MX2013004741A - Vacuna de subunidad recombinante del virus del dengue. - Google Patents

Abstract

La presente invención provee vacunas y composiciones inmunogénicas del virus del dengue para su administración a sujetos humanos; las composiciones de vacuna de la presente invención comprenden formas monoméricas y/o diméricas producidas recombinantemente de glicoproteína truncada de la envoltura del virus del dengue que, cuando se formulan junto con un adyuvante y un vehículo farmacéuticamente aceptable, inducen respuestas inmunes tetravalentes equilibradas; en modalidades preferidas de las composiciones descritas en la presente, el componente de proteína DEN4 es una forma dimérica de DEN4; las composiciones están diseñadas para ser aceptables para uso en la población general, incluyendo individuos inmunosuprimidos, inmunocomprometidos e inmunosenescentes; también se proveen en la presente métodos para inducir una respuesta inmune protectora en una población de pacientes humanos, administrando las composiciones descritas en la presente a los pacientes.

Description

VACUNA DE SUBUNIDAD RECOMBINANTE DEL VIRUS DEL DENGUE REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional de EE. UU. No. de serie 61/408,310, presentada el 29 de Octubre de 2010, cuyo contenido se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

DECLARACIÓN CON RESPECTO A INVESTIGACIÓN PATROCINADA FEDERALMENTE La invención fue patrocinada en parte por las subvenciones del gobierno de EE. UU. números 5U01 AI056410-03 y 1 UC1 AI062481 (NIH), y W81XWH-06-2-0035 (DOD). El gobierno de EE. UU. tiene ciertos derechos sobre esta invención.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a composiciones que provocan una respuesta inmune contra infecciones del virus del dengue, usadas para la prevención y/o tratamiento de infecciones del virus del dengue en sujetos humanos, y las manifestaciones clínicas de las mismas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La familia Flaviviridae incluye el prototipo virus de la fiebre amarilla (YF), los cuatro serotipos del virus del dengue (DEN-1 , DEN-2, DEN-3 y DEN-4), el virus de la encefalitis japonesa (JE), el virus de la encefalitis transmitido por garrapata (TBE), el virus del Nilo Occidental (WN), el virus de la encefalitis de San Luis (SLE), y aproximadamente otros 70 virus causantes de enfermedad. Los flavivirus son virus pequeños envueltos que contienen un genoma de ARN único de cadena positiva. Diez productos de gen son codificados por un solo marco de lectura abierto, y son traducidos como una poliproteína organizada en el orden: cápside (C), "preMembrana" (prM, que es procesada a "Membrana" (M) justo antes de la liberación del virión de la célula), "envoltura" (E), seguida por las proteínas no estructurales (NS) NS1 , NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b y NS5 (revisado por Chambers, T. J. et al., Annual Rev Microbio! (1990) 44:649-688; Henchal, E. A. y Putnak, J. R., Clin Microbiol Rev. (1990) 3:376-396). Después son producidas proteínas flavivirales individuales por medio de eventos de procesamiento precisos mediados por hospedero, así como proteasas codificadas viralmente.

La envoltura de los flavivirus deriva de la membrana celular del hospedero y contiene las glicoproteínas de membrana anclada a la membrana (M) y de envoltura (E) codificadas viralmente. La glicoproteína E es la proteína estructural viral más grande y contiene dominios funcionales responsables de la unión a la superficie celular y actividades de fusión ¡ntraendosómicas. También es un blanco principal del sistema inmune del hospedero, induciendo la producción de anticuerpos neutralizantes de virus que están asociados con inmunidad protectora.

Los virus del dengue son transmitidos al hombre por los mosquitos del género Aedes, principalmente A. aegypti y A. albopictus. La infección por el virus del dengue produce un escenario clínico diverso que va desde una enfermedad febril no aparente o ligera, pasando por fiebre de dengue clásica (DF) caracterizada por fiebre alta, cefalea, dolor de articulaciones y músculos, sarpullido, linfadenopatía y leucopenia (Gibbons, R. V. y D. W. Vaughn, British Medical Journal (2002) 324:1563-1566), hasta una forma más severa de la infección, más común en los niños, la fiebre de dengue hemorrágica/síndrome de choque de dengue (DHF/DSS), marcada por permeabilidad vascular y/o manifestaciones hemorrágicas severas que van desde la presencia de petequias y equimosis hasta hemorragia severa espontánea y choque profundo que, si no se le trata, produce la muerte. Sin un diagnóstico y una pronta intervención médica, el inicio repentino y avance rápido de DHF/DSS pueden ser fatales.

Los virus del dengue son el grupo más significativo de virus transmitidos por artrópodo en cuanto a la morbilidad y mortalidad global; se calcula que ocurren anualmente cien millones de casos de fiebre de dengue, que incluyen de 250,000 a 500,000 casos de DHF/DSS (Gubler, D. J., Clin. Microbiol. Rev. (1998) 1 1 :480-496; Gibbons, supra). Con el aumento global de la población, la urbanización de la población especialmente por todos los trópicos, y la falta de medidas sostenidas de control del mosquito, el vector del mosquito del dengue ha expandido su distribución por todos los trópicos, subtrópicos, y algunas zonas templadas, llevando el riesgo de infección del dengue a más de la mitad de la población mundial. Los viajes modernos en avión y la emigración humana han facilitado la distribución global de los serotipos del dengue, de tal manera que múltiples serotipos del dengue son ahora endémicos en muchas regiones. Ha habido un aumento de la frecuencia de las epidemias del dengue y la incidencia de DHF/DSS en los últimos 20 años o más. Por ejemplo, en el sureste de Asia, la DHF/DSS es una causa principal de hospitalización y muerte entre los niños (Gubler, supra; Gibbons y Vaughn, supra).

Hasta la fecha, el desarrollo de vacunas de flavivirus ha logrado un éxito variado. Existen cuatro enfoques básicos que se han puesto en práctica para producir candidatos de vacuna para proteger contra las enfermedades por flavivirus: vacunas vivas atenuadas, vacunas de virus completo desactivado, vacunas de proteína de subunidad recombinante, y vacunas basadas en ADN. Durante décadas ha estado disponible una vacuna viva atenuada para el virus de la fiebre amarilla. Se ha mostrado el uso de vacunas de virus completo desactivado para virus de TBE y JE.

A pesar del éxito de las vacunas de YF, JE y TBE arriba indicado, el uso de métodos de virus vivo atenuado y virus desactivado para desarrollar vacunas para el virus del dengue, ha encontrado retos significativos. Existen cuatro serotipos del virus del dengue (DEN1 , DEN2, DEN3 y DEN4), y por todas las regiones endémicas del dengue del mundo se encuentran circulando cepas de cada serotipo. La infección natural confiere inmunidad de larga duración para el serotipo infeccioso pero no para otros serotipos del dengue. Las formas más severas de la enfermedad (DHF/DSS) ocurren más frecuentemente después de una infección de dengue secundaria, cuando la infección con un serotipo de virus de dengue es seguida por una segunda infección con otro serotipo. Se ha formulado la hipótesis de que la asociación más frecuente de DHF y DSS con una infección de dengue secundaria se debe a anticuerpos no neutralizantes inducidos por infección con un tipo de virus, que intensifican la infecciosidad de un segundo tipo de virus de dengue (intensificación dependiente de anticuerpo -ADE). Este concepto tiene implicaciones importantes para el desarrollo de una vacuna, ya que una vacuna eficaz para el dengue debe inducir simultáneamente anticuerpos neutralizantes específicos equilibrados y células de memoria específicas contra los cuatro serotipos del dengue (Halstead y Deen, 2002). Se ha visto que esto es un problema mayor en el desarrollo de una vacuna para el dengue.

Hasta la fecha, la mayoría de las vacunas probadas clínicamente son vacunas vivas atenuadas, que presentan los problemas de seguridad comunes a todas las vacunas virales vivas administradas a los sujetos sanos. La atenuación baja del virus puede dar como resultado eventos adversos relacionados con la vacuna, mientras que la atenuación excesiva puede anular la eficacia de la vacuna. También puede ocurrir una reversión al tipo silvestre o mutación hacia mayor virulencia (o menor eficacia). Más aún, aunque estén atenuadas correctamente, las vacunas virales vivas están contraindicadas en poblaciones de pacientes específicas, tales como pacientes inmunodeficientes o inmunosuprimidos, y también en segmentos particulares de la población normal, tales como mujeres embarazadas, niños o personas de avanzada edad.

Problemas adicionales con los enfoques de virus vivo atenuado para el dengue incluyen los retos asociados con la combinación de cuatro virus que se replican independientemente en una vacuna tetravalente. Los problemas con la interferencia han fastidiado todas las formulaciones tetravalentes probadas hasta la fecha y han resultado en inmunidad tetravalente desequilibrada y la necesidad de administrar múltiples dosis en un intervalo prolongado (por ejemplo, 0, 6, 12 meses). Esto no es lo ideal y podría acarrear problemas de seguridad en individuos que han sido inmunizados parcialmente y se han expuesto al virus de tipo silvestre, ya que estos individuos pueden tener un riesgo más alto de enfermedad exacerbada (por ejemplo, fiebre de dengue hemorrágica).

Ivy et al. (patente de EE. UU. 6,432,41 1) describen una vacuna de subunidad tetravalente que comprende 80% de proteínas E de DEN 1-4 (equivalentes a los aminoácidos 1-395 del polipéptido de envoltura DEN-2). Ivy et al, supra, también reportan composiciones que comprenden 80% de E de DEN 1-4 y adyuvante ISCOMATRIX®. Sin embargo, persiste la necesidad de vacunas tetravalentes estables que puedan inducir una respuesta inmune equilibrada contra los cuatro serotipos del dengue.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee vacunas y composiciones inmunogénicas para usarse en poblaciones de pacientes humanos para la prevención y/o tratamiento de enfermedades asociadas con las infecciones del virus del dengue. Las vacunas están formadas por la combinación de proteínas de subunidad recombinantes derivadas de proteínas de envoltura del virus del dengue y un adyuvante. Las vacunas del virus del dengue de la presente invención están diseñadas para inducir respuestas inmunes tetravalentes protectoras equilibradas contra DEN1 , DEN2, DEN3 y DEN4, con un perfil de seguridad aceptable.

La formulación de la vacuna única depende de proteínas de subunidad de envoltura recombinantes novedosas, plegadas correctamente ("dengue 80E" o "DEN-80E" o "DEN1-80E" o "DEN2-80E" o "DEN3-80E" o "DEN4-80E" o "DEN4-80EZip"), combinadas con adyuvantes, para producir las formulaciones de vacuna. La combinación única en proporciones variables de formas monoméricas y/o diméricas de las proteínas de envoltura recombinantes de la formulación, está diseñada específicamente para manejar la necesidad de respuestas tetravalentes equilibradas. Las vacunas están diseñadas para inducir respuestas inmunes protectoras tetravalentes equilibradas, relevantes, tal como de anticuerpos neutralizantes de virus, en voluntarios humanos sanos, y para mantener un perfil de seguridad aceptable para su administración en individuos sanos e inmunocomprometidos. Una ventaja adicional de las composiciones de vacuna descritas en la presente es que no contienen cantidades significativas de la proteína de pre-membrana (prM), minimizando potencialmente el riesgo de ADE que se ha asociado recientemente con los anticuerpos anti-prM (Dejnirattisai et al., Science 328:745-748 (2010); Rodenhuis-Zybert et ai, PLos Pathogens 6:1-9 (2010)). Las proteínas 80E son expresadas conjuntamente en la traducción con prM, pero la poliproteína es cortada conforme pasa por la ruta secretoria en la unión prM-E por la señalasa de la célula hospedera, que libera el componente 80E al medio de cultivo para su purificación (Clements et al., 2010 Vaccine 28:2705).

Otros aspectos de esta invención incluyen el uso de cantidades terapéuticamente eficaces de las vacunas en un vehículo aceptable como un agente inmunoprofiláctico contra la enfermedad causada por la infección del virus del dengue, y el uso de la cantidad terapéuticamente eficaz de las vacunas en un vehículo aceptable como una composición farmacéutica.

Como se usa en toda la especificación y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen la referencia plural, a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera.

Como se usan en toda la especificación y las reivindicaciones anexas, se aplican las siguientes definiciones y abreviaturas: El término "tratamiento" se refiere tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas. Los individuos en necesidad de tratamiento incluyen aquellos que ya tienen infección de dengue, ya sea que manifiesten o no los síntomas clínicos, así como también los que están en riesgo de ser infectados con el dengue, es decir, los sujetos/pacientes en los que se quiere prevenir la infección del dengue y/o sus manifestaciones clínicas. El tratamiento de un paciente con las vacunas del dengue de la invención incluye uno o más de lo siguiente: inducir/aumentar una respuesta inmune contra el dengue en el paciente; prevenir, aliviar, anular o reducir la probabilidad de las manifestaciones clínicas del dengue en los pacientes que han sido infectados con el dengue; prevenir o reducir la probabilidad de desarrollar fiebre de dengue, DHF o DSS, y/o otra enfermedad o complicación asociada con la infección del dengue; reducir la severidad o duración de los síntomas clínicos de la infección del dengue y/o otra enfermedad o complicación asociada con el dengue; y prevenir o reducir la probabilidad de infección del dengue.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" significa que se introduce suficiente composición de vacuna en un paciente para producir un efecto deseado que incluye, sin limitación: inducir/aumentar una respuesta inmune contra el dengue en el paciente; prevenir o reducir la probabilidad de la infección del dengue o la infección recurrente del dengue; prevenir, aliviar o anular las manifestaciones clínicas de la infección del dengue en pacientes que han sido infectados con el dengue; prevenir la fiebre del dengue, DHF y/o DSS; reducir la severidad o duración de la enfermedad asociada con el dengue. El experto en la técnica reconocerá que esta cantidad puede variar.

El término "respuesta inmune" se refiere a una respuesta inmune mediada por célula (células T) y/o una respuesta de anticuerpo (células B).

