CN112805030A - 利用成像细胞计数术的病毒中和测定法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了病毒减少中和测试(VRNT)，其为当前标准的低通量和费力的中和测定法的快速、高通量替代方案。VRNT利用成像细胞计数法在感染后约一天对病毒‑感染的细胞进行计数(因此消除了其他测定法采用的允许病毒感染从细胞至细胞的等待时间)，减少总体测定时间，并将通量增加至少15倍。

Description

利用成像细胞计数术的病毒中和测定法
发明背景
登革热(DEN)是一种黄病毒科(黄病毒属)的蚊子传播的正义RNA病毒，其具有四种不同的血清型(DEN 1-4)。登革热影响超过40%的世界人口，并且是世界的亚热带和热带地区中幼儿中的疾病和死亡的主要原因(WHO. Dengue Fact Sheet (2007))。随后登革热病毒毒株的感染是严重疾病的危险因素，并且与90%的登革出血热(DHF)病例有关，而原发感染后呈现DHF的剩余10%主要是生命的第一年内的儿童(Green, S.和Rothman A., Curr. Opin. Infect. Dis. (2006) 19:429-36)。高流行区域传播所有四种血清型。因此，登革热的疫苗应当是四价的，提供均衡的免疫应答(WHO. Geneva, 2013)，并保护幼儿。一种疫苗(Dengvaxia® (CYD-TDV))目前在几个流行国家中被许可用于9-45岁的个体，其中年龄依赖性疫苗效力为45-66% (Hadinegoro, S.R. 等人, N. Engl. J. Med. (2015) 373:1195-1206; Godoi, I. P. 等人, J. Comp. Eff. Res. (2017) 6:165-180)。该疫苗由于在幼稚(naïve)受试者中缺乏效力而在幼儿(<9岁)中禁忌使用，并且得到III期试验中接种疫苗的2-5岁儿童中住院增加的支持。世界卫生组织(WHO)设定了到2020年全世界登革热疾病减少25%和死亡减少50%的目标(WHO Press, Geneva, 2012)；因此，迫切需要一种改进的登革热疫苗，尤其是在较年幼儿童中有效的登革热疫苗。
疫苗引发免疫应答的能力对于疫苗开发至关重要，并且在确定临床效力中是重要的。血清抗体应答的量度是评价免疫原性的优选方法。具体地，功能性中和抗体测试是经常进行以检测可有效中和病毒、预防体外感染的抗体量的血清学测定法。一种测量登革热病毒中和的技术是使用用悬浮细胞的流式细胞计数术，并且需要在固定和染色过程中的额外步骤(de Silva等人, J. Clin. Microbiology, (2007) 45:3777-3780)。当前用于测量病毒中和(包括登革热病毒中和)的金标准测试是噬斑减少中和测试(PRNT)，或类似的病灶减少中和测试(FRNT)，其利用免疫染色来将感染后的“噬斑”(称为病灶)可视化(当病毒感染和进一步复制从细胞扩散至细胞时生成噬斑)。由于病毒感染速率慢，这些测试是非常耗时的。例如，一些病毒可能花费数天(最多达5天或更多天)来经由噬斑或病灶形成显示可检测的感染。24-孔板形式已用于登革热临床样品FRNT测试(Durbin, A. P. 等人, Am. J. Trop. Med. Hyg. (2001) 65:405-413; Timiryasova, T. M. 等人, Am. J. Trop. Med. Hyg. (2013) 88:962-970)，对于2倍稀释方案，其每板仅容纳一个一式两份样品。当前开发中的登革热疫苗是四价的(Torresi, J. 等人, Hum. Vaccin. Immunother. (2017) 13:1059-1072)，由此使每个样品的测试数增加4倍。对于包括数千个参与者的大型研究，所需的板的数量变得累赘，并且测试加上分析的时间冗长，因此，涵盖接种疫苗的受试者的亚组的随机免疫原性组经常代替完整的样品测试(Saez-Llorens, X. 等人, Lancet Infect. Dis. (2017) 17:615-625; L’Azou, M. 等人, N. Engl. J. Med. (2016) 374:1155-1166)。因此，迫切需要改进当前的测试方法以减少测定时间并增加通量。本文描述了病毒减少中和测试(VRNT)。
发明概述
本发明描述了病毒减少中和测试(VRNT)，其为当前标准的低通量和费力的中和测定法的快速、高通量替代方案。VRNT利用成像细胞计数法在感染后约一天对病毒-感染的细胞进行计数(因此消除了其他测定法采用的允许病毒感染从细胞至细胞的等待时间)，减少总体测定时间，并将通量增加至少15倍。
附图简述
图1. VRNT和FRNT方法的并排比较。在该图中，第1天被视为板接种，而不是测定第1天。差异包括板形式(对于VRNT为96-孔，且对于FRNT为24-孔)，感染时间以及二抗和检测。VRNT检测依赖于荧光染色的细胞和细胞计数仪计数；FRNT依赖于过氧化物酶底物和病灶形成来进行手工病灶计数。
图2. MOI和一抗浓度对S/N比的相互作用图。
图3. 用DEN1-4使用单个阳性供体血清样品经四天的FRNT。经四天的病灶发展揭示较小的病灶可能密切接近。比例尺代表2 mm。(A)经四天的FRNT50滴度揭示经四天产生的广泛范围的滴度(B)。
