KR102301130B1 - 뎅기출혈열 진단 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 뎅기 바이러스 혈청형별 재조합 항원을 포함하는 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군 진단 키트, 진단용 조성물 및 이를 이용한 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명의 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군 진단 키트는 높은 특이도와 정확도로 혈청형별 뎅기 바이러스 감염 진단이 가능할 뿐 아니라, 뎅기열과 구별진단하여 조기에 합리적인 치료 방침을 정하는 데에 도움을 줄 수 있다.

Description

뎅기출혈열 진단 키트 {Kit for diagnosing dengue hemorrhagic fever}

본 발명은 뎅기 바이러스 혈청형별 특이 재조합 항원을 포함하는 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군 진단 키트, 진단용 조성물 및 이를 이용한 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군 진단 방법에 관한 것이다.

뎅기열은 뎅기 바이러스 감염에 의해 발병하는 질환으로서, 이집트숲모기(Aedes aegypti), 흰줄숲모기(Aedes albopictus) 또는 도시형 모기인 이집트숲모기(Aedes aegypti)를 매개체로 하여 감염되어 발병된다. 뎅기열의 기본적인 증상은 고열, 심한 두통, 관절통, 백혈구감소증 및 혈소판 감소 등이며, 일반적인 경우 충분한 수분 섭취와 휴식만으로 완치가 가능하다.

그러나, 중증 뎅기열로 알려진 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군은 사망에 이를 수 있는 질환으로서, 상기 질환이 발병된 경우에는 병원에 입원하여 대증치료를 해야하므로, 뎅기 바이러스 감염 의심자에 대한 합리적인 치료 방침을 정하기 위해서는, 뎅기열로 마무리될지 또는 뎅기출혈열(또는 뎅기쇼크증후군)로 진행될지의 여부를 조기에 판단하는 것이 중요하다.

현재까지 개발되어 있는 뎅기 바이러스 감염 진단용 조성물은 뎅기 바이러스에 공통적으로 존재하는 비구조 단백질인 NS1(non structure 1)에 대한 항원을 검출하는 것으로(대한민국 공개특허 제2013-0073304호), 다른 일부 바이러스(일본 뇌염 등)의 NS1에도 반응하여 특이성이 낮고 혈청형을 구분할 수 없었다. 또한, 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군의 진행 여부를 조기에 판단할 수 있는 진단 제품에 대해서는 알려진 바 없었다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 뎅기 바이러스 혈청형별 1차 및 2차 감염 여부를 효과적으로 진단할 수 있는 진단 키트를 개발하고자 예의 노력 연구한 결과, 본 발명의 뎅기 바이러스 혈청형별 재조합 항원은 높은 특이성으로 뎅기 바이러스 혈청형별 1차 및 2차 감염 여부를 판단할 수 있고, 이를 토대로 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군 발병 여부를 예견할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 (a) 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV1 재조합 항원; (b) 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV 2 재조합 항원; (c) 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV 3 재조합 항원; 및 (d) 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV 4 재조합 항원을 포함하는, 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군 진단 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 (a) 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV1 재조합 항원; (b) 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV 2 재조합 항원; (c) 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV 3 재조합 항원; 및 (d) 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV 4 재조합 항원을 포함하는, 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 키트를 이용하여, 개체로부터 분리된 시료에서 항체를 검출하는 단계를 포함하는, 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은, 서열번호 1, 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는, 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV1, DV2, DV3 또는 DV4 재조합 항원을 제공하는 것이다.

본 발명의 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군 진단 키트는 (a) 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV1 재조합 항원; (b) 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV 2 재조합 항원; (c) 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV 3 재조합 항원; 및 (d) 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV 4 재조합 항원을 포함하는 키트로서, 각 혈청형별 1차/2차 감염 여부를 확인할 수 있어, 혈청형별 뎅기 바이러스 감염을 확인할 수 있을 뿐만 아니라, 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군으로 진행하는 지를 진단할 수 있다.

이하에서는, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

한편, 본 발명에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 할 수 없다. 또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 하나의 양태는 (a) 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV1 재조합 항원; (b) 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV 2 재조합 항원; (c) 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV 3 재조합 항원; 및 (d) 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV 4 재조합 항원을 포함하는, 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군 진단 키트를 제공한다.

본 발명의 용어 "뎅기 바이러스(dengue virus)"는 Flaviviridae과의 Flavivirus속에 Dengue virus group에 속한 (+)ssRNA 바이러스로서, 상기 바이러스의 감염으로 인해 뎅기열(Dengue fever), 뎅기출혈열(Dengue hemorrhagic fever; DHF) 또는 뎅기쇼크증후군(Dengue shock syndrome; DSS) 등의 질환이 발병될 수 있다. 뎅기 바이러스는 4가지 혈청형이 존재하며(DV 1 내지 DV 4), 각 혈청형 사이에는 교차면역이 존재하지 않아, 4가지 형태의 뎅기 바이러스 감염이 모두 일어날 수 있다. 또한, 본 발명에서 "뎅기 바이러스 감염"은 뎅기 바이러스에 감염되거나, 감염되어 이상 증상을 나타내는 상태를 의미하여, "뎅기열", "뎅기출혈열" 및 "뎅기쇼크증후군" 등과 혼용되어 사용될 수 있다.

본 발명의 용어 "뎅기열"은, 뎅기 바이러스의 감염에 의해 유발되는 질환으로서, 잠복기는 3 내지 8일로 알려져 있으며, 임상증세는 급성발열, 오한, 두통, 근육통, 관절통, 안구통, 발진, 전신쇠약감, 상기도감염증상, 식욕부진, 구역 또는 구토 등이 있다. 또한, 임상경과 중 코피, 잇몸 출혈, 혈뇨, 월경과다, 위장관 출혈, 객혈, 비장피막하출혈 등 경미한 출혈성 경향이 나타날 수 있으나, 대규모 유행시에도 사망까지는 이르지 않는다.

또한, "뎅기출혈열" 또는 "뎅기쇼크증후군"은 중증 뎅기열로서, 뎅기열의 임상경과 중 심한 복통, 지속되는 구토, 빠른 호흡, 잇몸 출혈, 피로, 중증 쇠약감, 불안 등을 보이며 상태가 악화되는 경과를 취하는 질환으로서, 상기 질환은 혈장유출, 체액저류, 호흡곤란, 심한 출혈, 장기부전 등의 합병증으로 사망에 이르기도 한다.

뎅기 바이러스의 4가지 혈청형 중에서 하나의 혈청형이 1차 감염되면 대개 불현감염으로 나타나나, 현증감염이 되면 뎅기열(dengue fever; DF)로 발병하고 동일 혈청형에 대해서는 평생 방어면역이 형성된다. 그러나, 2차 감염으로 다른 혈청형이 감염되면 심각한 질환인 뎅기출혈열(dengue hemorrhagic fever; DHF) 또는 뎅기쇼크증후군(dengue shock syndrom; DSS)으로 증상이 나타나서 20 %까지 사망하게 된다. 이는, 일차감염에 의한 면역은 다른 형의 2차감염에 대한 방어능이 부족하고, 오히려 1차감염때 생긴 비방어 항체가 이차감염의 뎅기바이러스를 대식세포 속에 들어가는 것과 바이러스-항체가 결합하는 면역복합체를 촉진하여, 면역독성과 염증을 활성화함으로써 출혈 및 혈액부족을 야기하여 DHF나 DSS로 발전하게 한다.

상기 DHF 또는 DSS가 생긴 경우라면, 환자를 입원시켜 상태를 세심하게 살피면서 대응치료를 하여야 한다. 그러나, 이에 대한 신속진단법이 개발되어 있지 않아, 뎅기열로 진단되는바, 조기 진단이 필요한 실정이다. 또한, 대부분의 기존의 진단법은 비특이성이 높고 2차 감염 여부를 파악할 수 없으며, 혈청형별 감염 또한 파악할 수 없다. 즉, 그에 따라 뎅기열과 뎅기출혈열을 구별진단할 수 없어 합리적인 치료방침을 정하기가 어렵다. 따라서, 본 발명에서는 이러한 문제점을 해결하고자 하였으며, 특이성이 높고 정확한 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군 진단이 가능할 수 있다.