El término "paciente" se refiere a cualquier ser humano que va a recibir las composiciones inmunogénicas/vacuna para el dengue que se describen en la presente, incluso individuos inmunocompetentes e inmunocomprometidos. Como se define aquí, un "paciente" incluye los que ya están infectados con el dengue, ya sea por infección natural o vacunación, o los que pueden estar expuestos subsiguientemente.

"MAA" significa adyuvante de aluminio de Merck. MAA es un adyuvante de hidroxifosfato sulfato de aluminio amorfo. El término "MAA" se usa aquí intercambiablemente con el término "hidroxifosfato sulfato de aluminio amorfo" o "AAHS." Un "adyuvante de tipo ISCOM" es un adyuvante que comprende un complejo estimulador inmune (ISCOM), que está comprendido de una saponina, colesterol y un fosfolipido, que forman juntos una partícula característica de tipo jaula, que tiene una estructura esférica única de tipo jaula que contribuye a su función (para una revisión, véase Barr y Mitchell, Immunology and Cell Biology 74: 8-25 ( 996)). Este término incluye tanto adyuvantes ISCOM que son producidos con un antígeno y comprenden antígeno dentro de la partícula ISCOM, como adyuvantes de matriz ISCOM, que son adyuvantes de tipo ISCOM huecos que son producidos sin antígeno. En modalidades preferidas de las composiciones y métodos provistos en la presente, el adyuvante de tipo ISCOM es un adyuvante de partícula de matriz ISCOM, tal como ISCOMATRIX®, que se fabrica sin antígeno (ISCOM® e ISCOMATRIX® son marcas registradas de CSL Limited, Parkville, Australia).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las figuras 1A-1 B muestran un gel de electroforesis en gel de poliacrilamida -dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) teñido con plata (figura 1A) y Western blot (figura 1 B) de DEN1-80E, DEN2-80E, DEN3-80E y DEN4-80EZip purificadas grado GMPc (1 pg de cada muestra) . Todas las muestras se corrieron bajo condiciones no reductoras sobre geles al 10%. El Western blot se desarrolló usando un anticuerpo monoclonal de ratón (4G2) que reconoce todos los virus del dengue. Los tamaños de los marcadores de peso molecular (en kD) se indican a la izquierda del gel y el blot.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se describió arriba, se han hecho varios intentos para desarrollar una vacuna del dengue para uso humano, pero hasta ahora estos intentos han sido obstaculizados por problemas de seguridad y/o eficacia. Para ese fin, la presente invención provee composiciones que son útiles para la prevención y/o tratamiento. de infecciones del virus del dengue en sujetos humanos, y/o las manifestaciones clínicas de las mismas.

Muchos esfuerzos anteriores han estado dirigidos al desarrollo de vacunas del dengue humanas que sean tanto seguras como suficientemente inmunogénicas (por ejemplo, capaces de inducir respuestas tetravalentes equilibradas en los individuos inmunizados). A pesar de estos esfuerzos, hasta la fecha no se han establecido vacunas del virus del dengue para uso humano que cumplan completamente con estas condiciones. Por lo tanto, el problema técnico que la invención intenta resolver es el descubrimiento de vacunas del virus del dengue que satisfagan dos condiciones principales; capacidad para (1) inducir respuestas inmunes protectoras tetravalentes, equilibradas, en los individuos vacunados (sujetos humanos), y (2) mantener un perfil de seguridad excepcional en sujetos humanos que incluyen niños, personas de avanzada edad y personas inmunocomprometidas. Esto representa un reto significativo en el desarrollo de la vacuna del virus del dengue, y hasta la fecha ninguna formulación de vacuna ha mostrado manejar adecuadamente todos los aspectos de este problema técnico. Existe una demanda alta, creciente y no satisfecha de una solución conforme aumenta el predominio de las infecciones virales del dengue.

Todas las proteínas de envoltura del flavivirus comparten homología significativa. Los anticuerpos dirigidos contra los epítopes contenidos dentro de los tres dominios externos de la proteína de envoltura son capaces de neutralización viral, es decir, de inhibición de la infección viral de las células susceptibles in vitro. Un título alto de anticuerpos neutralizantes de virus generalmente se acepta como la mejor correlación in vitro de la protección in vivo contra la infección flaviviral y la prevención de enfermedad inducida por flavivirus (Markoff Vaccine (2000) 18:26-32; Ben-Nathan et al., J. Inf. Diseases (2003) 188:5-12; Kreil et al., J. Virol. (1998) 72:3076-3081 ; Beasley et al., Vaccine (2004) 22:3722-26). Por lo tanto, una vacuna que induce respuestas neutralizantes de virus del dengue de título alto probablemente protegerá a los vacunados contra la enfermedad inducida por los virus del dengue.

Se cree que la asociación más frecuente de DHF y DSS con la infección de dengue secundaria se debe a la presencia de anticuerpos no neutralizantes cruzadamente reactivos que se originan de la primera infección, que regulan positivamente la replicación del segundo serotipo infeccioso promoviendo la infección de células que llevan el receptor Fe, tales como monocitos/macrófagos, por medio de la ruta mediada por el receptor Fe (ADE; Halstead 1988; Halstead 1989). Alternativamente, una hipótesis más reciente sostiene que por medio del fenómeno de "sin antigénico original" la respuesta inmune inicial es dirigida principalmente contra el primer serotipo infeccioso, lo que permite al segundo serotipo infeccioso replicarse y tomar ventaja antes de que pueda iniciarse una respuesta inmune más específica (Mongkolsapaya et al., 2003). Sin importar el mecanismo, este fenómeno de intensificación de infección secundaria tiene implicaciones importantes para el desarrollo de la vacuna, ya que una vacuna eficaz del dengue debe inducir simultáneamente anticuerpos neutralizantes específicos equilibrados y células de memoria especificas contra los cuatro serotipos del dengue (Halstead y Deen, 2002). Se ha visto que esto es un problema mayor en el desarrollo de una vacuna para el dengue.

Para demostrar cómo es que este problema ha causado problemas en el desarrollo de la vacuna del dengue, es útil una revisión de los esfuerzos realizados hasta la fecha. Se ha invertido una cantidad significativa de esfuerzo para desarrollar cepas candidatas de vacuna de dengue vivo atenuado; sin embargo, muchas de las cepas probadas han resultado insatisfactorias y la interferencia entre los serotipos virales ha resultado ser muy desafiante. Dos programas de desarrollo que usaron virus atenuados de forma clásica avanzaron hasta las pruebas clínicas de fase 2, pero fueron abortados o detenidos en la fase 2 debido a problemas de interferencia y/o producción.

Como una alternativa de los métodos tradicionales de vivo-atenuado para desarrollar vacunas de flavivirus, se han utilizado métodos quiméricos recombinantes. Este método utiliza como base una cepa atenuada conocida, y los genes apropiados (prM y E para flavivirus) de un virus relacionado de interés sustituyen a los genes equivalentes del virus base. Un enfoque que se ha utilizado para el desarrollo de una vacuna de WN y del dengue, es el uso de una quimera intertípica basada en la cepa DEN-4 atenuada (Bray, M. et al. , J. Virol. (1996) 70:4162-4166; Chen, W., et al., J. Virol. (1995) 69:5186-5190; Bray, M. y Lai, C.-J., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1991) 88:10342-10346; Lai, C. J. et al., Clin. Diagn. Virol. (1998) 10: 173- 179). Otro enfoque es el uso de la cepa atenuada YF 17D como una base para desarrollar vacunas quiméricas recombinantes para el virus JE, virus DEN, y virus WN (Guy, B. et al. Vaccine (201 1 ), doi: 10.1016/j.vaccine.201 .06.094; Lai, C.J. y Monath T.P. Adv Virus Res (2003) 61 :469-509; Monath et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA (2006) 103:6694). Aunque el uso de métodos quiméricos de virus vivo-atenuado tiene ventajas sobre los métodos tradicionales de virus vivo-atenuado, los métodos quiméricos todavía enfrentan muchas dificultades para el desarrollo de cepas atenuadas correctamente y para lograr respuestas tetravalentes equilibradas contra los virus del dengue.

Actualmente existen vacunas disponibles comercialmente producidas para JE y TBE utilizando métodos de virus completo desactivado. Como con los métodos de virus vivo atenuado, el uso de métodos de virus desactivado para algunos flavivirus no ha garantizado el éxito con otros flavivirus. Por ejemplo, los esfuerzos por desarrollar vacunas de DEN desactivadas han tenido éxito limitado. Estos enfoques han estado limitados principalmente por la incapacidad de obtener rendimientos virales adecuados de los sistemas de cultivo celular. Los rendimientos de virus a partir de células de insecto tales como las células C6/36 generalmente están en la escala de 104 a 105 pfu/ml, muy por debajo de los niveles necesarios para generar una vacuna de virus desactivado rentable. Los rendimientos a partir de células de mamífero, que incluyen células LLC-MK2 y Vero, son más altos, pero los rendimientos pico, aproximadamente 106 pfu/ml de una línea celular Vero única, son todavía más bajos de lo necesario para lograr un producto de vacuna verdaderamente rentable. Los rendimientos bajos también pueden tener un impacto sobre la capacidad para inducir respuestas tetravalentes equilibradas.

También se ha evaluado el uso de métodos de ADN desnudo en un esfuerzo por desarrollar vacunas de flavivirus no replicativo para DEN, JE, TBE y WN (Porter et al, 1998; Raviprakash et al, 2000; Konishi et al, 1998; Chang et al, 2000; Schmaljohn et al, 1997; Aberle et al, 1999; Davis et al, 2001). El método de ADN ofrece ventajas de facilidad de producción, uso de secuencias definidas, potencial para provocar inmunidad tanto humoral como celular debido a la expresión de antígenos in vivo. A pesar de estas ventajas, la capacidad para inducir una respuesta inmune consistente y robusta continúa siendo un obstáculo mayor para este enfoque. Aunque se ha tenido cierto éxito para inducir respuestas inmunes protectoras relevantes en modelos de animal (Davis et al, 2001 ), la capacidad para inducir estas respuestas en los humanos no se ha establecido todavía. Adicionalmente, las vacunas de ADN enfrentan un escrutinio regulatorio adicional debido a problemas sobre la integración de las secuencias de plásmido en el genoma del hospedero y el potencial de generar auto-anticuerpos para ADN de doble cadena.

El uso de proteínas de subunidad recombinantes para el desarrollo de la vacuna de flavivirus es otro ejemplo de un enfoque de virus no replicativo. Este enfoque ofrece las ventajas de producción de productos bien definidos y el potencial de provocar respuestas inmunes especificas. Aunque existe el potencial para generar respuestas inmunes relevantes y robustas, existen retos asociados con el uso de las subunidades recombinantes. Esto se debe tanto a la calidad de las proteínas (estructura de tipo natural) como a la necesidad de adyuvantes para provocar las respuestas inmunes deseadas. Las vacunas de subunidad recombinante tienen una historia larga de seguridad y eficacia protectora, ilustrada muy eficientemente por las vacunas de subunidad recombinante de la hepatitis B (por ejemplo, RECOMBIVAX HB® (Merck Sharp & Dohme Corp., Whitehouse Station, NJ) y ENGERIX B® (GlaxoSmithKIine Biologicals SA Corp., Bélgica), y más recientemente por las vacunas del virus de papiloma humano (por ejemplo, GARDASIL® (Merck Sharp & Dohme Corp.) y CERVARIX® (GlaxoSmithKIine Biologicals SA Corp.). El hecho de que no haya virus replicativo presente en ningún momento durante la producción, ayuda a asegurar un riesgo muy limitado asociado con la administración de la vacuna de subunidad a individuos sanos o inmunocomprometidos en una situación profiláctica. Más aún, se ha mostrado que las vacunas de la hepatitis B y de papilomavirus humano son muy inmunogénicas y eficaces.

La expresión de proteínas de flavivirus recombinantes se enfoca en las proteínas estructurales C, prM y E, y la proteína no estructural NS1. La proteína E ha sido el sujeto de la mayoría de los esfuerzos, ya que esta proteína está expuesta sobre la superficie del virus y está implicada en aspectos biológicos importantes del virus, y es el blanco de los anticuerpos neutralizantes en los hospederos infectados (Chambers, supra; Masón, P. W., J. Gen Virol (1989) 70:2037-2048). Además, los anticuerpos monoclonales dirigidos contra proteínas E purificadas de flavivirus son neutralizantes in vitro y algunas han mostrado conferir protección pasiva in vivo (Henchal, E.A. et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. (1985) 34:162-169; Heinz, F. X. et al., Virology (1983) 130:485-501 ; Kimura-Kiroda, J. y Yasui, K., J. Immunol. (1988) 141 :3606-3610; Trirawatanapong, T. et al. , Gene (1992) 116:139-150).

Con el fin de producir proteínas de flavivirus recombinantes para usarse en vacunas, se ha utilizado una variedad de sistemas de expresión, tales como E. coli, levadura y baculovirus. Estos intentos han sido obstaculizados por rendimientos bajos, procesamiento inapropiado de las proteínas de flavivirus e inmunogenicidad de moderada a baja (Eckels y Putnak, 2003). Existe la necesidad de mantener la estructura de tipo nativa de la proteína E para que las proteínas recombinantes sirvan como potentes inmunógenos. La capacidad para producir proteínas E recombinantes con estructura de tipo nativa depende mucho del sistema de expresión utilizado. La patente de EE. UU. 6,165,477, describe el procedimiento para la expresión de subunidades de proteína E de DEN en células de levadura. Las subunidades E expresadas en células de levadura muestran una estructura mejorada sobre los sistemas bacterianos, pero todavía enfrentan problemas con la hiperglicosilación y los rendimientos.

