KR20130138789A - 재조합 서브유닛 뎅기 바이러스 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 대상체에게 투여하기 위한 뎅기 바이러스 백신 및 면역원성 조성물을 제공한다. 본 발명의 백신 조성물은 아주반트 (adjuvant) 및 제약상 허용되는 담체와 함께 제제화될 때, 균형잡힌 4가 면역 반응을 유도하는, 재조합 방식으로 생산된 단량체 및/또는 이량체 형태의 말단절단된 뎅기 바이러스 외피 (envelope) 당단백질을 포함한다. 본원에서 설명되는 조성물의 바람직한 실시양태에서, DEN4 단백질 성분은 이량체 형태의 DEN4이다. 조성물은 면역억제, 면역손상 및 면역노쇠 (immunosenescent) 개체를 비롯한 일반적인 집단에서 사용하기 위해 허용되도록 설계된다. 본원에서 설명되는 조성물을 환자에게 투여함으로써 인간 환자 집단에서 보호 면역 반응을 유도하는 방법을 본원에서 또한 제공한다.

Description

재조합 서브유닛 뎅기 바이러스 백신{RECOMBINANT SUBUNIT DENGUE VIRUS VACCINE}

관련 출원에 대한 교차 참조

본원은 그 내용 전부가 본원에 참고로 포함된, 2010년 10월 29일 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/408,310의 이익을 주장한다.

미국 정부 후원 연구에 관한 설명

본 발명은 부분적으로 미국 정부 승인 번호 5UO1 AI056410-03 및 1UC1 AI062481 (NIH), 및 W81XWH-06-2-0035 (DOD)에 의해 지원받았다. 미국 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 가진다.

발명의 분야

본 발명은 인간 대상체에서 뎅기 바이러스 감염 및 그의 임상 징후의 예방 및/또는 치료에 유용한, 뎅기 바이러스 감염에 대한 면역학적 반응을 유도하는 조성물에 관한 것이다.

플라비비리대 (Flaviviridae) 과는 원형 황열병 바이러스 (YF), 뎅기 바이러스의 4개 혈청형 (DEN-1, DEN-2, DEN-3, 및 DEN-4), 일본 뇌염 바이러스 (JE), 진드기 매개 뇌염 바이러스 (TBE), 웨스트 나일 바이러스 (WN), 세인트 루이스 뇌염 바이러스 (SLE), 및 약 70개의 다른 질병 유발 바이러스를 포함한다. 플라비바이러스는 단일 양성 가닥 RNA 게놈을 함유하는, 작은 외피보유 (enveloped) 바이러스이다. 10개의 유전자 생성물이 단일 개방 리딩 프레임 (open reading frame)에 의해 코딩되고, 다음 순서로 체계화된 다중단백질로서 번역된다: 캡시드 (C), "전구막 (preMembrane)" (prM, 이것은 세포로부터 비리온 방출 직전에 "막" (M)으로 처리됨), "외피 (envelope)" (E), 이어서 비-구조 (NS) 단백질 NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b 및 NS5 (문헌 [Chambers, T. J. et al., Annual Rev Microbiol (1990) 44:649-688]; [Henchal, E. A. and Putnak, J. R., Clin Microbiol Rev. (1990) 3:376-396]에서 검토됨). 이어서, 숙주 및 바이러스에 의해 코딩되는 프로테아제에 의해 매개된 정밀한 처리 사건을 통해 개별 플라비바이러스 단백질이 생산된다.

플라비바이러스의 외피는 숙주 세포막으로부터 유래하고, 바이러스에 의해 코딩되는 막 고정된 (anchored) 막 (M) 및 외피 (E) 당단백질을 함유한다. E 당단백질은 가장 큰 바이러스 구조 단백질이고, 세포 표면 부착 및 엔도좀내 융합 활성을 책임지는 기능성 도메인을 함유한다. 또한, 이것은 보호 면역과 연관된, 바이러스 중화 항체의 생산을 유도하는 숙주 면역계의 주요 표적이다.

뎅기 바이러스는 애데스 (Aedes) 속, 주로 에이. 애집티 (A. aegypti) 및 에이. 알보픽투스 (A. albopictus)의 모기에 의해 인간에게 전염된다. 뎅기 바이러스에 의한 감염은 고열, 두통, 관절 및 근육 통증, 발진, 림프절병 및 백혈구감소증을 특징으로 하는 고전적인 뎅기열 (DF)을 통한 불현성 또는 가벼운 발열 질병 (문헌 [Gibbons, R. V. and D. W. Vaughn, British Medical Journal (2002) 324:1563-1566])으로부터, 아동에서 보다 통상적이고 보다 심각한 형태의 감염, 혈관 투과성 및/또는 점상 출혈 및 반상 출혈의 존재로부터 미치료시 사망을 유발할 수 있는 자발적인 심각한 출혈 및 큰 쇼크에 이르는 심각한 출혈 징후를 특징으로 하는 뎅기 출혈열/뎅기 쇼크 증후군 (DHF/DSS)까지 해당하는 다양한 임상 상황을 유발한다. 진단 및 신속한 의료적 개입이 실시되지 않으면, DHF/DSS의 갑작스런 발병 및 신속한 진행은 치명적일 수 있다.

뎅기 바이러스는 250,000 내지 500,000명의 DHF/DSS 환자를 포함하여 매년 발생하는 뎅기열 환자가 1억명으로 추정되는, 세계적인 이환율 및 사망률 측면에서 절지동물-전염 바이러스의 가장 유의한 군이다 (문헌 [Gubler, D. J., Clin. Microbiol. Rev. (1998) 11:480-496]; [Gibbons, 상기 문헌]). 인구집단의 세계적인 증가, 특히 열대지방 전역에 걸쳐 인구집단의 도시화, 및 지속적인 모기 구제 수단의 결여 때문에, 뎅기의 모기 매개체는 열대지방, 아열대지방 및 일부 온대지역 전역에 걸쳐 그 분포가 확대되었고, 이로 인해 전세계 인구집단의 절반이 넘는 사람이 뎅기 감염의 위험에 놓이게 되었다. 현대의 제트기 여행 및 인간 이주가 뎅기 혈청형의 세계적 분포를 촉진하였고, 그에 의해 뎅기의 다수 혈청형이 이제 많은 지역에서 풍토병이 되었다. 뎅기 유행병의 빈도 및 DHF/DSS의 발생률은 지난 20년 이상 동안 증가하였다. 예를 들어, 동남 아시아에서, DHF/DSS는 아동의 주요 입원 및 사망 원인이다 ([Gubler, 상기 문헌]; [Gibbons and Vaughn, 상기 문헌]).

현재까지, 플라비바이러스 백신의 개발은 혼합된 성공을 거두었다. 플라비바이러스에 의해 야기되는 질환에 대해 보호하기 위한 백신 후보를 생산하기 위한 노력으로 실행된 다음과 같은 4가지 기본적인 방법이 존재한다: 생 약독화, 불활성화시킨 전체 바이러스, 재조합 서브유닛 단백질, 및 DNA-기반 백신. 황열병 바이러스에 대한 생 약독화 백신은 수십 년 동안 이용가능하였다. 불활성화시킨 전체 바이러스 백신의 사용은 TBE 및 JE 바이러스에 대해 입증되었다.

상기 강조된 바와 같이 YF, JE 및 TBE 백신의 성공에도 불구하고, 뎅기 바이러스에 대한 백신을 개발하기 위한 생 약독화 바이러스 및 불활성화시킨 바이러스 방법의 사용은 큰 도전과제에 직면하였다. 4가지 혈청형의 뎅기 바이러스 (DEN1, DEN2, DEN3, 및 DEN4)가 존재하고, 각각의 혈청형의 바이러스주는 전세계의 뎅기 풍토병 지역 전체에 걸쳐 돌고 있는 것으로 밝혀졌다. 자연 감염은 감염성 혈청형에 대해 오래 지속되는 면역을 부여하지만, 다른 뎅기 혈청형에 대해서는 그렇지 않다. 보다 심각한 형태의 질환 (DHF/DSS)은 뎅기 바이러스의 하나의 혈청형으로 감염된 후에 다른 혈청형의 제2 감염이 이어지는 2차 뎅기 감염 후에 가장 종종 발생한다. DHF 및 DSS와 2차 뎅기 감염의 보다 빈번한 연관은 제2 뎅기 바이러스 종류의 감염성을 증강시키는 하나의 바이러스 종류의 감염에 의해 유도된 비-중화 항체에 의한 것으로 가정되었다 (항체-의존성 증강 - ADE). 상기 개념은 효과적인 뎅기 백신이 4가지 모든 뎅기 혈청형에 대해 균형잡힌 특이적 중화 항체 및 특이적 기억 세포를 동시에 유도해야 하기 때문에, 백신 개발을 위해 중요한 의미를 갖는다 (문헌 [Halstead and Deen, 2002]). 이것은 뎅기 백신 개발에서 주요 문제인 것으로 입증되었다.

지금까지, 임상적으로 시험된 대부분의 백신은 생 약독화 백신이고, 이것은 건강한 대상체에게 제공된 모든 생 바이러스 백신에 공통적인 안전성 문제를 제시한다. 바이러스의 과소약독화는 바이러스-관련 유해 사건을 일으킬 수 있는 반면, 과다약독화는 백신 효능을 제거할 수 있다. 또한, 야생형으로의 회복 또는 증가된 병독성 (또는 감소된 효능)으로의 돌연변이가 일어날 수 있다. 또한, 적절하게 약독화된 경우에도, 생 바이러스 백신은 특정 환자 집단, 예컨대 면역결핍 또는 면역억제된 환자, 및 정상 인구집단의 특정 부류, 예컨대 임신한 여성, 유아, 또는 노인에서 그 사용이 금지된다.

뎅기에 대한 생 약독화 바이러스 방법과 관련된 추가의 문제는 4가 백신 내의 4개의 독립적으로 복제하는 바이러스의 조합과 연관된 도전과제를 포함한다. 간섭의 문제는 현재까지 시험된 모든 4가 제제에서 문제가 되었고, 균형이 잡히지 않은 4가 면역 및 연장된 간격 (예를 들어 0, 6, 12개월)으로 수회 용량을 투여할 필요성을 유발하였다. 이것은 결코 이상적이지 않고, 부분적으로 면역화되고 야생형 바이러스에 노출된 개체는 악화된 질환 (예를 들어 뎅기 출혈열)의 위험이 더 높을 수 있기 때문에 이들 개체에 대해 안정성 문제를 제시할 수 있다.

아이비 (Ivy) 등 (미국 특허 6,432,411)은 DEN1-4 80% E (DEN-2 외피 폴리펩티드의 아미노산 1-395와 동등함) 단백질을 포함하는 4가 서브유닛 백신을 개시하였다. 또한, 상기 아이비 등은 DEN1-4 80% E 및 이스코매트릭스 (ISCOMATRIX)® 아주반트 (adjuvant)를 포함하는 조성물을 보고하였다. 그러나, 4가지 모든 뎅기 혈청형에 대해 균형잡힌 면역 반응을 유도할 수 있는 안정한 4가 백신이 여전히 필요하다.

발명의 개요

본 발명은 뎅기 바이러스 감염과 연관된 질환의 예방 및/또는 치료를 위해 인간 환자 집단에서 사용하기 위한 백신 및 면역원성 조성물을 제공한다. 백신은 뎅기 바이러스 외피 단백질(들)로부터 유래한 재조합 서브유닛 단백질(들) 및 아주반트의 조합에 의해 형성된다. 본 발명의 뎅기 바이러스 백신은 허용되는 안전성 프로파일을 제공하면서 DEN1, DEN2, DEN3, 및 DEN4에 대한 균형잡힌 보호 4가 면역 반응을 유도하도록 설계된다.

독특한 백신 제제는 백신 제제를 생산하기 위해 아주반트와 조합된 신규한 적절하게 접힌 재조합 외피 서브유닛 단백질 ("뎅기 80E" 또는 "DEN-80E" 또는 "DEN1-80E" 또는 "DEN2-80E" 또는 "DEN3-80E" 또는 "DEN4-80E" 또는 "DEN4-80EZip")에 의존한다. 제제의 재조합 외피 단백질의 단량체 및/또는 이량체 형태의 다양한 비의 독특한 조합은 균형잡힌 4가 반응에 대한 필요성을 구체적으로 해결하도록 설계된다. 백신은 건강한 인간 지원자에서 관련된 균형잡힌 4가 보호 면역 반응, 예컨대 바이러스 중화 항체를 유도하고, 건강한 개체 및 면역손상된 개체에 투여하기 위한 허용되는 안전성 프로파일을 유지하도록 설계된다. 본원에서 설명되는 백신 조성물의 추가의 잇점은 이들이 유의한 양의 전구막 (prM) 단백질을 함유하지 않고, 따라서 최근에 항-prM 항체에 연관된 ADE의 위험을 잠재적으로 최소화하는 것이다 (문헌 [Dejnirattisai et al., Science 328:745-748 (2010)]; [Rodenhuis-Zybert et al., PLos Pathogens 6:1-9 (2010)]). 80E 단백질은 prM과 동시 번역 방식으로 발현되지만, 다중단백질은, 정제를 위해 80E 성분을 배양 배지 내로 방출시키는 숙주 세포 시그날라제 (signalase)에 의해 prM-E 연결부에서 분비 경로를 통과할 때 절단된다 (문헌 [Clements et al., 2010 Vaccine 28:2705]).

본 발명의 다른 측면은 뎅기 바이러스 감염에 의해 유발된 질환에 대한 면역예방제로서 허용되는 담체 내에 치료 유효량의 백신의 용도, 및 제약 조성물로서 허용되는 담체 내에 치료 유효량의 백신의 용도를 포함한다.

명세서와 첨부된 청구의 범위에 걸쳐 사용될 때, 단수 형태 ("a," "an," 및 "the")는 문맥상 분명하게 달리 나타내지 않는 한 복수 대상물을 포함한다.

명세서와 첨부된 청구의 범위에 걸쳐 사용될 때, 다음 정의 및 약어를 적용한다:

용어 "처치"는 치료적 처치 및 예방 또는 억제 조치를 둘 모두 나타낸다. 처치를 필요로 하는 개체는 이미 뎅기 감염이 있는 개체 (임의의 임상 증상을 나타내든 아니든), 및 뎅기로 감염될 위험이 있는 개체, 즉, 뎅기 감염 및/또는 그의 임상 징후를 예방해야 하는 대상체/환자를 포함한다. 본 발명의 뎅기 백신을 사용한 환자의 처치는 환자에서 뎅기에 대한 면역 반응을 유도/증가시키고, 뎅기로 감염된 환자에서 뎅기의 임상 징후의 가능성을 예방, 개선, 제거 또는 감소시키고, 뎅기열, DHF, 또는 DSS 및/또는 뎅기 감염과 연관된 다른 질환 또는 합병증을 발병할 가능성을 예방 또는 감소시키고, 뎅기 감염의 임상 증상 및/또는 뎅기와 연관된 다른 질환 또는 합병증의 중증도 또는 지속기간을 감소시키고, 뎅기 감염의 가능성을 예방 또는 감소시키는 것 중 하나 이상을 포함한다.

용어 "치료 유효량"은 환자에서 뎅기에 대한 면역 반응을 유도/증가시키거나, 뎅기 감염 또는 뎅기 재발 감염의 가능성을 예방 또는 감소시키거나, 뎅기로 감염된 환자에서 뎅기 감염의 임상 징후를 예방, 개선 또는 제거하거나, 뎅기열, DHF 및/또는 DSS를 예방하거나, 뎅기와 연관된 질환의 중증도 또는 지속기간을 감소시키는 것을 포함하지만 이로 제한되지 않는 목적하는 효과를 생성하기 위해 환자에게 도입되는 충분한 백신 조성물을 의미한다. 당업자는 상기 수준이 다양할 수 있음을 알 것이다.

용어 "면역 반응"은 세포-매개 (T-세포) 면역 반응 및/또는 항체 (B-세포) 반응을 나타낸다.

용어 "환자"는 면역적격 (immunocompetent) 개체 및 면역손상 개체 모두를 비롯한, 본원에서 설명되는 뎅기 백신/면역원성 조성물을 투여받을 임의의 인간을 나타낸다. 본원에서 정의할 때, "환자"는 자연 감염 또는 백신접종 (vaccination)을 통해 뎅기에 이미 감염된 개체, 또는 이후 노출될 수 있는 개체를 포함한다.