본 발명의 용어 "항원(Antigen)"은 면역 반응을 일으켜 특히 항체를 생산하게끔 만드는 물질로서, 일반적으로 생명체내에서 이물질로 간주되는 물질의 총체이다. 항원은 주로 병원균이나 바이러스로서 단백질이지만 다당류, 인공적으로 합성된 물질, 부착소, 자신의 몸속에 생긴 변이세포(암세포) 등의 다양한 것들도 항원이 될 수 있다.

본 발명의 뎅기 바이러스 혈청형별 재조합 항원은 바이러스를 구성하는 다양한 단백질을 포함할 수 있으며, 구체적으로 막(Membrane; M) 단백질, 피막(Envelope; E) 단백질, 비구조(Non Structure; NS) 단백질 등이 포함될 수 있고, 보다 구체적으로 본 발명의 뎅기 바이러스 혈청형별 재조합 항원은 피막 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 다양한 뎅기 바이러스 항원 후보군 중 일본뇌염바이러스, 웨스트 나일 바이러스 및 황열 바이러스와 교차 반응이 일어날 부위를 제외하고 피막 단백질 중 일부 영역을 선정하였고, 이를 토대로 특이성 및 민감성이 우수한 진단 키트용 재조합 항원을 개발하였다(실시예 1-2).

또한, 상기 뎅기 바이러스 재조합 항원은 혈청 알부민(serum albumin) 단백질을 포함할 수 있다. 이에, 상기 재조합 항원은 뎅기 바이러스 혈청형별 특이항원으로서 피막 단백질의 일부 영역 및 인간 혈청 알부민의 일부 영역이 결합되도록 인위적으로 합성된 항원일 수 있다. 피막 단백질의 일부 영역 및 인간 혈청 알부민의 일부 영역은 각각에 직접적으로 연결될 수도 있고, 링커를 통해 연결될 수도 있다.

상기 링커는 융합단백질의 활성을 나타내게 하는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로는 글라이신, 알라닌, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 리신, 아르기닌산 등의 아미노산을 사용하여 연결시킬 수 있고, 더욱 구체적으로는 발린, 루이신, 아스파르트산, 글라이신, 알라닌, 프롤린 등을 여러개 사용하여 연결시킬 수 있으며, 더더욱 구체적으로는 유전자 조작의 용이성을 고려하여 글라이신, 발린, 루이신, 아스파르트산 등의 아미노산을 1개 내지 20개씩 연결하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 뎅기 바이러스 혈청형별 특이항원으로서 피막 단백질의 일부 영역 및 인간 혈청 알부민의 일부 영역이 결합된 재조합 항원의 3차원 구조는 야생형 뎅기 바이러스 항원과 유사하였는 바, 이는 본 발명의 진단 키트의 효과를 향상시킬 수 있다.

상기 재조합 항원은 이에 포함되는 각 도메인의 야생형의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 폴리펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질을 포함할 수 있다.

상기 재조합 항원 또는 상기 재조합 항원을 구성하는 폴리펩타이드는 당해 분야에 공지된 화학적 펩타이드 합성방법으로 제조하거나, 상기 재조합 항원을 코딩하는 유전자를 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝하여 발현시켜서 제조할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 재조합 항원은 화학적으로 합성할 수도 있고 유전자 재조합 방법을 이용하여 미생물 또는 진핵세포에서 제조될 수도 있으나, 그의 제조방법이 반드시 여기에 한정되는 것은 아니다. 상기 유전자 재조합 방법을 이용하기 위한 벡터로는 인간 및 동물에는 감염성이 없으면서 재조합 항원을 발현시킬 수 있는 전이벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 구체적 실시에서, 바큘로바이러스 전이벡터를 사용하였다.

본 발명의 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군 진단 키트에 있어서, (a) 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV 1 재조합 항원은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고; (b) 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV 2 재조합 항원은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고; (c) 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV 3 재조합 항원은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고; (d) 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV 4 재조합 항원은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV 1 내지 DV 4의 재조합 항원은 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 발현되는 것일 수 있다.

본 발명의 용어 "폴리뉴클레오티드"란, 뉴클레오티드가 결합한 고분자 물질로서, 유전 정보를 코딩하고 있는 DNA를 의미한다. 상기 재조합 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 상기 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 용이하게 도출 가능하며, 구체적으로 서열번호 5 내지 8의 염기서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명에서 상기 재조합 항원을 코딩하는 염기 서열은 각 서열번호로 기재한 아미노산을 코딩하는 염기 서열뿐만 아니라, 상기 서열과 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 98% 이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기 서열로서 실질적으로 상기 각 단백질과 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 단백질을 코딩하는 염기 서열이라면 제한 없이 포함한다. 또한 상기 서열과 상동성을 가지는 서열로서 실질적으로 기재된 서열번호의 결합체 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지는 경우도 역시 본 발명의 범주에 포함됨은 자명하다.

본 발명의 용어 "상동성" 이란, 단백질을 코딩하는 염기 서열이나 아미노산 서열의 유사한 정도를 의미하는데, 상동성이 충분히 높은 경우 해당 유전자의 발현 산물은 동일하거나 유사한 활성을 가질 수 있다. 또한, 상동성은 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일차하는 정도에 따라 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건(stringent condition)하에서 썼던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor,New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.

본 발명의 재조합 항원은 상기 각각의 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 한, 기재된 서열번호의 아미노산 서열 또는 상기 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 상동성을 나타내는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

또한, 상기 단백질들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 따라서, 상기 폴리뉴클레오티드는 각 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이면 제한 없이 포함될 수 있다.

또한, 공지의 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화하여, 상기 결합체, 융합 단백질 및 약물의 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 서열이라면 제한 없이 포함될 수 있다.

상기 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성이 높은 유전자끼리, 40% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1XSSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1XSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1XSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.

혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 폴리뉴클레오티드가 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 폴리뉴클레오티드 단편을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.

폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).

본 발명의 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군 진단 키트 는 뎅기 바이러스의 1차 감염 또는 2차 감염 여부를 진단하는 것일 수 있으며, 이는 구체적으로 뎅기 바이러스 특이 IgM 및 IgG를 동시에 검출하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 진단 키트는 뎅기 바이러스 IgM 항체 및 IgG 항체 둘 모두를 검출하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

본 발명의 용어 "IgM" 및 "IgG"는 면역글로불린(Immunoglobulin; Ig)의 하위 그룹에 속하는 물질이다. 면역글로불린은 항체(Antibody)로도 불리우며, 항원과 특이적 결합을 하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질이다. 구체적으로, 면역 체계에서 세균이나 바이러스 같은 외부항원들과 특이적 결합을 하여 항원을 인식하게 하고 동시에 무력화시키는 작용을 하는 면역글로불린은 면역 항체라고 하는데 보통 항체라고 하면 면역 항체를 뜻한다. 상기 면역글로불린은 일반적으로 5가지 종류(IgG, IgA, IgM, IgD, 및 IgE)로 분류된다.

본 발명의 IgM는 면역 반응 시 최초로 만들어지는 항체로서, 다섯 개의 Y가지가 결합된 형태이다. 또한, IgG는 면역 반응을 주로 담당하는 항체로서, 면역 반응이 진행되면서 IgM이 IgG로 바뀌어 생산된다. 상기 IgM은 최초 면역 반응과 관계되어 바이러스의 1차 감염 또는 현재 감염 여부를 확인할 수 있는 지표로 이용될 수 있고, IgG는 2차 감염 또는 과거 감염 여부를 확인할 수 있는 지표로 이용될 수 있다.