En estudios más recientes, se ha establecido que el uso de células de insecto transformadas para expresar formas truncadas de la proteina E, resulta en productos que mantienen la estructura de tipo nativa, determinada por cristalografía de rayos X (Modis et al, 2003; Modis et al, 2005; y Zhang et al, 2004). El uso del sistema de células de insecto transformadas establemente ha resultado en la expresión exitosa de proteínas E truncadas recombinantes de flavivirus, tales como los serotipos DEN 1-4, JE, TBE y WN. La patente de EE. UU. 6,136,561 describe el proceso de expresión de proteínas de la subunidad E de DEN, JE, TBE y YF en células de insecto transformadas establemente. Ivy et al. (patente de EE. UU. 6,432,41 1 ) describen la utilidad de proteínas de la subunidad E de flavivirus (equivalentes a los aminoácidos 1-395 del polipéptido de envoltura de DEN-2), expresadas en células de insecto transformadas establemente, como vacunas candidatas cuando se combinan con estructuras de tipo iscom que contienen saponinas. Ivy et al. también reportan una vacuna de subunidad tetravalente que comprende 80% de proteínas E de los cuatro tipos de DEN (DEN 1-4), asi como composiciones que comprenden 80% de E DEN 1-4 y adyuvante ISCOMATRIX®. Se hizo un estudio piloto pequeño analizando la inmunogenicidad y eficacia protectora de esta vacuna tetravalente en nonos (Clements et al., Vaccine 28: 2705-15 (2010); Coller et al. Vaccine 29: 7267-75 (2011)). Se afirma que la vacuna induce anticuerpos neutralizantes e inmunidad protectora contra más de un tipo de dengue. La patente de EE. UU. 6,749,857 describe la expresión de formas diméricas de las proteínas truncadas de envoltura del dengue, tales como la DEN4-80EZip descrita en la presente solicitud. La patente de EE. UU. 6,416,763 describe el beneficio de incluir la proteína 1 (NS1 ) no estructural producida por líneas de células de insecto transformadas establemente en una formulación de vacuna basada en E recombinante. Estas patentes muestran la utilidad de las subunidades de flavivirus expresadas a partir de células de insecto transformadas establemente, cuando se combinan con estructuras de tipo iscom que contienen saponina en modelos de animal. Sin embargo, estas patentes no manejan ni predicen una formulación de vacuna basada únicamente en la proteína E formulada con un adyuvante que ha mostrado inmunogenicidad en sujetos humanos. Muchos candidatos de vacuna han mostrado eficacia potencial en modelos de animal pero no han logrado hacer la transición exitosa al uso humano.

En general, el uso de enfoques de vacuna de virus no replicativo, tal como virus desactivado, proteína de subunidad recombinante y ADN, tiene varias ventajas sobre los enfoques de vacuna de virus vivo atenuado. Principalmente estas ventajas están relacionadas con la seguridad pues no se suministra el virus vivo a los sujetos. Otras ventajas incluyen la capacidad para acelerar los programas de dosificación en comparación con los virus vivos atenuados y la capacidad para modular y equilibrar las respuestas inmunes ajusfando las dosis y los adyuvantes.

En el desarrollo de vacunas de flavivirus para humanos ha sido difícil predecir la seguridad e inmunogenicidad de las vacunas candidatas en los sujetos humanos, basándose en los datos preclínicos en los modelos de animal. Esto ha resultado ser un reto para muchos de los candidatos de vacuna de virus vivos atenuados que han avanzado a las pruebas clínicas humanas. El ejemplo más notable de una falla completa fue el perfil de seguridad mostrado por un aislado clonado del tipo 3 del virus del dengue que presentó un perfil de seguridad muy atractivo en primates no humanos, pero que indujo fiebre de dengue en los receptores de la vacuna en Hong Kong (Sánchez et al., FEMS Immunol. Med. Microbio!. (2006) 24:4914-26). Este reto se puede reducir usando vacunas de virus no replicativo que no requieren el mismo nivel de interacciones de virus/hospedero para lograr la eficacia de vacuna de las vacunas de virus replicativo. Sin embargo, existen muchos ejemplos de candidatos de vacuna de virus no replicativos que han mostrado buena seguridad y eficacia protectora en modelos preclínicos, que han fallado para funcionar como vacunas seguras y eficaces en los humanos (por ejemplo, la vacuna de RSV desactivada; Murphy et al., J. Clin. Microbio!. (1986) 24:197-202). De esta manera, puede haber múltiples retos asociados con el desarrollo de vacunas seguras y eficaces para flavivirus, y frecuentemente el desarrollo requiere años de prueba y error. Además, los estudios preclínicos basados en modelos de animal pueden no ser predictivos del funcionamiento de la vacuna en sujetos humanos; y por lo tanto, los datos en humanos son críticos para demostrar el potencial de una vacuna candidata.

Aunque existen muchas vacunas del dengue en investigación en varias etapas de investigación y desarrollo preclínico, solo seis candidatos de vacuna han procedido hasta las pruebas clínicas humanas. Las seis vacunas que se han probado en estudios clínicos son: (1) quimeras vivas atenuadas del dengue del serotipo 4 (por ejemplo, Durbin et al. 2006, Human Vaccines 2: 167; Blaney et al., 2005, J. Virol. 79:5516); (2) quimeras vivas atenuadas de la fiebre amarilla-dengue (Chimerivax; por ejemplo, Morrison et al., 2010, J. Inf. Dis. 201 :370); (3) vacunas de virus atenuado clásicamente, desarrolladas por el Walter Reed Army Institute of Research (por ejemplo, Sun et al., 2009, Human Vaccines 5:33); (4) quimeras vivas atenuadas del dengue del serotipo 2 (por ejemplo, Huang et al., 2003, J. Virol. 77: 1 1436); (5) una vacuna basada en ADN que expresa prM-E (Raviprakash et al., 2006, Virology 353:166); y (6) vacunas de virus atenuado clásicamente, desarrolladas por Mahidol University (por ejemplo, Bhamarapravati et al., 1987). Sin embargo, existen dificultades intrínsecas e inconvenientes potenciales asociados con cada una de las vacunas candidatas.

Problemas adicionales con los enfoques de virus vivo atenuado para el dengue incluyen los retos asociados con la combinación de cuatro virus que se replican independientemente en una vacuna tetravalente. Los problemas con la interferencia han fastidiado todas las formulaciones tetravalentes probadas hasta la fecha y han resultado en inmunidad tetravalente desequilibrada y la necesidad de administrar 3 dosis en un intervalo prolongado (por ejemplo, 0, 6, 12 meses). Esto no es lo ideal y podría acarrear problemas de seguridad en individuos que han sido inmunizados parcialmente y se han expuesto al virus de tipo silvestre, ya que estos individuos pueden tener un riesgo más alto de enfermedad exacerbada (por ejemplo, fiebre de dengue hemorrágica).

La vacuna del dengue final que se ha probado en las pruebas clínicas es una vacuna de ADN. Las vacunas de ADN desnudo no están probadas en este momento para ninguna enfermedad infecciosa, y no está resuelto el problema de inmunopatología potencial debido a la inducción de una reacción autoinmune al ADN durante el largo plazo. Las formulaciones de vacuna probadas provocaron poco o nada de anticuerpos neutralizantes del virus, sugiriendo falta de eficacia potencial.

Un aspecto de la invención descrita en la presente provee una glicoproteína de subunidad de la envoltura del virus del dengue (por ejemplo, DEN1 -80E, DEN2-80E, DEN3-80E, DEN4-80E, o DEN4-80EZip) que es producida y secretada usando un sistema de expresión recombinante, y combinada con un adyuvante en una formulación de vacuna (por ejemplo, HBV-001 D1 ). Las vacunas descritas son eficaces para inducir una respuesta de anticuerpo neutralizante de virus contra los virus de dengue homólogos en voluntarios humanos, y tienen un perfil de seguridad aceptable para sujetos humanos sanos y en riesgo.

Para ese fin, un aspecto de la presente invención provee una composición inmunogéníca que comprende una cantidad eficaz de proteínas de envoltura ("E") purificadas del virus del dengue del serotipo DEN-1 , DEN-2, DEN-3 y DEN-4, un excipiente farmacéuticamente aceptable, y una cantidad eficaz de adyuvante; en donde cada proteína E constituye aproximadamente el 80% de la longitud de la E de tipo silvestre empezando desde el residuo de aminoácido 1 en su extremo N, de tal manera que dicha proteína E es secretable al medio de crecimiento cuando es expresada recombinantemente en una célula hospedera; en donde la proteína E DEN-4 es dimérica ("DEN4-80EZíp"); y en donde la composición induce la producción de anticuerpos neutralizantes en sujetos humanos. En modalidades preferidas de este aspecto a la invención, las proteínas E de la composición anteriormente descrita son producidas recombinantemente y expresadas en células de insecto hospederas. En modalidades preferidas adicionales, la proteína E es producida recombinantemente y expresada en células hospederas de Drosophila melanogaster Schneider 2 (S2), como se describe más abajo.

Las proteínas E recombinantes de subunidad del virus del dengue de la presente invención son producidas por medio de un sistema de expresión de cultivo celular que utiliza células de Drosophila Schneider 2 (S2). Se ha mostrado que este sistema produce proteínas de envoltura recombinantes del dengue que mantienen la estructura de tipo nativa (Cuzzubbo et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. (2001) 8:1150-55; Modis et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (2003) 100:6986-91 ; Modis et al., Nature (2004) 427:313-9; Zhang et al., Structure (2004)12(9): 1607-18). También se ha mostrado que este sistema de expresión expresa otras proteínas de envoltura recombinantes de otros flavivirus, tales como los virus del Nilo Occidental, encefalitis japonesa, hepatitis C y encefalitis transmitida por garrapata. Las proteínas de envoltura recombinantes normalmente están truncadas en el extremo C, dejando 80% de la proteína de envoltura nativa ("80E"). De esta manera, 80E se define como aproximadamente 80% de los primeros aminoácidos consecutivos de la proteína E empezando en el aminoácido 1 de su extremo N.

El alcance de las proteínas 80E truncadas usadas en la invención suprime la porción de ancla de membrana (aproximadamente el último 10% de E en el extremo carboxi) de la proteína, en otras palabras, hasta el 90% de los primeros aminoácidos consecutivos de E empezando en el aminoácido 1 de su extremo N, permitiendo así que sea secretado al medio extracelular, facilitando la recuperación. Además, el truncamiento suprime la porción de "tallo" de la proteína E que enlaza la porción 80E con la porción de ancla de membrana; la porción de tallo no contiene epítopes antigénicos notables y por lo tanto no está incluida en los antígenos preferidos, DEN1 -80E, DEN2-80E, DEN3-80E, DEN4-80E, o DEN4-80EZip. Más del 90% pero menos del 100% de la proteína E puede ser clonado y secretado, esto es, la proteína puede ser de + 90% de longitud, truncada en el extremo carboxi, y puede incluir una porción del dominio de transmembrana, siempre que la proteína E truncada sea secretable. "Secretable" significa susceptible de ser secretada, y secretada normalmente, de las células transformadas en el sistema de expresión. De esta manera, el experto en la técnica se dará cuenta de que las proteínas E del dengue que son útiles en las composiciones y métodos de la presente invención pueden variar del 80% ejemplificado en la presente, siempre que la proteína sea secretable. En modalidades preferidas de cada aspecto de la presente invención, las proteínas E DEN son de una longitud de aproximadamente 80%, empezando desde el aminoácido N-terminal de la proteína de envoltura y terminando en un aminoácido en la extensión del 395° al 401° aminoácido, por ejemplo, del aminoácido 1 al aminoácido 395 del virus del dengue de tipo 2. En modalidades alternativas de cada aspecto de la invención, la proteína E del dengue puede ser aproximadamente 75%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, o aproximadamente 98% de los aminoácidos consecutivos de E, empezando en el aminoácido 1 de su extremo N. En modalidades ejemplares de los aspectos de la invención, la proteína E DEN es aproximadamente 80% de aminoácidos consecutivos de la proteína E, empezando en el aminoácido 1 de su extremo N, tal como DEN1- 80E, como se índica en SEQ ID NO:6; DEN2- 80E, como se indica en SEQ ID NO:7; DEN3-80E, como se indica en SEQ ID NO:8; y DEN4-80E, como se indica en SEQ ID NO:9.

La proteína E secretada, además, puede contener dominios que facilitan la dimerización, tal como en la proteína DEN4-80EZip, de tal manera que la inmunogenicidad de la proteína recombínante se intensifica adicionalmente. Una proteína DEN4-80EZip ejemplar comprende la secuencia de aminoácidos que se indica en SEQ ID NO:10. Combinando las formas diméricas y monoméricas de las proteínas E recombinantes de los cuatro virus del dengue, la respuesta inmune puede ser modulada de tal manera de inducir respuestas tetravalentes equilibradas. Cuando las proteínas recombinantes de la subunidad 80E del virus del dengue se formulan apropiadamente para uso humano, estas son capaces de inducir potentes anticuerpos neutralizantes de virus en sujetos humanos. De esta manera, la invención provee una solución novedosa a un problema técnico clave: la producción de una vacuna del virus del dengue que muestra tanto un alto grado de seguridad como una inmunogenicidad tetravalente equilibrada en sujetos humanos.

Adyuvantes La formulación de vacuna /composiciones inmunogénicas de la presente invención incluyen por lo menos un adyuvante que es adecuado para uso humano. En una modalidad preferida, las proteínas recombinantes de la subunidad 80E del dengue se formulan con adyuvantes basados en saponina ("tipo ISCOM") (por ejemplo, adyuvante ISCOMATRIX®), y/o adyuvantes basados en aluminio (colectivamente, "alumbre" o "adyuvantes basados en alumbre").

Durante mucho tiempo se ha mostrado que el aluminio estimula la respuesta inmune contra antígenos coadministrados, principalmente estimulando una respuesta TH2, y los adyuvantes basados en aluminio fueron los primeros adyuvantes registrados para uso humano en los Estados Unidos. Además de los antigenos 80E del dengue que se describen en la presente, las composiciones de este aspecto de la presente invención son adsorbidas en un adyuvante de aluminio tal como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, o una mezcla de los mismos. Se prefiere que el adyuvante de aluminio de las composiciones aquí provistas no esté en forma de un precipitado de aluminio. Las vacunas con aluminio precipitado pueden aumentar la respuesta inmune a un antígeno objetivo, pero se ha mostrado que son preparaciones muy heterogéneas y han tenido resultados inconsistentes {véase Lindblad E.B. Immunology and Cell Biology 82: 497-505 (2004)). En contraste, las vacunas adsorbidas en aluminio se pueden preformar de manera estandarizada, lo que es una característica esencial de las preparaciones de vacuna para su administración a los humanos. Además, se piensa que la adsorción física de un antígeno deseado sobre el adyuvante de aluminio tiene un papel importante en la función del adyuvante, quizás en parte permitiendo un aclaramiento más lento desde el sitio de la inyección, o permitiendo una captación más eficiente del antigeno por parte de las células presentadoras de antígeno.

