KR20170066433A - 면역조절제 및 백신 성분으로서 바이러스 rna 분절 - Google Patents

면역조절제 및 백신 성분으로서 바이러스 rna 분절 Download PDF

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니르잘 바타라이
제임스 맥린든
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Abstract

본 명세는 병원성 T-세포 활성화와 관련된 염증의 억제를 포함하여, 면역 반응의 조절에 사용하기 위한 바이러스 RNA 분절을 수반하는 조성물 및 방법을 제공한다. 또한, 면역 반응의 조절을 담당하는 바이러스 서열의 변형은 개선된 백신 제형을 제공한다.

Description

면역조절제 및 백신 성분으로서 바이러스 RNA 분절 {VIRAL RNA SEGMENTS AS IMMUNOMODULATORY AGENTS AND VACCINE COMPONENTS}
본 출원은 2014년 9월 17일자로 출원된 미국 가 출원 제 62/051,727 호에 대한 우선권의 이점을 주장하며, 상기 출원의 전체 내용은 본 발명에 참고로 인용된다.
본 발명은 국립 알러지 및 감염성 질병 연구소에 의해 수여된 허가번호 RO1 AI-58740 및 원호부로부터의 탁월성 평가 허가 I01BX000207하에서 정부 지원으로 수행되었다. 미국 정부는 본 발명에 일정한 권리를 갖는다.
I. 발명의 분야
본 명세는 일반적으로 분자 생물학 및 바이러스학 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 염증성 병증, 특히 병적인 T-세포 활성화로부터 발생하는 염증성 병증를 치료하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 개선된 백신 제형 및 유전자 치료 방법에 관한 것이다.
II. 관련 분야의 설명
C형 간염 바이러스(HCV)는 세계적으로 1억 2천만 명이 넘는 사람들을 감염시키며 간 질환의 선도 원인이다(Lavanchy 2009 and Rehermann 2009). HCV 감염의 자발적인 클리어런스는 감염된 개인의 20% 내지 40%에서 발생하며, 상기 제거는 지속적인 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응과 관련된다(Shoukry et al., 2003, Grakoui et al., 2003, Thimme et al ., 2002, Cox et al ., 2005, Thimme et al ., 2001 and Lauer et al., 2004). 그럼에도 불구하고, 감염된 개인의 대략 70%에서 만성적인 바이러스 혈증이 발생하며 이는 간경변 및 간세포 암종에 이를 수 있다(Rehermann 2009 and Li and Lemon 2013). 만성적인 HCV 감염의 특징들 중 하나는 손상된 HCV-특이성 T 세포 반응 및 HCV-특이성 체액 및 세포 면역 반응의 지연된 개시이다(Cox et al ., 2005, Netski et al ., 2005, Chen et al ., 1999, Park et al ., 2013, Bowen and Walker 2005, Wedemeyer et al ., 2002 and Gruener et al ., 2001). HCV-특이성 간내 T 세포는 낮은 바이러스 부하와 관련되며 만성적인 HCV 감염 도중 기능적으로 손상된다(Spangenberg et al ., 2005 and Freeman et al ., 2003). 또한, HCV 감염은 감소된 T 세포 활성화와 관련되지만(Rehermann 2009, Park et al., 2013 and Rehermann 2007), 상기 효과에 대한 근원적인 기전들은 명확하지가 않다.
유효한 후천성 면역 반응(adaptive immune response)에 중요한 한 가지 요소는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 활성화이다(Medzhitov and Janeway 1998). 다수의 인자들, 예를 들어 T 세포 소멸을 발생시키는 동시-억제 수용체의 발현을 유도하는 지속적이고 높은 항원 바이러스 부하(Radziewicz 2007 and Urbani et al ., 2008), 조절성 T 세포의 확대, 면역 회피 돌연변이체의 선택(Cox et al ., 2005, Netski et al ., 2005 and Soderholm and Sallberg 2006), 및 면역-억제성 사이토킨의 발현(Terilli and Cox, 2013; Liang, 2013)이 HCV 감염 중 둔화된 T 세포 반응에 기여하는 것으로 보인다.
HCV는 주로 간세포에서 복제되며 감염은 높은 혈장 바이러스 부하(중간값 대략 3.5 x 105 게놈 사본/mL)를 이끌어낸다(Schijman et al ., 2004 and Matthewsw-Greer et al ., 2001). 감염된 간세포는 바이러스 RNA 및 E2 단백질(면역세포와 상호작용하여 면역세포 기능을 조절할 수 있다)(Dreux et al ., 2012, Serti et al ., 2011 and Tu et al., 2013)을 함유하는 바이러스 입자 및 세포외 소낭을 분비한다(Ramakrishnaiah et al., 2013, Cosset and Dreux 2014 and Masciopinto et al ., 2004). 또한, 바이러스 RNA는 감염된 개인의 T 및 B 림프구에서 발견되며(Schmidt et al ., 1997, Wang et al ., 1992, Fornasieri et al ., 2000, Zignego et al ., 2007), 혈장 중 고 농도의 HCV RNA 함유 입자는 림프구와 함께 HCV RNA와 단백질 간의 풍부한 상호작용을 생성시킨다.
인간 페기바이러스(HPgV; 이전에는 G형 간염 바이러스/GB 바이러스 C라 칭하였다)가 생체내 T 세포의 활성화 및 증식의 감소와 관련있는 것으로 보고되었다(Bhattarai et al., 2012, Stapleton et al ., 2011, Berzsenyi et al ., 2011, Stapleton et al ., 2009, Maidana-Giret et al., 2009, Nattermann et al ., 2003 and Schwarze-Zander et al ., 2010). HPgV 입자는 T 세포 수용체(TCR) 신호전달 경로의 하나의 중요한 근위 요소인 림프구-특이성 티로신 키나제(Lck)를 억제함으로써 시험관내에서 T 세포 활성화를 억제한다(Bhattarai et al ., 2013, Bhattarai and Stapleton 2012 and Bhattrarai et al ., 2012). 예측되는 Lck 기질 부위인 GBV-C 외막(envelope) 단백질(E2)내에 보존된 모티프는 억제에 충분하며, 상기 보존된 티로신의 알라닌으로의 돌연변이는 상기 T 세포 활성화의 억제를 역전시킨다(Bhattarai et al ., 2013, Bhattarai and Stapleton 2012 and Bhattrarai et al ., 2012). HPgV는 HCV에 밀접하게 관련된 인간 바이러스이므로, 상기 HCV E2 단백질 서열을 조사하였고 Lck 기질인 것으로 예측된 보존된 모티프들을 발견하였다.
HIV 감염은 HIV 매개된 면역 기능이상에 기여하는 만성적인 면역활성화와 관련되며, 면역 활성화는 HIV 복제 및 병인을 촉진한다(Grossman et al ., 2006; Hazenberg et al., 2003). 복합 항레트로바이러스 요법(cART)은 HIV 혈장 바이러스 부하(VL)를 억제하지만, 면역 활성화 마커의 수준은 일반적으로 HIV-감염되지 않은 개인에서 관찰되는 수준으로 복귀되지 않는다(Hunt et al., 2008; Vinikoor et al., 2013). 또한, HIV-치료된 개인에서 관찰되는 지속적인 면역 활성화는 HIV 요법에 대해 감소된 반응과 관련 있는 것으로 보고되었다(Deeks et al ., 2004; Hunt et al ., 2003). HIV-감염된 피험자들 중에서, HPgV 동시감염이 HIV VL 또는 cART와 무관한 감소된 면역 활성화와 관련되는데(Bhattarai et al ., 2012b; Maidana-Giret et al ., 2009; Stapleton et al ., 2012), 이는 GBV-C 감염이 면역 활성화 경로를 변경시킴을 암시한다. 시험관내에서 HPgV 복제는 T 세포 활성화에 의해 감소되기 때문에 (Rydze et al ., 2012), 면역 활성화를 억제하는 기전의 개발이 상기 바이러스에 이롭다. HPgV가 HIV-감염된 피험자에서 만성적인 면역 활성화를 감소시키는 기전의 이해는 HIV 감염 및 HIV 관련된 만성 면역 활성화를 치료하기 위한 접근법들을 제공할 수 있다. 실제로, 다수의 바이러스는 T 세포 활성화 경로를 방해함으로써 지속적인 감염을 야기할 가능성을 증가시킬 것이다. 더욱 또한, 항원 제시의 방해는 기억 T 및 B 세포 반응 또는 항체의 높은 역가를 이끌어내는 능력을 손상시킨다.
따라서, 본 명세에 따라, 면역세포 활성화의 억제가 필요한 포유동물 피험자에게 T 세포 면역-억제 도메인을 포함하는 바이러스 RNA 분절을 투여함을 포함하는, 상기 억제 방법을 제공한다. 상기 바이러스 RNA 분절은 T 세포 면역-억제 도메인의 약 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 400 또는 500개의 연속적인 염기를 포함할 수 있다. 상기 바이러스 RNA 분절은 HCV E2 서열, GBV-C E2 서열, YFV 외막 단백질 또는 HIV gp41 또는 gp120/160 서열을 암호화할 수 있다. 상기 바이러스 RNA 분절은 비-HCV E2 서열, 비-GBV-C E2 서열, 비-YFV env 서열 또는 비-HIV gp41 서열을 추가로 암호화할 수도 있다. 상기 T 세포는 헬퍼 T 세포 억제인자 T 세포, 또는 킬러 T 세포일 수 있다. 상기 피험자는 인간 또는 비-인간 포유동물일 수 있다. 상기 면역 세포 활성화는 특히 T 세포 활성화 또는 T 세포 수용체 신호전달일 수 있다.
투여는 정맥내, 동맥-내, 경구, 피하, 국소 또는 복강내 투여를 포함할 수 있다. 상기 방법은 제2 소염제, 예를 들어 스테로이드 또는 COX-2 억제제를 투여함을 추가로 포함할 수 있다. 상기 제2 소염제를 상기 바이러스 RNA 분절 전에 또는 상기 분절 다음에, 또는 상기 바이러스 RNA 분절과 동시에 접촉시킬 수 있다. 상기 바이러스 RNA 분절을 유전자 요법과 함께 제공할 수 있다. 상기 바이러스 RNA 분절은 적어도 하나의 비-천연 염기를 포함할 수 있다. 상기 바이러스 RNA 분절은 다이서(Dicer) 기질을 포함할 수 있다.
상기 바이러스 RNA 분절을 0.1 내지 500 ㎎/㎏/d로 투여할 수 있다. 상기 바이러스 RNA 분절을 매일 또는 매주, 예를 들어 7일, 2주, 3주, 4주, 1개월, 6주, 8주, 2개월, 12주, 또는 3개월 동안 매일, 또는 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 10주 또는 12주 동안 매주 투여할 수 있다. 상기 바이러스 RNA 분절은 인간 면역결핍 바이러스 외막 gp41 또는 gp120/160, 황열 바이러스 외막 단백질, 소 바이러스성 설사 바이러스 외막 단백질, 돼지 콜레라 바이러스 외막 단백질, 인플루엔자 외막 단백질, 뎅기열 바이러스 외막 단백질, 웨스트 나일 바이러스 외막 단백질, 및 일본 뇌염 바이러스 외막 단백질로부터 유래될 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 약학적으로 허용 가능한 담체 완충제 또는 희석제와 함께 제형화된, T 세포 면역-억제 도메인을 포함하는 바이러스 RNA 분절을 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 바이러스 RNA 분절이, 상기 분절이 유래된 고유(native) 바이러스 게놈의 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 30, 35, 40, 45, 50, 51, 75, 100개의 연속적인 염기를 포함할 수 있다. 상기 바이러스 RNA 분절의 길이가 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 30, 35, 40, 45, 50, 51, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 400 또는 500개 염기일 수 있다. 상기 바이러스 RNA 분절을 비-바이러스 서열에 융합시킬 수도 있다. 상기 조성물을 약학적 투여, 예를 들어 국소, 피부, 피하, 소화기 또는 비경구 투여용으로 제형화할 수 있다.
더욱 또 다른 실시태양에서, 포유동물 피험자에게 하나 이상의 변형된 T 세포 면역-억제 도메인을 포함하는 바이러스 RNA 분절을 투여함을 포함하는, 상기 피험자에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 상기 변형된 부위는 다이서 기질을 포함할 수 있다. 상기 RNA 바이러스는 레오비리다에(Reoviridae), 아트로비리다에(Atroviridae), 칼리시비리다에(Caliciviridae), 헤페비리다에(Hepeviridae), 피코르나비리다에(Picornaviridae), 토가비리다에(Togaviridae), 플라비비리다에(Flaviviridae), 코로나비리다에(Coronaviridae), 오쏘믹소비리다에(Orthomyxoviridae), 아레나비리다에(Arenaviridae), 분야비리다에(Bunyaviridae), 파라믹소비리다에(Paramyxoviridae), 필로비리다에(Filoviridae), 라브도비리다에(Rabdoviridae) 또는 레트로비리다에(Retroviridae) 과로부터 유래될 수 있다. 상기 RNA 바이러스는 GBV-C, C형 간염 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 뎅기열 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 소 바이러스성 설사 바이러스, 돼지 콜레라 바이러스 또는 황열 바이러스일 수 있다. 상기 바이러스 RNA 분절은 다른 바이러스 서열이 없을 수도 있다.
상기 바이러스 RNA 분절을 발현 벡터, 예를 들어 바이러스 발현 벡터로부터 발현을 통해 전달할 수 있다. 상기 바이러스 RNA 분절을 지질 비히클 또는 나노입자 중에 포함시킬 수 있다. 상기 바이러스 RNA 분절을 특유의 혈청형 또는 상기 바이러스의 균주로부터의 제2 바이러스 RNA 분절과 함께 투여할 수 있다. 상기 바이러스 RNA 분절을 1회를 초과하여 투여할 수 있다. 상기 바이러스 RNA 분절을 항원보강제와 함께 제형화할 수 있다. 상기 바이러스 RNA 분절은 바이러스 당단백질 중의 면역조절 도메인에 대한 변형을 포함할 수 있다. 상기 바이러스 RNA 분절은 HCV E2-암호화 영역, 및 HIV gp41- 또는 gp120/160-암호화 영역 또는 GBV-C E2-암호화 영역으로부터의 것일 수 있다. 상기 부위는 다이서 기질을 포함한다. 상기 피험자는 인간 피험자 또는 비-인간 동물 피험자일 수 있다.
또한 T 세포 면역-억제 도메인 중에 변형을 갖는 바이러스 RNA 분절을 포함하는 백신을 제공한다. 상기 변형은 결실된 분절 또는 돌연변이된 분절을 포함할 수 있다. 상기 바이러스 RNA 분절은 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 30, 35, 40, 45, 50, 51, 75, 또는 100개의 연속적인 잔기의, 상기 분절이 유래된 고유 바이러스 게놈을 포함할 수 있다. 상기 바이러스 RNA 분절은 길이가 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 30, 35, 40, 45, 50, 51, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 219 또는 250 염기일 수 있다. 상기 바이러스 RNA 분절을 비-바이러스 서열에 융합시킬 수도 있다. 상기 백신을 항원보강제와 함께 제형화할 수 있다. 상기 바이러스 RNA 분절은 HCV E2-, YFV Env, HIV gp41-, HIV gp120/160 또는 GBV-C E2-암호화 영역으로부터 유래될 수 있다.
또 다른 실시태양은 피험자에게 상기 피험자의 세포에서 작동할 수 있는 프로모터의 조절하에서 이종 유전자 분절을 포함하는 발현 카세트를 투여함을 포함하는, 상기 피험자에서 유전자 전달을 수행하는 방법을 포함하며, 여기에서 상기 발현 카세트는 T 세포 면역-억제 도메인을 포함하는 바이러스 RNA 분절을 추가로 포함한다. 상기 바이러스 RNA 분절은 상기 분절이 유래된 고유 바이러스 게놈의 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 30, 35, 40, 45, 50, 51, 75, 100개의 연속적인 염기를 포함할 수 있다. 상기 바이러스 RNA 분절의 길이가 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 30, 35, 40, 45, 50, 51, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 400 또는 500개 염기일 수 있다. 상기 바이러스 RNA 분절을 비-바이러스 서열에 융합시킬 수도 있다. 상기 조성물을 약학적 투여, 예를 들어 국소, 피부, 피하, 소화기 또는 비경구 투여용으로 제형화할 수 있다.
더욱 또 다른 실시태양에서, 포유동물 피험자에게 바이러스 RNA 분절을 투여함을 포함하는 상기 피험자에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 바이러스 RNA 분절은 하나 이상의 변형된 T 세포 면역-억제 도메인을 포함한다. 상기 변형된 부위는 다이서 기질을 포함할 수 있다. 상기 RNA 바이러스는 레오비리다에, 아트로비리다에, 칼리시비리다에, 헤페비리다에, 피코르나비리다에, 토가비리다에, 플라비비리다에, 코로나비리다에, 오쏘믹소비리다에, 아레나비리다에, 분야비리다에, 파라믹소비리다에, 필로비리다에, 라브도비리다에 또는 레트로비리다에 과로부터 유래될 수 있다. 상기 RNA 바이러스는 GBV-C, C형 간염 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 뎅기열 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 소 바이러스성 설사 바이러스, 돼지 콜레라 바이러스 또는 황열 바이러스일 수 있다. 상기 바이러스 RNA 분절은 다른 바이러스 서열이 없을 수도 있다. 상기 바이러스 RNA 분절은 다이서 기질을 포함할 수 있다.
더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 HCV RNA의 표적은 신규의 T 세포 면역 조절제로서 확인되었다. 상기 표적은 포스파타제(단백질 티로신 포스파타제 수용체 유형 E 또는 입실론, PTPRE라 약기함)이다. PTPRE는 HCV RNA 외막 E2 및 YFV 외막 RNA 모두에 의해 감소되며, 상기 유전자의 완전한 녹다운은 상기 세포를 비-생육성으로 만든다. 그러나, HCV 및 YFV RNA는 완전한 상보성을 갖지 않으며, 따라서 단지 PTPRE 단백질 발현을 감소시킬 뿐이며, 이는 차례로 T 세포 활성화 및 기능성 반응을 감소시킨다. 이러한 부분적인 T 세포 억제는 충분한 면역 결핍을 이끌어내지 못하고 T 세포 반응을 손상시키기 때문에, PTPRE는 면역 억제 요법에 대한 신규의 표적으로서 확인된다. 따라서, 핵산-기반 방법(miRNA, siRNA, shRNA, 안티센스 등)을 사용하는 부분적인 억제는 단지 통상적인 실험을 사용하여, 즉 완전한 또는 높은 상보성을 갖는 분자로 시작하고 연속적인 변화를 수행하여 상보성을 감소시키고, 이에 의해 면역 기능이 둔화 되도록(완전히 제거되는 것은 아니지만) 억제 수준을 조절함으로써(즉 상기 세포를 비-생육성으로 만들어) 성취될 수 있다. 인식을 위해 "시드 서열"에 의존하는 억제성 RNA를 수반하는 상황에서, 상기 시드 서열은 완전하게 또는 고도로 상보적으로 남아있을 것이며, 다른 서열들은 상보성이 감소될 것으로 예상된다. 예를 들어, 시드 서열 상보성은 약 80%를 초과할 수 있는 반면, 다른 영역들은 20 내지 60% 상보적일 수 있다.
또한 하기 서열을 갖는 핵산을 포함하는 약학 조성물을 제공한다:
CTCACGCCAAGGTGCCTGATCGACTACCCCTACAGGCTCTGGCATTATCC (서열번호 3),
CTCACGCCAAGGTGCCTGATCGACTACCCCTACAGGCTCTGGCATTACCCC (서열번호 4), 또는
GACAACAACCTTTACAAACTACATGGT (서열번호 5).
상기 약학 조성물은 또한 GCATTATCC (서열번호 38), GCAUUAUCC (서열번호 39), GCATTACCCC (서열번호 40), GCAUUACCCC (서열번호 41), CUUUACAAAA (서열번호 42), 또는 CTTTACAAA (서열번호 43) 중에서 선택된 핵산 서열을 포함할 수 있으며, 여기에서 상기 핵산은 적어도 약 20개 염기쌍 및 약 55개 이하의 염기쌍으로 필수적으로 이루어진다. 특정 길이는 22, 27 및 51개 뉴클레오티드를 포함한다.
"하나의"란 단어의 사용은 청구항 및/또는 명세서에서 "포함하는"이란 용어와 함께 사용될 때 "하나"를 의미할 수 있지만, "하나 이상", "적어도 하나", 및 "하나 또는 하나보다 많은"의 의미와 또한 일치한다. 더욱 또한, 공정 방법의 다수의 단계들이 인용되는 경우에, 상기 단계들을, 당해 분야의 숙련가가 상기 방법을 상이한 순서로 실시할 수 있는 한, 인용된 특정한 순서로 수행할 필요는 없다.
본 명세의 다른 목적, 특징 및 이점들은 하기의 상세한 기재로부터 자명해질 것이다. 그러나, 상기 상세한 기재 및 구체적인 실시예는, 상기 명세의 몇몇 실시태양을 나타내지만, 단지 예시로서 제공되며, 따라서 상기 명세의 진의 및 범위내의 다양한 변화 및 변형들은 상기 상세한 기재로부터 당해 분야의 숙련가들에게 자명해질 것이다.
하기의 도면들은 본 명세서의 부분을 형성하며 본 명세의 몇몇 태양들을 추가로 설명하기 위해 포함된다. 상기 명세는 본 명세서에 제공된 특정 실시태양들의 상세한 기재와 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참조하여 보다 양호하게 이해될 수 있다.
도 1A 내지 D. HCV 혈청 입자는 1차 인간 T 림프구에서 T 세포 수용체( TCR ) 신호전달을 억제한다. 건강한 공여체 PBMC를 다양한 유전자형 및 하위유형들(GT; 1, 1a, 1b, 2, 2b 및 3)로 감염된 HCV 양성(HCV+) 인간으로부터 수득된 혈청 또는 HCV 음성 대조용 혈청(C1-C4)과 함께 인큐베이션하고 IL-2 방출(도 1A) 및 CD69 표면 발현(도 1B)을 항-CD3/CD28에 의한 TCR 자극에 이어서 측정하였다. CD69 MFI는 4개의 HCV 음성 및 6개의 HCV-양성 혈청 샘플들의 평균을 나타낸다. 표준 편차를 나타낸다. 다양한 용량의 풀링된(pooled) HCV 양성 또는 HCV 음성 혈청과 함께 인큐베이션된 인간 PBMC에 의한 TCR-유도된 IL-2 방출(도> 1C). 유전자형들(GT; 1, 1a, 1b, 2, 2b 및 3)로부터의 HCV-양성 혈청 또는 HCV 음성 혈청(C1-C4)과 인큐베이션된 정제된 1차 인간 CD3+ T 세포에 의한 IL-2 방출(도 1D). US = 자극되지 않은 세포. MFI = 평균 형광 강도. 데이터는 3개의 기술적 복제물의 평균을 나타낸다. 표준 편차를 나타내며, 각각의 연구를 유사한 결과로 상이한 공여체를 사용하여 독립적으로 3회 수행하였다. *P<0.05; **P<0.01.
도 2A 내지 F. HCV 혈청 유래된 세포외 소낭(EV)은 1차 인간 T 림프구에서 T 세포 수용체( TCR ) 신호전달을 억제한다. 건강한 공여체 PBMC를 HCV-감염된 환자 혈청으로부터 수득한 풀링된 혈청 세포외 소낭(EV)과 인큐베이션하였다(HCV+EV; GT; 1, 1a, 1b, 2, 2b 및 3). TCR 유도된 IL-2(도 2A) 및 CD69 표면 발현(도 2B)을 측정하였다. HCV-양성 또는 음성 혈청과 37 ℃ 또는 4 ℃에서 2시간 동안 인큐베이션된 인간 T 세포에 의한 TCR 유도된 IL-2 방출(도 2C). 유식 세포측정에 의해 측정된 바와 같은, CFSE 양성 혈청 EV의 분석(도 2D) 및 1차 인간 T 세포에 의한 CFSE+ EV의 흡수(도 2E). HCV RNA를 HCV-양성 혈청으로부터의 EV, 및 HCV-양성이지만 음성은 아닌 혈청과 인큐베이션된 인간 PBMC에서 RT-PCR을 사용하여 HCV RNA를 검출하였다(도 2F). HCV RNA US = 자극되지 않은 세포. MFI = 평균 형광 강도. 데이터는 표준 편차와 함께 3개의 기술적 복제물의 평균을 나타내며, 각각의 연구를 유사한 결과로 상이한 공여체를 사용하여 독립적으로 3회 수행하였다. *P<0.05; **P<0.01.
도 3A 내지 D. HCV 세포 유래된 입자( HCVcc ) 및 HCV 외막 위형 ( pseudotyped ) 레트로바이러스 입자( HCVpp )는 1차 인간 T 세포에서 T 세포 수용체( TCR ) 신호전달을 억제한다. Huh7.5 세포에서 생성된 HCVcc는, 항-CD3/CD28에 의한 TCR 자극에 이어서 모의-형질감염된 Huh7.5 세포 배양 상등액 유체 중에서 인큐베이션된 세포에 비해, 인간 말초 혈액 단핵 세포에서 TCR-매개된 IL-2 방출(도 3A) 및 CD69 표면 발현(도 3B)을 억제하였다. 유사하게, HCVpp는 레트로바이러스 GAG 입자에서 인큐베이션된 세포에 비해 TCR-매개된 IL-2 방출(도 3C) 및 CD69 표면 발현(도 3D)을 용량-관련된 방식으로 억제하였다. US = 자극되지 않은 세포. MFI = 평균 형광 강도. 데이터는 3개의 기술적 복제물의 평균을 나타낸다. 표준 편차를 나타낸다. 각각의 연구를 유사한 결과로 상이한 공여체를 사용하여 독립적으로 3회 수행하였다. *P<0.05; **P<0.01.
도 4A 내지 E. HCV 외막 단백질 E2는 T 세포 수용체( TCR )- 매개된 신호전달을 억제한다. 주르캣 대조용 세포(JC) 또는 HCV E2 단백질을 안정하게 발현하는 주르캣 세포를 항-CD3 및 항-CD28로 자극하였다. 24시간 후에, IL-2 방출(도 4A)을 측정하였다. 림프구 특이성 티로신 키나제(Lck Y394; 도 4B(603-619 = 서열번호 6)), 제타-쇄-관련된 단백질 키나제(ZAP)-70(Y319; 도 4C) 및 T 세포의 활성화를 위한 링커(LAT, Y226; 도 4D(603-619 = 서열번호 6))의 인산화 및 활성화를, 항-CD3을 사용하는 TCR 활성화에 이어서 상기 대조용(JC)과 비교하여 HCV E2 발현 주르캣 세포에서 분석하였다. 절두된 또는 치환 돌연변이체 HCV E2 단백질 발현 주르캣 세포에서 방출된 IL-2를 도 4E에 나타낸다. 상기 아미노산 번호는 HCV 폴리단백질상의 그의 위치와 관련된다. Lck, ZAP-70 및 LAT에 대한 포스포-블럿을 적어도 3회 수행하였으며 결과가 일치하였다. 데이터는 3개의 기술적 복제물의 평균을 나타낸다. 표준 편차를 나타낸다. 모든 연구를 적어도 3회 반복하였으며 결과가 일치하였다. *P<0.01, ns = 유의수준이 아니다.
도 5A 내지 D. HCV 외막(E2) 암호화 RNA는 근위 T 세포 수용체( TCR ) 신호전달을 억제하기에 충분하다. 유전자형(GT) 2a 및 GT3, 또는 4개의 시토딘 잔기가 알라닌 잔기로 바뀐 GT 2a 서열에 속하는 단리물로부터 단백질 발현을 없애는 프레임-이동 돌연변이와 함께 HCV 외막(E2) RNA(aa 384-703을 암호화한다)를 안정하게 발현하는 주르캣 세포를 생성시켰다. 상기 주르캣 세포로부터 TCR 유도된 IL-2 방출을, 항-CD3/CD28에 의한 24시간 자극 후에 측정하였다(도 5A). 림프구 특이성 티로신 키나제(Lck)의 활성화를, 항-CD3 자극에 이은 포스포Y394에 대한 면역블럿팅에 의해 측정하였다(도 5B). 전체 Lck는 로딩 대조용으로서 사용되었다. 상이한 HCV 유전자형(GT) 및 돌연변이체로부터의 HCV E2(aa 603-619) 암호화 영역의 RNA 서열을 도 5C에 나타낸다(GT-2a = 서열번호 7; GT-3 = 서열번호 8; GT-2a 돌연변이체 = 서열번호 9). 보존된 서열은 밑줄을 긋고 GT 2a 서열에 도입된 돌연변이는 *에 의해 나타낸다(도 5C). 작은 RNA를 3'-링커 결찰 및 특이성 cDNA 합성에 따라 증폭시켰다. 작은 RNA를 클로닝하고 서열분석하였으며, 상기 HCV E2 영역 암호화(aa 590-621)가 HCV E2 단백질을 발현하는 주르캣 세포에서 검출되었다. 도 5D는 플라스미드(pCR2.1)의 부분 서열 및 HCV E2 RNA 증폭 산물에 이어서 올리고뉴클레오티드 링커 서열(서열번호 10)을 나타낸다. 데이터는 3개의 기술적 복제물의 평균을 나타낸다. 표준 편차를 나타낸다. 각각의 연구를 적어도 3회 반복하였으며 결과가 일치하였다. *P<0.01, ns = 유의수준이 아니다.