"MAA"는 머크 (Merck) 알루미늄 아주반트를 의미한다. MAA는 무정형 알루미늄 히드록시포스페이트 술페이트 아주반트이다. 용어 "MAA"는 본원에서 용어 "무정형 알루미늄 히드록시포스페이트 술페이트" 또는 "AAHS"와 상호교환가능하게 사용된다.

"이스콤 (ISCOM)-유사 아주반트"는 그의 기능에 기여하는 독특한 구형의 새장형-유사 (caged-like) 구조를 갖는, 함께 특징적인 새장형-유사 입자를 형성하는, 사포닌, 콜레스테롤 및 인지질로 이루어진 면역 자극 복합체 (ISCOM)를 포함하는 아주반트이다 (검토를 위해, 문헌 [Barr and Mitchell, Immunology and Cell Biology 74:8-25 (1996)] 참조). 상기 용어는 두 이스콤 아주반트를 모두 포함하고, 이것은 항원을 사용하여 생산되고 이스콤 입자 및 이스콤 매트릭스 아주반트 내의 항원을 포함하고, 이것은 항원 없이 생산되는 중공형 (hollow) 이스콤-형 아주반트이다. 본원에서 제공되는 조성물 및 방법의 바람직한 실시양태에서, 이스콤-형 아주반트는 항원 없이 제조된 이스콤 매트릭스 입자 아주반트, 예컨대 이스코매트릭스®이다 (이스콤® 및 이스코매트릭스®는 씨에스엘 리미티드 (CSL Limited, 오스트레일리아 파크빌)의 등록 상표이다).

도 1은 정제된 cGMP 등급 DEN1-80E, DEN2-80E, DEN3-80E 및 DEN4-80EZip (1 ㎍의 각각의 샘플)의 은 염색된 나트륨 도데실 술페이트 - 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 겔 (패널 A) 및 웨스턴 블롯 (Western blot) (패널 B)을 보여준다. 모든 샘플을 비-환원 조건 하에 10% 겔 상에서 전개시켰다. 웨스턴 블롯은 모든 뎅기 바이러스를 인식하는 마우스 모노클로날 항체 (4G2)를 사용하여 전개시켰다. 분자량 마커의 크기 (kD 단위)를 겔 및 블롯의 좌측에 나타낸다.
도 2는 실시예 6에 설명된 바와 같이 4가 뎅기 레수스 마카크 (rhesus macaque; 붉은털 원숭이) 유발검사 (challenge) 연구: 베로 (Vero) 세포 상에서 원숭이 혈청의 직접 플라크 검정에 의한 유발검사 후 정량적 바이러스혈증 평가의 결과를 보여준다.

상기한 바와 같이, 인간에 사용하기 위한 뎅기 백신의 개발에 대한 몇몇 시도가 이루어졌지만, 지금까지, 이들 시도는 안전성 및/또는 효능의 문제에 직면했다. 이를 위해, 본 발명은 인간 대상체에서 뎅기 바이러스 감염 및/또는 그의 임상 징후의 예방 및/또는 치료를 위해 유용한 조성물을 제공한다.

많은 선행 노력은 안전하면서도 충분하게 면역원성인 (예를 들어, 면역화시킨 개체에서 균형잡힌 4가 반응을 유도할 수 있는) 인간 뎅기 백신의 개발에 기울어졌다. 이들 노력에도 불구하고, 이들 조건을 충분히 만족시키는, 인간에서 사용하기 위한 뎅기 바이러스 백신이 지금까지 확립되지 않았다. 따라서, 본 발명이 해결할 기술적 문제는 2가지 주요 조건을 만족시키는 뎅기 바이러스 백신의 발견이다; (1) 백신접종한 개체 (인간 대상체)에서 균형잡힌 4가 보호 면역 반응을 유도하는 능력, (2) 유아, 노인 및 면역손상된 개체를 비롯한 인간 대상체에서 뛰어난 안전성 프로파일을 유지하는 능력. 이것은 뎅기 바이러스 백신 개발에 상당한 도전과제를 제기하고, 지금까지 어떠한 백신 제제도 상기 기술적 문제의 모든 측면을 적절하게 다루는 것으로 보이지 않았다. 뎅기 바이러스 감염 증가의 유병률에 대한 해법으로서 충족되지 않고 증가하는 많은 수요가 존재한다.

모든 플라비바이러스 외피 단백질은 유의한 상동성을 공유한다. 외피 단백질의 3가지 모든 외부 도메인 내에 함유된 에피토프에 대해 생성된 항체는 바이러스를 중화시킬 수 있고, 즉, 시험관 내에서 감수성 세포의 바이러스 감염을 억제시킬 수 있다. 고역가의 바이러스 중화 항체는 플라비바이러스 감염에 대한 생체내 보호 및 플라비바이러스 유도 질환의 예방의 최상의 시험관내 연관성으로서 일반적으로 받아들여진다 (문헌 [Markoff Vaccine (2000) 18:26-32]; [Ben-Nathan et al., J. Inf. Diseases (2003) 188:5-12]; [Kreil et al., J. Virol. (1998) 72:3076-3081]; [Beasley et al., Vaccine (2004) 22:3722-26]). 따라서, 고역가 뎅기 바이러스 중화 반응을 유도하는 백신은 아마도 백신접종한 개체를 뎅기 바이러스에 의해 유도된 질환에 대해 보호할 것이다.

DHF 및 DSS와 2차 뎅기 감염의 보다 빈번한 연관은 제1 주사로부터 생성하는 교차 반응성의 비-중화 항체의 존재 때문인 것으로 가정되고, 이것은 Fc-수용체-매개 경로에 의해 Fc 수용체 보유 세포, 예컨대 단핵구/대식세포의 감염을 촉진함으로써 제2 감염성 혈청형의 복제를 상향조절한다 (ADE; Halstead 1988; Halstead 1989). 별법으로, 보다 최근의 가설은 "항원 원죄 (original antigenic sin)"의 현상을 통해, 초기 면역 반응은 주로 제1 감염성 혈청형에 대해 생성되고, 이것은 보다 특이적인 면역 반응이 개시할 수 있기 전에 제2 감염성 혈청형이 복제하고 잇점을 얻도록 허용한다고 생각된다 (문헌 [Mongkolsapaya et al., 2003]). 메카니즘에 무관하게, 증강된 2차 감염의 상기 현상은, 효과적인 뎅기 백신이 4가지 모든 뎅기 혈청형에 대해 균형잡힌 특이적 중화 항체 및 특이적 기억 세포를 동시에 유도해야 하기 때문에 백신 개발을 위해 중요한 의미를 갖는다 (문헌 [Halstead and Deen, 2002]). 이것은 뎅기 백신 개발에서 주요 문제인 것으로 입증되었다.

상기 문제가 뎅기 백신 개발에서 문제를 일으키는 방식을 입증하기 위해, 지금까지 시행된 노력의 검토가 유용하다. 후보 생 약독화 뎅기 백신 바이러스주를 개발하는데 상당한 노력이 투자되었지만, 시험된 많은 바이러스주는 불만족스러운 것으로 입증되었고, 바이러스 혈청형들 사이의 간섭은 매우 도전적인 것으로 입증되었다. 고전적으로 약독화시킨 바이러스를 사용하는 2가지 개발 프로그램이 2상 임상 시험으로 진행하였지만, 간섭 및/또는 생산 문제 때문에 2상에서 지연되거나 중지되었다.

플라비바이러스 백신을 개발하기 위한 전통적인 생 약독화 방법에 대한 별법으로서, 재조합 키메라 (chimeric) 방법이 사용되었다. 상기 방법은 기제 (base)로서 공지의 약독화 바이러스주를 사용하고, 관심있는 관련 바이러스로부터의 적절한 유전자 (플라비바이러스에 대해 prM 및 E)로 기제 바이러스의 동등한 유전자를 치환한다. WN 및 뎅기 백신 개발을 위해 사용된 하나의 방법은 약독화 DEN-4 바이러스주에 기반한 종류간 키메라의 사용이다 (문헌 [Bray, M. et al., J. Virol. (1996) 70:4162-4166]; [Chen, W., et al., J. Virol. (1995) 69:5186-5190]; [Bray, and Lai, C.-J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:10342-10346]; [Lai, C. J. et al., Clin. Diagn. Virol. (1998) 10:173-179]). 또 다른 방법은 JE 바이러스, DEN 바이러스, 및 WN 바이러스에 대한 재조합 키메라 백신을 개발하기 위해 기제로서 YF 17D 약독화 바이러스주의 사용이었다 (문헌 [Guy, B. et al. Vaccine (2011), doi:10.1016/j.vaccine.2011.06.094]; [Lai, C.J. and Monath T.P. Adv Virus Res (2003) 61:469-509]; [Monath et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103:6694]). 생 약독화 키메라 방법의 사용은 전통적인 생 약독화 방법에 비해 잇점이 있지만, 키메라 방법은 적절하게 약독화된 바이러스주를 개발하는데 있어서 및 뎅기 바이러스에 대한 균형잡힌 4가 반응을 달성하는데 있어서 직면한 어려움으로 문제가 되고 있다.

현재, 전체 불활성화시킨 바이러스 방법을 이용하는 JE 및 TBE에 대해 생산된 상업상 이용가능한 백신이 존재한다. 생 약독화 바이러스 방법에서와 같이, 특정 플라비바이러스에 대한 불활성화시킨 바이러스 방법의 사용은 다른 플라비바이러스에 대해 성공을 보장하지 않는다. 예를 들어, 불활성화시킨 DEN 백신을 개발하려는 노력은 성공이 제한되었다. 주로 이들 방법은 세포 배양 시스템으로부터 적절한 바이러스 수율을 얻지 못하여 제한되었다. 곤충 세포, 예컨대 C6/36 세포로부터 바이러스 수율은 일반적으로 10⁴ 내지 10⁵ pfu/ml 범위로, 비용-효과적인 불활성화시킨 바이러스 백신을 생산하기 위해 필요한 수준보다 매우 낮다. LLC-MK2 및 베로 세포를 비롯한 포유동물 세포로부터의 수율은 더 높지만, 피크 수율 (독특한 베로 세포주로부터 약 10⁶ pfu/ml)은 진정한 비용-효과적인 백신 제품을 달성하기 위해 필요한 것보다 여전히 더 낮다. 낮은 수율은 균형잡힌 4가 반응을 유도하는 능력에 추가로 영향을 미칠 수 있다.

DEN, JE, TBE 및 WN에 대한 비-복제 플라비바이러스 백신을 개발하기 위한 노력에서 네이키드 (naked) DNA 방법의 사용이 또한 평가되었다 (문헌 [Porter et al., 1998]; [Raviprakash et al., 2000]; [Konishi et al., 1998]; [Chang et al., 2000]; [Schmaljohn et al., 1997]; [Aberle et al., 1999]; [Davis et al., 2001]). DNA 방법은 생산의 용이함, 규정된 서열의 사용, 생체 내에서 항원의 발현으로 인한 체액 및 세포 면역 모두를 유도하는 가능성에서 잇점을 제공한다. 이들 잇점에도 불구하고, 일관되고 강건한 면역 반응을 유도하는 능력이 상기 방법에 대한 주요 장애가 되고 있다. 동물 모델에서 관련 보호 면역 반응을 유도하는데 일부 성공을 거두었지만 (문헌 [Davis et al., 2001]), 인간에서 이들 반응을 유도하는 능력은 아직 확립되지 않았다. 추가로, DNA 백신은 숙주 게놈 내에 플라스미드 서열의 통합 및 이중 나선 DNA에 대한 자가-항체의 생성 가능성에 관한 우려 때문에 추가의 규제하는 정밀조사 (regulatory scrutiny)에 직면해 있다.

플라비바이러스 백신 개발을 위한 재조합 서브유닛 단백질의 사용은 비-복제 바이러스 방법의 또 다른 예이다. 상기 방법은 잘 규정된 제품의 생산 및 특이적 면역 반응을 유도하는 가능성에서 잇점을 제공한다. 관련된 강건한 면역 반응을 생성하는 가능성이 존재하지만, 재조합 서브유닛의 사용과 연관된 도전과제가 존재한다. 이것은 단백질의 품질 (천연-유사 구조) 및 목적하는 면역 반응을 유도하는데 아주반트에 대한 필요 둘 모두 때문이다. 재조합 서브유닛 백신은 안전성 및 보호 효능이 오래전에 입증되었고, 이것은 재조합 서브유닛 B형 간염 백신 (예를 들어 레콤비박스 에이치비(RECOMBIVAX HB)® (머크 샤프 앤 돔 코프. (Merck Sharp & Dohme Corp., 미국 뉴저지주 화이트하우스 스테이션)) 및 엔게릭스 비(ENGERIX B)® (글락소스미스클라인 바이올로지칼스 에스에이 코프. (GlaxoSmithKline Biologicals SA Corp., 벨기에)), 및 보다 최근에 인간 유두종 바이러스 백신 (예를 들어 가다실(GARDASIL)® (머크 샤프 앤 돔 코프.) 및 서바릭스(CERVARIX)® (글락소스미스클라인 바이올로지칼스 에스에이 코프.))에 의해 가장 효과적으로 예시된다. 생산하는 동안 임의의 시점에 복제 바이러스가 존재하지 않는다는 사실은 예방 상황에서 건강한 또는 면역손상 개체에게 서브유닛 백신의 투여와 연관된 위험이 매우 한정된 것을 보장하는 것에 도움이 된다. 또한, B형 간염 및 인간 유두종 바이러스 백신은 고도로 면역원성이고 효력이 있는 것으로 나타났다.

재조합 플라비바이러스 단백질의 발현은 구조 단백질 C, prM 및 E와 비-구조 단백질 NS1에 집중되었다. E 단백질이 바이러스의 표면 상에 노출되어 있고, 바이러스의 중요한 생물학적 측면에 관여하고, 감염된 숙주에서 중화 항체의 표적이므로 이 단백질이 대부분의 노력의 주제가 되었다 (문헌 [Chambers, 상기 문헌]; [Mason, P. W., J. Gen Virol (1989) 70:2037-2048]). 또한, 정제된 플라비바이러스 E 단백질에 대해 생성된 모노클로날 항체는 시험관 내에서 중화성이고, 일부는 생체 내에서 수동 보호를 부여하는 것으로 나타났다 (문헌 [Henchal, E.A. et al., Am. J. Trop. Med. Hyg (1985) 34:162-169]; [Heinz, F. X. et al., Virology (1983) 130:485-501]; [Kimura-Kiroda, J. and Yasui, K., J. Immunol. (1988) 141:3606-3610]; [Trirawatanapong, T. et al., Gene (1992) 116:139-150]).

백신에서 사용하기 위한 재조합 플라비바이러스 단백질을 생산하기 위한 목표를 위해, 다양한 발현 시스템, 예컨대 이. 콜라이 (E. coli), 효모 및 바큘로바이러스가 이용되었다. 이들 시도에는 낮은 수율, 플라비바이러스 단백질의 부적합한 처리, 및 중간 내지 불량한 면역원성이 문제가 되었다 (문헌 [Eckels and Putnak, 2003]). 재조합 단백질이 강력한 면역원으로서 역할을 하기 위해서는 E 단백질의 천연-유사 구조를 유지할 필요가 있다. 천연-유사 구조를 갖는 재조합 E 단백질을 생산하는 능력은 사용된 발현 시스템에 매우 의존적이다. 미국 특허 6,165,477에서는 효모 세포에서 DEN E 단백질 서브유닛을 발현시키는 공정을 개시한다. 효모 세포에서 발현된 E 서브유닛은 세균 시스템에 비해 개선된 구조를 보였지만, 여전히 과다-글리코실화 및 수율의 문제에 직면하고 있다.