본 발명의 진단 키트는 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군의 진행 여부를 예측하는 것일 수 있다.

본 발명의 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, 구체적으로 뎅기 바이러스 감염 진단 여부, 뎅기열이 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군으로 진행할 지 여부를 판단하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 뎅기 바이러스 감염 진단 키트는 (a) 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV1 재조합 항원; (b) 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV 2 재조합 항원; (c) 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV 3 재조합 항원; 및 (d) 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV 4 재조합 항원을 포함하는 것일 수 있다. 상기 뎅기 바이러스 혈청형별 재조합 항원은 뎅기 바이러스 혈청형별 특이 IgG 및 IgM을 검출할 수 있어, 진단 대상이 어떠한 혈청형의 뎅기 바이러스에 1차 감염 또는 2차 감염되었는지 뿐만 아니라 과거 또는 현재에 어떠한 혈청형의 뎅기 바이러스에 감염되었었는지 명확하게 확인할 수 있다.

본 발명의 일 실시양태에 따르면, 본 발명의 뎅기 바이러스 감염 진단 키트는 (a) 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV 1 재조합 항원; (b) 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV 2 재조합 항원; (c) 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV 3 재조합 항원; 및 (d) 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV 4 재조합 항원을 모두 포함하는 것으로서, 뎅기 바이러스의 모든 혈청형에 대해 1차 감염/2차 감염 여부나 과거 또는 현재 감염 여부를 명확히 구분하여 확인할 수 있는 바, 이는 단순히 뎅기 바이러스 감염 진단 및 뎅기열 발병 진단 뿐만 아니라, 중증 뎅기열로서 사망에 이를 수 있는 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군의 진행 여부를 명확히 확인할 수 있다.

또한 본 발명의 일실시예에서는, 환자의 임상 검체 테스트를 통하여 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군으로 진단받은 환자의 검체가 2개 이상의 혈청형에 대한 항체 검출이 나타남을 확인하였는바(도 14), 이를 통하여 본 발명의 진단 키트가 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군을 정확하게 진단할 수 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 진단 키트는 뎅기 바이러스 혈청형 중 둘 이상의 혈청형에 대한 항체가 검출될 경우 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군으로 진단하는 것일 수 있다.

본 발명의 뎅기 바이러스 감염 진단 키트는 (a) 시료가 흡수되는 샘플패드(sample pad); (b) 시료 내의 인간의 항체와 결합하는 금 결합 패드(gold conjugation pad); (c) 뎅기 바이러스 재조합 항원을 포함하는 반응선(test line)과 대조군 단백질을 포함하는 대조선(control line)이 처리되어 있는 나이트로셀룰로오스 멤브레인 (nitrocellulose membrane; NC membrane; membrane); 및 (d) 잔량의 시료가 흡수되는 흡수패드(absorption pad)를 포함하는 테스트 스트립을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 뎅기 바이러스 감염 진단 키트는 샘플패드, 금 결합 패드, 멤브레인 및 흡수패드를 포함하는 테스트 스트립을 포함하고 있다. 샘플패드는 금 결합 패드 위에 겹쳐져 있어 제1 중첩 부분을 형성하고, 금 결합 패드는 멤브레인 위에 겹쳐져 있어 제2 중첩 부분을 형성한다. 또한 멤브레인과 흡수패드는 제3 중첩 부분을 형성한다. 시료가 샘플패드 상에 점적되면 모세관 현상에 의하여 시료는 금 결합 패드, 예를 들어 골드-라벨된 염소 항 인간 IgM 항체(goldlabeled goat anti-human IgM antibody) 또는 골드-라벨된 염소 항 인간 IgG 항체(goldlabeled goat anti-human IgG antibody) 등을 포함하고 있는 금 결합 패드를 통과하게 된다. 골드-라벨을 형성하는 금 입자는 바람직하게 20 내지 55nm의 지름 크기, 보다 바람직하게는 20 내지 40nm의 지름 크기를 가지며, 염색 지시자(indicator dye)로서 작용한다. 상기 금 결합 패드를 통과함에 따라, 시료 내의 항체는 골드-라벨된 염소 항 인간 IgM 항체(goldlabeled goat anti-human IgM antibody) 등과 결합하여 복합체를 형성하고, 상기 복합체는 멤브레인을 따라 이동한다.

본 발명의 용어 "시료"란, 뎅기 바이러스 감염, 뎅기열, 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군이 발병되거나 발병될 가능성이 있는 개체로부터 유래한 물질을 의미하며, 구체적으로 혈청, 혈장, 혈액일 수 있으나, 개체의 IgM 및 IgG를 확보할 수 있고 그로부터 뎅기 바이러스 특이 IgM 및 IgG 발현 여부를 확인할 수 있는 한, 그 종류는 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 시료는 본 발명의 진단 키트의 샘플 패드에 점적하기 전에 희석하여 사용하거나 또는 희석하지 않고 사용할 수 있다. 시료에 혈청형별 뎅기 바이러스 특이 항체가 있는 경우에는 본 발명의 상기 진단 키트 내 혈청형별 뎅기 바이러스에서 유래된 피막 단백질 항원과 결합하여 육안으로 식별할 수 있도록 멤브레인 위의 반응선에서 색 변화가 일어난다. 그러나 시료에 혈청형별 뎅기 바이러스 특이 항체가 없는 경우에는 본 발명의 상기 항원과 결합하지 않아 멤브레인 위의 반응선에서 아무런 변화가 일어나지 않는다. 즉, 본 발명의 바람직한 실시예에서는, 뎅기 바이러스 특이 항체는 멤브레인 위의 반응선에 고정되어 있는 혈청형별 뎅기 바이러스로부터 유래된 피막 단백질 항원에 결합한다. 이 항원-항체 복합체의 형성으로 시료의 항체와 골드 라벨(염소 항 인간 IgM 등)과 멤브레인 상의 항원이 복합체를 형성하여 붉은 보라색 밴드를 나타내고 이에 따라 시료 내에 혈청형별 뎅기 바이러스에 대한 항체가 존재하는 양성 반응을 나타내게 된다.

멤브레인은 규격화된 크기(10X500nm)의 니트로셀룰로오스막(Milipore^TM XA3J072100) 등의 적합한 물질을 포함할 수 있다. 멤브레인은 상기 반응선 및 대조선이 순서대로 배열되는 것이 바람직하며, 이들 반응선 및 대조선은 2.0 내지 4.5mm의 간격, 바람직하게는 2.5 내지 3.0mm로 배열될 수 있다.

뎅기 바이러스 감염에 대한 양성 반응 결과는 대조선 외에 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열을 가지는 재조합 항원 단백질을 포함하고 있는 반응선이 발색하는 경우이다.

상기 대조선은 진단 키트의 이상 유무를 확인하기 위한 것이다. 뎅기 바이러스 감염에 대한 음성 반응 결과는 대조선만이 발색하는 경우이다. 상기 대조선은 골드-라벨과 결합하는 대조군 단백질을 포함하고 있는데, 이는 예를 들어 토끼 항-염소 IgG 다클론 항체, 염소 항-인간 IgG 다클론 항체, 토끼 항-인간 IgM 다클론 항체 또는 염소 항-인간 IgM 다클론 항체 등을 포함할 수 있으며, 이들 대조군 단백질을 0.1mg/ml 내지 2.0mg/ml의 농도로 포함할 수 있다. 상기 반응선은 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열을 가지는 뎅기 바이러스 혈청형별 재조합 항원을 포함하고 있으며, 이들 항원 단백질은 0.5 내지 2.0mg/ml의 농도로 반응선에 포함된다.