도 6A 내지 F. HCV E2 RNA는 단백질 티로신 포스파타제 수용체 유형 E(PTPRE) 발현을 억제한다. PTRRE 3' 번역되지 않은 영역(UTR)내 2개 부위의 서열 정렬은 HCV E2 RNA(aa 603-619) 영역에의 결합을 예측하였다(도 6A; 부위 1 - PTPRE 3'UTR = 서열번호 11, HVC E2 RNA = 서열번호 12; 부위 2 - PTRRE 3'UTR = 서열번호 13, HVC E2 RNA = 서열번호 14). 대조용, HCV E2 RNA 또는 HCV E2 돌연변이 RNA 발현 주르캣 세포, 또는 전장 HCV 레플리콘(FL) 또는 비-구조 단백질(NS) 발현 레플리콘을 발현하는 Huh7 세포에서 PTPRE 단백질 수준의 면역블럿 분석. 상부 밴드는 막관통 도메인을 갖는 전장 PTPRE(동형-1)를 나타내고 하부 밴드는 세포질 PTPRE(동형-2)를 나타낸다. GAPDH는 로딩 대조용으로서 사용된다(도 6B). GFP 단독 또는 GFP와 패널 A에 나타낸 PTPRE 3'UTR 서열을 함께 암호화하는 플라스미드 DNA 1 ㎍ 및 HCV E2를 암호화하거나(도 6C) 또는 HCV-양성 혈청과 인큐베이션된(도 6D) 플라스미드 DNA 5 ㎍으로 동시-형질감염된 HEK 293 세포에 의한 GFP 발현 및 72시간 후에 측정된 GFP 발현. 데이터는 3개의 기술적 복제물의 평균을 나타내며 각각의 연구를 적어도 3회 반복하였고 결과가 일치하였다. PTPRE를 표적화하는 HCV E2의 영역을 세포 케모킨 수용체 CXCR4(도 6E; 서열번호 15)를 표적화하는 서열로 교체하고, 상기 서열을 안정하게 발현하는 주르캣 세포를 생성시켰다. CXCR4는 상기 CXCR4를 표적화하는 HCV E2 서열을 발현하는 주르캣 세포에서 감소되었지만, 고유 HCV E2 RNA 서열을 발현하는 주르캣 세포에서는 감소되지 않았다(도 6F). *P<0.01.
도 7A 내지 D. HCV E2 단백질은 원위 T 세포 수용체( TCR ) 신호전달을 억제한다. 지시된 바와 같이 전장 또는 다양한 절두된 또는 티로신 613 돌연변이 HCV E2 단백질 단편을 발현하는 주르캣 세포에 의한 PMA+이오노마이신(P+I) 매개된 IL-2 방출(도 7A). 재조합 HCV E2 단백질은 시험관내 키나제 반응에서 Lck에 의해 인산화되었으며, CD45 포스파타제에 의해서는 탈인산화되었다(도 7B). 주르캣 세포에서 발현된 HCV E2 단백질(고유, 또는 Y613A 돌연변이체)은 항-CD3에 의한 TCR 자극 전(-) 또는 후(+)에 침전되었다. E2 및 포스포-E2가 각각 E2 특이성 항체 또는 항-포스포티로신 항체에 의한 면역블럿에 의해 검출되었다(도 7C). 100 ㎍/㎖ Lck 억제제 또는 비히클 대조용(DMSO) 중에서 인큐베이션된 P+I 매개된 IL-2 방출 대조용 주르캣 세포(JC) 또는 HCV E2-발현 주르캣 세포(384-747)(도 7D). 데이터는 3개의 기술적 복제물의 평균을 나타낸다. 표준 편차를 나타낸다. 각각의 연구를 적어도 3회 반복하였으며 결과가 일치하였다. *P<0.01.
도 8A 내지 D. HCV E2 단백질은 NFAT 핵 전좌를 억제한다. 면역블럿에 의해 측정된 바와 같은, 주르캣 대조용 세포 또는 HCV E2 발현 세포 중 활성화된 T 세포의 핵 인자(NFAT)의 탈인산화(도 8A) 및 핵 전좌(도 8B). 핵 전사 인자 Yin Yang 1(YY1)은 핵 국소화용 로딩 대조용으로서 사용되었다. P+I 매개된 IL-2는 유전자형(GT; 1, 1a, 1b, 2, 2b 및 3)으로 감염된 HCV 양성(HCV+) 인간 HCV 음성(HCV-) 인간 피험자(C1-C4)로부터 수득된 혈청(도 8C) 또는 세포-배양물 유래된 HCV 입자(HCVcc) 및 HCV 외막(E1-E2; HCVpps) 또는 Y613F 돌연변이를 함유하는 HCV 외막(HCVpp Y613F)을 갖는 위형 레트로바이러스 입자(도 8D)와 함께 인큐베이션된 1차 건강한 공여자 말초 혈액 단핵세포(PBMC)로부터 방출되었다. US = 자극되지 않음, 및 S = 자극됨(혈청 없음). 데이터는 3개의 기술적 복제물의 평균을 나타낸다. 표준 편차를 나타낸다. 각각의 연구를 적어도 3회 반복하였으며 결과가 일치하였다. *P<0.01.
도 9. HCV 감염 중 T 세포 수용체( TCR ) 신호전달의 억제에 대해 제안된 모델. 간세포의 HCV 감염은 HCV RNA 및/또는 E2 단백질을 함유하는 자손 HCV 비리온 및 세포외 소낭의 방출을 발생시킨다. 바이러스 RNA 및/또는 E2 단백질은 입자 상호작용 중에 T 세포내로 방출된다. HCV 외막 RNA는 단백질 티로신 포스파타제 E(PTPRE) 발현을 억제하는 작은 RNA로 가공되고, TCR 진입(TCR engagement)에 따른 손상된 Lck 활성화 및 근위 TCR 신호전달의 결함을 생성시킨다. HCV E2 단백질은 Lck-매개된 인산화에 대해서 경쟁하고 Y613에서 인산화된 HCV E2는 NFAT 핵 전좌를 억제하여, 원위 TCR 신호전달을 억제한다. HCV E2 RNA 및 단백질에 의한 근위 및 원위 TCR 신호전달의 억제는 HCV 감염 동안 손상된 T 세포 기능에 기여한다.
도 10A 내지 B. 정제에 따른 CD3+ T 림프구의 순도.
도 11. 혈청으로부터 정제된 세포외 소낭(EV)의 특성화 및 HCV RNA의 정량분석.
도 12A 내지 E. HCVcc 및 HCVpp는 정제된 CD3+ T 세포에서 TCR 신호전달을 억제한다.
도 13A 내지 D. HCV의 발현 및 TCR 신호전달 분자(603-619 = 서열번호 6)의 활성화에 대한 E2의 영향.
도 14A 내지 B. Lck 조절 단백질에 대한 HCV E2 단백질의 영향.
도 15A 내지 B. 주르캣 세포에서 GFP 및 HCV E2 단백질의 발현.
도 16. 근위 TCR 신호전달을 억제하는 HCV E2 RNA 모티프에 대해 예측되는 구조 및 다이서 절단 부위(GT-2a = 서열번호 7; GT-3 = 서열번호 8; GT-2a 돌연변이체 = 서열번호 9).
도 17. PTPRE mRNA는 HCV E2 RNA에 의해 변경되지 않는다.
도 18A 내지 C. HCV E2 단백질, CD69로의 신호전달, 및 NFAT 조절 분자와의 상호작용.
도 19. HCV E2 단백질은 CD69의 근위 활성화( 원위 활성화는 아님)를 억제한다.
도 20A 내지 B. HCV E2 vsRNA -1 발현은 생체내에서 PTPRE를 억제한다. 전형적인 간 생검(도 20A) 및 말초 혈액 단핵세포 샘플(PBMC, 도 20B)에서 PTPRE 단백질 수준. 대조용 간 조직(HCV 음성)은 다른 형태의 간 질환(그러나 HCV 감염은 없는)을 갖는 개인으로부터의 간 생검을 나타낸다. 대조용 PBMC(HCV+)는 HCV, HIV, 또는 HBV로 감염되지 않은 건강한 공여자로부터 유래된다(도 20B). 액틴 하우스키핑 유전자 대조용은 젤 중에 로딩된 세포 단백질의 양을 나타낸다. 도 20C는 HCV 음성 및 양성인 사람들로부터의 간 조직 중 PTPRE 대 액틴의 비, 및 추가적인 HCV 감염된 피험자로부터의 PBMC 중 PTPRE:액틴 비를 나타낸다.
도 21A 내지 D. YFV 및 이하선염 바이러스 복제에 대한 Lck 결핍의 영향. YFV(백신 균주 17D)는 Lck가 없는 세포(JCAM(Lck-))에서 충분히 복제되었지만 Lck를 발현하는 주르캣 세포(Lck+)에서는 덜 충분히 복제된 반면(도 21A), 이하선염은 Lck의 존재 및 부재하에 주르캣 세포에서 복제되었다(도 21B). 감염 전 T 세포의 활성화는 YFV 복제를 감소시켰으며(도 21C), 활성화 전 감염은 추가의 복제를 억제하였다(도 21D).
도 22. Lck의 억제는 증대된 YFV 복제를 생성시켰다. GE/mL = 게놈 당량/mL. GE는 TCID50 분석에 의해 측정된 바와 같이 감염성과 충분한 상관성이 있다.
도 23. YFV로 감염되거나 UV-불활성화된 YFV와 인큐베이션된 세포에서 TCR 자극(항-C3/CD28)에 따른 1차 인간 T 세포에 의해 방출된 IL-2.
도 24. YFV 게놈 구성을 나타내며, Lck 기질이 될 것으로 예측되는 2개의 보존된 티로신 및 외막(적색)을 나타낸다. 주르캣 세포 대조용(JC), 고유 YFV 외막 YFVn, Y274F 및 Y274A 돌연변이를 갖는 전장 env, 예측된 Lck 기질 부위를 함유하는 펩티드(274 pep; 35 pep), 예측된 Lyn 부위를 함유하는 펩티드(96 Lyn), 및 RNA를 발현하지만 YFV 외막 단백질은 발현하지 않는 프레임 이동을 갖는 YFV 외막 암호화 영역(YFV FS)에 대한 항-CD3/CD28 자극 후 IL-2 반응을 나타낸다.
도 25. 마우스에서 YFV 감염의 영향. 마우스를 본문에 기재된 바와 같이 대조용 배지, UV-불활성화된 YFV 또는 감염성 YFV로 면역시켰다. 비장 및 배액 림프절을 기재된 바와 같이 ova-알룸 면역 및 추가 면역 후에 제거하고, 생체외에서 지시된 농도의 ova로 자극하였다. 상이한 조직들로부터의 IL-2 및 IFN-γ 방출을 나타내며 이들은 반대 효과를 가졌다. YFV는 사이토킨 분비를 감소시켰다. ova-특이성 항체가 또한 YFV 면역 마우스에서 감소되었다.
도 26. 마우스에서 이하선염 감염의 영향. 마우스를 본문에 기재된 바와 같이 대조용 배지, UV-불활성화된 이하선염 또는 감염성 이하선염으로 면역시켰다. 비장 및 배액 림프절을 기재된 바와 같이 ova-알룸 면역 및 추가 면역 후에 제거하고, 생체외에서 지시된 농도의 ova로 자극하였다. 상이한 조직들로부터의 IL-2 및 IFN-γ 방출을 나타내며 이들은 반대 효과를 가졌다. 이하선염은 사이토킨 분비를 증가시켰다.
도 27. TCR 신호전달 경로와 함께 바이러스 외막 단백질 및 RNA 상호작용의 조사결과에 대한 요약. 단백질 및 RNA(HCV, YFV, GBV-C, HIVgp41)는 근위 신호전달을 억제하는 반면 단백질 및 Lck는 원위 TCR 신호전달을 감소시킨다.
도 28. PTPRE 활성의 ELISA 기반 분석. 재조합 PTPRE(100 ng)를 신선한 포스파타제 희석 완충제에서 37 ℃에서 1시간 동안 pNPP 기질과 인큐베이션하였다. 활성 PTPRE를 제외하고 모든 것을 갖는 블랭크 웰을 또한 제조하였다. 흡광도를 405 ㎚에서 판독하였으며, 값들은 PTPRE 함유 웰 - 블랭크 웰을 나타낸다.
도 29A 내지 C. YFV TCR 억제. YFV RNA 서열을 2개의 PTPRE 3'utr 서열과 정렬한다(도 29A; 부위 1 - PTPRE 3'UTR = 서열번호 18, YF Env = 서열번호 19; 부위 2 - PTPRE 3'UTR = 서열번호 20, YF Env = 서열번호 21). 돌연변이는 시드 서열(UUUACAAAA; 서열번호 22) 중 2개의 뉴클레오시드의 돌연변이가 TCR 신호전달을 복원하였음을 나타낸다(도 29B; Y274 = 서열번호 23; Y274F = 서열번호 24; Y274A = 서열번호 25; Y274G = 서열번호 26). YFV(이하선염 바이러스 감염은 아니지만)는, MRC-5 세포 중 PTPRE 단백질 수준을 감소시켰다(도 29C).
앞서, GBV-C 및 다른 RNA 바이러스가 면역활성화를 감소시키는 잠재적인 기전들을 조사하였다. 지속적인 인간 페기바이러스(Pegivirus) GBV-C 외막 당단백질 E2에 의해 매개되는 림프구-특이성 단백질 티로신 키나제(Lck)에 대한 경쟁을 통해 T 세포 수용체(TCR) 신호전달을 억제하는 신규의 바이러스 기전을 발견하였다. C형 간염 바이러스(HCV) 및 황열 바이러스(YFV, 17D 균주)가 T 세포 활성화를 유사하게 억제하고, 상기 외막 당단백질 및 상기 두 바이러스 모두의 외막 암호화 영역이 모두 T 세포 활성화를 방해함을 나타내는 추가적인 데이터가 제공되었다. 마이크로RNA로 가공될 것으로 예측되는, 상기 두 바이러스 모두에서 고도로 보존된 RNA 서열이 확인되었다. 이들 서열은 PTPRE, 또는 수용체-유형 티로신-단백질 포스파타제 입실론(인간에서 상기 PTPRE 유전자에 의해 암호화되는 효소)을 표적화한다. 상기 유전자에 의해 암호화된 단백질은 단백질 티로신 포스파타제(PTP)과의 일원이다. PTP는 세포 성장, 분화, 유사분열 주기, 및 발암성 형질전환을 포함한 다양한 세포 과정들을 조절하는 신호전달 분자인 것으로 공지되어 있다. 상기 유전자의 2개의 선택적으로 이어맞춰진 전사물 변이체가 보고되었으며, 이중 하나는 짧은 세포외 도메인, 단일 막관통 영역, 및 2개의 나란한 세포질내 촉매 도메인을 갖는 수용체-유형 PTP를 암호화하고; 또 다른 하나는 특유의 친수성 N-말단을 함유하며, 따라서 상기 PTP의 비수용체-유형 동형을 나타내는 PTP를 나타낸다. 마우스에서 상기 유사한 유전자의 연구는 RAS에서 상기 PTP의 조절 역할이 신호 전달 경로, 사이토킨 유발된 SATA 신호전달뿐만 아니라 전압-관문 K+ 채널의 활성화와 관련됨을 암시하였다.
상기 Lck 키나제는 상기 GBV-C 및 HCV의 연구에 관련되지만, 추가적인 T 세포 억제성 신호전달 분자가 또한 HCV에 대해 관련된다. 더욱 또한, 웨스트 나일 바이러스(WNV), 뎅기열 바이러스(DENV), 일본 뇌염 바이러스(JEV), A형 및 B형 인플루엔자, 및 HIV를 포함한 병원체들이 이러한 면역조절 특징을 공유함을 보이는, 다른 인간 병원체들에 대한 생물정보학적 예측을 제공한다. 이들 바이러스 중 다수에 대한 서브유닛 백신이 갖는 주요 문제는 상기 백신이 불충분한 면역원이며 낮은 수준의 항체 및 불충분한 기억 반응을 이끌어낸다는 것이다. 따라서, 상기 외막 단백질의 T 세포 상호작용 도메인을 확인한 다음, T 및 B 세포 반응을 방해하는데 필요한 중요한 아미노산의 돌연변이를 확인함으로써, 상기가 개선된 보호 수명을 갖는 보다 효능 있는 백신을 생성시킬 수 있음을 단정하였다.
GBV-C 및 관련된 HCV는 지속적인 감염을 야기하는 세포질 인간 RNA 바이러스이다. GBV-C는, 활성화에 따라 CD4+ 및 CD8+ T 세포상에서 상향조절된 표면 마커의 측정에 의해 측정된 바와 같이 전체적인 T 세포 활성화를 조절한다(Nattermann et al ., 2003; Maidana et al ., 2009; Xiang et al ., 2004; Xiang et al ., 2006; Schwarze-Zander et al ., 2010; Stapleton et al ., 2012). 상기 효과는 적당하며, GBV-C 감염된 인간은 면역억제의 부작용이 없는 것으로 보인다(문헌[Bhattarai & Stapleton, 2012]에서 재고찰됨). 대조적으로, HCV는 다른 감염들, 특히 HBV, 세균성 감염 및 주혈흡충증에 대한 증가된 민감성과 관련있는 것으로 보고되었다(문헌[Hahn, 2003]에서 재고찰됨). 항-HCV 외막 항체는 침팬지를 감염으로부터 보호할 수 있지만(Farci et al ., 1996), HCV 외막에 대한 면역 반응은 약하다(Fournillier et al ., 2001; Cerny and Chisari, 1999). 지질과의 비리온 또는 E2 결합, 과중한 글리코실화, 및 현저한 항원성 변이를 포함하여 상기에 대한 여러가지 이유들이 제시되었다(Fournillier et al ., 2001).
다수의 임상 연구들이 GBV-C 감염과 T 및 B 세포 활성화의 감소된 수준과의 연관성을 찾고 있다(Bowen, and Walker, 2005; Lauer and Walker, 2001; Kanto et al., 1999; Krishnada et al ., 2010; Kobayashi et al ., 1998; Semmo et al ., 2005; Eckels et al ., 1999; Serti et al ., 2011; Doganiuc et al ., 2003; Tomova et al ., 2009; Masciopinto et al ., 2004). CD4+ T 세포주에서 GBV-C E2 단백질의 발현은 상기 T 세포 수용체(TCR)를 통한 자극에 따른 IL-2 방출의 차단 및 활성화 마커 CD69 및 CD25의 상향조절을 생성시켰다(Bhattarai et al., 2012b). 더욱 또한, 1차 인간 CD4 및 CD8 세포에 대한 재조합 E2의 첨가는 TCR 신호전달에 대한 상기 3가지 수단을 차단하였다(Bhattarai et al., 2012b).
GBV-C는 T 및 B 림프구에서 복제되지만(Xiang et al ., 2000; George et al ., 2006), 말초 혈액에서는 매우 낮은 비율의 림프구가 감염된다(평균, <1%). 따라서, 감염만으로는 TCR-매개된 활성화의 전체적인 감소를 야기하지 않는 듯하다. GBV-C-감염된 사람들로부터 수득된 혈청 미세소낭은 GBV-C 감염되지 않은 경우로부터의 혈청 미세소낭에 비해 T 세포 활성화를 차단하는 것으로 밝혀졌다. 추가로, E2 단백질을 발현하는 CD4+ T 세포주는 T 세포 활성화를 감소시키는 E2 함유 엑소솜을 생산하는 것으로 보고되었다(Bhattarai et al., 2013). 선행 보고서는 HCV가 엑소솜을 생산하고, E2가 엑소솜의 공통 성분인 E2 수용체 CD81(Masciopinto et al., 2004)과의 상호작용을 통해 상기 중에 통합됨을 가리킨다.
본 명세서에서, HCV 입자는 바이러스 복제의 부재하에서조차 인간 T 세포에서의 T 세포 수용체(TCR) 신호전달을 직접 방해함을 개시한다. 감염된 인간의 혈청 또는 세포-배양물로부터 수득된 HCV 입자는 TCR 신호전달을 억제하였다. TCR 신호전달의 억제는 적어도 부분적으로 HCV 외막(E2) 암호화 RNA 및 단백질에 의해 매개된다. HCV E2 RNA는 림프구-특이성 티로신 키나제(Lck)의 활성화를 감소시킴으로써 근위 TCR 신호전달을 억제하였다. HCV E2 단백질은 활성화된 NFAT의 핵 전좌를 감소시킴으로써 원위 TCR 신호전달을 억제하였다. HCV E2를 암호화하는 RNA 영역에서 보존된 뉴클레오티드 서열은 근위 TCR 신호전달 억제에 관련된 반면, 원위 TCR 신호전달의 억제는 HCV E2 단백질에서 보존된 티로신(Y613)의 Lck 매개된 인산화를 수반하였다. 근위 및 원위 TCR 신호전달 결함은 모두 E2 RNA 중의 뉴클레오티드 또는 E2 단백질 중의 Y613의 돌연변이에 의해 역전되었다. 이들 데이터는 HCV 입자가 TCR 신호전달을 직접 방해할 수 있음을 가리킨다.
I. 바이러스
GBV-C 외막 당단백질은 림프구 키나제와 경쟁하여 손상된 활성화에 이르게 하는 기질 부위 및 결합 부위를 함유한다. C형 간염 바이러스(HCV) 및 황열 바이러스(YFV) 외막은 림프구 활성화를 유사하게 손상시킨다. 이는 상기가 재조합 외막 단백질에 의한 면역화에 대한 불량한 면역원성 및 기억 반응을 설명할 수 있음을 시사한다. 따라서 이들 부위를 면역억제제로서 사용하는 것이 제안된다. 더욱이, 이들 면역조절 부위의 확인 및 돌연변이에 의해, 외막 당단백질은 보다 면역원성으로 될 것이며 개선된 기억 T 및 B 세포 반응을 유도할 것이다.
이와 같이, 본 명세는 T 세포 활성화를 억제하는 바이러스 외막 서열의 확인으로부터 유래하는 2개의 태양을 수반한다. 이들 서열을 사용하여, 필요한 상황에서 숙주 면역 반응을 감소시키거나, 또는 상기 서열들을 변경시키고 이어서 개선된 백신화와 관련하여 사용하여 바이러스 감염을 예방, 억제 또는 제한할 수 있다.
이를 레오비리다에과의 척추동물 dsRNA 바이러스, 및 아트로비리다에, 칼리시비리다에, HEV, 피코르나비리다에, 토가비리다에, 플라비비리다에, 코로나비리다에, 오쏘믹소비리다에, 아레나비리다에, 분야비리다에, 파라믹소비리다에, 필로비리다에, 라브도비리다에 및 레트로비리다에과의 ssRNA 바이러스를 포함한 모든 인간 및 동물 RNA 바이러스에 적용할 것이다.
A. C형 간염 바이러스
HCV는 주로 간세포에서 복제되나(Major et al ., 1997), 다양한 말초 혈액 세포(PBC)와 함께 발견된다(Major et al., 1997; Schmidt et al., 1997). 논란이 많기는 하지만, HCV는 PBC에서 어느 정도 복제되며, 비효율적인 시험관내 배양을 T- 및 B-세포주에서 성취할 수 있는 것으로 보인다(Major et al ., 1997; Bartenschlager et al., 2000).
HCV가 부착하고 세포에 진입하는 기전은 명확하지 않았다. 2개의 세포 표면 수용체가 시험관내에서 HCV 또는 HCV 외막 당단백질 E2와 상호작용하여, 상기 둘 중 어느 하나가 HCV 세포 수용체를 나타낼 수 있다는 결론에 이르는 것으로 나타났다(Pileri et al ., 1998; Monazahian et al ., 1999; Agnello et al ., 1999; Flint et al ., 1999; Wuenschmann et al ., 2000). 재조합 HCV E2는 인간 CD81에 결합함이 보고되었다(Pileri et al ., 1998; Flint et al ., 1999; Flint and Maidens et al., 1999; Hadlock et al ., 2000; Owsianka et al ., 2001; Flint and McKeating, 2000; Petracca et al ., 2000; Patel et al ., 2000). CD81은 세포 표면 분자의 테트라스파닌 상과의 일원이며, 실질적으로 모든 유핵 세포상에서 발현된다(Levy and Maecker, 1998). 초기의 연구들은 CD81에 결합하는 E2가 생체내에서 표적 세포에 대한 HCV의 결합에 책임이 있음을 시사하였다. 그러나, E2가 CD81에 결합함이 반복해서 보고되었지만, 오직 2개의 연구만이 인간 혈청으로부터 유래된 HCV 입자가 상기 표면 분자에 결합한다는 증거를 제공하였다(Pileri et al ., 1998; Hadlock et al ., 2000).
HCV E2는 CD81에 특이적으로 결합하지만(Wuenschmann et al ., 2000), 혈장으로부터 정제된 HCV 입자의 결합은 가용성 CD81에 의해 억제되지 않으며, 바이러스 결합의 정도는 LDLr 발현의 수준과 상관이 있는 것으로 보고되었다(Wuenschmann et al ., 2000). 추가적인 몇 줄의 증거는 CD81이 HCV 수용체가 아니라고 주장한다. HCV E2는 인간 CD81보다 마모셋 CD81에 대해 더 높은 친화성을 갖지만, 마모셋은 HCV에 민감하지 않다. CD81에 대한 HCV E2의 친화성은 진정한 바이러스 수용체에 대해 예측되는 것보다 현저하게 더 낮은 것으로 밝혀졌다(Petracca et al., 2000). RT-PCR 기반 검출 방법의 사용에 따르면, 혈장-유래된 HCV 및 HCV E2는 CD81의 발현이 없는 U937 서브클로닝된 세포에 결합하였다(Hamaia and Allain, 2001). 이들 데이터는 CD81이 HCV에 대한 1차 세포 수용체가 아님을 암시한다.
그럼에도 불구하고, HCV E2는 CD81과 상호작용하고, CD81 결합에 관련된 E2 영역들이 고도로 보존되며(Pileri et al ., 1998; Flint et al ., 1999; Flint and Maidens et al ., 1999; Hadlock et al ., 2000; Owsianka et al ., 2001; Flint and McKeating, 2000; Petracca et al ., 2000; Patel et al ., 2000)), 이는 HCV 복제에서 CD81-E2 상호작용에 대한 기능상 역할을 암시한다(Pileri et al ., 1998; Flint et al ., 1999; Flint and Maidens et al ., 1999; Hadlock et al ., 2000; Owsianka et al ., 2001; Flint and McKeating, 2000). 감염성 혈청의 구배 원심분리에서 밝혀진 HCV의 대단히 낮은 밀도는 VLDL 및 LDL과의 연관성을 암시하였다(Hijikata et al., 1993; Bradley et al ., 1991; Prince et al ., 1996). 감염성 바이러스는 VLDL 및 LDL과 동일한 밀도로 발견되었으며 LDL과 공침전되었다(Monazahian et al., 1999; Bradley et al ., 1991; Prince et al ., 1996; Thomssen and Thiele, 1993; Xiang et al ., 1998). 후속의 연구들(Monazahian et al ., 1999; Bradley et al., 1991; Prince et al . 1996; Xiang et al ., 1998)은 HCV 또는 HCV-LDL 복합체와, 저밀도 지단백질 수용체(LDLr) 간의 상호작용을 보고하였다(Wuenschmann et al., 2000; Prince et al ., 1996; Thomssen and Thiele, 1993; Xiang et al ., 1998; Thomssen et al., 1992).
감염된 사람들의 혈장 중에 존재하는 HCV가 또한 매우-저밀도(VLDL) 및 저밀도 지단백질(LDL)과 상호작용하는 것으로 보고되었다. 간은 트리아글리세롤, 콜레스테롤, 인지질 및 아포단백질 apoB-100, 혈액내로 방출된 VLDL(여기에서 상기는 추가적인 지단백질 CII를 획득한다) 및 고밀도 지단백질(HDL)로부터의 apoE로 이루어지는 VLDL을 합성한다. VLDL은 모세관 내피세포에 부착되는 것으로 밝혀진 효소인 지단백질 리파제(LPL)에 의해 절단되어 중간밀도 지단백질(IDL) 및 LDL을 형성하며, apoB-100은 LDL 중에 유일하게 남아있는 아포단백질이다. 상기 저밀도 지단백질 수용체(LDLr)는 apoE 및 apoB-100을 모두 인식하며 따라서 LDL 외에 VLDL, IDL 및 킬로마이크론 잔류물과 결합한다(Marks et al., 1996).
혈청 중 HCV-RNA 함유 물질, 추정상 바이러스 입자는 구배 침강에 의해 매우 저밀도 입자(<1.06 g/㎤)로 분리되며, 이는 HCV가 VLDL 및 LDL과 결합함을 암시한다(Monazahian et al ., 1999; Thomssen et al ., 1993; Xiang et al ., 1998; Prince et al ., 1996; Bradley et al ., 1991). 또한, 1.11 내지 1.18 g/㎤의 밀도를 갖는 입자들이 기재되었다(Xiang et al ., 1998; Prince et al ., 1996; Bradley et al ., 1991; Hijikata et al ., 1993). 침팬지 감염성 연구는 매우 저밀도 HCV 입자가 고도로 감염성인 반면, 보다 높은 밀도의 입자는 감염성이 아님을 보고하였다(Bradley, 2000). HCV 및 GBV-C는 상이한 입자 유형을 가지며, E2 단백질 및 HCV RNA의 기능상 효과들은 입자 유형에 따라 변할 수 있다(Monazahian et al ., 1999; Xiang et al ., 1998; Prince et al ., 1996; Bradley et al ., 1991). 톰센(Thomssen) 등(1993)은 HCV가 LDL과 공침전됨을 보였으며 HCV 또는 HCV-LDL 복합체와 LDLr과의 상호작용을 설명하였다(Wuenschmann et al ., 2000; Thomssen et al ., 1993; Xiang et al ., 1998; Prince et al ., 1996; Thomssen et al ., 1992).