보다 최근의 연구에서, 말단절단된 (truncated) 형태의 E 단백질을 발현하도록 안정하게 형질전환된 곤충 세포의 사용은 X-선 결정학에 의해 결정할 때 천연-유사 구조를 유지하는 생성물을 생성시키는 것이 확립되었다 (문헌 [Modis et al., 2003]; [Modis et al., 2005]; 및 [Zhang et al., 2004]). 안정하게 형질전환된 곤충 세포 시스템의 사용은 말단절단된 재조합 플라비바이러스 E 단백질, 예컨대 DEN 혈청형 1-4, JE, TBE 및 WN의 성공적인 발현을 일으켰다. 미국 특허 6,136,561에서는 안정하게 형질전환된 곤충 세포에서 DEN, JE, TBE 및 YF E 서브유닛 단백질의 발현을 위한 공정을 개시한다. 아이비 등의 미국 특허 6,432,411에서는 사포닌 함유 이스콤-유사 구조와 조합할 때 후보 백신으로서 안정하게 형질전환된 곤충 세포에서 발현된 (DEN-2 외피 폴리펩티드의 아미노산 1-395에 동등한) 플라비바이러스 E 서브유닛 단백질의 효용성을 개시하고 있다. 아이비 등은 4가지 모든 DEN 형 (DEN 1-4)으로부터의 80% E 단백질을 포함하는 4가 서브유닛 백신, 및 DEN 1-4 80% E 및 이스코매트릭스® 아주반트를 포함하는 조성물을 추가로 보고하였다. 원숭이에서 상기 4가 백신의 면역원성 및 보호 효능을 분석하는 소규모 파일럿 (pilot) 연구가 수행되었다 (문헌 [Clements et al., Vaccine 28: 2705-15 (2010)]; [Coller et al. Vaccine 29: 7267-75 (2011)). 백신은 하나 초과의 뎅기 종류에 대해 중화 항체 및 보호 면역을 유도하는 것으로 언급되었다. 미국 특허 6,749,857에서는 이량체 형태의 말단절단된 뎅기 외피 단백질, 예컨대 본원에 설명된 DEN4-80EZip의 발현을 개시한다. 미국 특허 6,416,763에서는 재조합 E-기반 백신 제제에서 안정하게 형질전환된 곤충 세포주에 의해 생산된 비-구조 단백질 1 (NS1)을 포함시키는 잇점을 설명하고 있다. 이들 특허는 동물 모델에서 사포닌 함유 이스콤-유사 구조와 조합할 때 안정하게 형질전환된 곤충 세포로부터 발현된 플라비바이러스 서브유닛의 효용성을 입증한다. 그러나, 이들 특허는 인간 대상체에서 면역원성을 나타낸 아주반트와 제제화된 E에만 전적으로 기반한 백신 제제를 다루거나 예측하지 않았다. 많은 백신 후보가 동물 모델에서 잠재적인 효능을 나타냈지만, 인간에게 사용하기 위해 성공적으로 이행되지 못하였다.

일반적으로, 비-복제 바이러스 백신 방법, 예컨대 불활성화시킨 바이러스, 재조합 서브유닛 단백질 및 DNA의 사용은 생 약독화 바이러스 백신 방법에 비해 몇가지 잇점이 있다. 살아있는 바이러스가 대상체에게 전달되지 않으므로 주로 이들 잇점은 안전성에 관련된다. 다른 잇점은 투여량 및 아주반트 첨가를 조정함으로써 면역 반응을 조정하고 균형잡는 능력, 및 생 약독화 바이러스에 비해 투여 스케줄을 가속화하는 능력을 포함한다.

인간을 위한 플라비바이러스 백신의 개발에서, 동물 모델에서의 전임상 데이터를 기초로 하여 인간 대상체에서 후보 백신의 안전성 및 면역원성을 예측하는 것은 어려웠다. 이것은 인간 임상 시험을 진행하는 많은 생 약독화 바이러스 백신 후보에 대해 도전하는 것으로 입증되었다. 완전한 실패의 가장 두드러지는 예는, 비-인간 영장류에서 매우 매력적인 안전성 프로파일을 보였지만 홍콩의 백신 수여자에서 뎅기열을 유발한 클로닝된 뎅기 바이러스 종류 3 단리물에서 나타난 안전성 프로파일이었다 (문헌 [Sanchez et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol. (2006) 24:4914-26]). 상기 도전과제는 복제 바이러스 백신만큼 백신 효능을 달성하기 위해 동일한 수준의 바이러스/숙주 상호작용을 요구하지 않는 비-복제 바이러스 백신의 사용에 의해 감소될 수 있다. 그러나, 전임상 모델에서 우수한 안전성 및 보호 효능을 나타냈지만 인간에서 안전하고 효과적인 백신으로서 기능하는데 실패한 비-복제 바이러스 백신 후보의 수많은 예가 존재한다 (예를 들어 불활성화시킨 RSV 백신; 문헌 [Murphy et al., J. Clin. Microbiol. (1986) 24:197-202]). 따라서, 플라비바이러스에 대한 안전하고 효과적인 백신을 개발하는데 연관된 다수의 도전과제가 있을 수 있고, 개발에는 종종 수년간의 시행착오가 요구된다. 또한, 동물 모델에 기반한 전임상 연구는 인간 대상체에서 백신 성능을 예측할 수 없고, 따라서, 인간 데이터가 후보 백신의 가능성을 입증하는데 중요하다.

전임상 연구 및 개발의 다양한 단계에 수많은 조사용 뎅기 백신이 존재하지만 단지 6개의 백신 후보가 인간 임상 시험으로 진행하였다. 임상 연구로 시험된 6가지 백신은 (1) 생 약독화 뎅기 혈청형 4 키메라 (예를 들어 문헌 [Durbin et al. 2006, Human Vaccines 2: 167]; [Blaney et al., 2005, J. Virol. 79:5516]); (2) 생 약독화 황열병-뎅기 키메라 (키메리박스 (Chimerivax); 예를 들어 문헌 [Morrison et al., 2010, J. Inf. Dis. 201:370]); (3) 월터 리드 육군 연구소 (Walter Reed Army Institute of Research)에서 개발된 고전적으로 약독화시킨 바이러스 백신 (예를 들어 문헌 [Sun et al., 2009, Human Vaccines 5:33]); (4) 생 약독화 뎅기 혈청형 2 키메라 (예를 들어 문헌 [Huang et al., 2003, J. Virol. 77:11436)]; (5) prM-E를 발현하는 DNA-기반 백신 (문헌 [Raviprakash et al., 2006, Virology 353:166]); 및 (6) 마히돌 유니버시티 (Mahidol University)에서 개발된 고전적으로 약독화시킨 바이러스 백신 (예를 들어 문헌 [Bhamarapravati et al., 1987])이다. 그러나, 각각의 후보 백신과 연관된 고유한 어려움 및 잠재적인 단점이 존재한다.

뎅기에 대한 생 약독화 바이러스 방법과 관련된 추가의 문제는 4가 백신 내의 4개의 독립적으로 복제하는 바이러스의 조합과 연관된 도전과제를 포함한다. 간섭의 문제는 현재까지 시험된 모든 4가 제제에서 문제가 되었고, 균형이 잡히지 않은 4가 면역 및 연장된 간격 (예를 들어 0, 6, 12개월)으로 3회 용량을 투여할 필요성을 유발하였다. 이것은 결코 이상적이지 않으며, 부분적으로 면역화되고 야생형 바이러스에 노출된 개체는 악화된 질환 (예를 들어 뎅기 출혈열)의 위험이 더 높을 수 있기 때문에 이들 개체에 대해 안정성 문제를 제시할 수 있다.

임상 시험으로 시험된 마지막 뎅기 백신은 DNA 백신이다. 네이키드 DNA 백신은 현재 시기에 임의의 감염성 질환에 대해 증명되지 않았고, 장기간에 걸친 DNA에 대한 자가면역 반응의 유도로 인한 잠재적인 면역병리학의 문제가 해결되지 않았다. 시험된 백신 제제에 의해 바이러스 중화 항체가 유도되지 않거나 적게 유도되었고, 이것은 잠재적인 효능의 결핍을 제안한다.

본원에서 설명되는 본 발명의 한 측면은 재조합 발현 시스템을 이용하여 생산 및 분비되고 백신 제제 (예를 들어 HBV-001 D1) 내에 아주반트와 함께 조합되는 서브유닛 뎅기 바이러스 외피 당단백질 (예를 들어 DEN1-80E, DEN2-80E, DEN3-80E, DEN4-80E, 또는 DEN4-80EZip)을 제공한다. 개시된 백신은 인간 지원자에서 상동성 뎅기 바이러스에 대한 바이러스 중화 항체 반응을 유도하는데 효과적이고, 건강한 인간 대상체 및 위험에 있는 인간 대상체에 대해 허용되는 안전성 프로파일을 갖는다.

이를 위해, 본 발명의 한 측면은 유효량의 혈청형 DEN-1, DEN-2, DEN3, 및 DEN-4의 정제된 뎅기 바이러스 외피 ("E") 단백질, 제약상 허용되는 부형제, 및 유효량의 아주반트를 포함하며, 여기서 E 단백질은 각각 그의 N-말단에서 아미노산 잔기 1로부터 시작하여 야생형 E의 길이의 약 80%를 구성하여, 상기 E 단백질이 숙주 세포 내에서 재조합 방식으로 발현될 때 성장 배지 내로 분비가능하고, DEN-4 E 단백질은 이량체 ("DEN4-80EZip")인, 인간 대상체에서 중화 항체의 생산을 유도하는 면역원성 조성물을 제공한다. 본 발명의 상기 측면의 바람직한 실시양태에서, 상기 설명된 조성물 내의 E 단백질은 곤충 숙주 세포 내에서 재조합 방식으로 생산되고 발현된다. 추가의 바람직한 실시양태에서, E 단백질을 아래 설명할 바와 같이 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster) 슈나이더 (Schneider) 2 (S2) 숙주 세포 내에서 재조합 방식으로 생산하고 발현시킨다.

본 발명의 재조합 서브유닛 뎅기 바이러스 E 단백질은 드로소필라 슈나이더 2 (S2) 세포를 이용하는 세포 배양 발현 시스템에 의해 생산된다. 상기 시스템은 천연-유사 구조를 유지하는 뎅기 재조합 외피 단백질을 생산하는 것으로 입증되었다 (문헌 [Cuzzubbo et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. (2001) 8:1150-55]; [Modis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (2003) 100:6986-91]; [Modis et al., Nature (2004) 427:313-9]; [Zhang et al., Structure (2004)12(9): 1607-18]). 상기 발현 시스템은 또한 다른 플라비바이러스, 예컨대 웨스트 나일, 일본 뇌염, C형 간염, 및 진드기 매개 뇌염 바이러스로부터의 다른 재조합 외피 단백질을 발현하는 것으로 나타났다. 재조합 외피 단백질은 대개 C-말단에서 말단절단되어, 천연 외피 단백질의 80% ("80E")를 남긴다. 따라서, 80E는 그의 N-말단의 아미노산 1에서 시작하여 E 단백질의 연속 아미노산의 대략 처음 80%로서 정의된다.

본 발명에서 사용된 말단절단된 80E 단백질의 범위는 단백질의 막 고정 부분 (카르복시 단부에서 E의 대략 마지막 10%)을 제거하고, 즉, 그의 N-말단의 아미노산 1에서 시작하여 E의 연속 아미노산의 처음 90%까지이어서, 세포외 배지 내로 분비되도록 허용하여 회수를 용이하게 한다. 말단절단은 80E 부분을 막 고정 부분과 연결하는 E 단백질의 "줄기 (stem)" 부분을 추가로 제거하고, 줄기 부분은 현저한 항원성 에피토프를 함유하지 않으므로, 바람직한 항원, DEN1-80E, DEN2-80E, DEN3-80E, DEN4-80E, 또는 DEN4-80EZip 내에 포함되지 않는다. 90% 초과, 그러나 100% 미만의 E 단백질을 클로닝하고 분비시킬 수 있고, 즉, 단백질은 길이가 90%+이고, 카르복시 말단절단될 수 있고, 말단절단된 E 단백질이 분비가능한 한 막 걸침 도메인의 일부를 포함할 수 있다. "분비가능한"은 발현 시스템에서 형질전환된 세포로부터 분비될 수 있는, 대개 분비되는 것을 의미한다. 따라서, 당업자는 단백질이 분비가능한 한, 본 발명의 조성물 및 방법에서 유용한 뎅기 E 단백질이 본원에 예시된 80%로부터 다양할 수 있음을 알 것이다. 본 발명의 각각의 측면의 바람직한 실시양태에서, DEN E 단백질은 길이가 외피 단백질의 N-말단 아미노산으로부터 시작하고 395번째 내지 401번째 아미노산의 범위의 아미노산에서 끝나는 약 80%, 예를 들어, 뎅기 바이러스 종류 2의 아미노산 1 내지 아미노산 395이다. 본 발명의 각각의 측면의 별도의 실시양태에서, 뎅기 E 단백질은 그의 N-말단의 아미노산 1에서 시작하여 E의 연속 아미노산의 약 75%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 98%일 수 있다. 본 발명의 측면의 예시적인 실시양태에서, DEN E 단백질은 그의 N-말단의 아미노산 1에서 시작하여 E 단백질의 연속 아미노산의 약 80%, 예컨대 서열 6에 제시된 DEN1-80E, 서열 7에 제시된 DEN2-80E, 서열 8에 제시된 DEN3-80E, 및 서열 9에 제시된 DEN4-80E이다.

분비된 E 단백질은 재조합 단백질의 면역원성이 추가로 향상되도록, DEN4-80EZip 단백질에서와 같은 이량체화를 용이하게 하는 도메인을 추가로 함유할 수 있다. 예시적인 DEN4-80EZip 단백질은 서열 10에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 4가지 뎅기 바이러스로부터의 이량체 및 단량체 형태의 재조합 E 단백질을 조합함으로써, 균형잡힌 4가 반응이 유도되도록 면역 반응을 조정할 수 있다. 재조합 뎅기 바이러스 80E 서브유닛 단백질이 인간에 사용하기 위해 적절하게 제제화될 때 이들은 인간 대상체에서 강력한 바이러스 중화 항체를 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명은 핵심적인 기술적 문제에 대한 신규한 해법을 제공한다: 인간 대상체에서 높은 수준의 안전성 및 균형잡힌 4가 면역원성을 모두 나타내는 뎅기 바이러스 백신의 생산.

아주반트

본 발명의 백신 제제/면역원성 조성물은 인간에 사용하기에 적합한 적어도 하나의 아주반트를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 뎅기 80E 재조합 서브유닛 단백질은 사포닌-기반 ("이스콤-유사") 아주반트 (예를 들어 이스코매트릭스® 아주반트) 및/또는 알루미늄-기반 아주반트 (종합적으로 "백반 (alum)" 또는 "백반-기반 아주반트")와 제제화된다.

오랫동안 알루미늄은 주로 T_H2 반응을 자극함으로써 동시투여한 항원에 대한 면역 반응을 자극하는 것으로 나타났고, 알루미늄-기반 아주반트는 미국에서 인간에 사용하기 위해 등록된 최초의 아주반트였다. 본원에서 설명되는 뎅기 80E 항원에 추가로, 본 발명의 상기 측면의 조성물은 알루미늄 아주반트, 예컨대 수산화알루미늄, 인산알루미늄 또는 그의 혼합물에 흡착된다. 본원에서 제공되는 조성물의 알루미늄 아주반트는 알루미늄 침전물의 형태로 존재하지 않는 것이 바람직하다. 알루미늄-침전된 백신은 표적 항원에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있지만, 고도로 비균질한 제제인 것으로 나타났고 일관성 없는 결과를 가졌다 (문헌 [Lindblad E.B. Immunology and Cell Biology 82: 497-505 (2004)] 참조). 이와 대조적으로, 알루미늄-흡착된 백신은 인간에 투여하기 위한 백신 제제의 필수 특징인 표준화 방식으로 수행될 수 있다. 또한, 알루미늄 아주반트 상으로 목적하는 항원을 물리적으로 흡착시키는 것은 아마도 부분적으로 주사 부위에서 보다 느리게 제거되도록 함으로써 또는 항원 제시 세포에 의한 항원의 보다 효율적인 흡수를 허용함으로써 아주반트 기능에 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다.

백반-기반 아주반트는 적어도 부분적으로 데포 (depot) 메카니즘을 통해 기능하는 것으로 생각되고, 천연-유사 구조를 갖는 재조합 뎅기 80E 항원 및 백반의 아주반트 효과를 조합시키면 면역결핍 인구집단의 구성원을 비롯한 백신접종한 개체에서 강력한 면역 반응을 유도하기 위해 충분하다.