Se cree que los adyuvantes basados en alumbre funcionan, por lo menos parcialmente, mediante un mecanismo de depósito, y la combinación de los antígenos recombinantes 80E del dengue con estructura de tipo nativa y el efecto adyuvante del alumbre es suficiente para inducir una respuesta inmune potente en los individuos vacunados, incluyendo los miembros de la población inmunodeficiente.

El adyuvante de aluminio de la presente invención puede estar en forma de hidróxido de aluminio (AI(OH)3), fosfato de aluminio (AIP04), hidroxifosfato de aluminio, hidroxifosfato sulfato de aluminio amorfo (AAHS), o el denominado "alumbre" (KAI(S04) 12H20) (véase Klein et al., Analysis of aluminum hydroxyphosphate vaccine adjuvants by (27)AI MAS NMR., J. Pharm. Sci. 89(3): 311 -21 (2000)). En modalidades ejemplares de la invención aquí provista, el adyuvante de aluminio es el hidróxido de aluminio.

En algunas modalidades de la invención, el adyuvante de aluminio está en forma de AAHS (denominado aquí intercambiablemente adyuvante de aluminio Merck (MAAA)). El MAA lleva una carga cero a pH neutro, mientras que el AIOH lleva una carga neta positiva y el AIPO4 normalmente lleva una carga neta negativa a pH neutro. El MAA tiene una capacidad para unirse a algunos antígenos más alta que el AIOH, debido potencialmente a la carga neta del adyuvante de aluminio que afecta la capacidad para unirse al antígeno. En otras modalidades ejemplares de la invención aquí descrita, el adyuvante de aluminio es el Alhydrogel.

El experto en la técnica será capaz de determinar una dosis óptima de adyuvante de aluminio que sea tanto segura como eficaz para aumentar la respuesta inmune al objetivo de antígenos 80E del dengue de la composición de vacuna. Para una exposición del perfil de seguridad del aluminio, y también las cantidades de aluminio incluidas en las vacunas autorizadas por la FDA, véase Baylor et al., Vaccine 20: S18-S23 (2002). Generalmente, una dosis eficaz y segura del adyuvante de aluminio varía de concentración de 200 a 1200 pg/ml. En modalidades especificas de la invención, la vacuna comprende entre 1.0 y 3.5 mg/ml de adyuvante de aluminio (hasta 1.25 mg de aluminio elemental). En modalidades alternativas de las formulaciones y composiciones de la presente invención, hay aproximadamente 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o 500 pg de adyuvante de aluminio por dosis de vacuna.

La formulación con adyuvantes basados en aluminio comprende una mezcla por medio de la cual los antígenos 80E del dengue se pueden unir al adyuvante de aluminio, por ejemplo Alhydrogel, de tal manera que > 75% del antígeno se enlaza al hidróxido de aluminio. La formulación y preparación de la vacuna DEN1-80E + Alhydrogel (HBV-001 D1) bajo cGMP para sustentar el desarrollo clínico, se describen en el ejemplo 3.

Como se indicó arriba, un aspecto de la presente invención provee vacunas y composiciones que comprenden antígenos 80E del dengue en combinación con un adyuvante. Un adyuvante preferido es un adyuvante ISCOM. En las formulaciones y métodos provistos en la presente, el adyuvante ISCOM comprende una saponina, colesterol y un fosfolípído, y forma un complejo inmunoestimulador o ISCOM. La potente actividad adyuvante de las saponinas, que normalmente se aislan de la corteza del árbol Quillaia saponaria, fue reportada por primera vez hace más de 80 años (para una revisión, véase Barr y Mitchell, Immunology and Cell Biology 74: 8-25 (1996); y Skene y Sutton, Methods 40: 53-59 (2006)). En comparación con los adyuvantes de aluminio, los adyuvantes de tipo ISCOM, o ISCOMs, son capaces de provocar una respuesta inmune más amplia a un antigeno coadministrado, que comprende respuestas tanto de células T como de anticuerpo. Sin embargo, se encontró un potencial de toxicidad y actividad hemolítica limitando la promesa de las saponinas para uso humano o animal en ese tiempo.

Desde entonces, se descubrió que las saponinas, cuando se combinan con colesterol y fosfolipido, forman una partícula característica que tiene una estructura de tipo jaula comprendida de veinte subunidades o más. Esta estructura única contribuye a la actividad adyuvante de los ISCOMs. Adicionalmente, se mostró que la incorporación de saponinas en ISCOMs, junto con colesterol y fosfolipido, elimina la actividad hemolítica de las saponinas. Se mostró que se requiere menos adyuvante para inducir una respuesta inmune cuando se utilizan como adyuvante los ISCOMs, en comparación con las saponinas libres (véase Skene y Sutton, supra). Por estas razones, los ISCOMs se han estudiado intensamente como adyuvantes de vacuna potenciales.

Para este fin, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden antígenos 80E del dengue, un adyuvante ISCOM, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, dicho adyuvante ISCOM comprendiendo una saponina, colesterol y un fosfolipido, en donde dichos antígenos 80E del dengue constituyen aproximadamente 80% de la longitud de E de tipo silvestre, empezando desde el residuo de aminoácido 1 en su extremo N, de tal manera que dicha proteína E es secretable al medio de crecimiento cuando se expresa recombinantemente en una célula hospedera. Las composiciones descritas anteriormente pueden comprender, además, un adyuvante de sal de aluminio.

En modalidades preferidas de este aspecto de la invención, los antigenos 80E DEN1 , DEN2 y DEN3 incluidos en la composición son monoméricos, y el antígeno 80E DEN4 es dimérico. Se ha mostrado en la presente (véase el ejemplo 6) que una composición tetravalente que comprende formas monoméricas de las subunidades de proteína 80E DEN1 , DEN2 y DEN3, y una forma dimérica de DEN4 (DEN4-80EZip), pueden inducir una respuesta inmune tetravalente equilibrada en monos Rhesus, y pueden proteger contra la provocación viral. Las composiciones descritas anteriormente pueden comprender, además, un adyuvante de sal de aluminio.

En modalidades alternativas de este aspecto de la invención, las proteínas DEN1-80E, DEN2-80E, DEN3-80E y DEN4-80E de la composición son monoméricas. En estas modalidades, el componente DEN4 está presente en una cantidad que es de aproximadamente 1.5 a aproximadamente 3 veces las cantidades individuales de las proteínas DEN1 , DEN2 y DEN3, de preferencia aproximadamente 2 veces la cantidad de los componentes (proteínas) DEN1 , DEN2 y DEN3.

En modalidades ejemplares de este aspecto de la invención, el adyuvante ISCOM es ISCOMATRIX®, un adyuvante basado en saponina. La formulación con el adyuvante ISCOMATRIX® comprende una mezcla en donde los antígenos 80E son suministrados junto con el adyuvante.

En modalidades alternativas de la invención, las composiciones de vacuna se formulan tanto con un adyuvante basado en aluminio como con un adyuvante ISCOM o uno basado en saponina.

Subunidades de proteína de envoltura del virus del dengue Se ha mostrado en la presente (véase el ejemplo 6) que una composición tetravalente que comprende formas monoméricas de las subunidades de proteína DEN1-80E, DEN2-80E y DEN3-80E, y una forma dimérica de DEN4 (DEN4-80EZip), pueden inducir una respuesta inmune tetravalente equilibrada en monos Rhesus, y pueden proteger contra la provocación viral. Por consiguiente, en modalidades preferidas de este aspecto de la invención, los antígenos 80E DEN1 , DEN2 y DEN3 incluidos en la composición son monoméricos, y el antígeno 80E DEN4 es dimérico. La formación de los dimeros de la proteína 80E del dengue se describe más abajo.

También se ha mostrado en la presente (véase el ejemplo 7) que se pueden lograr respuestas inmunes altas equilibradas contra los cuatro tipos del dengue, ajusfando el contenido antigénico del componente DEN4-80E de modo que la cantidad del componente antigénico DEN4 (bien DEN4-80E o bien DEN4-80EZip) sea aproximadamente el doble de la cantidad del antígeno DEN -80E, DEN2-80E o DEN3-80E presente en la composición. Por consiguiente, la invención provee composiciones inmunogénicas que comprenden una cantidad eficaz de proteínas de envoltura ("E") purificadas del virus del dengue del serotipo DEN1-80E, DEN2-80E, DEN3-80E y DEN4-80E, un excipiente farmacéuticamente aceptable, y una cantidad eficaz de adyuvante; en donde cada proteína E constituye aproximadamente 80% de la longitud de E de tipo silvestre, empezando desde el residuo de aminoácido 1 en su extremo N, de tal manera que dicha proteína E es secretable al medio de crecimiento cuando se expresa recombinantemente en una célula hospedera; y en donde la composición induce la producción de anticuerpos neutralizantes en sujetos humanos; en donde el contenido antigénico del componente DEN4 es aproximadamente de 1.5 veces a aproximadamente 3 veces el contenido antigénico individual de los componentes DEN1 , DEN2, o DEN3. En modalidades preferidas de este aspecto de la invención, la proporción de los antígenos DEN1 :DEN2:DEN3:DEN4 en las composiciones es de aproximadamente 1 :1 :1 :2.

En algunas modalidades de este aspecto de la invención, el componente DEN4 es DEN4-80E. De esta manera, la composición comprende monómeros de DEN1-80E, DEN2-80E, DEN3-80E y DEN4-80E. En modalidades alternativas de este aspecto de la invención, el componente DEN4 es DEN4-80EZip. En tales modalidades alternativas, la composición comprende monómeros de DEN1-80E, DEN2-80E y DEN3-80E, y un dímero de DEN4-80EZip.

En una modalidad preferida de la invención, los componentes de la proteina recombinante de la formulación de vacuna del virus del dengue (DEN1-80E, DEN2-80E, DEN3-80E, DEN4-80E, y/o DEN4-80EZip) descritos en la presente, son producidos por un sistema de expresión de cultivo de células eucariotas, específicamente el sistema de células S2 de Drosophila melanogaster (Johansen, H. et al., Genes Dev. (1989) 3:882-889; Ivey-Hoyle, M., Curr. Opin. Biotechnol. (1991 ) 2:704-707; Culp, J.S., eí al., Biotechnology (NY) (1991 ) 9: 173-177). Este método de expresión produce exitosamente proteínas de envoltura recombinantes truncadas de flavivirus, tales como los serotipos 1-4 del dengue, JE, TBE y WN. Estas proteínas están truncadas en el extremo C, dejando aproximadamente 80% de la proteína de envoltura nativa (80E). El truncamiento suprime el ancla de membrana de la proteína, permitiendo así su secreción al medio extracelular, facilitando la recuperación; el truncamiento también suprime la porción de tallo, que tiene poco efecto inmunogénico. Además, se ha mostrado que las proteínas expresadas son apropiadamente glicosíladas y mantienen la conformación nativa, determinada por la reactividad con un anticuerpo monoclonal conformacionalmente sensible, 4G2.

Como se describió anteriormente (Ivy et al., patente de EE. UU. No. 6,136,561 ; Ivy et al., patente de EE. UU. No. 6,165,477; McDonell et al., patente de EE. UU. No. 6,416,763; Ivy et al., patente de EE. UU. No. 6,432,41 1 ; y Peters et al., patente de EE. UU. No. 6,749,857), y como se usa en la presente, DEN1-80E, DEN2-80E, DEN3-80E, DEN4-80E y DEN4-80EZip se refieren a proteínas que abarcan una proteína de envoltura del virus del dengue, preferiblemente una que empieza desde el aminoácido N-terminal de la proteína de envoltura y termina en un aminoácido en la extensión del 395° al 401° aminoácido, por ejemplo, tal 80E puede ser la proteína que comprende los aminoácidos 1 a 395 del tipo 2 del virus del dengue. Como describen Peters et al., patente de EE. UU. No. 6,749,857, la proteína 80E recombínante opcionalmente puede contener un dominio de dimerización enlazado a la proteína 80E por medio de un enlazador flojo (por ejemplo, DEN4-80EZip). La inclusión de formas diméricas de las proteínas se usa para modular la respuesta inmune a componentes seleccionados, y resulta en la inducción de respuestas tetravalentes equilibradas. En el ejemplo 1 se describe la expresión de proteínas DEN-80E. En las modalidades preferidas de la invención se provee una composición tetravalente en donde el componente de proteína DEN4 es dimérico (por ejemplo, DEN4-80EZip).

Las subunidades de la proteína 80E dimérica, por ejemplo dímeros de DEN4 80E, pueden ser producidas mediante los métodos conocidos (véase, por ejemplo, Peters et al., patente de EE. UU. No. US 6,749,857 B1 ). Brevemente, Peters et al, supra, describen tres enfoques básicos para construir moléculas E 80% diméricas. El primer enfoque incluye usar copias en tándem de E 80% unidas covalentemente entre sí por un enlazador flexible. El tramo de aminoácidos que enlazan covalentemente las dos copias de E 80% DEN2 está diseñado para servir como una correa flexible que les permite a las dos moléculas de E 80% asociarse en orientación dimérica nativa de cabeza a cola, manteniendo al mismo tiempo su unión covalente una con la otra. Para el experto en la técnica será muy evidente cómo seleccionar también otras secuencias enlazadoras. La presente invención no está limitada a los enlazadores específicos descritos, sino a cualquier secuencia de aminoácidos que les permita a las dos moléculas de E 80% asociarse en la orientación nativa de cabeza a cola manteniendo al mismo tiempo su unión covalente una con la otra.