图4. VRNT/FRNT一致性。DEN1-4的VRNT50和FRNT50一致性图(A)。VRNT50和FRNT50测定程序之间的一致性量度(B)。
图5. 在37℃下孵育过夜之前，在室温(RT)下在孵育和不孵育的情况下接种的板的DRAQ5染色计数和热图。
图6. 未在室温下放置或在室温下放置、然后在37℃下放置过夜的板的DRAQ5对象计数(A)，以及对于选择的30分钟时间点和门控(15/45分钟)时间的对应的VRNT50滴度(B)和%CV (C)。
发明详述
本发明涉及病毒中和测定法，其包括：感染步骤，其中感染时间持续不长于约24小时；和成像步骤，其中利用成像细胞计数法对个体细胞进行计数。
在另一个实施方案中，本发明涉及测定样品中的中和抗体滴度的病毒中和测定法，其包括：感染步骤，其中感染时间持续不长于约24小时；和成像步骤，其中利用成像细胞计数法对个体细胞进行计数。
在另一个实施方案中，本发明涉及测定样品中的中和抗体滴度的病毒中和测定法，其包括：A)孵育步骤；B)铺板步骤；C)感染步骤，其中感染时间持续不长于约24小时；D)固定步骤；E)检测步骤；和F)成像步骤：其中利用成像细胞计数法对个体细胞进行计数。
在另一个实施方案中，本发明涉及测定样品中的中和抗体滴度的病毒中和测定法，其包括：A)孵育步骤：其中孵育包含病毒和含有抗体(样品抗体)的样品的混合物，其中一定量的所述样品抗体结合一定量的病毒，使结合的病毒被中和；B)铺板步骤：其中将预定量的混合物添加至板的各个孔中的接种细胞中，其中未结合的病毒自由感染细胞；C)感染步骤：其中感染时间持续不长于约24小时；D)固定步骤；E)检测步骤；和F)成像步骤：其中利用成像细胞计数法和软件对个体细胞进行计数，以测定样品中的中和抗体的量。
在另一个实施方案中，所述病毒中和测定法是登革热病毒中和测定法。在另一个实施方案中，所述登革热病毒选自DEN1、DEN2、DEN3和DEN4。
在另一个实施方案中，步骤A孵育在约37℃下进行。
在另一个实施方案中，步骤A孵育在37℃下进行。
在另一个实施方案中，步骤A孵育在约37℃下进行约15至45分钟。
在另一个实施方案中，步骤A孵育在37℃下进行15至45分钟。
在另一个实施方案中，步骤C感染时间不长于18小时。
在另一个实施方案中，步骤C感染时间不长于12小时。
在另一个实施方案中，步骤C感染时间不长于6小时。
在另一个实施方案中，步骤C感染时间不长于3小时。
在另一个实施方案中，步骤C感染时间不长于2小时。
在另一个实施方案中，步骤C感染时间不长于1小时。
在另一个实施方案中，步骤C感染时间为24小时。
在另一个实施方案中，步骤C感染时间发生在18至24小时之间。
在另一个实施方案中，步骤C感染时间为约12小时。
在另一个实施方案中，步骤C感染时间为12小时。
本发明的病毒中和测定法利用本领域中众所周知的许多标准步骤和程序，并在下面进行总体描述。
抗体中和测定法的技术和步骤：
孵育：
孵育步骤是众所周知的，并且也可以称为中和步骤。在该步骤中，将含有抗体(样品抗体)的样品连续稀释，与固定量的病毒组合(产生混合物)，并在各种标准时间和温度下孵育。孵育可以在室温、37℃或4℃下进行，并且根据需要可运行30分钟至过夜。在本发明的测定法的一个实施方案中，孵育时间为约30分钟。在一个进一步实施方案中，孵育温度为约37℃。
铺板：
铺板步骤通常可以描述为将在孵育步骤中产生的病毒和样品抗体混合物添加至铺板接种的细胞中，其中未与样品抗体结合的病毒自由感染细胞。在中和测定法中，可以利用许多不同类型的接种细胞，包括Vero、LLC-MK2、A549、C6/36、Hep-2和其他粘附细胞系。在本发明的测定法的一个实施方案中，接种的细胞是粘附细胞。在另一个实施方案中，接种的细胞是Vero细胞。
感染：
感染步骤可以被描述为病毒进入细胞和复制以产生可检测的病毒蛋白的过程。该步骤随着时间推移而发生，并且可以迅速发生和/或花费数天。在标准中和测定法中，感染步骤需要时间，以允许多个感染和复制周期以产生噬斑或病灶，然后通过下游技术对其进行成像。在本发明中，所述感染时间不长于24小时。在本发明的另一个实施方案中，所述感染时间不长于18小时。在本发明的另一个实施方案中，感染时间不长于12小时。在本发明的另一个实施方案中，所述感染时间不长于6小时。在本发明的另一个实施方案中，所述感染时间不长于3小时。在本发明的另一个实施方案中，所述感染时间不长于2小时。在本发明的另一个实施方案中，所述感染时间不长于1小时。在本发明的另一个实施方案中，所述感染时间为24小时。在本发明的另一个实施方案中，所述感染时间发生在18至24小时之间。在本发明的另一个实施方案中，所述感染时间为约12小时。在本发明的另一个实施方案中，所述感染时间为12小时。
固定：
存在许多固定方法来灭活病毒和透化细胞，其利用许多已知的固定剂，包括醇固定剂(单独或组合的甲醇、丙酮、乙醇)和醛固定剂，包括福尔马林和多聚甲醛，与分开的透化剂，包括Triton X- 100，以及其他本领域公认的固定剂。在本发明的测定法的一个实施方案中，在固定步骤期间使用的固定剂包括1:1甲醇/丙酮。
检测：
存在可用于在中和测定法中检测病毒的许多检测方法，包括利用针对病毒蛋白的一抗加上荧光二抗，与荧光染料预缀合的一抗，绿色荧光蛋白(GFP)标记的病毒等。一种优选的方法利用与荧光染料预缀合的一抗。
