formaldeído em uma quantidade de cerca de 0,01% p/v por dias a uma temperatura de 22ºC.
[00142] Em algumas modalidades, o método envolve ainda neutra- lizar a formalina não reagida com uma quantidade eficaz de metabis- sulfito de sódio. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz de me- tabissulfito de sódio varia de cerca de 0,01 mM a cerca de 100 mM. Por exemplo, o metabissulfito de sódio pode ser adicionado a uma concentração eficaz de cerca de 0,01 mM a cerca de 100 mM, de cer- ca de 0,1 mM a cerca de 50 mM, de cerca de 0,5 mM a cerca de 20 MM ou de cerca de 1 mM a cerca de 10 mM, ou a uma concentração de cerca de 0,01mMM, cerca de 0,05mM, cerca de 0,IMM, cerca de 0,25mM, cerca de 0,5mM, cerca de 0,75mM, cerca de 1ImM, cerca de 2mM, cerca de 3mM, cerca de 4mM, cerca de 5mMM, cerca de 6mM, cerca de 7mMM, cerca de 8mMM, cerca de 9mM, cerca de 10mM, cerca de 20mM, cerca de 320mM cerca de 40mM, cerca de 50mMM, cerca de 75mM ou cerca de 100mM. Em algumas modalidades, a formalina é neutralizada com cerca de 2 mM de metabissulfito de sódio.
[00143] Em algumas modalidades, a preparação do vírus Zika é tra- tada com peróxido de hidrogênio. Em algumas modalidades, a prepa- ração do vírus Zika é tratada com peróxido de hidrogênio em concen- trações que variam de 0,1 a 3% ou 0,1 a 1% a qualquer temperatura de 20ºC a 30ºC por 5 a 120 minutos. Em algumas modalidades, a pre- paração do vírus Zika é tratada com peróxido de hidrogênio a uma concentração final de 0,01% por 60 minutos ou menos.
[00144] Em algumas modalidades, o método envolve (a) isolar a preparação do vírus Zika de uma ou mais células cultivadas in vitro que são usadas para produzir a preparação do vírus; (b) purificação da preparação do vírus por uma ou mais etapas de purificação; (c) tratar a preparação de vírus com uma quantidade eficaz de formalina; (d) neu- tralizar a preparação do vírus com uma quantidade eficaz de metabis- sulfito de sódio; e (e) preparar uma composição farmacêutica compre- endendo o vírus Zika inativado. Qualquer método de purificação de uma preparação de vírus conhecido na técnica pode ser empregado para isolar o vírus Zika, incluindo, sem limitação, por meio da filtração transversal de fluxo (CFF), cromatografia multimodal, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de troca aniônica, e/ou cromato- grafia de troca aniônica. Em algumas modalidades, a preparação do vírus é isolada por filtração por fluxo cruzado (CFF). Em algumas mo- dalidades, a preparação de vírus é purificada em um alto grau em uma quantidade que é de cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cer- ca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95% cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou mais.
[00145] Em algumas modalidades, o vírus Zika pode ser seleciona- do do grupo de cepas consistindo em cepas Mr 766, ArD 41519, IbH 30656, P6-740, EC Yap, FSS13025, ArD 7117, ArD 9957, ArD 30101, ArD 30156, ArD 30332, HD 78788, ArD 127707, ArD 127710, ArD 127984, ArD 127988, ArD 127994, ArD 128000, ArD 132912, 132915, ArD 141170, ArD 142623, ArD 149917, ArD 149810, ArD 149938, ArD 157995, ArD 158084, ArD 165522, ArD 165531, ArA 1465, ArA 27101, ArA 27290, ArA 27106, ArA 27096, ArA 27407, ArA 27433, ArAÃ 506/96, ArA 975-99, Ara 982-99, ArA 986-99, ArA 2718, ArB 1362, Nigeria68, Malaysia66, Kedougou84, Suriname, MR1429, PRVABC59, ECMN2007, DakAr41524, H/PF/2013, R103451, 103344, 8375, JMB-185, ZIKV/H, sapiens/Brazil/Natal/2015, SPH2015, ZIKV/Hu/Chiba/S36/2016, Thai- land SVO127/14, Philippine COC C0740, Brazil Fortaleza 2015 e Cu- ba2017.
[00146] Em certas modalidades, o vírus Zika inclui uma mutação na proteína não estrutural 1 do vírus Zika (NS1). Em algumas modalida- des, o vírus Zika contém uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a vacina ou composição imunogênica compreende um vírus Zika inteiro inativado purificado compreendendo uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, em que o vírus Zika é derivado da cepa PRVABC59. Em algumas modalida- des, a vacina ou composição imunogênica compreende um vírus Zika inteiro inativado purificado compreendendo uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, em que o vírus Zika é derivado da cepa PRVABC59 compreendendo a sequência genômica de acordo com a SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a vacina ou composição imunogênica compreende um Zika inteiro inativado purificado que dife- re da cepa PRVABC59 em uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1.
[00147] As vacinas e/ou composições imunogênicas da presente divulgação contendo um ou mais antígenos de pelo menos um vírus Zika inativado podem ser úteis para tratar ou prevenir a infecção pelo vírus Zika em um sujeito em necessidade do mesmo e/ou induzir uma resposta imune, como um resposta imune protetora contra o vírus Zika em um sujeito em necessidade do mesmo.
[00148] O método para inativar uma preparação de vírus Zika pode compreender ainda uma etapa (c) de determinar a integridade da inati- vação, conforme descrito abaixo. Determinando a integridade da inativação
[00149] Outros aspectos da presente divulgação referem-se a mé- todos para determinar a integridade da inativação de uma preparação de arbovírus usando a infecção sequencial de dois tipos de células di- ferentes. Este método tem um limite surpreendentemente baixo de de- tecção (LOD) em comparação com um ensaio que usa apenas um tipo de célula e também comparado a outros métodos, como o método TCID50. Além disso, este método evita o uso de animais para deter-
minar a infectividade do vírus inativado.
[00150] O método para determinar a integridade da inativação de uma preparação de arbovírus compreende as seguintes etapas: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma prepa- ração de arbovírus que foi submetida a uma etapa de inativação e in- cubar as células de inseto por um primeiro período de tempo, produ- zindo assim um sobrenadante de célula de inseto; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o so- brenadante de célula de inseto produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (ili) determinar se a preparação do vírus contém um ví- rus residual de replicação que produz um efeito citopático nas células dos mamíferos.
[00151] — Arbovírus são vírus que são transmitidos aos humanos por artrópodes. Eles incluem vírus dos gêneros flavivírus, togavírus e bun- iavírus. A preparação de arbovírus examinada pelo método aqui divul- gado contém um arbovírus que é capaz de infectar células de mamífe- ros, em particular células Vero, e causar um efeito citopático nessas células. Em algumas modalidades, o arbovírus é selecionado de um vírus Zika, um vírus do Nilo Ocidental, um vírus da Febre Amarela, um vírus da encefalite japonesa, um vírus da dengue, um vírus da encefa- lite de St. Louis, um vírus da encefalite transmitida por carrapatos, um vírus de Chikungunya, uma Vírus O'nyong'nyong ou um Mayarovírus. Em algumas modalidades, o arbovírus é um vírus Zika.
[00152] Em algumas modalidades, o vírus Zika pode ser seleciona- do do grupo de cepas consistindo em cepas Mr 766, ArD 41519, IbH 30656, P6-740, EC Yap, FSS13025, ArD 7117, ArD 9957, ArD 30101, ArD 30156, ArD 30332, HD 78788, ArD 127707, ArD 127710, ArD 127984, ArD 127988, ArD 127994, ArD 128000, ArD 132912, 132915, ArD 141170, ArD 142623, ArD 149917, ArD 149810, ArD 149938, ArD
157995, ArD 158084, ArD 165522, ArD 165531, ArA 1465, ArA 27101, ArA 27290, ArA 27106, ArA 27096, ArA 27407, ArA 27433, ArA 506/96, ArA 975-99, Ara 982-99, ArA 986-99, ArA 2718, ArB 1362, Nigeria68, Malaysia66, Kedougou84, Suriname, MR1429, PRVABC59, ECMN2007, DakAr41524, H/PF/2013, R103451, 103344, 8375, JMB-185, ZIKV/H, sapiens/Brazil/Natal/2015, SPH2015, ZIKV/Hu/Chiba/S36/2016, Thai- land SVO127/14, Philippine COC C0740, Brazil Fortaleza 2015 e Cu- ba2017.
[00153] Em certas modalidades, o vírus Zika inclui uma mutação na proteína não estrutural 1 do vírus Zika (NS1). Em algumas modalida- des, o vírus Zika contém uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a vacina ou composição imunogênica compreende um vírus Zika inteiro inativado purificado compreendendo uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, em que o vírus Zika é derivado da cepa PRVABC59. Em algumas modalida- des, a vacina ou composição imunogênica compreende um vírus Zika inteiro inativado purificado compreendendo uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, em que o vírus Zika é derivado da cepa PRVABC59 compreendendo a sequência genômica de acordo com a SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a vacina ou composição imunogênica compreende um Zika inteiro inativado purificado que dife- re da cepa PRVABC59 em uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1.
[00154] As células de insecto em cultura são inoculados com a pre- paração arbovírus, adicionando a preparação arbovírus para a cultura de células de insecto, que contém células de insecto e meio de cres- cimento. As células de insecto inoculadas são então incubadas duran-
te um primeiro período de tempo com a preparação arbovírus sob condições adequadas. Em algumas modalidades, o primeiro período de tempo é de três a sete dias. Em algumas modalidades, o primeiro período de tempo é de cinco a sete dias. Em algumas modalidades, o primeiro período de tempo é de seis dias. Portanto, em algumas moda- lidades, as células de inseto inoculadas são incubadas com a prepara- ção de arbovírus por três a sete dias. Em algumas modalidades, as células de inseto inoculadas são incubadas com a preparação do ar- bovírus por cinco a sete dias. Em algumas modalidades, as células de inseto inoculadas são incubadas com a preparação do arbovírus por seis dias. Durante a incubação, qualquer vírus vivo será secretado no sobrenadante das células de insetos.
[00155] As células de inseto utilizadas podem ser quaisquer células de inseto que podem ser infectadas pelo arbovírus a ser investigado e cuja viabilidade não é alterada pela infecção pelo vírus. As células de inseto são selecionadas de modo que o vírus não tenha efeito citopáti- co nas células. As células de inseto adequadas incluem, mas não es- tão limitadas a células CCL-125, células Aag-2, células RML-12, célu- las C6/36, células C7-10, células AP-61, células A.t. GRIP-1, células At. GRIP-2, células A.t. GRIP-3, células UM-AVE1, células Mos. 55, células Sua1B, células 4a-3B, células Mos. 42, células MSQ43, células LSB-AA695BB, células NIID-CTR e células TRA-171. Em algumas modalidades, as células de inseto são células C6/36.
[00156] O sobrenadante das células de inseto produzido por incu- bação das células de inseto com a preparação de arbovírus é então usado para inocular células de mamífero cultivadas. Para inoculação, o sobrenadante das células de inseto é transferido para as células de mamífero e incubado com as células de mamífero por 60 a 120 minu- tos ou por 80 a 100 minutos ou por 90 minutos. Após a inoculação, o meio de cultura de células é adicionado e as células de mamífero são incubadas com o sobrenadante das células de inseto por um segundo período de tempo, sob condições adequadas. Em algumas modalida- des, o segundo período de tempo é de três a 14 dias. Em algumas modalidades, o segundo período de tempo é de cinco a doze dias. Em algumas modalidades, o segundo período é de seis a dez dias. Em algumas modalidades, o segundo período de tempo é sete a nove di- as. Em algumas modalidades, o segundo período de tempo é de oito dias. Portanto, em algumas modalidades, as células de mamífero ino- culadas são incubadas com o sobrenadante de célula de inseto por três a 14 dias. Em algumas modalidades, as células de mamífero ino- culadas são incubadas com o sobrenadante da célula de inseto por cinco a doze dias. Em algumas modalidades, as células de mamífero inoculadas são incubadas com o sobrenadante da célula de inseto por sete a nove dias. Portanto, em algumas modalidades, as células de mamífero inoculadas são incubadas com o sobrenadante de célula de inseto por oito dias. Durante a incubação, qualquer vírus vivo exerce um efeito citopático nas células dos mamíferos. Durante a incubação, qualquer vírus residual replicante exercerá um efeito citopático nas cé- lulas dos mamíferos, como as células Vero.
[00157] As células de mamífero utilizadas podem ser quaisquer cé- lulas de mamífero que possam ser infectadas pelo arbovírus a ser in- vestigado e nas quais o vírus exerce um efeito citopático. As células de mamíferos adequadas incluem, mas não estão limitadas a células VERO, células LLC-MK2, células MDBK, células MDCK, células ATCC CCL34 MDCK (NBL2), células MDCK 33016 (número de depósito DSM ACC 2219, conforme descrito em WOS97/37001), células BHK21- F, células HKCC e células de ovário de hamster chinês (células CHO). Em algumas modalidades, as células de mamíferos são células Vero.
[00158] Em algumas modalidades, o método para determinar a in- tegridade da inativação de uma preparação de arbovírus compreende as seguintes etapas: (i) inocular células C6/36 com uma preparação de arbo- vírus que foi submetida a uma etapa de inativação e incubar as células C6/36 por um primeiro período de tempo, produzindo assim um sobre- nadante de células C6/36; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o so- brenadante de célula C6/36 produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (ili) determinar se a preparação do vírus contém um ví- rus residual de replicação que produz um efeito citopático nas células dos mamíferos.
[00159] Em algumas modalidades, o método para determinar a in- tegridade da inativação de uma preparação de arbovírus compreende as seguintes etapas: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma prepa- ração de arbovírus que foi submetida a uma etapa de inativação e in- cubar as células de inseto por um primeiro período de tempo, produ- zindo assim um sobrenadante de célula de inseto; (ii) inocular células Vero com o sobrenadante de célula de inseto produzido em (i) e incubar as células Vero por um segundo período de tempo; e (ili) determinar se a preparação do vírus contém um ví- rus residual de replicação que produz um efeito citopático nas células Vero.
[00160] Em algumas modalidades, o método para determinar a in- tegridade da inativação de uma preparação de arbovírus compreende as seguintes etapas: (i) inocular células C6/36 com uma preparação de arbo- vírus que foi submetida a uma etapa de inativação e incubar as células C6/36 por um primeiro período de tempo, produzindo assim um sobre-
nadante de células C6/36; (ii) inocular células Vero com o sobrenadante de célula C6/36 produzido em (i) e incubar as células Vero por um segundo pe- ríodo de tempo; e (ili) determinar se a preparação do vírus contém um ví- rus residual de replicação que produz um efeito citopático nas células Vero.
[00161] Em algumas modalidades, o método para determinar a in- tegridade da inativação de uma preparação de vírus Zika compreende as seguintes etapas: (i) inocular células C6/36 com uma preparação de arbo- vírus que foi submetida a uma etapa de inativação e incubar as células C6/36 por um primeiro período de tempo, produzindo assim um sobre- nadante de células C6/36; (ii) inocular células Vero com o sobrenadante de célula C6/36 produzido em (i) e incubar as células Vero por um segundo pe- ríodo de tempo; e (ili) determinar se a preparação do vírus contém um ví- rus residual de replicação que produz um efeito citopático nas células Vero.
[00162] Em algumas modalidades, o método para determinar a in- tegridade da inativação de uma preparação de vírus Zika compreende as seguintes etapas: (i) inocular células C6/36 com uma preparação de arbo- vírus que foi submetida a uma etapa de inativação e incubar as células C6/36 por três a sete dias, produzindo assim um sobrenadante de cé- lulas C6/36; (ii) inocular células Vero com o sobrenadante de célula C6/36 produzido em (i) e incubar as células Vero por um segundo pe- ríodo de tempo; e
(ili) determinar se a preparação do vírus contém um ví- rus residual de replicação que produz um efeito citopático nas células Vero.
[00163] Em algumas modalidades, o método para determinar a in- tegridade da inativação de uma preparação de vírus Zika compreende as seguintes etapas: (i) inocular células C6/36 com uma preparação de arbo- vírus que foi submetida a uma etapa de inativação e incubar as células C6/36 por um primeiro período de tempo, produzindo assim um sobre- nadante de células C6/36; (ii) inocular células Vero com o sobrenadante de células C6/36 produzido em (i) e incubar as células Vero por três a 14 dias; e (ili) determinar se a preparação do vírus contém um ví- rus residual de replicação que produz um efeito citopático nas células Vero.
[00164] Em algumas modalidades, o método para determinar a in- tegridade da inativação de uma preparação de vírus Zika compreende as seguintes etapas: (i) inocular células C6/36 com uma preparação de arbo- vírus que foi submetida a uma etapa de inativação e incubar as células C6/36 por três a sete dias, produzindo assim um sobrenadante de cé- lulas C6/36; (ii) inocular células Vero com o sobrenadante de células C6/36 produzido em (i) e incubar as células Vero por três a 14 dias; e (ili) determinar se a preparação do vírus contém um ví- rus residual de replicação que produz um efeito citopático nas células Vero.
[00165] Em algumas modalidades, o método para determinar a in- tegridade da inativação de uma preparação de vírus Zika compreende as seguintes etapas:
(i) inocular células C6/36 com uma preparação de arbo- vírus que foi submetida a uma etapa de inativação e incubar as células C6/36 por seis dias, produzindo assim um sobrenadante de células C6/36; (ii) inocular células Vero com o sobrenadante de células C6/36 produzido em (i) e incubar as células Vero por oito dias; e (ili) determinar se a preparação do vírus contém um ví- rus residual de replicação que produz um efeito citopático nas células Vero.
[00166] No final do segundo período de tempo, é determinado se a preparação de vírus tem um efeito citopático sobre as células de ma- mífero. Um efeito citopático é qualquer alteração na estrutura celular causada por invasão viral, infecção e brotamento das células durante a replicação viral. No método da presente divulgação, o efeito citopático é determinado por uma mudança na cor do meio de rosa para laranja ou amarelo, se as células forem cultivadas em um meio contendo ver- melho de fenol ou por um exame microscópico das células dos mamí- feros. Se o exame microscópico das células dos mamíferos mostrar que as células se arredondam, começam a se afastar do recipiente de cultura de tecidos (placa, poço ou balão) ou desaparecem da pla- ca/balão de cultura de tecidos, considera-se que existe um efeito cito- pático. Outros indícios de um efeito citopático incluem a fusão de célu- las adjacentes para formar sincícios e o aparecimento de corpos de inclusão nuclear ou citoplasmática.
[00167] Como discutido acima, o método aqui divulgado tem um limite muito baixo de detecção. Com este método, um teor de vírus in- ferior a 1,0 TCID5so pode ser detectado. Em algumas modalidades, um teor de vírus inferior a 0,8 TCIDso pode ser detectado. Em algumas modalidades, um teor de vírus inferior a 0,5 TCID5o pode ser detecta- do. Em algumas modalidades, um teor de vírus inferior a 0,2 TCID5so pode ser detectado. Em algumas modalidades, um teor de vírus inferi- or a 0,1 TCID5o pode ser detectado.
[00168] O método acima para determinar a integridade da inativa- ção pode ser usado em qualquer método de inativação de um arboví- rus. Em uma modalidade, o método para inativar uma preparação de arbovírus compreende: (a) isolar a preparação de arbovírus de uma ou mais células cultivadas in vitro, em que as células são usadas para produzir a pre- paração de arbovírus; (b) tratar a preparação de arbovírus com 0,005% a 0,02% p/v de formaldeído; (c) determinar a integridade da inativação por: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma prepa- ração de vírus tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as células de inseto por um primeiro período de tempo, produzindo assim um so- brenadante; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o so- brenadante produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação do arbovírus contém um vírus residual de replicação que produz um efeito citopático nas célu- las dos mamíferos.
[00169] Em uma modalidade, o método para inativar uma prepara- ção de arbovírus compreende: (a) isolar a preparação de arbovírus de uma ou mais células cultivadas in vitro, em que as células são usadas para produzir a pre- paração de arbovírus; (b) tratar a preparação de arbovírus com 0,0075% a 0,015% p/v de formaldeído; (c) determinar a integridade da inativação por:
(i) inocular células de inseto cultivadas com uma prepa- ração de vírus tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as células de inseto por um primeiro período de tempo, produzindo assim um so- brenadante; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o so- brenadante produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação do arbovírus contém um vírus residual de replicação que produz um efeito citopático nas célu- las dos mamíferos.