모나자히안(Monazahian) 등(1999)은 인간 CD81이 없는 쥐 세포에서 재조합 인간 LDLr의 발현이 상기 세포에 대한 HCV의 결합을 입증함을 보고하였으며, 아그넬로(Agnello) 등(1999)은 인사이투 하이브리드화 방법을 사용하여, HCV가 LDLr을 함유하는 섬유아세포에 결합하여 상기 세포에 진입하지만, LDLr 결핍 섬유아세포에는 그렇지 않음을 보고하였다. 유식 세포측정을 사용하여, 혈장-유래된 HCV는 LDLr을 발현하는 세포에는 결합하지만 LDLr이 없는 세포에는 그렇지 않음을 보고하였다(Wuenschmann et al ., 2000). 바이러스 외막 단백질(E1 또는 E2)과 LDL 수용체간에 상호작용이 없음이 보고되었다(Wuenschmann et al., 2000). 모나자히안 등(1999)은 35S-메티오닌으로 표지된, 시험관내 번역된 HCV E1 및 E2 단백질이 VLDL, LDL 및 HDL과 공-침전됨을 발견하였다(Monazahian et al ., 2000).
HCV E2는 바이러스 외막의 바깥쪽 단백질이고 표적 세포에 대한 바이러스의 결합에 참여할 수 있다. 상기 단백질은 HCV 폴리단백질의 아미노산 394에서 시작하여 아미노산 747까지 연장된다. 상기는 상기 단백질의 아미노 말단에 고가변성 영역을 가지며, 카복시 말단은 막관통 도메인을 포함한다.
종래 기술에서의 결함으로 인해, 피험자에서 보다 낮은 LDL 수준에 대한 보다 유효한 치료가 여전히 필요하다. 또한, 피험자에서 HCV 감염을 감소시키거나, 억제하거나 또는 예방하는 신규의 유용한 방법이 여전히 필요하다. 현재 특허청구된 명세는 피험자에서 LDL 수준을 감소시키는 신규의 유용한 방법을 개시함으로써 종래 기술의 결함을 극복한다. 본 명세는 또한 HCV 억제제를 식별하는 신규의 유용한 방법 및 HCV 감염의 치료 방법을 개시한다.
HCV의 바이러스 게놈 서열은 상기 서열의 획득 방법과 같이 공지되어 있다. 국제 공보 WO 89/04669; WO 90/11089; 및 WO 90/14436을 참조하시오. C형 간염 바이러스(HCV) HCV는 대략 9.5 kb의 양성-센스 단일-가닥 RNA 게놈을 함유하는 외막 바이러스이다. HCV의 게놈 서열은 길이가 대략 9401 염기쌍이다(서열번호 1). HCV에 대한 펩티드 서열을 진뱅크(Genbank) 수납 번호 M62321로부터 획득할 수 있다. 상기 바이러스 게놈은 긴 5' 비번역 영역(UTR), 대략 3011 아미노산의 폴리단백질 전구체를 암호화하는 긴 개방 판독 프레임(서열번호 2) 및 짧은 3'UTR로 이루어진다. 상기 5'UTR은 HCV 게놈의 고도로 보존된 부분이며 폴리단백질 번역의 개시 및 조절에 중요하다. 상기 HCV 게놈의 번역은 내부 리보솜 진입으로서 공지된 캡-독립적인 기전에 의해 개시된다. 상기 기전은 내부 리보솜 진입 부위(IRES)로서 공지된 RNA 서열에 대한 리보솜의 결합을 수반한다. 상기 폴리단백질 전구체는 숙주 및 바이러스 프로테아제 모두에 의해 절단되어 성숙한 바이러스 구조 및 비-구조 단백질을 제공한다. 바이러스 구조 단백질은 뉴클레오캡시드 코어 단백질 및 2개의 외막 당단백질, E1 및 E2를 포함한다(미국특허 제 6,326,151 호).
HCV는 세포 결합 및 진입을 위해 저밀도 지단백질 수용체(LDLr)를 사용한다(Wuenschmann et al ., 2000; Monazahian et al ., 1999; Agello et al ., 1999). 상기 HCV 외막 당단백질(HCV E2 당단백질)이 인간 지단백질의 지질 모이어티에 결합하고, 상기 지질-바이러스 복합체가 세포에 결합하기 위해 LDL에 대한 천연 수용체를 사용함은 앞서 암시되었다. 상기 HCV E2 당단백질은 상기 HCV 당단백질의 아미노산 394에서 시작하여 아미노산 747까지 연장된다. 상기는 상기 단백질의 아미노 말단에 고가변 영역을 가지며, 카복시 말단은 막관통 도메인을 포함한다. HCV는 LDL 수용체를 사용하여 엔도사이토시스를 통해 세포에 진입한다. LDL과의 HCV E2 당단백질 상호작용은 세포에 대한 CD81-독립적인 결합(Wuenschmann et al., 2000)뿐만 아니라 상기 세포에 의한 LDL 결합 및 흡수의 증대를 생성시킨다.
B. 다른 바이러스
1. 황열 바이러스
황열은 플라비비리다에과에 속하는 40 내지 50 ㎚ 너비의 외막 RNA 바이러스인 황열 바이러스에 의해 야기된다. 양성 센스 단일-가닥 RNA는 대략 11,000 뉴클레오티드 길이이며 폴리단백질을 암호화하는 단일 개방 판독 프레임을 갖는다. 숙주 프로테아제는 상기 폴리단백질을 3개의 구조(C, prM, E) 및 7개의 비-구조 단백질(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5)로 절단하며; 상기 나열은 상기 바이러스 외막과 상기 엔도솜 막의 융합을 유도하는 감소된 pH에 상응한다. 따라서, 캡시드는 시토솔에 도달하여 게놈을 붕괴시키고 방출시킨다. 수용체 결합뿐만 아니라 막 융합은 상기 단백질 E에 의해 촉진되며, 상기 단백질은 낮은 pH(이는 90개 동종이량체의 60개 동종삼량체로의 재배열을 야기한다)에서 그의 입체형태적 구조가 변한다.
상기 숙주 세포에 진입 후, 상기 바이러스 게놈은 조면 소포체(ER) 및 소위 소낭 패킷에서 복제된다. 먼저, 상기 바이러스 입자의 미성숙한 형태가 상기 ER 내부에서 생성되며, 그의 M-단백질은 아직 그의 성숙한 형태로 절단되지 않고 따라서 상기를 prM(전구체 M)으로서 표시하며 단백질 E와 복합체를 형성한다. 상기 미성숙 입자는 숙주 단백질 퓨린(prM을 M으로 절단시킨다)에 의해 골지체에서 가공된다. 상기는 상기 복합체로부터 E를 방출시키며, 상기 복합체는 이제 성숙한 감염성 비리온으로 간주될 수 있다.
상기 황열 바이러스는 주로 황열 모기 아에데스 아에지프티(Aedes aegypti)에 의해 물려 전염되나, 다른 모기들, 예를 들어 "외줄 모기"(아에데스 알보피크투스(Aedes albopictus))가 또한 상기 바이러스의 벡터로서 작용할 수 있다. 모기를 통해 전염되는 다른 아르보바이러스들처럼, 상기 황열 바이러스는 감염된 사람 또는 영장류의 혈액을 흡입하는 암모기에 의해 흡수된다. 바이러스는 상기 모기의 위에 도달하고 상기 바이러스 농도가 충분히 높은 경우, 상기 비리온은 상피 세포를 감염시키고 거기에서 복제될 수 있다. 거기에서부터 상기 바이러스는 혈액낭(모기의 혈액 시스템)에 도달하고 거기에서부터 침샘에 도달한다. 이어서 상기 모기가 혈액을 흡입하면, 상기 모기가 타액을 상처내로 주입하고, 따라서 상기 바이러스는 상기 물린 사람의 혈액에 도달한다. 에이 아에지프티내의 상기 황열 바이러스의 경란 전염 및 변태기 통과 전염, 즉 암모기로부터 알 및 이어서 유충으로의 전염에 대한 징후가 또한 존재한다. 선행 혈분 없이 이러한 벡터의 감염은 상기 질병의 단일의 갑작스러운 발발에 한 역할을 하는 것으로 보인다.
2. HIV
HIV는 레트로비리다에과 부분인 렌티바이러스 속의 일원이다. 렌티바이러스는 공통으로 다수의 형태 및 생물학적 성질을 갖는다. 다수의 종들이 렌티바이러스에 의해 감염되며, 상기 바이러스는 특징적으로 긴 인큐베이션 기간과 함께 장기 질병의 원인이 된다. 렌티바이러스는 단일-가닥, 양성-센스, 외막 RNA 바이러스로서 전염된다. 상기 바이러스 RNA 게놈은 표적 세포에 진입시, 바이러스에 의해 암호화되는 역전사효소(상기 바이러스 입자 중의 바이러스 게놈과 함께 운반된다)에 의해 이중-가닥 DNA로 전환된다(역전사된다). 이어서 상기 생성되는 바이러스 DNA는 세포 핵내로 유입되고 바이러스에 의해 암호화된 인티그라제 및 숙주 보조-인자에 의해 세포 DNA에 통합된다. 상기 바이러스는 일단 통합되었으면, 잠복성으로 될 수 있으며, 이는 상기 바이러스 및 그의 숙주 세포가 면역계에 의한 검출을 피할 수 있게 한다. 한편으로, 상기 바이러스는 전사되어 새로운 RNA 게놈 및 바이러스 단백질을 생산하며, 이들은 패키징되고 새로 상기 복제 주기를 시작하는 새로운 바이러스 입자로서 상기 세포로부터 방출된다.
HIV는 인간 면역계 중의 생명유지 세포들, 예를 들어 헬퍼 T 세포(구체적으로 CD4+ T 세포), 대식세포, 및 수지상 세포를 감염시킨다. HIV 감염은 감염되지 않은 방관자 세포(bystander cell)의 세포사멸, 감염된 세포의 직접적인 바이러스 살해, 및 감염된 세포를 인식하는 CD8 세포독성 림프구에 의한 감염된 CD4+ T 세포의 살해를 포함한 다수의 기전들을 통해 CD4+ T 세포의 낮은 수준을 도출한다. CD4+ T 세포수가 일정 수준 아래로 감소하면, 세포-매개된 면역성이 상실되고, 신체는 점진적으로 기회감염에 보다 민감하게 된다.
2가지 유형의 HIV가 특성화되었다: HIV-1 및 HIV-2. HIV-1은 초기에 발견되었고 LAV 및 HTLV-III 둘 다로 지칭된 바이러스이다. 상기는 보다 독성이며, 보다 감염성이고, 세계적으로 대부분의 HIV 감염의 원인이다. HIV-1에 비해 HIV-2의 보다 낮은 감염성은 노출당 HIV-2에 노출된 사람 중 보다 적은 사람을 감염시킬 것임을 암시한다. HIV-2는 그의 비교적 불량한 전염 능력으로 인해, 주로 서부 아프리카로 국한된다.
HIV는 다른 레트로바이러스들과 구조가 상이하다. 상기는 약 120 ㎚의 직경을 갖는 대략적인 구형이며, 적혈구보다 대략 60배 더 작지만, 바이러스로서는 크다. 상기는 바이러스 단백질 p24의 2,000개 사본으로 구성된 원추형 캡시드에 의해 둘러싸인 상기 바이러스의 9개 유전자를 암호화하는 양성 단일-가닥 RNA의 2개 사본으로 구성된다. 상기 단일-가닥 RNA는 뉴클레오캡시드 단백질, p7, 및 상기 비리온의 발생에 필요한 효소들, 예를 들어 역전사효소, 프로테아제, 리보뉴클레아제 및 인티그라제에 단단히 결합된다. 상기 바이러스 단백질 p17로 구성된 기질은 상기 캡시드를 둘러싸 상기 비리온 입자의 완전성을 보장한다.
상기는 차례로, 새롭게 형성된 바이러스 입자가 인간 세포로부터 발아시 상기 세포의 막으로부터 취한 인지질이라 칭하는 2개의 지방 분자의 층으로 구성되는 바이러스 외막에 의해 둘러싸인다. 상기 숙주 세포로부터의 단백질 및 상기 바이러스 입자의 표면을 통해 돌출되는 복합 HIV 단백질의 약 70개 사본이 상기 바이러스 외막 중에 매몰되어 있다. Env로서 공지된 상기 단백질은 당단백질(gp) 120이라 칭하는 3개의 분자로 제조된 캡, 및 상기 바이러스 외막에 상기 구조를 고정시키는 3개의 gp41 분자로 이루어지는 줄기로 이루어진다. 상기 당단백질 복합체는 상기 바이러스가 표적 세포에 부착하고 상기 세포와 융합하여 감염성 주기를 시작할 수 있게 한다. 이들 표면 단백질 모두, 특히 gp120은 HIV에 대한 추후의 치료 또는 백신의 표적으로서 간주되었다.
상기 RNA 게놈은 적어도 7개의 구조 지표(LTR, TAR, RRE, PE, SLIP, CRS, 및 INS), 및 19개의 단백질을 암호화하는 9개의 유전자(gag, pol, 및 env, tat, rev, nef, vif, vpr, vpu, 및 때때로 10번째 tev(상기는 tat env와 rev의 융합물이다))로 이루어진다. 이들 유전자 중 3개, gag, pol, 및 env는 새로운 바이러스 입자에 대한 구조 단백질을 제조하는데 필요한 정보를 함유한다. 예를 들어, env는 세포 프로테아제에 의해 절단되어 gp120 및 gp41을 형성하는 gp160이라 칭하는 단백질을 암호화한다. 상기 6개의 나머지 유전자들, tat, rev, nef, vif, vpr, 및 vpu(또는 HIV-2의 경우에 vpx)은 세포를 감염시키거나, 바이러스의 새로운 사본을 생성시키거나(복제하거나) 또는 질병을 야기하는 HIV의 능력을 조절하는 단백질에 대한 조절 유전자이다.
2개의 Tat 단백질(p16 및 p14)은 상기 TAR RNA 요소를 결합시킴으로써 작용하는 LTR 프로모터에 대한 전사적 전사촉진인자이다. 상기 TAR은 또한 세포사멸 유전자 ERCC1 및 IER3을 조절하는 마이크로RNA로 가공될 수 있다. 상기 Rev 단백질(p19)은 RRE RNA 요소에 결합함으로써 핵 및 세포질로부터 RNA를 왕복 수송(shuttling)하는데 관련된다. 상기 Vif 단백질(p23)은 APOBEC3G(DNA:RNA 하이브리드를 탈아민화시키고/시키거나 Pol 단백질을 방해하는 세포 단백질)의 작용을 억제한다. 상기 Vpr 단백질(p14)은 G2/M에서 세포분열을 저지한다. 상기 Nef 단백질(p27)은 CD4(주요 바이러스 수용체)뿐만 아니라 MHC I 부류 및 II 부류 분자를 하향-조절한다.
Nef는 또한 SH3 도메인과 상호작용한다. 상기 Vpu 단백질(p16)은 감염된 세포로부터 새로운 바이러스 입자의 방출에 영향을 미친다. HIV RNA의 각 가닥의 단부는 긴 말단 반복부(LTR)라 칭하는 RNA 서열을 함유한다. 상기 LTR 중의 영역들은 새로운 바이러스의 생산을 조절하는 스위치로서 작용하며 HIV 또는 숙주 세포로부터의 단백질에 의해 촉발될 수 있다. 상기 Psi 요소는 바이러스 게놈 패키징에 관련되며 Gag 및 Rev 단백질에 의해 인식된다. 상기 SLIP 요소(TTTTTT)는 기능성 Pol을 만들기 위한 Gag-Pol 판독 프레임 중의 프레임이동과 관련된다.
HIV는 매우 높은 유전자 변이성을 갖는다는 점에서 다수의 바이러스들과 상이하다. 이러한 다양성은 복제 주기당 뉴클레오티드 염기당 대략 3 x 10- 5 의 높은 돌연변이 속도 및 역전사효소의 재조합체 생성 성질과 결합된 그의 빠른 복제 주기의 결과이며, 매일 약 1010 비리온이 생성된다. 이러한 복잡한 시나리오는 하루의 과정 동안 단일의 감염 환자에서 HIV의 다수의 변이체 발생을 이끌어낸다. 상기 변이성은 단일 세포가 2개 이상의 상이한 HIV 균주에 의해 동시에 감염될 때 배가된다(is compounded). 동시 감염이 발생하는 경우, 자손 비리온의 게놈은 2개의 상이한 균주로부터의 RNA 가닥들로 구성될 수 있다. 이어서 상기 하이브리드 비리온은 새로운 세포를 감염시키고 여기에서 복제를 겪는다. 상기가 발생함에 따라, 상기 역전사효소는 상기 2개의 상이한 RNA 주형 사이에서 앞뒤로 점프함으로써 새로 합성된 레트로바이러스 DNA 서열을 생성시킬 것이며, 이는 상기 두 모 게놈간의 재조합체이다. 상기 재조합은 상기가 하위유형들 사이에서 발생할 때 분명하다.
HIV-1의 3개의 그룹이 외막(env) 영역 중의 차이를 근거로 확인되었다: M, N 및 O. 그룹 M이 주 유형이며 전체 게놈을 기준으로, 지리학적으로 상이한 8개의 하위유형(또는 계통군)으로 세분된다. 가장 우세한 것은 하위유형 B(주로 북미와 유럽에서 발견된다), A 및 D(주로 아프리카에서 발견된다) 및 C(주로 아프리카와 아시아에서 발견된다)이며; 이들 하위유형은 HIV-1의 M 그룹의 계통을 나타내는 계통수에서 가지를 형성한다. 특유의 하위유형들에 의한 동시감염은 순환하는 재조합 형태(CRF)를 생성시킨다. 전세계 하위유형 이환율의 분석이 이루어진 마지막 해인 2000년에, 세계적인 감염의 47.2%는 하위유형 C의 것이었고, 26.7%는 하위유형 A/CRF02_AG의 것이었으며, 12.3%는 하위유형 B의 것이었고, 5.3%는 하위유형 D의 것이었으며, 3.2%는 CRF_AE의 것이었고, 나머지 5.3%는 다른 하위유형 및 CRF로 구성되었다. 대부분의 HIV-1 연구는 하위유형 B에 집중되고 있으며; 소수의 연구만이 다른 하위유형들에 집중하고 있다. 네 번째 그룹, "P"의 존재는 2009년에 단리된 바이러스를 근거로 추측되었다. 상기 균주는 2006년 서부 로랜드 고릴라로부터 최초로 단리된, 고릴라 SIV(SIVgor)로부터 명백히 유래된다. HIV-2의 유전자 서열은 HIV-1과 단지 부분적으로 상동성이며 SIVsmm의 경우를 보다 가깝게 닮고 있다.
3. 인플루엔자
인플루엔자 바이러스는 오쏘믹소비리다에과의 RNA 바이러스이며, 5개의 속: A형 인플루엔자바이러스, B형 인플루엔자바이러스, C형 인플루엔자바이러스, 이사바이러스 및 토고토바이러스를 포함한다. 상기 A형 인플루엔자바이러스 속은 하나의 종인 A형 인플루엔자 바이러스를 갖는다. 야생 수생 조류는 광범위하게 다양한 A형 인플루엔자의 천연 숙주이다. 때때로 바이러스는 다른 종으로 전염되고 이어서 가금류에서 강력한 발발을 야기하거나 또는 인간 인플루엔자 대유행을 발생시킬 수도 있다. A형 바이러스는 3개의 인플루엔자 유형 가운데 상당한 독성의 인간 병원체이며 심각한 질병을 야기한다. 상기 A형 인플루엔자 바이러스는 상기 바이러스에 대한 항체 반응을 기준으로 상이한 하위유형들로 세분될 수 있다.
A, B 및 C형 인플루엔자바이러스는 구조가 매우 유사하다. 상기 바이러스 입자는 직경이 80 내지 120 나노미터이고 대개는 대략적인 구형이지만, 섬유모양 형태가 존재할 수 있다. 상기 입자는 중심 코어 둘레를 둘러싸고 있는, 2개의 주요 유형의 당단백질을 함유하는 바이러스 외막으로 이루어진다. 상기 중심 코어는 바이러스 RNA 게놈, 및 상기 RNA를 패키징하고 보호하는 다른 바이러스 단백질을 함유한다. 임의의 바이러스와 달리, 그의 게놈은 단일 조각의 핵산이 아니며; 대신에 7 또는 8 조각의 분절된 음성-센스 RNA를 함유한다. 상기 A형 인플루엔자 게놈은 11개 단백질을 암호화한다: 헤마글루티닌(HA), 뉴라미니다제(NA), 핵단백질(NP), M1, M2, NS1, NS2(NEP), PA, PB1, PB1-F2 및 PB2.
헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다제(NA)는 바이러스 입자 외부상의 2개의 큰 당단백질이다. HA는 바이러스의 표적 세포에의 결합 및 바이러스 게놈의 상기 표적 세포에의 진입을 매개하는 렉틴인 반면, NA는 성숙한 바이러스 입자에 결합하는 당의 절단에 의한 감염된 세포로부터의 자손 바이러스의 방출에 관련된다. 따라서, 이들 단백질은 항바이러스 약물에 대한 표적이다. 더욱 또한, 이들은 항체가 발생될 수 있는 항원이다. A형 인플루엔자 바이러스는 HA 및 NA에 대한 항체 반응을 기준으로 하위유형들로 분류된다. HA 및 NA의 이러한 상이한 유형들은 예를 들어 H5N1에서 H 및 N 구별의 기준을 형성한다.
인플루엔자 바이러스는 헤마글루티닌을 통해; 전형적으로는 포유동물의 코, 목 및 폐 및 조류의 장에서 상피세포 표면상의 시알산 당에 결합한다. 상기 세포는 엔도사이토시스에 의해 상기 바이러스를 유입한다. 산성 엔도솜에서, 상기 헤마글루티닌 단백질 부분은 상기 바이러스 외막을 액포의 막과 융합시켜, 상기 바이러스 RNA(vRNA) 분자, 부속 단백질(accessory protein) 및 RNA-의존성 RNA 폴리머라제를 세포질내로 방출시킨다. 이들 단백질 및 vRNA는 복합체를 형성하며 상기 복합체는 세포 핵으로 수송되고 여기에서 상기 RNA-의존성 RNA 폴리머라제는 상보성 양성-센스 vRNA의 전사를 시작한다. 상기 vRNA는 (a) 세포질내로 유출되어 번역되거나, 또는 (b) 핵 중에 남아있는다. 새로 합성된 바이러스 단백질은 골지체를 통해 세포 표면상으로 분비되거나 또는 다시 핵내로 운반되어 vRNA와 결합하여 새로운 바이러스 게놈 입자를 형성한다. 다른 바이러스 단백질들은 숙주 세포에서, 세포 mRNA를 분해하고 vRNA 합성을 위해 방출된 뉴클레오티드를 사용하고 또한 숙주 세포 mRNA의 번역을 억제함을 포함한 다수의 작용을 갖는다.
미래의 바이러스 게놈을 형성하는 음성-센스 vRNA, RNA-의존성 RNA 폴리머라제, 및 다른 바이러스 단백질들이 비리온으로 조립된다. 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제 분자는 세포막에서 불룩하게(bulge) 떼를 이룬다. 상기 vRNA 및 바이러스 코어 단백질은 핵을 떠나 상기 막 돌기에 진입한다. 성숙한 바이러스는 상기 세포로부터 숙주 인지질 막의 구체 중에 발아하여, 상기 막 코트와 함께 헤마글루티닌 및 뉴마리니다제를 획득한다. 앞서와 같이, 상기 바이러스는 헤마글루티닌을 통해 상기 세포에 부착하고; 상기 성숙한 바이러스는 일단 그의 뉴라미니다제가 상기 숙주 세포로부터 시알산 잔기를 절단하였으면 탈착된다. 새로운 인플루엔자 바이러스의 방출 후에, 상기 숙주 세포는 죽는다.
RNA 교정 효소의 부재로 인해, 상기 RNA-의존성 RNA 폴리머라제는 대략 1만 개의 뉴클레오티드(이는 상기 인플루엔자 vRNA의 대략적인 길이이다)마다 단일 뉴클레오티드 삽입 오류를 만든다. 따라서, 새로 제조된 인플루엔자 바이러스의 대부분은 돌연변이체이며, "항원 변이(antigenic drift)"를 야기한다. 상기 게놈의 vRNA의 8개의 분리된 분절로의 분리는, 하나 초과의 바이러스 계통이 단일 세포를 감염시킨 경우 vRNA의 혼합 또는 재편성을 허용한다. 상기 생성된 신속한 바이러스 유전학의 변화는 항원 이동을 생성시키고 상기 바이러스가 새로운 숙주 종을 감염시키고 보호 면역을 신속히 극복하게 한다.
4. 다른 바이러스
본 명세는 웨스트 나일 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 뎅기열 바이러스 및 돼지 콜레라 바이러스(CSFV)를 포함한 다른 외막 단백질로부터 유래하는 RNA 분절의 용도를 고려한다.
II. 면역억제제로서 바이러스 RNA 분절
몇몇 태양에서, 본 명세는 바이러스 RNA 분절, 예를 들어 HCV E2 단백질 또는 다른 바이러스로부터의 그의 상동체를 암호화하는 분절에 관한 것이다. 상기 RNA 분절의 제공을 사용하여 면역 기능을 조절할 수 있다. 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법을 사용하여 상기 RNA 분절의 전부 또는 그의 일부를 발현할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 본 명세의 조성물은 특정 단백질들을 암호화하는 RNA를 포함할 수 있다. 상기 RNA 분절은 예를 들어 외막 서열로부터의, 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 30, 35, 40, 45, 50, 51, 75, 100, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 350, 400, 450 또는 500개의 연속적인 염기의 RNA 게놈을 포함할 수 있다. 어느 RNA 분절이 활성을 갖는지의 결정은 당해 분야의 숙련가들에게 친숙한 T-세포 활성화 및 증식 뿐만 아니라 사이토킨 생성을 측정하는 기능 분석들을 사용하여 성취될 수 있다. 예시적인 HCV E2 암호화 영역(균주 H77로부터)을 하기에 나타낸다:
Figure pct00001
(서열번호 27)
예시적인 YFV 외막 암호화 서열을 하기에 나타낸다:
Figure pct00002
Figure pct00003
(서열번호 28)
특히, 상기 암호화 영역으로부터의 분절은 다이서 효소에 대한 기질인 것으로 여겨지며, 따라서 상기 모티프를 갖는 RNA 영역이 특별히 고려된다. 예측 모델은 다이서에 대한 기질로서 작용해야 하는 다수의 RNA 서열을 밝힌다. 알려진 대로 T 세포 수용체 신호전달을 억제하는 HCV 외막(E2)-암호화 RNA/YFV env-암호화 서열을 검색하는 프로그램 miR-FIND(bioinfo.51donate.com/microrna/mir-find)을 사용하여, 상이한 유전자형들간에 상이한 수의, 다수의 잠재적인 다이서 부위를 확인하였다. HCV E2 암호화 영역 중의 유전자형 2a 단리물(밑줄 그은 것)에서 보존된 리보뉴클레오티드:
CTCACGCCAAGGTGCCTGATCGACTACCCCTACAGGCTCTGGcattatcC
(서열번호 3)
또는
CTCACGCCAAGGTGCCTGATCGACTACCCCTACAGGCTCTGGcattacccC
(서열번호 4)
개재 서열(intervening sequence)들은, 유전자형 3 바이러스 E2 암호화 영역(상기 영역에서 일부의 서열 변화를 갖는다)이 또한 T 세포 수용체 신호전달 및 T 세포 활성화를 억제하는 것으로 관찰된 바와 같이, 다양할 수 있다. 상기 RNA는, 상기 암호화 영역 처음에 프레임이동 삽입을 포함시킨 것이 상기 억제를 없애지 않았기 때문에, T 세포 활성화를 억제하기에 명백히 충분하다. 더욱 또한, 상기 RNA 구조는, 상기 RNA 구조를 변화시키는 돌연변이가 수행된 경우에 상기 보존된 서열을 제거하는 돌연변이가 단지 T 세포 신호전달만을 구제하기 때문에, 분명히 필요하다. 선택적인 돌연변이를 갖는 상기 구조의 복원은 상기 T 세포 억제 효과를 복원하였다. 소문자는 추정적인 시드 서열을 나타내며, 이때 마지막 대문자 C도 어쩌면 포함된다. YFV에 필적하는 서열을 하기에 나타낸다(이때 소문자는 시드 서열을 나타낸다):
GACAACAACcuuuacaaaCTACATGGT
(서열번호 37)
따라서, 몇몇 실시태양에서, 상기 NRA 분절은 상기 HCV E2 단백질의 적어도 약 51개 염기를 포함하고 길이가 100 염기 이하이며 T-세포 억제 도메인, 즉 시드 서열을 함유하거나, 또는 상기 YFV Env 단백질의 적어도 약 27개 염기를 포함하며 길이가 100 염기 이하이고 T-세포 억제 도메인, 즉 시드 서열을 함유한다. 본 명세의 몇몇 실시태양은 HCV/YFV 폴리펩티드, 특히 HCV E2 단백질 및 YFV Nnv 단백질을 암호화하는 다양한 RNA 분절을 포함한다. 예를 들어, HCV E2 단백질/YFV Env 단백질 암호화 RNA의 전부 또는 일부를 본 명세의 다양한 실시태양들에 사용할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 RNA 분절은 비제한적으로 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 51, 약 52, 약 53, 약 54, 약 55, 약 56, 약 57, 약 58, 약 59, 약 60, 약 61, 약 62, 약 63, 약 64, 약 65, 약 66, 약 67, 약 68, 약 69, 약 70, 약 71, 약 72, 약 73, 약 74, 약 75, 약 76, 약 77, 약 78, 약 79, 약 80, 약 81, 약 82, 약 83, 약 84, 약 85, 약 86, 약 87, 약 88, 약 89, 약 90, 약 91, 약 92, 약 93, 약 94, 약 95, 약 96, 약 97, 약 98, 약 99, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 약 140, 약 150, 약 160, 약 170, 약 180, 약 190, 약 200, 약 210, 약 225, 약 220개 이상의 염기, 및 상기 중에서 유도될 수 있는 임의의 범위를 포함할 수 있다.