Un segundo enfoque incluye la adición de un dominio de cierre de leucina carboxi-terminal a la E 80% monomérica para incrementar la dimerización entre dos moléculas de cierre de leucina-E 80%. Se pueden adoptar dos versiones de este enfoque. Una versión incluye un enlace disulfuro que enlaza los dominios de cierre de leucina, dando como resultado un producto dimérico enlazado covalentemente, mientras que el otro se basa en la asociación no covalente de los dominios de cierre de leucina. El dominio de cierre de leucina está diseñado para dimerizarse con la secuencia idéntica de otra molécula de cierre- E 80%. La formación de un cierre de leucina enlazado no covalentemente incrementará la dimerización de las moléculas E 80%, que se pueden asociar en la conformación nativa de cabeza a cola en virtud del enlazador flexible que une las moléculas E 80% con el dominio de cierre de leucina. El dominio de cierre de leucina está diseñado para dimerizarse con la secuencia idéntica de otra molécula de cierre- E 80%. Una vez que se dimeriza el cierre de leucina se forma un enlace disulfuro entre los dos extremos, dando como resultado un producto dimérico enlazado covalentemente. La formación de un cierre de leucina enlazado covalentemente incrementará la dimerización de las moléculas E 80%, que se pueden asociar en la conformación nativa de cabeza a cola en virtud del enlazador flexible que une las moléculas E 80% con el dominio de cierre de leucina.

El enfoque final usado para incrementar la dimerización de E 80% es la adición de un dominio de hélice-vuelta-hélice al extremo carboxi- terminal de E 80%. El dominio hélice-vuelta-hélice de una molécula de E 80% modificada se asociará con el de otra para formar un dominio dimérico de manojo de cuatro hélices. La formación de un dominio de manojo de cuatro hélices asociado no covalentemente incrementará la dimerización de las moléculas de E 80% que se pueden asociar en la conformación nativa de cabeza a cola, en virtud de los enlazadores flexibles que unen a E 80% con el manojo de hélices.

En otra modalidad de la invención, DEN-80E es definida más ampliamente como una subunidad de proteína de envoltura del virus del dengue, que comprende seis puentes disulfuro en Cys1-Cys2, Cys3-Cys8, Cys4-Cys6, Cys5-Cys7, Cys9-Cys10 y Cys1 1-Cys12; en donde la proteína ha sido secretada como una proteína recombinante por células de Drosophila; y en donde la proteína genera respuestas de anticuerpo neutralizante a los flavivirus homólogos cuando se administra a sujetos humanos.

En una modalidad más preferida, la subunidad de la proteína de envoltura recombinante del virus del dengue comprende adicionalmente el patrón de disulfuro descrito y un perfil de hidrofilicidad característico de una porción homologa de 80% de una proteína de envoltura (80E), empezando desde el primer aminoácido en el extremo N de la proteína de envoltura nativa del virus del dengue. En otras palabras, se pueden sustituir los aminoácidos de la secuencia que comprende 80E del virus del dengue, siempre que se mantenga el perfil de disulfuro e hidrofilicidad para asegurar que las subunidades de proteína recombinante retengan una estructura de tipo nativa e inmunogenicidad apropiada (capacidad de provocar anticuerpos neutralizantes de virus).

Preferiblemente, la subunidad 80E del virus del dengue es expresada usando un Master Cell Bank en medio libre de suero, y purificada por cromatografía como se describió anteriormente (Ivy et al., patente de EE. UU. No. 6,432,411). En el ejemplo 2 se describe la fabricación de un lote de DEN1-80E bajo cGMP para sustentar las pruebas clínicas.

A diferencia del beneficio añadido descrito por la inclusión de proteínas no estructurales, tales como la proteína no estructural 1 (NS1 ), en las formulaciones de virus del dengue probadas en animales (McDonell et al., US 6,416,763), las proteínas DEN-80E de la invención sirven como una vacuna inmunogénica potente en sujetos humanos, incluso sin la inclusión de NS1.

Administración y uso La presente invención provee un medio para prevenir o atenuar la enfermedad que resulta de la infección por virus del dengue. Como se usa en la presente, se dice que una vacuna previene o atenúa una enfermedad si la administración de la vacuna a un individuo resulta en la inmunidad total o parcial del individuo a la enfermedad, o en la atenuación (es decir, la supresión) total o parcial de síntomas o afecciones asociadas con la enfermedad.

Por consiguiente, la invención se refiere a un método para provocar la respuesta inmune protectora en un paciente humano, el método comprendiendo administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición inmunogénica como la que se describe en cualquier parte de la especificación.

Las composiciones terapéuticas de la invención descrita se pueden administrar por vía parenteral mediante inyección subcutánea, intramuscular o intradérmica; sin embargo, también se pueden utilizar otros modos de administración sistémica. El método de administración preferido para la presente invención es la vía intramuscular. De esta manera, en algunas modalidades de los métodos de la invención, la composición se administra al paciente por la vía intramuscular. En modalidades alternativas se contempla el suministro intradérmico o subcutáneo.

También se provee en la presente un método para proveer protección inmune a los humanos contra la enfermedad inducida por el virus del dengue, que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de las composiciones de la invención, suministrando así protección contra la enfermedad del dengue. En este aspecto de la invención, la vía de administración preferida se selecciona del grupo que consiste en intramuscular, subcutánea e intradérmica.

La invención también se refiere a un método para provocar una respuesta inmune protectora en un paciente humano, el método comprendiendo administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición inmunogénica que comprende una proteína de envoltura ("E") purificada del virus del dengue y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde la proteína E constituye aproximadamente 80% de la longitud de la proteína E de tipo silvestre, empezando desde el residuo de aminoácido 1 en su extremo N, de tal manera que dicha proteína E es secretable al medio de crecimiento cuando es expresada recombinantemente en una célula hospedera; y una cantidad eficaz de adyuvante, en donde la vacuna induce la producción de anticuerpos neutralizantes en sujetos humanos.

Otro aspecto de la presente invención provee una composición inmunogénica que comprende una cantidad eficaz de proteínas de envoltura ("E") purificadas del virus del dengue del serotipo DEN-1 , DEN-2, DEN-3 y DEN-4, un excipiente farmacéuticamente aceptable, y una cantidad eficaz de adyuvante; en donde cada proteína E constituye aproximadamente el 80% de la longitud de la proteína E de tipo silvestre empezando desde el residuo de aminoácido 1 en su extremo N, de tal manera que dicha proteína E es secretable al medio de crecimiento cuando es expresada recombinantemente en una célula hospedera; y en donde opcionalmente la proteína E DEN-4 es dimérica; para la prevención o tratamiento de la enfermedad del dengue y/o infección del dengue. En algunos aspectos de la invención, las composiciones descritas en la presente son para administrarse a poblaciones inmunodeficientes. En aspectos adicionales, las composiciones son para administrarse a poblaciones pediátricas.

En algunas modalidades de este aspecto de la invención, el componente DEN4 de la composición es DEN4-80EZip. En modalidades alternativas, el componente DEN4 es DEN4-80E o DEN4-80Ezip, y la cantidad de la proteína DEN4 es de aproximadamente 1 .5 a aproximadamente 3 veces la cantidad del componente DEN1-80E, DEN2-80E, o DEN3-80E.

Otros aspectos de esta invención también describen el uso de una composición como la que se describe arriba o en toda la especificación para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la infección del dengue, o enfermedad causada por el mismo.

Los ingredientes farmacéuticos activos de las composiciones descritas en la presente (80E del dengue y/o 80Ezip del dengue) son suministrados al paciente en una "cantidad terapéuticamente eficaz", es decir, una cantidad que es fisiológicamente significativa como se describe en la breve descripción de la invención. Los ingredientes activos de las composiciones de la invención están presentes en una cantidad fisiológicamente significativa si la administración de ia composición a un paciente resulta en un cambio detectable en la fisiología del paciente receptor. En la presente invención, un cambio detectable en el paciente receptor es la inducción de un anticuerpo neutralizante contra el virus del dengue homólogo.

La vacuna activa de la invención se puede usar sola o en combinación con otras vacunas activas, como las que contienen otras subunidades activas en la medida en que estén disponibles. En una formulación particular se pueden incluir subunidades correspondientes o diferentes de uno o varios virus o serotipos. La vacuna activa de la invención puede comprender adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Existen muchas técnicas para programar el tiempo de las inmunizaciones cuando se utiliza un régimen de administración múltiple. Es preferible usar las composiciones de la invención más de una vez para aumentar la cantidad y la diversidad de expresión del repertorio de inmunoglobulinas expresado por el sujeto inmunizado. Normalmente, si se dan inmunizaciones múltiples, se darán con uno a dos meses de separación. El programa de inmunización preferido de la invención es inmunizar a los sujetos a los 0, 1 y 2 meses. También se pueden utilizar otros programas de inmunización. Por ejemplo, se pueden usar programas de inmunización alternativos, tales como 0, 1 y 3 meses, o 0, 1 y 6 meses.

Para inmunizar a los sujetos contra la enfermedad inducida por el virus del dengue, por ejemplo, las vacunas que contienen las subunidades se administran al sujeto en protocolos de inmunización convencionales que incluyen, usualmente, administraciones múltiples de la vacuna. La administración normalmente es por inyección, típicamente inyección intramuscular o subcutánea; sin embargo, también se pueden usar otros modos de administración sistémica.

Composiciones inmunopénicas Como indica arriba, un aspecto de la presente invención es una composición inmunogénica que comprende una cantidad eficaz de proteínas de envoltura ("E") purificadas del virus del dengue del serotipo DEN-1 , DEN-2, DEN-3 y DEN-4, un excipiente farmacéuticamente aceptable, y una cantidad eficaz de adyuvante; en donde cada proteína E constituye aproximadamente el 80% de la longitud de la proteína E de tipo silvestre empezando desde el residuo de aminoácido 1 en su extremo N; en donde la proteína E DEN-4 es dimérica; y en donde la composición induce la producción de anticuerpos neutralizantes en sujetos humanos.

En modalidades de este aspecto de la invención, la cantidad de proteína E del dengue para cada serotipo es de aproximadamente 1 pg a aproximadamente 150 pg, de aproximadamente 1 pg a aproximadamente 10 pg, de aproximadamente 1 pg a aproximadamente 5 pg, de aproximadamente 2 pg a aproximadamente 4 pg, de aproximadamente 3 pg a aproximadamente 6 pg, de aproximadamente 5 pg a aproximadamente 25 pg, de aproximadamente 10 pg a aproximadamente 20 pg, de aproximadamente 5 pg a aproximadamente 10 pg, de aproximadamente 20 pg a aproximadamente 25 pg, de aproximadamente 40 pg a aproximadamente 60 pg, de aproximadamente 75 pg a aproximadamente 125 pg, o de aproximadamente 90 pg a aproximadamente 1 10 pg. En modalidades alternativas, la cantidad de cada proteína de dengue es de aproximadamente 1 pg, aproximadamente 2 pg, aproximadamente 3 pg, aproximadamente 4 pg, aproximadamente 5 pg, aproximadamente 6 pg, aproximadamente 7 pg, aproximadamente 8 pg, aproximadamente 9 pg, aproximadamente 10 pg, aproximadamente 15 pg, aproximadamente 20 pg, aproximadamente 25 pg, aproximadamente 30 pg, aproximadamente 35 pg, aproximadamente 40 pg, aproximadamente 45 pg, aproximadamente 50 pg, aproximadamente 55 pg, aproximadamente 60 pg, aproximadamente 65 pg, aproximadamente 70 pg, aproximadamente 75 pg, aproximadamente 80 pg, aproximadamente 85 pg, aproximadamente 90 pg, aproximadamente 95 pg, aproximadamente 100 pg, aproximadamente 1 10 pg, aproximadamente 120 pg, aproximadamente 130 pg, aproximadamente 140 pg, o aproximadamente 150 pg. En modalidades preferidas de la invención, la cantidad de cada proteína E de dengue es de aproximadamente 3 pg, aproximadamente 6 pg, aproximadamente 10 pg, aproximadamente 20 pg, aproximadamente 50 pg, aproximadamente 100 pg, 3 pg, 6 pg, 10 pg, 20 pg, 50 pg, o 100 pg.

También se provee una composición inmunogénica que comprende una cantidad eficaz de proteínas de envoltura ("E") purificadas del virus del dengue del serotipo DEN-1 , DEN-2, DEN-3 y DEN-4, un excipiente farmacéuticamente aceptable, y una cantidad eficaz de adyuvante; en donde cada proteína E constituye aproximadamente el 80% de la longitud de la proteína E de tipo silvestre empezando desde el residuo de aminoácido 1 en su extremo N; en donde la cantidad de la proteína DEN4 es aproximadamente de 1.5 a aproximadamente 3 veces las cantidades individuales de las proteínas DEN1 , DEN2 y DEN3; y en donde la composición induce la producción de anticuerpos neutralizantes en sujetos humanos. En este aspecto de la invención, las proteínas E DEN1 , DEN2, DEN3 y DEN4 son monoméricas (por ejemplo, DEN-80E), o las proteínas E DEN1 , DEN2 y DEN3 son monoméricas y la proteína DEN4 es dimérica.

En este aspecto de la invención, las proteínas E del dengue de la composición están presentes en las cantidades anteriormente descritas, con la condición de que la proteína E DEN4, ya sea monomérica o dimérica, esté presente en una cantidad que es de aproximadamente 1.5 a aproximadamente 3 veces las cantidades individuales de las proteínas E DEN1 , DEN2 y DEN3. De esta manera, solamente como un ejemplo, si las proteínas E DEN1 , DEN2 y DEN3 están presentes en la composición en una cantidad de aproximadamente 3 pg, entonces la proteína E DEN4 está presente en la composición en una cantidad de aproximadamente 4.5 pg a aproximadamente 9 pg, de preferencia aproximadamente 6 pg. Como un ejemplo adicional, si las proteínas E DEN1 , DEN2 y DEN3 están presentes en la composición en una cantidad de aproximadamente 10 pg, entonces la proteína E DEN4 está presente en la composición en una cantidad de aproximadamente 15 pg a aproximadamente 30 pg, de preferencia aproximadamente 20 pg. En otro ejemplo adicional, si las proteínas E DEN1 , DEN2 y DEN3 están presentes en la composición en una cantidad de aproximadamente 50 pg, entonces la proteína E DEN4 está presente en la composición en una cantidad de aproximadamente 75 pg a aproximadamente 150 pg, de preferencia aproximadamente 100 pg. El experto en la técnica se dará cuenta de que aunque la cantidad de las proteínas E DEN1 , DEN2 y DEN3 sea aproximadamente igual, las cantidades pueden variar y no tienen que estar presentes en una proporción exacta de 1 :1 :1. El experto en la técnica será capaz de determinar una dosis óptima de cada proteína E DEN que sea segura e induzca una respuesta inmune tetravalente equilibrada contra DEN1 , DEN2, DEN3 y DEN4.