本发明的病毒中和测定法需要使用如下所定义和描述的成像细胞计数法。
成像：
本发明的成像方法利用成像细胞计数仪(也称为成像细胞计数法)。一般而言，成像细胞计数仪是，包括和/或组合使用显微镜(显微术)和读板器(微板读取)。存在许多市售的成像细胞计数仪，包括：Multi-mode Microplate Reader - SpectraMax™ (MolecularDevices, San Jose, CA)、Cell-Imaging Multi-Mode Reader - CYTATION™ (BioTek,Winooski, VT)等。使用成像细胞计数法的讨论公开于Ozaki Y-i等人。Ozaki Y-i, 等人, (2010) A Quantitative Image Cytometry Technique for Time Series or PopulationAnalyses of Signaling Networks. PLoS ONE 5(4): e9955. doi:10.1371/journal.pone.0009955。
在可以用作本发明的测定法的一部分的成像步骤和/或过程的实例中，可以使用SpectraMax® i3X MiniMax™ 300成像细胞计数仪和相应的SoftMax® Pro采集软件6.5.1版或7.0版(利用优选设置)读板。MiniMax能够采集每孔12个位点(3 x 4网格)，其包括整个孔加上孔外区域。可以采集每孔12个可能的位点中的四个(孔的近似80%)，以减少每个板的读取时间并消除从孔的边缘的自发荧光看到的假计数。可以将采集的对象计数原始数据输出为文本文件，并输入至MS Excel工作簿用于处理。在下面进一步更详细地描述利用成像细胞计数仪和随后分析的成像步骤。
定义
术语“粘附细胞”，也称为“锚定依赖性细胞”，是指在细胞培养基中生长、同时粘附至组织培养烧瓶或其他类似容器(即板、多孔板等)的底部的细胞。
“细胞”包括能够被铺板的任何细胞。能够被铺板的细胞是粘附细胞系(粘附细胞)，并且可以是转化的、永生的或原代的细胞系。细胞包括Vero、LLC-MK2、Hep-2、C6/36和A549。在本发明的一个实施方案中，Vero细胞是优选的。
术语“感染”或“病毒感染”是指病毒在铺板步骤期间进入细胞的过程，即，一旦将病毒/样品抗体混合物添加至细胞中，就发生病毒感染。病毒几乎可以立即进入细胞，但通常需要一定时间才发生感染。在本发明的一个实施方案中，感染时间不长于约24小时。在另一个实施方案中，感染时间不长于18小时。在另一个实施方案中，感染时间不长于12小时。在另一个实施方案中，感染时间不长于6小时。在另一个实施方案中，感染时间不长于3小时。在另一个实施方案中，感染时间不长于2小时。在另一个实施方案中，感染时间不长于1小时。在另一个实施方案中，感染时间是24小时。在另一个实施方案中，感染时间发生在18至24小时之间。在另一个实施方案中，感染时间为约12小时。在另一个实施方案中，感染时间是12小时。
术语“复制”或“病毒复制”意指感染后细胞中病毒的形成。
术语“样品抗体”意指从血清或血浆或另一种来源(例如样品)获得的结合病毒的任何抗体。抗体是血液中的蛋白，其响应于特定抗原(诸如病毒)而产生。中和抗体能够结合病毒并抑制感染。所述样品可能含有中和抗体，所述中和抗体在测定法中结合病毒并抑制感染。
术语“病毒”意指选择用于本发明的测定法中的任何单链、双链、正义、负义DNA或RNA病毒。在本发明的一个实施方案中，所述病毒选自黄病毒科(黄病毒属)。在另一个实施方案中，所述病毒选自DEN1、DEN2、DEN3和DEN4。在另一个实施方案中，所述病毒是RSV病毒。在另一个实施方案中，所述病毒是埃博拉病毒。所述测定法中利用的病毒量不同，并且取决于测定条件。病毒输入范围是300至5,000个对象计数。优选范围是400至3,000个对象计数。对象计数是指病毒感染的细胞计数。
“病毒中和测定法”是进行用于检测样品中的病毒中和抗体的水平的基于细胞的测试。
术语“中和抗体”意指能够结合病毒并抑制感染的抗体。
术语“中和抗体滴度”意指样品中的中和抗体的水平。滴度基于病毒对照的减少百分比确定，并且使用如下面的材料和方法部分中所定义的四参数逻辑回归方程进行计算。
术语“板”意指具有透明底部的多孔板。在本发明的一个实施方案中，“板”意指制造为每个板中具有6、12、24、48、96、384或1536个样品孔的多孔板。在另一个实施方案中，板是具有24个或更多个样品孔的多孔板。在另一个实施方案中，板是具有48个或更多个样品孔的多孔板。在另一个实施方案中，板是具有384个或更多个样品孔的多孔板。在另一个实施方案中，板是具有1536个或更多个样品孔的多孔板。在另一个实施方案中，板是96样品孔板。在另一个实施方案中，板是384样品孔板。在另一个实施方案中，板是1536样品孔板。
术语“接种(seeded)”或“接种(seeding)”意指将细胞添加至具有适当生长培养基的板中。在本发明的一个实施方案中，孔中接种的细胞数为5,000个细胞/100μl或为约5,000个细胞/100μl。在另一个实施方案中，孔中接种的细胞数为10,000个细胞/100μl或为约10,000个细胞/100μl。在另一个实施方案中，孔中接种的细胞数为30,000个细胞/100μl或为约30,000个细胞/100μl。