본 발명의 알루미늄 아주반트는 수산화알루미늄 (Al(OH)₃), 인산알루미늄 (AlPO₄), 알루미늄 히드록시포스페이트, 무정형 알루미늄 히드록시포스페이트 술페이트 (AAHS) 또는 소위 "백반" (KAl(SO₄)₂·12H₂O)의 형태로 존재할 수 있다 (문헌 [Klein et al., Analysis of aluminum hydroxyphosphate vaccine adjuvants by (27)Al MAS NMR., J. Pharm. Sci. 89(3): 311-21 (2000)] 참조). 본원 발명의 예시적인 실시양태에서, 알루미늄 아주반트는 수산화알루미늄이다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 알루미늄 아주반트는는 AAHS (본원에서 상호교환가능하게 머크 알루미늄 아주반트 (MAA)로서 칭한다)의 형태로 존재한다. MAA는 중성 pH에서 0 전하를 운반하는 반면, AlOH는 순수 양전하를 운반하고, AlPO₄는 중성 pH에서 대개 순수 음전하를 운반한다. 잠재적으로 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 알루미늄 아주반트의 순수 전하 때문에, MAA가 일부 항원에 결합하는 능력이 AlOH보다 더 크다. 본 발명의 또 다른 예시적인 실시양태에서, 알루미늄 아주반트는 알히드로겔 (Alhydrogel)이다.

당업자는 안전하면서도 백신 조성물의 표적화된 뎅기 80E 항원에 대한 면역 반응을 증가시키는데 효과적인 알루미늄 아주반트의 최적 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 알루미늄의 안전성 프로파일, 및 FDA-허가된 백신 내에 포함된 알루미늄의 양에 대한 논의에 대해서는 문헌 [Baylor et al., Vaccine 20: S18-S23 (2002)]을 참조한다. 일반적으로, 알루미늄 아주반트의 효과적이고 안전한 용량은 200 내지 1200 ㎍/mL 농도로 다양하다. 본 발명의 특정한 실시양태에서, 백신은 1.0 내지 3.5 mg/mL 알루미늄 아주반트 (1.25 mg까지의 원소 알루미늄)를 포함한다. 본 발명의 제제 및 조성물의 별도의 실시양태에서, 백신의 용량당 약 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 또는 500 ㎍의 알루미늄 아주반트가 존재한다.

알루미늄-기반 아주반트와의 제제는 ≥75%의 항원이 수산화알루미늄에 결합되도록 뎅기 80E 항원이 알루미늄 아주반트, 예를 들어 알히드로겔에 결합하도록 허용되는 혼합물을 포함한다. 임상 개발을 지지하기 위해 cGMP 하의 DEN1-80E + 알히드로겔 백신 (HBV-001 D1)의 제제화 및 충전을 실시예 3에서 설명한다.

상기 진술한 바와 같이, 본 발명의 한 측면은 뎅기 80E 항원을 아주반트와 조합으로 포함하는 백신 및 조성물을 제공한다. 바람직한 아주반트는 이스콤 아주반트이다. 본원에서 제공되는 제제 및 방법에서, 이스콤 아주반트는 사포닌, 콜레스테롤, 및 인지질을 포함하고, 면역-자극 복합체 또는 이스콤을 형성한다. 일반적으로 퀼라이아 사포나리아 (Quillaia saponaria) 나무의 수피로부터 단리된 사포닌의 강력한 아주반트 활성은 80년도 더 전에 처음 문서화되었다 (검토를 위해, 문헌 [Barr and Mitchell, Immunology and Cell Biology 74: 8-25 (1996)]; 및 [Skene and Sutton, Methods 40: 53-59 (2006)] 참조). 알루미늄 아주반트에 비해, 이스콤-형 아주반트 또는 이스콤은 T-세포 및 항체 반응을 모두 포함한, 동시-투여된 항원에 대해 보다 넓은 면역 반응을 불러일으킬 수 있다. 그러나, 독성 및 용혈 활성에 대한 가능성이 발견되어, 그 시기에 인간 또는 동물 사용을 위한 사포닌의 장래성을 제한하였다.

그 이래로, 사포닌을 콜레스테롤 및 인지질과 조합할 때 20개 이상의 서브유닛으로 이루어진 새장형-유사 구조를 갖는 특징적인 입자를 형성하는 것이 밝혀졌다. 상기 독특한 구조는 이스콤의 아주반트 활성에 기여한다. 추가로, 사포닌을 콜레스테롤 및 인지질과 함께 이스콤 내로 포함시키면 사포닌의 용혈 활성을 제거하는 것으로 나타났다. 유리 사포닌에 비해 이스콤을 아주반트로서 사용할 때 면역 반응을 유도하기 위해 더 적은 아주반트가 필요한 것으로 또한 나타났다 (Skene and Sutton, 상기 문헌 참조). 이들 이유로 인해, 이스콤은 잠재적인 백신 아주반트로서 집중적으로 연구되었다.

이를 위해, 본 발명은 뎅기 80E 항원, 이스콤 아주반트, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하며, 여기서 상기 이스콤-아주반트는 사포닌, 콜레스테롤, 및 인지질을 포함하고, 상기 뎅기 80E 항원은 그의 N-말단에서 아미노산 잔기 1로부터 시작하여 야생형 E의 길이의 약 80%를 구성하여, 상기 E 단백질이 숙주 세포 내에서 재조합 방식으로 발현될 때 성장 배지 내로 분비가능한 것인, 제약 조성물에 관한 것이다. 상기 설명된 조성물은 알루미늄 염 아주반트를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 측면의 바람직한 실시양태에서, 조성물 내에 포함된 DEN1, DEN2, 및 DEN3 80E 항원은 단량체이고, DEN4 80E 항원은 이량체이다. 단량체 형태의 DEN1, DEN2, 및 DEN3 80E 단백질 서브유닛 및 이량체 형태의 DEN4 (DEN4-80EZip)를 포함하는 4가 조성물이 붉은털 원숭이에서 균형잡힌 4가 면역 반응을 유도할 수 있고 바이러스 유발검사에 대해 보호를 제공할 수 있음을 본원에서 보여준다 (실시예 6 참조). 상기 설명된 조성물은 알루미늄 염 아주반트를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 측면의 별도의 실시양태에서, 조성물 내의 DEN1-80E, DEN2-80E, DEN3-80E 및 DEN4-80E 단백질은 단량체이다. 그러한 실시양태에서, DEN4 성분은 DEN1, DEN2, 및 DEN3 단백질의 개별적인 양의 약 1.5 내지 약 3배, 바람직하게는 DEN1, DEN2, 및 DEN3 성분 (단백질)의 양의 약 2배의 양으로 존재한다.

본 발명의 상기 측면의 예시적인 실시양태에서, 이스콤 아주반트는 이스코매트릭스® 아주반트, 사포닌-기반 아주반트이다. 이스코매트릭스® 아주반트 함유 제제는 80E 항원이 아주반트와 함께 전달되는 혼합물을 포함한다.

본 발명의 별도의 실시양태에서, 백신 조성물은 알루미늄-기반 아주반트 및 이스콤 또는 사포닌-기반 아주반트 둘 모두와 함께 제제화된다.

뎅기 바이러스 외피 단백질 서브유닛

단량체 형태의 DEN1-80E, DEN2-80E, 및 DEN3-80E 단백질 서브유닛 및 이량체 형태의 DEN4 (DEN4-80EZip)를 포함하는 4가 조성물이 붉은털 원숭이에서 균형잡힌 4가 면역 반응을 유도할 수 있고 바이러스 유발검사에 대해 보호를 제공할 수 있음을 본원에서 보여준다 (실시예 6 참조). 따라서, 본 발명의 상기 측면의 일부 바람직한 실시양태에서, 조성물 내에 포함된 DEN1, DEN2 및 DEN3 80E 항원은 단량체이고, DEN4 80E 항원은 이량체이다. 뎅기 80E 단백질 이량체의 형성을 아래에 설명한다.

DEN4 항원 성분 (DEN4-80E 또는 DEN4-80EZip)의 양이 조성물 내에 존재하는 DEN1-80E, DEN2-80E, 또는 DEN3-80E 항원의 양의 약 2배 이도록 DEN4-80E 성분의 항원 함량을 조정함으로써, 4가지 모든 뎅기 종류에 대한 높은 균형잡힌 면역 반응을 달성할 수 있음을 또한 본원에서 보여주었다 (실시예 7 참조). 따라서, 본 발명은 유효량의 혈청형 DEN1-80E, DEN2-80E, DEN3-80E, 및 DEN4-80E의 정제된 뎅기 바이러스 외피 ("E") 단백질, 제약상 허용되는 부형제, 및 유효량의 아주반트를 포함하며, 여기서 E 단백질은 각각 그의 N-말단에서 아미노산 잔기 1로부터 시작하여 야생형 E의 길이의 약 80%를 구성하여, 상기 E 단백질이 숙주 세포 내에서 재조합 방식으로 발현될 때 성장 배지 내로 분비가능하고, DEN4 성분의 항원 함량은 DEN1, DEN2, 또는 DEN3 성분의 개별적인 항원 함량의 약 1.5 내지 약 3배인, 인간 대상체에서 중화 항체의 생산을 유도하는 면역원성 조성물을 제공한다. 본 발명의 상기 측면의 바람직한 실시양태에서, 조성물 내의 DEN1:DEN2:DEN3:DEN4 항원의 비는 약 1:1:1:2이다.

본 발명의 상기 측면의 일부 실시양태에서, DEN4 성분은 DEN4-80E이다. 따라서, 조성물은 DEN1-80E, DEN2-80E, DEN3-80E 및 DEN4-80E의 단량체를 포함한다. 본 발명의 상기 측면의 별도의 실시양태에서, DEN4 성분은 DEN4-80EZip이다. 그러한 별도의 실시양태에서, 조성물은 DEN1-80E, DEN2-80E, 및 DEN3-80E의 단량체 및 DEN4-80EZip의 이량체를 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본원에 설명되는 뎅기 바이러스 백신 제제의 재조합 단백질 성분(들) (DEN1-80E, DEN2-80E, DEN3-80E, DEN4-80E, 및/또는 DEN4-80EZip)은 진핵 세포 배양 발현 시스템, 구체적으로 드로소필라 멜라노가스터 S2 세포 시스템에서 생산한다 (문헌 [Johansen, H. et al., Genes Dev. (1989) 3:882-889]; [Ivey-Hoyle, M, Curr. Opin. Biotechnol. (1991) 2:704-707]; [Culp, J.S., et al., Biotechnology (NY) (1991) 9:173-177]). 상기 발현 방법은 플라비바이러스로부터 말단절단된 재조합 외피 단백질, 예컨대 뎅기 혈청형 1-4, JE, TBE 및 WN을 성공적으로 생산한다. 이들 단백질은 C-말단에서 말단절단되어, 천연 외피 단백질의 약 80%를 남긴다 (80E). 말단절단은 단백질의 막 고정부를 제거하고, 따라서 세포외 배지로 분비되도록 허용하여, 회수를 용이하게 하고, 말단절단은 또한 면역원성 효과가 거의 없는 줄기 부분을 제거한다. 또한, 발현된 단백질은 적절하게 글리코실화되고, 입체형태적으로 감수성 모노클로날 항체, 4G2와의 반응성에 의해 결정할 때 천연 입체형태를 유지하는 것으로 나타났다.

본원에서 사용되고 이전에 설명된 바와 같이 (미국 특허 번호 6,136,561 (Ivy et al.); 미국 특허 번호 6,165,477 (Ivy et al.); 미국 특허 번호 6,416,763 (McDonell et al.); 미국 특허 번호 6,432,411 (Ivy et al.); 및 미국 특허 번호 6,749,857 (Peters et al.), DEN1-80E, DEN2-80E, DEN3-80E, DEN4-80E, 및 DEN4-80EZip은 뎅기 외피 단백질에 걸치는 단백질, 바람직하게는 외피 단백질의 N-말단 아미노산으로부터 시작하고 395번째 내지 401번째 아미노산의 범위의 아미노산에서 끝나는 단백질을 나타내고, 예를 들어, 그러한 80E는 뎅기 바이러스 종류 2의 아미노산 1 내지 395를 포함하는 단백질일 수 있다. 미국 특허 번호 6,749,857 (Peters et al.)에 설명된 바와 같이, 재조합 80E 단백질은 임의로 플로피 링커 (linker)에 의해 80E 단백질에 연결된 이량체화 도메인을 함유할 수 있다 (예를 들어 DEN4-80EZip). 이량체 형태의 단백질을 포함시키는 것은 선택된 성분에 대한 면역 반응을 조정하기 위해 사용되고, 균형잡힌 4가 반응을 유도한다. DEN-80E 단백질의 발현을 실시예 1에 설명한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, DEN4 단백질 성분이 이량체인 4가 조성물을 제공한다 (예를 들어 DEN4-80EZip).

이량체 80E 단백질 서브유닛, 예를 들어 DEN4 80E 이량체는 당업계에 공지된 수단에 의해 생산할 수 있다 (예를 들어 미국 특허 번호 US 6,749,857 B1 (Peters et al.) 참조). 간단히 설명하면, 이량체 80% E 분자를 구성하기 위한 3가지 기초적인 방법이 상기 문헌 (Peters et al.)에 설명되어 있다. 제1 방법은 가요성 링커에 의해 서로에 공유 부착된 80% E의 탠덤 카피 (tandem copy)의 사용을 수반한다. 2개의 카피의 DEN2 80% E를 공유 연결하는 아미노산의 스트레치 (stretch)는 2개의 80% E 분자가 서로에 대한 공유 부착을 유지하면서 천연 머리-꼬리 (head-to-tail) 이량체 배향으로 회합하도록 허용하는 가요성 테터 (tether)로서 기능하도록 설계된다. 다른 링커 서열을 또한 선택하는 것은 당업자에게 쉽게 명백해질 것이다. 본 발명은 개시된 특정 링커에 제한되지 않고, 대신에 2개의 80% E 분자가 서로에 대한 공유 부착을 유지하면서 천연 머리-꼬리 이량체 배향으로 회합하도록 허용하는 임의의 아미노산 서열을 포함한다.

제2 방법은 2개의 80% E-류신 지퍼 (leucine zipper) 분자 사이에서 이량체화를 향상시키기 위해 단량체 80% E에 카르복시-말단 류신 지퍼 도메인의 첨가를 수반한다. 이 방법의 2개의 버전을 채택할 수 있다. 하나의 버전은 공유 연결된 이량체 생성물을 생성시키는 류신 지퍼 도메인을 연결하는 디술피드 결합을 포함하는 한편, 다른 버전은 류신 지퍼 도메인의 비-공유 회합을 기반으로 한다. 류신 지퍼 도메인은 또 다른 80% E 지퍼 분자로부터의 동일한 서열과 이량체화하도록 설계된다. 비-공유 연결된 류신 지퍼의 형성은 80% E 분자의 이량체화를 향상시킬 것이고, 이것은 80% E 분자를 류신 지퍼 도메인과 연결시키는 가요성 링커에 의해 천연 머리-꼬리 입체형태로 회합할 수 있다. 류신 지퍼 도메인은 또 다른 80% E 지퍼 분자로부터의 동일한 서열과 이량체화하도록 설계된다. 일단 류신 지퍼가 이량체화하면, 디술피드 결합이 2개의 단부 사이에서 형성되어, 공유 연결된 이량체 생성물을 생성시킨다. 공유 연결된 류신 지퍼의 형성은 80% E 분자의 이량체화를 향상시킬 것이고, 이것은 80% E 분자를 류신 지퍼 도메인과 연결시키는 가요성 링커에 의해 천연 머리-꼬리 입체형태로 회합할 수 있다.