[00170] Em uma modalidade, o método para inativar uma prepara- ção de arbovírus compreende: (a) isolar a preparação de arbovírus de uma ou mais células cultivadas in vitro, em que as células são usadas para produzir a pre- paração de arbovírus; (b) tratar a preparação de arbovírus com 0,01% p/v de for- maldeído; (c) determinar a integridade da inativação por: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma prepa- ração de vírus tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as células de inseto por um primeiro período de tempo, produzindo assim um so- brenadante; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o so- brenadante produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação do arbovírus contém um vírus residual de replicação que produz um efeito citopático nas célu- las dos mamíferos.
[00171] Em uma modalidade, o método para inativar uma prepara- ção de arbovírus compreende:
(a) isolar a preparação de arbovírus de uma ou mais células cultivadas in vitro, em que as células são usadas para produzir a pre- paração de arbovírus; (b) tratar a preparação de arbovírus com 0,005% a 0,02% p/v de formaldeído por um período de oito a doze dias; (c) determinar a integridade da inativação por: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma prepa- ração de vírus tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as células de inseto por um primeiro período de tempo, produzindo assim um so- brenadante; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o so- brenadante produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação do arbovírus contém um vírus residual de replicação que produz um efeito citopático nas célu- las dos mamíferos.
[00172] Em uma modalidade, o método para inativar uma prepara- ção de arbovírus compreende: (a) isolar a preparação de arbovírus de uma ou mais células cultivadas in vitro, em que as células são usadas para produzir a pre- paração de arbovírus; (b) tratar a preparação de arbovírus com 0,0075% a 0,015% p/v de formaldeído por um período de oito a doze dias; (c) determinar a integridade da inativação por: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma prepa- ração de vírus tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as células de inseto por um primeiro período de tempo, produzindo assim um so- brenadante; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o so- brenadante produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação do arbovírus contém um vírus residual de replicação que produz um efeito citopático nas célu- las dos mamíferos.
[00173] Em uma modalidade, o método para inativar uma prepara- ção de arbovírus compreende: (a) isolar a preparação de arbovírus de uma ou mais células cultivadas in vitro, em que as células são usadas para produzir a pre- paração de arbovírus; (b) tratar a preparação de arbovírus com 0,01% p/v de for- maldeído por um período de oito a doze dias; (c) determinar a integridade da inativação por: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma prepa- ração de vírus tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as células de inseto por um primeiro período de tempo, produzindo assim um so- brenadante; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o so- brenadante produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação do arbovírus contém um vírus residual de replicação que produz um efeito citopático nas célu- las dos mamíferos.
[00174] Em uma modalidade, o método para inativar uma prepara- ção de arbovírus compreende: (a) isolar a preparação de arbovírus de uma ou mais células cultivadas in vitro, em que as células são usadas para produzir a pre- paração de arbovírus; (b) tratar a preparação de arbovírus com 0,005% a 0,02% p/v de formaldeído por um período de nove a onze dias; (c) determinar a integridade da inativação por:
(i) inocular células de inseto cultivadas com uma prepa- ração de vírus tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as células de inseto por um primeiro período de tempo, produzindo assim um so- brenadante; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o so- brenadante produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação do arbovírus contém um vírus residual de replicação que produz um efeito citopático nas célu- las dos mamíferos.
[00175] Em uma modalidade, o método para inativar uma prepara- ção de arbovírus compreende: (a) isolar a preparação de arbovírus de uma ou mais células cultivadas in vitro, em que as células são usadas para produzir a pre- paração de arbovírus; (b) tratar a preparação de arbovírus com 0,0075% a 0,015% p/v de formaldeído por um período de nove a onze dias; (c) determinar a integridade da inativação por: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma prepa- ração de vírus tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as células de inseto por um primeiro período de tempo, produzindo assim um so- brenadante; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o so- brenadante produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação do arbovírus contém um vírus residual de replicação que produz um efeito citopático nas célu- las dos mamíferos.
[00176] Em uma modalidade, o método para inativar uma prepara- ção de arbovírus compreende:
(a) isolar a preparação de arbovírus de uma ou mais células cultivadas in vitro, em que as células são usadas para produzir a pre- paração de arbovírus; (b) tratar a preparação de arbovírus com 0,01% p/v de for- maldeído por um período de nove a onze dias; (c) determinar a integridade da inativação por: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma prepa- ração de vírus tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as células de inseto por um primeiro período de tempo, produzindo assim um so- brenadante; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o so- brenadante produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação do arbovírus contém um vírus residual de replicação que produz um efeito citopático nas célu- las dos mamíferos.
[00177] Em uma modalidade, o método para inativar uma prepara- ção de arbovírus compreende: (a) isolar a preparação de arbovírus de uma ou mais células cultivadas in vitro, em que as células são usadas para produzir a pre- paração de arbovírus; (b) tratar a preparação de arbovírus com 0,005% a 0,02% p/v de formaldeído por um período de dez dias; (c) determinar a integridade da inativação por: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma prepa- ração de vírus tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as células de inseto por um primeiro período de tempo, produzindo assim um so- brenadante; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o so- brenadante produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação do arbovírus contém um vírus residual de replicação que produz um efeito citopático nas célu- las dos mamíferos.
[00178] Em uma modalidade, o método para inativar uma prepara- ção de arbovírus compreende: (a) isolar a preparação de arbovírus de uma ou mais células cultivadas in vitro, em que as células são usadas para produzir a pre- paração de arbovírus; (b) tratar a preparação de arbovírus com 0,0075% a 0,015% p/v de formaldeído por um período de dez dias; (c) determinar a integridade da inativação por: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma prepa- ração de vírus tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as células de inseto por um primeiro período de tempo, produzindo assim um so- brenadante; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o so- brenadante produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação do arbovírus contém um vírus residual de replicação que produz um efeito citopático nas célu- las dos mamíferos.
[00179] Em uma modalidade, o método para inativar uma prepara- ção de arbovírus compreende: (a) isolar a preparação de arbovírus de uma ou mais células cultivadas in vitro, em que as células são usadas para produzir a pre- paração de arbovírus; (b) tratar a preparação de arbovírus com 0,01% p/v de for- maldeído por um período de dez dias; (c) determinar a integridade da inativação por:
(i) inocular células de inseto cultivadas com uma prepa- ração de vírus tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as células de inseto por um primeiro período de tempo, produzindo assim um so- brenadante; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o so- brenadante produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação do arbovírus contém um vírus residual de replicação que produz um efeito citopático nas célu- las dos mamíferos.
[00180] Em algumas modalidades, o método para inativar uma pre- paração de arbovírus compreende: (a) isolar a preparação de arbovírus de uma ou mais células cultivadas in vitro, em que as células são usadas para produzir a pre- paração de arbovírus; (b) tratar a preparação de arbovírus com 0,1 a 3% de peró- xido de hidrogênio a uma temperatura de 20ºC a 30ºC por 5 a 120 mi- nutos; (c) determinar a integridade da inativação por: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma prepa- ração de vírus tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as células de inseto por um primeiro período de tempo, produzindo assim um so- brenadante; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o so- brenadante produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação do arbovírus contém um vírus residual de replicação que produz um efeito citopático nas célu- las dos mamíferos.
[00181] Em algumas modalidades, o método para inativar uma pre-
paração de arbovírus compreende: (a) isolar a preparação de arbovírus de uma ou mais células cultivadas in vitro, em que as células são usadas para produzir a pre- paração de arbovírus; (b) tratar a preparação de arbovírus com peróxido de hidro- gênio a 0,01% a uma temperatura de 20ºC a 30ºC por 60 minutos; (c) determinar a integridade da inativação por: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma prepa- ração de vírus tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as células de inseto por um primeiro período de tempo, produzindo assim um so- brenadante; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o so- brenadante produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação do arbovírus contém um vírus residual de replicação que produz um efeito citopático nas célu- las dos mamíferos.
[00182] O método acima para determinar a integridade da inativa- ção pode ser usado em qualquer método de inativação de um vírus Zika. Em uma modalidade, o método para inativar uma preparação de vírus Zika compreende: (a) isolar a preparação de vírus Zika de uma ou mais célu- las cultivadas in vitro, em que as células são usadas para produzir a preparação de vírus Zika; (b) tratar a preparação do vírus Zika com 0,005% a 0,02% p/v de formaldeído; (c) determinar a integridade da inativação por: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma prepa- ração de vírus Zika tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as cé- lulas de inseto por um primeiro período de tempo, produzindo assim um sobrenadante; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o so- brenadante produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação do vírus Zika contém um vírus residual de replicação que produz um efeito citopático nas células dos mamíferos.
[00183] Em uma modalidade, o método para inativar uma prepara- ção de vírus Zika compreende: (a) isolar a preparação de vírus Zika de uma ou mais célu- las cultivadas in vitro, em que as células são usadas para produzir a preparação de vírus Zika; (b) tratar a preparação do vírus Zika com 0,005% a 0,02% p/v de formaldeído; (c) determinar a integridade da inativação por: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma prepa- ração de vírus tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as células de inseto por um primeiro período de tempo, produzindo assim um so- brenadante; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o so- brenadante produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação do vírus Zika contém um vírus residual de replicação que produz um efeito citopático nas células dos mamíferos.
[00184] Em uma modalidade, o método para inativar uma prepara- ção de vírus Zika compreende: (a) isolar a preparação de vírus Zika de uma ou mais célu- las cultivadas in vitro, em que as células são usadas para produzir a preparação de vírus Zika;
(b) tratar a preparação do vírus Zika com 0,0075% a 0,015% p/v de formaldeído; (c) determinar a integridade da inativação por: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma prepa- ração de vírus tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as células de inseto por um primeiro período de tempo, produzindo assim um so- brenadante; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o so- brenadante produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação do vírus Zika contém um vírus residual de replicação que produz um efeito citopático nas células dos mamíferos.
[00185] Em uma modalidade, o método para inativar uma prepara- ção de vírus Zika compreende: (a) isolar a preparação de vírus Zika de uma ou mais célu- las cultivadas in vitro, em que as células são usadas para produzir a preparação de vírus Zika; (b) tratar a preparação do vírus Zika com 0,01% p/v de for- maldeído; (c) determinar a integridade da inativação por: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma prepa- ração de vírus tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as células de inseto por um primeiro período de tempo, produzindo assim um so- brenadante; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o so- brenadante produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação do vírus Zika contém um vírus residual de replicação que produz um efeito citopático nas células dos mamíferos.
[001868] Em uma modalidade, o método para inativar uma prepara- ção de vírus Zika compreende: (a) isolar a preparação de vírus Zika de uma ou mais célu- las cultivadas in vitro, em que as células são usadas para produzir a preparação de vírus Zika; (b) tratar a preparação de vírus Zika com 0,005% a 0,02% p/v de formaldeído por um período de oito a doze dias; (c) determinar a integridade da inativação por: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma prepa- ração de vírus tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as células de inseto por um primeiro período de tempo, produzindo assim um so- brenadante; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o so- brenadante produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação do vírus Zika contém um vírus residual de replicação que produz um efeito citopático nas células dos mamíferos.
[00187] Em uma modalidade, o método para inativar uma prepara- ção de vírus Zika compreende: (a) isolar a preparação de vírus Zika de uma ou mais célu- las cultivadas in vitro, em que as células são usadas para produzir a preparação de vírus Zika; (b) tratar a preparação de vírus Zika com 0,0075% a 0,015% p/v de formaldeído por um período de oito a doze dias; (c) determinar a integridade da inativação por: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma prepa- ração de vírus tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as células de inseto por um primeiro período de tempo, produzindo assim um so-
brenadante; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o so- brenadante produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação do vírus Zika contém um vírus residual de replicação que produz um efeito citopático nas células dos mamíferos.
[00188] Em uma modalidade, o método para inativar uma prepara- ção de vírus Zika compreende: (a) isolar a preparação de vírus Zika de uma ou mais célu- las cultivadas in vitro, em que as células são usadas para produzir a preparação de vírus Zika; (b) tratar a preparação de vírus Zika com 0,01% p/v de for- maldeído por um período de oito a doze dias; (c) determinar a integridade da inativação por: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma prepa- ração de vírus tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as células de inseto por um primeiro período de tempo, produzindo assim um so- brenadante; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o so- brenadante produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação do vírus Zika contém um vírus residual de replicação que produz um efeito citopático nas células dos mamíferos.
[00189] Em uma modalidade, o método para inativar uma prepara- ção de vírus Zika compreende: (a) isolar a preparação de vírus Zika de uma ou mais célu- las cultivadas in vitro, em que as células são usadas para produzir a preparação de vírus Zika;
(b) tratar a preparação de vírus Zika com 0,005% a 0,02% p/v de formaldeído por um período de nove a onze dias; (c) determinar a integridade da inativação por: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma prepa- ração de vírus tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as células de inseto por um primeiro período de tempo, produzindo assim um so- brenadante; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o so- brenadante produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação do vírus Zika contém um vírus residual de replicação que produz um efeito citopático nas células dos mamíferos.
[00190] Em uma modalidade, o método para inativar uma prepara- ção de vírus Zika compreende: (a) isolar a preparação de vírus Zika de uma ou mais célu- las cultivadas in vitro, em que as células são usadas para produzir a preparação de vírus Zika; (b) tratar a preparação de vírus Zika com 0,0075% a 0,015% p/v de formaldeído por um período de nove a onze dias; (c) determinar a integridade da inativação por: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma prepa- ração de vírus tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as células de inseto por um primeiro período de tempo, produzindo assim um so- brenadante; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o so- brenadante produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação do vírus Zika contém um vírus residual de replicação que produz um efeito citopático nas células dos mamíferos.
[00191] Em uma modalidade, o método para inativar uma prepara- ção de vírus Zika compreende: (a) isolar a preparação de vírus Zika de uma ou mais célu- las cultivadas in vitro, em que as células são usadas para produzir a preparação de vírus Zika; (b) tratar a preparação de vírus Zika com 0,01% p/v de for- maldeído por um período de nove a onze dias; (c) determinar a integridade da inativação por: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma prepa- ração de vírus tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as células de inseto por um primeiro período de tempo, produzindo assim um so- brenadante; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o so- brenadante produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação do vírus Zika contém um vírus residual de replicação que produz um efeito citopático nas células dos mamíferos.
[00192] Em uma modalidade, o método para inativar uma prepara- ção de vírus Zika compreende: (a) isolar a preparação de vírus Zika de uma ou mais célu- las cultivadas in vitro, em que as células são usadas para produzir a preparação de vírus Zika; (b) tratar a preparação de vírus Zika com 0,005% a 0,02% p/v de formaldeído por um período de dez dias; (c) determinar a integridade da inativação por: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma prepa- ração de vírus tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as células de inseto por um primeiro período de tempo, produzindo assim um so-
brenadante; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o so- brenadante produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação do vírus Zika contém um vírus residual de replicação que produz um efeito citopático nas células dos mamíferos.
[00193] Em uma modalidade, o método para inativar uma prepara- ção de vírus Zika compreende: (a) isolar a preparação de vírus Zika de uma ou mais célu- las cultivadas in vitro, em que as células são usadas para produzir a preparação de vírus Zika; (b) tratar a preparação de vírus Zika com 0,0075% a 0,015% p/v de formaldeído por um período de dez dias; (c) determinar a integridade da inativação por: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma prepa- ração de vírus tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as células de inseto por um primeiro período de tempo, produzindo assim um so- brenadante; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o so- brenadante produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação do vírus Zika contém um vírus residual de replicação que produz um efeito citopático nas células dos mamíferos.
[00194] Em uma modalidade, o método para inativar uma prepara- ção de vírus Zika compreende: (a) isolar a preparação de vírus Zika de uma ou mais célu- las cultivadas in vitro, em que as células são usadas para produzir a preparação de vírus Zika;
(b) tratar a preparação de arbovírus com 0,01% p/v de for- maldeído por um período de dez dias; (c) determinar a integridade da inativação por: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma prepa- ração de vírus tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as células de inseto por um primeiro período de tempo, produzindo assim um so- brenadante; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o so- brenadante produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação do vírus Zika contém um vírus residual de replicação que produz um efeito citopático nas células dos mamíferos.
[00195] Em algumas modalidades, o método de inativar uma prepa- ração de vírus Zika compreende: (a) isolar a preparação de vírus Zika de uma ou mais célu- las cultivadas in vitro, em que as células são usadas para produzir a preparação de vírus Zika; (b) tratar a preparação de vírus Zika com 0,1 a 3% de peró- xido de hidrogênio a uma temperatura de 20ºC a 30ºC por 5 a 120 mi- nutos; (c) determinar a integridade da inativação por: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma prepa- ração de vírus Zika tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as cé- lulas de inseto por um primeiro período de tempo, produzindo assim um sobrenadante; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o so- brenadante produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação do vírus Zika contém um vírus residual de replicação que produz um efeito citopático nas células dos mamíferos.
[00196] Em algumas modalidades, o método de inativar uma prepa- ração de vírus Zika compreende: (a) isolar a preparação de vírus Zika de uma ou mais célu- las cultivadas in vitro, em que as células são usadas para produzir a preparação de vírus Zika; (b) tratar a preparação de vírus Zika com peróxido de hi- drogênio a 0,01% a uma temperatura de 20ºC a 30ºC por 60 minutos; (c) determinar a integridade da inativação por: (i) inocular células de inseto com uma preparação de vírus Zika tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as células de inseto por um primeiro período de tempo, produzindo assim um sobre- nadante; (ii) inocular células de mamífero com o sobrenadante produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação do vírus Zika contém um vírus residual de replicação que produz um efeito citopático nas células dos mamíferos.
[00197] Em algumas modalidades, o método de inativar uma prepa- ração de vírus Zika compreende: (a) isolar a preparação de vírus Zika de uma ou mais célu- las cultivadas in vitro, em que as células são usadas para produzir a preparação de vírus Zika; (b) tratar a preparação de vírus de Zika com 0,05% de for- malina, a uma temperatura de 20ºC a 30ºC, tal como 22ºC, durante sete dias; (c) determinar a integridade da inativação por: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma prepa-
ração de vírus Zika tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as cé- lulas de inseto por um primeiro período de tempo, produzindo assim um sobrenadante; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o so- brenadante produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (ili) determinar se a preparação do vírus contém um ví- rus residual de replicação que produz um efeito citopático nas células dos mamíferos.
[00198] Em algumas modalidades, as células são células não hu- manas. As células de mamíferos não humanos adequadas incluem, mas não estão limitadas a células VERO, células LLC-MK2, células MDBK, células MDCK, células ATCC CCL34 MDCK (NBL2), células MDCK 33016 (número de depósito DSM ACC 2219, conforme descrito em WOS97/37001), células BHK21-F, células HKCC e células de ovário de hamster chinês (células CHO). Em algumas modalidades, as célu- las de mamíferos são células Vero. Composições Farmacêuticas
[00199] “Outros aspectos da presente divulgação referem-se a com- posições farmacêuticas compreendendo um vírus Zika inativado que é obtido pelos métodos aqui divulgados. Estas composições farmacêuti- cas têm um particularmente baixo teor de formaldeído residual. Sem desejar estar vinculado a nenhuma teoria em particular, postula-se que o baixo teor de formaldeído residual reduz o risco de um sujeito de- senvolver efeitos adversos.
[00200] O termo "teor de formaldeído residual" refere-se à quanti- dade de formaldeído, que ainda está presente na composição farma- cêutica, após o vírus Zika ter sido inativado e a preparação foi neutrali- zada e, opcionalmente, submetida a uma ou mais uma ou mais etapas adicionais de purificação ou filtração. De acordo com a US Pharmaco-
peia o limite superior para o formaldeído residual em vacinas compre- endendo bactérias ou vírus inativado é de 0,02%, o que é equivalente a 100 pg/ml formaldeído.
[00201] O teor de formaldeído residual pode ser determinado por qualquer método conhecido para o versado na técnica. Um método adequado é descrito em EMEA, VICH Topic GL25, Biologicals: Testing of residual formaldehyde, 30 April 2002 e envolve o uso de Cloridrato de metilbenzotiazolona hidrazona (MBTH). Outros métodos incluem titulação de acetil acetona, titulação de cloreto férrico e teste básico de fucsina. Um método particularmente adequado é descrito aqui.