术语“未结合的病毒”意指未被中和且自由感染细胞的病毒。
术语“病毒蛋白”意指由病毒核酸编码且在复制期间在细胞中转录的任何蛋白。
根据以下提供的材料和方法以及数据，可以进一步理解本发明。
材料和方法
板细胞接种：
将Vero细胞(ATCC CCL-81)计数并使用Vi-CELL™ XR (Beckman Coulter)测量活力，然后接种至96-孔CellBIND®黑色透明底板(Corning 3340)。每孔每150 μl含有10%胎牛血清(FBS: Hyclone-SH30071.03HI)的基础必需培养基(MEM：Gibco-11095)添加总共30,000个细胞，所述培养基补充有1x非必需氨基酸(Gibco 11140)、1x L-谷氨酰胺(Gibco-25030)和1x青霉素/链霉素(Gibco-15140)。将板置于37℃、具有湿度和+5% CO2的培养箱中过夜。
病毒和病毒稀释液的测定：
用于这些实验的病毒，WHO参考收集毒株(Roehrig, J. T.等人, Viral Immunol.(2008) 21:123-132) DEN1:West Pacific, DEN2:S16803, DEN3:CH53489, DEN4:TVP-360，是内部来源的。通过在Vero细胞中传代病毒、离心、等分上清液并在-80℃下储存直至使用而生成大型文库。使用模拟中和在96-孔板中进行病毒滴定，以通过如下确定工作稀释液：将病毒跨板水平系列稀释2倍，与2% FBS MEM 1:1组合，在37℃下孵育30分钟。接下来，将50 μl转移至细胞接种板(在转移前除去培养基)，并在室温下孵育30分钟，随后在37℃下孵育过夜。然后将细胞固定并如下所述染色。对病毒感染的细胞通过成像细胞计数法进行计数(如下所述)。VRNT的开发包括为病毒对照设定500-8000个对象计数的接受标准，因此，选择该范围内的病毒稀释液作为VRNT的工作稀释液。
中和与感染-测定第1天：
通过将20 µl样品(血清)添加至180 µl培养基中，实现样品(血清)的两倍系列稀释；将第一稀释液添加于96-孔板(Costar-3879)中，并使用WellPro 3000 (ProGroupInstrument Corp)或手动移液(备份至自动化并提供相似的结果-数据未显示)稀释2倍。接下来，将先前确定的工作病毒稀释液添加至样品(血清)和病毒对照孔中。将血清样品稀释液和病毒通过移液或以300 RPM摇动板2分钟来混合，并在37℃下放置30分钟。然后将板从培养箱取出，并将50 µl转移至接种细胞的黑色96-孔板中(在转移前除去培养基)。将血清样品和病毒混合物在室温下放置30-50分钟以吸附至细胞中，随后向每个孔添加150 µl 2%FBS MEM，并将板置于37℃过夜(22 + 2小时)。
固定和染色-测定第2天：
感染后(即，感染步骤后)近似24小时，将板从37℃培养箱中取出并在室温下放置10分钟。除去接种物，然后使用洗板机(BioTek)用单次PBS洗涤来洗涤细胞或用移液器手动洗涤细胞，然后在冰上冷却板并添加冷丙酮。将板在-20℃下固定10分钟，除去丙酮，并将细胞放置在室温下干燥。此时，针对在单层中的孔，目视检查细胞。将封闭缓冲液(PBS中的1%牛血清白蛋白)添加至孔中，并在室温下封闭细胞1小时。除去封闭缓冲液后，将在封闭缓冲液中以预定浓度稀释的一抗(由Merck开发的兔抗包膜登革热抗体)添加至孔中，并将板在37℃下无湿度或CO2下孵育30分钟。除去一抗，并将孔用PBS手动或使用洗板机洗涤3次。添加1:1000稀释于封闭缓冲液中的Alexa Fluor 488二抗(Invitrogen-A11070)，并将板在37℃下无湿度孵育30分钟。将板用PBS再次洗涤3次，并且将残余PBS吸干，然后添加最终200 μl PBS。
对象计数和分析-测定第2天：
使用SpectraMax® i3X MiniMax™ 300成像细胞计数仪和相应的SoftMax® Pro采集软件6.5.1版或7.0版读板，高度为14.2 mm，进行离散对象分析，并分类且目标区域关闭。采集设置为波长541，0 µm聚焦，曝光时间为45 ms，具有离散对象参数，最小值5，最大值30和强度125以上。MiniMax能够每孔采集12个位点(3 x 4网格)，其包括整个孔加上孔外区域。采集每孔12个可能的位点中的四个(孔的近似80%)，以减少每个板的读取时间并消除从孔边缘的自发荧光看到的假计数。采集的对象计数原始数据作为文本文件输出，并输入至MS Excel工作簿用于处理。
使用加权的4-参数逻辑回归函数拟合板上的每个测试样品稀释系列。对于每个测试样品稀释系列，将最大值的值(A)约束为对照板上32个病毒对照孔间的中值计数，并将最小值的值(D)约束为对照板上的32个细胞对照孔间的平均响应。对于每个一式两份稀释系列，估计斜率(B)和EC50 (C)的值。最终参数估计值是将加权残差平方和最小化的集合。报告的滴度为VRNT50。这是测试样品的估计稀释度，其提供了响应的50%降低，其中响应范围由最小值和最大值定义。VRNT50是拟合曲线具有计数(A+D)/2的稀释度，并且由C给出。