또한, 서열이 추가적인 염기를 포함할 수 있음을 알 것이며, 더욱 또한 필수적으로, 상기 서열이 생물 활성(예를 들어 면역억제)의 유지를 포함하여 상기에 제시된 기준을 충족시키는 한, 본 명세서에 개시된 서열들 중 하나에 제시된 바와 같음을 알 것이다. 이들 서열을 "이종성"이라 칭할 수 있다.
본 명세의 실시태양은 다양한 바이러스 RNA 분절 및 그의 유도체를 포함한다. RNA 분절 변이체는 치환, 삽입 또는 결실 변이체일 수 있다. 결실 변이체는 기능 또는 면역억제 활성에 필수적이지 않은 고유 서열의 하나 이상의 염기가 없다. 삽입 돌연변이체는 전형적으로 상기 RNA 분절 중에 비-말단 점에서의 물질의 첨가를 수반한다. 말단 첨가(때때로 융합이라 칭한다)가 또한 고려된다.
"생물학적으로 기능상 동등한"이란 용어는 당해 분야에서 충분히 이해되며 본 명세서에서 상세히 추가로 정의된다. 상응하게, 서열은 약 70% 내지 약 80%, 또는 약 81% 내지 약 90%; 또는 약 91% 내지 약 99%;의 고유 서열에 일치하는 염기를 갖는다.
본 명세는 변형된, 비-천연 및/또는 통상적이지 않은 염기를 포함하는 RNA 분절을 사용할 수 있다. 엑소뉴클레아제 내성을 위해 3' 단부에 포스포로티오에이트(P=S) 주쇄 결합 및 엔도뉴클레아제 내성을 위해 2' 변형(2'-OMe, 2'-F 및 관련된)을 도입시킴으로써 성취된 몇몇 올리고뉴클레오티드 변형은 뉴클레아제 분해에 대한 안정성을 개선시킬 수 있다. 전적으로 2'-O-메틸 및 2'-플루오로 뉴클레오티드를 갖는 모티프는 증대된 혈장 안정성 및 증가된 시험관내 효능을 나타내었다. 4'-티오리보스 변형을 함유하는 서열은 천연 RNA의 경우보다 600배 더 큰 안정성을 갖는 것으로 나타났다. 결정 구조 연구는 4'-티오리보스가 고유 듀플렉스 중 변형되지 않은 당에 대해 관찰된 C3'-엔도 주름(pucker)과 매우 유사한 입체형태를 채용함을 보여준다. 4'-티오-RNA의 신장은 표적 및 비표적 가닥 모두에서 충분히 허용되었다.
보라노포스페이트 결합에서, 비-가교성 포스포디에스테르 산소는 등전자성 보란(BH3) 모이어티에 의해 치환된다. 보라노포스페이트 siRNA는 전사 반응에서 T7 RNA 폴리머라제 및 보라노포스페이트 리보뉴클레오시드 트리포스페이트를 사용하는 효소 경로에 의해 합성되었다. 보라노포스페이트 siRNA는 상기 가이드 가닥(guide strand)의 중심이 변형되지 않은 경우 고유 siRNA보다 더 활성이며, 변형되지 않은 siRNA보다 적어도 10배 더 뉴클레아제 내성일 수 있다.
몇몇 말단 접합체들이 세포 흡수를 개선시키거나 지시하는 것으로 보고되었다. 센스 및 안티센스 가닥상에 부분적인 포스포로티오에이트 주쇄 및 2'-β-메틸 당 변형을 갖는 화학적으로-안정화된 siRNA(상기에 논의됨)는 혈청 및 조직 균질물에서 엑소- 및 엔도뉴클레아제에 의한 분해에 대해 현저하게 증대된 내성을 나타내었으며, 피롤리딘 링커에 의한 NAA의 센스 가닥의 3' 단부에 대한 콜레스테롤의 접합은 세포 배양물에서 유전자-침묵 활성을 그다지 상실시키지 않는다. 이러한 연구는 콜레스테롤 접합이 NAA의 생체내 약물학적 성질을 현저하게 개선시킴을 입증한다.
"다른 암호화 서열로부터 실질적으로 멀리 떨어져 단리된"은 관심 유전자가 핵산 분절의 암호화 영역의 일부를 형성하고 상기 분절이 천연 암호화 핵산의 큰 부분들, 예를 들어 큰 염색체 단편 또는 다른 기능성 유전자 또는 cDNA 암호화 영역을 함유하지 않음을 의미한다. 물론, 이는 최초에 단리된 핵산 분절을 지칭하며, 인간 조작에 의해 상기 분절에 나중에 첨가된 유전자 또는 암호화 영역을 배제하지 않는다.
특정한 실시태양에서, 본 명세는 바이러스 외막 폴리펩티드 또는 펩티드를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 단리된 핵산 분절 및 재조합 벡터에 관한 것이다. 이들 폴리펩티드/펩티드는 그의 아미노산 서열내에 바이러스 외막 폴리펩티드에 일치하거나 또는 필수적으로 상응하는 연속적인 아미노산 서열을 포함한다. 또한 이들 폴리펩티드 내에 하나 이상의 키나제 부위의 변형을 갖는 변이체가 구상된다.
본 명세에 사용된 핵산 분절은 상기 암호화 서열 자체의 길이와 상관 없이, 다른 DNA 또는 RNA 서열, 예를 들어 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 추가적인 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 다른 암호화 분절 등과 결합할 수 있으며, 따라서 그들의 전체 길이는 상당히 다양할 수 있다. 따라서, 거의 모든 길이의 핵산 단편이 사용될 수 있는 것으로 생각되며, 이때 전체 길이는 단지 의도된 재조합 DNA 프로토콜에서의 제조 용이성 및 용도에 의해서만 제한된다.
A. HCV E2 서열 또는 다른 바이러스 외막 영역을 운반하는 벡터
본 명세는 또한 RNA 분절을 제공하기 위한 벡터의 용도를 포함한다. "벡터"란 용어는 핵산 서열을 상기 서열을 복제할 수 있는 세포에 도입시키기 위해 삽입시킬 수 있는 캐리어 핵산 분자를 지칭하는데 사용된다. 핵산 서열은 "외인성"일 수 있으며, 이는 상기 서열이, 상기 벡터가 도입되는 세포에 이질이거나, 또는 상기 서열이 상기 세포 중에는 있지만 상기 서열이 통상적으로 발견되지 않는 숙주 세포 핵산 내의 위치에 있는 서열에 상동성임을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스(박테리오파지, 동물 바이러스, 및 식물 바이러스), 및 인공 염색체(예를 들어 YAC)를 포함한다. 특정한 실시태양에서, 유전자 요법 또는 면역화 벡터가 고려된다. 당해 분야의 숙련가는 표준 재조합 기법(이는 문헌[Maniatis et al., 1988] 및 문헌[Ausubel et al., 1994](이 둘은 모두 본 발명에 참고로 인용된다)에 기재되어 있다)을 통해 벡터를 제작할 능력이 충분할 것이다.
"발현 벡터" 또는 "발현 구조물"이란 용어는 전사될 수 있는 유전자 산물의 적어도 일부를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 다양한 "조절 서열"을 함유할 수 있으며, 상기 서열은 특정한 숙주 유기체 중의 작동적으로 연결된 암호화 서열의 전사 및 어쩌면 번역에 필요한 핵산 서열을 지칭한다. 벡터 및 발현 벡터는 전사 및 번역을 결정하는 조절 서열 외에, 다른 기능을 또한 제공하고 하기에 기재되는 핵산 서열들을 함유할 수 있다.
1. 프로모터 및 인헨서
"프로모터"는 전사의 개시 및 속도를 조절하는 핵산 서열의 영역인 조절 서열이다. 상기는 RNA 폴리머라제 및 다른 전사 인자와 같은 조절 단백질 및 분자가 결합될 수 있는 유전자 요소를 함유할 수 있다. "작동적으로 위치한", "작동적으로 연결된", "조절하에 있는" 및 "전사 조절하에 있는"이란 어구들은 프로모터가 핵산 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 조절하기 위해 상기 서열과 관련하여 올바른 기능상 위치 및/또는 배향으로 있음을 의미한다. 프로모터는 "인헨서"와 함께 사용될 수도, 또는 사용되지 않을 수도 있으며, 상기 인헨서는 핵산 서열의 전사 활성화와 관련된 시스-작용 조절 서열을 지칭한다.
프로모터는 암호화 분절 및/또는 엑손의 상류에 위치한 5' 비-암호화 서열을 단리시킴으로써 획득될 수 있는 바와 같은, 유전자 또는 서열과 자연적으로 관련된 것일 수 있다. 상기와 같은 프로모터를 "내인성"으로서 지칭할 수 있다. 유사하게, 인헨서는 핵산 서열의 하류 또는 상류에 위치한, 상기 서열과 자연적으로 관련된 것일 수 있다. 한편으로, 몇몇 이점이, 상기 암호화 핵산 분절을 재조합 또는 이종 프로모터(자연 환경에서 핵산 서열과 통상적으로 관련되지 않은 프로모터)의 조절하에 위치시킴으로써 획득될 것이다. 재조합 또는 이종 인헨서는 또한 자연 환경에서 핵산 서열과 통상적으로 관련되지 않은 인헨서를 지칭한다. 상기와 같은 프로모터 또는 인헨서는 다른 유전자의 프로모터 또는 인헨서, 및 임의의 다른 원핵생물, 바이러스 또는 진핵생물 세포로부터 단리된 프로모터 또는 인헨서, 및 "천연"이 아닌, 즉 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소들, 및/또는 발현을 변경시키는 돌연변이를 함유하는 프로모터 또는 인헨서를 포함할 수 있다. 프로모터 및 인헨서의 핵산 서열을 합성적으로 생성시키는 것 외에, 본 명세서에 개시된 조성물과 관련하여, PCR™을 포함한 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술을 사용하여 서열을 생성시킬 수 있다(미국특허 제 4,683,202 호 및 미국특허 제 5,928,906 호(이들은 각각 본 발명에 참고로 인용된다)를 참조하시오). 더욱 또한, 비-핵 세포 소기관, 예를 들어 미토콘드리아, 엽록체 등의 내부에서 서열의 전사 및/또는 발현을 지시하는 조절 서열들을 또한 사용할 수 있는 것으로 생각된다.
당연히, 발현을 위해 선택된 세포 유형, 세포 소기관 및 유기체에서 핵산 분절의 발현을 유효하게 지시하는 프로모터 및/또는 인헨서를 사용하는 것이 중요할 것이다. 분자 생물학 분야의 숙련가들은 일반적으로 단백질 발현을 위한 프로모터, 인헨서 및 세포유형 조합의 용도를 알고 있다, 예를 들어 본 발명에 참고로 인용된 문헌[Sambrook et al.(1989)]을 참조하시오. 상기 사용되는 프로모터는 상기 도입된 DNA 분절의 높은 수준의 발현을 지시하기에 적합한 조건하에서 구성적이고, 조직-특이적이고, 유도성이고, 및/또는 유용할 수 있다. 상기 프로모터는 이종성 또는 외인성, 즉 바이러스와 상이한 공급원으로부터의 것일 수 있다. 일부 예에서, 원핵생물 프로모터를 목적하는 서열의 시험관내 전사와 함께 사용하기 위해 사용한다. 다수의 상업적으로 입수할 수 있는 시스템과 함께 사용하기 위한 원핵생물 프로모터는 T7, T3 및 Sp6을 포함한다.
조직-특이성 프로모터 또는 요소의 정체뿐만 아니라 그들의 활성을 특성화하기 위한 분석은 당해 분야의 숙련가들에게 주지되어 있다. 상기와 같은 영역의 예는 인간 LIMK2 유전자(Nomoto et al . 1999), 소마토스타틴 수용체 2 유전자(Kraus et al., 1998), 쥐 부고환(epididymal) 레티노산-결합 유전자(Lareyre et al., 1999), 인간 CD4(Zhao-Emonet et al., 1998), 마우스 α(XI) 콜라겐(Tsumaki, et al., 1998), D1A 도파민 수용체 유전자(Lee et al ., 1997), 인슐린-유사 성장 인자 II(Wu et al ., 1997), 인간 혈소판 내피세포 부착 분자-1(Almendro et al ., 1996)을 포함한다.
2. 개시 신호
특정한 개시 신호가 또한 암호화 서열의 효율적인 번역에 요구될 수 있다. 이러한 신호는 ATG 개시 코돈 또는 인접한 서열을 포함한다. ATG 개시 코돈을 포함한 외인성 번역 조절 신호를 제공할 필요가 있을 수 있다. 당해 분야의 통상적인 숙련가는 용이하게 상기를 결정하여 필요한 신호를 제공할 수 있을 것이다. 단백질의 경우, 상기 개시 코돈은 전체 삽입물의 번역을 보장하기 위해서 목적하는 암호화 서열의 판독 프레임과 "인-프레임"될 필요가 있음이 주지되어 있다. 상기 외인성 번역 조절 신호 및 개시 코돈은 천연 또는 합성일 수 있다. 상기 발현 효율을 적합한 전사 인헨서 요소의 포함에 의해 증대시킬 수 있다.
3. 다중 클로닝 부위
벡터는 다수의 제한 효소 부위를 함유하는 핵산 영역인 다중 클로닝 부위(MCS)를 포함할 수 있으며, 상기 제한 효소 부위 중 어느 하나는 벡터의 절단을 위해 표준 재조합 기술과 함께 사용될 수 있다(문헌[Carbonelli et al ., 1999], 문헌[Levenson et al ., 1998], 및 문헌[Cocea, 1997](본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오). "제한 효소 절단"은 핵산 분자 중의 단지 특정한 위치들에서만 기능하는 효소에 의한 핵산 분자의 촉매적 절단을 지칭한다. 이들 제한 효소 중 다수는 상업적으로 입수될 수 있다. 상기와 같은 효소의 용도는 당해 분야의 숙련가들에 의해 널리 이해된다. 흔히, 벡터를, 상기 MCS 내에서 외인성 서열을 상기 벡터에 결찰될 수 있도록 절단하는 제한 효소를 사용하여 선형화하거나 단편화한다. "결찰"은 2개의 핵산 단편(이들은 서로 연속적일 수도, 또는 연속적이지 않을 수도 있다) 사이에 포스포디에스테르 결합을 형성시키는 과정을 지칭한다. 제한 효소 및 결찰 반응을 수반하는 기법들은 재조합 기술 분야의 숙련가들에게 주지되어 있다.
4. 이어맞추기 부위
대부분의 전사된 진핵생물 RNA 분자는 1차 전사물로부터 인트론을 제거하기 위해 RNA 이어맞추기를 겪을 것이다. 게놈 진핵생물 서열을 함유하는 벡터는 단백질 발현을 위한 전사물의 적합한 가공을 보장하기 위해서 공여체 및/또는 수용체 이어맞추기 부위를 포함할 수 있다. 문헌[Chandler et al., 1997](본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오.
5. 종결 신호
본 명세의 벡터 또는 구조물은 일반적으로 적어도 하나의 종결 신호를 포함할 것이다. "종결 신호" 또는 "종결자"는 RNA 폴리머라제에 의한 RNA 전사물의 특이적인 종결에 관련된 DNA 서열로 구성된다. 따라서, 몇몇 실시태양에서 RNA 전사물의 생성을 종결시키는 종결 신호가 고려된다. 종결자는 바람직한 메시지 수준을 성취하기 위해서 생체내에서 필요할 수 있다.
진핵생물계에서, 상기 종결자 영역은 또한 새로운 전사물의 부위-특이적 절단을 허용하여 폴리아데닐화 부위를 노출시키는 특정한 DNA 서열을 포함할 수 있다. 상기는 상기 전사물의 3' 단부에 약 200 A 잔기(폴리A)의 신장부를 첨가하기 위해서 분화된 내인성 폴리머라제를 신호한다. 상기 폴리A 꼬리로 변형된 RNA 분자는 보다 안정성으로 보이며 보다 효율적으로 번역된다. 따라서, 진핵생물을 수반하는 다른 실시태양에서, 상기 종결자는 상기 RNA의 절단을 위한 신호를 포함하고, 다른 실시태양에서 상기 종결자 신호는 상기 메시지의 폴리아데닐화를 촉진한다. 상기 종결자 및/또는 폴리아데닐화 부위 요소는 메시지 수준을 증대시키고/시키거나 카세트로부터 다른 서열로의 판독을 최소화하는 작용을 할 수 있다.
본 명세에 사용이 고려되는 종결자는 본 명세서에 기재되거나 당해 분야의 통상적인 숙련가에게 공지된 임의의 전사 종결자를 포함하며, 예를 들어 비제한적으로 유전자의 종결 서열, 예를 들어 소 성장 호르몬 종결자 또는 바이러스 종결 서열, 예를 들어 SV40 종결자를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 종결 신호는 예를 들어 서열 절단으로 인해 전사성 또는 번역성 서열이 없을 수도 있다.
6. 폴리아데닐화 신호
발현, 특히 진핵생물 발현을 위해서, 전형적으로는 전사물의 적합한 폴리아데닐화를 수행하기 위한 폴리아데닐화 신호를 포함할 것이다. 상기 폴리아데닐화 신호의 성질은 본 명세의 성공적인 실시에 중요한 것으로 여겨지지 않고/않거나, 임의의 상기와 같은 서열을 사용할 수 있다. 일부 실시태양은 다양한 표적 세포에서 편리하고/하거나 잘 기능하는 것으로 공지된 SV40 폴리아데닐화 신호 및/또는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 폴리아데닐화는 상기 전사물의 안정성을 증가시키거나 세포질 수송을 용이하게 할 수 있다.
7. 복제의 기원
숙주 세포에서 벡터를 증식시키기 위해서, 상기 벡터는 하나 이상의 복제 기원 부위(종종 "ori"라 칭한다)를 함유할 수 있으며, 상기 부위는 복제가 개시되는 특정한 핵산 서열이다. 한편으로, 상기 숙주 세포가 효모인 경우 자율 복제 서열(ARS)이 사용될 수 있다.
8. 선택성 및 선별성 마커
본 명세의 몇몇 실시태양에서, 본 명세의 핵산 구조물을 함유하는 세포를 발현 벡터 중에 마커를 포함시킴으로써 시험관내 또는 생체내에서 확인할 수 있다. 상기와 같은 마커는 상기 세포에 확인 가능한 변화를 부여하여 상기 발현 벡터를 함유하는 세포의 용이한 확인을 허용한다. 일반적으로, 선택성 마커는 선택을 허용하는 성질을 부여하는 것이다. 양성 선택성 마커는 상기 마커의 존재가 그의 선택을 허용하는 것인 반면, 음성 선택성 마커는 그의 존재가 그의 선택을 방지하는 것이다. 양성 선택성 마커의 일례는 약물 내성 마커이다.
대개 약물 선택 마커의 포함은 형질전환체의 클로닝 및 확인에 도움을 준다, 예를 들어 네오마이신, 퓨로마이신, 하이그로마이신, DHFR, GPT, 제오신 및 히스티디놀에 내성을 부여하는 유전자는 유용한 선택성 마커이다. 조건의 실행을 근거로 형질전환체의 식별을 허용하는 표현형을 부여하는 마커 외에, GFP와 같은 선별성 마커(그의 기반은 비색측정 분석이다)를 포함한 다른 유형의 마커들이 또한 고려된다. 한편으로, 선별성 효소, 예를 들어 헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나제(tk) 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT)를 사용할 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 또한 면역학적 마커들을, 가능하게는 FACS 분석과 함께 어떻게 사용하는지를 알 것이다. 상기 사용되는 마커는, 상기가 유전자 산물을 암호화하는 핵산과 동시에 발현될 수 있는 한, 중요하지 않은 것으로 여겨진다. 선택성 및 선별성 마커의 추가적인 예는 당해 분야의 숙련가에게 주지되어 있다.
B. 숙주 세포
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"이란 용어들은 호환 가능하게 사용될 수 있다. 이들 용어는 또한 모두 그들의 자손을 포함하며, 상기 자손은 모든 후속 세대를 지칭한다. 모든 자손은 고의적인 또는 우연한 돌연변이로 인해 일치하지 않을 수도 있음은 물론이다. 이종 핵산 서열의 발현과 관련하여, "숙주 세포"는 원핵생물 또는 진핵생물 세포를 지칭하며, 상기는 벡터를 복제하고/하거나 벡터에 의해 암호화된 이종 유전자를 발현할 수 있는 임의의 형질전환 가능한 유기체를 포함한다. 숙주 세포는 벡터에 대한 수용자로서 사용될 수 있으며 사용되어 왔다. 숙주 세포는 "형질감염되거나" 또는 "형질전환될" 수 있으며, 이는 외인성 핵산이 숙주 세포내로 전달되거나 또는 도입되는 과정을 지칭한다. 형질전환된 세포는 1차 피험자 세포 및 그의 자손을 포함한다.
숙주 세포는 목적하는 결과가 벡터의 복제인지, 상기 벡터-암호화된 핵산 서열의 발현인지, 또는 감염성 바이러스 입자의 생산인지에 따라 원핵생물 또는 진핵생물로부터 유래될 수 있다. 다수의 세포주 및 배양물을 숙주 세포로서 사용하기 위해 입수할 수 있으며, 이들을 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)(살아있는 배양물 및 유전 물질의 보관을 맡고 있는 기관이다)을 통해 수득할 수 있다. 적합한 숙주는 벡터 주쇄 및 목적하는 결과를 근거로 당해 분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있다. 플라스미드 또는 코스미드를, 예를 들어 다수 벡터의 복제를 위해 원핵생물 숙주 세포내에 도입시킬 수 있다. 벡터 복제 및/또는 발현을 위한 숙주 세포로서 사용되는 세균 세포는 DH5α, JM109, 및 KC8뿐만 아니라 다수의 상업적으로 입수할 수 있는 세균 숙주, 예를 들어 슈어(SURE)® 컴피턴트 셀(Competent Cells) 및 솔로팩(SOLOPACK)™ 골드 셀즈(Gold Cells)(스트라타진(STRATAGENE)®, 라 호야 소재)를 포함한다. 한편으로, 세균 세포, 예를 들어 이 콜라이 LE392를 파지 바이러스용 숙주 세포로서 사용할 수 있었다.
벡터의 복제 및/또는 발현을 위한 진핵생물 숙주 세포의 예는 HeLa, NIH3T3, 주르캣(Jurkat), 293, Cos, CHO, Saos, 및 PC12를 포함한다. 다양한 세포 유형 및 유기체로부터의 다수의 숙주 세포들을 입수할 수 있으며 이들은 당해 분야의 숙련가에게 공지될 수 있다. 유사하게, 바이러스 벡터를 진핵생물 또는 원핵생물 숙주 세포, 특히 상기 벡터의 복제 또는 발현에 허용되는 것과 함께 사용할 수 있다.
C. 핵산의 세포내로의 도입
몇몇 실시태양에서, 핵산을 세포에 도입시킬 수 있다. 핵산 분자, 예를 들어 벡터를 세포에 도입시킬 수 있는 다수의 방법들이 존재한다. 수용체-매개된 엔도사이토시스를 통해 세포에 진입하고, 숙주 세포 게놈내에 통합하고 바이러스 전사물을 안정하고 효율적으로 발현시키는 몇몇 바이러스의 능력은 상기 바이러스들을 외래 유전자의 포유동물 세포내로의 전달에 매력적인 후보로 만들어 왔다((Ridgeway, 1988; Nicolas and Rubenstein, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Temin, 1986).
"바이러스 발현 벡터"는 상기 벡터에 클로닝된 폴리뉴클레오티드를 발현시키기에 충분한 상기 바이러스의 서열을 함유하는 벡터를 포함함을 의미한다. 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스바이러스, 및 우두 바이러스를 포함한 다수의 상기와 같은 바이러스 벡터들이 이미 철저히 연구되었다.
전달을, 세포주의 형질전환을 위한 실험실 과정에서와 같이 시험관내에서, 또는 몇몇 질병 상태의 치료에서와 같이 생체내 또는 생체외에서 수행할 수 있다. 하나의 전달 기전은 상기 발현 벡터를 감염성 바이러스 입자 중에 캡시드화시키는 바이러스 감염을 통해서이다. 발현 벡터를 배양된 포유동물 세포내로 전달하기 위한 다수의 비-바이러스 방법들이 또한 본 명세에 의해 고려된다. 이들 방법은 칼슘 포스페이트 침전(Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe et al., 1990) DEAE-덱스트란(Gopal, 1985), 일렉트로포레이션(Tur-Kaspa et al ., 1986; Potter et al., 1984), 직접적인 마이크로주사(Harland and Weintraub, 1985), DNA-로딩된 리포솜(Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979) 및 리포펙타민-DNA 복합체, 세포 초음파처리(Fechheimer et al ., 1987), 고속 미립자가속장치를 사용하는 유전자 충격(gene bombardment)(Yang et al., 1990), 리포솜(Ghosh and Bachhawat, 1991; Kaneda et al., 1989) 및 수용체-매개된 형질감염(Wu and Wu, 1987; Wu and Wu, 1988)을 포함한다. 이들 기법 중 일부는 생체내 또는 생체외 용도에 성공적으로 적합할 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 유전자 또는 유전자들을 암호화하는 핵산을 세포의 게놈내에 안정하게 통합시킬 수 있다. 상기 통합은 상동성 재조합(유전자 치환)을 통해 같은 위치 및 배향으로 이루어지거나, 또는 무작위, 불특정 위치(유전자 증대)에 통합될 수 있다. 더욱 추가의 실시태양에서, 상기 핵산은 세포 중에, DNA의 분리된, 에피솜 분절로서 안정하게 유지될 수 있다. 상기와 같은 핵산 분절 또는 "에피솜"은 숙주 세포 주기와 독립적으로 또는 상기 주기와 동시에 유지 및 복제를 허용하기에 충분한 서열을 암호화한다. 상기 발현 벡터가 세포에 어떻게 전달되고 상기 세포에서 상기 핵산이 어디에 남아있는지는, 사용되는 발현 벡터의 유형에 따라 변한다.
핵산 분자의 전달은 물리적으로 또는 화학적으로 세포막을 침투할 수 있는 상기 언급한 방법들 중 어느 하나에 의해 수행될 수 있다. 이를 특별히 시험관내 전달에 적용할 수 있으나, 생체내 사용에도 또한 적용할 수 있다.
III. 면역억제 요법
A. 염증성 병증
본 명세는 면역 반응의 조절을 위한 바이러스 RNA 분자의 용도, 특히 병적인 염증과 관련된 용도에 관한 것이다. 하나의 실시태양에서, 상기 병적인 염증은 인터류킨-2(IL-2) 발현에 관한 것이다. IL-2는 염증 반응 동안 다수의, 때때로 반대되는 기능을 갖는다. 상기는 T 세포 증식 및 T-헬퍼 1(Th1) 및 Th2 효과기 T 세포 분화의 효능 있는 유도인자이며 T 세포에 오래-지속되는 경쟁적 이점을 제공하여 기억 세포의 최적의 생존 및 기능을 생성시킨다. 조절 역할에서, IL-2는 기억 T 세포의 발생, 생존 및 기능에 중요하며, 상기는 Fas-매개된 활성화-유도된 세포사를 증대시키고, 상기는 염증성 Th17 세포의 발생을 억제한다. 따라서, IL-2는 그의 이중 및 대조적인 기능에서, 염증성 면역 반응의 유도 및 종결 모두에 기여한다.
따라서 본 명세는, 예를 들어 IL-2가 T 세포를 활성화하고 염증성 병증에 이르게 하는 질병들에서의 개재를 추구한다. 상기와 같은 질병은 다발성 경화증, 건선, 염증성 장 질환, 초기 관절염, 소아 관절염, 류머티스성 관절염, 장병성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 가족성 지중해열, 근위축성 측삭 경화증, 전신 홍반성 루푸스, 궤양성 대장염, 염증성 장 질병, 쇼그렌 증후군, 또는 크론병과 같은 자가면역 질병을 포함한다. 다른 염증성 병증는 심혈관 질병, 외상, 또는 췌장염을 포함한다.
B. 유전자 요법
하나의 실시태양에서, 본 명세는 유전자 요법에 사용되는 본 명세서에서 언급된 바이러스 핵산 구조물 중 하나 이상으로부터의 면역억제 서열을 포함함을 고려한다. 유전자 요법의 한 가지 문제점은, 일반적으로 수회 투여를 요하는 지속된 발현의 성취이다. 단일 투여든 수회 투여든 간에, 전달 벡터/비히클에 대한 면역 반응이 생성될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 면역조절 도메인의 포함이, 유전자 요법 양상에 대한 불필요하고 제한적인 숙주 면역 반응을 제거하는 방법으로서 본 명세서에서 유전자 요법 벡터에 제시된다.