En las modalidades preferidas de la invención, la composición inmunogénica comprende aproximadamente 3 pg de proteínas E DEN1 , DEN2 y DEN3, y aproximadamente 6 pg de la proteína E DEN4 (DEN4-80E o DEN4-80EZip). En una modalidad preferida adicional, la composición inmunogénica comprende aproximadamente 10 pg de proteínas E DEN1 , DEN2 y DEN3, y aproximadamente 20 pg de la proteina E DEN4 (DEN4-80E o DEN4-80EZip). En una modalidad preferida adicional, la composición inmunogénica comprende aproximadamente 50 pg de proteínas E DEN1 , DEN2 y DEN3, y aproximadamente 100 pg de la proteína E DEN4 (DEN4-80E o DEN4-80EZip).

Los vehículos farmacéuticamente aceptables útiles en las composiciones de la invención incluyen cualquier agente compatible que sea inocuo para los pacientes a las dosis y concentraciones usadas, tal como agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol, amortiguadores, etcétera, y combinaciones de los mismos. El vehículo también puede contener componentes adicionales, tales como un estabilizador, un solubilizante, un modificador de tonicidad tal como NaCI, gCl2, o CaCl2, etc., un agente tensoactivo, y mezclas de los mismos.

De acuerdo con la invención descrita, una "cantidad eficaz" de una composición terapéutica es una que es suficiente para lograr un efecto biológico deseado. Generalmente las dosis necesarias para proveer una cantidad eficaz de la composición variarán dependiendo de factores tales como la edad, condición y sexo del sujeto, y la magnitud de la enfermedad, si existe, y otras variables que pueden ser ajustadas por un experto en la técnica. Las preparaciones antigénicas de la invención se pueden administrar mediante dosis únicas o múltiples de una cantidad eficaz. Las cantidades eficaces de las composiciones de la invención pueden variar desde 0.01500 pg por producto por dosis, preferiblemente 1 100 pg por producto por dosis, y muy preferiblemente 550 pg por producto por dosis. Las composiciones de la invención pueden comprender adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con la presente invención, se muestra la producción de los ingredientes activos DEN1-80E, DEN2-80E, DEN3-80E y DEN4-80EZip, y HBV-001 D1 y vacunas de dengue tetravalentes en gran escala y bajo cGMP, para sustentar su administración a sujetos humanos (ejemplos 1-4). Se describe la determinación de la seguridad e inmunogenicidad (eficacia) de las vacunas de la invención en primates no humanos y voluntarios adultos sanos (ejemplos 5-8). Las modalidades de las vacunas del dengue de la invención combinan dos aspectos importantes. En un aspecto, la seguridad inherente de las subunidades de proteína recombinante combinadas con adyuvantes provee el enfoque óptimo para la prevención de una enfermedad en individuos sanos e inmunocomprometidos. En un segundo aspecto, la producción de los antigenos recombinantes DEN1-80E, DEN2-80E, DEN3-80E, DEN4-80E y DEN4-80EZip conformacionalmente relevantes, bajo las buenas prácticas de manufactura actuales (cGMP), en cantidades suficientes para uso práctico, resulta en vacunas que inducen anticuerpos neutralizantes tetravalentes equilibrados para el virus en primates no humanos y sujetos humanos, suministrando un mecanismo de protección contra la enfermedad. La combinación única de proteínas 80E monoméricas y diméricas y en varias proporciones se utiliza para asegurar el equilibrio tetravalente, que es crítico para minimizar el riesgo de enfermedad exacerbada, tal como DHF. La combinación de estos aspectos novedosos resulta en la invención novedosa de vacunas del virus del dengue que son seguras y eficaces en sujetos humanos. Estas formulaciones de vacuna se caracterizan adicionalmente por el hallazgo inesperado de que no es necesaria la inclusión de la proteína no estructural NS1 para inmunogenicidad y protección eficaces. Además, las vacunas del dengue descritas manejan el problema técnico de inducir respuestas inmunes relevantes protectoras en los individuos vacunados, manteniendo al mismo tiempo un perfil de seguridad aceptable, en particular para los sujetos en riesgo más alto de enfermedad severa, que incluyen niños, personas de avanzada edad y personas inmunocomprometidas.

Todas las publicaciones mencionadas en la presente se incorporan como referencia con la finalidad de describir y revelar métodos y materiales que se podrían usar con respecto a la presente invención. Nada aquí se considera como una admisión de que la invención no tiene derecho a anticipar a dicha descripción en virtud de invención anterior.

Habiendo descrito las modalidades preferidas de la invención haciendo referencia a los dibujos anexos, se entiende que la invención no se limita a estas modalidades precisas, y que varios cambios y modificaciones pueden ser efectuados por el expertos en la técnica sin apartarse del alcance o espíritu de la invención definida en las reivindicaciones anexas.

Los siguientes ejemplos ilustran, más no limitan la invención.

EJEMPLO 1 Expresión y purificación de proteínas 80E del dengue en el sistema de Drosophila S2 El plásmido de expresión pMttbns (derivado de pMttPA) contiene los siguientes elementos: Promotor de metalotioneína de Drosophila melanogaster, la guía de secreción del activador plasminógeno tisular humano (tPAL) y la señal de poliadenilación temprana de SV40. Un fragmento BamH\ (enzima de restricción de Bacillus amyloliqufacience)de 14 pares de bases se extirpó del vector pMttbns para producir pMttAXho que contiene un sitio Xho\ (enzima de restricción de Xanthomonas holicicola) único, además de un sitio único existente de BglW (enzima de restricción de Bacillus globigii). Este vector de expresión promueve la secreción de las proteínas expresadas hacia el medio de cultivo. Las secuencias del dengue se introdujeron en el vector pMttAXho usando estos sitios BglW y Xho\ únicos. Las secuencias de dengue usadas para los estudios descritos en la presente son representadas por SEQ ID NOs: 1-5, de la siguiente manera: (1 ) SEQ ID NO:1 ¡ DEN1 prM-80E¡ (2) SEQ ID N0:2; DEN2 prM-80E; (3) SEQ ID N0:3; DEN3 prM-80E; (4) SEQ ID N0:4; DEN4 prM-80E; y (5) SEQ ID N0:5; DEN4 prM-80EZ¡p. Para la expresión de las proteínas de envoltura del dengue carboxi-truncadas, el fragmento de gen relevante se amplificó a partir de clones de ARN o ADNc virales. El fragmento de gen sintético prM80E (preproteína de membrana -80% glicoproteína E) incluyó dos codones de terminación inmediatamente después del último codón del dengue.

Las células S2 se cotransformaron con el plásmido de expresión y con el plásmido de selección pCoHygro que codifica resistencia a la higromicina, utilizando el método (i) coprecipitación con fosfato de calcio, o (ii) Cellfectin (Invitrogen Kits, Carlsbad, CA), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Las células se cotransformaron con 20 pg de ADN total con una relación de plásmido de expresión a plásmido de selección de 20: 1. Los transformantes se seleccionaron con higromicina B (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) a 300 pg/ml. Después de la selección, las células se adaptaron para crecer en el medio libre de suero, Excel 420 (JRH, Lenexa, KS). Para estudios de expresión, las células se desarrollaron en Excel 420, 300 pg/ml de higromicina, y se indujeron con CuS04 200µ?. Las células se sembraron a una densidad de 2 X 106 células/ml y se dejaron desarrollar durante 6-7 días. Bajo condiciones óptimas se lograron densidades celulares de 1.5 a 2 X 107 células/ml después de 6-7 días de desarrollo. El sobrenadante del cultivo se examinó para determinar la proteína expresada por medio de SDS-PAGE y Western blot.

Para la detección de la DEN-80E en los Western blots, se usó anticuerpo policlonal de conejo anti-virus del dengue desarrollado contra el virus de dengue desactivado, seguido por un anticuerpo secundario anti-lgG de conejo conjugado con fosfatasa alcalina. Los blots se desarrollaron con substrato de fosfatasa alcalina en fase sólida NBT/BCIP (Sigma Chem. Co., San Luis, MO).

La purificación de la proteina DEN1-80E, DEN2-80E, DEN3-80E, DEN4-80E o DEN4-80EZip se efectuó por medió de cromatografía de inmunoafinidad (IAC) usando el anticuerpo monoclonal (MAb) 4G2. Brevemente, el procedimiento incluye la clarificación del medio después de la expresión. Después, el material crudo se carga en una columna IAC que contiene MAb inmovilizado que está acoplado covalentemente por medio de química de N-hidroxisuccinimída. Después de cargar la muestra, la matriz se lava con solución salina amortiguadora de fosfato (PBS) 10 mM, pH 7.2, que contiene 0.05% (v/v) de Tween 20 (PBST, NaCI 140 mM). La proteina enlazada se eluye de la columna IAC con amortiguador de glicina 20 mM, pH 2.5. El eluato se neutraliza y luego se intercambia el amortiguador contra PBS. Los productos de la purificación se analizan rutinariamente por medio de SDS-PAGE con tinción de Coomassie o plata, Western blot, absorción de UV, y ensayo de inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA) para determinar la pureza, identidad, cantidad y bioactividad, respectivamente. Además, las muestras se analizaron mediante secuenciación de aminoácido N-terminal y análisis de aminoácidos. Estos análisis confirmaron la identidad y cantidad de los productos de la purificación.

Las figuras 1A-1B proveen perfiles representativos de SDS-PAGE (figura 1A) y Western blot (figura 1 B) de las proteínas DEN-80E purificadas. Para el análisis, las muestras se corrieron bajo condiciones no reductoras. Las moléculas de DEN1-80E, DEN2-80E y DEN3-80E emigran como una sola banda con un peso molecular relativo consistente con el peso molecular determinado de la composición de aminoácidos (es decir, 45kD). La proteína DEN4-80EZip emigra principalmente como un dímero bajo condiciones no reductoras con un peso molecular aparente de aproximadamente 90kD.

EJEMPLO 2 Producción de lotes de DEN1-80E, DEN2-80E. DEN3-80E, o DEN4-80EZÍP bajo cGMP Se preparó un banco de células Master Cell Bank (MCB) de cada línea celular S2 bajo condiciones de cGMP. El procedimiento de fabricación bajo cGMP incluye la expansión de la línea celular S2 de MCB a un biorreactor de tanque agitado, y después la cosecha del medio de cultivo que contiene la proteína secretada. Las células se separan del medio de cultivo por filtración usando filtros profundos. Después se purificó DEN1-80E, DEN2-80E, DEN3-80E, o DEN4-80EZip del sobrenadante clarificado resultante por medio de cromatografía de inmunoafinidad, usando el anticuerpo monoclonal 4G2. El producto de la purificación de inmunoafinidad se llevó subsiguientemente a través de un paso de desactivación viral a pH bajo y un paso de filtración viral usando membranas con tamaños de poro capaces de separar partículas de 20 nm. La capacidad para llevar los componentes de la vacuna de subunidad recombinante a través de pasos de desactivación viral a pH bajo y filtración viral, es una ventaja sobre las vacunas vivas atenuadas en donde esto no es posible. Estos pasos de aclaramiento viral simplifican significativamente las pruebas de agentes adventicios y proveen un grado adicional de seguridad al producto. El procesamiento final de las proteínas DEN-80E implican un intercambio de amortiguador y concentración por ultrafiltración, seguido por una filtración final a través de un filtro de 0.2 µ??.

La fabricación de los lotes de DEN1-80E, DEN2-80E, DEN3-80E, o DEN4-80EZip bajo cGMP, se hizo como se describe abajo. Los frascos de cada MCB se descongelaron y el contenido de cada frasco descongelado se cultivó en un volumen de 10 mi de medio EX-CELL durante 5 días a 26°C. Cada cultivo se expandió en matraces agitados desechables de 500 mi. Los cultivos se desarrollaron hasta obtener una densidad celular de 1.5 X 107/ml. Los matraces se reunieron y se usaron para inocular un cultivo más grande en un matraz agitado desechable que luego se desarrolló durante 3 a 4 días. El cultivo se desarrolló hasta obtener una densidad de 2 X 107células/ml. Después, el cultivo se expandió en múltiples matraces agitados desechables. Estos cultivos se desarrollaron hasta obtener una densidad celular promedio de 1.6 X 107células/ml. Las células de los matraces se reunieron y se usaron para inocular un biorreactor de acero inoxidable de 20 I. El cultivo se desarrolló hasta obtener una densidad celular de 1.2 X 107células/ml. La cantidad apropiada de células del biorreactor de 20 I se transfirió a un biorreactor de acero inoxidable de 100 I para obtener una densidad celular inicial de 2 X 106 células/ml. El cultivo se desarrolló hasta obtener una densidad celular de > 4.0 X 106 células/ml. Después se indujo el cultivo agregándole sulfato de cobre al cultivo para obtener una concentración final de 0.2 mM. Después, el cultivo se desarrolló durante 5 días. Los 100 I de cada cultivo se cosecharon por filtración profunda usando un cartucho de filtro de 0.45 µ??, seguido por un cartucho de filtro de 0.2 µ??. El filtrado se recogió en volúmenes de 10 I en bolsas de un solo uso y se guardó a -20 °C.