处理的样品包括阴性质量对照(NQC)(登革热阴性人血清)和内部质量对照(IQC)(登革热阳性人血清)，在对照板上一式两份，并且选择特定板内的每个测试样品用于处理。在VRNT和FRNT测定两者中验证IQC和NQC的阳性和阴性。为每个重复稀释系列确定分开的VRNT50估计值。运行的有效性基于对照板的性能，并根据以下标准进行评价：a)病毒对照(VC)的中值计数与细胞对照(CC)的中值计数的比率必须超过其接受下限10；b) CC的最大计数必须小于对应于截止值的计数；c) VC的最小计数必须大于对应于截止值(VC平均值的50%)的计数；d) 4-参数逻辑回归函数必须已经成功地拟合至NQC和IQC的每个稀释系列；e)NQC的每个重复VRNT50估计值必须低于其接受上限，所述接受上限对应于检测下限或<20；且f) IQC的重复样品VRNT50估计值的比率必须低于其接受上限(2倍)。如果不满足上述任何标准，则运行内的所有板都视为无效，并且必须重新测试该运行内的所有测试样品。根据以下标准评价每个处理样品的有效性：a)每个重复稀释系列必须已使用4-参数逻辑函数成功地拟合；且b)每个稀释系列的重复VRNT50估计值的比率必须低于其接受上限(2倍)。如果不满足以上标准中的任一个，则测试样品结果被认为无效，并且必须在随后的运行中重新测试测试样品。构成处理工作簿的所有单元格(cell)(除了指定的用户输入单元格(cell))、工作表和模块均被锁定并受密码保护，以防止进行未经授权和意外的修改。
VRNT测定开发和优化：
对于DEN2分析，评价八个因素对十五个响应变量的影响。利用的响应变量是：a)细胞对照的对象计数，b)来自曲线拟合的四个参数(即，渐近最大值，希尔斜率，拐点和渐近最小值)各自的值，c)计算的VRNT50值，和d)系列稀释的样品(4G2中和抗体)的每种稀释度的精确度(% CV)的十个估计值，总共15个响应变量。分析每个响应变量以确定哪些因素在对该响应进行建模中是显著的。该模型中仅包括在ANOVA中被认为显著(p<0.05)的主要影响或2FI。另外，利用软件内的Box-Cox诊断函数来确定是否需要原始数据的转换。如所预期，每个响应变量没有被认为显著的相同因素或2FI。采取多重响应优化方法，而不是独立地优化每个响应变量。使用以下约束条件来找到用于测定的总体最佳条件：a) CC的目标范围为0-20个对象计数，b)渐近最大值(VC)的目标范围为300至5000个对象计数，并且c)希尔斜率的目标为1，并且针对十个稀释度%CV中的每一个，确定解决方案以使这些值最小化。同时多重响应优化的结果显示于表1中。验证实验表明，从优化选择的因子水平确实提供了具有期望结果的可重复测定。
对于DEN1分析，评价三个因素对两个响应变量的影响。利用的响应变量是滴定曲线的希尔斜率和VC与CC的信噪(S/N)比。该模型中仅包括在ANOVA中被认为显著(p <0.05)的主要影响或2FI。另外，利用软件内的Box-Cox诊断函数来确定是否需要原始数据的转换。来自分析的结果表明，对于希尔斜率显著的因素之间没有主要影响或相互作用，因此进一步分析仅关注S/N比。仅一个因素是显著的，其中p-值小于0.05，其为感染复数(MOI)。然而，一抗浓度的p-值刚好通过0.05的阈值，且因此包括在S/N比的分析中的模型中。结果表明，MOI的增加导致S/N比的增加(图2)。
由于未在VRNT中确定噬斑或病灶，因此将MOI(pfu/细胞数)替换为被认为最佳且对于VC产生大于500的对象计数的病毒稀释度。随后评估60分钟的一抗和二抗孵育时间的实验表明，该孵育时间可以缩短至30分钟，对VRNT的性能没有明显影响，通过计算的VRNT50滴度没有变化所示。从DEN1和DEN2测定法的开发和优化收集的信息用于开发DEN3和DEN4的VRNT。
经四天的FRNT滴度：
向24孔板中每孔接种100,000个Vero细胞，并在37℃下孵育过夜。用登革热阳性样品在96-孔板中准备中和。将以1:10开始的系列2倍稀释液与100 PFU病毒1:1组合(最终50PFU)。对于所有板准备一种病毒稀释液。将中和板置于板式振荡器上，以300 RPM持续2分钟以进行混合，然后在37℃下放置30分钟以进行中和。将一百微升添加至24-孔细胞板中，并在室温下孵育30分钟，然后将板在37℃下放置1-4天。每天(第1、2、3和4天)将板用-20℃丙酮固定15分钟，然后使其干燥，然后在室温下封闭一小时。一抗(兔抗登革热，定制)以1-2.5µg/ml(病毒依赖性)添加，并在37℃下孵育30分钟。一抗用PBS洗涤三次，然后添加1:500二抗(KPL-4741516)，并在37℃下孵育30分钟。将二抗用PBS洗涤3次，然后添加TrueBlue(KPL-207802)持续5分钟，冲洗并干燥板。
边缘效应：
96孔CellBIND®板以每孔30,000个Vero细胞进行接种。将一个板直接置于37℃；将另一个板在室温下保持15分钟，然后放置在37℃下；将另一个板在室温下保持30分钟，然后放置在37℃下；并将另一个板保持45 min，然后放置在37℃下。将一种登革热阳性供体血清添加至每个板的每个测试样品位置，并在板间2倍系列稀释。将每种血清型的一种稀释病毒制备物用于所有相应的板。如上所述进行中和、感染和染色。DRAQ5 (Fisher-62252)与二抗一起添加，并与病毒感染的对象计数一起计数。
VRNT/FRNT相关性：