C. 약학 제형 및 투여 경로
임상 용도를 고려하는 경우, 약학 조성물을 의도된 용도에 적합한 형태로 제조할 필요가 있을 것이다. 일반적으로, 이는 발열원뿐만 아니라 인간 또는 동물에 유해할 수 있는 다른 불순물이 필수적으로 없는 조성물의 제조를 수반할 것이다.
일반적으로 단백질을 안정하게 만들기에 적합한 염 및 완충제를 사용하는 것이 요구될 것이다. 완충제는 또한 RNA 분절을 환자에게 도입시키는 경우 사용될 것이다. 본 명세의 수성 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 수성 매질에 용해되거나 분산된 유효량의 상기 RNA 분절을 포함한다. 상기와 같은 조성물을 또한 접종물이라 칭한다. "약학적으로 또는 약물학적으로 허용 가능한"이란 어구는 동물 또는 인간에게 투여시 불리하거나, 알러지성이거나 또는 다른 부적합한 반응을 생성시키지 않는 분자 존재 및 조성물을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "약학적으로 허용 가능한 담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적 활성 물질에 대한 상기와 같은 매질 및 작용제의 용도는 당해 분야에 주지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 본 명세의 벡터 또는 세포에 부적합한 경우를 제외하고, 치료 조성물에서 사용이 고려된다. 보충적인 활성 성분을 또한 상기 조성물에 혼입시킬 수 있다.
임의의 약학적 제제 중의 활성 화합물의 비율은 상기 화합물의 활성에 따라 변한다. 전형적으로, 상기와 같은 조성물은 적어도 0.1%의 활성 화합물을 함유해야 한다. 상기 조성물 및 제제의 비율은 물론 변할 수 있으며, 편의상 상기 단위의 중량의 약 2 내지 약 60%일 수 있다. 상기와 같은 치료학적으로 유용한 조성물 중의 활성 화합물의 양은 적합한 투여량이 획득되도록 하는 양이다.
주사용에 적합한 약학적 형태는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사성 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 상기 형태는 멸균성이어야 하며 용이한 주사가 가능한 정도로 유동성이어야 한다. 상기는 제조 및 보관 조건하에서 안정성이어야 하며 미생물, 예를 들어 세균 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 상기 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 그의 적합한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적합한 유동성은 예를 들어 코팅제, 예를 들어 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지 또는 억제는 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살, 페닐머큐릭 니트레이트, m-크레졸 등에 의해 발생할 수 있다. 일부 실시태양에서, 등장성 용액, 예를 들어 당 또는 염화 나트륨을 사용할 수 있다. 상기 주사성 조성물의 연장된 흡수는 상기 조성물 중에 흡수 지연제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 발생할 수 있다.
멸균 주사성 용액을, 상기 활성 화합물을 적합한 용매 중에, 필요에 따라 상기 열거된 다양한 다른 성분들과 함께 필요한 양으로 혼입시킨 다음 멸균 여과함으로써 제조한다. 일반적으로, 분산액을, 다양한 멸균된 활성 성분을, 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시킴으로써 제조한다. 멸균 주사성 용액 제조용 멸균 분말의 경우에, 제조 방법은 앞서 멸균-여과된 용액으로부터의 활성 성분 + 임의의 추가적인 목적하는 성분의 분말을 제공하는 진공 건조 및 동결-건조 기법일 수 있다.
본 명세는 바이러스 RNA 면역억제 분절, 및 이를 암호화하는 핵산 분자를 고려한다. 일부 실시태양에서, 약학 조성물을 피험자에게 투여한다. 본 명세의 상이한 태양은 유효량의 수성 조성물을 투여함을 수반한다. 상기와 같은 조성물을 일반적으로는 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 수성 매질에 용해시키거나 분산시킬 것이다. 당해 분야의 숙련가들은 작용제의 투여뿐만 아니라 생체내 및 생체외 상황으로의 유전자 전달 방법을 잘 알고 있다.
"약학적으로 허용 가능한" 또는 "약물학적으로 허용 가능한"이란 어구는 적합한 대로 동물 또는 인간에게 투여시 불리하거나, 알러지성이거나 다른 부적합한 반응을 생성시키지 않는 분자 존재 및 조성물을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "약학적으로 허용 가능한 담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적 활성 물질에 대한 상기와 같은 매질 및 작용제의 용도는 당해 분야에 주지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 성분과 부적합한 경우를 제외하고, 치료 조성물에서 사용이 고려된다. 보충적인 활성 성분, 예를 들어 다른 항암제를 또한 상기 조성물에 혼입시킬 수 있다.
정맥내 또는 근육내 주사용 화합물과 같이 비경구 투여를 위해 제형화된 화합물 외에, 다른 약학적으로 허용 가능한 형태들, 예를 들어 경구 투여용 정제 또는 다른 고체; 지속 방출 캡슐; 및 현재 사용되는 임의의 다른 형태, 예를 들어 크림, 로션, 구강세척제, 흡입제 등을 포함한다.
본 명세의 활성 화합물을 비경구 투여를 위해 제형화할 수 있다, 예를 들어 정맥내, 근육내, 흉곽내, 피하, 또는 심지어 복강내 경로를 통한 주사를 위해 제형화할 수 있다. i.v. 또는 i.m.에 의한 투여가 특별히 고려된다.
상기 활성 조성물을 중성 또는 염 형태로 제형화할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염은 산염 및 무기산, 예를 들어 염산 또는 인산, 또는 아세트산, 옥살산, 타타르산, 만델산 등과 같은 유기산과 형성된 염들을 포함한다. 유리 카복실기와 형성된 염은 무기 염기, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 또는 수산화 제2철, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유래될 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 환자에게 조성물을 연속적으로 공급하는 것이 바람직할 수 있다. 정맥내 또는 동맥내 경로의 경우, 이를 적하 시스템에 의해 수행한다. 다양한 접근법을 위해서, 연장된 기간에 걸쳐 제한되지만 일정한 양의 치료제를 제공하는 지연된 방출 제형을 사용할 수 있다. 내부 적용을 위해서, 연속적인 관류를 사용할 수 있다. 이를 카테터 설치에 이어서 치료제의 연속 투여에 의해 수행할 수 있다. 상기 관류 기간은 특정 환자 및 상황에 대해서 임상의에 의해 선택될 수 있으나, 시간은 약 1-2시간 내지 2-6시간, 약 6-10시간, 약 10-12시간, 약 1-2일, 약 1-2주 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 일반적으로, 상기 연속적인 주입을 통한 치료 조성물의 용량은, 단일 또는 수회 주사에 의해 제공되고 상기 주사가 투여되는 기간 동안 조절되는 용량과 동등할 것이다. 그러나, 보다 높은 용량도 관류를 통해 성취될 수 있는 것으로 여겨진다.
수용액 중의 비경구 투여를 위해서, 예를 들어 상기 용액을 필요한 경우 적합하게 완충시키고 액체 희석제를 먼저 충분한 염수 또는 글루코스로 등장성으로 만들어야 한다. 상기 특정한 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 명세에 비추어 당해 분야의 숙련가들에게 공지될 것이다. 예를 들어, 하나의 투여량을 1 ㎖의 등장성 NaCl 용액에 용해시키고 1000 ㎖의 피하주사액(hypodermoclysis fluid)에 가하거나 또는 제안된 주입 부위에 주사할 수 있었다(예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 1990]을 참조하시오). 투여량의 약간의 변화가 치료되는 피험자의 조건에 따라 반드시 발생할 것이다. 투여를 담당하는 사람은 어쨌든 개별 피험자에게 적합한 용량을 결정할 것이다.
상기 치료 조성물의 유효량을 의도하는 목적을 근거로 결정한다. "단위 용량" 또는 "투여량"이란 용어는 피험자에서 사용하기에 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며, 각 단위는 투여, 즉 적합한 경로 및 치료 섭생과 관련하여 상기에 논의된 목적하는 반응을 생성시키도록 계산된 소정량의 상기 치료 조성물을 함유한다. 치료 횟수 및 단위 용량 모두에 따라 상기 투여되는 양은, 목적하는 보호에 따라 변한다.
RNA 분절을 다양한 일수, 주 수, 개월 수 또는 년수 동안 1회 이상 매일, 매주, 매월 또는 매년 투여시 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ㎎/㎏의 중량 내지 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 ㎎/㎏의 중량으로 변할 수 있는 용량으로 투여할 수 있다. 상기 NRA 분절을 비경구 주사(정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 강내 또는 경피)에 의해 투여할 수 있다.
다수의 경우에, 본 명세의 RNA 분절의 수회 투여를 갖는 것이 바람직할 것이다. 본 명세의 조성물을 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 이상 투여할 수 있다. 상기 투여는 통상적으로 1 내지 12주 간격, 보다 대개는 1 내지 4주 간격으로 있을 것이다.
수동 면역을 제공하는 제형에 통상적으로 사용되는 투여량은 용량당 0.5 ㎖ 내지 10 ㎖의 범위, 또는 용량당 2 ㎖ 내지 5 ㎖의 범위이다. 적합한 양의 활성 화합물을 전달하기 위해 반복되는 용량은 통상적이다. 투여하기에 적합한 활성 성분의 투여량 및 부피를 결정할 때 수용자의 연령 및 체중을 모두 고려해야 한다.
상기 치료 조성물의 정확한 양은 또한 의사의 판단에 따르며 각 개인에 고유하다. 용량에 영향을 미치는 인자는 환자의 신체적 및 임상적 상태, 투여 경로, 의도하는 치료 목적(증상의 경감 대 치유) 및 특정한 치료 물질의 효능, 안정성 및 독성을 포함한다.
제형화시, 용액을 상기 투여량 제형과 적합한 방식으로 치료학적으로 유효한 바와 같은 양으로 투여할 것이다. 상기 제형을 다양한 투여형, 예를 들어 상술한 주사성 용액의 유형으로 쉽게 투여하나, 약물 방출 캡슐 등을 또한 사용할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 시험관내 투여란 용어는 동물로부터 제거된 세포, 예를 들어 비제한적으로 배양물 중의 세포상에서 수행되는 조작을 지칭한다. 생체외 투여란 용어는 시험관내에서 조작되었고 후속으로 살아있는 동물에게 투여되는 세포를 지칭한다. 생체내 투여란 용어는 동물 내 세포상에서 수행되는 모든 조작을 포함한다.
D. 소염제와의 조합
질병을 종종 "복합 요법"이라 칭하는 다중 치료 양상으로 치료하는 것은 다수의 약물 분야에 통상적이다. 염증 질병도 예외는 아니다. 본 명세의 방법 및 조성물을 사용하여 염증 질환을 치료하기 위해서, 표적 세포 또는 피험자를 바이러스 RNA 면역억제 분절 및 적어도 하나의 다른 요법과 일반적으로 접촉시킬 것이다. 이들 요법은 하나 이상의 질병 매개변수의 감소를 성취하기에 유효한 결합된 양으로 제공될 것이다. 상기 과정은 상기 세포/피험자를 상기 작용제/요법 모두와 동시에, 예를 들어 2개의 작용제를 모두 포함하는 단일 조성물 또는 약물학적 제형을 사용하여 접촉시키거나, 또는 상기 세포/피험자를 2개의 별도의 조성물 또는 제형(여기에서 하나의 조성물은 바이러스 면역억제성 분절을 포함하고 다른 것은 다른 작용제를 포함한다)과 동시에 접촉시킴을 수반한다.
한편으로, 상기 면역억제성 RNA 분절은 수분 내지 수주 범위의 간격에 의해 상기 다른 처리에 앞서거나 뒤에 이어질 수 있다. 일반적으로 상기 요법들이 상기 세포/피험자상에서 여전히 유리한 복합 효과를 발휘할 수 있도록 각각의 전달 시간 사이에 상당한 시간이 소멸되지 않도록 해야 할 것이다. 상기와 같은 경우에, 상기 세포를 상기 두 양상 모두와 서로 약 12 내지 24시간 이내에, 서로 약 6 내지 12시간 이내에, 또는 단지 약 12시간의 지연 시간으로 접촉시킬 것이 고려된다. 일부 상황에서, 상기 치료 기간을 현저하게 연장시키는 것이 바람직할 수 있으나; 각 투여 사이에 수일(2, 3, 4, 5, 6 또는 7) 내지 수주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8)가 경과한다.
또한 생각되는 바로는, 바이러스 면역억제성 분절이나 다른 요법 중 어느 하나의 1회 초과의 투여가 요구될 것이다. 다양한 조합들이 사용될 수 있으며, 이때 하기에 예시되는 바와 같이, 상기 바이러스 RNA 분절은 "A"이고, 다른 요법은 "B"이다:
Figure pct00004
다른 조합들도 고려된다.
염증 질환에 대한 복합 요법에 사용하기에 적합한 작용제 또는 인자는 스테로이드, 글루코코르티코이드, 비-스테로이드성 소염 약물(NSAIDS: COX-1 및 COX-2 억제제 포함), 아스피린, 이부프로펜, 및 나프록센을 포함한다. 진통제는 소염 약물과 통상적으로 관련되나, 소염 효과는 없다. 일례는 미국에서 아세트아미노펜이라 지칭되는 파라세타몰이며 타이레놀이란 상표명으로 판매된다. COX 효소를 억제시킴으로써 통증 및 염증을 감소시키는 NSAIDS와 상반되게, 파라세타몰은 최근에 엔도칸나비노이드의 재흡수를 차단하는 것으로 나타났으며, 이는 단지 통증만을 감소시킬 뿐이며, 이는 상기가 염증에 미미한 효과를 갖는 이유를 설명하는 듯하다.
숙련가는 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, chapter 33], 특히 624 내지 652 페이지를 가리킨다. 투여량의 약간의 변화가 치료되는 피험자의 조건에 따라 반드시 발생할 것이다. 투여를 담당하는 사람은 어쨌든 개별 피험자에게 적합한 용량을 결정할 것이다. 더욱이, 인간 투여의 경우, 제제는 FDA 관청의 생물학적 표준에 의해 요구되는 바와 같은 멸균성, 발열원성, 일반적인 안전성 및 순도 표준을 충족시켜야 한다.
또한, 상기 요법들 중 어떠한 요법도 염증 치료에 단독으로 유용함을 입증할 수 있는 것으로 판명되어야 한다.
IV. 백신
본 명세의 실시태양에서, 바이러스 감염을 예방, 억제 또는 제한하기 위해서 고유 RNA보다는 조작된 바이러스 RNA 분절에 대해 증대된 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 하나 이상의 면역억제 부위가 없는 변형된 바이러스 RNA 분절을 서브유닛 또는 전체 바이러스 면역화에 사용할 것이다. 백신 조성물의 유효량은 일반적으로 질병 또는 그의 상태 또는 증상의 정도를 검출가능하고 반복적으로 개선시키거나, 감소시키거나, 최소화하거나 또는 제한하기에 충분한 양으로서 정의된다. 질병의 제거, 근절 또는 치유를 포함하여 보다 엄격한 정의를 적용할 수도 있다.
A. 투여
본 명세의 조성물을 면역 반응을 변형시키거나 조절하기 위해 생체내에서 사용할 수 있으며, 따라서 상기 조성물은 치료학적 및 예방학적 백신을 구성한다. 따라서, 상기 조성물을 비경구 투여를 위해 제형화할 수 있다, 예를 들어 피내, 정맥내, 근육내, 피하 또는 복강내 경로를 통한 주사를 위해 제형화할 수 있다. 피내 및 근육내 경로에 의한 투여가 특히 고려된다. 상기 백신을 또한 점막에 직접 국소 경로에 의해, 예를 들어 코 점적제 또는 미스트, 흡입, 또는 분무기에 의해 투여할 수 있다.
투여량 및 섭생의 약간의 변화는 치료되는 피험자의 연령 및 의학적 상태뿐만 아니라 선택된 경로에 따라 반드시 발생할 것이다. 투여를 담당하는 사람은 어쨌든 개별 피험자에게 적합한 용량을 결정할 것이다. 다수의 경우에, 상기 백신의 수회 투여를 갖는 것이 바람직할 것이다. 따라서, 본 명세의 조성물을 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 이상 투여할 수 있다. 상기 투여는 통상적으로 1 내지 12주 간격으로, 보다 대개는 1 내지 6주 간격으로 있을 것이다. 주기적인 재-투여가 병원체에 대한 재발 노출에 바람직할 것이다.
상기 투여는 다양한 "단위 용량"을 사용할 수 있다. 단위 용량은 소정량의 상기 치료 조성물을 함유하는 것으로서 정의된다. 투여되는 양, 및 특정한 경로 및 제형은 임상 분야의 기술 내에 있다.
B. 면역 반응의 측정
당해 분야의 숙련가는 백신에 대해 면역 반응이 생성되었는지의 여부를 측정하기 위한 다양한 분석을 알 것이다. "면역 반응"이란 어구는 세포 및 체액 면역 반응 모두를 포함한다. 다양한 B 림프구 및 T 림프구 분석, 예를 들어 ELISA, 세포독성 T 림프구(CTL) 분석, 예를 들어 크로뮴 방출 분석, 말초 혈액 림프구(PBL)를 사용하는 증식 분석, 사량체 분석, 및 사이토킨 생성 분석이 주지되어 있다. 문헌[Benjamini et al.(1991)](본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오.
C. 주사성 제형
본 명세에 따른 약제의 전달을 위한 한 가지 방법은 주사를 통해서이다. 그러나, 본 명세서에 개시된 약학 조성물을 선택적으로, 미국특허 제 5,543,158 호; 미국특허 제 5,641,515 호 및 미국특허 제 5,399,363 호(각각은 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)에 기재된 바와 같이 정맥내, 피내, 근육내, 또는 심지어 복강내로 투여할 수 있다.
주사는, 작용제가 주사에 필요한 특정 게이지의 바늘을 통과할 수 있는 한, 주사기 또는 용액의 주사에 사용되는 임의의 다른 방법에 의할 수 있다. 상기 용액을 유지하기 위한 앰풀 챔버를 한정하는 노즐 및 상기 용액을 상기 노즐 밖으로 밀어내어 전달 부위로 보내는 에너지 장치를 갖는 신규의 무바늘 주사 시스템이 개시되었다(미국특허 제 5,846,233 호).
유리 염기 또는 약물학적으로 허용 가능한 염으로서 상기 백신의 용액을 계면활성제, 예를 들어 하이드록시프로필셀룰로스와 적합하게 혼합된 수 중에서 제조할 수 있다. 분산액을 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 이들의 혼합물 및 오일 중에서 제조할 수 있다. 통상적인 보관 및 사용 조건하에서, 상기 제제는 미생물의 생육을 방지하거나 억제하기 위해 보존제를 함유한다. 주사성 용도에 적합한 약학적 형태는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사성 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다(미국특허 제 5,466,468 호, 내용 전체가 본 발명에 구체적으로 인용된다). 상기 형태는 멸균성이어야 하며 용이한 주사성이 존재할 정도로 유동성이어야 한다. 상기는 제조 및 보관 조건하에서 안정성이어야 하며 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 상기 담체는 예를 들어 수, 에탄올, 폴리올(예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물 및/또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적합한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅제의 사용, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
미생물의 방지 또는 억제는 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 발생될 수 있다. 일부 실시태양에서 등장화제, 예를 들어 당 또는 염화 나트륨을 사용할 수 있다. 상기 주사성 조성물의 연장된 흡수는 상기 조성물 중에 흡수 지연제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 발생할 수 있다. 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 명세에 비추어 당해 분야의 숙련가들에게 공지될 것이다. 예를 들어, 하나의 투여량을 1 ㎖의 등장성 NaCl 용액에 용해시키고 1000 ㎖의 피하주사액에 가하거나 또는 제안된 주입 부위에 주사할 수 있다(예를 들어 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580]을 참조하시오). 투여량의 약간의 변화가 치료되는 피험자의 조건에 따라 반드시 발생할 것이다. 투여를 담당하는 사람은 어쨌든 개별 피험자에게 적합한 용량을 결정할 것이다. 더욱이, 인간 투여의 경우, 제제는 FDA 관청의 생물학적 표준에 의해 요구되는 바와 같은 멸균성, 발열원성, 일반적인 안전성 및 순도 표준을 충족시켜야 한다.
멸균 주사성 용액을, 상기 활성 화합물을 적합한 용매 중에, 필요에 따라 상기 열거된 다양한 다른 성분들과 함께 필요한 양으로 혼입시킨 다음 멸균 여과함으로써 제조한다. 일반적으로, 분산액을, 다양한 멸균된 활성 성분을, 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시킴으로써 제조한다. 멸균 주사성 용액 제조용 멸균 분말의 경우에, 제조 방법은 앞서 멸균-여과된 용액으로부터의 활성 성분 + 임의의 추가적인 목적하는 성분의 분말을 제공하는 진공 건조 및 동결-건조 기법일 수 있다.
본 명세서에 개시된 조성물을 중성 또는 염 형태로 제형화할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염은 산 부가염(단백질의 유리 아미노기와 형성됨)을 포함하고, 무기산, 예를 들어 염산 또는 인산, 또는 아세트산, 옥살산, 타타르산, 만델산 등과 같은 유기산과 형성된 염들을 포함한다. 유리 카복실기와 형성된 염은 무기 염기, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 또는 수산화 제2철, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유래될 수 있다. 제형화시, 용액을 상기 투여량 제형과 적합한 방식으로 치료학적으로 유효한 바와 같은 양으로 투여할 것이다. 상기 제형은 다양한 투여형으로, 예를 들어 상기와 같은 주사성 용액, 약물 방출 캡슐 등으로 쉽게 투여된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "담체"는 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 희석제, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 약학적 활성 물질에 대한 상기와 같은 매질 및 작용제의 용도는 당해 분야에 주지되어 있다. 보충적인 활성 성분을 또한 상기 조성물에 혼입시킬 수 있다.
"약학적으로-허용 가능한" 또는 "약물학적으로-허용 가능한"이란 어구는 인간에게 투여시 알러지 또는 유사한 부적합한 반응을 생성시키지 않는 분자 존재 및 조성물을 지칭한다. 활성 성분으로서 단백질을 함유하는 수성 주사성 조성물의 제조는 당해 분야에서 충분히 이해된다.
D. 흡입성 또는 에어로졸 제형
본 명세의 RNA 분절에 대해 고려되는 특정한 투여 방식은 코 점막에의 흡입 및/또는 투여, 즉 비내 투여를 통해서이다. 다양한 상업적인 백신(인플루엔자, 홍역)은 현재 코 미스트 제형을 사용하여 투여된다. 본 명세의 방법을 플루-미스트(Flu-Mist)® 제품(BD 애큐스프레이(AccuSpray)® 시스템(벡톤 디킨슨(Becton Dickinson))을 사용한다)에 사용되는 전달과 유사한 전달을 사용하여 수행할 수 있다. 분무기, 예를 들어 제트 분무기 및 초음파 분무기가 또한 상기 경로에 유용하다.
E. 추가적인 백신 성분들
본 명세의 다른 실시태양에서, 상기 항원성 조성물은 추가적인 면역자극제를 포함할 수 있다. 면역자극제는 비제한적으로 추가적인 항원, 면역조절제, 항원 제시 세포 또는 항원보강제를 포함한다. 다른 실시태양에서, 상기 추가적인 작용제(들) 중 하나 이상을 상기 항원 또는 면역자극제에 임의의 조합으로 공유 결합시킨다.
1. 항원보강제
당해 분야에 또한 주지된 바와 같이, 특정 면역원 조성물의 면역원성을 항원보강제로서 공지된, 면역 반응의 비특이적인 자극제의 사용에 의해 증대시킬 수 있다. 항원보강제는 미지의 항원에 대한 일반화된 면역성의 증가를 촉진하기 위해 사용되었다(미국특허 제 4,877,611 호를 참조하시오). 면역 프로토콜은 수년간 반응을 자극하기 위해서 항원보강제를 사용하여 왔으며, 이와 같이 항원보강제는 당해 분야의 통상적인 숙련가에게 주지되어 있다. 일부 항원보강제는 항원이 제공되는 방식에 영향을 미친다. 예를 들어, 단백질 항원을 알룸에 의해 침전시킬 때 면역 반응이 증가된다. 항원의 유화가 또한 항원 제시의 지속기간을 연장시킨다. 적합한 분자 항원보강제들은 모두 허용 가능한 면역자극성 화합물, 예를 들어 사이토킨, 독소 또는 합성 조성물을 포함한다.
예시적인 항원보강제는 완전 프로인트 항원보강제(살해된 마이코박테리움 튜베르큘로시스를 함유하는 면역 반응의 비특이적인 자극제), 불완전 프로인트 항원보강제 및 수산화 알루미늄 항원보강제를 포함한다. 또한 사용될 수 있는 다른 항원보강제는 IL-1, IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, γ-인터페론, BCG, 수산화 알루미늄, MDP 화합물, 예를 들어 thur-MDP 및 nor-MDP, CGP(MTP-PE), 지질 A 및 모노포스포릴 지질 A(MPL)를 포함한다. RIBI(2% 스쿠알렌/트윈 80 유화액 중에 세균으로부터 추출된 3가지 성분, MPL, 트레할로스 디마이콜레이트(TDM) 및 세포벽 골격(CWS)을 함유함)가 또한 고려된다. 심지어 MHC 항원을 사용할 수도 있다.
하나의 태양에서, 항원보강제 효과는 포스페이트 완충된 염수 중의 약 0.05 내지 약 0.1% 용액으로 사용되는, 알룸과 같은 작용제의 사용에 의해 성취된다. 한편으로, 상기 항원을 약 0.25% 용액으로서 사용되는 당의 합성 중합체(카르보폴(CARBOPOL)®)와의 혼합물로서 제조한다. 항원보강제 효과를 또한 각각 30-초 내지 2-분의 기간 동안 약 70 ℃ 내지 약 101 ℃ 범위의 온도의 열처리에 의한 상기 백신 중의 상기 항원의 응집에 의해 만들 수 있다. 알부민에 대한 펩신-처리된(Fab) 항체, 세균 세포(들), 예를 들어 씨 파르븀(C. parvum)과의 혼합물, 그람 음성 세균의 내독소 또는 리포폴리사카라이드 성분, 생리학적으로 허용 가능한 오일 비히클, 예를 들어 만니드 모노-올리에이트(아라셀(Aracel) A) 중의 유화액, 또는 차단 대용물로서 사용되는 퍼플루오로카본(플루오솔(Fluosol)-DA®)의 20% 용액을 갖는 유화액에 의한 재활성화에 의한 응집을 또한 사용할 수 있다.
일부 항원보강제, 예를 들어 세균으로부터 획득된 몇몇 유기 분자는 항원상에서보다는 숙주상에서 작용한다. 일례는 뮤라밀 디펩티드(N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민; MDP), 세균성 펩티도글리칸이다. 대부분의 항원보강제와 같이, MDP의 효과는 충분히 이해되어 있지 않다. MDP는 대식세포를 자극하지만 또한 B 세포를 직접 자극하는 것으로 보인다. 따라서 항원보강제의 효과는 항원-특이성이 아니다. 그러나, 상기가 정제된 항원과 함께 투여되는 경우, 상기는 항원에 대한 반응을 선택적으로 촉진하기 위해 사용될 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 헤모시아닌 및 헤모에리쓰린을 또한 본 명세에 사용할 수 있다. 키홀 림펫으로부터의 헤모시아닌(KLH)을 몇몇 실시태양에 사용할 수 있지만, 다른 연체동물 및 절지동물 헤모시아닌 및 헤모에리쓰린을 사용할 수도 있다.
다양한 폴리사카라이드 항원보강제를 또한 사용할 수 있다. 예를 들어 마우스의 항체 반응에 대한 다양한 폐렴구균 폴리사카라이드 항원보강제의 용도가 개시되었다(Yin et al., 1989). 최적의 반응을 생성시키거나 또는 달리 억제를 생성시키지 않는 용량을 지시된 대로 사용해야 한다(Yin et al., 1989). 탈아세틸화된 키틴을 포함하여, 키틴 및 키토산과 같은 폴리사카라이드의 폴리아민 변이체들을 사용할 수 있다.
항원보강제의 또 다른 그룹은 세균성 펩티도글리칸의 뮤라밀 디펩티드(MDP, N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민) 그룹이다. 뮤라밀 디펩티드의 유도체, 예를 들어 아미노산 유도체 쓰레오닐-MDP, 및 지방산 유도체 MTPPE가 또한 고려된다.
미국특허 제 4,950,645 호는 포스파티딜 콜린 및 포스파티딜 글리세롤로부터 형성된 인공 리포솜에서의 용도에 대해 기재된 뮤라밀 디펩티드의 친지성 디사카라이드-트리펩티드 유도체를 기재한다. 상기는 인간 단핵구의 활성화 및 종양 세포의 파괴에 유효하지만, 일반적으로 고 용량에서 무-독성이다. 미국특허 제 4,950,645 호 및 PCT 특허 출원 WO 91/16347의 화합물들이 세포 담체 및 본 명세의 다른 실시태양들과 함께 사용할 것이 고려된다.