[00202] A composição farmacêutica está em uma forma que pode ser administrada a um sujeito e tipicamente contém um ou mais exci- pientes farmaceuticamente aceitáveis.
[00203] O teor de formaldeído residual na composição farmacêutica é inferior a 50 ug/ml. Numa modalidade, o teor residual de formaldeído na composição farmacêutica é inferior a 45 pg/ml, inferior a 40 pg/ml, inferior a 35 pg/ml, inferior a 30 pg/ml, inferior a 25 ug/ml, inferior a 20 ng/ml, inferior a 15 ug/ml ou inferior a 10 ug/ml. Numa modalidade, o teor residual de formaldeído na composição farmacêutica é inferior a 9,5 pg/ml, inferior a 9 ug/ml, inferior a 8,5 ug/ml, inferior a 8 ug/ml, infe- rior a 7,5 pg/ml, inferior a 7 pg/ml, inferior a 6,5 pg/ml, inferior a 6 ng/ml, inferior a 5,5 ug/ml, inferior a 5 pg/ml, inferior a 4,5 pg/ml, inferi- or a 4 ugíml, inferior a 3,5 pg/ml, inferior a 3 ug/ml, inferior a 2,5 pg/ml, inferior a 2 ug/ml, inferior a 1,5 pg/ml, inferior a 1 ug/ml ou inferior a 0,5 pg/ml. Numa modalidade, o teor residual de formaldeído na composi- ção farmacêutica é inferior a 0,5 ug/ml. Métodos de determinação de teor de formaldeído residual
[00204] Outros aspectos da presente divulgação se relacionam com um método para determinar o teor residual de formaldeído em uma composição farmacêutica compreendendo um vírus inativado, com-
preendendo as etapas de: (a) proporcionar uma composição compreendendo um vírus que foi tratado com formaldeído; (b) misturar a composição de (a) com ácido fosfórico e 2,4- dinitrofenil-hidrazina (DNPH), proporcionando assim uma mistura; (c) incubar a mistura de (b) sob condições adequadas; e (d) analisar a mistura para a presença de formaldeído resi- dual.
[00205] O usodo DNPH como reagente de detecção oferece as se- guintes vantagens: (1) alta sensitividade, (2) detecção por UV do for- maldeído derivado e (3) preparação da amostra em uma etapa sem aquecimento. O presente método é particularmente adequado para detectar formaldeído residual em vacinas contendo um adjuvante co- mo o hidróxido de alumínio. O método foi validado em termos de es- pecificidade, linearidade, precisão, repetibilidade, robustez e estabili- dade, de acordo com as diretrizes Q2 da Conferência Internacional sobre Harmonização (ICH).
[00206] A composição compreendendo um vírus que foi tratada com formaldeído pode compreender ainda um adjuvante. Numa moda- lidade, o adjuvante é hidróxido de alumínio. Numa modalidade, a com- posição compreendendo um vírus que foi tratado com formaldeído compreende 0,1 mg/ml a 1,0 mg/ml de hidróxido de alumínio como ad- juvante. Numa modalidade, a composição compreendendo um vírus que foi tratado com formaldeído compreende 0,2 mg/ml a 0,9 mg/ml de hidróxido de alumínio como adjuvante. Numa modalidade, a composi- ção compreendendo um vírus que foi tratado com formaldeído com- preende 0,3 mg/ml a 0,8 mg/ml de hidróxido de alumínio como adju- vante. Numa modalidade, a composição compreendendo um vírus que foi tratado com formaldeído compreende 0,3 mg/ml a 0,7 mg/ml de hi- dróxido de alumínio como adjuvante. Numa modalidade, a composição compreendendo um vírus que foi tratado com formaldeído compreende 0,3 mg/ml a 0,6 mg/ml de hidróxido de alumínio como adjuvante. Nu- ma modalidade, a composição compreendendo um vírus que foi trata- do com formaldeído compreende 0,3 mg/ml a 0,5 mg/ml de hidróxido de alumínio como adjuvante. Numa modalidade, a composição com- preendendo um vírus que foi tratado com formaldeído compreende 0,4 mg/ml de hidróxido de alumínio como adjuvante.
[00207] Em algumas modalidades, 50 partes da composição com- preendendo um vírus que foi tratado com formaldeído são misturadas com 1 parte de 15 a 25% (v/v) de ácido fosfórico e 2,5 partes de 0,9 a 1,1 mg/ml de DNPH. Em algumas modalidades, 50 partes da composi- ção compreendendo um vírus que foi tratado com formaldeído são misturadas com 1 parte de ácido fosfórico a 20% (v/v) e 2,5 partes de 1,0 mg/ml de DNPH. Em algumas modalidades, 1 ml da composição compreendendo um vírus que foi tratado com formaldeído é misturado com 20 ul de ácido fosfórico a 20% (v/v) e 50 ul de DNPH a 1,0 mg/ml.
[00208] Em algumas modalidades, a mistura da composição com- preendendo um vírus que foi tratado com formaldeído com ácido fosfó- rico e DNPH é incubada a uma temperatura de 18ºC a 30ºC. Em al- gumas modalidades, a mistura da composição compreendendo um vírus que foi tratado com formaldeído com ácido fosfórico e DNPH é incubada a uma temperatura de 20ºC a 25ºC. Em algumas modalida- des, a mistura da composição compreendendo um vírus que foi tratado com formaldeído com ácido fosfórico e DNPH é incubada a uma tem- peratura de 22ºC.
[00209] Em algumas modalidades, a mistura da composição com- preendendo um vírus que foi tratado com formaldeído com ácido fosfó- rico e DNPH é incubada por 10 a 30 minutos. Em algumas modalida- des, a mistura da composição compreendendo um vírus que foi tratado com formaldeído com ácido fosfórico e DNPH é incubada por 15 a 25 minutos. Em algumas modalidades, a mistura da composição compre- endendo um vírus que foi tratado com formaldeído com ácido fosfórico e DNPH é incubada por 20 minutos.
[00210] Em algumas modalidades, a mistura da composição com- preendendo um vírus que foi tratado com formaldeído com ácido fosfó- rico e DNPH é incubada a uma temperatura de 18ºC a 30ºC por 10 a 30 minutos. Em algumas modalidades, a mistura da composição com- preendendo um vírus que foi tratado com formaldeído com ácido fosfó- rico e DNPH é incubada a uma temperatura de 18ºC a 30ºC por 15 a minutos. Em algumas modalidades, a mistura da composição com- preendendo um vírus que foi tratado com formaldeído com ácido fosfó- rico e DNPH é incubada a uma temperatura de 18ºC a 30ºC por 20 minutos.
[00211] Em algumas modalidades, a mistura da composição com- preendendo um vírus que foi tratado com formaldeído com ácido fosfó- rico e DNPH é incubada a uma temperatura de 20ºC a 25ºC por 10 a minutos. Em algumas modalidades, a mistura da composição com- preendendo um vírus que foi tratado com formaldeído com ácido fosfó- rico e DNPH é incubada a uma temperatura de 20ºC a 25ºC por 15 a 25 minutos. Em algumas modalidades, a mistura da composição com- preendendo um vírus que foi tratado com formaldeído com ácido fosfó- rico e DNPH é incubada a uma temperatura de 20ºC a 25ºC por 20 minutos.
[00212] Em algumas modalidades, a mistura da composição com- preendendo um vírus que foi tratado com formaldeído com ácido fosfó- rico e DNPH é incubada a uma temperatura de 22ºC por 10 a 30 minu- tos. Em algumas modalidades, a mistura da composição compreen- dendo um vírus que foi tratado com formaldeído com ácido fosfórico e DNPH é incubada a uma temperatura de 22ºC por 15 a 25 minutos. Em algumas modalidades, a mistura da composição compreendendo um vírus que foi tratado com formaldeído com ácido fosfórico e DNPH é incubada a uma temperatura de 22ºC por 20 minutos.
[00213] Em algumas modalidades, a mistura de 50 partes da com- posição compreendendo um vírus que foi tratado com formaldeído com 1 parte de ácido fosfórico a 20% e 2,5 partes de 1,0 mg/ml de DNPH é incubada a uma temperatura de 18ºC a 30ºC por 10 a 30 mi- nutos. Em algumas modalidades, a mistura de 50 partes da composi- ção compreendendo um vírus que foi tratado com formaldeído com 1 parte de ácido fosfórico a 20% e 2,5 partes de 1,0 mg/ml de DNPH é incubada a uma temperatura de 18ºC a 30ºC por 15 a 25 minutos. Em algumas modalidades, a mistura de 50 partes da composição compre- endendo um vírus que foi tratado com formaldeído com 1 parte de áci- do fosfórico a 20% e 2,5 partes de 1,0 mg/ml de DNPH é incubada a uma temperatura de 18ºC a 30ºC por 20 minutos.
[00214] Em algumas modalidades, a mistura de 50 partes da com- posição compreendendo um vírus que foi tratado com formaldeído com 1 parte de ácido fosfórico a 20% e 2,5 partes de 1,0 mg/ml de DNPH é incubada a uma temperatura de 20ºC a 25ºC por 10 a 30 mi- nutos. Em algumas modalidades, a mistura de 50 partes da composi- ção compreendendo um vírus que foi tratado com formaldeído com 1 parte de ácido fosfórico a 20% e 2,5 partes de 1,0 mg/ml de DNPH é incubada a uma temperatura de 20ºC a 25ºC por 15 a 25 minutos. Em algumas modalidades, a mistura de 50 partes da composição compre- endendo um vírus que foi tratado com formaldeído com 1 parte de áci- do fosfórico a 20% e 2,5 partes de 1,0 mg/ml de DNPH é incubada a uma temperatura de 20ºC a 25ºC por 20 minutos.
[00215] Em algumas modalidades, a mistura de 50 partes da com- posição compreendendo um vírus que foi tratado com formaldeído com 1 parte de ácido fosfórico a 20% e 2,5 partes de 1,0 mg/ml de DNPH é incubada a uma temperatura de 22ºC por 10 a 30 minutos.
Em algumas modalidades, a mistura de 50 partes da composição compreendendo um vírus que foi tratado com formaldeído com 1 parte de ácido fosfórico a 20% e 2,5 partes de 1,0 mg/ml de DNPH é incu- bada a uma temperatura de 22ºC por 15 a 25 minutos. Em algumas modalidades, a mistura de 50 partes da composição compreendendo um vírus que foi tratado com formaldeído com 1 parte de ácido fosfóri- co a 20% e 2,5 partes de 1,0 mg/ml de DNPH é incubada a uma tem- peratura de 22ºC por 20 minutos.
[00216] Após a incubação, a mistura da composição compreenden- do um vírus que foi tratado com formaldeído com ácido fosfórico e DNPH pode ser analisada por qualquer método adequado. Numa mo- dalidade, após a incubação, a mistura da composição compreendendo um vírus que foi tratado com formaldeído com ácido fosfórico e DNPH é analisada por HPLC. Numa modalidade, após a incubação, a mistura da composição compreendendo um vírus que foi tratado com formal- deído com ácido fosfórico e DNPH é analisada por HPLC de fase re- versa. Numa modalidade, o ligando da coluna HPLC de fase reversa é selecionado de C18, n-butal, n-octil, fenil e cianopropil. Numa modali- dade, o ligando da coluna HPLC de fase reversa é C18. Numa modali- dade, uma mistura de água e acetonitrila (1:1, v/v) é usada como a fa- se móvel na HPLC de fase reversa. Numa modalidade, o comprimento de onda de detecção é de 360 nm.
[00217] Em uma modalidade, a presente divulgação fornece um método para determinar o teor residual de formaldeído em uma com- posição farmacêutica compreendendo um vírus inativado, compreen- dendo as etapas de: (a) proporcionar uma composição compreendendo um vírus que foi tratado com formaldeído; (b) misturar 50 partes da composição de (a) com 1 parte de ácido fosfórico a 20% e 2,5 partes de 1 mg/ml de 2,4-dinitrofenil-
hidrazina (DNPH), proporcionando assim uma mistura; (c) incubar a mistura de (b) por 20 minutos em temperatura ambiente; e (d) analisar a mistura quanto à presença de formaldeído residual por HPLC de fase reversa usando uma coluna C18 e uma mistura de água e acetonitrila (1:1, v/v) como fase móvel.
[00218] Em uma modalidade, a presente divulgação fornece um método para determinar o teor residual de formaldeído em uma com- posição farmacêutica compreendendo um vírus Zika inativado, com- preendendo as etapas de: (a) proporcionar uma composição compreendendo um vírus Zika que foi tratado com formaldeído; (b) misturar 50 partes da composição de (a) com 1 parte de ácido fosfórico a 20% e 2,5 partes de 1 mg/ml de 2,4-dinitrofenil- hidrazina (DNPH), proporcionando assim uma mistura; (c) incubar a mistura de (b) por 20 minutos em temperatura ambiente; e (d) analisar a mistura quanto à presença de formaldeído residual por HPLC de fase reversa usando uma coluna C18 e uma mistura de água e acetonitrila (1:1, v/v) como fase móvel.
Adjuvantes
[00219] Outros aspectos da presente divulgação referem-se a vaci- nas contra o vírus Zika e/ou composições imunogênicas contendo um ou mais antígenos de pelo menos um vírus Zika aqui descrito em combinação com um ou mais adjuvantes. Em algumas modalidades, as vacinas e/ou composições imunogênicas contêm um vírus Zika in- teiro inativado purificado, como um vírus Zika com uma mutação que é uma substituição de triptofano por glicina na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, como descrito aqui em combinação com um ou mais adjuvan-
tes. Em algumas modalidades, a vacina ou composição imunogênica compreende um vírus Zika inteiro inativado purificado compreendendo uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, em que o ví- rus Zika é derivado da cepa PRVABC59 em combinação com um ou mais adjuvantes. Em algumas modalidades, a vacina ou composição imunogênica compreende um vírus Zika inteiro inativado purificado compreendendo uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, em que o vírus Zika é derivado da cepa PRVABC59 compreendendo a sequência genômica de acordo com a SEQ ID NO: 2 em combinação com um ou mais adjuvantes. Numa modalidade, as vacinas e compo- sições imunogênicas contêm um isolado de vírus de Zika clonal purifi- cado em placa em combinação com um ou mais adjuvantes. Tais va- cinas adjuvantes e/ou composições imunogênicas da presente divul- gação podem ser úteis, por exemplo, para tratar ou prevenir a infecção pelo vírus Zika em um indivíduo em necessidade do mesmo e/ou in- duzir uma resposta imune, como uma resposta imune protetora, contra o vírus Zika em um sujeito em necessidade do mesmo.
[00220] São conhecidos vários métodos para alcançar um efeito adjuvante para vacinas e podem ser utilizados em conjunto com as vacinas contra o vírus Zika e/ou composições imunogênicas aqui di- vulgadas. Os princípios e métodos gerais são detalhados em "The Theory and Practical Application of Adjuvants", 1995, Duncan E. S. Stewart-Tull (ed.), John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6, e também em "Vaccines: New Generation Immunological Adjuvants", 1995, Gregoriadis G et al. (eds.), Plenum Press, New York, ISBN 0- 306-45283-9.
[00221] —Adjuvantes exemplificativos podem incluir, mas não estão limitados a, sais de alumínio, fosfato de cálcio, agonistas do receptor de pedágio (TLR), monofosforil lipídeo A (MLA), derivados de MLA, lipídeo sintético A, miméticos ou análogos de lipídeo A, citocinas, sa- poninas, derivados de dipeptídeo muramil (MDP), oligos CpG, lipopo- lissacarídeo (LPS) de bactérias gram-negativas, polifosfazenos, emul- sões (emulsões de óleo), quitosana, vitamina D, estearil ou octadecil tirosina, virossomas, cocleados, poly(lactide-co-glycolides) (PLG) mi- cropartículas, partículas poloxâmero, micropartículas, lipossomas, Ad- juvante Completo de Freund (CFA), e Adjuvante Incompleto de Freund (IFA). Em algumas modalidades, o adjuvante é um sal de alumínio.
[00222] Em algumas modalidades, o adjuvante inclui pelo menos um de alúmen, fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio, sulfato de alumínio e potássio e Alhydrogel 85. Em algumas modalidades, verifi- cou-se que os adjuvantes de sal de alumínio da presente divulgação aumentam a adsorção dos antígenos das vacinas contra o vírus do Zika e/ou composições imunogênicas da presente divulgação. Por conseguinte, em algumas modalidades, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cer- ca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo me- nos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou cerca de 100% do antígeno são adsorvidos no adjuvante de sal de alumínio.
[00223] Certas modalidades da presente divulgação incluem um método para preparar uma vacina ou composição imunogênica adju- vante do vírus Zika, que envolve (a) misturar a vacina ou composição imunogênica com um adjuvante de sal de alumínio, com a vacina ou composição imunogênica, incluindo um ou mais antígenos de pelo menos um vírus Zika aqui descrito e (b) ncubar a mistura sob condi- ções adequadas por um período de tempo que varia de cerca de 1 ho- ra a cerca de 24 horas (por exemplo, cerca de 16 horas a cerca de 24 horas), com pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pe- lo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93 %, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo me- nos cerca de 99% ou cerca de 100% do antígeno adsorvido no sal de alumínio adjuvante. Em certas modalidades do método, o pelo menos um vírus Zika é um vírus Zika que compreende uma mutação de adap- tação celular não humana (por exemplo, uma mutação de adaptação celular não humana na proteína NS1, como uma mutação Trp98GlIy). Em algumas modalidades, o pelo menos um vírus Zika é um vírus Zika inteiro inativado purificado compreendendo uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1, ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, em que o vírus Zika é derivado da cepa PRVABC59. Em algumas modalidades, o vírus Zika é um vírus Zika inteiro inativado purificado compreendendo um vírus Zika inteiro inati- vado purificado compreendendo uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, em que o vírus Zika é derivado da cepa PRVABC59 compreendendo a sequência genômica de acordo com a SEQ ID NO:
2.
Purificação de vírus
[00224] “Outros aspectos da presente divulgação referem-se a mé- todos de purificação do vírus Zika. Em algumas modalidades, o méto- do inclui inocular uma pluralidade de células com um inóculo contendo uma população de vírus Zika e obter uma ou mais das células inocula- das um isolado clonal do vírus Zika por purificação de placas. Em al- gumas modalidades, as células são células não humanas (por exem- plo, células de insetos, células de mamíferos, etc.). Em algumas mo- dalidades, as células são células de inseto (como qualquer uma das células/linhagens celulares de mosquito aqui descritas). Em algumas modalidades, as células são células de mamífero (como qualquer uma das células/linhagens celulares de mamífero aqui descritas). Em algu- mas modalidades, as células de mamíferos são células de macaco. Em algumas modalidades, as células de mamíferos são células Vero.
[00225] Em algumas modalidades, a população do vírus Zika é he- terogênea, isto é, compreende dois ou mais genótipos. Os dois ou mais genótipos diferem uns dos outros em, pelo menos, um nucleotí- deo. Em algumas modalidades, a população de vírus Zika compreende um isolado clínico de vírus Zika (por exemplo, da cepa PRVABC59) e/ou um ou mais vírus Zika que foram passados anteriormente em cul- tura de células. Um isolado clinico do vírus Zika é obtido a partir de uma amostra de um paciente que está infectado com o vírus Zika. Em algumas modalidades, a purificação de placas (por exemplo, como aqui descrito) permite a separação substancial e/ou completa de um isolado clonal (geneticamente homogêneo) de uma população viral heterogênea. Em algumas modalidades, as células de macaco são de uma linhagem celular VERO (por exemplo, células VERO 10-87). Em algumas modalidades, o inóculo compreende soro humano. Em algu- mas modalidades, o inóculo compreende um ou mais agentes adventí- cios (por exemplo, um ou mais vírus de contaminação). Em algumas modalidades, a purificação de placas (por exemplo, como aqui descri- ta) permite a purificação substancial e/ou completa de um isolado clo- nal (geneticamente homogêneo) longe de um ou mais agentes adven- tícios.
[00226] Em algumas modalidades, os métodos descritos para isolar e/ou purificar um clonal do vírus Zika incluem um ou mais (por exem- plo, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, etc.) purificações de placas adicionais do isolado clonal do vírus Zika. Em algumas modalidades, os métodos descritos para isolar e/ou purificar um isolado clonal do vírus Zika incluem a passagem do isola- do clonal do vírus Zika um ou mais (por exemplo, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, etc.) vezes em uma cultura celular (por exemplo, em células de inseto, como uma linhagem celular de mosquito e/ou em células de mamíferos, como uma linha- gem celular VERO).