80% E의 이량체화를 향상시키기 위해 사용된 최종 방법은 80% E의 카르복시 말단 단부에 나선-회전-나선 (helix-turn-helix) 도메인의 추가이다. 하나의 변형된 80% E 분자로부터의 나선-회전-나선 도메인은 또 다른것과 회합하여 이량체 4-나선 다발 (bundle) 도메인을 형성할 것이다. 비-공유 회합된 4개 나선 다발 도메인의 형성은 80% E 분자의 이량체화를 향상시킬 것이고, 이것은 80% E를 나선 다발에 연결시키는 가요성 링커에 의해 천연 머리-꼬리 입체형태로 회합할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, DEN-80E는 Cys1-Cys2, Cys3-Cys8, Cys4-Cys6, Cys5-Cys7, Cys9-Cys10 및 Cys11-Cys12에서 6개의 디술피드 가교를 포함하는 뎅기 바이러스 외피 단백질 서브유닛으로서 보다 넓게 규정되며, 여기서 단백질은 드로소필라 세포로부터 재조합 단백질로서 분비되고, 단백질은 인간 대상체에게 투여될 때 상동성 플라비바이러스에 대한 중화 항체 반응을 생성한다.

보다 바람직한 실시양태에서, 재조합 뎅기 바이러스 외피 단백질 서브유닛은 천연 뎅기 바이러스 외피 단백질의 N-말단에서 제1 아미노산으로부터 시작하는 외피 단백질의 상동성 80% 부분 (80E)의 친수성 프로파일 특징 및 설명된 디술피드 패턴을 추가로 포함한다. 즉, 재조합 서브유닛 단백질이 천연-유사 구조 및 적절한 면역원성 (바이러스 중화 항체를 유도하는 능력)을 보유하도록 보장하기 위해 디술피드 및 친수성 프로파일이 유지되는 한, 뎅기 바이러스 80E를 포함하는 서열 내에서 아미노산이 치환될 수 있다.

바람직하게는, 뎅기 바이러스 80E 서브유닛은 혈청 비함유 배지 내에서 MCB (Master Cell Bank)를 사용하여 발현되고, 이전에 설명된 바와 같이 크로마토그래피에 의해 정제된다 (미국 특허 번호 6,432,411 (Ivy et al.)). 임상 시험을 지지하기 위해 cGMP 하의 DEN1-80E의 배치 (batch)의 제조를 실시예 2에 설명한다.

동물에서 시험된 뎅기 바이러스 제제 내에 비-구조 단백질, 예컨대 비-구조 단백질 1 (NS1)의 포함에 대해 설명된 추가의 이익과는 반대로 (McDonell et al., US 6,416,763), 본 발명의 DEN-80E 단백질은 NS1을 포함시키지 않을 때에도 인간 대상체에서 강력한 면역원성 백신으로서 기능을 한다.

투여 및 용도

본 발명은 뎅기 바이러스에 의한 감염으로 인해 발생하는 질환을 예방 또는 약화시키는 수단을 제공한다. 본원에서 사용될 때, 백신은 개체에 백신을 투여할 때 질환에 대한 개체의 전체적 또는 부분적 면역을 일으키는 경우 또는 질환과 연관된 증상 또는 병태의 전체적 또는 부분적 약화 (즉, 억제)를 일으키는 경우에 질환을 예방 또는 약화시키는 것으로 말해진다.

따라서, 본 발명은 치료 유효량의 명세서 전체에서 임의의 곳에 설명된 면역원성 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 환자에서 보호 면역 반응을 일으키는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 치료 조성물은 피하, 근육내, 또는 피내 주사에 의해 비경구로 투여될 수 있지만, 다른 전신 투여 방식을 또한 이용할 수 있다. 본 발명에 바람직한 투여 방법은 근육내 경로이다. 따라서, 본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 조성물은 환자에게 근육내 경로를 통해 투여된다. 별도의 실시양태에서, 피내 또는 피하 전달이 고려된다.

유효량의 본 발명의 조성물을 환자에게 투여하여, 뎅기 질환으로부터 보호를 제공하는 것을 포함하는, 뎅기 바이러스 유도 질환에 대해 인간에서 면역 보호를 제공하는 방법을 또한 본원에서 제공한다. 본 발명의 상기 측면에서, 바람직한 투여 경로는 근육내, 피하 및 피내로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

본 발명은 또한 정제된 뎅기 바이러스 외피 ("E") 단백질 및 제약상 허용되는 부형제 (여기서 E 단백질은 그의 N-말단에서 아미노산 잔기 1로부터 시작하여 야생형 E의 길이의 약 80%를 구성하여, 상기 E 단백질이 숙주 세포 내에서 재조합 방식으로 발현될 때 성장 배지 내로 분비가능하다) 및 유효량의 아주반트를 포함하는 면역원성 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 인간 환자에서 보호 면역 반응을 일으키는 방법에 관한 것이고, 여기서 백신은 인간 대상체에서 중화 항체의 생산을 유도한다.

본 발명의 또 다른 측면은 뎅기 질환 및/또는 뎅기 감염의 예방 또는 치료를 위한, 유효량의 혈청형 DEN-1, DEN-2, DEN3, 및 DEN-4의 정제된 뎅기 바이러스 외피 ("E") 단백질, 제약상 허용되는 부형제, 및 유효량의 아주반트를 포함하며, 여기서 E 단백질은 각각 그의 N-말단에서 아미노산 잔기 1로부터 시작하여 야생형 E의 길이의 약 80%를 구성하여, 상기 E 단백질이 숙주 세포 내에서 재조합 방식으로 발현될 때 성장 배지 내로 분비가능하고, DEN-4 E 단백질은 임의로 이량체인, 면역원성 조성물을 제공한다. 본 발명의 일부 측면에서, 본원에서 설명되는 조성물은 면역결핍 집단에 투여될 것이다. 추가의 측면에서, 조성물은 소아과 인구집단에 투여될 것이다.

본 발명의 상기 측면의 일부 실시양태에서, 조성물의 DEN4 성분은 DEN4-80EZip이다. 별도의 실시양태에서, DEN4 성분은 DEN4-80E 또는 DEN4-80Ezip이고, DEN4 단백질의 양은 DEN1-80E, DEN2-80E, 또는 DEN3-80E 성분의 양의 약 1.5 내지 약 3배이다.

본 발명의 다른 측면은 또한 뎅기 감염 또는 그에 의해 유발된 질환의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에 있어서 상기 또는 명세서 전체에 설명된 바와 같은 조성물의 용도를 설명한다.

본원에서 설명되는 조성물의 활성 제약 성분 (뎅기 80E 및/또는 뎅기 80Ezip)은 발명의 개요에 설명된 바와 같은 "치료 유효량," 즉, 생리학상 유의한 양으로 환자에게 전달된다. 환자에게 조성물을 투여할 때 수여자 환자의 생리학에서 검출가능한 변화를 일으키는 경우, 본 발명의 조성물의 활성 성분은 생리학상 유의한 양으로 존재한다. 본 발명에서, 수여자 환자에서 검출가능한 변화는 상동성 뎅기 바이러스에 대한 중화 항체의 유도이다.

본 발명의 활성 백신은 단독으로, 또는 다른 활성 백신, 예컨대 이용가능한 정도로 다른 활성 서브유닛을 함유하는 것과 조합으로 사용할 수 있다. 하나 또는 수개의 바이러스 또는 혈청형으로부터 상응하는 또는 상이한 서브유닛이 특정 제제 내에 포함될 수 있다. 본 발명의 활성 백신은 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.

다수의 투여 요법이 사용될 때 면역화의 시기 선택 (timing)을 위한 많은 상이한 기술이 존재한다. 면역화시킨 대상체가 발현하는 면역글로불린 레파토리 (repertoire)의 발현의 수준 및 다양성을 증가시키기 위해 본 발명의 조성물을 1회 넘게 사용하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 다수의 면역화가 제공되면, 1 내지 2개월 간격으로 주어질 것이다. 본 발명의 바람직한 면역화 스케줄은 0, 1, 및 2개월에 대상체를 면역화시키는 것이다. 다른 면역화 스케줄을 또한 사용할 수 있다. 예를 들어, 별도의 면역화 스케줄, 예컨대 0, 1 및 3개월, 또는 0, 1 및 6개월을 이용할 수 있다.

뎅기 바이러스-유도된 질환에 대해 대상체를 면역화시키기 위해, 예를 들어, 서브유닛을 함유하는 백신을, 대체로 백신의 다수 투여를 수반한 통상적인 면역화 프로토콜로 대상체에게 투여한다. 투여는 대개 주사, 대개 근육내 또는 피하 주사에 의하지만, 다른 전신 투여 방식을 또한 사용할 수 있다.

면역원성 조성물

상기 진술한 바와 같이, 본 발명의 한 측면은 유효량의 혈청형 DEN-1, DEN-2, DEN3, 및 DEN-4의 정제된 뎅기 바이러스 외피 ("E") 단백질, 제약상 허용되는 부형제, 및 유효량의 아주반트를 포함하며, 여기서 E 단백질은 각각 그의 N-말단에서 아미노산 잔기 1로부터 시작하여 야생형 E의 길이의 약 80%를 구성하고, DEN-4 E 단백질은 이량체인, 인간 대상체에서 중화 항체의 생산을 유도하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 상기 측면의 실시양태에서, 각각의 혈청형에 대한 뎅기 E 단백질의 양은 약 1 ㎍ 내지 약 150 ㎍, 약 1 ㎍ 내지 약 10 ㎍, 약 1 ㎍ 내지 약 5 ㎍, 약 2 ㎍ 내지 약 4 ㎍, 약 3 ㎍ 내지 약 6 ㎍, 약 5 ㎍ 내지 약 25 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 20 ㎍, 약 5 ㎍ 내지 약 10 ㎍, 약 20 ㎍ 내지 약 25 ㎍, 약 40 ㎍ 내지 약 60 ㎍, 약 75 ㎍ 내지 약 125 ㎍, 또는 약 90 ㎍ 내지 약 110 ㎍이다. 별도의 실시양태에서, 각각의 뎅기 단백질의 양은 약 1 ㎍, 약 2 ㎍, 약 3 ㎍, 약 4 ㎍, 약 5 ㎍, 약 6 ㎍, 약 7 ㎍, 약 8 ㎍, 약 9 ㎍, 약 10 ㎍, 약 15 ㎍, 약 20 ㎍, 약 25 ㎍, 약 30 ㎍, 약 35 ㎍, 약 40 ㎍, 약 45 ㎍, 약 50 ㎍, 약 55 ㎍, 약 60 ㎍, 약 65 ㎍, 약 70 ㎍, 약 75 ㎍, 약 80 ㎍, 약 85 ㎍, 약 90 ㎍, 약 95 ㎍, 약 100 ㎍, 약 110 ㎍, 약 120 ㎍, 약 130 ㎍, 약 140 ㎍, 또는 약 150 ㎍이다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 각각의 뎅기 E 단백질의 양은 약 3 ㎍, 약 6 ㎍, 약 10 ㎍, 약 20 ㎍, 약 50 ㎍, 약 100 ㎍, 3 ㎍, 6 ㎍, 10 ㎍, 20 ㎍, 50 ㎍, 또는 100 ㎍이다.

유효량의 혈청형 DEN-1, DEN-2, DEN3, 및 DEN-4의 정제된 뎅기 바이러스 외피 ("E") 단백질, 제약상 허용되는 부형제, 및 유효량의 아주반트를 포함하며, 여기서 E 단백질은 각각 그의 N-말단에서 아미노산 잔기 1로부터 시작하여 야생형 E의 길이의 약 80%를 구성하고, DEN4 단백질의 양은 DEN1, DEN2, 및 DEN3 단백질의 개별적인 양의 약 1.5 내지 약 3배인, 인간 대상체에서 중화 항체의 생산을 유도하는 면역원성 조성물을 또한 제공한다. 본 발명의 상기 측면에서, DEN1, DEN2, DEN3 및 DEN4 E 단백질은 단량체 (예를 들어 DEN-80E)이거나, 또는 DEN1, DEN2, 및 DEN3 E 단백질은 단량체이고 DEN4 단백질은 이량체이다.

본 발명의 상기 측면에서, 조성물 내의 뎅기 E 단백질은 상기 설명된 양으로 존재하며, 단, DEN4 E 단백질 (단량체이든 이량체이든)은 DEN1, DEN2, 및 DEN3 E 단백질의 개별적인 양의 약 1.5 내지 약 3배인 양으로 존재한다. 따라서, 단지 예로서, DEN1, DEN2, 및 DEN3 E 단백질이 조성물 내에 약 3 ㎍의 양으로 존재하면, DEN4 E 단백질은 조성물 내에 약 4.5 ㎍ 내지 약 9 ㎍, 바람직하게는 약 6 ㎍의 양으로 존재한다. 추가의 예로서, DEN1, DEN2, 및 DEN3 E 단백질이 조성물 내에 약 10 ㎍의 양으로 존재하면, DEN4 E 단백질은 조성물 내에 약 15 ㎍ 내지 약 30 ㎍, 바람직하게는 약 20 ㎍의 양으로 존재한다. 또 다른 추가의 예에서, DEN1, DEN2, 및 DEN3 E 단백질이 조성물 내에 약 50 ㎍의 양으로 존재하면, DEN4 E 단백질은 조성물 내에 약 75 ㎍ 내지 약 150 ㎍, 바람직하게는 약 100 ㎍의 양으로 존재한다. 당업자는 DEN1, DEN2, 및 DEN3 E 단백질의 양이 대략 동일하지만, 그 양은 변할 수 있고 정확한 1:1:1비로 존재할 필요가 없음을 알 것이다. 당업자는 안전하면서도 DEN1, DEN2, DEN3 및 DEN4에 대한 균형잡힌 4가 면역 반응을 유도하는 각각의 DEN E 단백질의 최적 용량을 결정할 수 있을 것이다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약 3 ㎍의 DEN1, DEN2, 및 DEN3 E 단백질, 및 약 6 ㎍의 DEN4 E 단백질 (DEN4-80E 또는 DEN4-80EZip)을 포함한다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약 10 ㎍의 DEN1, DEN2, 및 DEN3 E 단백질, 및 약 20 ㎍의 DEN4 E 단백질 (DEN4-80E 또는 DEN4-80EZip)을 포함한다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약 50 ㎍의 DEN1, DEN2, 및 DEN3 E 단백질, 및 약 100 ㎍의 DEN4 E 단백질 (DEN4-80E 또는 DEN4-80EZip)을 포함한다.

본 발명의 조성물에서 유용한 제약상 허용되는 담체는 사용된 투여량 및 농도에서 환자에게 무독성인 임의의 상용성 물질, 예컨대 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올, 완충제 등 및 이들의 조합물을 포함한다. 담체는 또한 안정화제, 가용화제, 장도 조정제, 예컨대 NaCl, MgCl₂, 또는 CaCl₂ 등, 계면활성제, 및 이들의 혼합물과 같은 추가의 성분을 함유할 수 있다.

본 발명에 따라, 치료 조성물의 "유효량"은 목적하는 생물학적 효과를 달성하기 위해 충분한 양이다. 일반적으로, 조성물의 유효량을 제공하기 위해 필요한 투여량은 대상체의 연령, 상태, 성별, 및 존재하는 경우에 질환의 정도, 및 당업자가 조정할 수 있는 다른 변수와 같은 인자에 따라 변할 것이다. 본 발명의 항원성 제제는 유효량의 단일 또는 다수 투여량에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물의 유효량은 용량당 생성물당 0.01-500 ㎍, 보다 바람직하게는 용량당 생성물당 1-100 ㎍, 가장 바람직하게는 용량당 생성물당 5-50 ㎍으로 다양할 수 있다. 본 발명의 조성물은 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따라, 인간 대상체에 대한 투여를 지지하기 위해 cGMP 하의 대규모의 DEN1-80E, DEN2-80E, DEN3-80E, 및 DEN4-80EZip 활성 성분 및 HBV-001 D1과 4가 뎅기 백신의 생산을 제시한다 (실시예 1-4). 비-인간 영장류 및 건강한 성인 지원자에서 본 발명의 백신의 안전성 및 면역원성 (효능)의 결정 (실시예 5-8)을 설명한다. 본 발명의 뎅기 백신의 실시양태는 2개의 중요한 측면을 조합한다. 한 측면에서, 아주반트와 조합된 재조합 서브유닛 단백질의 내재하는 안전성은 건강한 및 면역손상된 개체에서 질환의 예방을 위한 최적 방법을 제공한다. 제2 측면에서, 실제 사용을 위해 충분한 양으로 현재 우수 제조 실무 (cGMP) 하의 입체형태학상 관련 재조합 DEN1-80E, DEN2-80E, DEN3-80E, DEN4-80E 및 DEN4-80EZip 항원의 생산은 비-인간 영장류 및 인간 대상체에서 균형잡힌 4가 바이러스 중화 항체를 유도하는 백신을 생성시키고, 이것은 질환에 대한 보호 메카니즘을 제공한다. 다양한 비의 단량체 및 이량체 80E 단백질의 독특한 조합은 DHF와 같은 악화된 질환의 위험을 최소화하기 위해 중요한 4가 균형을 보장하기 위해 이용된다. 이들 신규한 측면의 조합은 인간 대상체에서 안전하고 효과적인 뎅기 바이러스 백신의 신규한 발명을 생성한다. 이들 백신 제제는 비-구조 단백질 NS1의 포함이 효과적인 면역원성 및 보호를 위해 요구되지 않는다는 예기치 않는 발견에 의해 추가로 특성화된다. 또한, 개시된 뎅기 백신은 특히 유아, 노인, 및 면역손상된 개체를 비롯한 심각한 질환의 위험이 가장 큰 대상체에 대해 허용되는 안전성 프로파일을 유지하면서 백신접종한 개체에서 관련 보호 면역 반응을 유도하는 기술적 문제를 다룬다.