在VRNT中测试来自先前在Q2 Solutions Vaccines FRNT中针对DEN1-4测试的21个受试者的81个样品，用于比较。基于其DEN1-4 FRNT滴度选择81个样品，并在基线和接种疫苗(安慰剂或活性疫苗)后时间点间分开。将血清热灭活，然后等分并储存在-80℃直至使用。VRNT如上所述运行。
为了估计测定之间的滴度比的目的，从定量滴度比较排除报告为<10的滴度。使用线性统计关系(LSR)模型估计测定方法之间的函数关系(Tan, C. 等人, Technometrics(1999) 41:(192-201))。在比较两种测定法之间的测量值时，LSR模型(也称为含误差变量模型(errors-in-variables model))是一种回归模型，其识别在所比较的两种测定法中均存在测量误差。相反，标准回归模型考虑测量误差仅在两种测定法之一中存在，并将来自另一种测定法的测量值视为已经准确获得，没有误差。没有考虑两种测定法中的测量误差导致测定法之间的关系的偏倚(即不准确)确定。此外，测定法测量值之间的相关性通过Pearson相关性系数以及Lin的准确性和一致性系数来估计(Lin. L. I. 等人,Biometrics (1989) 45:255-268)。测定方法之间的定性比较基于关于1:10的最小稀释度的倒数的2×2交叉分类表。从2×2交叉分类表中，报告了一致率(双阳性和双阴性样品数相对于样品总数的比例)。还估计Cohen氏κ系数，即超出可归因于偶然一致性的一致率。
讨论
VRNT测定描述：
已经开发了病毒减少中和测试(VRNT)作为PRNT和FRNT的替代方案。VRNT与FRNT的相似之处在于，将血清(样品)进行系列稀释，然后与固定量的野生型病毒组合，然后将该混合物添加至细胞上。像FRNT一样，50%中和滴度基于病毒对照的50%减少进行确定，并使用四参数逻辑(4PL)回归模型进行计算。与FRNT (其在感染后几天对免疫染色的病灶进行计数)不同，VRNT通过在感染后一天使用成像细胞计数仪对单个病毒感染的细胞进行成像来将总测定时间减少至两天(图1)。VRNT使用96-孔形式，其与FRNT相比将每个板的样品(一式两份)增加高达6倍。VRNT相比于PRNT/FRNT提供许多额外优点，诸如，将通量增加高达15倍，快速周转，减少样品体积要求，和自动化实施，包括自动化系列稀释，洗涤板和使用SpectraMax® i3x MiniMax™300细胞计数仪和SoftMax® Pro微孔板数据采集和分析软件以计数病毒感染的细胞，减少手工劳动。
实验设计：
针对DEN1和DEN2病毒，对于VRNT进行实验设计(DOE)。DEN2被选择为VRNT中开发的第一种病毒。设计八因素DOE来鉴定显著因素，以便确定用于后续实验的可接受范围。DOE中研究的因素和水平显示于表1中。
表1. 对于DEN2研究的DOE因素和水平
因素 完整图或子图 水平1 水平2 水平3 水平4
A：板孵育温度 完整图 环境 37℃ N/A N/A
B：一抗孵育时间和温度 完整图 60分钟/ 37℃ 过夜 / 4℃ N/A N/A
C：二抗孵育时间 完整图 30分钟 90分钟 N/A N/A
D：细胞接种密度 子图 1 x 10<sup>4</sup>个细胞 3 x 10<sup>4</sup>个细胞 N/A N/A
E：MOI 子图 0.01 0.1 N/A N/A
F：中和混合物孵育时间和温度 子图 30分钟/ 30℃ 过夜 / 4℃ 60分钟/ 37℃ 60分钟/ 环境
G：一抗浓度 子图 1μg/ml 10μg/ml N/A N/A
H：二抗稀释 子图 1:250 1:1000 N/A N/A
对于该DOE分析15个不同的响应变量。这些包括阴性对照的对象计数，用于4PL回归的参数值(渐近最大值，斜率，EC50和渐近最小值)，VRNT50值以及系列稀释的阳性对照上的十个点各自的精确度估计值。对于分析的每个响应变量，存在可能认为不同因素对特定响应具有显著影响的可能性。这确实如此，因此将努力聚焦于进行数值多响应优化。这将允许折衷以确定提出的用于证实运行的最佳条件，而不使一个响应变量相对于另一个响应变量偏倚。在以下约束条件下进行多响应优化：将阴性对照设置为0-20个对象计数的范围，将渐近最大值约束在300-5000个对象计数的范围内，斜率参数使用目标值1，将渐近最小值设置为0-20个对象计数的范围，并且稀释系列的每个点的精确度是找到最小值。同时多响应数值优化的结果显示于表2中。
表2. DEN2 DOE的最佳条件的概述。
因素 结论
A：中和混合物板孵育温度 环境
B：一抗的孵育时间和温度 在37℃下60分钟
C：二抗孵育时间 70分钟
D：细胞接种密度 3 x 10<sup>4</sup>
E：感染复数(MOI) 0.01
F：中和混合物时间和温度 在37℃下30分钟
G：一抗的浓度 1 µg/mL
H：二抗稀释度 1:1000
证实实验表明，所选因素的水平提供了可重复的测定，具有期望的结果。
对DEN1进行较小的DOE。所研究的因素、水平和保持恒定的因素设置显示于表3中。
表3i和3ii. 对于DEN1研究的DOE因素、水平和恒定因素
<u>3i.DOE因素</u> 水平1 水平2
A：MOI 0.01 0.1
B：一抗浓度 1μg/ml 2.5μg/ml
C：二抗稀释度 1:250 1:1000
Figure 535122DEST_PATH_IMAGE001