[00227] Outros aspectos da presente divulgação referem-se a mé- todos de purificação do vírus Zika para a preparação de uma vacina ou composição imunogênica. Em algumas modalidades, os métodos in- cluem um ou mais (por exemplo, uma ou mais, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais ou seis) etapas de (em qualquer ordem, incluindo a seguinte ordem): realizar a filtragem em profundi- dade de uma amostra ou preparação contendo um vírus Zika; troca de tampão e/ou diluição de uma amostra contendo um vírus Zika (por exemplo, por filtração de fluxo cruzado (CFF)) para produzir um reten- tado; ligação de uma amostra que compreende um vírus Zika a uma membrana de troca iônica (por exemplo, uma membrana de troca aniônica, uma membrana de troca catiônica) para produzir uma fração ligada, em que a fração ligada compreende o vírus Zika e eluindo a fração ligada da membrana de troca iônica; tratar uma amostra con- tendo um vírus Zika com uma quantidade eficaz de qualquer um dos inativadores químicos descritos aqui; neutralizar uma amostra conten- do um vírus Zika inativado quimicamente com metabissulfito de sódio; e/ou purificação de uma amostra neutralizada compreendendo um ví- rus Zika quimicamente inativado (por exemplo, por filtração de fluxo cruzado (CFF)). Em algumas modalidades, o método inclui as etapas de (a) passar uma amostra contendo um vírus Zika através de um pri- meiro filtro de profundidade para produzir um primeiro eluato, onde o primeiro eluato contém o vírus Zika; (b) troca de tampão e/ou diluição do primeiro eluído por filtração cruzada (CFF) para produzir um primei-
ro retentato, onde o primeiro retentato contém o vírus Zika; (c) ligar o primeiro retentado a uma membrana de troca iônica para produzir uma primeira fração ligada, onde a primeira fração ligada contém o vírus Zika, e eluir a primeira fração ligada da membrana de troca iônica para produzir um segundo eluato, onde o segundo eluato contém o vírus Zika; (d) passar o segundo eluato através de um segundo filtro de pro- fundidade para produzir um segundo retentato, em que o segundo re- tentato contém o vírus Zika; (e) tratar o segundo retentato com uma quantidade eficaz de um inativador químico; (f) neutralizar o segundo retentado tratado com metabissulfito de sódio; e (g) purificar o segun- do retentato neutralizado por filtração por fluxo cruzado (CFF).
[00228] No método da presente invenção, a preparação do vírus Zika é isolada de uma ou mais células cultivadas in vitro em que as células são usadas para produzir a preparação do vírus Zika por uma ou mais etapas selecionadas da filtração em profundidade, troca de tampão e/ou cromatografia de troca iônica e diluição. Em uma modali- dade, a preparação do vírus Zika é isolada de uma ou mais células cultivadas in vitro, em que as células são usadas para produzir a pre- paração do vírus Zika pelas etapas de filtração em profundidade, troca de tampão e/ou cromatografia de troca iônica e diluição. Em uma mo- dalidade, a preparação do vírus Zika é isolada de uma ou mais células cultivadas in vitro em que as células são usadas para produzir a prepa- ração do vírus Zika pelas etapas de filtração em profundidade, troca de tampão e/ou cromatografia de troca iônica e diluição, em que as eta- pas são realizadas na ordem de filtração em profundidade, troca de tampão e/ou cromatografia de diluição e troca iônica.
[00229] Filtragem de profundidade significa que é utilizado um meio de filtração poroso, em que as partículas são retidas no meio e não apenas na superfície do meio.
[00230] Numa modalidade, a etapa de troca de tampão e/ou dilui-
ção da amostra compreendendo a preparação do vírus Zika envolve filtração de fluxo cruzado. Na filtração de fluxo cruzado, também chama- da de filtração de fluxo tangencial, o fluxo de alimentação se desloca tan- gencialmenteao longo da superfície do filtro e não dentro do filtro.
[00231] Numa modalidade, a etapa da cromatografia de troca iônica envolve cromatografia de troca aniônica. Numa modalidade, a croma- tografia de troca aniônica utiliza uma membrana de troca aniônica compreendendo ligandos quaternários de amônio. Em algumas modali- dades, o vírus é eluído da membrana de troca aniônica por etapa de elui- ção, por exemplo, usando NaCl 250 mM, NaCl 500 mM e NaCl 750 mM. Formulações de vacinas e/ou composições imunogênicas
[00232] “Outros aspectos da presente divulgação referem-se a for- mulações de vacinas e/ou composições imunogênicas da presente di- vulgação contendo um ou mais antígenos de um vírus Zika aqui des- crito. Em algumas modalidades, o vírus Zika é um vírus Zika inteiro inativado purificado. Em algumas modalidades, o vírus Zika inteiro ina- tivado purificado compreende uma mutação na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o vírus Zika inteiro inativado purifi- cado compreende uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o vírus Zika inteiro inativado purifi- cado compreende uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1, ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, em que o vírus Zika é derivado da cepa PRVABC59. Em algu- mas modalidades, o vírus Zika inteiro inativado purificado compreende um vírus Zika inteiro inativado purificado compreendendo uma muta- ção Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição cor- respondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, em que o vírus Zika é de- rivado da cepa PRVABC59 compreendendo a sequência genômica de acordo com a SEQ ID NO: 2.
[00233] Tais vacinas e/ou composições imunogênicas da presente divulgação contendo um ou mais antígenos de um vírus Zika descrito aqui podem ser úteis para tratar ou prevenir a infecção pelo vírus Zika em um sujeito em necessidade do mesmo e/ou induzir uma resposta imune, como um resposta imune protetora contra o vírus Zika em um sujeito em necessidade do mesmo.
[00234] Tipicamente, as vacinas e/ou composições imunogênicas da presente divulgação são preparadas como injetáveis, como solu- ções líquidas ou suspensões; também podem ser preparadas formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em líquido antes da injeção. Tais preparações também podem ser emulsionadas ou produ- zidas como um pó seco. O ingrediente imunogênico ativo é frequente- mente misturado com excipientes que são farmaceuticamente aceitá- veis e compatíveis com o ingrediente ativo. Excipientes adequados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, sacarose, glicerol, etanol ou semelhantes, e combinações dos mesmos. Além disso, se desejado, a vacina ou composição imunogênica pode conter substân- cias auxiliares, como agentes umectantes ou emulsificantes, agentes tamponantes de pH ou adjuvantes que aumentam a eficácia da vacina ou composição imunogênica.
[00235] Vacinas ou composições imunogênicas podem ser conven- cionalmente administradas parenteralmente, por injeção, por exemplo, subcutânea, transcutânea, intradérmica, subdérmica ou intramuscular. Formulações adicionais que são adequadas para outros modos de administração incluem supositórios e, em alguns casos, formulações orais, perorais, intranasais, bucais, sublinguais, intraperitoneais, intra- vaginais, anais e intracranianas. Para supositórios, aglutinantes e veí- culos tradicionais podem incluir, por exemplo, polialcaleno glicóis ou triglicerídeos; esses supositórios podem ser formados a partir de mis-
turas contendo o ingrediente ativo na faixa de 0,5% a 10%, ou mesmo 1-2%.Em certas modalidades, uma cera de baixo ponto de fusão, co- mo uma mistura de glicerídeos de ácidos graxos ou manteiga de ca- cau, é primeiro fundida e a vacina contra o vírus Zika e/ou a composi- ção imunogênica aqui descrita é dispersa homogeneamente, por exemplo, por agitação. A mistura homogênea fundida é então vertida em moldes de tamanho conveniente e deixada esfriar e solidificar.
[00236] As vacinas e/ou composições imunogênicas da presente divulgação podem ser administradas de uma maneira compatível com a formulação de dosagem e na quantidade que será terapeuticamente eficaz e imunogênica. A quantidade a ser administrada depende do sujeito a ser tratado, incluindo, por exemplo, a capacidade do sistema imunológico do indivíduo para montar uma resposta imune e o grau de proteção desejado. Os intervalos de dosagem adequados podem incluir, por exemplo, de cerca de 0,1 ug a cerca de 100 ug do vírus Zika inteiro inativado purificado. A quantidade do vírus Zika inativado purificado pode ser determinada por um ensaio de Bradford (Bradford et al. (1976) Anal. Biochem. 72: 248-254) usando quantidades definidas de proteína do envelope de Zika recombinante para estabelecer a curva padrão.
[00237] Os regimes adequados para administração inicial e doses de reforço também são variáveis, mas são tipificados por uma adminis- tração inicial seguida de inoculações subsequentes ou outras adminis- trações.
[00238] O modo de aplicação pode variar amplamente. Qualquer um dos métodos convencionais para administração de uma vacina ou composição imunológica são aplicáveis. Estes incluem a aplicação oral numa base sólida fisiologicamente aceitável ou numa dispersão fisio- logicamente aceitável, parenteralmente, por injeção ou semelhante. À dosagem da vacina ou composição imunogênica dependerá da via de administração e pode variar de acordo com a idade da pessoa a ser vacinada e a formulação do antígeno A vacina ou composição imuno- gênica pode ter um volume de dosagem unitária superior a 0,5 mL, de 0,5 mL ou inferior a 0,5 mL, como aqui descrito. Por exemplo, ele pode ser administrado a um volume de 0,25 mL.
[00239] Para controlar a tonicidade, é preferível incluir um sal fisio- lógico, como um sal de sódio. É preferido cloreto de sódio (NaCl), que pode estar presente entre 1 e 20 mg/ml. Outros sais que podem estar presentes incluem cloreto de potássio, di-hidrogenofosfato de potássio, fosfato dissódico desidratado, cloreto de magnésio, cloreto de cálcio, etc.
[00240] As vacinas e/ou composições imunogênicas da presente divulgação podem incluir um ou mais tampões. Tampões típicos inclu- em: um tampão fosfato; um tampão Tris; um tampão de borato; um tampão succinato; um tampão histidina (particularmente com um adju- vante de hidróxido de alumínio); ou um tampão de citrato. Os tampões normalmente serão incluídos na faixa de 5 a 20 mM
[00241] O pH de uma vacina ou composição imunogênica geral- mente estará entre 5,0 e 8,5 ou 5,0 e 8,1 e mais tipicamente entre 6,0 e 8,5 por exemplo entre 6,0 e 8,0, entre 6,5 e 8,0, entre 6,5 e 7,5, entre 7,0 e 8,5, entre 7,0 e 8,0 ou entre 7,0 e 7,8. Um processo de fabrica- ção da presente divulgação pode, portanto, incluir uma etapa de ajuste do pH da vacina a granel antes da embalagem.
[00242] A vacina ou composição imunogênica é preferencialmente estéril. É preferencialmente não pirogênico, por exemplo, contendo < 1 EU (unidade de endotoxina, uma medida padrão) por dose e, de prefe- rência, 0,1 EU por dose. Ele é, de preferência sem glúten.
[00243] Em certas modalidades, as vacinas e/ou composições imu- nogênicas da presente divulgação podem incluir um detergente em uma concentração eficaz. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de detergente pode incluir, sem limitação, cerca de 0,00005% v/v a cerca de 5% v/v ou cerca de 0,0001% v/v a cerca de 1% v/v. Em certas modalidades, uma quantidade eficaz de detergente é de cerca de 0,001% v/v, cerca de 0,002% v/v, cerca de 0,003% v/v, cerca de 0,004% v/v, cerca de 0,005% v/v, cerca de 0,006% v/v, cerca de 0,007% v/v, cerca de 0,008% v/v, cerca de 0,009% v/v ou cerca de 0,01% v/v. Sem desejar estar vinculado à teoria, os detergentes aju- dam a manter as vacinas e/ou composições imunogênicas da presente divulgação em solução e ajudam a impedir que as vacinas e/ou com- posições imunogênicas se agreguem.
[00244] Os detergentes adequados incluem, por exemplo, tensoati- vo éster de polioxietileno sorbitano (conhecido como 'Tweens'), octoxi- nol (como octoxinol-9 (Triton X 100) ou t-octilfenoxipolietoxietanol!), brometo de cetil trimetil amônio (CTAB') e desoxicolato de sódio. O detergente pode estar presente apenas em quantidades vestigiais. Ou- tros componentes residuais em quantidades vestigiais pode ser anti- bióticos (por exemplo, neomicina, canamicina, polimixina B). Em algu- mas modalidades, o detergente contém polissorbato. Em algumas mo- dalidades, a concentração eficaz de detergente inclui faixas de cerca de 0,00005% v/v a cerca de 5% v/v.
[00245] As vacinas e/ou composições imunogênicas são preferen- cialmente armazenadas entre 2ºC e 8ºC. Eles deveriam idealmente ser mantidos fora da luz direta. O antígeno e a emulsão estarão tipicamen- te em mistura, embora possam inicialmente ser apresentados na forma de um kit de componentes separados para mistura extemporânea. As vacinas e/ou composições imunogênicas geralmente estarão na forma aquosa quando administradas a um sujeito. Métodos da presente divulgação
[00246] Outros aspectos da presente divulgação referem-se a mé- todos para o uso de vacinas e/ou composições imunogênicas aqui descritas contendo um vírus Zika inteiro inativado purificado, como um vírus Zika com uma mutação que é um triptofano para substituição de glicina na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspon- dente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, como aqui descrito) para tratar ou prevenir o vírus Zika em um sujeito em necessidade do mesmo e/ou para induzir uma resposta imune ao vírus Zika em um sujeito em necessidade do mesmo.
Outros aspectos da presente divulgação refe- rem-se a métodos para o uso de vacinas e/ou composições imunogê- nicas aqui descritas contendo um vírus Zika inteiro inativado purificado com uma mutação que é uma substituição de triptofano por glicina na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1 para tratar ou prevenir o vírus Zika em um sujeito em necessidade do mesmo e/ou para induzir uma resposta imune ao vírus Zika em um sujeito em necessidade do mesmo.
Outros aspectos da presente divulgação referem-se a métodos para o uso de vacinas e/ou composições imunogênicas aqui descritas contendo um vírus Zika inteiro inativado purificado com uma mutação que é uma substituição de triptofano por glicina na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, em que o vírus Zika é derivado da cepa PRVABCS59, para tratar ou prevenir o vírus Zika em um sujeito em necessidade do mesmo e/ou para induzir uma resposta imune ao vírus Zika em um sujeito em ne- cessidade do mesmo.
Outros aspectos da presente divulgação refe- rem-se a métodos para o uso de vacinas e/ou composições imunogê- nicas aqui descritas contendo um vírus Zika inteiro inativado purificado com uma mutação que é uma substituição de triptofano por glicina na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, em que o vírus Zika é derivado da cepa PRVABC59 compreendendo a sequência genômica de acordo com a SEQ ID NO: 2 para tratar ou prevenir o vírus Zika em um sujeito em necessidade do mesmo e/ou para induzir uma resposta imune ao vírus Zika em um sujeito em necessidade do mesmo.
[00247] Em algumas modalidades, a presente divulgação refere-se a métodos para tratar ou prevenir a infecção pelo vírus Zika em um sujeito em necessidade do mesmo, administrando ao sujeito um vírus Zika inteiro inativado purificado, como um vírus Zika com uma mutação que é uma substituição de triptofano por glicina na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou numa posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, como aqui descrito.
[00248] Em algumas modalidades, a presente divulgação refere-se a métodos para tratar ou prevenir a infecção pelo vírus Zika em um sujeito em necessidade do mesmo, administrando ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina e/ou composição imunogênica da presente divulgação contendo um vírus Zika inteiro inativado purificado com uma mutação que é uma substituição de trip- tofano por glicina na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modali- dades, a presente divulgação refere-se a métodos para tratar ou prevenir a infecção pelo vírus Zika em um sujeito em necessidade do mesmo, administrando ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina e/ou composição imunogênica da presente divulgação con- tendo um vírus Zika inteiro inativado purificado com uma mutação que é uma substituição de triptofano por glicina na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, em que o vírus Zika é derivado da cepa PRVABC59. Em algumas modalida- des, a presente divulgação refere-se a métodos para tratar ou prevenir a infecção pelo vírus Zika em um sujeito em necessidade do mesmo, ad- ministrando ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina e/ou composição imunogênica da presente divulgação contendo um vírus Zika inteiro inativado purificado com uma mutação que é uma substituição de triptofano por glicina na posição 98 da SEQ ID NO: 1, ou em uma posição correspondendo à posição 98 da SEQ
ID NO: 1, em que o vírus Zika é derivado da cepa PRVABC59 com- preendendo a sequência genômica de acordo com a SEQ ID NO: 2.
[00249] Em algumas modalidades, a presente divulgação refere-se a métodos para induzindo uma resposta imune ao vírus Zika em um sujeito em necessidade do mesmo, administrando ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina e/ou composição imunogênica da presente divulgação contendo um vírus Zika inteiro inativado purificado, tal como um vírus Zika com uma mutação que é uma substituição de triptofano por glicina na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1 como descrito aqui). Em algumas modalidades, a presente di- vulgação refere-se a métodos para induzir uma resposta imune ao ví- rus Zika em um sujeito em necessidade do mesmo, administrando ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina e/ou composição imunogênica da presente divulgação contendo um vírus Zika inteiro inativado purificado com uma mutação que é uma substi- tuição de triptofano por glicina na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, em que o vírus Zika é derivado da cepa PRVABC59. Em algumas modalidades, a presente divulgação refere-se a métodos para induzir uma resposta imune ao vírus Zika em um sujeito em necessidade do mesmo, admi- nistrando ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina e/ou composição imunogênica da presente divulgação conten- do um vírus Zika inteiro inativado purificado com uma mutação que é uma substituição de triptofano por glicina na posição 98 da SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1, em que o vírus Zika é derivado da cepa PRVABC59 compreen- dendo a sequência genômica de acordo com a SEQ ID NO: 2.
[00250] Em algumas modalidades, a etapa de administração induz uma resposta imune protetora contra o vírus Zika no sujeito. Em algu-
mas modalidades, o sujeito é um humano. Em algumas modalidades, o sujeito está grávida ou pretende engravidar.
[00251] Em algumas modalidades, a etapa de administração inclui uma ou mais administrações. A administração pode ser feita por um esquema de dose única ou um esquema de doses múltiplas (iniciação- reforço). Num esquema de doses múltiplas, as várias doses podem ser administradas pela mesma ou por diferentes vias por exemplo uma iniciação parenteral e reforço mucoso, uma iniciação mucosa e reforço parenteral, etc. Normalmente eles serão dados pela mesma via. Nor- malmente, doses múltiplas serão administradas com pelo menos 1 semana de intervalo (por exemplo cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 4 semanas, cerca de 5 semanas, cerca de 6 se- manas, cerca de 7 semanas, cerca de 8 semanas, cerca de 9 sema- nas, cerca de 10 semanas, cerca de 11 semanas, cerca de 12 sema- nas, cerca de 16 semanas, etc.). Dar duas doses separadas por 25 a dias (por exemplo 28 dias) é particularmente útil.
[00252] Os métodos da presente divulgação incluem administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz ou uma quantidade imu- nogênica das vacinas contra o vírus Zika e/ou composições imunogê- nicas da presente divulgação. Uma quantidade terapeuticamente efi- caz ou uma quantidade imunogênica pode ser uma quantidade das vacinas e/ou composições imunogênicas da presente divulgação que induzirão uma resposta imunológica protetora no sujeito não infectado, infectado ou não exposto ao qual é administrado. Essa resposta ge- ralmente resultará no desenvolvimento de uma resposta imune secre- tora, celular e/ou mediada por anticorpos à vacina. Geralmente, essa resposta inclui, mas não se limita a, um ou mais dos seguintes efeitos; a produção de anticorpos de qualquer uma das classes imunológicas, tais como imunoglobulinas A, D, E, G ou M; proliferação de linfócitos B e T; o fornecimento de sinais de ativação, crescimento e diferenciação para células imunológicas; expansão da célula T auxiliar, célula T su- pressora e/ou célula T citotóxica.