본원에 언급된 모든 공개문헌은 본 발명에 연관하여 사용될 수 있는 방법 및 물질을 설명하고 개시하기 위한 목적으로 본원에 참고로 포함된다. 본원에서 본 발명이 선행 발명에 의해 상기 개시내용에 선행하는 자격이 없다는 인정으로서 해석되어서는 안 된다.

본 발명의 바람직한 실시양태를 첨부 도면을 참조로 설명하였지만, 본 발명은 이들 정확한 실시양태에 제한되지 않고, 첨부된 청구의 범위에 규정된 바와 같은 본 발명의 범위 또는 취지로부터 벗어나지 않으면서 당업자에 의해 여기에 다양한 변화 및 변형이 이루어질 수 있음을 이해해야 한다.

다음 실시예는 본 발명을 예시하지만 제한하지는 않는다.

실시예 1

드로소필라 S2 시스템 내에서 뎅기 80E 단백질의 발현 및 정제

발현 플라스미드 pMttbns (pMttPA로부터 유래함)는 다음 요소를 함유한다: 드로소필라 멜라노가스터 메탈로티오네인 프로모터, 인간 조직 플라스미노겐 활성화인자 분비 리더 (leader) (tPAL) 및 SV40 조기 폴리아데닐화 신호. 14 염기쌍 BamHI (바실러스 아밀로리쿠파시엔스 (Bacillus amyloliqufacience)로부터의 제한 효소) 단편을 pMttbns 벡터로부터 절제하여, 기존의 독특한 BglII (바실러스 글로비지트 (Bacillus globigit)로부터의 제한 효소) 부위에 추가로 독특한 XhoI (잔토모나스 홀리시콜라 (Xanthomonas holicicola)로부터의 제한 효소) 부위를 함유하는 pMttΔXho를 얻었다. 상기 발현 벡터는 배양 배지 내로 발현된 단백질의 분비를 촉진한다. 이들 독특한 BglII 및 XhoI 부위를 이용하여 뎅기 서열을 pMttΔXho 벡터 내로 도입하였다. 본원에 설명된 연구를 위해 사용된 뎅기 서열은 다음과 같이 서열 1-5로 나타낸다: (1) 서열 1: DEN1 prM-80E; (2) 서열 2: DEN2 prM-80E; (3) 서열 3: DEN3 prM-80E; (4) 서열 4: DEN4 prM-80E; 및 (5) 서열 5: DEN4 prM-80EZip. 카르복시-말단절단된 뎅기 외피 단백질의 발현을 위해, 관련 유전자 단편을 바이러스 RNA 또는 cDNA 클론으로부터 증폭시켰다. 합성 prM80E (전구막 단백질-80% 당단백질 E) 유전자 단편은 마지막 뎅기 코돈 바로 다음에 2개의 중지 코돈을 포함하였다.

S2 세포를 (i) 인산칼슘 동시-침전 방법 또는 (ii) 셀펙틴 (Cellfectin) (인비트로겐 (Invitrogen) 키트, 미국 캘리포니아주 칼스바드)를 이용하여 제조자의 권장사항에 따라 발현 플라스미드, 및 히그로마이신 내성을 코딩하는 pCoHygro 선택 플라스미드 모두로 동시-형질전환시켰다. 세포를 20:1 비의 발현 플라스미드 대 선택 플라스미드의 비를 갖는 20 ㎍ 총 DNA로 동시-형질전환시켰다. 형질전환체를 300 ㎍/ml의 히그로마이신 B (로슈 몰레큘라 바이오케미칼스 (Roche Molecular Biochemicals, 미국 인디애나주 인디애나폴리스))를 사용하여 선택하였다. 선택 후에, 세포를 혈청 비함유 배지 엑셀 (Excel) 420 (제이알에이치 (JRH, 미국 캔사스주 레넥사)) 내에서 성장하도록 적응시켰다. 발현 연구를 위해, 세포를 엑셀 420, 300 ㎍/ml 히그로마이신 내에서 성장시키고, 200 μM CuSO₄로 유도하였다. 세포를 2 X 10⁶ 세포/ml의 밀도로 접종하고, 6-7일 동안 성장시켰다. 최적 조건 하에, 6-7일의 성장 후에 1.5 내지 2 X 10⁷ 세포/ml의 세포 밀도가 달성되었다. 배양 상청액을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에 의해 발현된 단백질에 대해 검사하였다.

웨스턴 블롯 상의 DEN-80E의 검출을 위해, 정제된 불활성화시킨 뎅기 바이러스에 대해 발생된 토끼 폴리클로날 항-뎅기 바이러스 항체에 이어, 항-토끼 IgG-알칼리성 포스파타제 접합된 2차 항체를 사용하였다. 블롯을 NBT/BCIP (시그마 켐. 코. (Sigma Chem. Co., 미국 미주리주 세인트루이스)) 고체상 알칼리성 포스파타제 기질로 발색시켰다.

DEN1-80E, DEN2-80E, DEN3-80E, DEN4-80E 또는 DEN4-80EZip 단백질의 정제는 모노클로날 항체 (MAb) 4G2를 사용하는 면역친화도 크로마토그래피 (IAC)에 의해 완수하였다. 간단히 설명하면, 절차는 발현 후 배지의 청정화를 수반한다. 이어서, 조질 물질을 N-히드록시숙신이미드 화학을 통해 공유 연결된 고정된 MAb를 함유하는 IAC 컬럼 상에 로딩하였다. 샘플을 로딩한 후, 매트릭스를 0.05% (v/v) 트윈 (tween)-20 (PBST, 140 mM NaCl)를 함유하는 10 mM 포스페이트 완충 염수 (PBS), pH 7.2로 세척하였다. 결합된 단백질을 IAC 컬럼으로부터 20 mM 글라이신 완충제, pH 2.5를 사용하여 용리시켰다. 이어서, 용리물을 중화한 후 PBS에 대해 완충제 교환하였다. 정제 생성물을 각각 순도, 정체성, 양, 및 생물활성을 결정하기 위해 쿠마지 (Coomassie) 또는 은 염색을 사용한 SDS-PAGE, 웨스턴 블롯, UV 흡수, 및 효소 연결 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 정기적으로 분석하였다. 추가로, 샘플을 N-말단 아미노산 서열결정 및 아미노산 분석에 의해 분석하였다. 이들 분석은 정제 생성물의 정체성 및 양의 확인을 제공한다.

도 1은 정제된 DEN-80E 단백질의 대표적인 SDS-PAGE (패널 A) 및 웨스턴 블롯 (패널 B) 프로파일을 제공한다. 분석을 위해, 샘플을 비-환원 조건 하에 전개시켰다. DEN1-80E, DEN2-80E, 및 DEN3-80E 분자는 아미노산 조성으로부터 결정된 것 (즉, 45 kD)과 일치하는 상대적인 분자량을 갖는 단일 밴드로서 이동한다. DEN4-80EZip 단백질은 비-환원 조건 하에 주로 약 90 kD의 겉보기 분자량을 갖는 이량체로서 이동한다.

실시예 2

DEN1-80E, DEN2-80E, DEN3-80E, 또는 DEN4-80EZip의 cGMP 로트 (Lot)의 생산

cGMP 조건 하에 각각의 S2 세포주로부터 MCB (Master Cell Bank)를 제조하였다. cGMP 제조 과정은 교반식 탱크 생물반응기로 S2 MCB 세포주의 팽창, 및 분비된 단백질을 함유하는 배양 배지의 수거를 수반한다. 세포는 심층 (depth) 필터를 사용한 여과에 의해 배양 배지로부터 분리하였다. 이어서, 생성된 청정화시킨 상청액으로부터 4G2 모노클로날 항체를 사용하는 면역친화도 크로마토그래피에 의해 DEN1-80E, DEN2-80E, DEN3-80E, 또는 DEN4-80EZip을 정제하였다. 이어서, 면역친화도 정제 생성물을 저 pH 바이러스 불활성화 단계, 및 20 nm 입자를 제거할 수 있는 공극 크기를 갖는 막을 사용한 바이러스 여과 단계로 통과시켰다. 재조합 서브유닛 백신 성분을 저 pH 바이러스 불활성화 및 바이러스 여과 단계로 통과시키는 능력은 이것이 가능하지 않은 생 약독화 백신에 비해 잇점이다. 이들 바이러스 청소 단계는 외래 물질 (adventitious agent) 시험을 유의하게 단순화시키고, 제품에 대한 추가의 수준의 안전성을 제공한다. DEN-80E 단백질의 최종 처리는 완충제-교환, 및 한외여과에 이어 0.2 ㎛ 필터를 통한 최종 여과에 의한 농축을 수반한다.

cGMP 하의 DEN1-80E, DEN2-80E, DEN3-80E, 또는 DEN4-80EZip의 로트의 제조는 아래에 설명된 바와 같이 달성하였다. 각각의 MCB의 바이알을 해동시키고, 각각의 해동시킨 바이알의 내용물을 10 mL 부피의 EX-CELL 배지 내에서 5일 동안 26℃에서 배양하였다. 각각의 배양액을 500 mL 일회용 진탕 플라스크 내로 팽창시켰다. 1.5 X 10⁷/mL의 세포 밀도를 달성할 때까지 배양액을 성장시켰다. 플라스크를 모으고, 일회용 진탕 플라스크 내에서 보다 많은 배양액을 접종하기 위해 사용하고, 이어서 이를 3 내지 4일 동안 성장시켰다. 2 X 10⁷ 세포/mL의 밀도를 달성할 때까지 배양액을 성장시켰다. 이어서, 배양액을 일회용 진탕 플라스크 내에서 다수의 배양을 위해 팽창시켰다. 1.6 X 10⁷ 세포/mL의 평균 세포 밀도를 달성할 때까지 이들 배양액을 성장시켰다. 플라스크로부터의 세포를 모으고, 20 L 스테인레스 스틸 생물반응기를 접종하기 위해 사용하였다. 1.2 X 10⁷ 세포/mL의 세포 밀도를 달성할 때까지 배양액을 성장시켰다. 20 L 생물반응기로부터의 적절한 양의 세포를 2 X 10⁶ 세포/mL의 초기 세포 밀도를 달성하기 위해 100 L 스테인레스 스틸 생물반응기로 옮겼다. > 4.0 X 10⁶ 세포/mL의 세포 밀도를 달성할 때까지 배양액을 성장시켰다. 이어서, 0.2 mM의 최종 농도를 달성하도록 황산구리를 배양액에 첨가함으로써 배양을 유도하였다. 이어서, 배양액을 5일 동안 성장시켰다. 100 L의 각각의 배양액을 0.45 ㎛ 필터 카트리지에 이어 0.2 ㎛ 필터 카트리지를 사용하는 심층 여과에 의해 수거하였다. 여액을 일회용 백 내에 10 L 부피에 수집하고, -20℃에서 저장하였다.

DEN1-80E, DEN2-80E, DEN3-80E, 또는 DEN4-80EZip 벌크 수거물 (bulk harvest)을 주위 온도 (15-25℃)에서 약 24시간 동안 해동시켰다. 이어서, 물질을 5 ㎛ 공극 크기 필터로 통과시켜 미립자를 제거하였다. 여과된 벌크 수거물을 4G2-세파로스 컬럼 상에 직접 로딩하였다. 로딩한 후, 컬럼을 0.05% 트윈-20 (PBST)을 함유하는 11 mM PBS, pH 7.1로 세척한 후, 보유된 80E를 글라이신 완충제를 사용하여 pH를 낮춤으로써 용리시켰다. 이어서, 하위-배치를 모은 후, pH를 3.8의 최종 pH로 낮추고 물질을 주위 온도 (15-25℃)에서 16-24시간 동안 인큐베이션함으로써 바이러스를 불활성화시키고, 그 후 pH를 7.0±0.5로 조정하였다. 물질을 0.2 ㎛ 프리-필터를 통해 통과시켜 작은 미립자를 제거한 후, 20 nm 공극 크기의 막을 사용하여 바이러스를 여과하였다. 이어서, 물질을 농축하고 한외여과에 의해 완충제 교환하고, 최종 멸균 여과는 0.2 ㎛ 필터를 통해 멸균 백 내로 직접 통과시킴으로써 완수하였다. 정제된 80E 생물학적 물질을 백신 제품으로 제제화하기 위해 출고하기 전에 광범위한 안전성, 정체성, 강도, 및 순도 평가를 수행하였다.

실시예 3

임상 연구에서 사용하기 위한 HBV-001 D1 백신의 제제화

일가 DEN1-80E 백반 흡착된 (HBV-001 D1) 백신의 제제화를 cGMP 하에 수행하였다. 간단히 설명하면, 실시예 2에 설명된 정제된 생물학적 물질 DEN1-80E를 해동시키고, 클래스 (Class) 100 층류 (laminar flow) 영역으로 옮겼다. DEN1-80E를 멸균 둘베코 (Dulbecco) 포스페이트 완충 염수 (DPBS)로 희석하여 0.20 mg/mL의 최종 단백질 표적 농도를 달성하고, 희석시킨 80E 용액을 멸균 여과하였다. DPBS 및 알히드로겔 '85'를 희석시킨 DEN1-80E 용액에 2.50 mg/mL의 최종 알루미늄 농도로 부피에 의해 첨가하였다. 용액을 2-8℃에서 밤새 부드럽게 혼합하였다.

밤새 흡착시킨 후, 흡착되지 않은 DEN1-80E 단백질의 양을 결정하였다. HBV-001 D1 백신의 충전을 위해 이동하기 위해 최소 75% 흡착이 요구되었다. 적절한 양의 HBV-001 D1 백신을 준비된 멸균 바이알에 옮겼다. 채워진 바이알을 스토퍼로 막고, 밀봉하고, 권축시켰다. 백신의 채워진 바이알을 2 내지 8℃에서 저장하였다. 임상 연구에서 백신을 사용하기 전에 광범위한 안전성, 강도, 정체성, 효력, 및 순도 시험을 수행하였다.

실시예 4

임상 연구에서 사용하기 위한 4가 뎅기 항원의 제제화

4가 DEN-80E 백신의 제제화를 cGMP 하에 수행하였다. 간단히 설명하면, 실시예 2에 설명된 정제된 생물학적 물질 DEN1-80E, DEN2-80E, DEN3-80E, 및 DEN4-80EZip을 해동시키고, 클래스 100 층류 영역으로 옮겼다. 해동시킨 항원을 멸균 여과하고, 여과후 단백질 농도를 결정하였다. DEN-80E 항원을 각각 독립적으로 멸균 둘베코 포스페이트 완충 염수 (DPBS)로 희석하여 0.50 mg/mL의 최종 단백질 표적 농도를 달성하였다. 이어서, 4가지 단백질 용액을 DEN1-80E:DEN2-80E:DEN3-80E:DEN4-80EZip에 대해 1:1:1:2의 비로 부피에 의해 혼합하여, DEN1-80E를 0.1 mg/mL로, DEN2-80E를 0.1 mg/mL로, DEN3-80E를 0.1 mg/mL로, DEN4-80EZip을 0.2 mg/mL로 함유하는 4가 용액을 생산하였다. 적절한 양의 4가 백신 혼합물을 준비된 멸균 바이알 내로 옮겼다. 채워진 바이알을 스토퍼로 막고, 밀봉하고, 권축시켰다. 백신의 채워진 바이알을 2 내지 8℃에서 저장하였다. 임상 시험을 지지하기 위해 DEN1-80E, DEN2-80E, DEN3-80E 및 DEN4-80E를 함유하는 유사한 제제를 또한 제조하였다. 임상 연구에서 백신을 사용하기 전에 광범위한 안전성, 강도, 정체성, 효력, 및 순도 시험을 수행하였다. 4가 항원은 우수 임상 실무 (Good Clinical Practices)에 따라 단독으로 또는 인간 대상체에 투여하기 전에 멸균의 채워진 아주반트와 혼합하여 투여한다.