금 결합 패드는 적합한 마커, 예를 들어 마커로서 건조된 콜로이드성 골드-라벨된 프로틴 A(gold labeled portein A), 골드-라벨된 항-인간 IgG 항체(glodlabeled anti-human IgG antibody) 또는 골드-라벨된 항-인간 IgM 항체(goldlabeled anti-human IgM antibody) 등을 포함할 수 있으며, 바람직하게 샘플패드에 인접하여 위치할 수 있다. 상기 골드 라벨된 마커가 금 결합 패드에 과량으로 포함될 경우에는 분석하고자 하는 뎅기 바이러스에 대한 항체가 비교적 낮은 영역에서도 비특정신호로 증가됨으로써 위양성 결과를 초래할 수 있으므로, 본 발명에서는 골드-콜로이드 원액을 희석하여 흡광도(optical density; OD)가 1 내지 6, 바람직하게는 흡광도가 2 내지 4의 농도로 포함할 수 있다. 흡수패드는 막의 반대편 말단에 위치하며 모세관 현상에 의해 막을 따라 이동한 생물학적 시료, 예를 들면 혈청, 혈장 등을 흡수한다.

하나의 구체적 실시에서, 진단 시간은 약 5 내지 10분으로서, 15분 이내이다. 진단 결과는 환자의 뎅기 바이러스 감염 상태를 진단하거나, 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군으로의 진행 여부를 판단하는데 사용할 수 있다.

예를 들어, 만일 뎅기 바이러스 감염 환자로부터 수집된 시료라면, 본 발명의 진단 키트는 감염을 유발한 특정 혈청형 부분에서 양성 반응을 나타내어 어떠한 혈청형의 뎅기 바이러스에 감염되었는 지 진단할 수 있으며, 둘 이상의 혈청형별 항체가 검출될 경우 상기 환자는 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군으로 진행될 것으로 진단할 있다. 만일 뎅기 바이러스에 감염되지 않은 환자로부터 수집된 시료인 경우 본 발명의 진단 키트는 음성 반응을 나타내어 감염되지 않은 것으로 진단할 수 있다.

본 발명의 진단 키트는 교차반응을 제거하기 위한, 일본 뇌염 바이러스 항원, 황열 바이러스 항원 및 웨스트 나일 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항원을 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로는 일본 뇌염, 황열, 웨스트나일 바이러스를 키메릭으로 항원 제조하여 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 (a) 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV1 재조합 항원; (b) 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV 2 재조합 항원; (c) 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV 3 재조합 항원; 및 (d) 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV 4 재조합 항원을 포함하는, 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군 진단용 조성물을 제공한다.

여기서, 용어 "뎅기 바이러스", "뎅기출혈열", "뎅기쇼크증후군", "재조합 항원" 및 "진단"의 정의는 전술한 바와 같다.

구체적으로, 뎅기 바이러스 감염 진단용 조성물은 (a) 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV 1 재조합 항원은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고; (b) 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV 2 재조합 항원은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고; (c) 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV 3 재조합 항원은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고; (d) 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV 4 재조합 항원은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군의 진행 여부를 예측할 수 있다.

또한, 뎅기 바이러스 혈청형 중 둘 이상의 혈청형에 대한 항체가 검출될 경우 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군으로 진단하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 본 발명의 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군 진단 키트를 이용하여, 개체로부터 분리된 시료에서 항체를 검출하는 단계를 포함하는, 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

여기서, 용어 "뎅기출혈열", "뎅기쇼크증후군" 및 "진단"의 정의는 전술한 바와 같다.

본 발명의 용어 "개체"는, 뎅기 바이러스 감염, 뎅기열, 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군이 발병되거나 발병될 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

또한, 상기 정보제공 방법에서 항체를 검출하는 단계는 뎅기 바이러스 특이 IgM 및 IgG를 동시에 검출하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 뎅기 바이러스 감염이 의심되거나 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군 발병이 의심되는 환자로부터 시료, 예를 들어 혈청을 채취하고, 이 채취된 시료를 상기 진단 키트의 시료가 흡수되는 부위인 샘플패드(sample pad)에 점적하면, 시료는 모세관 현상에 의해 금 결합 패드(gold conjugation pad)에 도달하여 시료 내의 항체가 금 결합 패드 내의 마커, 예를 들어 골드-라벨된 프로틴 A(gold-labeled protein A), 골드-라벨된 항 인간 IgG 항체(gold-labeled anti-human IgG antibody) 및 골드-라벨된 항인간 IgM 항체(gold-labeled anti-human IgM antibody) 등에 결합하여 콜로이드를 형성하게 된다. 이때, 검체하고자 하는 시료는 상기 금 결합 패드에 고정화되지 않고 계속 이동하여 혈청형별 뎅기 바이러스 유래 피막 단백질을 포함하는 재조합 항원이 고정화되어 있는 반응선(test line)에 도달하게 된다. 뎅기 바이러스 감염 환자의 시료인 경우에는 상기 혈청형별 재조합 항원과 항원-항체 반응을 일으키게 되는데, 즉 환자의 금 결합 패드 내의 특정 마커에 결합된 항체는 반응선에 고정된 뎅기 바이러스 혈청형별 재조합 항원에 결합하여 붉은 보라색 밴드를 형성함으로써 육안으로 관찰할 수 있게 된다. 그리고, 시료 내 항체와 반응하지 않은 나머지 금 결합 패드 내의 마커는 대조선에 도달하여 대조군 단백질과 반응하여 붉은 보라색 밴드를 형성함으로써 검사의 적합성을 나타내게 된다.

이와 같은 방법에 의하여 뎅기 바이러스의 혈청형별 특이 IgG 또는 IgM 항체를 검출하여, 어떠한 혈청형의 뎅기 바이러스에 1차 감염 또는 2차 감염되었는지 뿐만 아니라 과거 또는 현재에 어떠한 혈청형의 뎅기 바이러스에 감염되었었는지 명확하게 확인할 수 있다.

또한, 본 발명의 정보제공 방법은 뎅기 바이러스 혈청형 중 둘 이상의 혈청형에 대한 항체가 검출될 경우 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군으로 진단할 수 있으며, 이뿐만 아니라, 혈청형별 뎅기 바이러스의 감염 상태를 확인함으로서, 추후 다양한 질환의 발병 여부를 판단할 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV1 재조합 항원을 제공하고, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는, 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV2 재조합 항원을 제공하고, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는, 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV3 재조합 항원을 제공하고, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는, 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV4 재조합 항원을 제공한다.

상기 각각의 뎅기 바이러스 혈청형별 재조합 항원의 서열은 본 발명에서 최초로 규명한 것으로서, 이에 대해서는 전술한 바와 같다.

본 발명의 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군 진단 키트는 높은 특이도와 정확도로 혈청형별 뎅기 바이러스 감염 진단이 가능할 뿐 아니라, 뎅기열과 구별진단하여 조기에 합리적인 치료 방침을 정하는 데에 도움을 줄 수 있다.

도 1은 뎅기 바이러스 혈청형별 유전자 map 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 뎅기 바이러스의 면역반응 유도 활성화 부위를 나타낸 도면이다.
도 3은 뎅기 바이러스와 교차반응을 일으킬 수 있는 플라비바이러스 속 유전자 map 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 뎅기 바이러스 피막 단백질에서의 항원 부위를 3차원 분석한 결과이다.
도 5는 곤충세포-기반 발현 시스템을 위한 뎅기 바이러스 혈청형별 재조합 항원 클로닝 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 바큘로바이러스 유전자에 뎅기 바이러스 혈청형별 재조합 항원이 전이된 결과를 PCR 실험을 통해 확인한 결과이다.
도 7은 재조합 바큘로바이러스에 뎅기바이러스 혈청형별 재조합 항원 유전자가 삽입되었는지 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 SDS-PAGE 실험을 통해 뎅기바이러스 혈청형 DV 1 재조합 항원의 발현 여부를 확인한 도면이다.
도 9는 뎅기 바이러스 혈청형 DV1 재조합 항원의 3차원적 구조 및 특이항원 부위를 나타낸 도면이다.
도 10은 뎅기 바이러스 혈청형 DV2 재조합 항원의 3차원적 구조 및 특이항원 부위를 나타낸 도면이다.
도 11은 뎅기 바이러스 혈청형 DV3 재조합 항원의 3차원적 구조 및 특이항원 부위를 나타낸 도면이다.
도 12는 뎅기 바이러스 혈청형 DV4 재조합 항원의 3차원적 구조 및 특이항원 부위를 나타낸 도면이다.
도 13은 혈청형별 재조합 항원의 항원성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 14는 환자의 임상 검체 테스트를 한 결과를 나타낸 도면이다.