BCG(바실러스 칼메트-게랑, 마이코박테리움의 약독화된 균주) 및 BCG-세포벽 골격(CWS)을 또한 트레할로스 디마이콜레이트와 함께 또는 상기 없이 항원보강제로서 사용할 수 있다. 트레할로스 디마이콜레이트 자체를 사용할 수도 있다. 트레할로스 디마이콜레이트 투여는 마우스에서 인플루엔자 바이러스 감염에 대해 증대된 내성과 상관이 있는 것으로 보고되었다(Azuma et al., 1988). 트레할로스 디마이콜레이트를 미국특허 제 4,579,945 호에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. BCG는 그의 면역자극 성질로 인해 중요한 임상적 도구이다. BCG는 세망내피계를 자극하고, 천연 킬러 세포를 활성화시키며 조혈모세포의 증식을 증가시키는 작용을 한다. BCG의 세포벽 추출물은 탁월한 면역 항원보강제 활성을 갖는 것으로 입증되었다. 마이코박테리아에 대한 분자 유전학적 도구 및 방법은 외래 유전자를 BCG에 도입시키는 수단을 제공하였다(Jacobs　et al .,　1987; Snapper　et al .,　1988; Husson　et al .,　1990; Martin　et al .,　1990). 생 BCG는 결핵을 예방하기 위해 전세계적으로 사용되는 유효하고 안전한 백신이다. BCG 및 다른 마이코박테리아는 매우 유효한 항원보강제이며, 마이코박테리아에 대한 면역 반응은 광범위하게 연구되었다. 거의 20억명의 면역화와 함께, BCG는 인간에서 장시간 안전 사용기록을 갖는다(Luelmo, 1982; Lotte et al., 1984). 상기는 출생시 제공될 수 있는 소수의 백신 중 하나이며, 단지 단일 용량으로 오래가는 면역 반응을 초래하고, BCG 백신접종에 경험이 있는 세계적인 유통망이 존재한다. 예시적인 BCG 백신은 TICE BCG(오르가논 인코포레이티드(Organon Inc.), 미국 뉴저지주 웨스트 오렌지 소재)이다.
양친매성 및 표면 활성제, 예를 들어 사포닌 및 유도체, 예를 들어 QS21(캠브리지 바이오테크(Cambridge Biotech))은 본 명세의 면역원과 함께 사용하기 위한 더욱 또다른 항원보강제 그룹을 형성한다. 비이온성 블록 공중합체 계면활성제(Rabinovich et al., 1994)를 또한 사용할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또 다른 유용한 항원보강제 그룹이다(Yamamoto et al., 1988). 퀼 A 및 렌티넨은 본 명세의 몇몇 실시태양에서 사용될 수 있는 다른 항원보강제이다.
또 다른 항원보강제 그룹은 해독된 내독소, 예를 들어 미국특허 제 4,866,034 호의 정제된 해독된 내독소이다. 이들 정제된 해독된 내독소는 포유동물에서 항원보강제 반응을 생성시키기에 유효하다. 물론, 상기 해독된 내독소를 다른 항원보강제와 병용하여 다중-항원보강제-통합된 세포를 제조할 수도 있다. 예를 들어, 미국특허 제 4,435,386 호에 기재된 바와 같은, 해독된 내독소와 트레할로스 디마이콜레이트의 조합이 특별히 고려된다. 해독된 내독소와 트레할로스 디마이콜레이트 및 내독성 당지질의 조합이 또한, 미국특허 제 4,436,727 호, 미국특허 제 4,436,728 호 및 미국특허 제 4,505,900 호에 기재된 바와 같은, 해독된 내독소와 세포벽 골격(CWS) 또는 CSW와 트레할로스 디마이콜레이트와의 조합과 같이 고려된다(미국특허 제 4,505,899 호). 해독된 내독소 부재하의 CWS와 트레할로스 디마이콜레이트의 조합이 또한 미국특허 제 4,520,019 호에 기재된 바와 같이 유용한 것으로 기대된다.
당해 분야의 숙련가들은 본 명세에 따라 세포 백신에 접합시킬 수 있는 상이한 종류의 항원보강제들을 알 것이며, 여기에는 특히 알킬 리소포스피리피드(ALP); BCG; 및 비오틴(비오틴화된 유도체 포함)이 포함된다. 사용이 특별히 고려되는 몇몇 항원보강제는 그람-세포로부터의 테이코산이다. 여기에는 리포테이코산(LTA), 리비톨 테이코산(RTA) 및 글리세롤 테이코산(GTA)이 포함된다. 이들의 합성 대응물의 활성 형태를 또한 본 명세와 관련하여 사용할 수 있다(Takada et al., 1995).
예를 들어 항체를 발생시키거나 또는 후속적으로 활성화된 T 세포를 획득하기 원하는 경우, 다양한 항원보강제, 심지어 인간에서 통상적으로 사용되지 않는 것들조차 여전히 동물에서 사용될 수 있다. 상기 항원보강제 또는 상기 세포로부터 생성될 수 있는, 예를 들어 조사되지 않은 종양 세포를 사용하여 발생할 수도 있는 바와 같은 독성 또는 다른 부작용들은 상기와 같은 상황에 관련이 없다.
항원보강제는 핵산(예를 들어 DNA 또는 RNA)에 의해 암호화될 수 있다. 상기와 같은 항원보강제는 또한 항원을 암호화하는 핵산(예를 들어 발현 벡터), 또는 별도의 벡터 또는 다른 구조물에서 또한 암호화될 수 있는 것으로 생각된다. 상기 항원보강제를 암호화하는 핵산을, 예를 들어 지질 또는 리포솜과 함께 직접 전달할 수 있다.
2. 생물학적 반응 조절제
항원보강제 외에, 생물학적 반응 조절제(BRM)(T 세포 면역성을 상향조절하거나 또는 억제 세포 활성을 하향조절하는 것으로 입증되었다)를 동시투여하는 것이 바람직할 수 있다. 상기와 같은 BRM은 비제한적으로 시메티딘(CIM; 1200 ㎎/d)(스미스/클라인(Smith/Kline), 미국 펜실바니아주 소재); 저용량 사이클로포스파미드(CYP; 300 ㎎/㎡)(존슨/메드(Johnson/Mead), 미국 뉴저지주 소재), 사이토킨, 예를 들어 γ-인터페론, IL-2 또는 IL-12, 또는 면역 헬퍼 기능에 관련된 단백질을 암호화하는 유전자, 예를 들어 B-7을 포함한다.
3. 케모킨
케모킨, 케모킨을 암호화하는 핵산, 및/또는 상기와 같은 것을 발현하는 세포를 또한 백신 성분으로서 사용할 수 있다. 케모킨은 일반적으로 화학유인물질로서 작용하여 면역 효과기 세포를 케모킨 발현 부위로 모집한다. 특정한 케모킨 암호화 서열을 예를 들어 사이토킨 암호화 서열과 함께 발현시켜 다른 면역계 성분들의 치료 부위로의 모집을 증대시키는 것이 유리할 수 있다. 상기와 같은 케모킨은 예를 들어 RANTES, MCAF, MIP1-α, MIP1-β, IP-10 및 이들의 조합을 포함한다. 숙련가는 몇몇 사이토킨(예를 들어 IFN)이 또한 화학유인물질 효과를 갖는 것으로 공지되어 있고 또한 케모킨이란 용어하에 분류될 수 있음을 알 것이다.
V. 실시예
하기의 실시예들은 본 명세의 몇몇 실시태양들을 설명하기 위해 포함된다. 당해 분야의 숙련가들은 하기 실시예에 개시된 기법들이 본 명세의 실시에서 잘 기능하도록 결정된 기법들을 나타내며, 따라서 이들이 일부 그의 실행 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 알아야 한다. 그러나, 당해 분야의 숙련가들은 본 명세에 비추어 다수의 변화를 개시된 특정 실시태양들에서 수행할 수 있고 본 명세의 진의 및 범위로부터 이탈됨 없이 여전히 같은 또는 유사한 결과를 획득할 수 있음을 알아야 한다.
실시예 1 - 물질 및 방법
세포 및 바이러스. 인간 간세포 암종 세포주(Huh-7.5; 친절하게도 록펠러 대학의 찰스 라이스 박사(Dr. Charles Rice)에 의해 제공됨)를 10% 소 태아 혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 1% L-글루타민을 함유하는 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM)에서 5% CO2 중에서 37 ℃에서 배양하였다. 유전자형(1, 1a, 1b, 2, 2b 및 3)으로 감염된 HCV 양성 인간 혈청 또는 음성 대조용 혈청을 환자 또는 건강한 혈액 공여자로부터 수득된 혈액으로부터 제조하였다. 전장 HCV 게놈 또는 상기 게놈의 NS2-5 영역으로 이루어지는 레플리콘을 함유하는 Huh 7 세포는 친절하게도 랄프 바르텐슈라거 박사(Dr. Ralf Bartenschlager)(하이델베르크 대학)에 의해 제공되었으며 기재된 바와 같이 유지되었다(Lohmann et al., 1999 and Quinkert et al., 2005). 혈청 세포외 소낭(EV)을 제조사의 설명에 따라 엑소퀵(ExoQuick) 시약(시스템스 바이오사이언시즈(Systems Biosciences))을 사용하여 혈청으로부터 정제하였다. 구체적으로, 인간 혈청을 1시간(4 ℃) 동안 상기 엑소퀵 시약과 함께 인큐베이션하고 권장되는 대로 30 분(10,000 g) 원심분리시켰다. 상기 펠릿을 RPMI 중에 재현탁시키고 사용 시까지 -20 ℃에서 보관하였다. 상기 시약은 세포 배양 상등액 및 인간 혈청 모두로부터 EV를 생성시키는 것으로 보고되었다(Fabbri et al., 2012). 세포 배양물 유래된, 감염성 HCV 입자(HCVcc)를, 다른 사람들에 의해 기재된 바와 같이(Lindenbach et al., 2005) Huh7.5 세포를 J6/JFH 감염성 클론(친절하게도 타카지 와키타 박사(Dr. Takaji Wakita)(토쿄 메트로폴리탄 신경과학 연구소) 및 찰스 라이스 박사(록펠러 대학)에 의해 제공되었다)으로부터 시험관내 전사된 HCV RNA로 형질감염시킴으로써 수득하였다. 세포 배양 상등액을 형질감염에 이어서 72시간 째에 수확하고 농축시켰다. 상기 배양 상등액 중의 HCV 역가는 4.98 x 107(사본/㎖)이었다. 4.98 x 107 입자를 1 x 106 세포에 가하였다. HCV(E1-E2) 위형 HIV 입자(HCVpp) 또는 바이러스 외막이 없는 HIV gag 입자(GAGpp)를 기재된 바와 같이(Mohr et al., 2010) pNL4-3-Luc.R-E-(NIRRRP 카탈로그 # 3417)를 사용하여 HEK 293T 세포에서 생성시켰다. 상등액 중의 HCVcc, HCVpp 및 GAGpp를 아미콘(Amicon) 100K 필터 유닛(밀리포어(Millipore))을 사용하여 농축시키고 HCVpp/GAGpp를 p24 ELISA(젭토메트릭스 인코포레이티드(Zeptometrix Inc.))를 사용하여 정량분석하였다.
HCV 외막 단백질의 발현. J6/JFH 플라스미드(aa 384-747)(Lindenbach et al., 2005)로부터 또는 아이오와 대학의 환자로부터 수득한 유전자형 3 단리물로부터의 HCV E2 단백질의 암호화 영역을 앞서 기재된 바와 같이(Xiang et al., 2012) 증폭시키고 변형된 pTRE2-HGY 플라스미드(클론테크 인코포레이티드(Clontech, Inc.))에 결찰시켰다. HCV 서열을, 플라스미드 DNA를 서열분석함으로써 확인하였다(아이오와 대학 DNA 코어 설비). 상기 변형된 플라스미드는 상기 HCV E2 서열에 이어서 정지 코돈을 암호화하는 이중시스트론 메시지, GFP의 번역을 지시하는 뇌척수심근염 바이러스(EMC) 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 생성시킨다. 주르캣(tet-off) 세포주(클론테크 인코포레이티드)를 형질감염시키고(뉴클레오펙터(Nucleofector) II, 론자 인코포레이티드(Lonza Inc.)) 세포주를 하이그로마이신 및 G418 내성에 대해 선택하였다. GFP 양성 세포를 벌크 분류하고(BD FACS Aria, 아이오와 대학 유식 세포측정 설비) GFP 발현을 유식 세포측정(BD LSR II)에 의해 평가하였다. HCV E2 단백질 발현을 인간 단클론 항체(HC33-1, 친절하게도 스탠포드 대학 스티븐 풍 박사(Dr. Steven Foung)에 의해 제공되었다)를 사용하여 면역블럿에 의해 측정하였다. 모든 세포주를 10% 열-불활성화된 송아지 태아 혈청, 2 mM L-글루타민, 100 IU/㎖ 페니실린, 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 하이그로마이신 및 G418(200 ㎍/㎖)과 함께 보충된 RMPI 1640에서 유지시켰다.
세포 단리 및 자극. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 피콜-구배 원심분리에 의해 건강한 공여자로부터 수득된 혈액으로부터 제조하였다. PBMC를 밤새 HCV 양성 또는 음성 혈청(달리 서술되지 않는 한 각각 100 ㎕)과 함께 인큐베이션하였다. CD3+(T) 세포를 제조사의 설명(밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec), 미국 캘리포니아주 오번 소재)에 따라 자기 시스템을 사용하여 양성 선택에 의해 농축시키고 순도를 유식 세포측정에 의해 평가하였다. PBMC(1 x 106 세포/㎖)를 플레이트-결합된 항-CD3(100 ng/㎖, OKT3 클론, 이바이오사이언스(eBioscience)) 및 가용성 CD28 항체(100 ng/㎖, 클론 CD28.2, BD 바이오사이언시즈)로 자극하였다. 주르캣 세포(5 x 106 세포/㎖)를 항-CD3 및 가용성 CD28(둘 다 5 ㎍/㎖) 또는 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트(PMA, 50 ng/㎖) 및 이오노마이신(1 ㎍/㎖)(P+I)으로 자극하였다. 세포 수용체 발현 및 사이토킨 방출을 각각 유식 세포측정 및 ELISA에 의해 자극 후 24시간 째에 측정하였다. Lck 억제를 위해서, 주르캣 세포를 P+I로 자극하기 전에 Lck 억제제 II(EMD 밀리포어) 100 ㎍/㎖과 함께 밤새 인큐베이션하였다.
유식 세포측정: 세포 표면 수용체 발현을 제조사의 권장에 따라 CD69(APC) 또는 CD45(PE) 항체(BD 바이오사이언시즈)로 측정하였다. 세포를 얼음상에서 1시간 동안 인큐베이션하고, PBS로 3회 세척하고, 2% 파라포름알데히드(폴리사이언시즈) 중에서 고정시켰다. 정제된 세포외 세포 소낭(EV)을 항-CD63 엑소-플로우 염색 키트(시스템스 바이오사이언시즈) 또는 CFSE 염료(5 μM)로 37 ℃에서 15분 동안 염색하였다. EV를 PBS 중에서 4회 세척하고 아미콘(Amicon) 100K 필터 유닛(밀리포어)을 사용하여 농축시켰다. 데이터를, 보정을 위해 단일 염색된 콤프비즈(CompBeads)(BD 바이오사이언시즈)를 사용하여 BD LSR II 유식 세포계상에서 획득하였다. 적어도 10,000건의 전체 사건을 각 연구에서 수집하고 플로우조(FlowJo) 소프트웨어 프로그램(트리 스타 인코포레이티드(Tree Star Inc.))을 데이터 분석에 사용하였다. 모든 유식 세포측정 연구를 적어도 3회 반복하여 일관된 결과를 얻었다.
HCV PCR . 밤새 인큐베이션 후, PBMC를 1분 동안 트립신 중에서 인큐베이션하고 RPMI로 2회 세척하였다. 전체 RNA를 단리하고(RNeasy 키트, 퀴아겐(Qiagen)) cDNA를 HCV 5' UTR 특이성 프라이머 또는 랜덤 헥사머로 제조하였다. 첫 번째 라운드 RT-PCR에 대해서, 외부 프라이머는 센스 5'CTCCACCCAATGAATCACTCCC (서열번호 29) 및 안티센스 5'GAGGTTTAGGATTCGTGCTC (서열번호 30)이었다. 이중(nested) PCR에 대해서, 프라이머는 센스 5'CGTTAGTATGAGTGTCGTGC (서열번호 31) 및 안티센스 5'GATGCACGGTCTACGAGACC (서열번호 32)이었다. 최종 생성물 크기는 250 bp였다. 사용된 GAPDH 프라이머는 센스 5'ATCCCATCACCATCTTCCAG (서열번호 33) 및 안티센스 5'CCATCACGCCACAGTTTCC (서열번호 34)이었고, 383 bp의 생성물 크기를 생성시킨다.
HCV E2 유래된 작은 RNA를 하기와 같이 확인하였으며, HCV E2를 발현하는 주르캣 세포로부터 전체 RNA를 단리하였다(RNeasy 키트, 퀴아겐). RNA를 제조사의 프로토콜에 따라 T4 RNA 리가제 2(뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))를 사용하여 예비-아데닐화된 DNA 범용 miRNA 클로닝 링커(뉴잉글랜드 바이오랩스)에 결찰시켰다. 결찰된 RNA를 RNA 컬럼(퀴아겐)을 사용하여 정제시키고 cDNA를 DNA 링커 프라이머 (5'- ATTGATGGTGCCTACAG-3' (서열번호 35))를 사용하여 전사시켰다. PCR을 HCV E2 프라이머 (5'-TCCTGATACCACTTACCTCAA-3' (서열번호 36)) 및 DNA 링커 프라이머를 사용하여 수행하였다. PCR 산물을 TA 클로닝 벡터(인비트로젠(Invitrogen))에 클로닝하고 DNA 서열을 플라스미드의 서열분석(아이오와 대학 DNA 코어 설비)에 의해 획득하였다.
ELISA 및 면역블럿 분석. 세포 배양 상등액내로 방출된 IL-2 사이토킨을 제조사의 설명에 따라 인간 IL-2 ELISA 키트(BD 바이오사이언시즈)를 사용하여 정량분석하였다. 주르캣 세포를 세포 용해 완충제(셀 시그널링(Cell Signaling))의 첨가 전에 지시된 시간 동안 항-CD3(5 ㎍/㎖)로 자극하였다. 15분 동안 PMA/이오노마이신 자극에 이어서, 핵 단백질을 핵 단백질 단리 키트(NEPER, 써모 사이언티픽)를 사용하여 제조사의 설명에 따라 단리하였다. 단백질들을 폴리아크릴아미드 젤 전기영동에 의해 분리시키고 니트로셀룰로스 멤브레인(BIORAD)으로 옮겼다. 멤브레인을 실온에서 1시간 동안 단백질-없는 차단 완충제(blocking buffer)(써모 사이언티픽) 중에서 인큐베이션한 다음 1차 항체와 인큐베이션하였다. 단백질을 코닥 이미저(Kodak Imager)를 사용하여 애머샴(Amersham) ECL(GE 헬쓰케어)로 검출하였다. 사용된 1차 항체들은 하기와 같았다: NFAT 및 pLAT(Y226; BD 바이오사이언시즈); 전체 LAT (바이오레전드(Biolegend)); pZAP70 (Y319); 전체 ZAP70; pLck (Y394/ pSrcY416); 전체 Lck (Y394); Csk; YY1 (모두 셀 시그널링 테크놀로지로부터); PTPRE (오리진(Origene), 클론 4B2). 면역블럿들을 이미지제이(ImageJ)에 의해 정량분석하였다.
시험관내 키나제 분석. Lck에 의한 HCV E2 단백질의 인산화를, 제조사에 의해 권장된 바와 같이 재조합 E2 단백질(e엔자임)을 인간 Lck(R&D 시스템스) 및 CD45(엔조 라이프 사이언시즈(Enzo Life Sciences))와 함께 또는 이들 없이 인큐베이션함으로써 측정하였다. 샘플을 상술한 바와 같이 면역블럿 분석하였다. 인산화를 포스포티로신 항체(인비트로젠)로 면역블럿 분석에 의해 측정하고 HCV E2 단백질을 상술한 항-HCV E2 인간 단클론 항체를 사용하여 확인하였다.
면역침전. C-말단 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그를 갖는 HCV E2(HCV 폴리단백질의 aa 384-715)를 안정하게 발현하는 주르캣 세포를 15분 동안 10 ㎍/㎖의 항-CD3으로 자극하고 용해시켰다(25 mM 트리스, 150 mM NaCl, 5% 글리세롤, 1 mM EDTA, 1% NP40; 얼음상에서 1시간). 세포 용해물을 항-HA 아가로스 비드(써모 사이언티픽) 또는 단백질 G 비드에 접합된 NFAT 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 비드를 펠릿화하고 용해 완충제 중에서 3회 세척하였다. 결합된 단백질을 면역블럿 분석 전에 2x 램리(LaemmLi) 샘플 완충제 중에서 용출시켰다.
통계: 통계를 그래프패드 소프트웨어 V4.0(그래프패드 소프트웨어 인코포레이티드)을 사용하여 수행하였다. 양측 스튜던츠 t 검정을 사용하여 시험과 대조군 간의 결과를 비교하였다. 0.05 미만의 P 값을 통계학적 유의수준으로 간주하였다.
윤리학 진술: 본 연구는 아이오와 임상연구심의위원회에 의해 승인되었다. 모든 피험자(건강한 공여자 및 바이러스 감염된 피험자)는 서면 동의서를 제출하였다.
실시예 2 - 결과
HCV 입자는 1차 인간 T 세포에서 TCR 신호전달을 억제한다. HCV-감염된 피험자(유전자형 1, 1a, 1b, 2, 2b 및 3; RNA 농도 범위 1 x 105 내지 1 x 106 RNA 게놈 당량[GE]/㎖)로부터의 혈청 또는 HCV 감염되지 않은 대조용을 건강한 혈액 공여자로부터 수득한 PBMC와 인큐베이션하였다. 항-CD3/CD28에 의한 TCR 자극에 이어서, 배양 상등액내로의 IL-2 방출을 측정하거나 또는 상기 1차 CD4+ 및 CD8+ T 림프구상의 CD69 발현을 측정함으로써 신호전달을 정량분석하였다. 모든 HCV RNA 양성 혈청은 IL-2 방출(도 1A) 및 CD69 표면 발현(도 1B)을 HCV-감염되지 않은 대조군에 비해 용량-의존적인 방식으로(도 1C) 억제하였다. 정제된 T 세포(>99% 순수, 도 10)의 시험은 HCV RNA 양성 혈청이 IL-2 방출에 의해 측정된 바와 같이 다른 세포 유형의 부재하에서 T 세포 활성화를 억제함을 입증하였다(도 1D).
TCR 신호전달을 방해할 수 있는 혈청 인자를 제거하기 위해서, 혈청 세포외 소낭(EV)을 상업적인 시약(엑소퀵(Exoquick), 시스템스 바이오사이언시즈)을 사용하여 제조하였다. 상기 정제 방법은 인간 혈청으로부터의 엑소솜과 일치하는 충분히 특성화된 EV를 제공한다(Fabbri et al., 2012). 엑소솜은 HCV 외막 단백질, HCV RNA를 함유하고 시험관내에서 HCV 감염을 옮기는 것으로 보고된다(Ramakrishnaiah et al ., 2013; Cosset and Dreux, 2014; Masciopinto et al ., 2004; Bukong et al ., 2014 and Dreux et al ., 2012). 정제된 HCV RNA-함유 EV는 CD63 및 CD81을 함유하였지만 CD69 및 CD25는 함유하지 않았으며(도 11A), 이는 식작용 공급원(endocytic source)의 기원을 지지한다. PBMC와 HCV-감염된 개인으로부터의 EV와의 배양은 HCV-음성 대조용 EV에 비해 IL-2 방출 및 CD69 발현을 억제하였다(각각 도 2A-B). 상기 제조 방법은 엑소솜의 특징을 갖는 EV를 제공하지만, 일부 바이러스 입자가 상기 제조에 포함될 가능성을 배제할 수는 없다.
EV와 림프구와의 상호작용을 추가로 조사하기 위해서, HCV 감염되거나 감염되지 않은 피험자로부터의 혈청을 37 ℃ 또는 4 ℃에서 정제된 T 세포와 인큐베이션하였다. 2시간 인큐베이션 및 세척(실온에서)에 이어서, 세포를 항-CD3/CD28로 자극하였다. HCV 양성 혈청은 4 ℃는 아닌 37 ℃에서 TCR 신호전달을 현저하게 억제하였다(도 2C). 상기 억제의 정도는 추정상 초기의 연구에 비해 단축된 인큐베이션으로 인해 더 적었다. EV와 세포와의 융합을 평가하기 위해서, HCV 양성 또는 음성 피험자로부터의 혈청 EV를 1차 인간 PBMC와 인큐베이션 전에 카복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르(CFSE)로 표지하였다(도 2D). EV는 CFSE를 밤새 인큐베이션 동안 CD4+ 및 CD8+ T 세포 모두에 전달하였다(도 2E). CFSE는 세포-침투성 염료이고 미량의 CFSE는 양의 결과를 도출할 수 있었기 때문에, 세포를 또한 최종 세척 완충제(EV 세척) 중에서 인큐베이션하였으며 이들 세포에서 CFSE는 검출되지 않았다(도 2E). 더욱이, HCV RNA는 동일한 인큐베이션 동안 EV에서 PBMC로 이동되었다(도 2F). 따라서 혈청-유래된 HCV 입자는 바이러스 RNA와 융합되고 T 세포로 이동되었다. 혈청이 시험관내에서 바이러스 또는 EV의 T 세포 흡수를 매개할 가능성을 배제하기 위해서, HCV RNA를 상술한 바와 같이 PBMC(>97% 순수)로부터 정제된 T 세포로부터 증폭시켰다. HCV RNA는 HCV-감염된 피험자로부터 수득된 PBMC 및 정제된 T 세포 모두에 존재한 반면, 바이러스 RNA는 HCV-감염되지 않은 피험자에서 검출되지 않았다(도 11B).
이어서, 간세포 세포주(Huh7.5 세포)에서 생성된 감염성 HCV 입자를 TCR 자극 전에 PBMC와 인큐베이션하였다. 혈청-유래된 EV와 유사하게, 세포 배양 감염성 HCV 입자(HCVcc)는 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 TCR 신호전달을 억제하였다(도 3A-B). 바이러스 복제는, HCV E1 및 E2를 갖는 위형의 복제 결함 레트로바이러스 입자(HCVpp)가 또한 외막이 없는 레트로바이러스 입자(GAGpp; 도 3C-D)에 비해 용량-의존적인 방식으로 TCR 신호전달을 억제하였기 때문에, 요구되지 않았다. HCVcc 및 HCVpp는 또한 정제된 CD3+ T 세포(>99% 순수, 도 12)에서 TCR 신호전달을 억제하였으며, 따라서 HCV 입자에 의한 TCR 신호전달 억제의 기전은 다른 면역 세포의 존재를 필요로 하지 않는다.
요약하면, 1차 인간 PBMC와 i) HCV-감염된 개인으로부터의 혈청, ii) HCV RNA 및 CD63/CD81 함유 혈청-유래된 EV, iii) HCVcc 및 iv) HCVpp와의 인큐베이션은 대조용에 비해 1차 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 TCR-매개된 활성화를 감소시켰다.
HCV E2 암호화 RNA는 근위 TCR 신호전달 경로를 억제한다. HCVpp 입자는 필수적으로 오직 HCV E1 및 E2만을 함유하기 때문에, 주요 HCV 외막 당단백질(E2)을 상기 TCR을 통해 T 세포 활성화를 억제하는 그의 능력에 대해 조사하였다. HCV는 림프구에서 복제된다 하더라도 잘 복제되지 않기 때문에, HCV E2 단백질을 안정하게 발현하는 주르캣(CD4+) T 세포주(도 13A)를 생성시켰다. 전장 E2(aa 384-747)를 발현하는 세포에서, 단지 GFP만을 발현하는 대조용 주르캣 세포에 비해, IL-2 방출(도 4A) 또는 표면 CD69 증가(도 13B)에 의해 측정되는 바와 같은 현저하게 적은 TCR-매개된 활성화가 관찰되었다. 상기 TCR 신호전달 캐스케이드에서 가장 근위의 키나제는 림프구-특이성 단백질 티로신 키나제(Lck)이다(Davis and van der Merwe, 2011). 불활성 Lck는 c-src 티로신 키나제(Csk)에 의해 티로신 505(Y505)에서 인산화된다. TCR 진입에 이어서, Y505는 CD45를 포함한 다수의 티로신 포스파타제에 의해 탈인산화되어, 입체형태적 변화 및 후속으로 티로신 394(Y394)에서 자동-트랜스-인산화를 생성시킨다. 인산화된 Lck(Y394)는 후속의 하류 신호전달에 사용되는 활성 키나제이다.
TCR 신호전달에 이어서, Lck 인산화(Y394)는 대조용에 비해 HCV E2 단백질을 발현하는 주르캣 세포에서 감소되었다(도 13B). 제타-쇄-결합된 단백질 키나제(ZAP)-70 및 T 세포의 활성화를 위한 링커(LAT) 모두의 활성화에 활성화된 Lck가 필요하다. 감소된 Lck 활성화와 일관되게, ZAP-70 및 LAT 인산화가 대조용에 비해 HCV E2 발현 세포에서 감소되었다(도 4C-D). 상기 억제는 감소된 CD45 및 Csk 발현 수준에 기인하지 않았는데, 그 이유는 이들 수준이 HCV E2 발현 세포 및 대조용 세포에서 유사하였기 때문이다(각각 도 14A 및 14B).