[00253] De preferência, a quantidade terapeuticamente eficaz ou quantidade imunogênica é suficiente para provocar tratamento ou pre- venção de sintomas da doença. A quantidade exata necessária varia de acordo com o sujeito a ser tratado; a idade e condição geral do sujeito a ser tratado; a capacidade do sistema imunológico do sujeito de sintetizar anticorpos; o grau de proteção desejado; a gravidade da condição sendo tratada; o antígeno do vírus Zika específico selecionado e seu modo de administração, entre outros fatores. Uma quantidade terapeuticamente eficaz apropriada ou quantidade imunogênica pode ser facilmente deter- minada por um versado na técnica. Uma quantidade terapeuticamente eficaz ou quantidade imunogênica cairá em uma faixa relativamente am- pla que pode ser determinada através de ensaios de rotina.
[00254] A presente divulgação será mais completamente compre- endida pela referências aos seguintes Exemplos. Eles não devem, no entanto, ser interpretados como limitativos de qualquer aspecto ou âmbito da presente divulgação, em qualquer maneira.
EXEMPLOS Exemplo 1: Geração de Cepas Clonais do Vírus Zika
[00255] Este exemplo descreve a produção de cepas de vírus Zika (ZIKAV) com um histórico de pesquisa conhecido.
Materiais e Métodos Manutenção de células Vero
[00256] Um frasco de células Vero 10-87 da OMS foi rapidamente descongelado em banho-maria e inoculado diretamente em 19mL de DMEM pré-aquecido (meio essencial mínimo modificado de Dulbecco) contendo penicilina-estreptomicina, L-glutamina 40mM e 10% de FBS em um frasco de T-75cm? a 36ºC+/2ºC, a 5% de CO». As células fo- ram deixadas crescer até à confluência e subcultivadas usando TryplE.
Este frasco foi expandido para dois frascos de T-185cm?, cultivados à confluência e subcultivados para frascos de 31 xT-185cm? e cultivados até as células atingirem 100% de confluência. As células foram colhi- das por tripsinização, centrifugadas a 800 x g por 10 minutos e res- suspensas em DMEM contendo 10% de FBS e 10% de DMSO a uma concentração de 1,9x107 células/mL. Um frasco das células Vero foi rapidamente descongelado e ressuscitado, conforme descrito acima em um frasco de T-75cm? . Estes foram subcultivados duas vezes para produzir um banco de células em frascos de 13 x T-185cm? . Após a tripsinização, as células foram centrifugadas a 800 x g e ressuspensas em meio de congelamento (DMEM contendo 10% de FBS e 10% de DMSO) a uma concentração de 4.68x10º células/mL. Este banco de células foi separado em alíquotas para criofrascos.
[00257] As células Vero foram cultivadas e mantidas em DMEM contendo penicilina-estreptomicina, L-glutamina e 10% de FBS (CDMEM-10%-FBS). O TryplExpress foi usado para manter e tripsini- zar as células. Dois dias antes da adsorção viral, placas de 6 poços foram semeadas com 4-5 x 10ºcélulas/poço em 3 mL de cDMEM-10% -FBS ou 7 x 10º células em frascos T-25cm? em 5 mL de cDMEM- 10%-FBS, ou 1 x 10º células/poço em placas de 96 poços em 0,1 mL de cDMEM-10% -FBS. As incubadoras foram monitoradas diariamente para manter as temperaturas indicadas. As linhagens celulares Vero foram armazenadas em nitrogênio líquido. Ensaio de placas
[00258] Os títulos virais foram determinados por titulação de placas em monocamadas recentemente confluentes de células Vero cultiva- das em placas de 6 poços. Alíquotas congeladas foram descongeladas e séries de diluição de dez vezes das alíquotas foram feitas em CcDMEM-0%-FBS em placas de 96 poços. Os vírus diluídos foram man- tidos em gelo antes da inoculação das monocamadas de células Vero.
No momento do ensaio, o meio de crescimento foi aspirado da placa de 6 poços e 100 uL de cada diluição de vírus foram adicionados aos poços. O vírus foi adsorvido por 60 minutos a 36ºC + 2ºC, a 5% de CO», com agitação frequente (a cada 10 minutos) das placas para evi- tar a secagem das folhas das células. Após a adsorção viral, foram adicionados a cada poço 4 mL de uma primeira camada de agarose (1X cDMEM-2%-FBS + 0,8% de agarose) mantida a 40-41ºC. A aga- rose foi deixada solidificar por 30 minutos em temperatura ambiente, e as placas foram incubadas de cabeça para baixo por 4-6 dias a 36ºC+/2ºC, a 5% de CO». Dois mL de uma segunda camada de aga- rose contendo 160 ug/mL de corante vital vermelho neutro foram adi- cionados no dia 4. As placas foram visualizadas nos dias 5 e 6. Quantificação do vírus pelo ensaio de TCID50
[00259] Os títulos virais também foram determinados por titulação em monocamadas recentemente confluentes de células Vero cultiva- das em placas de 96 poços. Alíquotas congeladas foram descongela- das e séries de diluição de dez vezes das alíquotas foram feitas em diluente CDMEM-2%-FBS em placas de 96 poços. Os vírus diluídos fo- ram mantidos em gelo antes da inoculação das monocamadas de células Vero. No momento do ensaio, o meio de crescimento foi aspirado da pla- ca de 96 poços e 100 uL de cada diluição de vírus foram adicionados aos poços. As placas foram incubadas por 5 dias a 36ºC+/2ºC, a 5% de CO>2. O título de 50% da dose infecciosa da cultura de tecidos (TCID50) foi calculado usando a calculadora Reed/Muench. Artigos para Teste
[00260] A cepa do vírus Zika PRVABC59 (um frasco de 0,5 mL em gelo seco) foi recebida dos Centros de Controle e Prevenção de Do- enças (CDC). A identificação do vírus Zika foi confirmada por RT-PCR. A cepa foi negativa para contaminação por Alfavírus e micoplasma por PCR. Esta informação está resumida na Tabela 1.
Tabela 1: Informações sobre a cepa PRVABC59 Informações — de | Informação Cepa informações Prep isolamento do paciente Sequenciamento por torrente de íons: acessão de gene tHtKU501215 Soro humano; via- Passagem: Vero(2)C6/36(1) PFU por ensaio de placa PRVABC59 Nenhum for- 6,7 log pfu/ml jou para Porto Rico Prep: 29Jan2016 Identidade por RT-PCR (Asiática) necido . em 2015 Hospedeiro: C6/36 (-) Para alfavírus por PCR (-) para micoplasma por ATCC e
ABM PCR R Sequenciamento S
[00261] Um kit QIAampViral RNA Mini Spin foi utilizado para extrair o RNA das colheitas de vírus estabilizadas de cada isolado, de acordo com os protocolos do fabricante. O RNA extraído de cada isolado foi usado para criar e ampli- ficar 6 fragmentos de cDNA que abrangem todo o genoma viral do zika. Os fragmentos de cDNA amplificados foram analisados quanto ao tamanho e pureza em um gel de Agarose/TBE a 1% e subsequentemente purificados em gel usando um Kit de Extração Qiagen Quick Gel. Um sequenciador ABI 3130XL Genetic Analyzer foi usado para conduzir reações automáticas de sequenciamento. O software Lasergene SeqMan foi utilizado para analisar os dados de se- quenciamento.
Resultados
[00262] — Foi procurada uma cepa de ZIKAV com histórico de pesqui- Sa relevante para o atual surto de ZIKAV nos Estados Unidos. Por esse motivo, a linhagem ZIKAV PRVABCS59 foi escolhida. Para gerar um vírus bem caracterizado, adaptado ao crescimento em células Vero, o ZIKAV PRVABCS59 foi amplificado pela primeira vez em células Vero (P1).
[00263] Frascos de células Vero (T-175cm?), 100% confluentes, fo- ram infectados com um MOI de 0,01 em 4mL de cDMEM-0% -FBS. O vírus foi adsorvido na monocamada por 60 minutos a 36ºC + 2ºC, a 5% de CO>, 20 mL de cDMEM-0%-FBS foram aplicados para amplifi- cação viral a 36ºC + 2ºC, a 5% de CO». A camada celular foi monitora- da diariamente quanto ao efeito citopático (CPE) após a inoculação (FIG. 1). O sobrenadante foi colhido após 96 horas, coletando os mei- os e clarificando por centrifugação (600 x g, 4ºC, 10 min). A colheita foi estabilizada pela adição de trealose a uma concentração final de 18% p/v. O volume foi dividido em alíquotas em frascos de 0,5 mL e arma- zenado a -80ºC.
[00264] A colheita de P1 estabilizada foi analisada quanto à pre- sença de vírus infeccioso nas monocamadas de células Vero por um ensaio TCID50. A cinética de crescimento foi monitorada tomando alí- quotas diárias a partir da hora O. O título de pico foi alcançado na hora 72 (FIG. 2).
[00265] O material P1 foi purificado em placa titulando a colheita a partir do dia 3 em monocamadas de 6 poços de células Vero. As pla- cas foram visualizadas no dia 6, e 10 placas para serem isoladas fo- ram identificadas desenhando um círculo em torno de uma placa distinta e separada na parte inferior da placa de plástico. As placas foram colhi- das extraindo o tampão de agarose usando uma pipeta estéril de diâme- tro largo enquanto raspava o fundo do poço e enxaguava com cDMEM- 10%-FBS. O tampão de agarose foi adicionado a 0,5 mL de cDMEM-
10%-FBS, agitado em vórtex, rotulado como PRVABC59 P2a-j e colo- cado em uma incubadora durante a noite a 36ºC + 2ºC, a 5% de CO,».
[00266] Três placas (PRVABC59 P2a-c) foram transportadas para purificação adicional. Cada isolado foi plaqueado em duplicado puro em uma monocamada fresca de 6 poços de células Vero. Esta transi- ção P2/P3 foi purificada em placas e marcada como PRVABC59 P3a-)j.
[00267] Seis placas (PRVABC59 P3a-f) foram transportadas para uma rodada final de purificação. Cada isolado foi plaqueado em dupli- cado puro em uma monocamada fresca de 6 poços de células Vero. Esta transição P3/P4 foi purificada em placas e marcada como PRVABCS59 P4a-j.
[00268] Seis placas (PRVABC59 P4a-f) da purificação da placa P4 foram passadas às cegas em monocamadas de células Vero em fras- cos de T-25 cm? . Cada captação de placa foi diluída em 2 mL de CDMEM-0%-FBS — 1 mL foi adsorvido por 1 hora a 36ºC+2ºC, a 5% de CO;>; o outro 1 mL foi estabilizado com trealose (18% v/v final) e arma- zenado a <-60ºC. Após a adsorção do vírus, CDMEM-O0%-FBS foi adi- cionado a cada frasco e deixado crescer a 36ºC+2ºC, a 5% de CO» por 4 dias. Os sobrenadantes do vírus foram colhidos, clarificados por cen- trifugação (600 x g, 4C, 10 min), estabilizados em trealose a 18% e divididos em alíquotas e armazenados a <-60ºC. Esta semente P5 foi testada por TCID50 quanto à potência do vírus Zika (FIG. 3).
[00269] Monocamadas confluentes de frascos de T-175cm? de célu- las Vero foram infectadas com cada um dos seis clones de PRVABCS59 (P5a-f) a um MOI de 0,01 em 4 mL de cDMEM-0%-FBS. O vírus foi adsorvido por 60 minutos a 36ºC+/2ºC, a 5% de CO», após o qual 20 mL de cDMEM-0%-FBS foram adicionados a cada frasco e deixados crescer a 36ºC+/2ºC, a 5% de CO». A saúde da monocama- da de células Vero e o CPE foram monitorados diariamente. O vírus foi colhido nos dias 3 e 5, como indicado (FIG. 4). As colheitas de cepa
P6 dos dias 3 e 5 foram reunidas, estabilizadas com trealose a 18%, divididas em alíquotas e armazenadas a <-60ºC.
[00270] Cada um dos seis clones de PRVABC59 (P6a-f) foi testado para a potência do vírus Zika in vitro (FIG. 5). A potência foi determi- nada por dois métodos diferentes, TCID50 e titulação em placa. O TCIDB50 foi calculado por inspeção visual do CPE (microscópio) e me- dindo a diferença na absorbância (Asso-A4s20) dos poços que exibem CPE (cor amarela) em comparação com vermelho (sem CPE). As pla- cas foram lidas em um leitor de placas e aplicadas na mesma calcula- dora que as placas de leitura microscopicamente (absorbância). Os valores no TCID50 entre as duas técnicas de pontuação são bastante semelhantes, enquanto os valores obtidos pela titulação da placa são mais baixos.
[00271] Um resumo da geração e caracterização do vírus P6 é mostrado na Tabela 2 abaixo. Tabela 2: Resumo da passagem e caracterização do vírus para a geração de cepas clonais de ZIKAV femea EEE] de placa, genótipo, se- Amplificar vírus P5 (a-f) em células Vero | quenciamento completo do genoma, cinética de crescimento
[00272] — Procurou-se um clone isolado do vírus Zika que se asseme- lhava muito à sequência de glicoproteínas de envelope do isolado ori-
ginal, uma vez que a proteína de envelope dos flavivírus é a porção imunogênica dominante do vírus.
Os clones PRVABC59 P6a, P6c, P6d e P6f continham uma mutação G — T no nucleotídeo 990 na regi- ão do envelope (G990T7), resultando em uma mutação de aminoácido Val — Leu no resíduo do envelope 330, enquanto o gene do envelope dos clones PRVABC59 P6b e P6e eram idênticos em relação à cepa de referência (GenBank ref KU501215.1) (Tabela 3 e FIG. 6).
Tabela 3: Sequenciamento de clones PRVABC59 P6 Sequenciamento de envelope (gene de referência de PRVABC59; acessão tKU501215) Nucleotídeo PRVABC59 P6a Quo Env-330: Val330Leu | Val/Leu Mutação em 3 de 4 leituras. — PRVABC59 P6b Env-1404: TG silenciosa | Tipo selvagem Tipo selvagem Tipo selvagem em relação à referência.
Env-990: PRVABC59 P6c Env-330: Val330—>Leu | Val/Leu Mutação em 3 de 4 leituras. — Env-990: - . PRVABCS59 P6d Got Env-330: Val830-Leu | Val/Leu Mutação em 2 de 2 leituras.
MN — o PRVABC59 P6e Tipo selvagem Tipo selvagem Tipo selvagem Tipo selvagem em relação à referência. = Env-990: Env-330: Mutação em 2 de 2 leituras. 190 pb não 8 PRVABCSO P6Í GT Val330Leu Val/Leu sequenciado (aa 421 - 484). Sequenciamento completo do genoma (gene de referência de PRVABC59; acessão %KU501215) Nucleotídeo Eniaos Tipo selvagem Mutação em 2 de 2 leituras. — PRVARSSA DO NS1-292 NS1-98 Trp/GI Mutação em 2 de 2 leituras TG Trpo8g->Gly po é ' PRVABC59 P6e NO» aee Gy Trp/Gly Mutação em 2 de 2 leituras.
[00273] Os doisclonessem mutações na sequência do envelope do Zika foram então submetidos a sequenciamento completo do genoma. Os resultados do sequenciamento estão resumidos na Tabela 3 aci- ma. A análise de sequência revelou uma substituição de T — G no nu- cleotídeo 292 na região NS1 para ambos os clones, resultando em uma mutação Trp — Gly no resíduo NS1 98. Esta mutação também foi posteriormente confirmada através de sequenciamento de profundida- de. A mutação NS1 W98G está localizada na alça entrelaçada do do- mínio de asa de ZIKAV NS1, que tem sido implicado na associação de membranas, interação com a proteína do envelope e formação poten- cialmente hexamérica de NS1. Enquanto outros resíduos de triptofano (W115, W118) são altamente conservados entre os flavivírus, o W98 não é (FIG. 7). Curiosamente, no entanto, 100% de conservação do resíduo W98 é observado em 11 cepas diferentes de ZIKAV, incluindo aquelas das linhagens africanas e asiáticas. As mutações identificadas em cada cepa são resumidas na Tabela 4.
Tabela 4: Resumo das mutações identificadas nos clones PRVABC59 P6 [Pa er — ven — [Po rms erendeso) — [p5a er va [pse rerum renan [Po sms — nstwese — | [Pee sims — nstwese — |
[00274] A análise fenotípica dos estoques de ZIKAV PRVABC59 P6 foi realizada para caracterizar os clones de ZIKAV. Como ilustrado na FIG. 8 e quantificado na FIG. 9, cada isolado clonal consistiu de uma população relativamente homogênea de placas de grandes dimen- sões, em comparação com o vírus P1 que tinha uma população mista de grandes e pequenas placas. Esses dados sugerem o isolamento bem sucedido de clones únicos de ZIKAV.
[00275] A seguir, foram analisadas análises de cinética de cresci- mento em células Vero dos clones ZIKAV PRVABCS59 P6. As células Vero foram infectadas com 0,01 de TCIDso/célula de cada clone ZIKAV P6 em meio de crescimento livre de soro. Amostras virais de sobrena- dante foram coletadas diariamente e simultaneamente testadas quanto ao título infeccioso por ensaio TCID5o . Para todos os clones P6, ocor- reu um pico de título entre os dias 3 e 4 (- 9,0 logio TCID5so/mL). Não houve diferença significativa na cinética de crescimento dos vários clones P6 (FIG. 10).
[00276] “Tomados em conjunto, os resultados indicam que uma se- mente do vírus Zika foi gerada com sucesso. Essa seleção de semen- tes exigia a compreensão do histórico de crescimento, cinética, produ- tividade, genótipo e fenótipo do vírus. É importante ressaltar que o iso- lamento clonal das cepas do vírus Zika permitiu a purificação bem- sucedida do vírus dos agentes contaminantes (por exemplo, agentes adventícios que podem estar no isolado humano parental). Curiosa- mente, três purificações sequenciais de placa conseguiram selecionar rapidamente o vírus adaptado às células Vero (cepas P6a-f), onde es- sas cepas foram capazes de se replicar bem em culturas de células Vero sem soro, com as cepas P6a, c, d e f abrigando uma mutação na proteína do envelope viral, enquanto as cepas p6b e p6e obtiveram uma mutação na proteína viral NS1 (sem modificação no envelope vi- ral). Além disso, as cepas adaptadas à Vero possibilitaram o cresci-
mento eficiente e reproduzível e a fabricação de passagens virais sub- sequentes propagadas a partir dessas cepas. Sem desejar estar vincu- lado à teoria, a mutação Env-V330L observada nas cepas P6a, c, de f pode potencialmente resultar de adaptação in vitro como uma mutação no Env 330 também foi observada após passagem nas células Vero (Weger-Lucarelli et al. 2017. Journal of Virology). Como a proteína de envelope é o epítopo imunogênico dominante do vírus Zika, as cepas que contêm uma mutação adaptativa Vero no Env podem afetar nega- tivamente a imunogenicidade da vacina. Sem desejar estar vinculado à teoria, a mutação de adaptação na proteína NS1 parece não apenas melhorar a replicação viral, mas também pode reduzir ou inibir a ocor- rência de mutações indesejáveis, como a proteína do envelope E (Env) do vírus Zika. Além disso, sabe-se que o NS1 se liga à proteína Envelope durante o ciclo de vida do vírus. Esta mutação (NS1 W98G) pode estar implicada na alteração da capacidade do NS1 de se asso- ciar e possivelmente copurificar, com o vírus durante o processamento a jusante. Sabe-se também que o NS1 é imunogênico e pode estar implicado na resposta imune à vacina. Exemplo 2: Imunogenicidade e eficácia pré-clínica de uma vacina de vírus Zika inativado purificado (PIZV) derivado das cepas P6b e P6e
[00277] O exemplo a seguir descreve a imunogenicidade e a eficá- cia pré-clínica em camundongos CD1 e AG129 de uma vacina de vírus Zika inativado (PIZV) derivado das cepas P6b e P6e. Como descrito no Exemplo 1, seis clones foram gerados a partir da cepa PRVABCB59, epidemicamente relevante, e dois (P6b e P6e) foram escolhidos para estudos adicionais de imunogenicidade e eficácia pré-clínica. Materiais e Métodos Purificação, inativação e formulação de uma vacina contra o vírus Zika
[00278] Muitas vacinas contra ZIKAV inativado, adequadas para uso em estudos pré-clínicos de imunogenicidade e eficácia, foram ge- radas e caracterizadas. O vírus foi amplificado a partir das cepas P6b e P6e, infectando frascos de células Vero confluentes a um MOI de 0,01. O vírus foi adsorvido por 1 hora a 36ºC+2ºC/5% de CO». Após a adsorção, 20 mL de cCDMEM-0%-FBS foram adicionados a cada frasco e incubados a 36ºC+2ºC/5% de CO,» por cinco dias. Os sobrenadantes celulares foram colhidos nos dias 3 e 5 após a infecção, e os detritos celulares foram clarificados por centrifugação.