이하, 아래 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 아래 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 뎅기출혈열 진단키트 개발을 위한 뎅기 바이러스 혈청형별 특이 항원 개발

1-1: 뎅기 바이러스 혈청형별 항원 후보 선정

뎅기 바이러스 혈청형별 특이항원을 개발하기 위해, 하기와 같은 실험을 통해 뎅기 바이러스에 감염된 후 체내의 면역반응을 유도할 수 있는 활성화 부위를 확인하였다.

구체적으로, 4종류의 뎅기 바이러스 혈청형(DV 1 내지 4)의 유전자를 Vector NTI를 이용하여 유전자 map을 작성하여 분석하였고(도 1), 상기 분석한 결과를 토대로 뎅기 바이러스에서의 면역반응 주요 표적 위치를 확인하여 혈청형별 항원 후보로 선정하였다.

그 결과, 뎅기 바이러스 감염시 체내의 면역반응에서 항원으로 작용하여 항-뎅기 바이러스 항체를 유도할 수 있는 단백질은 M (membrane) 단백질, E (envelope) 단백질 또는 NS1 (non structure) 단백질인 것을 확인하였다(도 2).

1-2: 뎅기 바이러스 항원부위 선정

뎅기 바이러스는 플라비바이러스 속에 속하는 일본뇌염바이러스(Japanese encephalitis virus), 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus) 또는 황열 바이러스(Yellow Fever virus)와 교차반응을 일으킬 수 있고, 이로 인해 뎅기출혈열 진단 키트의 특이성 및 민감성을 저해시킬 수 있는 바, 뎅기 바이러스 항원부위 선정 시 교차반응 부위를 피하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 뎅기 바이러스 혈청형 DV 1 내지 4와 교차반응을 일으킬 수 있는 플라비바이러스 속(Japanese encephalitis virus, West Nile virus, Yellow Fever virus) 유전자를 분석하였고(도 3), 뎅기 바이러스 혈청형 DV 1 내지 4과 일본뇌염바이러스, 웨스트 나일 바이러스 및 황열 바이러스의 M 단백질, E 단백질 및 NS1 단백질의 아미노산을 나열시켜 교차반응이 일어날 부위를 확인하였다.

그 결과, M 단백질 및 NS1 단백질 부위에서 교차반응이 일어날 수 있음을 확인하여, 최종 항원부위 선정시 제외하였고, E 단백질에서도 교차반응이 예상되는 부위를 제외하여, 최종적으로 혈청형별 특이항원 부위를 선정하였다.

1-3: 선정된 특이항원부위의 3차원 단백질 구조 분석 및 재조합 항원 설계

뎅기 바이러스 혈청형별 특이항원 부위를 포함하는 재조합 항원을 설계하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 상기 실시예 1-2에서 선정된 뎅기 바이러스 혈청형별 특이항원 부위를 토대로 3차원 단백질 구조 분석을 수행한 결과, 피막 단백질의 3차원 구조에서의 특이항원 위치를 확인하였다(도 4).

또한, 뎅기 바이러스 혈청형별 특이항원 부위를 포함하는 재조합 항원의 3차원 구조를 유지하기 위해, 특이항원 부위를 연결할 링커 서열을 선정하기 위해 다양하게 탐색한 결과, 3차원 구조, 비특이적인 결합 특성, 호르몬, 대사산물, 및 약제의 결합 등을 고려하였을 때 인간 혈청 알부민(HSA)의 IIB 영역 일부가 링커로 적합한 것을 확인하였다.

다음으로, 실시예 1-2에서 선정된 뎅기 바이러스 혈청형별 특이항원 부위 및 인간 혈청 알부민의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 항원을 설계하였고, 이를 기초로 뎅기 바이러스 혈청형별 재조합 항원을 개발하였다.

또한, 개발된 뎅기 바이러스 혈청형별 재조합 항원 중 뎅기 바이러스 DV 1 재조합 항원과 야생형 뎅기 바이러스 DV 1 피막 단백질의 3차원 구조를 비교한 결과, 재조합 항원에서 특이항원 부위가 바깥쪽으로 노출되어 있으며, 3차원 구조가 야생형과 유사함을 확인하였다.

실시예 2: 뎅기 바이러스 혈청형별 재조합 항원의 발현 시스템 구축

2-1: 발현 시스템의 숙주세포 선정

실시예 1에서 개발한 뎅기 바이러스 혈청형별 재조합 항원을 효율적으로 제조하기 위한 발현 시스템을 구축하기 위해 먼저 숙주세포를 선정하였다.

구체적으로, 숙주세포의 단백질 발현 속도 및 비용적인 측면을 고려하였을 경우에는 박테리아 세포를 이용한 발현 시스템이 효율적이지만, 전사 후 변형 과정을 고려할 경우에는 곤충 세포(insect cell)나 포유류 세포(mammalian cell)가 효율적인 것을 확인하였다. 또한, 곤충 세포의 경우 단백질 발현 속도 및 비용적인 측면에서 포유류 세포보다 효율적이며, 일반적으로 곤충 세포는 기능성 분석(functional assays), 항원 제조, 구조 분석, 바이러스 제조 등에 널리 이용되고 있는 바, 본 발명의 뎅기 바이러스 혈청형별 재조합 항원 발현에 탁월하다고 판단하여, 곤충세포 발현시스템을 구축하였다.

2-2: 곤충세포 발현시스템에 적합한 뎅기 바이러스 혈청형별 재조합 항원 유전자 클로닝

상기 실시예 1에서 선정된 뎅기 바이러스 혈청형별 재조합 항원 유전자를 곤충세포-기반 발현 시스템에 맞게 설계하여 클로닝 하였다.

구체적으로, 전이 플라스미드(donor plasmid)로서 pFastBac HT를 선정하였고, 상기 전이 플라스미드에 맞게 제한효소인식부위(EcoR I 및 Pst I)를 추가하여 뎅기 바이러스 혈청형별 재조합 항원 유전자를 설계하였다. 다음으로, 상기 재조합 항원 유전자와 전이 플라스미드를 EcoR I 및 Pst I 제한효소로 절단하고, 연결시켜 재조합 플라스미드를 제조하였다. 상기 재조합 플라스미드 Competent cell (JM109)에 형질전환 시킨 후, 상기 세포를 플라스미드 소량 추출(mini prep.) 하여 뎅기 바이러스 혈청형별 재조합 항원 유전자가 플라스미드에 적절히 삽입되었는지 확인하였다.

그 결과, 각 DV 1 내지 4의 뎅기 바이러스 혈청형별 재조합 항원 유전자가 전이 플라스미드에 안정적으로 삽입된 것을 확인하였다(도 5).

2-3: 바큘로바이러스 ( Baculovirus ) 유전자에 뎅기 바이러스 혈청형별 재조합 항원 유전자 전이

곤충 세포-기반 발현 시스템과 관련된 바큘로바이러스(Baculovirus) 유전자에 뎅기 바이러스 혈청형별 재조합 항원 유전자를 전이시키기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 뎅기 바이러스 혈청형별 재조합 항원 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드를 E. coli DH10Bac(바큘로바이러스 유전자를 가지고 있음; Bacmid DNA)에 형질전환 시켰다. 그 후, 상기 E. coli DH10Bac의 유전자를 추출하여 PCR을 통해 Bacmid DNA에 뎅기 바이러스 혈청형별 재조합 항원 유전자가 전이되었는지 확인하였다.