La cosecha a granel de DEN1-80E, DEN2-80E, DEN3-80E, o DEN4-80EZip se descongeló a temperatura ambiente (15-25°C) durante aproximadamente 24 horas. Después, las partículas se separaron pasando el material a través de un filtro de tamaño de poro de 5 pm. La cosecha a granel filtrada se cargó directamente en una columna 4G2-Sepharose. Después de la carga, la columna se lavó con PBS 1 mM, pH 7.1 , que contenía 0.05% de Tween 20 (PBST); luego la 80E retenida se eluyó reduciendo el pH con amortiguador de glicina. Los sub-lotes se reunieron y entonces se desactivaron viralmente reduciendo el pH a un pH final de 3.8 e incubando el material a temperatura ambiente (15-25 °C) durante 16-24 horas, después de lo cual el pH se ajustó a 7.0 ± 0.5. El material se pasó a través de un prefiltro de 0.2 pm para quitar las partículas pequeñas y luego se filtró del virus usando una membrana de tamaño de poro de 20 nm. Después, el material se concentró y el amortiguador se intercambió por medio de ultrafiltración, y se hizo una filtración estéril final pasando a través de un filtro de 0.2 pm directamente a bolsas estériles. Las sustancias biológicas 80E purificadas se sometieron a determinaciones extensas de seguridad, identidad, concentración y pureza antes de liberarlas para su formulación en los productos de vacuna.

EJEMPLO 3 Formulación de la vacuna HBV-001 para usarse en estudios clínicos La formulación de la vacuna monovalente DEN1-80E adsorbida en alumbre (HBV-001 D1 ) se hizo bajo cGMP. Brevemente, la sustancia biológica DEN1-80E purificada descrita en el ejemplo 2 se descongeló y se transfirió a un área de flujo laminar de Clase 100. La DEN1-80E se diluyó en solución salina amortiguadora de fosfato de Dulbecco (DPBS) para obtener una concentración final objetivo de proteina de 0.20 mg/ml, y la solución de 80E diluida se esterilizó por filtración. Se agregó volumétricamente DPBS y Alhydrogel '85' a la solución de DEN1-80E diluida, hasta una concentración final de aluminio de 2.50 mg/ml. La solución se mezcló suavemente a 2-8 °C durante la noche.

Después de la adsorción durante la noche, se determinó la cantidad de proteína DEN1-80E que no fue adsorbida. Se requirió un mínimo de 75% de adsorción para avanzar a la preparación de la vacuna HBV-001 D1. Las cantidades apropiadas de la vacuna HBV-001 D1 se transfirieron a frascos estériles preparados. Los frascos llenos se taparon, se sellaron y el sello se dobló hacia adentro. Los frascos llenos de vacuna se guardaron a 2-8 °C. Se hizo un análisis extenso de la seguridad, concentración, identidad, potencia y pureza antes de usar la vacuna en los estudios clínicos.

EJEMPLO 4 Formulación del antíqeno tetravalente del dengue para usarse en estudios clínicos La formulación de la vacuna DEN-80E tetravalente se hizo bajo cGMP. Brevemente, las sustancias biológicas DEN1 -80E, DEN2-80E, DEN3-80E y DEN4-80EZip purificadas, descritas en el ejemplo 2, se descongelaron y se transfirieron a un área de flujo laminar de Clase 100. Los antígenos descongelados se esterilizaron por filtración y se determinó la concentración de la proteína después de la filtración. Cada antigeno DEN-80E se diluyó independientemente con solución salina amortiguadora de fosfato de Dulbecco (DPBS) para obtener una concentración final objetivo de proteína de 0.50 mg/ml. Las cuatro soluciones de proteína se mezclaron entonces volumétricamente a una proporción de 1 :1 :1 :2 para DE 1 -80E:DEN2-80E:DEN3-80E: DEN4-80EZip, para producir una solución tetravalente que contiene DEN1-80E a 0.1 mg/ml, DEN2-80E a 0.1 mg/ml, DEN3-80E a 0.1 mg/ml, y DEN4-80EZ¡p a 0.2 mg/ml. Las cantidades apropiadas de la mezcla de vacuna tetravalente se transfirieron a frascos estériles preparados. Los frascos llenos se taparon, se sellaron y el sello se dobló hacia adentro. Los frascos llenos de vacuna se guardaron a 2-8 °C. También se prepararon formulaciones similares que contenían DEN1-80E, DEN2-80E, DEN3-80E y DEN4-80E para sustentar las pruebas clínicas. Se hizo un análisis extenso de la seguridad, concentración, identidad, potencia y pureza antes de usar la vacuna en los estudios clínicos. El antígeno tetravalente se administra solo o mezclado de acuerdo con Las Buenas Prácticas Clínicas con un adyuvante preparado estéril, antes de su administración a sujetos humanos.

EJEMPLO 5 Pruebas clínicas de la vacuna de subunidad recombinante del dengue de tipo l HBV-001D1 La vacuna HBV-001 D1 fabricada bajo cGMP como se describe en el ejemplo 3 se probó en una prueba clínica. El estudio de fase 1 aleatorizado, de doble ciego, de un solo centro, para evaluar el producto biológico HBV-001 D1 en voluntarios adultos sanos, evaluó dos niveles de dosis diferentes del ingrediente activo de la vacuna (DEN1-80E), con la misma cantidad de adyuvante Alhydrogel '85'. Los sujetos recibieron una sola inyección i.m. de la vacuna de estudio en las semanas 0, 4 y 8, El diseño del estudio se resume en el cuadro 1 más abajo.

CUADRO 1 Diseño del estudio clínico de HBV-001 -C-101 La seguridad y tolerancia se evaluaron durante todo el estudio por medio de examen físico dirigido, pruebas rutinarias de laboratorio (hematología, química clínica y uríanálisis), y el registro de signos vitales y eventos adversos en los voluntarios del estudio. Además, los sujetos usaron tarjetas de registro diario durante 14 +1-2 días después de cada vacunación para registrar los datos de reactogenicidad y tolerancia y también eventos adversos específicos. Las evaluaciones de eficacia en este estudio incluyeron la determinación de la velocidad y magnitud de los títulos de anticuerpo neutralizante de virus (es decir, inmunogenicidad), determinada por medio de una prueba PRNT50 (prueba de neutralización de reducción de placa) de = 1 : 10. No hubo señales de alerta de seguridad identificadas en el estudio, sugiriendo que la vacuna es segura para los sujetos humanos.

En el cuadro 2 se resumen los datos de inmunogenicidad de los individuos inmunizados. De los 6 receptores de la vacuna en la cohorte de dosis baja, todos los sujetos resultaron negativos para títulos de anticuerpo neutralizante en las semanas 0, 2 y 4. La mayoría de los sujetos (4/6) había desarrollado anticuerpos neutralizantes por la semana 10, que fue 2 semanas después de la tercera dosis de vacuna. Ningún sujeto mostró anticuerpos detectables por la semana 34. Un sujeto (007) mostró un resultado positivo empezando en la semana 6 (2 semanas después de la segunda dosis de vacuna) que también estuvo presente en la semana 10, pero fue indetectable en la semana 34 (26 semanas después de la dosis 3).

De los 6 receptores de la vacuna en la cohorte de dosis alta, todos los sujetos resultaron negativos para títulos de anticuerpo neutralizante en las semanas 0, 2 y 4. Un sujeto mostró resultados positivos empezando en la semana 6 (2 semanas después de la segunda dosis de vacuna). Dos sujetos mostraron anticuerpos neutralizantes en la semana 8 (día de la tercera dosis de vacuna), y la mayoría de los sujetos (5/6) habían desarrollado anticuerpos neutralizantes por la semana 10. Dos sujetos continuaron mostrando títulos de anticuerpo detectables en la semana 34. Esto representa la primera demostración de la inducción de anticuerpos neutralizantes de virus para una vacuna no replicativa para el dengue en sujetos humanos. Los 4 receptores de placebo tuvieron títulos de anticuerpo indetectables en todos los puntos de tiempo medidos.

CUADRO 2 Resumen de títulos de anticuerpo neutralizante por sujeto Los niveles de anticuerpo se determinaron mediante la prueba PRNT con un título detectable mínimo de 10. Los sujetos con títulos de anticuerpo no detectables se designan con "<10".

* El sujeto 014 recibió solo una dosis de vacuna pero completó todas las visitas del estudio y las evaluaciones de seguridad.

Los resultados demuestran que la vacuna HBV-001 D1 es segura y capaz de inducir una respuesta inmune contra DEN1 en pacientes humanos. Además, esta respuesta inmune protectora relevante fue inducida en los individuos vacunados sin la inclusión de NS1 en la formulación, a pesar del requerimiento anticipado de NS1 para una protección potente (McDonell et al., US 6,416,763).

EJEMPLO 6 Pruebas de la vacuna tetravalente de subunidad recombinante 80E del dengue (w/DEN4-80EZip) en macacos Rhesus Se preparó una formulación tetravalente que comprende la combinación única de DEN1-80E monomérica, DEN2-80E monomérica, DEN3-80E monomérica, y DEN4-80EZip dimérica, como una mezcla con adyuvante ISCOMATRIX® para suministrar una dosis de 1 g de cada DEN-80E y 47 unidades ISCO de adyuvante ISCOMATRIX® a macacos Rhesus (grupo 1 ). Se preparó una segunda mezcla que comprendía la misma composición tetravalente pero también incluía una dosis de 0.1 g de proteína NS1 de DEN2 (grupo 2). A grupos de 12 monos se les administraron 3 dosis de cualquier mezcla o ISCOMATRIX® solo (grupo 3) a intervalos de 2 meses. La inmunogenicidad se evaluó 30 días después de la tercera dosis de vacuna (día 150 del estudio). En el cuadro 3 se presentan los títulos de anticuerpo de los animales individuales inmunizados con la formulación tetravalente sin NS1. Como puede observarse claramente, la combinación única de los antígenos monoméricos y diméricos resulta en respuestas tetravalentes equilibradas de neutralización de virus de alto título en los animales.

CUADRO 3 Respuestas de anticuerpo neutralizante de virus después de 3 dosis de la vacuna tetravalente ID Animal Respuesta Respuesta Respuesta Respuesta anti-virus anti-virus anti-virus anti-virus DEN1 * DEN2 * DEN3 * DEN4 * CT343 480. 622. 328. 99.

CR14 519. 2979. 1509. 447.

CN96 1365. 1 101. 959. 449.

CN94 277. 1710. 744. 305.

CM80 1522. 1897. 603. 312.

CM50 184. 157. 166. 131.

CL84 151. 839. 589. 781.

CL47 829. 584. 608. 442.

CL25 NT 1 187. 302. 309.

CI27 725. 1290. 1034. 289.

CH97 2718. 767. 555. 117.

CN32 1927. 867. 588. 256.

Títulos de anticuerpo neutralizante de virus determinados en pruebas de neutralización de reducción de placa con un corte de 50% de reducción Cinco meses después de recibir la última dosis de vacuna, los animales fueron sometidos a provocación con virus del dengue de tipo silvestre. Para la provocación, cada grupo de 12 monos se subdividió aleatoriamente en 4 grupos de 3 monos cada uno para la provocación con uno de los cuatro virus del dengue. Cada mono fue provocado con aproximadamente 105 unidades formadoras de placa de los virus del dengue administrados por vía subcutánea. Los siguientes 1 1 días se tomaron diariamente muestras de sangre de los animales. La presencia del virus (viremia) en las muestras de sangre se determinó por medio de cultivo en placa directo en células Vero, o amplificación en células C3/36 de mosquito y después cultivo en placa en células Vero. Aunque los macacos Rhesus no desarrollan síntomas de la enfermedad cuando se infectan con el virus del dengue de tipo silvestre, sí desarrollan viremia, y la prevención de la viremia se considera un substituto de la eficacia protectora. En el cuadro A se presentan los datos de la provocación. Aunque 1 1/12 animales de control que recibieron solo el adyuvante ISCOMATRIX® desarrollaron viremia después de la provocación, todos los animales que recibieron la formulación de vacuna tetravalente sin NS1 (grupo 1 ) fueron protegidos completamente de la viremia detectable. También fueron protegidos de la viremia 1/12 animales que recibieron la formulación de vacuna tetravalente que contenía NS1 (grupo 2), pero sorprendentemente un mono que recibió la formulación que contenía NS1 desarrolló un solo día de viremia. De esta manera, una formulación de vacuna tetravalente que contiene la combinación única de proteínas monoméricas y diméricas sin NS1 mostró inmunidad tetravalente equilibrada y protección completa contra la provocación viral, y sorprendentemente parece mostrar protección superior en comparación con una formulación que contiene NS1.

CUADRO A Resultados de un estudio de provocación de dengue tetravalente en el macaco Rhesus: determinación cuantitativa de viremia después de la provocación por medio de una prueba de placa directa del suero del mono sobre células Vero, como se describe en el ejemplo 6 CUADRO A (Continuación) EJEMPLO 7 Pruebas de la vacuna tetravalente de subunidad recombinante 80E del dengue en macacos Rhesus El objetivo de este estudio no GLP en monos Rhesus fue: 1 ) comparar la inmunogenicidad y eficacia protectora de DEN4-80E y DEN4-80EZip, y 2) evaluar la inmunogenicidad y eficacia protectora de DEN4-80E en una formulación tetravalente con las otras subunidades recombinantes monoméricas de DEN-80E (DEN1-80E, DEN2-80E y DEN3-80E). DEN4-80E y DEN4-80Ezip se evaluaron a dosis baja, media y alta (6, 20 y 100 pg/dosis). Asimismo, las formulaciones tetravalentes se evaluaron a dosis baja (3, 3, 3, 6 pg de DEN1-80E, DEN2-80E, DEN3-80E y DEN4-80E respectivamente), media (10, 10, 10, 20 pg) y alta (50, 50, 50, 100 pg). La mayoría de las formulaciones probadas contenían adyuvante ISCOMATRIX® a 90 Unidades ISCO por dosis. Se incluyó un grupo de control negativo que recibió solo adyuvante ISCOMATRIX® a 90 Unidades ISCO por dosis. Para fines comparativos se incluyeron en el estudio dos grupos adicionales. Se incluyó un grupo que recibió la dosis media de DEN4-80E (20 pg) formulada con 225 pg de Alhydrogel, y un grupo que recibió la dosis media de la vacuna tetravalente formulada con 37.6 Unidades ISCO. Cada vacuna o formulación de control se administró a macacos Rhesus adultos sanos de cualquier sexo, con pesos mayores de 3 kg, y que eran negativos para anticuerpo de flavivirus (DEN 1 , 2, 3 y 4, y WN) según una prueba ELISA. Se usaron tres monos por grupo para evaluar las vacunas de DEN4 monovalentes y 12 monos por grupo para evaluar las formulaciones tetravalentes o el grupo de control negativo de ISCOMATRIX®.