[00279] Para cada isolado, os sobrenadantes clarificados foram reunidos, estabilizados em DMEM contendo 18% de trealose e arma- zenados a <-60ºC. Os sobrenadantes de vírus clarificados reunidos foram descongelados em banho-maria a 37ºC e tratados com benzo- nase durante a noite a 4ºC. Após o tratamento com benzonase, cada amostra foi aplicada a um filtro de profundidade Sartorius PP3. Após a filtração em profundidade, cada amostra foi aplicada a um dispositivo de filtração por fluxo tangencial (TFF) Centricon Plus-70. O retentato foi trocado por tampão, diluído e aplicado a um Sartorius SartobindQ IEXNano. Cada amostra foi aplicada a um segundo Sartorius Sarto- bindQ IEXNano e eluída usando um processo de eluição em 3 etapas com NaCl 250 mM, 500 mM e 750 mM. Após cromatografia e diluição MonoQ, cada eluato de 250 mM foi aplicado a um dispositivo de filtra- ção de fluxocruzado (CFF) Centricon Plus-70 para troca de tampão, diluído para 35 mL com PBS e armazenado a 2-8ºC.
[00280] Para a inativação da formalina, foi adicionado gota a gota a cada amostra purificada formaldeído a 1% preparado a fresco com agi- tação suave para obter uma concentração final de formaldeído de 0,02%. As amostras foram incubadas à temperatura ambiente (-22ºC) durante 14 dias, com inversão diariamente. O formaldeído foi neutrali- zado com metabissulfito de sódio durante 15' à temperatura ambiente antes de ser aplicado a um dispositivo de filtração de fluxo tangencial
(TFF) Centricon Plus-70. A troca de tampão foi realizada quatro vezes pela adição de 50 mL de tampão de substância de fármaco (10 mM de NaH2PO4, 50 mM de NaCl, 6% de sacarose, pH 7,4). Cada amostra foi então diluída para 15 mL com tampão de substância de fármaco, esterilizada usando um filtro de seringa de 0,2 m, dividida em alíquotas em frascos de vidro com rolha estéril (0,5 mL por frasco) e congelada a <-60ºC.
[00281] A inativação do vírus foi confirmada pelo teste TCID50 e pelo teste de dupla infecciosidade. Amostra de substância de fármaco foi aplicada brevemente às células C6/36 e deixada amplificar por 6 dias. O sobrenadante das células C6/36 foi aplicado às células Vero e o CPE foi monitorado por 8 dias. Para a formulação do produto de fármaco, os frascos da substância de fármaco PIZV foram desconge- lados, reunidos de acordo com o tipo de amostra e diluídos em 1 upg/mL ou 10 ug/ml em PBS com ou sem Alhydrogel (Brenntag; 0,5 mg/mL final, 0,050 mg/dose ) e incubados durante a noite a 2-8ºC com agitação suave. Os lotes resultantes de produtos de fármaco foram então divididos em alíquotas em frascos de vidro com rolha estéreis e armazenados a 2-8ºC até o uso. FIG. 11 fornece um resumo das eta- pas utilizadas para preparar produto de fármaco. Imunização e desafio de camundongo.
[00282] Para o estudo de imunogenicidade, camundongos Swiss- ICR (CD-1) machos e fêmeas de seis semanas de idade foram dividi- dos em 6 grupos (n = 10/grupo). No Dia O, camundongos dos grupos 1-5 foram inoculados com 0,1 mL de vacina pela via intramuscular (i.m.) (2 x injeções de 0,05 mL). Os camundongos do grupo 6 foram inoculados com PBS como controle placebo. Os camundongos foram aumentados nos dias 28 e 56, usando a mesma dosagem e tipo de vacina que o dia O. As amostras de sangue foram coletadas no dia -1 (pré-imune), dia 27 (início), dia 42 (reforço 1) e dia 70 (reforço 2).
[00283] Para o estudo de imunogenicidade e eficácia, camundon- gos AG129 machos e fêmeas com quatro semanas de idade foram divididos em 7 grupos (n = 5/grupo). No Dia 0, camundongos dos gru- pos 1-6 foram inoculados com 0,1 mL de vacina pela via intramuscular (i.m.) (2 x injeções de 0,05 mL). Os camundongos do grupo 7 foram inoculados com PBS como controle placebo. Os camundongos foram aumentados nos dias 28 usando a mesma dosagem e tipo de vacina que no dia O. Amostras de sangue foram coletadas da veia da cauda no dia -1 (pré-imune), dia 27 (início) e dia 55 (reforço). No momento da eutanásia, os ratos foram sangrados por punção cardíaca sob aneste- sia profunda com isoflurano (terminal). No dia 56, os camundongos foram desafiados intraperitonealmente com 10º unidades formadoras de placas (PFU) de ZIKAV PRVABC59. Transferência de soro
[00284] O soro foicoletado de camundongos AG129 vacinados com PIZV e desafiados e foi congelado após a associação (grupos 1,2,4 e da Tabela 6). O pool de soro foi descongelado e os artigos de teste foram gerados por diluições de três vezes do pool de soro em PBS. Um placebo foi gerado usando diluições de 3 vezes do soro normal de camundongo AG129 em PBS.
[00285] Os artigos de teste foram administrados como injeções in- traperitoneais de 0,1 mL em camundongos AG129 (um volume equiva- lente do artigo placebo foi administrado para controlar camundongos). Os animais foram então desafiados intraperitonealmente com 10º uni- dades formadoras de placas da cepa do vírus Zika PRVABC59 em 100yuL.
[00286] O volume de sangue permitido em peso foi coletado como sangue total por sangramento de cauda de dez camundongos no dia - 11 (pré-imunização). O sangue total foi coletado de cada camundongo no dia 1 (primário, Nab circulante) e no dia 4 (viremia) por sangramen-
to da cauda. O sangramento terminal após desafio letal foi realizado por punção cardíaca sob anestesia profunda para maior volume antes da eutanásia por deslocamento cervical. As amostras de sangue foram coletadas em tubos de gel de separação sérica de microtainer SST e deixadas coagular por pelo menos 30 minutos antes da separação do soro por centrifugação (10.000 x g por 2 min) e congeladas a -80ºC. Teste de neutralização de redução de placas
[00287] Os títulos de anticorpos neutralizantes foram determinados por um teste de neutralização por redução de placa (PRNT), conforme descrito anteriormente (Ver, por exemplo, Osorio et al. Lancet Infect Dis. 2014 Sep;14(9):830-8). Ensaio de neutralização de partículas de vírus repórter (RVP)
[00288] Os títulos de anticorpos neutralizantes foram analisados por titulação de amostras de soro com uma quantidade constante de RVPs de Zika em células Vero cultivadas em placas de 96 poços. Os RVPs continham as proteínas prME do zika (cepa SPH2012) e um repórter da Renilla luciferase baseado em dengue. Resumidamente, os soros foram inativados pelo calor a 56ºC por 30 min, diluídos e depois incu- bados a 37ºC com RVPs. A mistura soro/RVP foi então misturada com células Vero e incubada por 72 horas a 37ºC+2ºC/ 5% de CO,» antes da detecção com substrato luciferase. Os dados foram analisados usando a análise não linear JMP11 de 4 parâmetros, normalizada para um controle de rastreamento positivo e a dose efetiva de 50% (ECs50) foi relatada.
[00289] A menos que indicado em contrário, todos os métodos ex- perimentais adicionais foram realizados tal como descrito no Exemplo 1 acima. Resultados
[00290] Para avaliar a imunogenicidade dos candidatos à PIZV em camundongos CD-1 machos e fêmeas de 6 semanas de idade, os grupos de camundongos CD-1 (N = 10/grupo) foram imunizados por via i.m. via com uma dose de 0,1 ug (+ alúmen), 1,0 ug (+ alúmen) de uma vacina derivada das cepas do vírus ZIKAV PRVABC69 P6b ou P6e. Para avaliar a necessidade de adjuvante, um grupo de animais foi vacinado com 0,1 ug de vacina derivada de P6e e sem adjuvante de alúmen. As vacinas ocorreram nos dias 0, 28 e 56, com o grupo 6 recebendo PBS como controle placebo (FIG. 12A e Tabela 5).
Tabela 5: Formulações de PIZV e desafios em camundongos CD-1 [anpo [ea — Tnosetra) Aum(Go) | N Po o e e Fm e e e Ee e e e Eme e e e
E E pers o
[00291] Após a vacinação, as amostras de soro coletadas após imunizações primárias (dia 27), secundária (dia 40) e terciária (dia 70) foram testadas para anticorpos neutralizantes específicos para ZIKAV por ensaio de neutralização de RVP (FIG. 12B). Vinte e sete dias após receber a primeira dose, foi observada uma leve resposta de anticor- pos neutralizantes em camundongos vacinados com PIZV derivados de qualquer clone contendo alúmen, em comparação com o grupo controle com PBS placebo. É importante ressaltar que esta resposta aumentou significativamente após uma segunda imunização (dia 40), mas não foi adicionalmente aumentada após a imunização com uma terceira dose (dia 70). Não foi observada resposta de anticorpos neu- tralizantes em camundongos vacinados com vacina não adjuvante (FIG. 12B).
[00292] Para avaliar a imunogenicidade e a eficácia protetora dos candidatos à PIZV, grupos de camundongos AG129 com 4 semanas de idade (n = 5/grupo) foram imunizados por via i.m. via com uma dose de 0,1 ug (+ alume), dose de 1,0 ug (+ alume) ou dose de 0,1 ug (- alume) de uma vacina derivada dos estoques de ZIKAV PRVABC59 P6b ou P6e nos dias 1 e 28 (FIG. 13A e Tabela 6). Tabela 6: Formulações de PIZV e desafios em camundongos AG129 |ômpo [Sexo [cepa => |Pose(ug) [Alumíva) IN =| re a les 2 e ee les ls E e AM e e le qm je o los ls e Mo e e 7 e pesa so
[00293] Após a vacinação, os camundongos vacinados e controle foram desafiados intraperitonealmente no dia 56 com 10º PFU de ZIKAV PRVABCS59 (passagem baixa). As amostras de soro coletadas após imunizações primárias (D27) e secundárias (D55) foram testadas quanto à resposta de anticorpos neutralizantes específicos para ZIKAV (FIG. 13B e Tabela 7). Somente os grupos que receberam a dose alta da vacina com adjuvante de alúmen (grupos 2 e 5) provocaram uma resposta de anticorpos neutralizantes após uma única imunização, que aumentou dramaticamente após o reforço. Em contraste, os grupos que receberam a dose baixa ou alta da vacina com adjuvante de alú- men produziram uma resposta de anticorpos neutralizantes alta após uma segunda dose. Ao receber duas doses de vacina, não houve dife- rença estatística entre os grupos de camundongos que receberam va- cina com adjuvante de alúmen, independentemente da dosagem ou derivação do clone P6.
Tabela 7: Resposta de anticorpos neutralizantes específicos para
ZIKAV o RR essta [0rupo Tramulação — em Ts mr se [2 pet rammen hrs ao az too [Ema E o e o [5 pone ramen o o e a Pe e ep Tm e)
[00294] “Todos os grupos também foram monitorados para a morta- lidade, morbidade e perda de peso durante 21 dias pós-desafio. A vi- remia após o desafio foi detectada e quantificada por titulação de pla- ca. Os camundongos vacinados com uma dose baixa ou alta de can- didatos à PIZV formulados com alúmen (grupos 1, 2, 4 e 5) foram to- talmente protegidos do desafio letal de ZIKAV, avaliado pelo teste do teste de neutralização da placa bacteriana (PRNT), bem como por um ensaio de neutralização secundária comparável (Tabela 8). Nenhuma perda de peso ou sinais clínicos de doença foram observados em ca- mundongos vacinados, nenhum apresentou viremia infecciosa detec- tável três dias após o desafio e todos os camundongos vacinados com antígeno de dose baixa ou alta + adjuvante de alúmen sobreviveram aos 21 dias após o desafio (FIGS. 14-16). Em contraste, o desafio de todos os camundongos naiíve resultou em alta viremia no dia 2 pós- desafio e morbimortalidade entre os dias 10 e 18 pós-desafio (sobrevi- da média = D13). Além disso, o desafio de camundongos vacinados com uma vacina de dose baixa sem adjuvante derivada da cepa P6b resultou em alta viremia no dia 2 após o desafio e em um dia de so- brevida mediana semelhante ao grupo controle placebo, enquanto ca-
mundongos vacinados com uma dose baixa sem adjuvante alúmen derivada do clone e permaneceram parcialmente protegidos com uma sobrevida média de 19 dias. Esses resultados indicam que a imuniza- ção é mais eficaz com alúmen, a imunização secundária pode ser um requisito e que a dose baixa foi tão eficaz quanto a dose alta. Tabela 8: Títulos de anticorpos neutralizantes no soro
[00295] Além disso, foi testada a presença de NS1 na substância de fármaco da vacina (DS) produzida a partir do vírus P7b e P7e intei- ro inativado (uma passagem adicional das cepas P6b e P6e, respecti- vamente). Um ELISA sanduíche foi realizado usando placas pré-reves- tidas com um anticorpo monoclonal reativo para linhagens Asiáticas e Africanas do vírus Zika NS1, mas não reativo para Dengue NS1. As diluições duplicadas de 2-, 4-, 8-, 16- e 32- vezes de DS foram prepa- radas e foram comparadas com uma curva padrão usando NS1 purifi- cado recombinante em duplicado a uma concentração de 0-8 ng/mL. Diluições duplicadas de tampão DS isoladamente foram preparadas como controles negativos. O NS1 ligado foi detectado com o conjuga- do anti-NS1 HRP e a absorbância (Asso-As3o) dos poços apenas com tampão DS foi subtraído da absorbância medida nos poços contendo as amostras correspondentes de DS. Os resultados do ELISA de san- duíche são mostrados na Tabela 9 abaixo. Curiosamente, observou-se que o NS1 copurifica com as preparações de substâncias de fármaco da vacina, sugerindo que o NS1 viral pode ser um componente imuno- gênico da vacina de vírus inativado inteiro.
Tabela 9: NS1 ELISA ração de vacina jOD predito a 95% Pp5% Diluição lpredita (ng/mL)
[00296] O limiar de anticorpo neutralizante (Nab) necessário para conferir proteção contra o desafio do vírus Zika do tipo selvagem após a transferência passiva de anticorpos foi testado em seguida. (Tabelas 10AeB). Tabela 10A: desenho do estudo de transferência passiva em ca- mundongos AG129 pre E Pietim imar antes de IP Poe e so Eee E E AA Tabela 10B: Tempo do estudo de transferência passiva em ca- mundongos AG129 enseemapasta — per
[00297] O soro reunido de camundongos AG129 vacinados e desa- fiados foi diluído em série 3 vezes em PBS e injetado intraperitoneal- mente em 7 grupos (N = 5/grupo) de camundongos AG129 com 5-6 semanas de idade. O soro de camundongo AG129 pré-imune foi usa- do como controle placebo (Grupo 8). Após a transferência passiva (- 16-19 horas depois), o sangue total foi coletado e o soro foi separado por centrifugação de cada camundongo antes do desafio do vírus para determinação do título de anticorpos neutralizantes circulantes (FIG. 17). Imediatamente antes do desafio do vírus, grupos de camundon- gos (grupos designados 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8) tinham títulos de anticor- pos neutralizantes log10 médios de 2,69, 2,26, 1,72, 1,30, <1,30, <1,30, <1,30, <1,30, respectivamente.
[00298] Vinte e quatro horas após a transferência passiva de nAbs de ZIKV, os camundongos foram desafiados intraperitonealmente com 10º pfu de ZIKV PRVABC59. Após o desafio, os animais foram pesa- dos diariamente e monitorados 1-3 vezes por dia durante 28 dias para sinais de doença. A pontuação clínica foi determinada para cada ani- mal com base nos sintomas (Tabela 11 ). Os animais moribundos e/ou que apresentaram sinais neurológicos claros (pontuação clínica 22) foram sacrificados humanamente e contados como não sobreviventes. Tabela 11: Descrição das pontuações clínicas dadas durante o monitoramento de morbidade e mortalidade [E prenda e compotameria ramais 2 Aumentos no comportamento/aparência acima, alterações O essas comam 3 Primeiros sinais de neuropatia - postura severamente cur- vada, paralisia parcial (imobilidade, marcha instável, per- — EEosnTr 4 Encontrado morto sem mostrar sinais de pontuação 2 ou 3 [O aee ndo
[00299] Os sinais da doença começaram a aparecer nove dias após o desafio no grupo controle (grupo 8) e nos grupos 5-7, com uma per-
da correspondente de peso (FIG. 18). O sangue total foi recolhido e o soro foi separado por centrifugação a partir de cada animal, três dias após o desafio. As amostras de soro foram analisadas quanto à pre- sença de ZIKV infeccioso usando um ensaio de titulação em placas (FIG. 19). O título infeccioso médio (logio pfu/mL) para camundongos nos grupos 1-8 foram: 1,66, 2,74, 4,70, 4,92, 7,24, 7,54, 7,54 e 7,46, respectivamente. É importante ressaltar que camundongos dos grupos 1-4 com níveis detectáveis de anticorpos neutralizantes para o ZIKV (21,30 logo) presentaram níveis estatisticamente mais baixos (títulos de 102,5 a 106,0 vezes mais baixos) de viremia (p = 0,0001, 0,0003, 0,0007 e 0,0374) do que os camundongos controle. Esses resultados sugeriram que níveis detectáveis de anticorpos neutralizantes do ZIKV (21,30 log10) reduziram a viremia de maneira dependente da dose.
[00300] O dia médio de sobrevida dos camundongos nos grupos 1- 8 foi: não determinado, dia 17, dia 17, dia 13, dia 11, dia 11, dia 11 e dia 10, respectivamente (FIG. 20). É importante ressaltar que as cur- vas de sobrevida para grupos de camundongos com títulos de anticor- pos neutralizantes detectáveis pelo ZIKV (grupos 1-4) foram estatisti- camente diferentes em comparação com o grupo controle (grupo 8) (p = 0,0019, 0,0019, 0,0019, 0,0153, respectivamente). Estes resultados sugeriram que níveis detectáveis (21,30 log1o) de anticorpos neutrali- zantes para ZIKV retardavam o início da doença de maneira depen- dente da dose.
[00301] Finalmente, o título de anticorpo neutralizante de ZIKV de cada animal foi representado graficamente contra o seu título de vire- mia correspondente e a análise de regressão linear foi realizada. Foi observada uma relação altamente inversamente correlacionada entre os títulos de anticorpos neutralizantes do ZIKV e os níveis de viremia no dia 3 após o desafio (FIG. 21). Um resumo dos resultados dos es- tudos de transferência passiva é mostrado na Tabela 12 abaixo.
Tabela 12: Resumo dos resultados da transferência passiva [our [atu | Smmecnr Logratane | tania L ncaios | de soro culante GMT log10 pfu/uml. | vida (D28) média Dia pode [es ese Jo Tr pode [ess en Jo Tr pode pe fee o Te potes 5 pe o pote sm pes o pole ss pess o pote em pes o e
[00302] “Embora nenhum grupo de camundongos que receberam anticorpos neutralizantes do ZIKAV tenha sido totalmente protegido do desafio letal do ZIKAV nesta experiência, foram demonstrados níveis reduzidos de viremia e atraso no início da doença de maneira depen- dente da dose entre os grupos de camundongos com níveis detectá- veis de títulos de anticorpos neutralizantes do ZIKAV circulantes.
[00303] “Tomados em conjunto, os dados pré-clínicos dos estudos com camundongos CD-1 e AG129 indicam que um PIZV derivado de clones virais separados e bem caracterizados é imunogênico e capaz de fornecer proteção contra o desafio com o ZIKAV de tipo selvagem. É importante ressaltar que uma dose baixa e alta de vacina provocou uma resposta semelhante de anticorpos neutralizantes após duas do- ses e proporcionou níveis semelhantes de proteção contra o desafio letal de ZIKAV. Curiosamente, os camundongos vacinados com um candidato PIZV não adjuvado também mostraram proteção parcial contra o desafio ZIKAV. Os antissoros da vacina diminuíram significa- tivamente a viremia em camundongos AG129 imunizados passivamen- te e a sobrevida prolongada contra o desafio letal de ZIKAV. Estes re- sultados também demonstram que os candidatos PIZV bem caracteri-
zados foram altamente eficazes contra a infecção por ZIKAV no mode- lo de camundongo AG129 altamente suscetível a ZIKAV.