그 결과, E. coli DH10Bac 내의 helper 플라스미드에 의해 상기 재조합 벡터에 삽입된 뎅기 바이러스 혈청형별 재조합 항원 유전자가 Bacmid DNA로 전이된 것을 확인하였다(도 6).

2-4: 곤충세포에서 뎅기 바이러스 혈청형별 재조합 항원 발현 확인

곤충 세포-기반 발현 시스템에서 뎅기 바이러스 혈청형별 재조합 항원이 발현되는지 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 상기 실시예 2-3에서 제조된 재조합 Bacmid DNA를 곤충세포 (Sf21 세포)에 트랜스펙션(transfection)시키고, 이로부터 제조된 뎅기 바이러스 혈청형별 특이항원 유전자를 포함하는 재조합 바큘로바이러스를 회수 및 정제한 후, PCR을 통해 뎅기 바이러스 혈청형별 재조합 항원 유전자가 재조합 바큘로바이러스에 포함되어 있는 지 확인하였다. 그 결과, 상기 재조합 바이러스에 뎅기 바이러스 혈청형별 재조합 항원 유전자가 포함되어 있는 것을 확인하였다(도 7).

다음으로, 상기에서 제조한 재조합 바큘로바이러스 증폭시켜 stock을 제조하였고, 이를 곤충세포(Sf21 세포)에 감염시켰다. 3일 동안 배양한 후 세포를 회수하여, Ag preparation 및 Ag purification을 통해 뎅기 바이러스 혈청형별 재조합 항원을 수득하였다. 또한, SDS-PAGE를 이용하여 뎅기 바이러스 혈청형별 재조합 항원 중 대표적으로 뎅기 바이러스 DV 1 재조합 항원이 안정적으로 수득되었음을 확인하였다(도 8).

실시예 3: 뎅기출혈열 진단키트 제조를 위한 뎅기 바이러스 혈청형별 항원 균주 배양

상기 실시예들을 통하여 뎅기출혈열 진단키트 제조를 위한 뎅기 바이러스 혈청형별 재조합 항원을 확인하였는바, 이를 생산하기 위한 균주 배양 공정을 구축하고자 하였다. 구체적으로, 뎅기 바이러스 혈청형별 (DV1, DV2, DV3, DV4) 4가지 항원 및 pre-line 용 항원의 효율적인 생산을 위한 균주 배양 방법을 확인하고자 하였다.

3-1: Seed Culture

62.5 mL LB broth를 준비하고 항생제(Ampicillin; 50 ug/mL)를 처리하였다. -80℃ deep freezer에 보관된 stock을 확보하여 1/1000 부피로 접종하였다. 이후 37℃, 220 rpm으로 16시간 seed culture를 진행하였다.

3-2: Mass Culture

500 mL LB broth 4개를 준비하고 항생제(Ampicillin; 50 ug/mL)를 처리하였다. 16시간 seed culture가 완료된 배양액을 각 LB broth에 1/100 부피로 접종하였다. 이후 37℃, 180 rpm으로 2시간 배양 후 배양액의 OD(600 nm)를 측정하였고, OD(600 nm)값이 0.5~0.6사이인 경우 IPTG를 final 농도 0.5 mM이 되도록 처리하였다. IPTG 접종 후 3시간 동안 위와 동일한 조건으로 배양하였다.

3-3: Harvest & washing

배양 종료 후 250 mL size centrifugal bottle 2개에 500 mL 배양액을 소분하였다. 4℃, 6,000 rpm으로 세팅된 원심분리기를 이용하여 20분간 원심분리를 진행하였고, 1X PBS(pH 7.4) 25 mL로 pellet resuspension 후, 50 mL conical tube로 이동시켰다. 다음으로, 4℃, 3,000 rpm으로 세팅된 원심분리기를 이용하여 30분간 원심분리를 진행하고, Sup 폐기 후 labeling을 진행한 뒤 pellet을 확보하였다.

3-4: Storage

항원의 장기 보존을 위하여 -80℃ deep freezer에서 pellet을 보관하였다.

그 결과, 여러 종류의 항원을 동일한 방법으로 확보하는 공정을 구축하여 생산성을 향상시켰고, 하기 정제에 따라 IPTG induction 후 항원의 발현량이 급격히 상승하는 것을 확인하였다. 즉, 뎅기출혈열 진단키트 생산을 위한 항원 확보를 위한 균주 배양 공정 구축을 완료하였다.

실시예 4: 뎅기출혈열 진단키트 제조를 위한 뎅기 바이러스 혈청형별 항원 정제

상기 제조한 뎅기출혈열 진단키트 제조를 위한 뎅기 바이러스 혈청형별 항원을 정제하기 위한 공정을 구축하였다.

4-1: 항원 preparation

- 80℃ deep freezer에서 보관되던 pellet을 binding buffer를 이용하여 resuspension 하였다. 이후 Sonication을 이용하여 세포 파쇄하고, 4℃, 14,000 rpm으로 세팅된 원심분리기를 이용하여 15분간 원심분리를 진행하였다. Sup을 회수하여 0.45 um syringe filter를 이용하여 filtration 진행하였다.

4-2: 정제

His-resin column을 준비하고, Binding buffer를 이용하여 equilibration 후, sample을 apply하였다. Washing buffer를 이용하여 washing을 진행하며, bradford assay를 이용하여 washing의 진행여부를 확인하였다. Elution buffer를 이용하여 elution을 진행하며, bradford assay를 이용하여 elution fraction을 확인하였다. 정제 완료된 후 strip buffer, DW, NaOH 순서로 column regeneration을 진행하였다.

4-3: Dialysis

Sodium phosphate buffer을 5L X 3개(1종류의 항원 당) 준비하였다. Dialysis cassettes를 준비하고 swelling 진행하였다. Syringe를 이용하여 dialysis cassettes에 항원을 주입하였다. Dialysis는 냉장고 내에서 진행하며, 1시간-O/N(16h)-1시간 순서에 따라 buffer change를 진행하였다.

4-4: 정량 및 농축, preservative 처리

투석이 완료된 항원을 회수하고, BCA kit를 이용하여 항원의 농도를 확인하였다. 기준 농도에 미달될 경우 10K MWCO size centrifugal filter를 이용하여 농축을 진행하였고, 농축 진행 후 다시 BCA kit를 이용하여 정량을 진행하여 확인 후 Sodium azide(final 0.02 %)를 처리하였다.

4-5: SDS-PAGE를 이용한 항원 분석

Preservative 처리까지 완료된 항원 5ug을 SDS-PAGE를 이용하여 분석하였다.

실시예 5: 뎅기출혈열 진단키트 제조를 위한 뎅기 바이러스 혈청형별 항원의 항원성 확인

상기 실시예들을 통해서 제조한 뎅기출혈열 진단키트 제조를 위한 뎅기 바이러스 혈청형별 재조합 항원의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다.