실시예 5

HBV-001 D1 뎅기 종류 1 재조합 서브유닛 백신의 임상 시험

실시예 3에 설명한 바와 같이 cGMP 하에 제조된 HBV-001 D1 백신을 임상 시험에서 시험하였다. 건강한 성인 지원자에서 HBV-001 D1 생물학적 제품을 평가하기 위해 단일-기관, 이중-맹검, 무작위, 1상 연구에서 동일한 양의 알히드로겔 '85' 아주반트를 갖는 2가지 상이한 용량 수준의 백신의 활성 성분 (DEN1-80E)을 평가하였다. 대상체에게 제0, 4 및 8주에 연구 백신의 단일 IM 주사를 제공하였다. 연구의 설계를 아래 표 1에 요약한다.

표적화된 신체 검사, 일상적인 실험실 시험 (혈액학, 임상 화학 및 소변검사) 및 연구 지원자에서 활력 징후 및 유해 사건의 기록에 의해 연구 전체에서 안전성 및 관용성을 평가하였다. 추가로, 대상체는 반응원성 (reactogenicity) 및 관용성 데이터뿐만 아니라 특이적 유해 사건을 기록하기 위해 각각의 백신접종을 위해 14+/-2일 동안 다이어리 카드 (diary card)를 사용하였다. 본 연구에서 효능 평가는 ≥1:10의 PRNT₅₀ (플라크 감소 중화 시험) 검정에 의해 결정할 때 바이러스 중화 항체 역가 (즉, 면역원성)의 비율 및 정도의 결정을 포함하였다. 백신이 인간 대상체에 대해 안전하다는 것을 제안하는 안전성 신호는 연구에서 확인되지 않았다.

면역화시킨 개체로부터 면역원성 데이터를 표 2에 요약한다. 저-용량 코호트 (cohort)에서 6명의 백신 수여자 중에서, 모든 대상체는 제0, 2, 및 4주에 중화 항체 역가에 대해 음성이었다. 대다수의 대상체 (4/6)는 제10주에 중화 항체를 발생하였고, 이것은 제3 백신 용량의 2주 후이다. 제34주에 대상체는 검출가능한 항체를 보이지 않았다. 1명의 대상체 (007)는 제6주 (제2 백신 용량의 2주 후)에서 시작하여 양성 결과를 보였고, 이것은 제10주에 또한 나타나지만 제34주 (용량 3의 26주 후)에 검출가능하지 않았다.

고-용량 코호트 내의 6명의 백신 수여자 중에서, 모든 대상체는 제0, 2, 및 4주에서 중화 항체 역가에 대해 음성이었다. 1명의 대상체는 제6주 (제2 백신 용량의 2주 후)에서 시작하여 양성 결과를 보였다. 2명의 대상체는 제8주 (제3 백신 용량의 투여일)에 중화 항체를 보였고, 대다수의 대상체 (5/6)는 제10주에 중화 항체를 발생시켰다. 2명의 대상체는 제34주에 검출가능한 항체 역가를 계속하여 보였다. 이것은 인간 대상체에서 뎅기에 대한 비-복제 백신에 대한 바이러스 중화 항체의 유도의 최초의 입증을 나타낸다. 4명의 위약 수여자는 모두 모든 측정된 시점에서 검출가능한 항체 역가를 갖지 않았다.

결과는 HBV-001 D1 백신이 인간 환자에서 안전하면서도 DEN1에 대한 면역 반응을 유도할 수 있음을 입증한다. 또한, 강력한 보호를 위한 NS1에 대한 예상된 요건에도 불구하고 제제 내에 NS1를 포함하지 않으면서 백신접종한 개체에서 상기 관련 보호 면역 반응이 유도되었다 (McDonell et al., US 6,416,763).

실시예 6

레수스 마카크에서 4가 뎅기 80E 재조합 서브유닛 백신 (w/DEN4-80EZip)의 시험

단량체 DEN1-80E, 단량체 DEN2-80E, 단량체 DEN3-80E, 및 이량체 DEN4-80EZip의 독특한 조합을 포함하는 4가 제제를 1 ㎍ 용량의 각각의 DEN-80E 및 47 ISCO 유닛의 이스코매트릭스® 아주반트를 레수스 마카크에게 전달하기 위해 이스코매트릭스® 아주반트와의 혼합물로서 제조하였다 (제1군). 동일한 4가 조성물을 포함하지만 0.1 ㎍ 용량의 DEN2로부터의 NS1 단백질을 또한 포함하는 제2 혼합물을 제조하였다 (제2군). 각각 12마리 원숭이의 군에게 3가지 용량의 혼합물 또는 이스코매트릭스® 단독 (제3군)을 2개월 간격으로 투여하였다. 면역원성은 제3 용량의 백신의 30일 후에 평가하였다 (연구일 150). NS1이 없는 4가 제제로 면역화시킨 개별 동물로부터의 항체 역가를 표 3에 제시한다. 명백하게 볼 수 있는 바와 같이, 단량체 및 이량체 항원의 독특한 조합은 동물에서 고역가의 균형잡힌 4가 바이러스 중화 반응을 생성시킨다.

50% 감소의 컷오프를 사용한 플라크 감소 중화 시험에서 결정할 때 바이러스 중화 항체 역가

마지막 용량의 백신을 제공한 5개월 후에, 동물에게 야생형 뎅기 바이러스를 유발검사하였다. 유발검사를 위해, 각각 12마리 원숭이의 각각의 군을 4가지 뎅기 바이러스 중 하나를 사용한 유발검사를 위해 각각 3마리 원숭이의 4개의 군으로 무작위적으로 세분하였다. 각각의 원숭이를 피하 경로로 투여한 약 10⁵ 플라크 형성 유닛의 야생형 뎅기 바이러스로 유발검사하였다. 동물에게서 혈액 샘플을 다음 11일 동안 매일 취하였다. 혈액 샘플을 베로 세포 상에 직접 플레이팅함으로써 또는 모기 C6/36 세포에 대한 증폭 후 베로 세포 상에 플레이팅함으로써 바이러스의 존재 (바이러스혈증)에 대해 평가하였다. 레수스 마카크는 야생형 뎅기 바이러스로 감염될 때 질환 증상을 발병하지 않지만, 바이러스혈증을 발병하고 바이러스혈증의 예방은 보호 효능에 대한 대용물 (surrogate)로서 간주된다. 유발검사 데이터를 도 2에 제시한다. 이스코매트릭스® 아주반트만을 제공한 11/12 대조군 동물은 유발검사 후 바이러스혈증을 발병한 반면, NS1이 없는 4가 백신 제제를 제공한 모든 동물 (제1군)은 검출가능한 바이러스혈증으로부터 완전히 보호되었다. NS1을 함유한 4가 백신 제제를 제공한 11/12 동물 (제2군)도 또한 바이러스혈증으로부터 보호되었지만, 놀랍게도 NS1 함유 제제를 제공한 1마리의 원숭이는 단 하루도 바이러스혈증을 발병하지 않았다. 따라서, NS1이 없이 단량체 및 이량체 단백질의 독특한 조합을 함유하는 4가 백신 제제는 바이러스 유발검사로부터 균형잡힌 4가 면역 및 완전한 보호를 보여주었고, 놀랍게도 NS1을 함유하지 않은 제제에 비해 우수한 보호를 보이는 것으로 나타났다.

실시예 7

레수스 마카크에서 4가 뎅기 80E 재조합 서브유닛 백신의 시험

본 비-GLP 붉은털 원숭이 연구의 목적은 1) DEN4-80E 및 DEN4-80EZip의 면역원성 및 보호 효능을 비교하고, 2) 다른 단량체 DEN-80E 재조합 서브유닛 (DEN1-80E, DEN2-80E 및 DEN3-80E)과의 4가 제제에서 DEN4-80E의 면역원성 및 보호 효능을 평가하기 위한 것이다. DEN4-80E 및 DEN4-80Ezip을 저, 중간 및 고 용량 (6, 20 및 100 ㎍/용량)에서 평가하였다. 이와 마찬가지로, 4가 제제를 저 (각각 3, 3, 3, 6 ㎍의 DEN1-80E, DEN2-80E, DEN3-80E 및 DEN4-80E), 중간 (10, 10, 10, 20 ㎍) 및 고 (50, 50, 50, 100 ㎍) 용량에서 평가하였다. 대다수의 시험한 제제는 이스코매트릭스® 아주반트를 용량당 90 ISCO 유닛으로 함유하였다. 이스코매트릭스® 아주반트 만을 용량당 90 ISCO 유닛으로 제공한 음성 대조군을 포함시켰다. 비교 목적을 위해, 2개의 추가의 군을 연구에 포함시켰다. 225 ㎍의 알히드로겔과 함께 제제화된 중간 용량의 DEN4-80E (20 ㎍)를 제공한 하나의 군, 및 37.6 ISCO 유닛과 함께 제제화된 중간 4가 백신 용량을 제공한 하나의 군을 포함시켰다. 각각의 백신 또는 대조군 제제를 ELISA 검정에 의해 플라비바이러스 (DEN1, 2, 3 및 4, 및 WN) 항체 음성인, 체중이 3 kg 초과인 양쪽 성별의 건강한 성체 레수스 마카크에 투여하였다. 일가 DEN4 백신을 평가할 때 한 군당 3마리의 원숭이를 사용하고, 4가 제제 또는 이스코매트릭스® 음성 대조군을 평가하기 위해 한 군당 12마리의 원숭이를 사용하였다.

상기 설명된 후보 백신 제제를 0.5 mL 총 부피로 근육내 접종에 의해 투여하였다. 3가지 용량의 백신을 4주 간격으로 투여하였다. 바이러스 중화 활성은 LiCor 기반 마이크로중화 검정을 이용하여 4주마다 결정하였다 (T=0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32). 제12주 (용량 3의 4주 후)에 대한 LiCor 결과를 아래 표 4에 요약한다. 제12주 결과로부터의 핵심 결론 중 하나는 DEN4-80E 및 DEN4-80Ezip의 면역원성이 평가된 용량에 걸쳐서 매우 유사하다는 것이다. 저, 중간 및 고용량에서 DEN4-80E에 대한 기하 평균 중화 역가는 각각 508, 508 및 320인 한편, DEN4-80Ezip에 대한 역가는 640, 1016 및 320이었다. 이스코매트릭스® 아주반트의 중간 DEN4-80E 용량을 제공한 군은 알히드로겔을 제공한 군 (32)보다 실질적으로 더 높은 기하 평균 중화 역가 (508)를 가졌음이 또한 관찰되었다. 4가 백신 제제를 제공한 군들에서 모든 뎅기 종류에 걸쳐서 높은 균형잡힌 반응이 달성되었음이 또한 나타났다. 단일 성분 백신 (DEN4-80E 또는 DEN480E-zip) 또는 4가 백신에 대해 명백한 용량 반응은 관찰되지 않았다.

실시예 8

4가 뎅기 80E 재조합 서브유닛 백신의 임상 시험

cGMP 하에 제조된 4가 뎅기 80E 백신을 임상 시험으로 시험하기 위해 준비하였다. 연구는 4가 뎅기 80E 백신의 I상 연구로 이루어질 것이다. 연구는 무작위, 이중-맹검, 위약-대조, 용량 상승 연구일 것이고, 이것은 18 내지 45세의 건강한 플라비바이러스-나이브 (naive) 성인에서 4가 (DEN1-80E, DEN2-80E, DEN3-80E 및 DEN4-80E) 뎅기 백신의 상이한 제제의 안전성, 관용성 및 면역원성을 평가할 것이다. 면역원성 데이터를 각각의 백신접종의 1개월 후, 및 제3 백신접종의 6개월 및 1년 후에 수집할 것이다.

총 90명의 대상체를, 0, 4, 및 8주에 투여하는 활성 백신 또는 위약의 3회 근육내 주사를 맞도록 연구에 등록할 것이다. 표 5에 제시한 바와 같이, 3개 용량 수준의 뎅기 1, 뎅기 2, 뎅기 3, 및 뎅기 4-80E 항원을 평가할 것이다: 저용량 (각각 3, 3, 3, 및 6 ㎍), 중간 용량 (각각 10, 10, 10, 및 20 ㎍), 및 고용량 (각각 50, 50, 50, 및 100 ㎍) 제제. 각각의 용량 수준 내에서, 시험한 구체적인 백신은 이스코매트릭스® 아주반트의 (30 또는 60 ISCO 유닛으로), 알히드로겔™-아주반트의, 또는 비-아주반트의 제제를 포함할 것이다.