[00304] Além disso, verificou-se que a sequência de um PRVABC59 (de PRVABC59 P6e) na passagem 7 era geneticamente idêntica à da passagem 6. Isso foi surpreendente, uma vez que os flavivírus são ge- ralmente considerados geneticamente lábeisó. O PRVABC59 P6e foi selecionado como a semente do vírus pré-mestre devido em parte à sua estabilidade genética em 7 passagens. Sem desejar estar vincula- do à teoria, acredita-se que essa estabilidade genética aprimorada possa ser devida à substituição de um único aminoácido (W98G) no domínio de asa de NS1, pois essa foi a única mutação observada no genoma PRVABC59 P6 adaptado às células Vero. Além disso, a esta- bilidade genética e a homogeneidade são vantajosas, pois reduzem a variabilidade e aumentam a produção reproduzível de cepas subse- quentes que podem ser usadas para a formulação de vacinas. Exemplo 3: Avaliação pré-clínica do fenótipo das linhagens P6a e P6e Materiais e Métodos
[00305] “Os camundongos AG129 (sem receptores de interferon a/B e y) são suscetíveis à infecção e doença por ZIKV, incluindo patologias graves no cérebro. Camundongos AG129 de 14 semanas de idade foram infectados intraperitonealmente com 10º and 10º pfu dos clones da passagem 6 do ZlIKV a e e.
[00306] “Os camundongos foram pesados e monitorados diariamen- te (até 28 dias) quanto a sinais clínicos de doença (perda de peso, pe- los amarrotados, postura curvada, letargia, fraqueza nos membros, paralisia parcial/total). Além disso, a análise de viremia foi realizada por titulação em placa de amostras de soro recolhidas três dias após o desafio como descrito no Exemplo 1.
Resultados
[00307] A infecção com preMVS P6e resultou em 100% de mortali- dade (tempo médio de sobrevida = 12,5 dias), enquanto a infecção com preMVS P6a resultou em apenas 33% de mortalidade (tempo médio de sobrevida = indeterminado) (Figura 22). De acordo com isso, os camundongos infectados com preMVS P6e apresentaram maior perda de peso em comparação com os camundongos infectados com PRVABC59 P6a (3). Não foi encontrada diferença estatística nos ní- veis médios de viremia entre os grupos de camundongos infectados com PRVABCS59 P6a ou P6e (Figura 24). Esses dados sugerem que a cinética do crescimento por si só pode não ser um determinante chave (uma vez que ambas as cepas produziram viremia semelhante e títu- los de pico semelhantes in vitro) e que uma característica da proteína Envelope pode ser importante para a virulência (de uma cepa do tipo selvagem) e imunogenicidade (de um candidato inativado). Exemplo 4: Integridade do ensaio de inativação para determinar a eficácia da inativação
[00308] Foi desenvolvido um ensaio de dupla infecciosidade, tam- bém chamado de integridade de inativação (COI), para determinar a eficácia da inativação de formalina (formaldeído a 0,01%) e a potencial atividade viral infecciosa residual da substância de fármaco a granel (BDS) de vírus zika inativado purificado (PIZV).
[00309] “Preparação de amostra: Quatro lotes de Vacina contra o Zika inativado purificado (PIZV) (lotes Tox 1-4) do clone e como des- crito acima foram fabricados por crescimento em células Vero. Os so- brenadantes de 4 colheitas diárias (totalizando cerca de 4000 mL) fo- ram purificados por cromatografia seguida de adição de formaldeído a uma concentração final de 0,01%. p/v A inativação foi deixada prosse- guir por 10 dias a 22ºC. As amostras em controle de processo (IPC) foram removidas diariamente da substância de fármaco a granel (BDS)
durante a inativação para caracterização e análise. As amostras diá- rias de IPC foram neutralizadas com metabissulfito de sódio e dialisa- das em DMEM (meio de crescimento viral). As amostras contêm o ví- rus Zika inativado purificado. No último dia de inativação, o volume restante de amostras de BDS não foi neutralizado, mas foi processado com TFF para remover formaldeído e trocado em tampão em PBS.
[00310] Integridade do ensaio de inativação (COI): O ensaio COI foi utilizado para analisar a eficácia da inativação nas amostras diárias do IPC para entender a cinética da inativação e o BDS final. Para sen- sibilidade máxima, duas linhagens celulares, Vero e C6/36, foram ini- cialmente utilizadas neste ensaio para detectar possíveis vírus vivos nas amostras de IPC e DS. Quando o vírus Zika infecta células Vero na presença de meio de crescimento contendo vermelho de fenol, os subprodutos da morte celular causam uma queda no pH. Consequen- temente, a cor do meio muda de vermelho/rosa para amarelo, indicati- vo dessa mudança ácida no pH do meio. Esse fenômeno é causado pela apoptose e efeitos citopáticos (CPE), que se refere às alterações observadas na estrutura celular das células hospedeiras causadas por invasão viral, infecção e brotamento das células durante a replicação viral. Por fim, enquanto as células Vero e mosquito C6/36 são uma linhagem celular permissiva para infecção, a infecção pelo vírus Zika mata apenas células Vero in vitro. Portanto, as células Vero foram usadas como linhagem celular indicadora para o ensaio. Em contraste, as células C6/36 que são derivadas de um vetor hospedeiro natural para o vírus Zika não exibem um CPE na infecção por Zika e não |i- sam. O meio não mudar de cor e a viabilidade de células C6/36 não é alterada.
[00311] O ensaio é assim dividido em duas partes: A primeira parte do ensaio permite a amplificação paralela de partículas virais potenci- almente vivas em placas de 96 poços das duas linhagens celulares suscetíveis por seis dias. A segunda etapa do ensaio envolve a trans- ferência do sobrenadante das placas de 96 poços (incluindo partículas potencialmente amplificadas) para placas de 6 poços contendo mono- camadas de células Vero e incubação por mais 8 dias para permitir a infecção viral e um efeito citopático para desenvolver nas células Vero. Qualquer CPE observado foi confirmado usando um microscópio ópti- Co.
[00312] Embora descrito em detalhes com relação ao uso de placas de 96 poços na primeira parte do ensaio, ou seja, a cultura em células C6/36 e seis placas de poço na segunda parte do ensaio, ou seja, a cultura de células Vero para observar efeito citofático, o teste pode ser facilmente ampliado de acordo com a tabela a seguir:
Ensaio parte 1: aplicação BDS (deve se encaixar dentro da faixa de vol recomendado) Ensaio parte 2: transferir para Vero (deve acomo- dar o volume agrupado para transferência) placa ou fras- | Área de | Faixa de volume | amostra mL | vol de inóculo | % recipientes ne- | & recipientes | volume agru- | amostra vol. inóculo co superfície recomendada (para | por cm2 por poço (ou | cessários para | necessários para | pado para |ml — por | transferido (cm?) Oo crescimento) por frasco) aumento de esca- | aumento de | transferência | cm2 por poço (ou la de 15X; Dilui- | escala de 15X; | (mL) frasco) ção 2 vezes Diluição 5 vezes formato de 96 | 0,32 100-200 ul 0,3125 [a poços Formato — de | 3,8 0,076-1,14 ml 0,3125 1,188 6,48 16,21 11,88 12 poços Formato de 6 | 9,5 1,9-2,9mL 0,3125 2,969 4,32 10,81 17,81 0,0526 01 a poços B formato de | 25 5-7,5 mL 0,3125 7,813 9,86 24,64 7,813 0,0526 1,32 = frasco T25 8 Formato — do |75 15-22,5 mL 0,3125 23,438 3,29 8,21 23,438 0,0526 3,95 frasco T75 Formato — do | 150 30-45 mL 0,3125 46,875 1,64 4,11 46,88 0,0526 7,89 frasco T150 Formato — do | 175 35-52,5 0,3125 54,688 1,41 3,52 54,69 0,0526 9,21 frasco T175 Formato — do | 235 47-70,5 0,3125 73,438 1,05 2,62 73,44 0,0526 12,36 frasco T235 Formato — do | 300 30-40 mL? 0,3125 93,750 0,82 2,05 93,75 0,0526 15,78 frasco T300 fem e so os eo fo [O os Tas [em iz ams —osias — senso forte [o foosas es [er ess 15002000 [osias — 1omonano fomo [ oosas ss327
[00313] É aparente que durante a escala o volume de amostra por cm2 de recipiente permanece constante para a parte | e as mesmas condições de infecção viral são mantidas na parte 2.
[00314] Controle de ensaio COI: Os controles de titulação e titula- ção reversa para este ensaio foram realizados usando células indica- doras Vero e pontuados em um TCIDso de formato de 96 poços com poços com resultado positivo com base na mudança de cor do meio de rosa para amarelo, como substituto para morte celular ou presença de CPE. Teste de controle de título de vírus: Duas réplicas independentes do vírus controle (PRVABC59) do título conhecido foram submetidas a uma série de diluições de 10 vezes em meio contendo 2% de FBS, e 100 uL de cada diluição foram adicionados a quatro poços de uma placa de 96 poços contendo células Vero. As placas foram incubadas durante 5 dias, em seguida, os poços contendo CPE foram registrados e o título do vírus foi calculado usando a calculadora Reed-Meunch. Teste de controle de titulação de vírus: O vírus de controle do título conhecido foi diluído em série para 200 TCID50. Duas réplicas inde- pendentes do vírus de controle 200 TCID50 foram submetidas a uma série de diluições de 2 vezes em meios contendo 2% de FBS, e 100 ul de cada diluição foram adicionados a quatro poços de uma placa de 96 poços contendo células Vero. As células foram incubadas duran- te 5 dias, em seguida, os poços contendo CPE foram registrados e o título do vírus foi calculado usando a calculadora Reed-Meunch.
[00315] Protocolo COI detalhado:
1. Primeira parte do ensaio: Células Vero (1.4E*%º célu- las/mL) e células de mosquito Aedes aegypti C6/36 (4E* células/mL) foram semeadas em placas de 96 poços dois dias antes da adição das amostras. As células Vero foram cultivadas em DMEM + 10% de FBS final + 2% de L-glutamina + 1% de penicilina/estreptomicina a 37ºC. As células C6/36 foram cultivadas em DMEM + 10% de FBS + 2% de L- glutamina + 1% de penicilina/estreptomicina + 1% de aminoácidos não essenciais a 28ºC.
2. Três réplicas independentes do vírus de controle 200 TCID50 (preparado no teste de controle de titulação de vírus) ou as amostras de DS foram diluídas (diluições de 5 e 10 vezes) em meio contendo FBS a 2%.
3. As células em placas de 96 poços foram inoculadas com as amostras. Antes da infecção das monocamadas celulares nas pla- cas de 96 poços, a amostra foi submetida a vórtex para interromper qualquer possível agregação. 100 uL de cada diluição foram aplicados a cada um dos 5 poços em duas placas separadas de 96 poços con- tendo células Vero e C6/36, respectivamente.
4. Somente o meio foi incluído em outro poço para cada tipo de célula como um controle de CPE negativo.
5. As placas foram incubadas durante 6 dias à temperatura apropriada para a linhagem celular.
6.Segunda parte do ensaio: Para permitir que o vírus vivo seja ainda mais amplificado e visualizado por CPE em uma linhagem celular permissiva, todo o volume de cada sobrenadante de 96 poços das células Vero e C6/36 foi transferido para poços individuais de pla- cas de 6 poços de células Vero. A inoculação prosseguiu por 90 minu- tos com agitação a intervalos de 15 minutos.
7. Meio contendo 2% de FBS foi adicionado aos poços e as placas foram incubadas por mais 8 dias para detecção subsequente das amostras amplificadas em função do CPE. A inativação foi consi- derada incompleta se alguma das réplicas do DS apresentasse CPE no final do dia 8.
7. A presença de virions vivos/replicantes foi visualizada pela formação de placas ou CPE em monocamadas de células susce-
tíveis após transferência para a placa de 6 poços e incubação por 8 dias para permitir a replicação viral. A pontuação da % CPE nas pla- cas de 6 poços no final do ensaio foi calculada da seguinte forma: - Cada placa de 6 poços de células Vero foi examinada quanto a CPE por visualização de alteração colorimétrica, seguida pela confirmação de CPE por inspeção sob um microscópio de luz invertida.
- Cada placa de 6 poços representou uma das réplicas das diluições de DS preparadas nas diluições de 5 e 10 vezes descritas acima (5 poços, mais um poço contendo apenas o meio).
Portanto, a % de CPE para cada réplica refletiu o número de poços com CPE de 5 poços totais por amostra (120 poços totais são usados por ensaio). O % CPE médio e o desvio padrão foram cal- culados com base em três réplicas de cada diluição.
[00316] Resultados: As amostras diárias foram analisadas em ca- da um dos lotes Tox t1-4 como mostrado nas tabelas a seguir.
Tabela A: Cinética de inativação, Tox lot 41 [1oDat — [Veroparavero — fio o (Tíomiao —VeroparaVero — [100 [o [1oDat — [Veroparavero — fo o (Tíoma2z — Veroparavero [o o (TíoDiad —VeroparaVero [o o [11o0Das — [Veroparavero — fo o (Tíoma7 — Veroparavero [o o [110Das — [Veroparavero — fo o (Tíomiao — Veroparavero fo o [110Dato — [Veroparavero — fo o [100TcIDSOmE |Veroparavero — 400 jo | (TioDat — lceBeparavero — [100 [o [110Dao — [ce/a6paravero [too o
(rioDas — cs/separavero o o MTioDas — [cssepaaveo — fo fo MTioDa7 — [cssasparaves fo fo (rioDas — cseparavero — o o MTíoDas —[cssasparaves fo fo (rioDiato — cs/separavero o o [TooTeIDSOmL [c6/a6paravero — [100 fo Tabela B: Cinética de inativação, Tox lot %&2
(roDiat — Veroparavero — [100 jo MTioDao — [Veroparavero — fr o rioDat — VeroparaVero — [too jo Tomaz [Veroparaveo — fo o MTioDas — [Veroparaveo — fo o rioDaa — VeroparaVero — O o Tomar [Veroparaveo — fo o rioDas — VeroparaVero — O o MTioDas — [Veroparaveo — fo o MTioDato — [Veroparaveo — fo o [TooTCIDSOmL VeroparaVero — [100 jo MioDat — [cssepaaves — 1 o (rioDao — cs/soparavero — [too jo Tomas — [cssepaaveo — fo o Tomas — [cssepaaveo — fo o rioDa7 — cs/separavero — O jo MTioDas — [cssanparaveo fo o rioDas — cs/separavero — O jo MTioDato —[cssanparaveo fo o [TooTeIDSOmL [c6/a6paravero — [100 o
Tabela C: Cinética de inativação, Tox lot 43
TioDat — [Veroparavers — [10 o rioDao — VeroparaVero — [too jo rioDa2 — VeroparaVero — O o Tomas — [Veroparaveo — fo o rioDaa — VeroparaVero — O o Tomar [Veroparaveo — fo o MTioDas — [Veroparaveo — fo o rioDas — VeroparaVero — O o MTioDato — [Veroparaveo — fo o [TooTCIDSOmL VeroparaVero — [100 jo MioDat — [cssasparavero [mo o (rioDao — csBeparavero — too jo rioDas — cs/separavero O jo Tomas — [cssepaaveo fo o rioDa7 — cs/separavero O jo MTioDas — [cssanparavero fo o Tomas — [cssasparavero fo o (rioDiato —cs/separavero O jo [TooTeIDSOmL [c6/a6paravero [100 o Tabela D: Cinética de inativação, Tox lot X4
Der veses o o [FoneT fveorevao [Fonez veoreevao o o [Des veses [ones ves o o
1:10 Dia-1 C6/36-para-Vero [10 To | 1:10 Dia O C6 / 36-para-Vero [10 To | 1:10 Dia 1 C6 / 36-para-Vero 1:10 Dia 2 C6/36-para-Vero 1:10 Dia 3 C6 / 36-para-Vero | ig | 1:10 Dia 4 C6 / 36-para-Vero | ig | 1:10 Dia 7 C6 / 36-para-Vero jo To] 1:10 dia 8 C6/36-para-Vero [o iii" 1:10 Dia 9 C6 / 36-para-Vero | ig | 1:10 Dia 10 C6 / 36-para-Vero | ig | 100TCID50/mL |C6/36-para-Vero 1100 o
[00317] Cinética compilada de dados inativação: Os dados de COI para amostras dos quatro lotes de toxicologia foram comparados com a potência infecciosa (TCID50) determinada como descrito acima e com a cópia do RNA. A cópia de RNA foi determinada por purifica- ção de ácidos nucleicos a partir da amostra e amplificação do RNA do Zika com iniciadores específicos de sorotipo usando um kit de RT- PCR. O resultado mostrado na Figura 25 mostra que a sensibilidade do ensaio CO! é significativamente maior do que a de TCID50.
[00318] Características de desempenho do ensaio COI - Preci- são: As diluições alvo (TCID50/well) e as suas respectivas propor- ções de CPE foram usadas para determinar a precisão relativa. Para as células Vero, houve uma relação linear significativa entre as pro- porções observadas e esperadas de CPE positivo. A inclinação da |i-
nha que relaciona os resultados observados e esperados é de 0,92, com um intervalo de confiança de 95% (Cl) de 0,83 a 1,01 que se so- brepõe a 1, indicando 100% de precisão. Para as células C6/36, existe uma relação linear estatisticamente significativa entre as proporções observadas e esperadas de CPE positivo. A inclinação da linha que relaciona os resultados observados e esperados é de 0,88, com um intervalo de confiança de 95% (CI) de 0,80 a 0,95, indicando que um leve viés (5-20%) foi observado com essa linhagem celular. Ambas as linhagens celulares demonstraram precisão satisfatória (relativa).
[00319] Características de desempenho do ensaio COI - limite de detecção (LoD): A sensibilidade do ensaio foi avaliada tanto para as placas C6/36-para-Vero e Vero-para-Vero. Como descrito acima, os dados foram ajustados usando a regressão de mínimos quadrados da proporção de +ve CPE observada por total de poços semeados com diluições de título semeadas a partir de 10,00 TCID50/poço até um tí- tulo mais baixo de 0,08 TCID50. Além disso, controles negativos (0,00 TCID50/poço) foram incluídos para cada diluição nas placas. A pontu- ação de CPE foi realizada para cada diluição nas placas C6/36-para- Vero e Vero-para-Vero. Uma relação clara entre o CPE e o título de vírus de log de entrada foi vista. Isso exibe a relação logística (sigmoi- dal) entre a proporção de poços positivos para CPE em relação à con- centração log10 de TCID50/poço, juntamente com um limite de confi- ança inferior e superior a 99%. Em uma concentração de -2 log10 (= 0,01 TCID50/poço), um modelo baseado em e contabilizando todas as variações de fontes fixas e aleatórias nos dados de qualificação previu 0,85%, ou 0,01 quando arredondado para 0,01 TCID50/poço, com um valor menor de 99 % de limite de confiança de 0,42%. Como o limite de confiança inferior a 99% não inclui zero, há uma chance quantificá- vel muito pequena (<1%) de que os poços CPE de 0,85% possam ter surgido de O TCID50/poço (ou seja, devido ao ruído). Isso estabelece um limite de detecção para o ensaio de pelo menos 0,01 TCID50/poço (isto é, a menor quantidade de partículas de Zika vivas na amostra que pode ser detectada). Ou seja, quando arredondado, 1 em 60 poços terá CPE positivo ou, dados esses parâmetros, a menor proporção teórica do CPE +ve que poderia ser detectada em 60 poços seria 1,67%, ou 0,0167.
[00320] Os tipos de células (C363 e Vero) foram comparados quan- to à sensibilidade relativa, com a C6/36 demonstrando que uma dilui- ção menor do título de vírus pode ser detectado em comparação com células Vero como mostrado na Figura 26 ; no mesmo nível de entra- da de vírus (0,31 TCID50), a proporção de poços positivos de CPE é mais elevada para C6/36 em relação a células Vero.