뎅기 바이러스 혈청형 DV1 재조합 항원	QHQVGNETTEHGTIATITPQAPTSEIQLTDYGALTLDCSPTSGTTKSFKLEKEVAETTVLVQVKYEGTDAPCKIPFSTQDEKGVTQNDKEKPVNIGAGEKALKLS	서열번호 1
	CAGCACCAGGTGGGAAATGAGACCACAGAACATGGAACAATTGCAACCATAACACCTCAAGCTCCTACGTCGGAAATACAGCTGACCGACTACGGAGCTCTTACATTGGATTGCTCACCCACGTCTGGAACGACAAAATCATTCAAGTTAGAGAAAGAAGTGGCTGAGACCACTGTTCTAGTGCAGGTTAAATACGAAGGAACAGATGCACCATGCAAGATCCCCTTTTCGACCCAAGATGAGAAAGGAGTAACCCAGAATGACAAAGAAAAACCAGTCAACATTGGAGCAGGTGAAAAAGCTTTGAAATTAAGC	서열번호 5
뎅기 바이러스 혈청형 DV2 재조합 항원	EHAVGNDTGKHGKEIKITPQSSITEAELTGYGTVTMECSPMSSGNLKFKVVKEIAETTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEKRHVLEKDSPVNIGVEPGQLKLN	서열번호 2
	GAGCATGCAGTCGGAAATGACACAGGAAAACATGGCAAGGAAATCAAAATAACACCACAGAGTTCCATCACAGAAGCAGAGTTGACAGGCTATGGCACTGTCACGATGGAGTGCTCTCCGATGTCATCAGGAAACTTAAAGTTTAAAGTTGTGAAGGAAATAGCAGAAACAACAATAGTTATCAGAGTACAATATGAAGGGGACGGTTCTCCATGTAAGATCCCTTTTGAGATAATGGATTTGGAAAAAAGACATGTTTTAGAAAAAGATAGCCCAGTCAACATAGGAGTAGAGCCGGGACAATTGAAGCTCAAC	서열번호 6
뎅기 바이러스 혈청형 DV3 재조합 항원	QHQVGNETQGVTAEITSQASTAEAILPEYGTLGLECSPTSGGTSTFVLKKEVSETTILIKVEYKGEDAPCKIPFSTEDGQGKAHNKKEEPVNIGIGDKALKIN	서열번호 3
	CAACACCAGGTGGGAAATGAAACGCAGGGAGTTACGGCTGAGATAACATCCCAGGCATCAACCGCTGAAGCCATTTTACCTGAATATGGAACCCTCGGGCTAGAATGCTCACCAACCTCAGGAGGCACAAGTACCTTTGTGTTGAAGAAAGAAGTCTCCGAAACGACAATACTCATTAAGGTTGAGTACAAAGGGGAAGATGCACCCTGCAAGATTCCTTTCTCCACGGAGGATGGACAAGGGAAAGCTCACAATAAGAAGGAGGAGCCTGTCAACATTGGAATTGGAGACAAAGCCCTGAAAATCAAC	서열번호 7
뎅기 바이러스 혈청형 DV4 재조합 항원	THAVGNDIPNHGVTATITPRSPSVEVKLPDYGELTLDCEPSGDGNHKFSIDKEMAETTTVVKVKYEGAGAPCKVPIEIRDVNKEKVVYTNSVTNIGVGDSALTLH	서열번호 4
	ACCCATGCAGTAGGAAATGACATACCCAACCATGGAGTGACAGCCACGATAACCCCCAGGTCACCATCGGTAGAAGTTAAATTACCGGATTATGGAGAATTAACACTCGATTGTGAACCCTCCGGTGATGGAAACCACAAGTTCTCAATTGACAAAGAGATGGCAGAAACAACAACAGTGGTAAAAGTCAAGTATGAGGGTGCTGGAGCTCCATGTAAAGTTCCCATAGAGATAAGAGATGTGAACAAGGAAAAAGTGGTATATACCAACAGTGTAACCAACATAGGTGTTGGAGACAGTGCATTAACACTCCAT	서열번호 8

또한, Bio tool인 'PyMOL'을 이용하여 혈청형별 특이항원의 3차 구조를 분석한 결과, 도 9 내지 12와 같이 각각의 3차원적 구조와 특이항원 부위 (노란색으로 표시) 를 확인할 수 있었다.

상기 재조합 항원 각각의 항원성을 먼저 확인하고자 하였다. 구체적으로는, 스트립 상 dispensing 규격을 설정하고 규격이 맞게 생산된 혈청형별 특이항원을 dispensing 하여 kit 상에서 항원성을 확인하였다.

스트립 상에서 6 line(Control, DV1, DV2, DV3, DV4, pre-line)에 대해 검사창에 동등한 간격으로 5 line 보이게 하고 pre-line은 검사창에 안 보이게 규격을 정했다. 이후, 실제 dispensing이 가능한지 control capture Ab로 6 line dispensing 진행한 후 colloidal gold conjugated Ab로 테스트를 진행하였다.

다음으로, 혈청형별 특이항원을 dispensing 하여 kit 상에서 항원성을 확인하였다. 구체적으로, 임상검체(음성, 혈청형별 양성 및 2차 감염 검체)를 이용하여 혈청형별 항원성을 확인하고자 하였다. 용법용량은 sample 3 ul, diluent buffer 180 ul 이고, 판독 시간은 sample과 diluent buffer 주입 후 15분에 판독하였다.

그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 혈청형별로 항원성을 나타내는 것을 확인하였다. 구체적으로, 음성 대조군의 경우 키트 전체적으로 음성으로 나타났고, 각각의 1번, 2번, 3번, 4번 혈청형에 감염되어 뎅기열인 환자 검체의 경우 각각의 혈청형별로 positive 결과가 나타났다. 아울러, 뎅기 바이러스에 2회 감염되어 뎅기출혈열로 번진 2차 감염 검체의 경우에는 1번 혈청형과 3번 혈청형에 positive 결과가 나타나 2가지 혈청형에 감염된 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6: 뎅기출혈열 진단키트 제조 및 이를 이용한 환자의 임상 검체 테스트

상기 실시예 5를 통하여 각각의 혈청형별 항원의 항원성을 확인하였는바, 단순히 뎅기 바이러스 감염만을 확인하는 것이 아니라, 뎅기출혈열로의 발병을 확인하기 위한 뎅기출혈열 진단키트를 제조하고자 하였다.

구체적으로는, 하나의 진단키트 내에서 IgM 및 IgG 항체를 각각 검출할 수 있는 스트립으로 구분한 상태에서, 각각의 혈청형별 재조합 항원을 각각의 라인에 분주하여 대조선을 제외하고 총 8개의 검출선을 확인할 수 있도록 구성하였다. 즉, DV1 IgM 항체, DV2 IgM 항체, DV3 IgM 항체, DV4 IgM 항체, DV1 IgG 항체, DV2 IgG 항체, DV3 IgG 항체, DV4 IgG 항체의 검출 여부를 각각 확인할 수 있는 구조이다(도 14).

각각의 스트립 및 라인에 분주된 원료는 다음과 같다.

		원료명
C-capture (Line 1)		Goat anti-Chicken IgY
T-capture	Line 2	뎅기 바이러스 혈청형 DV1 재조합 항원
	Line 3	뎅기 바이러스 혈청형 DV2 재조합 항원
	Line 4	뎅기 바이러스 혈청형 DV3 재조합 항원
	Line 5	뎅기 바이러스 혈청형 DV4 재조합 항원
Pre-line (Line 6)		JWY EDIII
IgM	C-CGC	Chicken IgY
	T-CGC	Goat anti-Human IgM
IgG	C-CGC	Chicken IgY
	T-CGC	Goat anti-Human IgG

상기 제조된 진단키트를 통하여 기존에 확보된 환자의 임상 검체 테스트를 통하여 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군을 검출할 수 있는지 확인하고자 하였다. 구체적으로는 7번, 9번 및 10번 환자는 뎅기출혈열이라고 진단받은 환자의 검체이고, 나머지 환자는 단순히 뎅기 바이러스에 감염된 환자의 검체이다.