참고문헌

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tgtatgcagg acatctgaaa tgcaaagttc gcatggagaa attgagaatt 1380 aagggaatgt catacacgat gtgctcagga aagttctcaa ttgacaaaga gatggcagaa 1440 acacagcatg ggacaacagt ggtaaaagtc aagtatgagg gtgctggagc tccatgtaaa 1500 gttcccatag agataagaga tgtgaacaag gaaaaagtgg tagggcgcat catctcatct 1560 accccttttg ctgagtatac caacagtgta accaacatag aattagaacc cccctttggg 1620 gacagctaca tagtaatagg tgttggagac agtgcattaa cactccattg gttcaggaaa 1680 gggggtggtg gttctggtgg tggtggtacc ggcggtggct ccggcggtgg ctccccccgc 1740 atgaagcagc tggaggacaa ggtggaggag ctgctgtcca agaactacca cctggagaac 1800 gaggtggccc gcctgaagaa gctggtgggc gagcgcggcg gttgcggcgg t 1851 <210> 6 <211> 395 <212> PRT <213> Dengue virus type 1 <400> 6 Met Arg Cys Val Gly Ile Gly Ser Arg Asp Phe Val Glu Gly Leu Ser 1 5 10 15 Gly Ala Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu His Gly Ser Cys Val Thr 20 25 30 Thr Met Ala Lys Asp Lys Pro Thr Leu Asp Ile Glu Leu Leu Lys Thr 35 40 45 Glu Val Thr Asn Pro Ala Val Leu Arg Lys Leu Cys Ile Glu Ala Lys 50 55 60 Ile Ser Asn Thr Thr Thr Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala 65 70 75 80 Thr Leu Val Glu Glu Gln Asp Ala Asn Phe Val Cys Arg Arg Thr Phe 85 90 95 Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser 100 105 110 Leu Ile Thr Cys Ala Lys Phe Lys Cys Val Thr Lys Leu Glu Gly Lys 115 120 125 Ile Val Gln Tyr Glu Asn Leu Lys Tyr Ser Val Ile Val Thr Val His 130 135 140 Thr Gly Asp Gln His Gln Val Gly Asn Glu Ser Thr Glu His Gly Thr 145 150 155 160 Thr Ala Thr Ile Thr Pro Gln Ala Pro Thr Ser Glu Ile Gln Leu Thr 165 170 175 Asp Tyr Gly Ala Leu Thr Leu Asp Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp 180 185 190 Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Thr Met Lys Glu Lys Ser Trp Leu Val 195 200 205 His Lys Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Thr Ser Gly Ala 210 215 220 Ser Thr Ser Gln Glu Thr Trp Asn Arg Gln Asp Leu Leu Val Thr Phe 225 230 235 240 Lys Thr Ala His Ala Lys Lys Gln Glu Val Val Val Leu Gly Ser Gln 245 250 255 Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Thr 260 265 270 Ser Gly Thr Thr Thr Ile Phe Ala Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Lys 275 280 285 Met Asp Lys Leu Thr Leu Lys Gly Met Ser Tyr Val Met Cys Thr Gly 290 295 300 Ser Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val 305 310 315 320 Leu Val Gln Ile Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro 325 330 335 Phe Ser Thr Gln Asp Glu Arg Gly Val Thr Gln Asn Gly Arg Leu Ile 340 345 350 Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val Asn Ile Glu 355 360 365 Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Val Ile Gly Ala Gly Glu 370 375 380 Lys Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Lys Lys Gly 385 390 395 <210> 7 <211> 395 <212> PRT <213> Dengue virus type 2 <400> 7 Met Arg Cys Ile Gly Ile Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Val Ser 1 5 10 15 Gly Gly Ser Trp Val Asp Ile Val Leu Glu His Gly Ser Cys Val Thr 20 25 30 Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp Phe Glu Leu Ile Lys Thr 35 40 45 Glu Ala Lys Gln Pro Ala Thr Leu Arg Lys Tyr Cys Ile Glu Ala Lys 50 55 60 Leu Thr Asn Thr Thr Thr Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Pro 65 70 75 80 Thr Leu Asn Glu Glu Gln Asp Lys Arg Phe Val Cys Lys His Ser Met 85 90 95 Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Gly 100 105 110 Ile Val Thr Cys Ala Met Phe Thr Cys Lys Lys Asn Met Glu Gly Lys 115 120 125 Ile Val Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Thr Val Val Ile Thr Pro His 130 135 140 Ser Gly Glu Glu His Ala Val Gly Asn Asp Thr Gly Lys His Gly Lys 145 150 155 160 Glu Val Lys Ile Thr Pro Gln Ser Ser Ile Thr Glu Ala Glu Leu Thr 165 170 175 Gly Tyr Gly Thr Val Thr Met Glu Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp 180 185 190 Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Gln Met Lys Asp Lys Ala Trp Leu Val 195 200 205 His Arg Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Leu Pro Gly Ala 210 215 220 Asp Thr Gln Gly Ser Asn Trp Ile Gln Lys Glu Thr Leu Val Thr Phe 225 230 235 240 Lys Asn Pro His Ala Lys Lys Gln Asp Val Val Val Leu Gly Ser Gln 245 250 255 Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Met 260 265 270 Ser Ser Gly Asn Leu Leu Phe Thr Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Arg 275 280 285 Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly 290 295 300 Lys Phe Lys Val Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile 305 310 315 320 Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro 325 330 335 Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile 340 345 350 Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu 355 360 365 Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro 370 375 380 Gly Gln Leu Lys Leu Asp Trp Phe Lys Lys Gly 385 390 395 <210> 8 <211> 393 <212> PRT <213> Dengue virus type 3 <400> 8 Met Arg Cys Val Gly Val Gly Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Leu Ser 1 5 10 15 Gly Ala Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu His Gly Gly Cys Val Thr 20 25 30 Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp Ile Glu Leu Gln Lys Thr 35 40 45 Glu Ala Thr Gln Leu Ala Thr Leu Arg Lys Leu Cys Ile Glu Gly Lys 50 55 60 Ile Thr Asn Ile Thr Thr Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala 65 70 75 80 Ile Leu Pro Glu Glu Gln Asp Gln Asn Tyr Val Cys Lys His Thr Tyr 85 90 95 Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser 100 105 110 Leu Val Thr Cys Ala Lys Phe Gln Cys Leu Glu Ser Ile Glu Gly Lys 115 120 125 Val Val Gln His Glu Asn Leu Lys Tyr Thr Val Ile Ile Thr Val His 130 135 140 Thr Gly Asp Gln His Gln Val Gly Asn Glu Thr Gln Gly Val Thr Ala 145 150 155 160 Glu Ile Thr Pro Gln Ala Ser Thr Val Glu Ala Ile Leu Pro Glu Tyr 165 170 175 Gly Thr Leu Gly Leu Glu Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp Phe Asn 180 185 190 Glu Met Ile Leu Leu Thr Met Lys Asn Lys Ala Trp Met Val His Arg 195 200 205 Gln Trp Phe Phe Asp Leu Pro Leu Pro Trp Thr Ser Gly Ala Thr Thr 210 215 220 Glu Thr Pro Thr Trp Asn Arg Lys Glu Leu Leu Val Thr Phe Lys Asn 225 230 235 240 Ala His Ala Lys Lys Gln Glu Val Val Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly 245 250 255 Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Asn Ser Gly 260 265 270 Gly Thr Ser Ile Phe Ala Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Lys Met Asp 275 280 285 Lys Leu Glu Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ala Met Cys Leu Asn Thr Phe 290 295 300 Val Leu Lys Lys Glu Val Ser Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Leu Ile 305 310 315 320 Lys Val Glu Tyr Lys Gly Glu Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser 325 330 335 Thr Glu Asp Gly Gln Gly Lys Ala His Asn Gly Arg Leu Ile Thr Ala 340 345 350 Asn Pro Val Val Thr Lys Lys Glu Glu Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu 355 360 365 Pro Pro Phe Gly Glu Ser Asn Ile Val Ile Gly Ile Gly Asp Lys Ala 370 375 380 Leu Lys Ile Asn Trp Tyr Lys Lys Gly 385 390 <210> 9 <211> 395 <212> PRT <213> Dengue virus type 4 <400> 9 Met Arg Cys Val Gly Val Gly Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Val Ser 1 5 10 15 Gly Gly Ala Trp Val Asp Leu Val Leu Glu His Gly Gly Cys Val Thr 20 25 30 Thr Met Ala Gln Gly Lys Pro Thr Leu Asp Phe Glu Leu Ile Lys Thr 35 40 45 Thr Ala Lys Glu Val Ala Leu Leu Arg Thr Tyr Cys Ile Glu Ala Ser 50 55 60 Ile Ser Asn Ile Thr Thr Ala Thr Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Pro 65 70 75 80 Tyr Leu Lys Glu Glu Gln Asp Gln Gln Tyr Ile Cys Arg Arg Asp Val 85 90 95 Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Gly 100 105 110 Val Val Thr Cys Ala Lys Phe Ser Cys Ser Gly Lys Ile Thr Gly Asn 115 120 125 Leu Val Gln Ile Glu Asn Leu Glu Tyr Thr Val Val Val Thr Val His 130 135 140 Asn Gly Asp Thr His Ala Val Gly Asn Asp Thr Ser Asn His Gly Val 145 150 155 160 Thr Ala Thr Ile Thr Pro Arg Ser Pro Ser Val Glu Val Lys Leu Pro 165 170 175 Asp Tyr Gly Glu Leu Thr Leu Asp Cys Glu Pro Arg Ser Gly Ile Asp 180 185 190 Phe Asn Glu Met Ile Leu Met Lys Met Lys Lys Lys Thr Trp Leu Val 195 200 205 His Lys Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Ala Ala Gly Ala 210 215 220 Asp Thr Ser Glu Val His Trp Asn Tyr Lys Glu Arg Met Val Thr Phe 225 230 235 240 Lys Val Pro His Ala Lys Arg Gln Asp Val Thr Val Leu Gly Ser Gln 245 250 255 Glu Gly Ala Met His Ser Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Val Asp Ser 260 265 270 Gly Asp Gly Asn His Met Tyr Ala Gly His Leu Lys Cys Lys Val Arg 275 280 285 Met Glu Lys Leu Arg Ile Lys Gly Met Ser Tyr Thr Met Cys Ser Gly 290 295 300 Lys Phe Ser Ile Asp Lys Glu Met Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Thr 305 310 315 320 Val Val Lys Val Lys Tyr Glu Gly Ala Gly Ala Pro Cys Lys Val Pro 325 330 335 Ile Glu Ile Arg Asp Val Asn Lys Glu Lys Val Val Gly Arg Ile Ile 340 345 350 Ser Ser Thr Pro Phe Ala Glu Tyr Thr Asn Ser Val Thr Asn Ile Glu 355 360 365 Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Asp 370 375 380 Ser Ala Leu Thr Leu His Trp Phe Arg Lys Gly 385 390 395 <210> 10 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DEN4-80EZip <400> 10 Met Arg Cys Val Gly Val Gly Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Val Ser 1 5 10 15 Gly Gly Ala Trp Val Asp Leu Val Leu Glu His Gly Gly Cys Val Thr 20 25 30 Thr Met Ala Gln Gly Lys Pro Thr Leu Asp Phe Glu Leu Ile Lys Thr 35 40 45 Thr Ala Lys Glu Val Ala Leu Leu Arg Thr Tyr Cys Ile Glu Ala Ser 50 55 60 Ile Ser Asn Ile Thr Thr Ala Thr Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Pro 65 70 75 80 Tyr Leu Lys Glu Glu Gln Asp Gln Gln Tyr Ile Cys Arg Arg Asp Val 85 90 95 Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Gly 100 105 110 Val Val Thr Cys Ala Lys Phe Ser Cys Ser Gly Lys Ile Thr Gly Asn 115 120 125 Leu Val Gln Ile Glu Asn Leu Glu Tyr Thr Val Val Val Thr Val His 130 135 140 Asn Gly Asp Thr His Ala Val Gly Asn Asp Thr Ser Asn His Gly Val 145 150 155 160 Thr Ala Thr Ile Thr Pro Arg Ser Pro Ser Val Glu Val Lys Leu Pro 165 170 175 Asp Tyr Gly Glu Leu Thr Leu Asp Cys Glu Pro Arg Ser Gly Ile Asp 180 185 190 Phe Asn Glu Met Ile Leu Met Lys Met Lys Lys Lys Thr Trp Leu Val 195 200 205 His Lys Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Ala Ala Gly Ala 210 215 220 Asp Thr Ser Glu Val His Trp Asn Tyr Lys Glu Arg Met Val Thr Phe 225 230 235 240 Lys Val Pro His Ala Lys Arg Gln Asp Val Thr Val Leu Gly Ser Gln 245 250 255 Glu Gly Ala Met His Ser Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Val Asp Ser 260 265 270 Gly Asp Gly Asn His Met Tyr Ala Gly His Leu Lys Cys Lys Val Arg 275 280 285 Met Glu Lys Leu Arg Ile Lys Gly Met Ser Tyr Thr Met Cys Ser Gly 290 295 300 Lys Phe Ser Ile Asp Lys Glu Met Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Thr 305 310 315 320 Val Val Lys Val Lys Tyr Glu Gly Ala Gly Ala Pro Cys Lys Val Pro 325 330 335 Ile Glu Ile Arg Asp Val Asn Lys Glu Lys Val Val Gly Arg Ile Ile 340 345 350 Ser Ser Thr Pro Phe Ala Glu Tyr Thr Asn Ser Val Thr Asn Ile Glu 355 360 365 Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Asp 370 375 380 Ser Ala Leu Thr Leu His Trp Phe Arg Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly 385 390 395 400 Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Arg Met Lys 405 410 415 Gln Leu Glu Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu 420 425 430 Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu Arg Gly Gly 435 440 445 Cys Gly Gly 450

Claims (20)

1. 유효량의 혈청형 DEN-1, DEN-2, DEN3, 및 DEN-4의 정제된 뎅기 바이러스 외피 ("E") 단백질, 제약상 허용되는 부형제, 및 유효량의 아주반트 (adjuvant)를 포함하며, 여기서 E 단백질은 각각 그의 N-말단에서 아미노산 잔기 1로부터 시작하여 야생형 E의 길이의 약 80%를 구성하고, DEN-4 E 단백질은 이량체인, 인간 대상체에서 중화 항체의 생산을 유도하는 면역원성 조성물.
2. 제1항에 있어서, E 단백질이 곤충 숙주 세포 내에서 재조합 방식으로 생산되고 발현되는 것인 조성물.
3. 제1항에 있어서, E 단백질이 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster) 슈나이더 (Schneider) 2 (S2) 숙주 세포 내에서 재조합 방식으로 생산되고 발현되는 것인 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 알루미늄 염 아주반트인 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 이스콤 (ISCOM)-형 아주반트인 조성물.
6. 제5항에 있어서, 아주반트가 이스코매트릭스(ISCOMATRIX)인 조성물.
7. 제5항에 있어서, DEN4 단백질의 양이 DEN1, DEN2, 및 DEN3 단백질의 개별적인 양의 약 1.5 내지 약 3배인 조성물.
8. 제7항에 있어서, DEN4 단백질의 양이 DEN1, DEN2, 및 DEN3 단백질의 개별적인 양의 약 2배인 조성물.
9. 유효량의 혈청형 DEN-1, DEN-2, DEN-3, 및 DEN-4의 정제된 뎅기 바이러스 외피 ("E") 단백질 단량체, 제약상 허용되는 부형제, 및 유효량의 아주반트를 포함하며, 여기서 E 단백질은 각각 그의 N-말단에서 아미노산 잔기 1로부터 시작하여 야생형 E의 길이의 약 80%를 구성하여, 상기 E 단백질이 숙주 세포 내에서 재조합 방식으로 발현될 때 성장 배지 내로 분비가능하고, DEN4 E 단백질의 양은 DEN1, DEN2, 및 DEN3 E 단백질의 개별적인 양의 약 1.5 내지 약 3배인, 인간 대상체에서 중화 항체의 생산을 유도하는 면역원성 조성물.
10. 제9항에 있어서, DEN 4 E 단백질의 양이 DEN1, DEN2, DEN3 E 단백질의 개별적인 양의 약 2배인 조성물.
11. 제10항에 있어서, DEN E 단백질의 양이 (a) 약 3 ㎍ DEN1-80E, 약 3 ㎍ DEN2-80E, 약 3 ㎍ DEN3-80E, 및 약 6 ㎍ DEN4-80E; (b) 약 10 ㎍ DEN1-80E, 약 10 ㎍ DEN2-80E, 약 10 ㎍ DEN3-80E, 및 약 20 ㎍ DEN4-80E; (c) 약 50 ㎍ DEN1-80E, 약 50 ㎍ DEN2-80E, 약 50 ㎍ DEN3-80E, 및 약 100 ㎍ DEN4-80E; (d) 약 3 ㎍ DEN1-80E, 약 3 ㎍ DEN2-80E, 약 3 ㎍ DEN3-80E, 및 약 6 ㎍ DEN4-80EZip; (e) 약 10 ㎍ DEN1-80E, 약 10 ㎍ DEN2-80E, 약 10 ㎍ DEN3-80E, 및 약 20 ㎍ DEN4-80EZip; 및 (f) 약 50 ㎍ DEN1-80E, 약 50 ㎍ DEN2-80E, 약 50 ㎍ DEN3-80E, 및 약 100 ㎍ DEN4-80EZip로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 조성물.
12. 치료 유효량의 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 환자에서 보호 면역 반응을 일으키는 방법.
13. 유효량의 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 투여하여, 뎅기 질환으로부터 보호를 제공하는 것을 포함하는, 뎅기 바이러스 유도 질환에 대해 인간에서 면역 보호를 제공하는 방법.
14. 정제된 뎅기 바이러스 외피 ("E") 단백질 및 제약상 허용되는 부형제 및 유효량의 아주반트를 포함하는 면역원성 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 E 단백질은 그의 N-말단에서 아미노산 잔기 1로부터 시작하여 야생형 E의 길이의 약 80%를 구성하고, 백신은 인간 대상체에서 중화 항체의 생산을 유도하는 것인, 인간 환자에서 보호 면역 반응을 일으키는 방법.
15. 제14항에 있어서, 면역원성 조성물이 혈청형 DEN1, DEN2, DEN3, 및 DEN4의 뎅기 바이러스 E 단백질을 포함하며, 여기서 DEN4 E 단백질은 이량체인 방법.
16. 제14항 또는 제15항에 있어서, DEN4 단백질의 양이 조성물 내의 DEN1, DEN2, 및 DEN3 단백질의 개별적인 양의 약 2배인 방법.
17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 근육내, 피하 또는 피내 투여 경로를 통해 투여되는 것인 방법.
18. 유효량의 혈청형 DEN-1, DEN-2, DEN3, 및 DEN-4의 정제된 뎅기 바이러스 외피 ("E") 단백질, 제약상 허용되는 부형제, 및 유효량의 아주반트를 포함하며, 여기서 E 단백질은 각각 그의 N-말단에서 아미노산 잔기 1로부터 시작하여 야생형 E의 길이의 약 80%를 구성하고, DEN-4 E 단백질은 이량체인, 뎅기 질환의 예방 또는 치료를 위한 면역원성 조성물.
19. 제16항에 있어서, 면역결핍 환자에게 투여되는 조성물.
20. 뎅기 감염 또는 질환의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에 있어서 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.

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