TCR 신호전달의 억제에 필요한 HCV E2 영역(들)을 특성화하기 위해서, 절두된 E2 단백질을 발현하는 일련의 주르캣 세포주를 생성시켰다(도 13C). 개별 세포주들에서 HCV E2 발현은 필적할만 하였다(도 15A). TCR 자극에 이은 IL-2 방출은 aa 603 내지 619를 함유하는 E2 단편을 발현하는 모든 세포주에서 감소되었다(도 4E). 대조적으로, IL-2 방출은 상기 영역을 함유하지 않는 HCV E2 단백질을 발현하는 세포에서 억제되지 않았다.
키나제-특이성 인산화 기질 예측 모델을 사용하여, HCV E2 aa 613에서 티로신(Y613)은 Src/Lck 기질인 것으로 예측되었다(도 13C)(Xue et al., 2008). 상기 영역(aa 603-619)은 고도로 보존되며 Y613은 모든 HCV 유전자형(www.hcv.lan1.gov)을 나타내는 600개 초과의 단리물에서 보존된다. 선행의 연구들은 관련된 인간 페기바이러스(HPgV)에서 보존된 티로신이 TCR-신호전달 억제에 필요하고 상기 잔기의 돌연변이는 TCR 신호전달을 복원시킴을 발견하였다(Bhattarai et al., 2013). 따라서, HCV E2 Y613은 상기 펩티드(HCV aa 603-619)와 관련하여 알라닌(Y613A)으로, 또는 절두된 C-말단 막관통 도메인을 갖는 E2 단백질과 관련하여 알라닌 또는 페닐알라닌(Y613A, Y613F)으로 돌연변이되었다(도 13D, 15A-B). Y613 돌연변이는 TCR 자극에 이어서 TCR 신호전달을 복원하지 않았다(도 4E).
E2 단백질이 TCR 억제에 필요한지를 결정하기 위해서, 프레임-이동 돌연변이를 갖는 HCV E2 RNA 암호화 서열을 발현하는 주르캣 세포주를 생성시켰다. 상기 세포주는 HCV E2 RNA를 발현하였지만, E2 단백질은 발현하지 않았다(도 15A-B). 놀랍게도, HCV E2 RNA 발현은 TCR 신호전달을 억제하기에 충분하였다(도 5A-B). 따라서, aa 603-619를 암호화하는 E2 RNA가 TCR 진입에 의해 매개되는 T 세포 활성화의 억제에 필요하고 충분하였다.
HCV는 E2 aa 603-619를 암호화하는 서열들(www.hcv.lan1.gov)을 포함하여, 단리물들 가운데 상당한 서열 다양성을 갖는다. aa 603-619를 암호화하는 RNA에서 13 nt 차이를 함유하는 상이한 HCV 단리물(유전자형 3; GT-3)로부터의 HCV E2 RNA 및 단백질 발현을 조사하였다(도 5C). GT-2a처럼, GT-3 E2 RNA는 TCR-매개된 IL-2 방출을 억제하였다(도 5A). 일부 서열 다양성에도 불구하고, 4개의 시토신 잔기가 모든 유전자형을 나타내는 600개 초과의 HCV 단리물에서 보존된다(도 5C). 아데노신으로 돌연변이된 시토신 잔기를 갖는 HCV E2 RNA를 발현하는 주르캣 세포를 생성시켰으며(도 5C), IL-2 방출 및 항-CD3/CD28에 따른 Lck의 인산화에 의해 측정된 바와 같은 TCR 신호전달이 상기 돌연변이를 발현하는 세포에서 복원되었다(도 5A-B).
생물정보학 분석은 HCV E2 603-619 암호화 RNA 서열 내의 보존된 뉴클레오티드가 다이서, 마이크로RNA(miRNA) 경로에 관련된 세포질 엔도리보뉴클레아제에 의해 가공되는 RNA 구조를 생성시킬 것을 필요로 함을 예측하였다(도 16)(Ahmed et al., 2013). TCR 신호전달을 구제하는(rescued) 상기 보존된 시토신의 돌연변이는 다이서 기질로 폴딩되지 않은 RNA 구조를 생성시켰다(도 16). 선행 연구는 다이서를 포함한 HCV RNA와 miRNA 경로간의 상호작용을 확인하였으며(Shimakami et al ., 2012 and Randall et al., 2007) 상기 E2 암호화 영역으로부터의 RNA를 포함하여, HCV 바이러스-유래된, 작은 RNA(vd-sRNA)가 HCV 감염된 세포에서 발견된다(Parameswaran et al., 2010). vd-sRNA가 E2 발현 세포 중에 존재하는지를 측정하기 위해서, 전체 세포 RNA를 상기 방법에 기재된 바와 같이 작은, E2 유래된 RNA의 존재에 대해 분석하였다. 상기 세포 중에 존재하는 RNA 종의 증폭 및 서열 분석에 이어서, HCV E2 aa 590-621을 암호화하는 T 세포 억제 NRA 영역을 함유하는 vd-sRNA를 확인하였다(도 5D). 따라서, 전장 HCV E2 RNA는 상기 세포에서 TCR 억제성 vd-sRNA로 가공되었다.
vd-sRNA가 TCR 신호전달을 억제하는 기전을 이해하기 위해서, 추가적인 분석을 수행하여 상기 vd-sRNA 서열에 대한 잠재적인 표적들을 확인하였다. vd-sRNA에 상보성인 2개의 보존된 부위가 단백질 티로신 포스파타제 E 유형(PTPRE; 도 6A)의 3' 번역되지 않은 영역(UTR)내에서 발견되었다. PTPRE는 Src과 키나제를 조절하며, 이중에 Lck가 일원이다(Lewis et al., 2005; Roskoski, 2005; Gil-Henn and Elson, 2003; Granot-Attas et al ., 2009 and Toledano-Katchalski and Elson, 1999). PTPRE mRNA 발현 수준은 대조용 및 HCV E2 RNA 발현 세포에서 유사하였으나(도 17); E2 RNA를 발현하는 주르캣 세포는 대조용에 비해 현저하게 감소된 PTPRE 단백질 수준을 가졌다(도 15B). 상부 밴드는 막관통 도메인(동형 1)과 함께 전장 PTPRE를 나타내고 하부 밴드는 세포질 PTPRE(동형 2)를 나타낸다(도 15B). 상기 예측된 다이서 기질을 제거하기 위한 E2 RNA 중의 보존된 뉴클레오티드의 돌연변이는 PTPRE 단백질 발현(도 6B) 및 TCR 신호전달(도 5A-B)을 복원시켰다. PTPRE 단백질 수준은 또한 모 Huh 세포 또는 단지 비구조 단백질(NS)을 발현하는 HCV 레플리콘을 함유하는 Huh7에 비해 레플리콘 중에 전장 HCV RNA(FL)를 함유하는 인간 간종양(Huh) 세포에서 감소되었다(도 6B).
PTPRE 녹다운을 위한 특이성 및 HCV E2 암호화 RNA 요건을 측정하기 위해서, 상기 PTPRE 3'UTR 서열을 발현 플라스미드 중의 GFP의 3'UTR내에 삽입하였다. 293T 세포에서 GFP 발현은 PTPRE 3'UTR이 없는 GFP에 비해 HCV E2 암호화 플라스미드의 동시-형질감염에 의해 감소되었다(도 6C). 더욱 또한, HCV RNA 함유 혈청에서 293T 세포의 인큐베이션은 대조용(HCV RNA 음성) 혈청에서 인큐베이션된 세포에 비해 감소된 GFP 발현을 도출하였다(도 6D). 따라서, 외막 E2를 암호화하는 HCV RNA는 PTPRE를 직접 표적화하고 그의 발현을 억제한다.
세포 유전자를 표적화하기 위한 HCV E2 RNA의 특이성을 추가로 조사하기 위해서, PTPRE에 대해 예측된 시드 서열을 주르캣 세포에서 발현된 세포 유전자를 표적화하는 서열(CXCR4)로 치환시켰다(도 6E). 주르캣 세포주는 앞서와 같이 제조되었으며, CXCR4 발현을 조사하였다. PTPRE 표적화 서열의 CXCR4에 의한 치환은 CXCR4 발현을 현저하게 감소시켰다(도 6F).
함께, 이들 데이터는 시험관내에서 발현된 HCV E2 RNA가 인간 간세포(Huh 7) 및 T(주르캣) 세포에서 PTPRE 발현을 억제하는 짧은 RNA로 가공되며 TCR-매개된 Src(Lck) 신호전달을 억제함을 설명한다. 293 세포에의 HCV RNA-함유 혈청의 첨가가 또한 PTPRE 발현을 억제하며, 따라서 상기 효과는 생물학적으로 매우 관련이 있는 듯하다.
함께, 상기 데이터는 시험관내에서 발현된 HCV E2 RNA가 인간 간세포(Huh 7) 및 T(주르캣) 세포에서 PTPRE 발현을 억제하는 짧은 RNA로 가공되며 TCR-매개된 Src(Lck) 신호전달을 억제함을 설명한다. 293 세포에의 HCV RNA-함유 혈청의 첨가가 또한 PTPRE 발현을 억제하며, 따라서 상기 효과는 생물학적으로 매우 관련이 있는 듯하다.
HCV E2 단백질은 원위 TCR 신호전달을 억제한다. T 세포 활성화를 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트(PMA) 및 이오노마이신(P+I)을 사용하여 TCR의 하류를 자극함으로써 시험관내에서 개시시킬 수 있다. HCV E2 RNA가 근위 및 원위 TCR-매개된 신호전달을 억제하는지를 측정하기 위해서, 주르캣 세포를 P+I로 자극하였으며, 단지 HCV RNA만을 발현하는 세포는 원위 신호전달을 억제하지 않았다(도 7A). 따라서, 상기 바이러스 RNA는 근위 신호전달 억제에 특이적이었다. 놀랍게도, (aa 384-747)과 함께 및 (aa 384-703) 막관통 도메인 없이 HCV E2 단백질 발현은 P+I 활성화에 따른 원위 신호전달을 억제하였다(도 7A). 억제는 P+I 자극이 HCV E2 RNA 또는 E2 단백질 발현 세포에서 CD69 발현을 억제하지 않았으므로, NFAT 경로에 특이적이었다(도 18A 및 19). 절두된 E2(384-609) 또는 (601-725)를 발현하는 주르캣 세포는 원위 신호전달을 억제하지 않았으므로(도 7A), 거의 전장 E2(384-703)가 필요하였다(도 7A). 상기 거의 완전-길이 단백질과 관련하여 상기 예측된 Lck 기질 부위의 돌연변이(Y613F, Y613A)는 P+I-매개된 IL-2 방출을 복원하였으므로 상기 보존된 E2 Y613이 또한 필요하였다(도 7A).
HCV E2 단백질의 Y613은 예측된 Lck 기질이며, 따라서 상기 잔기의 인산화를 시험하였다. 시험관내 재조합 HCV E2는 Lck에 의해 인산화되고 CD45에 의해 탈인산화되었으며(도 7B), 주르캣 세포에서 발현된 HCV E2는 TCR 자극에 이어서 인산화되었다(도 7C). 따라서, 상기 Y613A 돌연변이체는 TCR 진입에 이어서 인산화되지 않았기 때문에 HCV E2는 Lck 기질로서 작용하였고 인산화는 Y613에서 발생하였다(도 7C). NFAT 신호전달에서 HCV E2의 Lck 매개된 인산화의 역할을 평가하기 위해서, 주르캣 세포를 밤새 Lck 억제제로 처리하였다. P+I 매개된 IL-2 방출은 Lck 억제제로 처리된 HCV E2 발현 세포에서 구제되었으며, 이는 원위 TCR 신호전달을 억제하는데 Y613에서 HCV E2의 Lck-매개된 인산화가 필요함을 암시하였다(도 7D). 함께, 이들 데이터는 E2 매개된 원위 TCR 신호전달의 억제를 위한 HCV E2상의 보존된 티로신(Y613)의 인산화에서의 T 세포 특이성 키나제 Lck의 새로운 역할을 확인하였다.
포스포-HCV E2가 P+I 유도된 IL-2 방출을 억제하는 기전을 측정하기 위해서, IL-2 mRNA 전사에 필요한 전사 인자인 활성화된 T 세포의 핵 인자(NFAT)의 활성화 및 핵 전좌를 평가하였다. P+I 자극시, NFAT는 대조용 및 HCV E2 단백질 발현 주르캣 세포에서 유사하게 활성화되었다(탈인산화되었다)(도 8A). 그러나, 활성 NFAT의 핵 전좌는 대조용 세포에서의 경우에 비해 HCV E2-발현 세포에서 감소되었다(도 8B). E2 단백질상의 Y613은 Lck에 의해 인산화되었고 포스포-HCV E2는 NFAT의 감소된 핵 전좌에 필요하였기 때문에, NFAT와 인산화된 HCV E2 단백질간의 상호작용을 평가하였다. HCV E2 단백질은, 자극되지 않거나 또는 TCR 자극된 주르캣 세포에서 NFAT를 침전시키지 않았다(도 10C). NFAT 핵 유입 및 유출은 다수의 세포 단백질 및 비-암호화 RNA, 예를 들어 임포틴-β, 튜불린-α, 칼시뉴린, 단백질 키나제 D2(PKD2), CSE1L 및 기타에 의해 조절된다(Sharma et al., 2011). E2 또는 포스포-E2와 지금까지 연구된 인자들과의 직접적인 상호작용은 면역 침전 연구에서 관찰되지 않았다(도 18C). 이들 데이터는 HCV E2가 Lck에 의해 Y613에서 인산화시 NFAT 핵 전좌를 억제하여 손상된 원위 TCR 신호전달을 생성시킴을 암시한다.
이어서, 1차 인간 T 세포에서 원위 TCR 신호전달에 대한 HCV 외막 입자의 영향을 평가하였다. P+I 자극에 이어서, 건강한 인간 PBMC로부터의 IL-2 방출이 혈청으로부터 획득된 HCV 입자(도 8C) 및 감염성 및 결함성 HCV 입자(각각 HCVcc 및 HCVpp)에 의해 억제되었다(도 8D). Y613의 페닐알라닌으로의 돌연변이(Y613F)는 주르캣 세포에서 원위 TCR 신호전달의 HCV E2-매개된 억제를 역전시켰기 때문에(도 7A), 레트로바이러스 입자는 고유 E1-E2 또는 Y613F 돌연변이(HCVpp Y613F)를 갖는 E1-E2에 의해 위형분류되었다. IL-2 방출은 건강한 PBMC의 P+I 자극에 이어서 Y613F 돌연변이체와 함께 인큐베이션된 세포에서 복원되었다(도 8D). 함께, 이들 데이터는 원위 TCR 신호전달의 억제에 필수적인 HCV 외막 단백질상의 단일 잔기(Y613)를 확인한다.
종합해보면, 이들 데이터는 HCV RNA-함유 혈청, HCVcc, HCVpp, HCV E2 단백질(그러나 HCV E2 RNA는 아니다)은 1차 인간 T 세포 및 CD4+ 인간 T 세포주에서 원위 TCR 신호전달을 억제함을 입증한다. 상기 억제는 HCV E2 단백질의 Y613의 Lck 인산화를 요하며, HCVpp는 원위 신호전달을 억제하므로 바이러스 복제를 요하지 않는다.
황열 바이러스( YFV ) RNA 및 외막 단백질은 T 세포 신호전달을 억제한다. 상기 HCV 및 GBV-C 연구에 대한 주요 문제점은, 어떠한 바이러스도 시험관내에서 충분히 복제되지 않으며 HCV가 생체내에서 림프구 중에서 발견되기는 하지만 림프구에서 광범위하게 복제되지는 않는다는 것이다. 우리는 앞서 YFV(17D)의 백신 균주 및 이하선염(Jeryl Lyn) 균주가 시험관내에서 PBMC 및 CD3+(T) 세포에서 복제됨을 보였다(Xiang et al., 2009; Mohr et al., 2008). 생물정보학 분석은 상기 두 바이러스가 모두 Lck에 대한 기질로서 작용하는 것으로 예측되는 모티프를 보존함을 나타내었다(Xue et al, 2011). Lck와의 잠재적인 상호작용을 조사하기 위해서, 우리는 먼저 Lck의 존재 및 부재하에서 주르캣 세포에서 YFV 및 이하선염의 복제를 연구하였다. YFV는 Lck의 존재하에서 바이러스를 적게 생산한 반면, 이하선염은 Lck 함유 세포에서 보다 높은 수준으로 복제되었다(도 21A-B). YFV에 앞서 항-CD3으로 TCR을 자극하면 Lck를 발현하는 세포에서 복제가 감소하였으며(도 1C), YFV 감염 후 항-CD3 활성화는 추가적인 복제를 차단하였다(도 21D). 상기 과정은, Lck 억제제 또는 siRNA에 의한 Lck 억제가 TCR-자극된 1차 인간 세포에서 YFV 복제를 현저하게 증가시켰기 때문에, Lck 활성에 따라 변하였다(도 22).
항-CD3 활성화 전에 1차 인간 CD3+(T) 세포의 YFV 감염은 IL-2 방출에 의해 측정된 바와 같이 TCR-신호전달을 감소시켰다(도 23). 중요하게, 측정 가능한 감염성이 없는 UV-불활성화된 YFV도 또한 상기 분석에서 TCR 신호전달을 억제하였기 때문에(그러나 보다 적은 정도로), 복제는 상기 TCR 억제 효과에 요구되지 않았다(도 23). 감염성 TFV 클론이 획득되었으며, 상기 외막 암호화 영역을 상기 tet-오프 발현 시스템에서 증폭시키고 발현시켰다. HCV처럼, Lck 기질로서 작용하는 것으로 예측된 2개의 보존된 티로신 Y274 및 Y375가 존재한다(도 24). Y274는 억제에 요구되었다. HCV처럼, YFV는 근위(TCR-매개된) 및 원위 TCR(P+I 유도된) 신호전달을 모두 억제하였다. 따라서, 우리는 프레임이동 구조물을 제조하였으며 HCV처럼, env-암호화 RNA가 근위 신호전달을 억제함을 발견하였다(도 24). 중요하게, RNA 암호화 영역(Y274F 돌연변이체 중의) 중의 단일 뉴클레오티드의 돌연변이는 근위 신호전달을 복원하지 않았지만, 2개의 잔기(Y274A 돌연변이체 중의)의 돌연변이는 그렇게 하였다(도 24). 놀랍게도, Y274에서 암호화 서열의 분석은 HCV env(PTPRE)에 의해 조절되는 동일한 포스파타제와의 상동성을 나타낸다. 이들 데이터는 매우 새로운 것이며, 감염된 세포에서 바이러스-유래된 짧은 RNA의 존재를 확인하는 중에 있다.
마우스를 YFV 또는 이하선염 바이러스로 IP 면역시켰다. 초기 연구는 Balb/C 마우스에서 있었으나; 연구를 C57/블랙 6 마우스에서 반복하였으며 유사한 결과를 얻었다. 나타낸 모든 데이터는 블랙 6 마우스에서였다. 스톡 바이러스(Stock virus)를 모두 베로 세포(Vero cell)에서 생성시켰다. 모의 감염된 베로 세포 배양 상등액으로 면역시킴으로써 실험을 조절하였다. 또한, UV-불활성화된 YFV 및 이하선염 바이러스를 시험하였다. 상이한 접종물의 바이러스 역가(불활성화 전) 및 단백질 농도를 표준화하였다. YFV에 의한 IP 면역에 이어서, 비장세포의 TCR-활성화를 18일 동안 길이로 측정하였으며, TCR 신호전달은 4일까지 감소하고, 10 내지 12일째에 최저점에 도달하고, 이어서 18일까지 증가하는 것(기준선까지는 아니지만)으로 밝혀졌다. 후속으로, YFV 면역 후에 오브알부민(알룸 중의)을 투여하고, 7일 후에 제2 용량의 알룸 중 ova를 제공하였다. 동물을 상기 추가 제공 후 7일째에 죽이고, 비장세포 및 배액 림프절을 면역 반응에 대해 검사하였다. YFV로 면역된 마우스는 세포 배양 대조용에 비해 IL-2, IFN-γ, 및 ova-특이성 항체가 현저하게 감소하였다(도 5-6). 이들 연구는 2회 반복되었으며, 모든 연구에서 상기 효과는 재현가능하였다. 임의의 바이러스 제제에 의한 면역이 전체적으로 손상된 면역 반응을 도출할 수도 있다는 우려와, 이하선염 바이러스가 시험관내 시스템에서 활성화를 증대시킨다는 사실로 인해, 마우스를 이하선염 백신 균주(Jeryl Lynn; 복제 가능(replication competent) 및 UV-불활성화됨)로 면역시켰다. 상기 첫 번째 연구는 각 그룹에서 3마리의 마우스를 면역시켰으며, 사이토킨 수준이 생체외에서 ova 자극에 이어 증가하였다(도 6에서 나타낸 IFN-γ 및 IL-2; IL-4, IL-13).
이들 데이터는 다수의 바이러스로부터의 바이러스 외막 암호화 RNA 및 env 단백질들이 TCR 신호전달을 방해하며, 이는 잠재적으로 env-특이성 면역 반응을 지연 또는 감소시키고 복제를 촉진함을 가리킨다. HCV 및 YFV는 상기 표현형을 공유하지만, 상이한 기전들이 상이한 바이러스들에 의해 사용되는 것으로 보인다. 도 7은 시험된 상이한 바이러스 단백질 또는 RNA 및 이들이 어디에서 TCR 신호전달을 억제하는 지를 나타내는 데이터를 요약한다. 인플루엔자 HA 및 HIV gp120이 또한 TCR 신호전달을 방해하는 것으로 보고되었지만, 이들 상호작용의 기전은 연구되지 않고 있다.
실시예 3 - 논의
HCV는 복잡하고 불완전하게 이해된 기전을 통해 지속적인 감염을 확립한다. 강한 T 세포 반응은 HCV 감염의 유효한 조절 및 클리어런스와 상관이 있으나; 상기 감염된 개인은 대부분 바이러스혈증을 깨끗이하지 못한다(Rehermann, 2009). 만성적인 감염은 HCV-특이성 간내 및 말초 혈액 T 세포의 감소와 관련되며, 이는 HCV 단백질, RNA 또는 이 둘 모두가 T 세포 기능을 억제함을 암시한다. 여기에서 발명자들
본 명세서에 개시된 바와 같이, HCV 입자는 T 세포 수용체(TCR) 신호전달 경로의 억제를 통해 T 세포 활성화를 직접 감소시켰다. 혈청, HCV-감염된 개인으로부터의 HCV RNA-함유 EV 및 HCVcc는 인간 T 세포에서 TCR 신호전달을 억제하였다. TCR 신호전달의 억제는, 복제 불능 HCVpp가 TCR 신호전달을 억제하였으므로 복제를 요하지 않았다. HCV 양성 혈청에 의한 TCR 신호전달의 상대적인 억제는 세포 배양물 유래된 HCVcc 또는 HCVpp보다 더 강하였다. 이는, HCV 양성 혈청이 HCVcc, 정제된 EV 및 HCVpp 중에 존재하지 않는 TCR 억제성 사이토킨(IL-10, TGF-β)을 함유하므로 놀랍지 않다(Nelson et al., 1997 and Reiser et al., 1997). 그럼에도 불구하고, 상기 혈청 인자의 부재하에서 HCVcc, HCV 양성 EV 및 HCVpp는 또한 PBMC 및 정제된 T 세포에서 TCR 신호전달을 억제하였으며, 따라서 바이러스 E2 단백질 및 RNA는 TCR 신호전달을 변경시키기에 충분하였다.
E2 및 E2 단백질 자체를 암호화하는 HCV RNA는 상기 TCR 신호전달 경로내의 2개의 별도의 부위에서 TCR 신호전달을 독립적으로 억제하였다. HCV E2 RNA는 Lck의 활성화를 감소시킴으로써 근위 TCR 신호전달을 억제하였으며, 억제는 상기 보존된 E2 Y613에 인접한 고도로 보존된 뉴클레오티드 서열을 요하였다. 상기 RNA 영역은 다이서에 의해 vd-sRNA로 가공된 구조로부터 보존된 잔기를 함유한다. 상기 보존된 잔기 중 4개의 돌연변이는 상기 예측된 RNA 2차 구조를 없애고 TCR 신호전달을 복원시켰다. 상기 vd-sRNA 서열에서 보존된 서열들은 Src 키나제 신호전달에 관련된 포스파타제인 PTPRE를 표적화하는 것으로 예측되었다.
PTPRE 번역은 HCV E2 RNA를 발현하는 림프구 세포 및 HCV 전장 게놈을 발현하는 간세포에서 현저하게 감소되었다. PTPRE는 Grb2를 통해 Src 신호전달을 조절하고(Toledano-Katchalski and Elson, 1999), Grb2 결핍 세포는 Lck 활성화를 손상시켰으며(Jang et al., 2010), 이는 HCV-유래된, 짧은 RNA가 PTPRE 번역을 방해하여 감소된 TCR 신호전달에 이르게 함을 암시한다. 간세포에서 HCV 복제는 Src 키나제의 억제에 의해 증대되며(Supekova et al., 2008), 따라서 상기 HCV-유래된 짧은 RNA에 의해 Src 키나제를 조절하는 간세포 PTPRE의 녹다운은 또한 림프구에서 T 세포 신호전달을 방해하는 것 이외에 간세포에서 바이러스 복제를 촉진할 수 있다. 293 세포에의 HCV RNA-함유 혈청의 첨가는 HCV RNA 음성 혈청에 비해 GFP에 첨가시 TPTRE 서열을 표적화하였으며, 이는 상기 관찰의 생물학적 관련성을 예시한다.
PTPRE 활성의 ELISA 기반 분석을 사용하여, 범용-포스파타제 억제제가 PTPRE를 효능 있게 억제함을 입증하였다(도 28).
TCR 신호전달의 억제의 두 번째 기전은 E2 단백질 인산화를 수반하였다. 본 명세서의 연구들에서 4줄의 증거는 Y613에서 HCV E2 단백질의 Lck-매개된 인산화에 대한 역할을 지지한다. 첫 번째, E2는 Lck에 의해 시험관내에서 인산화되었다. 두 번째, 주르캣 세포에서 발현된 고유 E2 단백질은 TCR 진입에 이어서 인산화되었으나, Y613A 돌연변이를 갖는 E2는 인산화되지 않았다. 세 번째, Lck 억제제는 P+I 활성화에 따른 NFAT 전좌에 대한 HCV E2 단백질-매개된 영향을 구제하였으며, 최종적으로, Y613의 알라닌 또는 페닐알라닌으로의 돌연변이는 원위 TCR 신호전달을 복원하였다. 인산화된 HCV E2는 NFAT 핵 전좌를 감소시킴으로써 원위 TCR 신호전달을 억제하였다. NFAT 핵 유입 및 유출은 다수의 세포 단백질 및 비-암호화 RNA에 의해 조절된다(Sharma et al., 2011). 포스포-E2는 이들 인자 중 어느 하나, 또는 인자들의 조합을 방해할 수 있으며, 이는 손상된 NFAT 핵 전좌를 생성시킨다.
함께, 상기 결과는 HCV E2 Y613이 Lck 기질로서 작용하였고, Y613의 Lck-매개된 인산화가 원위 TCR 신호전달 억제에 요구되었음을 가리킨다. 표적 T 세포로 전달된 바이러스 RNA 및 E2 단백질의 양이 E2를 발현하는 주르캣 세포에서의 양에 필적할 것 같지는 않지만, T 세포 활성화의 현저한 억제가, 효능 있는 TCR 작용물질(CD3/CD28 항체)에 의한 자극에 이어서 혈청, EV 또는 바이러스 입자(HCVcc 및 HCVpp)와 인큐베이션된 세포에서 측정되었다. 따라서 혈청 및 EV 중에 존재하는 소량의 E2 단백질 및 RNA는 TCR 활성화를 감소시키기에 충분하다. E1이 T 세포 활성화 억제에 영향을 미칠 수 있었지만, E2 단백질은 원위 TCR 신호전달을 억제하기에 충분하였으며, 상기 Y613 잔기의 돌연변이는 E2 단백질 발현(Y613A, Y613F) 또는 HCV 입자(HCVpp; Y613F)와 관련하여 TCR 신호전달을 복원하였다. HCV 입자 상호작용 및 TCR 신호전달의 E2 RNA 및 단백질 억제의 단계들을 예시하는 모델을 도 9에 나타낸다. 더욱 또한, HCV E2 RNA 및 단백질이 상기 신호전달 캐스케이드의 2개의 별도의 단계에서 TCR-매개된 활성화를 억제한다는 관찰은 HCV 감염 동안 TCR의 역할을 강조한다. 상기 관련된 RNA 및 아미노산 서열은 고도로 보존되며, 따라서 TCR 억제는 E2 RNA 및 단백질을 모두 발현하는 세포에서 상승적으로 억제된다.