对于分析考虑两个响应变量：(1)曲线的斜率，和(2)阳性对照与阴性对照的信噪(S/N)比。来自分析的结果表明，所述因素无一显著影响曲线的斜率，并且将焦点置于S/N比上。Box-Cox诊断表明需要对数据进行自然对数转换，并且ANOVA导致一个因素具有<0.05的显著性p值，即MOI。然而，一个因素 - 一抗浓度，刚刚通过0.05水平的显著性阈值，并保留在模型中。在评估的三个因素中，S/N的分析模型仅包括MOI和一抗浓度(图2)。
两种DOE均表明较高的MOI降低S/N比，并产生接近1的斜率。由于在VRNT中未确定噬斑或病灶，因此MOI (PFU/细胞数)用产生对象计数>500的病毒稀释度替代，因为这被确定为最佳。比较60分钟的一抗和二抗孵育时间与30分钟的优选缩短时间的后续实验显示滴度没有变化并且实施优选的时间。鉴于来自两种DOE和后续实验的信息，滴定DEN3和DEN4以确定产生对象计数>500的工作稀释度，并在证实适用性(包括在DOE中评估的响应：接近1的斜率，渐近最小值<20计数，对象计数>500，高S/N比)之前对一抗浓度进行优化。其他因素(包括孵育时间和温度)保持恒定。
VRNT相比于FRNT：
VRNT平台表明良好精确度。经十个月时段，在DEN2测定中在5个分析者和两个实验室(Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ USA以及Q2 Solutions Vaccines, San JuanCapistrano, CA USA)之间进行的33次运行间测试阳性对照血清样品。33次运行间的VRNT50滴度的总体变异系数(CV)为23%，其中所有33个滴度都落在中值滴度的1.5倍之内。与登革热病毒的其他验证的噬斑减少中和测定相比，该测定精确度水平看起来提高(Roehrig, J.T. 等人 Viral Immunol. (2008) 21:123-132)。
假设对单独病毒感染的细胞进行计数有助于VRNT的精确度。FRNT依赖于手动计数病灶，这经常看起来是重叠的。登革热FRNT测定的感染时间(孵育时间)和病毒输入量(噬斑形成单位：PFU)在血清型和实验室之间变化。由于这些差异，FRNT滴度在实验室之间可显著不同。此外，实验室之间的高度可变的结果对疫苗试验间的中和滴度的解释提出挑战(Salje, H. 等人, PLoS Negl. Trop. Dis. (2014) 8:e2952; Rainwater-Lovett, K.等人, BMC Infect. Dis. (2012) 12:233)。对于FRNT，实验室与实验室间和日与日的变异是众所周知的，然而，病灶形成的差异也可能显著有助于内在变异性。为了评估噬斑大小和病灶的潜在重叠对滴度的影响，使用50 PFU的病毒经连续四天计算DEN1-4的FRNT50滴度。在第一天，通过肉眼没有观察到病灶，然而，放大的图像揭示噬斑，并且到第四天，对于所有四种病毒，在许多孔中，明显的病灶重叠且难以计数(图3A)。减少感染天数减少了每种病毒的病灶大小，并且较小的病灶非常接近出现，表明随着时间推移，这些较小病灶可能融合在一起以形成较大的病灶(图3A)。日间的滴度变化显著(高达30倍)，其中当病灶最小时，滴度最高(图3B)。当与相同血清样品的VRNT滴度相比时，对于所有四种病毒(DEN1-4)，第一天FRNT50滴度在相应VRNT50滴度的1.5倍之内。该实验表明，第一天后，病灶可能由重叠的较小病灶组成，这会有助于内在可变性，因为由于重叠，病灶形成可能变化。相反，VRNT仅测量单独病毒感染的细胞，并且没有重叠或融合病灶的可能性。
DEN1和DEN2的DOE和随后的实验显示，病毒输入量范围可以大(> 16倍)，并且VRNT50滴度保持一致(1.5倍之内)。因此，VRNT与FRNT相比具有的额外优点在于，无需改变测定时间来控制病毒之间的复制差异且无需命中狭窄的靶标(病毒对照病灶计数)。
VRNT/FRNT相关性：
为了评价FRNT和VRNT平台之间的相关性，在VRNT中针对所有四种登革热血清型测试先前在FRNT中针对相同四种登革热血清型进行测试的81个登革热接种疫苗的临床血清样品。结果显示，对于四种登革热血清型中的每一种，两种测定法之间存在明显的正相关性(图4A)。在四种血清型间，拟合的一致性斜率范围在0.74和1.22之间，并且估计的Pearson相关性系数范围在0.80和0.93之间。对于DEN3，VRNT50和FRNT50之间的平均滴度倍数差异与1.0没有统计学显著性差异。对于DEN2，VRNT50滴度比FRNT50滴度平均低1.27倍(95%CI =(1.08，低1.52倍))，而对于DEN1和DEN4，VRNT50滴度与FRNT50滴度相比分别平均高1.82倍(95% CI=(1.43,2.31))和高3.07倍(95%CI=(2.33,4.05))(图4B)。DEN4病毒在FRNT中产生最大的病灶，并且由于病灶重叠，在第1-4天之间的滴度具有8倍差异，这使得测定法可变性更大且准确性更小，这是该病毒的VRNT50和FRNT50之间的3倍差异的可能原因。