Las formulaciones de vacunas candidatas anteriormente descritas se administraron en un volumen total de 0.5 mi por inoculación intramuscular. Se administraron tres dosis de vacuna a intervalos de 4 semanas. La actividad neutralizante de virus se determinó cada cuatro semanas (T= 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32) usando la prueba de microneutralización basada en LiCor. Más abajo en el cuadro 4 se resumen los resultados de LiCor en la semana 12 (4 semanas después de la dosis 3). Una de las conclusiones clave de los resultados de la semana 12 es que la inmunogenicidad de DEN4-80E y DEN4-80EZip es muy comparable entre las dosis evaluadas. La media geométrica de los títulos de neutralización para DEN4-80E a las dosis baja, media y alta fueron 508, 508 y 320, respectivamente, mientras que los títulos para DEN4-80EZip fueron 640, 1016 y 320. También se observó que el grupo que recibió la dosis media de DEN4-80E con adyuvante ISCOMATRIX® tuvo una media geométrica del título de neutralización sustancialmente más alta (508) que el grupo que recibió Alhydrogel (32). También se observó que se lograron respuestas equilibradas altas para los cuatro tipos de dengue en los grupos que recibieron las formulaciones de vacuna tetravalente. No se observó una respuesta de dosis evidente con cualquiera de las vacunas de un solo componente (DEN4-80E o DEN4-80E-Zip) o la vacuna tetravalente.

CUADRO 4 Títulos de anticuerpo neutralizante de serotipos de dengue (LiCorso GMT) inducidos en macacos Rhesus en la semana 12 (4 semanas después de la dosis 3) con varias formulaciones de subunidad recombinante y de control NT - no probado; * resultado de L¡Cor50 <10 considerado como 5 para calcular GM EJEMPLO 8 Pruebas clínicas de la vacuna tetravalente de subunidad recombinante 80E del dengue La vacuna tetravalente 80E del dengue fabricada bajo cGMP se prepara para someterse a una prueba clínica. El estudio consistirá en un estudio de fase I de la vacuna tetravalente 80E del dengue. El estudio será un estudio de escalación de dosis aleatorizado, de doble ciego, controlado por placebo, que evaluará la seguridad, tolerancia e inmunogenicidad de diferentes formulaciones de una vacuna tetravalente del dengue (DEN1-80E, DEN2-80E, DEN3-80E y DEN4-80E) en adultos sanos de 18 a 45 años de edad sin flavivirus previo. Se recolectarán datos de inmunogenicidad 1 mes después de cada vacunación, y también 6 meses y 1 año después de la tercera vacunación.

En conjunto, serán enrolados en el estudio 90 sujetos para recibir 3 inyecciones intramusculares de cualquier vacuna activa o placebo, administrados a las 0, 4 y 8 semanas. Como se muestra en el cuadro 5, se evaluarán 3 niveles de dosis de antigenos 80E de dengue 1 , dengue 2, dengue 3 y dengue 4: dosis baja (3, 3, 3 y 6 pg, respectivamente), dosis media (10, 10, 10 y 20 pg, respectivamente), y dosis alta (50, 50, 50 y 100 pg, respectivamente) de las formulaciones. Dentro de cada nivel de dosis, las vacunas específicas probadas incluirán formulaciones con adyuvante ISCOMATRIX® (con 30 o 60 unidades ISCO), con adyuvante Alhydrogel™, o sin adyuvante.

CUADRO 5 Formulaciones investigadas por evaluar en el protocolo 001 Referencias Angsubhakorn, S. et al., (1994) Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health 25:554-59 Azzari, C. et al., (1987) Pediatr. Med. Chir. 9:391-6 Bailas, Z.J. et al., (2001 ) J. Immunol. 167:4878-86 Bancroft, W.H. et al., (1984) Vaccine 149:1005-10 Bakonyi et al., (2005) Emerg. Inf. Dis. 1 :225 Banzhoff et al., (2003) Gerentology 49:177-84 Barr and Mitchell, Immunology and Cell Biology 74: 8-25 (1996) Beasley, D. and Barrett A., (2002) J. Virol. 76:13097-13100 Beasley, D. et al., (2004) Vaccine 22:3722-26 Ben-Nathan et al., (2003) J. Inf. Dis. 188:5-12 Ben-Yehuda et al., (2003) Vaccine 21 :3169-78 Bhamarapravati, N. et al., (1987) Bull. World Health Organ. 65:189-95 Bhamarapravati, N. and Sutee, Y. (2000) Vaccine Suppl 2:44-47 Brandt, E.E. (1990) J. Infecí Dis. 162:577-83 Bray, M. et al., (1996) J. Virol. 70:4162-66 Bray, M. and Lai, C.J. (1991 ) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:10342-46 Brunger, A. et al., (1998) Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 54:905-21 Cañe, P.A. et al., (1988) J. Gen. Virol. 69:1241-46 Bungener et al., (2005) Vaccine 23:1232-41 Cardosa, M.J. (1998) British Med. Bull. 54:395-405 Cerquetti, M.C. et al., (1983) Infecí. Immun. 41 :1017 Chambers, T.J. et al., (1990) Annual Rev. Microbiol. 44:649-88 Chang et al., (2001 ) Ann. N. Y. Acad. Sci. 951 :272-85 Chen, W. et al., (1995) J. Virol. 69:5186-90 Chowers et al., (2001) Emerg. Inf. Dis. 7:675-78 Chu, R.S. et al., (1997) J. Exp. Med. 186:1623 Clements et al., (2010) Vaccine 28:2705 Comment (2004) Ann. Inter. Med. 141 :153 Cox, J.C. and Coulter, A.R. (1997) Vaccine 15:248-56 Crill, W. and Roehrig J. (2001) J. Virol. 75:7769-73 Culp, J.S. et al., (1991 ) Biotechnology 9 :173-7 Cuzzubbo et al., (2001 ) Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8:1 150-55 Dejnirattisai et al., (2010) Science 328:745-748 Dharakul, T. et al., (1994) J. Infecí. Dis. 170:27-33 Eckels, K.H. et al., (1984) Am. J. Trop. Med. Hyg. 33:684-89 Edelman, R. et al., (1994) J. Infecí. Dis. 170:1448-55 Elias et al., (2003) J. Immunol. 171 :3697-3704 Ennis, F. et al., (1999) Virology 259:256-61 Falgout, B. et al., (1990) J. Virol. 64:4356-63 Fleeton, M.N. et al. (1990) J. Gen. Virol. 80:1 189-98 Frech et al., (2005) Vaccine 23:946-50 Gibbons, R.V. and Vaughn, D.W. (2002) British Medical Journal 324:1563-66 Gluck, R. and Metcalf (2002) Vaccine 20:B10-6 Guebre-Xabier et al. (2004) J. Virol. 78:7610-18 Gubler, D.J. (1998) Clin. Microbiol. Rev. 11 :480-96 Gupta, R.K. and G.R. Siber (1995) Vaccine 13:1263-76 Hall, R A. et al., (1996) J. Gen. Virol. 77:1287-94 Halstead, S.B. (1988) Science 239:476-81 Hartmann, G. and Krieg, A. (2000) J. Immunol. 164:944-52 Hartmann, G. et al., (2000) J. Immunol 164:1617-24 Heinz, F.X. et al., (1983) Virology 130:485-501 Henchal, E.A. et al., (1985) Am. J. Trop. Med. Hyg. 34 : 162-69 Henchal, E.A. and Putnak J.R. (1990) Clin. Microbiol Rev. 3:376-96 Hoke, C.H. Jr. et al., (1990) Am. J. Trop. Med. Hyg. 43:219-26 Ivey-Hoyle, M. (1991 ) Curr. Opin. Biotechnol. 2:704-7 Jacobs, S.C. et al., (1994) J. Gen. Virol. 75:2399-2402 Jan, L. et al., (1993) Am. J. Trop. Med. Hyg. 48:412-23 Johansen, H. et al., (1989) Genes Dev. 3:882-89 Jones, T.A. and Kjeldgaard, M. (1998) Essential O, software manual, Uppsala Kanesa-thasan, N. et al., (2001 ) Vaccine 19:3179-88 Katz, J. et al., (2004) Immunol. Res. 29 :1 13-24.

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Claims (20)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una composición inmunogénica que comprende una cantidad eficaz de proteínas de envoltura ("E") purificadas del virus del dengue del serotipo DEN-1 , DEN-2, DEN-3 y DEN-4, un excipiente farmacéuticamente aceptable, y una cantidad eficaz de adyuvante; en donde cada proteína E constituye aproximadamente el 80% de la longitud de la proteína E de tipo silvestre empezando desde el residuo de aminoácido 1 en su extremo N; en donde la proteína E DEN-4 es dimérica; y en donde la composición induce la producción de anticuerpos neutralizantes en sujetos humanos.

2. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la proteína E es producida recombinantemente y expresada en células hospederas de insecto.

3. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la proteína E es producida recombinantemente y expresada en células hospederas Schneider 2 (S2) de Drosophila melanogaster.

4. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque el adyuvante es un adyuvante de sal de aluminio.

5. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque el adyuvante es un adyuvante de tipo ISCOM.

6. - La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque el adyuvante es ISCOMATRIX.

7. - La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque la cantidad de proteína DEN4 es de aproximadamente 1.5 a aproximadamente 3 veces las cantidades individuales de las proteínas DEN1 , DEN2 y DEN3.

8.- La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque la cantidad de proteína DEN4 es aproximadamente dos veces las cantidades individuales de las proteínas DEN1 , DEN2 y DEN3.

9.- Una composición inmunogénica que comprende una cantidad eficaz de monómeros de proteína de envoltura ("E") purificada del virus del dengue del serotipo DEN-1 , DEN-2, DEN-3 y DEN-4, un excipiente farmacéuticamente aceptable, y una cantidad eficaz de adyuvante; en donde cada proteína E constituye aproximadamente el 80% de la longitud de la proteína E de tipo silvestre empezando desde el residuo de aminoácido 1 en su extremo N, de tal manera que dicha proteína E es secretable al medio de crecimiento cuando se expresa recombinantemente en una célula hospedera; en donde la cantidad de la proteína E DEN4 es aproximadamente de 1.5 a aproximadamente 3 veces las cantidades individuales de las proteínas DEN1 , DEN2 y DEN3; y en donde la composición induce la producción de anticuerpos neutralizantes en sujetos humanos.

10. - La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque la cantidad de proteína E DEN4 es aproximadamente dos veces las cantidades individuales de las proteínas E DEN1 , DEN2 y DEN3.

11. - La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque la cantidad de las proteínas E DEN se selecciona del grupo que consiste en: (a) aproximadamente 3 pg de DEN1 -80E, aproximadamente 3 pg de DEN2-80E, aproximadamente 3 pg de DEN3-80E y aproximadamente 6 pg de DEN4-80E; (b) aproximadamente 10 pg de DEN1-80E, aproximadamente 10 pg de DEN2-80E, aproximadamente 10 pg de DEN3-80E, y aproximadamente 20 pg de DEN4-80E; (c) aproximadamente 50 pg de DEN1-80E, aproximadamente 50 pg de DEN2-80E, aproximadamente 50 pg de DEN3-80E, y aproximadamente 100 pg de DEN4-80E; (d) aproximadamente 3 pg de DEN1-80E, aproximadamente 3 pg de DEN2-80E, aproximadamente 3 pg de DEN3-80E, y aproximadamente 6 pg de DEN4-80EZip; (e) aproximadamente 10 pg de DEN1-80E, aproximadamente 10 pg de DEN2-80E, aproximadamente 10 pg de DEN3-80E, y aproximadamente 20 pg de DEN4-80EZip; y (f) aproximadamente 50 pg de DEN1-80E, aproximadamente 50 pg de DEN2-80E, aproximadamente 50 pg de DEN3-80E, y aproximadamente 100 pg de DEN4-80EZip.

12. - El uso de una composición inmunogénica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 , para preparar una vacuna para provocar una respuesta inmune protectora.

13. - El uso de una composición inmunogénica de cualquiera de las reivindicaciones 1-1 1 , para preparar una vacuna para proveer protección inmune contra la enfermedad inducida por el virus del dengue.

14. - El uso de una composición inmunogénica que comprende una proteína de envoltura ("E") purificada del virus del dengue y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde la proteína E constituye aproximadamente 80% de la longitud de la proteina E de tipo silvestre, empezando desde el residuo de aminoácido 1 en su extremo N; y una cantidad eficaz de adyuvante; para preparar una vacuna para provocar una respuesta inmune protectora.

15 - El uso como el que se reclama en la reivindicación 14, en donde la composición inmunogénica comprende proteínas E del virus del dengue de los serotipos DEN1 , DEN2, DEN3 y DEN4, en donde la proteína E DEN4 es dimérica.

16. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 14 o la reivindicación 15, en donde la cantidad de proteína DEN4 es aproximadamente dos veces la cantidad individual de las proteínas DEN1 , DEN2 y DEN3 en la composición.

17. - El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 12-16, en donde la composición se adapta para ser administrable por vía intramuscular, subcutánea o intradérmica.

18.- Una composición inmunogénica que comprende una cantidad eficaz de proteínas de envoltura ("E") purificadas del virus del dengue del serotipo DEN-1 , DEN-2, DEN-3 y DEN-4, un excipiente farmacéuticamente aceptable, y una cantidad eficaz de adyuvante; en donde cada proteína E constituye aproximadamente el 80% de la longitud de la proteína E de tipo silvestre empezando desde el residuo de aminoácido 1 en su extremo N; y en donde la proteína E DEN-4 es dimérica; para usarse en la prevención o tratamiento de la enfermedad del dengue en un paciente.

19 - La composición de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque el paciente es un paciente inmunodefíciente.

20 - El uso de una composición como la que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1-11 , para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la infección o enfermedad del dengue.