[00321] O valor de entrada menor vírus utilizado durante a forma- ção deste ensaio foi de 0,02 TCID50 (-1.61 log TCID50). Usando a curva ajustada para células C6/36, isso resulta em 0,035 ou 3,5% dos poços com resultado positivo de CPE (1 em 28 poços). Se a curva for extrapolada para o nível prático mais baixo de 0,167 ou 1,6%, isso equivale a um nível de entrada de vírus de 0,015 TCID50 (-1,82 log TCID50). No entanto, o impacto da variação do ensaio transmitido pre- cisa ser considerado ao determinar os níveis mais baixos de vírus in- feccioso que podem ser detectados conforme refletido nos resultados de +ve CPE. Este ruído surge da geração do estoque de trabalho de vírus de entrada. A comparação do TCID50 alvo e o cálculo da titula- ção retroativa mostram que o TCID50 do vírus do estoque de trabalho exibiu um desvio padrão (SD) de 85 TCID50/mL, derivado de uma mé- dia de 213 ao atingir uma concentração de 200 de TCID50/mL de es- toque. A % CV calcula para — 40% com um viés de cerca de + 7%. Es- se ruído foi levado em consideração no modelo de regressão logística para gerar intervalos de confiança em torno dos valores desejados pa- ra as diluições do vírus. Com um valor alvo de 0,01 TCID50/poço, um modelo baseado em e contabilizando todas as fontes de variação fixas e aleatórias nos dados de qualificação nos dois locais prevê que 0,86% dos poços serão positivos para CPE (1 em 60 poços). Como o limite de confiança inferior a 99% não inclui zero, há uma chance quantificável (<1%) muito pequena de que 0,85% dos poços positivos para CPE possam ter surgido de O TCID50/poço devido a ruído(Figura 27). Isso estabelece um limite de detecção para o ensaio: 0,01 TCID50/poço é a menor quantidade de partículas vivas Zika na amos- tra que pode ser detectada.
[00322] Características de desempenho do ensaio COI - Faixa: a faixa do ensaio foi de 0,01 TCID50/poço a 4,5 TCID50/poço e é defini- da como a faixa de vírus de entrada que resultou em uma pontuação de CPE +ve superior a 0%, mas menor que 100%.
[00323] Conclusão: A análise dos quatro Tox revelou que a inati- vação estava completa após a incubação em formaldeído 0,01% por dias em temperatura ambiente. A inativação foi alcançada pelos dias 3-4 em todos os lotes produzidos, conforme medido pelo ensaio COI. O ensaio COI é mais sensível que a potência do TCID50 ou me- dições de RNA; o aumento da sensibilidade também foi observado por LoD. Exemplo 5: Determinação do teor de formalina residual numa composição farmacêutica
1. Materiais e métodos
1.1 Materiais
[00324] A solução padrão de formaldeído (em metanol) (982 upg/mL), DNPH, acetonitrila de grau HPLC e ácido fosfórico foram ad- quiridos da Wako Pure Chemicals Co. (Tóquio, Japão). A água desti- lada usada para diluir o ácido fosfórico foi obtida da Otsuka Pharma- ceutical (Tokushima, Japão). Alhydrogel 2% (Correspondendo a 10 mg/mL alumínio) utilizado como gel de hidróxido de alumínio foi obtido da Brenntag (Frederikssund, Dinamarca). O PBS foi preparado inter- namente e o produto de fármaco contra a vacina Zika contendo gel de hidróxido de alumínio foi fabricado como descrito abaixo. O vírus foi purificado Zika com várias técnicas após a colheita. Após a inativação com formaldeído, o vírus foi concentrado e o tampão foi trocado com PBS por filtração. A substância de fármaco a granel foi diluída com PBS e formulada com gel de hidróxido de alumínio (0,4 mg/mL de alumínio) para formar o produto de fármaco final.
1.2 Condições de HPLC
[00325] Um sistema Waters Alliance HPLC equipado com um de- tector de UV (Milford, EUA) e uma coluna de fase reversa (YMC-Pack ODS-A, 4,6 mm x 250 mm, 5 um (Kyoto, Japão)) foi usado. Uma mis- tura de água e acetonitrila (1:1, v/v) foi usada como fase móvel, o comprimento de onda de detecção foi fixado em 360 nm e a taxa de fluxo foi de 1,0 mL/min. A temperatura da coluna e o volume de injeção foram de 25ºC e 50 yuL, respectivamente.
1.3 Preparação de amostras
[00326] O produto de fármaco da vacina (1,2 mL) foi centrifugado a 15000 rpm por 10 min, e o sobrenadante (1 mL) foi transferido para um frasco de vidro de 2 mL para HPLC adquirido da Waters (Milforad, EUA). Em seguida, foram adicionados 20 uL de ácido fosfórico a 20% (v/v) e 50 ul de solução de DNPH a 1,0 mg/mL em acetonitrila, e a mistura foi agitada e deixada à temperatura ambiente por 20 minutos antes da injeção.
1.4 Validação do método
[00327] De acordo com as diretrizes da ICH Q2, o método foi vali- dado em termos de especificidade, linearidade, precisão, repetibilida- de, precisão intermediária, robustez e estabilidade da amostra. No es- tudo de precisão, o produto de fármaco da vacina contra o Zika e a solução de gel de hidróxido de alumínio foram adicionados com uma quantidade específica de formaldeído, e a amostra foi bem misturada com vórtex antes de seguir o procedimento descrito na Seção 2.3.
2. Resultados e Discussão
2.1 Linearidade e especificidade
[00328] Seis soluções padrão de formaldeído (0,049, 0,098, 0,196, 0,491, 0,982 e 1,964 ug/mL) foram preparadas por diluição com PBS. Em seguida, 20% (v/v) de ácido fosfórico e 1 mg/mL de solução de DNPH em acetonitrila foram adicionados a cada solução, e os croma- togramas correspondentes são mostrados naFig. 28. Claramente, a área do pico de 10,4 min mostrou linearidade com a equação de re- gressão: y = 1075730x + 11731 (onde y é a área do pico de 10,4 minu- tos e x é a concentração de formaldeído em ug/mL) (coeficiente de correlação: 0,9998), indicando que foi devido ao HCHO-DNPH (isto é, formaldeído derivado com DNPH). Além disso, o pico em 5,8 min foi atribuído ao DNPH, pois foi detectado em todas as amostras adiciona- das com DNPH. Portanto, a área do pico HCHO-DNPH foi usada para avaliação da linearidade e precisão após subtrair a área do pico de fundo em PBS.
2.2 Precisão e exatidão (repetibilidade)
[00329] O efeito do adjuvante hidróxido de alumínio foi avaliado por estudos de recuperação, realizados por três amostras de hidróxido de alumínio (0,1, 0,4 e 1,0 mg/mL de alumínio) em PBS com 0,05 pug/mL de formaldeído na ausência da substância de fármaco da vacina. As recuperações médias foram de 102% (n = 3), 100% (n = 3) e 100% (n = 3), respectivamente, com valores baixos de desvio padrão relativo (RSD) (Tabela 13). O RSD dos dados de precisão foi calculado para avaliar a repetibilidade e foi de 1,0%, indicando que quantidades de alumínio de até 1,0 mg/mL não interferiram na recuperação do formal- deído.
Tabela 13 Precisão e repetibilidade avaliadas usando amostras de hi- dróxido de alumínio adicionadas com 0,05 ug/mL de formaldeído Concentração de hidróxido de alumínio Média (n = 3) [%] (0,2) (0,8) (0,3)
[00330] A precisão do método foi avaliada por estudos de recupera- ção, realizados com a injeção do produto de fármaco contra a vacina Zika contendo adjuvante de hidróxido de alumínio com três concentra- ções de formaldeído (0,05, 0,10 e 1,00 ug/mL), e os resultados médios de recuperação são mostrados na Tabela 14. O RSD dos dados de precisão foi calculado para avaliar a repetibilidade, e foi encontrado em 3,7%, indicando que os produtos de fármaco da vacina contra o zika formulados com hidróxido de alumínio não interferem na recuperação do formaldeído entre 0,05 e 1,00 ug/mL. Tabela 14 Precisão e repetibilidade avaliadas usando produtos de fármaco da vacina contra o Zika contendo hidróxido de alumínio com adição de formaldeído Concentração de formaldeído cravada Média (n = 3) [%]
2.4 Robustez
[00331] A robustez do método foi avaliada para determinar como a concentração de formaldeído nas amostras seria afetada por variações nos parâmetros experimentais durante a preparação da amostra. Con- siderando o impacto na eficácia da derivatização, a concentração de DNPH e ácido fosfórico foram selecionados como parâmetros monito- rados neste estudo. O efeito foi examinado variando as concentrações de DNPH e ácido fosfórico em + 0,1 mg/mL e + 5%, respectivamente. O formaldeído foi determinado em dois lotes de produto de fármaco de desenvolvimento sob cada condição e os resultados, mostrados na Tabela 15, sugerem que variações nas concentrações de DNPH e áci- do fosfórico não tiveram impacto significativo na determinação do for- maldeído. Tabela 15 Robustez do método Concentração de formal- Condição Concentração A concentração de — FE Fo e e o (*) condições definidas do método
Claims (57)
1. Método para inativar uma preparação de vírus Zika, ca- racterizado pelo fato de que compreende: (a) isolar a preparação de vírus Zika a partir de uma ou mais células cultivadas in vitro, em que as células são utilizadas para produzir a preparação de vírus Zika, em que o isolamento da prepara- ção de vírus Zika compreende uma ou mais etapas selecionadas de: (i) filtração em profundidade, (ii) troca de tampão e/ou diluição; (ili) cromatografia de troca iônica; e (b) tratar a preparação do vírus Zika com formaldeído, em que o resultado numérico da multiplicação da concentração de formal- deído, medida em % (p/v), com o período de incubação com formalde- ido, medido em dias, é de 0,025 a 0,5.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células são células não humanas.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri- zado pelo fato de que as células são células Vero.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a preparação do vírus Zika é obtida a partir de um inóculo contendo uma população heterogênea de vírus Zika.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a preparação do vírus Zika é obtida a partir de um isolado clínico.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a preparação do vírus Zika é obtida a partir de um isolado clonal do vírus Zika.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o isolado clonal do vírus Zika é obtido por purificação de placas.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que antes da purificação da placa é inoculada uma plurali- dade de células com um inóculo contendo uma população heterogê- nea de vírus Zika.
9. Método para inativar uma preparação de vírus Zika, ca- racterizado pelo fato de que compreende: (a) obter uma preparação de vírus Zika a partir de um isola- do clínico; e (b) tratar a preparação do vírus Zika com formaldeído, em que o resultado numérico da multiplicação da concentração de formal- deído, medida em % (p/v), com o período de incubação com formalde- ido, medido em dias, é de 0,025 a 0,5.
10. Método para inativar uma preparação de vírus Zika, ca- racterizado pelo fato de que compreende: (a) obter uma preparação do vírus Zika a partir de um inó- culo contendo uma população heterogênea de vírus Zika; e (b) tratar a preparação do vírus Zika com formaldeído, em que o resultado numérico da multiplicação da concentração de formal- deído, medida em % (p/v), com o período de incubação com formalde- ido, medido em dias, é de 0,025 a 0,5.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, caracterizado pelo fato de que a preparação do vírus Zika é tratada com formaldeído a uma concentração de 0,005% (p/v) a 0,02% (p/v).
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, caracterizado pelo fato de que a preparação do vírus Zika é tratada com formaldeído por oito a doze dias.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, caracterizado pelo fato de que a preparação do vírus
Zika é tratada com formaldeído por dez dias.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, caracterizado pelo fato de que a preparação do vírus Zika é tratada com formaldeído a uma temperatura de 15ºC a 30ºC.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, caracterizado pelo fato de que a preparação do vírus Zika é tratada com formaldeído a uma temperatura de 22ºC.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma etapa (c) de determinar a integridade da inativação.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracteriza- do pelo fato de que a etapa (c) compreende: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma prepa- ração de vírus Zika tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as cé- lulas de inseto por um primeiro período de tempo, produzindo assim um sobrenadante de célula de inseto; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o so- brenadante de célula de inseto produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação do vírus Zika contém um vírus residual de replicação que produz um efeito citopático nas células dos mamíferos.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracteriza- do pelo fato de que as células de inseto são selecionadas de células CCL-125, células Aag-2, células RML-12, células C6/36, células C7- 10, células AP-61, células A.t. GRIP-1, células A.t. GRIP-2, células A-t. GRIP-3, células UM-AVE1, células Mos. 55, células Sua1B, células 4a- 3B, células Mos. 42, células MSQ43, células LSB-AA695BB, células NIID-CTR e células TRA-171, como células C6/36.
19. Método, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, carac-
terizado pelo fato de que o primeiro período de tempo é de 3 a 7 dias.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 17 a 19, caracterizado pelo fato de que as células de mamífero são selecionadas de células VERO, células LLC-MK2, células MDBK, células MDCK, células ATCC CCL34 MDCK (NBL2), células MDCK 33016 (número de depósito DSM ACC 2219, conforme descrito em WOS97/37001), células BHK21-F, células HKCC e células de ovário de hamster chinês (células CHO), como células VERO.
21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 17 a 20, caracterizado pelo fato de que o segundo período de tempo é de 3 a 14 dias.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma etapa (d) de neutralizar a preparação do vírus Zika tratada com formaldeído com metabissulfito de sódio.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracteriza- do pelo fato de que a preparação do vírus Zika tratada com formaldeí- do é neutralizada pelo menos cinco, pelo menos sete, pelo menos no- ve, pelo menos 11 ou pelo menos 14 dias após o tratamento com for- maldeído.
24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma etapa (e) de preparar uma composição farmacêutica compreen- dendo a preparação inativada do vírus Zika.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracteriza- do pelo fato de que a preparação de vírus Zika é misturada com um adjuvante.
26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracteriza- do pelo fato de que o adjuvante pode ser selecionado do grupo que consiste em sais de alumínio, agonistas de receptores semelhantes a toll (TLR), lipídeos monofosforil A (MLA), lipídeos sintéticos A, miméti- cos ou análogos de lipídeo A, derivados de MLA, citocinas, saponinas, derivado de dipeptídeo muramil (MDP), oligos CpG, lipopolissacarídeo (LPS) de bactérias gram-negativas, polifosfazenos, emulsões, viros- somas, cocleatos, micropartículas de poli(lactídeo-co-glicolídeos) (PLG), partículas de poloxâmero, micropartículas, lipossomas, Adju- vante completo de Freund (CFA) e Adjuvante incompleto de Freund (IFA).
27. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracteriza- do pelo fato de que o adjuvante é um sal de alumínio, como fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio, sulfato de potássio e alumínio e Alhydrogel 85.
28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 25 a 27, caracterizado pelo fato de que pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pe- lo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de um ou mais antígenos na preparação do vírus Zika são adsorvidos no adju- vante.
29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, caracterizado pelo fato de que o vírus Zika compreen- de uma mutação na posição 98 de SEQ ID NO: 1 ou em uma posição correspondente à posição 98 da SEQ ID NO: 1.
30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracteriza- do pelo fato de que a mutação é uma mutação Trp98Gly na SEQ ID NO: 1.
31. Método, de acordo com a reivindicação 29 ou 30, carac- terizado pelo fato de que o vírus Zika não compreende uma mutação na proteína de envelope (E).
32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracteriza- do pelo fato de que a sequência que codifica a proteína do envelope é a mesma que a sequência correspondente na SEQ ID NO: 2.
33. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um vírus Zika inativado obtenível pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 32.
34. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um vírus Zika inativado e com um teor residual de formaldeído inferior a 50 pg/ml.
35. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 34, caracterizada pelo fato de que é obtida pelo método como de- finido em qualquer uma das reivindicações 1 a 32.
36. Método para determinar a integridade da inativação de uma preparação de arbovírus, caracterizado pelo fato de que compre- ende as etapas de: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma prepa- ração de arbovírus que foi submetida a uma etapa de inativação e in- cubar as células de inseto por um primeiro período de tempo, produ- zindo assim um sobrenadante de célula de inseto; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o so- brenadante de célula de inseto produzido em (i) e incubar as células de mamífero por um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação do arbovírus contém um vírus residual de replicação que produz um efeito citopático nas célu- las dos mamíferos.
37. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracteriza- do pelo fato de que o arbovírus é um flavivírus ou um alfavírus.
38. Método, de acordo com a reivindicação 36 ou 37, ca- racterizado pelo fato de que o arbovírus é um vírus Zika, um vírus do Nilo Ocidental, um vírus da Febre Amarela, um vírus encefalite japo- nesa, um carrapato borne-encephalitis vírus. um vírus dengue, um ví- rus encefalite de St. Louis, um vírus Chikungunya, um vírus
O'nyong'nyong ou um Mayarovirus.
39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 36 a 38, caracterizado pelo fato de que a preparação do arboví- rus foi submetida a um tratamento com detergente, formalina, peróxido de hidrogênio, beta-propiolactona (BPL), etilamina binária (BEI), acetil etilenoimina, azul de metileno ou psoraleno.
40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 36 a 39, caracterizado pelo fato de que as células de inseto são selecionadas de células CCL-125, células Aag-2, células RML-12, cé- lulas C6/36, células C7-10, células AP-61, células A.t. GRIP-1, células At. GRIP-2, células A.t. GRIP-3, células UM-AVE1, células Mos. 55, células Sua1B, células 4a-3B, células Mos. 42, células MSQ43, células LSB-AAG95BB, células NIID-CTR e células TRA-171, como células C6/36.
41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 36 a 40, caracterizado pelo fato de que o primeiro período de tempo é de 3 a 7 dias.
42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 36 a 41, caracterizado pelo fato de que as células de mamífero são selecionadas de células VERO, células LLC-MK2, células MDBK, células MDCK, células ATCC CCL34 MDCK (NBL2), células MDCK 33016 (número de depósito DSM ACC 2219, conforme descrito em WOS97/37001), células BHK21-F, células HKCC e células de ovário de hamster chinês (células CHO), como células VERO.
43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 36 a 42, caracterizado pelo fato de que o segundo período de tempo é de 3 a 14 dias.
44. Método, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 36 a 43, caracterizado pelo fato de que o método é capaz de detectar menos que 1,0 TCIDso do arbovírus.
45. Método para determinar o teor residual de formaldeído em uma composição farmacêutica compreendendo um vírus inativado, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) proporcionar uma composição compreendendo um vírus que foi tratado com formaldeído; (b) misturar a composição de (a) com ácido fosfórico e 2,4- dinitrofenil-hidrazina (DNPH), proporcionando assim uma mistura; (c) incubar a mistura de (b) sob condições adequadas; e (d) analisar a mistura para a presença de formaldeído resi- dual.
46. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracteriza- do pelo fato de que a composição de (a) contém um adjuvante.
47. Método, de acordo com a reivindicação 46, caracteriza- do pelo fato de que o adjuvante é hidróxido de alumínio.
48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 45 a 47, caracterizado pelo fato de que a composição de (a) con- tém 0,1 mg/ml a 1,0 mg/ml de hidróxido de alumínio como adjuvante.
49. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 45 a 48, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) compreende misturar 50 partes da composição de (a) com 1 parte de 15 a 25% (v/v) de ácido fosfórico e 2,5 partes de 0,9 a 1,1 mg/ml de DNPH.
50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 45 a 49, caracterizado pelo fato de que a mistura da composição de (a) com ácido fosfórico e 2,4-dinitrofenil-hidrazina (DNPH) é incu- bada à temperatura ambiente.
51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 45 a 50, caracterizado pelo fato de que a mistura da composição de (a) com ácido fosfórico e 2,4-dinitrofenil-hidrazina (DNPH) é incu- bada por 10 a 30 minutos.
52. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica-
ções 45 a 51, caracterizado pelo fato de que a mistura da composição de (a) com ácido fosfórico e 2,4-dinitrofenil-hidrazina (DNPH) é anali- sada por HPLC.
53. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracteriza- do pelo fato de que o HPLC é HPLC de fase reversa.
54. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracteriza- do pelo fato de que uma mistura de água e acetonitrila (1:1, v/v) é usada como uma fase móvel em HPLC.
55. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 45 a 54, caracterizado pelo fato de que o vírus é um vírus Zika inativado.
56. Método, de acordo com a reivindicação 55, caracteriza- do pelo fato de que o vírus Zika inativado foi tratado com formaldeído a 0,01% (p/v) por 10 dias a 22ºC.
57. Método, de acordo com a reivindicação 55 ou 56, carac- terizado pelo fato de que o vírus Zika compreende uma mutação na posição 98 de SEQ ID NO: 1 ou numa posição correspondente à posi- ção 98 da SEQ ID NO: 1, tal como uma mutação Trp98GIy na SEQ ID NO: 1.
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