VRNT显示比FRNT更大的灵敏度，在VRNT中检测到低中和抗体滴度，相比之下，在FRNT中没有检测到滴度。两种平台(VRNT和FRNT)都将阳性样品定义为NT50 >10，并将阴性样品定义为NT50<10(由最低血清稀释度设定)。在四种血清型间，对于在FRNT中测试阴性(FRNT50<10)的29个接种疫苗的临床样品(每种病毒5-9个样品)，VRNT检测到滴度(VRNT50≥10，范围10-163)。相反，对于在VRNT中阴性的四个接种疫苗的临床样品(DEN1=3，DEN3=1)，FRNT为阳性(FRNT50≥10，范围41-64)。此外，在84个预期的阴性测试结果(在4种登革热类型间测试的6个安慰剂样品和15个基线样品)中，在VRNT中81个(96.4%)测试为阴性。对于在VRNT中测试阳性的三个预期阴性样品中的每一个，VRNT50滴度接近于最小值(10)，并且每个样品的所得阳性都归因于边缘效应。VRNT测定法对该数据集的性能表明，VRNT可以区分真阳性和真阴性临床样品。
消除边缘效应：
为了在VRNT中进行相关性测试，增加每板样品和每批板的数目(每个分析者的最大板数)以模拟临床测试环境。该测试揭示，由于四种登革热病毒(主要来自位于板的顶部和底部的样品)间的复制比率失败(>2倍)，因此复检率高于预期(8-28%)。将测定转移至Q2Solutions Vaccines后，从位于板的顶部和底部的样品再次观察到甚至更大的复制比率失败率。随后用DRAQ5的实验表明，板的周边周围的细胞数相比于板内部存在显著差异(图5)。经确定，该现象在测定开始之前也是明显的，并且发生在细胞接种步骤中。据推测，由于暴露于外部的孔在37℃下的快速加热相比于内部孔的潜在绝缘作用，在板的周边的细胞粘附被抑制。为了克服该效应，将细胞接种并将板保持在室温下，然后置于37℃培养箱中过夜。结果是边缘效应的消除，其中在室温下少至15分钟，然后将板置于37℃培养箱中。为了证实边缘效应的丧失和重复滴度的改进的一致性，将三个板中的每一个用30,000个细胞接种，其中一个板在室温下保持15、30或45分钟，然后在37℃下放置过夜。选择这些时间，因为30分钟被认为是对于分析者而言最佳的时间，并且15/45分钟围绕该优选时间进行门控(图6A-B)。在三个板间评估相同的测试样品。在每种情况下，样品以接近于1.0的复制比率通过，表明边缘效应的消除改进了重复滴度的一致性。该实验中的%CV范围为7-25%，并且每孔30,000个细胞(在室温下保持30分钟)，并且被选择为最佳条件(图6C)。
VRNT计数单独感染的细胞而不是大的重叠病灶(FRNT)，并且不像传统的微中和测定法(其依赖于整个孔强度或报告病毒)(Shan, C. 等人, E. Bio. Medicine (2017) 17:157-162; Song, K. Y., 等人, BMC Microbiol. (2014) 14:44; Yang, H. 等人, J. Biopharm, Stat. (2016) 26:409-420; Maistriau, M. 等人, Virus Res. (2017) 237:1-6; Lin R. 等人, J. Virol. Methods (2017) 247:15-21)，VRNT是快速的(在感染后一天计数病毒感染的细胞)，并使用未改变的野生型病毒。与其他微中和测定法(包括适用于96-孔形式的FRNT，其计数斑点>2天)相比，VRNT提供额外优点：能够在一天内对一个受感染的细胞进行计数，而不是等待重叠病灶形成，这确保准确性，并有助于增加VRNT的精确性和灵敏度。VRNT大大减少劳动和分析时间，消除手动噬斑计数，并显著增加通量。该新型中和平台与FRNT良好相关，并且是用于登革热病毒疫苗候选物的金标准FRNT的替代方案。尽管未在此处呈现，但用来自无关科的病毒进行的实验显示，VRNT是一个通用平台，并且可以被广泛利用。
利用本发明的中和测定法测试的其他病毒：
对VRNT的要求使得任何病毒都可以在该平台中使用，只要其1)感染粘附细胞和2)具有针对病毒蛋白的抗体可用。VRNT已被用于其他病毒，包括呼吸道合胞病毒(毒株A和B)，埃博拉Zaire-GP和Marburg-GP病毒。对于这些病毒，平台方法与上述过程相似之处在于：1)使用粘附细胞并且感染步骤在24小时内发生，并且2)成像细胞计数法用于分析。

Claims (5)

1.测定样品中的中和抗体滴度的病毒中和测定法，其包括：感染步骤：其中感染时间持续不长于约24小时；和成像步骤：其中利用成像细胞计数法对个体细胞进行计数。
2.权利要求1的病毒中和测定法，其包括：A)孵育步骤；B)铺板步骤；C)感染步骤：其中感染时间持续不长于约24小时；D)固定步骤；E)检测步骤；和F)成像步骤：其中利用成像细胞计数法对个体细胞进行计数。
3.权利要求1的病毒中和测定法，其包括：A)孵育步骤：其中孵育包含病毒和样品抗体的混合物，其中一定量的所述样品抗体结合一定量的病毒，使结合的病毒被中和；B)铺板步骤：其中将预定量的混合物添加至板的各个孔中的接种细胞中，其中未结合的病毒自由感染细胞；C)感染步骤：其中感染时间持续不长于约24小时；D)固定步骤；E)检测步骤；和F)成像步骤：其中利用成像细胞计数法和软件对个体细胞进行计数，以测定样品中的中和抗体的量。
4.权利要求1-3的病毒中和测定法，其中所述病毒是登革热病毒。
5.权利要求1-4的病毒中和测定法，其中所述病毒选自DEN1、DEN2、DEN3和DEN4。
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