HCV 감염 중에, 혈청 HCV RNA-함유 입자의 농도는 높다, 흔히 밀리리터당 1백만 초과의 사본수의 바이러스 RNA이다(Schijman et al ., 2004 and Matthews-Greer, 2001). 따라서 바이러스 RNA-함유 입자와 림프구 사이에 풍부한 상호작용이 존재한다. 비리온 외에, HCV RNA가 또한 세포외 소낭 중에 존재한다(Ramakrishnaiah et al ., 2013; Cosset and Dreux, 2014 and Dreux et al ., 2012). HCV, HPgV 또는 A형 간염 바이러스 RNA를 함유하는 세포외 소낭이 바이러스 RNA를 감염되지 않은 세포내로 전달하고 감염을 개시하는 것으로 보고되었다(Ramakrishnaiah et al ., 2013; Cosset and Dreux, 2014; Chivero et al ., 2014 and Feng et al ., 2013). TCR에 대한 HCV 혈청의 시험관내 효과는 효능 있고 용량-의존적인 것으로 보이지만(도 1C), HCV RNA 및 단백질의 억제 효과는, 림프구 중의 HCV RNA 및 단백질의 농도가 낮은 것으로 여겨지기 때문에, 생체내에서 완전하지 않다. 따라서, HCV 입자의 억제 효과는 심한 면역 결핍으로 되는 듯 하지는 않다. 그럼에도 불구하고, HCV 감염 중에 일반적인 면역 억제의 증거가 존재한다. HCV 감염된 피험자는 HBV와 같은 백신 항원에 대해 둔감한 면역 반응, 및 기관 이식 거부의 감소를 갖는다(Rehermann, 2013; Corell et al ., 1995; Moorman et al., 2011 and Shi et al ., 2014). HCV 입자에 의해 매개된 T 세포 활성화 및 IL-2 방출의 감소는 상기 관찰된 손상된 T 세포 증식, 분화 및 효과기 기능에 기여할 수 있으며(Rios-Olivares et al ., 2006 and Folgori et al ., 2006), 이는 급성 감염의 확립을 돕고 만성 감염에서 바이러스 지속성의 유지에 일조할 수 있다. 더욱 또한, 효율적인 T 세포 활성화는 백신 항원을 포함한 병원체에 대한 유효 면역 반응의 생성에 관련된다. HCV E2 RNA 및 단백질 내 TCR 억제 모티프의 돌연변이는 개선된 외막-기반 HCV 백신의 설계를 도출할 수 있다.
본 명세서에 개시되고 특허청구된 조성물 및 방법은 모두 본 명세에 비추어 과도한 실험 없이 제조되고 실행될 수 있다. 본 명세의 조성물 및 방법을 다양한 실시태양들에 관하여 기재하였지만, 본 명세의 개념, 진의 및 범위로부터 이탈됨 없이, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법 및 상기 방법의 단계들 또는 단계들의 순서에 변화를 적용할 수 있음은 당해 분야의 숙련가들에게 자명할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적으로 및 생리학적으로 모두 관련된 몇몇 작용제를, 동일하거나 유사한 결과를 성취하면서 본 명세서에 기재된 작용제 대신 사용할 수 있음은 자명할 것이다. 당해 분야의 숙련가들에게 자명한 모든 상기와 같은 유사한 치환 및 변형은 첨부된 특허청구범위에 의해 한정되는 바와 같은 명세의 진의, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
VI. 참고문헌
하기의 참고문헌들은, 이들이 예시적인 과정 또는 본 명세서에 제시된 것들에 보충적인 다른 세부사항들을 제공하는 정도로 구체적으로 본 명세서에 참고로 인용된다.
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
SEQUENCE LISTING <110> THE UNIVERSITY OF IOWA RESEARCH FOUNDATION <120> VIRAL RNA SEGMENTS AS IMMUNOMODULATORY AGENTS AND VACCINE COMPONENTS <130> IPA170262-US <140> PCT/US2015/049167 <141> 2015-09-09 <150> US 62/051,727 <151> 2014-09-17 <160> 43 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9401 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 1 gccagccccc tgatgggggc gacactccac catgaatcac tcccctgtga ggaactactg 60 tcttcacgca gaaagcgtct agccatggcg ttagtatgag tgtcgtgcag cctccaggac 120 cccccctccc gggagagcca tagtggtctg cggaaccggt gagtacaccg gaattgccag 180 gacgaccggg tcctttcttg gatcaacccg ctcaatgcct ggagatttgg gcgtgccccc 240 gcaagactgc tagccgagta gtgttgggtc gcgaaaggcc ttgtggtact gcctgatagg 300 gtgcttgcga gtgccccggg aggtctcgta gaccgtgcac catgagcacg aatcctaaac 360 ctcaaaaaaa aaacaaacgt aacaccaacc gtcgcccaca ggacgtcaag ttcccgggtg 420 gcggtcagat cgttggtgga gtttacttgt tgccgcgcag gggccctaga ttgggtgtgc 480 gcgcgacgag aaagacttcc gagcggtcgc aacctcgagg tagacgtcag cctatcccca 540 aggctcgtcg gcccgagggc aggacctggg 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Phe 2120 2125 2130 Ala Pro Pro Cys Lys Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Ser Phe Arg 2135 2140 2145 Val Gly Leu His Glu Tyr Pro Val Gly Ser Gln Leu Pro Cys Glu 2150 2155 2160 Pro Glu Pro Asp Val Ala Val Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp Pro 2165 2170 2175 Ser His Ile Thr Ala Glu Ala Ala Gly Arg Arg Leu Ala Arg Gly 2180 2185 2190 Ser Pro Pro Ser Val Ala Ser Ser Ser Ala Ser Gln Leu Ser Ala 2195 2200 2205 Pro Ser Leu Lys Ala Thr Cys Thr Ala Asn His Asp Ser Pro Asp 2210 2215 2220 Ala Glu Leu Ile Glu Ala Asn Leu Leu Trp Arg Gln Glu Met Gly 2225 2230 2235 Gly Asn Ile Thr Arg Val Glu Ser Glu Asn Lys Val Val Ile Leu 2240 2245 2250 Asp Ser Phe Asp Pro Leu Val Ala Glu Glu Asp Glu Arg Glu Ile 2255 2260 2265 Ser Val Pro Ala Glu Ile Leu Arg Lys Ser Arg Arg Phe Ala Gln 2270 2275 2280 Ala Leu Pro Val Trp Ala Arg Pro Asp Tyr Asn Pro Pro Leu Val 2285 2290 2295 Glu Thr Trp Lys Lys Pro Asp Tyr Glu Pro Pro Val Val His Gly 2300 2305 2310 Cys Pro Leu Pro Pro Pro Lys Ser Pro Pro Val Pro Pro Pro Arg 2315 2320 2325 Lys Lys Arg Thr Val Val Leu Thr Glu Ser Thr Leu Ser Thr Ala 2330 2335 2340 Leu Ala Glu Leu Ala Thr Arg Ser Phe Gly Ser Ser Ser Thr Ser 2345 2350 2355 Gly Ile Thr Gly Asp Asn Thr Thr Thr Ser Ser Glu Pro Ala Pro 2360 2365 2370 Ser Gly Cys Pro Pro Asp Ser Asp Ala Glu Ser Tyr Ser Ser Met 2375 2380 2385 Pro Pro Leu Glu Gly Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser Asp Gly 2390 2395 2400 Ser Trp Ser Thr Val Ser Ser Glu Ala Asn Ala Glu Asp Val Val 2405 2410 2415 Cys Cys Ser Met Ser Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Leu Val Thr Pro 2420 2425 2430 Cys Ala Ala Glu Glu Gln Lys Leu Pro Ile Asn Ala Leu Ser Asn 2435 2440 2445 Ser Leu Leu Arg His His Asn Leu Val Tyr Ser Thr Thr Ser Arg 2450 2455 2460 Ser Ala Cys Gln Arg Gln Lys Lys Val Thr Phe Asp Arg Leu Gln 2465 2470 2475 Val Leu Asp Ser His Tyr Gln Asp Val Leu Lys Glu Val Lys Ala 2480 2485 2490 Ala Ala Ser Lys Val Lys Ala Asn Leu Leu Ser Val Glu Glu Ala 2495 2500 2505 Cys Ser Leu Thr Pro Pro His Ser Ala Lys Ser Lys Phe Gly Tyr 2510 2515 2520 Gly Ala Lys Asp Val Arg Cys His Ala Arg Lys Ala Val Thr His 2525 2530 2535 Ile Asn Ser Val Trp Lys Asp Leu Leu Glu Asp Asn Val Thr Pro 2540 2545 2550 Ile Asp Thr Thr Ile Met Ala Lys Asn Glu Val Phe Cys Val Gln 2555 2560 2565 Pro Glu Lys Gly Gly Arg Lys Pro Ala Arg Leu Ile Val Phe Pro 2570 2575 2580 Asp Leu Gly Val Arg Val Cys Glu Lys Met Ala Leu Tyr Asp Val 2585 2590 2595 Val Thr Lys Leu Pro Leu Ala Val Met Gly Ser Ser Tyr Gly Phe 2600 2605 2610 Gln Tyr Ser Pro Gly Gln Arg Val Glu Phe Leu Val Gln Ala Trp 2615 2620 2625 Lys Ser Lys Lys Thr Pro Met Gly Phe Ser Tyr Asp Thr Arg Cys 2630 2635 2640 Phe Asp Ser Thr Val Thr Glu Ser Asp Ile Arg Thr Glu Glu Ala 2645 2650 2655 Ile Tyr Gln Cys Cys Asp Leu Asp Pro Gln Ala Arg Val Ala Ile 2660 2665 2670 Lys Ser Leu Thr Glu Arg Leu Tyr Val Gly Gly Pro Leu Thr Asn 2675 2680 2685 Ser Arg Gly Glu Asn Cys Gly Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Ser Gly 2690 2695 2700 Val Leu Thr Thr Ser Cys Gly Asn Thr Leu Thr Cys Tyr Ile Lys 2705 2710 2715 Ala Arg Ala Ala Cys Arg Ala Ala Gly Leu Gln Asp Cys Thr Met 2720 2725 2730 Leu Val Cys Gly Asp Asp Leu Val Val Ile Cys Glu Ser Ala Gly 2735 2740 2745 Val Gln Glu Asp Ala Ala Ser Leu Arg Ala Phe Thr Glu Ala Met 2750 2755 2760 Thr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro Gly Asp Pro Pro Gln Pro Glu Tyr 2765 2770 2775 Asp Leu Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser Ser Asn Val Ser Val Ala 2780 2785 2790 His Asp Gly Ala Gly Lys Arg Val Tyr Tyr Leu Thr Arg Asp Pro 2795 2800 2805 Thr Thr Pro Leu Ala Arg Ala Ala Trp Glu Thr Ala Arg His Thr 2810 2815 2820 Pro Val Asn Ser Trp Leu Gly Asn Ile Ile Met Phe Ala Pro Thr 2825 2830 2835 Leu Trp Ala Arg Met Ile Leu Met Thr His Phe Phe Ser Val Leu 2840 2845 2850 Ile Ala Arg Asp Gln Leu Glu Gln Ala Leu Asp Cys Glu Ile Tyr 2855 2860 2865 Gly Ala Cys Tyr Ser Ile Glu Pro Leu Asp Leu Pro Pro Ile Ile 2870 2875 2880 Gln Arg Leu His Gly Leu Ser Ala Phe Ser Leu His Ser Tyr Ser 2885 2890 2895 Pro Gly Glu Ile Asn Arg Val Ala Ala Cys Leu Arg Lys Leu Gly 2900 2905 2910 Val Pro Pro Leu Arg Ala Trp Arg His Arg Ala Arg Ser Val Arg 2915 2920 2925 Ala Arg Leu Leu Ala Arg Gly Gly Arg Ala Ala Ile Cys Gly Lys 2930 2935 2940 Tyr Leu Phe Asn Trp Ala Val Arg Thr Lys Leu Lys Leu Thr Pro 2945 2950 2955 Ile Ala Ala Ala Gly Gln Leu Asp Leu Ser Gly Trp Phe Thr Ala 2960 2965 2970 Gly Tyr Ser Gly Gly Asp Ile Tyr His Ser Val Ser His Ala Arg 2975 2980 2985 Pro Arg Trp Ile Trp Phe Cys Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gly Val 2990 2995 3000 Gly Ile Tyr Leu Leu Pro Asn Arg 3005 3010 <210> 3 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid <400> 3 ctcacgccaa ggtgcctgat cgactacccc tacaggctct ggcattatcc 50 <210> 4 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid <400> 4 ctcacgccaa ggtgcctgat cgactacccc tacaggctct ggcattaccc c 51 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid <400> 5 gacaacaacc tttacaaact acatggt 27 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 6 Leu Thr Pro Arg Cys Leu Ile Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr 1 5 10 15 Pro <210> 7 <211> 51 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 7 ctcacgccaa ggtgcctgat cgactacccc tacaggctct ggcattaccc c 51 <210> 8 <211> 51 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 8 ttgacacctc gctgcatggt cgactatcca taccggcttt ggcattaccc a 51 <210> 9 <211> 51 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 9 ctcacaaaaa ggtgcctgat cgactacccc tacaggctct ggcattacaa a 51 <210> 10 <211> 140 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid <400> 10 gccgccagtg tgctggaatt cggctttcct gataccactt acctcaaatg cggctctggg 60 ccctggctca cgccaaggtg cctgatcgac tacccctaca ggctctggca ttacccctgc 120 acactgtagg caccatcaat 140 <210> 11 <211> 22 <212> RNA <213> Hepatitis C virus <400> 11 caaaugccaa auagugauua ga 22 <210> 12 <211> 22 <212> RNA <213> Hepatitis C virus <400> 12 ccccuacagg cucuggcauu ac 22 <210> 13 <211> 22 <212> RNA <213> Hepatitis C virus <400> 13 auaaugccag ugaauguugc ug 22 <210> 14 <211> 22 <212> RNA <213> Hepatitis C virus <400> 14 ccccuacagg cucuggcauu ac 22 <210> 15 <211> 65 <212> RNA <213> Hepatitis C virus <400> 15 ccccucacgc augacggaca aguacagauc gacuaacccu acuguacuug uccgucaugc 60 acccc 65 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Yellow fever virus <400> 16 Asp Asn Asn Leu Tyr Lys Leu His Gly 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Yellow fever virus <400> 17 Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Val Gly 1 5 <210> 18 <211> 11 <212> RNA <213> Yellow fever virus <400> 18 auuuuguaaa a 11 <210> 19 <211> 11 <212> RNA <213> Yellow fever virus <400> 19 cuuuacaaaa c 11 <210> 20 <211> 9 <212> RNA <213> Yellow fever virus <400> 20 cuuguaaaa 9 <210> 21 <211> 9 <212> RNA <213> Yellow fever virus <400> 21 cuuuacaaa 9 <210> 22 <211> 9 <212> RNA <213> Yellow fever virus <400> 22 uuuacaaaa 9 <210> 23 <211> 12 <212> DNA <213> Yellow fever virus <400> 23 ccuuuacaaa ct 12 <210> 24 <211> 12 <212> DNA <213> Yellow fever virus <400> 24 ccuuutcaaa ct 12 <210> 25 <211> 12 <212> DNA <213> Yellow fever virus <400> 25 ccuugccaaa ct 12 <210> 26 <211> 12 <212> DNA <213> Yellow fever virus <400> 26 ccuugccaaa ct 12 <210> 27 <211> 1089 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 27 gaaacccatg tgaccggcgg caacgcgggc cgtaccaccg cgggcctggt gggcctgctg 60 accccgggcg cgaaacagaa cattcagctg attaacacca acggcagctg gcatattaac 120 agcaccgcgc tgaactgcaa cgaaagcctg aacaccggct ggctggcggg cctgttttat 180 cagcataaat ttaacagcag cggctgcccg gaacgtctgg cgagctgccg tcgtctgacc 240 gattttgcgc agggctgggg cccgattagc tatgcgaacg gcagcggcct ggatgaacgt 300 ccgtattgct ggcattatcc gccgcgtccg tgcggcattg tgccggcgaa aagcgtgtgc 360 ggcccggtgt attgctttac cccgagcccg gtggtggtgg gcaccaccga tcgtagcggc 420 gcgccgacct atagctgggg cgcgaacgat accgatgtgt ttgtgctgaa caacacccgt 480 ccgccgctgg gcaactggtt tggctgcacc tggatgaaca gcaccggctt taccaaagtg 540 tgcggcgcgc cgccgtgcgt gattggcggc gtgggcaaca acaccctgct gtgcccgacc 600 gattgctttc gtaaatatcc ggaagcgacc tatagccgtt gcggcagcgg cccgcgtatt 660 accccgcgtt gcatggtgga ttatccgtat cgtctgtggc attatccgtg caccattaac 720 tataccattt ttaaagtgcg tatgtatgtg ggcggcgtgg aacatcgtct ggaagcggcg 780 tgcaactgga cccgtggcga acgttgcgat ctggaagatc gtgatcgtag cgaactgagc 840 ccgctgctgc tgagcaccac ccagtggcag gtgctgccgt gcagctttac caccctgccg 900 gcgctgagca ccggcctgat tcatctgcat cagaacattg tggatgtgca gtatctgtat 960 ggcgtgggca gcagcattgc gagctgggcg attaaatggg aatatgtggt gctgctgttt 1020 ctgctgctgg cggatgcgcg tgtgtgcagc tgcctgtgga tgatgctgct gattagccag 1080 gcggaagcg 1089 <210> 28 <211> 1479 <212> DNA <213> Yellow fever virus <400> 28 gctcactgca ttggaattac tgacagggat ttcattgagg gggtgcatgg aggaacttgg 60 gtttcagcta ccctggagca agacaagtgt gtcactgtta tggcccctga caagccttca 120 ttggacatct cactagagac agtagccatt gatagacctg ctgaggtgag gaaagtgtgt 180 tacaatgcag ttctcactca tgtgaagatt aatgacaagt gccccagcac tggagaggcc 240 cacctagctg aagagaacga aggggacaat gcgtgcaagc gcacttattc tgatagaggc 300 tggggcaatg gctgtggcct atttgggaaa gggagcattg tggcatgcgc caaattcact 360 tgtgccaaat ccatgagttt gtttgaggtt gatcagacca aaattcagta tgtcatcaga 420 gcacaattgc atgtaggggc caagcaggaa aattggaata ccgacattaa gactctcaag 480 tttgatgccc tgtcaggctc ccaggaagtc gagttcattg ggtatggaaa agctacactg 540 gaatgccagg tgcaaactgc ggtggacttt ggtaacagtt acatcgctga gatggaaaca 600 gagagctgga tagtggacag acagtgggcc caggacttga ccctgccatg gcagagtgga 660 agtggcgggg tgtggagaga gatgcatcat cttgtcgaat ttgaacctcc gcatgccgcc 720 actatcagag tactggccct gggaaaccag gaaggctcct tgaaaacagc tcttactggc 780 gcaatgaggg ttacaaagga cacaaatgac aacaaccttt acaaactaca tggtggacat 840 gtttcttgca gagtgaaatt gtcagctttg acactcaagg ggacatccta caaaatatgc 900 actgacaaaa tgttttttgt caagaaccca actgacactg gccatggcac tgttgtgatg 960 caggtgaaag tgtcaaaagg agccccctgc aggattccag tgatagtagc tgatgatctt 1020 acagcggcaa tcaataaagg cattttggtt acagttaacc ccatcgcctc aaccaatgat 1080 gatgaagtgc tgattgaggt gaacccacct tttggagaca gctacattat cgttgggaga 1140 ggagattcac gtctcactta ccagtggcac aaagagggaa gctcaatagg aaagttgttc 1200 actcagacca tgaaaggcgt ggaacgcctg gccgtcatgg gagacaccgc ctgggatttc 1260 agctccgctg gagggttctt cacttcggtt gggaaaggaa ttcatacggt gtttggctct 1320 gcctttcagg ggctatttgg cggcttgaac tggataacaa aggtcatcat gggggcggta 1380 cttatatggg ttggcatcaa cacaagaaac atgacaatgt ccatgagcat gatcttggta 1440 ggagtgatca tgatgttttt gtctctagga gttggggcg 1479 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 29 ctccacccaa tgaatcactc cc 22 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 30 gaggtttagg attcgtgctc 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 31 cgttagtatg agtgtcgtgc 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 32 gatgcacggt ctacgagacc 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 33 atcccatcac catcttccag 20 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 34 ccatcacgcc acagtttcc 19 <210> 35 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 35 attgatggtg cctacag 17 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 36 tcctgatacc acttacctca a 21 <210> 37 <211> 27 <212> DNA <213> Yellow fever virus <400> 37 gacaacaacc uuuacaaact acatggt 27 <210> 38 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid <400> 38 gcattatcc 9 <210> 39 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid <400> 39 gcauuaucc 9 <210> 40 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid <400> 40 gcattacccc 10 <210> 41 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid <400> 41 gcauuacccc 10 <210> 42 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid <400> 42 cuuuacaaaa 10 <210> 43 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid <400> 43 ctttacaaa 9

Claims (57)

  1. 면역세포 활성화의 억제가 필요한 포유동물 피험자에게 T 세포 면역-억제 도메인을 포함하는 바이러스 RNA 분절을 투여함을 포함하는, 면역세포 활성화의 억제 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    바이러스 RNA 분절이 T 세포 면역-억제 도메인의 약 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 30, 35, 40, 45, 50, 51, 75, 100, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 400 또는 500개의 연속적인 염기를 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    바이러스 RNA 분절이 HCV E2 서열, GBV-C E2, YFV 외막 또는 HIV gp41 서열을 암호화하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    바이러스 RNA 분절이 비-HCV E2 서열, 비-GBV-C E2 서열, 비-YFV env 서열 또는 비-HIV gp41 서열을 추가로 암호화하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    T 세포가 헬퍼 T 세포 억제인자 T 세포, 또는 킬러 T 세포인 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    피험자가 비-인간 포유동물인 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    피험자가 인간인 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    투여가 정맥내, 동맥내, 경구, 피하, 국소 또는 복강내 투여를 포함하는 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    제2 소염제를 투여함을 추가로 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    제2 소염제가 스테로이드 또는 COX-2 억제제인 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    제2 소염제를, 바이러스 RNA 분절 전에 또는 상기 분절 다음에 접촉시키는 방법.
  12. 제9항에 있어서,
    제2 소염제를 바이러스 RNA 분절과 동시에 접촉시키는 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    바이러스 RNA 분절을 유전자 요법 벡터와 함께 제공하는 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    유전자 요법 벡터를 투여함을 추가로 포함하는 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    유전자 요법 벡터가 바이러스 유전자 요법 벡터를 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    바이러스 유전자 요법 벡터가 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 포함하는 방법.
  17. 제1항에 있어서,
    바이러스 RNA 분절이 적어도 하나의 비-천연 염기를 포함하는 방법.
  18. 제1항에 있어서,
    바이러스 RNA 분절이 다이서(Dicer) 기질을 포함하는 방법.
  19. 제1항에 있어서,
    바이러스 RNA 분절을 0.1 내지 500 ㎎/㎏/d로 투여하는 방법.
  20. 제1항에 있어서,
    바이러스 RNA 분절을 매일 또는 매주 투여하는 방법.
  21. 제18항에 있어서,
    바이러스 RNA 분절을 7일, 2주, 3주, 4주, 1개월, 6주, 8주, 2개월, 12주, 또는 3개월 동안 매일, 또는 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 10주 또는 12주 동안 매주 투여하는 방법.
  22. 제1항에 있어서,
    바이러스 RNA 분절이 인간 면역결핍 바이러스 외막 gp120/160, 황열 바이러스 외막 단백질, 소 바이러스성 설사 바이러스 외막 단백질, 돼지 콜레라 바이러스 외막 단백질, 인플루엔자 외막 단백질, 뎅기열 바이러스 외막 단백질, 웨스트 나일 바이러스 외막 단백질, 및 일본 뇌염 바이러스 외막 단백질로부터 유래되는 방법.
  23. 약학적으로 허용 가능한 담체 완충제 또는 희석제와 함께 제형화된, T 세포 면역-억제 도메인을 포함하는 바이러스 RNA 분절을 포함하는, 조성물.
  24. 제21항에 있어서,
    바이러스 RNA 분절이, 상기 분절이 유래된 고유 바이러스 게놈의 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 30, 35, 40, 45, 50, 51, 75, 100개의 연속적인 염기를 포함하는 조성물.
  25. 제21항에 있어서,
    바이러스 RNA 분절의 길이가 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 30, 35, 40, 45, 50, 51, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 400 또는 500개 염기인 조성물.
  26. 제21항에 있어서,
    바이러스 RNA 분절이 비-바이러스 서열에 융합된 조성물.
  27. 제21항에 있어서,
    약학적 투여, 예를 들어 국소, 피부, 피하, 소화기 또는 비경구 투여용으로 제형화된 조성물.
  28. 포유동물 피험자에게 하나 이상의 변형된 T 세포 면역-억제 도메인을 포함하는 바이러스 RNA 분절을 투여함을 포함하는, 상기 피험자에서 면역 반응을 유도하는 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    변형된 부위가 다이서 기질을 포함하는 방법.
  30. 제28항에 있어서,
    RNA 바이러스가 레오비리다에(Reoviridae), 아트로비리다에(Atroviridae), 칼리시비리다에(Caliciviridae), 헤페비리다에(Hepeviridae), 피코르나비리다에(Picornaviridae), 토가비리다에(Togaviridae), 플라비비리다에(Flaviviridae), 코로나비리다에(Coronaviridae), 오쏘믹소비리다에(Orthomyxoviridae), 아레나비리다에(Arenaviridae), 분야비리다에(Bunyaviridae), 파라믹소비리다에(Paramyxoviridae), 필로비리다에(Filoviridae), 라브도비리다에(Rabdoviridae) 또는 레트로비리다에(Retroviridae) 과로부터 유래되는 방법.
  31. 제28항에 있어서,
    RNA 바이러스가 GBV-C, C형 간염 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 뎅기열 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 소 바이러스성 설사 바이러스, 돼지 콜레라 바이러스 또는 황열 바이러스인 방법.
  32. 제28항에 있어서,
    바이러스 RNA 분절이 다른 바이러스 서열이 없는 방법.
  33. 제28항에 있어서,
    바이러스 RNA 분절을 발현 벡터로부터의 발현을 통해 전달하는 방법.
  34. 제33항에 있어서,
    발현 벡터가 바이러스 발현 벡터인 방법.
  35. 제28항에 있어서,
    바이러스 RNA 분절을 지질 비히클 또는 나노입자 중에 포함시키는 방법.
  36. 제28항에 있어서,
    바이러스 RNA 분절을 상기 바이러스의 다른 혈청형 또는 균주로부터의 제2 바이러스 RNA 분절과 함께 투여하는 방법.
  37. 제28항에 있어서,
    바이러스 RNA 분절을 1회를 초과하여 투여하는 방법.
  38. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    바이러스 RNA 분절을 항원보강제와 함께 제형화하는 방법.
  39. 제28항에 있어서,
    바이러스 RNA 분절이 HCV E2로부터 유래되는 방법.
  40. 제28항에 있어서,
    바이러스 RNA 분절이 YFV env로부터 유래되는 방법.
  41. 제28항에 있어서,
    바이러스 RNA 분절이 GBV-C E2로부터 유래되는 방법.
  42. 제28항에 있어서,
    변형된 도메인이 천연 서열에 비해 결실 또는 치환을 포함하는 방법.
  43. 제42항에 있어서,
    피험자가 인간 피험자인 방법.
  44. 제42항에 있어서,
    피험자가 비-인간 동물 피험자인 방법.
  45. T 세포 면역-억제 도메인 중에 변형을 갖는 바이러스 RNA 분절을 포함하는, 백신.
  46. 제45항에 있어서,
    변형이 결실된 분절 또는 돌연변이된 분절을 포함하는 백신.
  47. 제45항에 있어서,
    바이러스 RNA 분절이 상기 분절이 유래된 고유 바이러스 게놈의 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 30, 35, 40, 45, 50, 51, 75, 또는 100개의 연속적인 염기를 포함하는 백신.
  48. 제45항에 있어서,
    바이러스 RNA 분절의 길이가 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 30, 35, 40, 45, 50, 51, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 219 또는 250개 염기인 백신.
  49. 제45항에 있어서,
    바이러스 RNA 분절이 비-바이러스 서열에 융합된 백신.
  50. 제45항에 있어서,
    항원보강제와 함께 제형화된 백신.
  51. 제45항에 있어서,
    바이러스 RNA 분절이 HCV 암호화 영역으로부터의 것인 백신.
  52. 피험자에게
    a) 상기 피험자의 세포에서 작동할 수 있는 프로모터의 조절하에서 이종 유전자 분절을 포함하는 발현 카세트 및
    b) T 세포 면역-억제 도메인을 포함하는 바이러스 RNA 분절
    을 투여함을 포함하는, 상기 피험자에서 유전자 전달을 수행하는 방법.
  53. 제52항에 있어서,
    발현 카세트가 T 세포 면역-억제 도메인을 포함하는 바이러스 RNA 분절을 추가로 포함하는 방법.
  54. 제52항에 있어서,
    발현 카세트가 바이러스 벡터를 포함하는 방법.
  55. 제52항에 있어서,
    바이러스 벡터가 아데노-관련된 바이러스(AAV) 벡터를 포함하는 방법.
  56. 하기 서열을 갖는 핵산을 포함하는 약학 조성물:
    CTCACGCCAAGGTGCCTGATCGACTACCCCTACAGGCTCTGGCATTATCC (서열번호 3), 또는
    CTCACGCCAAGGTGCCTGATCGACTACCCCTACAGGCTCTGGCATTACCCC (서열번호 4), 또는
    GACAACAACCTTTACAAACTACATGGT (서열번호 5).
  57. GCATTATCC (서열번호 38), GCAUUAUCC (서열번호 39), GCATTACCCC (서열번호 40), GCAUUACCCC (서열번호 41), CUUUACAAAA (서열번호 42), 또는 CTTTACAAA (서열번호 43) 중에서 선택된 핵산 서열을 포함하고, 상기 핵산이 적어도 약 20개 염기쌍 및 약 55개 이하의 염기쌍으로 필수적으로 이루어지는, 약학 조성물.

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