그 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, 뎅기열에 감염된 환자의 경우에는 하나의 혈청형에 대한 항체만이 검출되었으나, 7번, 9번 및 10번 환자의 경우에는 2개 이상의 혈청형에 대한 항체가 검출되었다. 이러한 결과는 본 발명의 진단키트를 통하여 2개 이상의 혈청형에 대한 항체가 검출될 경우에, 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군을 정확하게 진단할 수 있음을 보여주는 결과이다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예 및 실험예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> IMMUNEMED INC. <120> Kit for diagnosing dengue hemorrhagic fever <130> KPA180406-KR <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue Virus DV1 Recombinant Antigen <400> 1 Gln His Gln Val Gly Asn Glu Thr Thr Glu His Gly Thr Ile Ala Thr 1 5 10 15 Ile Thr Pro Gln Ala Pro Thr Ser Glu Ile Gln Leu Thr Asp Tyr Gly 20 25 30 Ala Leu Thr Leu Asp Cys Ser Pro Thr Ser Gly Thr Thr Lys Ser Phe 35 40 45 Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Thr Val Leu Val Gln Val Lys 50 55 60 Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr Gln Asp 65 70 75 80 Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn Asp Lys Glu Lys Pro Val Asn Ile Gly 85 90 95 Ala Gly Glu Lys Ala Leu Lys Leu Ser 100 105 <210> 2 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue Virus DV2 Recombinant Antigen <400> 2 Glu His Ala Val Gly Asn Asp Thr Gly Lys His Gly Lys Glu Ile Lys 1 5 10 15 Ile Thr Pro Gln Ser Ser Ile Thr Glu Ala Glu Leu Thr Gly Tyr Gly 20 25 30 Thr Val Thr Met Glu Cys Ser Pro Met Ser Ser Gly Asn Leu Lys Phe 35 40 45 Lys Val Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Thr Ile Val Ile Arg Val Gln 50 55 60 Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro Phe Glu Ile Met Asp 65 70 75 80 Leu Glu Lys Arg His Val Leu Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Gly 85 90 95 Val Glu Pro Gly Gln Leu Lys Leu Asn 100 105 <210> 3 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue Virus DV3 Recombinant Antigen <400> 3 Gln His Gln Val Gly Asn Glu Thr Gln Gly Val Thr Ala Glu Ile Thr 1 5 10 15 Ser Gln Ala Ser Thr Ala Glu Ala Ile Leu Pro Glu Tyr Gly Thr Leu 20 25 30 Gly Leu Glu Cys Ser Pro Thr Ser Gly Gly Thr Ser Thr Phe Val Leu 35 40 45 Lys Lys Glu Val Ser Glu Thr Thr Ile Leu Ile Lys Val Glu Tyr Lys 50 55 60 Gly Glu Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr Glu Asp Gly Gln 65 70 75 80 Gly Lys Ala His Asn Lys Lys Glu Glu Pro Val Asn Ile Gly Ile Gly 85 90 95 Asp Lys Ala Leu Lys Ile Asn 100 <210> 4 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue Virus DV4 Recombinant Antigen <400> 4 Thr His Ala Val Gly Asn Asp Ile Pro Asn His Gly Val Thr Ala Thr 1 5 10 15 Ile Thr Pro Arg Ser Pro Ser Val Glu Val Lys Leu Pro Asp Tyr Gly 20 25 30 Glu Leu Thr Leu Asp Cys Glu Pro Ser Gly Asp Gly Asn His Lys Phe 35 40 45 Ser Ile Asp Lys Glu Met Ala Glu Thr Thr Thr Val Val Lys Val Lys 50 55 60 Tyr Glu Gly Ala Gly Ala Pro Cys Lys Val Pro Ile Glu Ile Arg Asp 65 70 75 80 Val Asn Lys Glu Lys Val Val Tyr Thr Asn Ser Val Thr Asn Ile Gly 85 90 95 Val Gly Asp Ser Ala Leu Thr Leu His 100 105 <210> 5 <211> 315 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue Virus DV1 Recombinant Antigen <400> 5 cagcaccagg tgggaaatga gaccacagaa catggaacaa ttgcaaccat aacacctcaa 60 gctcctacgt cggaaataca gctgaccgac tacggagctc ttacattgga ttgctcaccc 120 acgtctggaa cgacaaaatc attcaagtta gagaaagaag tggctgagac cactgttcta 180 gtgcaggtta aatacgaagg aacagatgca ccatgcaaga tccccttttc gacccaagat 240 gagaaaggag taacccagaa tgacaaagaa aaaccagtca acattggagc aggtgaaaaa 300 gctttgaaat taagc 315 <210> 6 <211> 315 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue Virus DV2 Recombinant Antigen <400> 6 gagcatgcag tcggaaatga cacaggaaaa catggcaagg aaatcaaaat aacaccacag 60 agttccatca cagaagcaga gttgacaggc tatggcactg tcacgatgga gtgctctccg 120 atgtcatcag gaaacttaaa gtttaaagtt gtgaaggaaa tagcagaaac aacaatagtt 180 atcagagtac aatatgaagg ggacggttct ccatgtaaga tcccttttga gataatggat 240 ttggaaaaaa gacatgtttt agaaaaagat agcccagtca acataggagt agagccggga 300 caattgaagc tcaac 315 <210> 7 <211> 309 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue Virus DV3 Recombinant Antigen <400> 7 caacaccagg tgggaaatga aacgcaggga gttacggctg agataacatc ccaggcatca 60 accgctgaag ccattttacc tgaatatgga accctcgggc tagaatgctc accaacctca 120 ggaggcacaa gtacctttgt gttgaagaaa gaagtctccg aaacgacaat actcattaag 180 gttgagtaca aaggggaaga tgcaccctgc aagattcctt tctccacgga ggatggacaa 240 gggaaagctc acaataagaa ggaggagcct gtcaacattg gaattggaga caaagccctg 300 aaaatcaac 309 <210> 8 <211> 315 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue Virus DV4 Recombinant Antigen <400> 8 acccatgcag taggaaatga catacccaac catggagtga cagccacgat aacccccagg 60 tcaccatcgg tagaagttaa attaccggat tatggagaat taacactcga ttgtgaaccc 120 tccggtgatg gaaaccacaa gttctcaatt gacaaagaga tggcagaaac aacaacagtg 180 gtaaaagtca agtatgaggg tgctggagct ccatgtaaag ttcccataga gataagagat 240 gtgaacaagg aaaaagtggt atataccaac agtgtaacca acataggtgt tggagacagt 300 gcattaacac tccat 315

Claims (15)

1. (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV1 재조합 항원; (b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV 2 재조합 항원; (c) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV 3 재조합 항원; 및 (d) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV 4 재조합 항원을 포함하는, 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군 진단 키트.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 뎅기 바이러스 재조합 항원은 뎅기 바이러스의 피막(envelope; E) 단백질을 포함하는 것인, 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군 진단 키트.
   
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 키트는 뎅기 바이러스에 대한 IgM 항체 및 IgG 항체 둘 모두를 검출하는 것을 특징으로 하는, 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군 진단 키트.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 키트는 뎅기 바이러스에 대한 IgM 항체를 검출하는 스트립, 및 뎅기 바이러스에 대한 IgG 항체를 검출하는 스트립을 포함하는 것인, 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군 진단 키트.
   
6. 제1항에 있어서, 뎅기 바이러스 혈청형 중 둘 이상의 혈청형에 대한 항체가 검출될 경우 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군으로 진단하는 것인, 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군 진단 키트.
   
7. (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV1 재조합 항원; (b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV 2 재조합 항원; (c) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV 3 재조합 항원; 및 (d) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV 4 재조합 항원을 포함하는, 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군 진단용 조성물.
   
8. 삭제
9. 제7항에 있어서, 뎅기 바이러스 혈청형 중 둘 이상의 혈청형에 대한 항체가 검출될 경우 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군으로 진단하는 것인, 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군 진단용 조성물.
   
10. 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 키트를 이용하여, 개체로부터 분리된 시료에서 항체를 검출하는 단계를 포함하는, 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군 진단을 위한 정보제공방법.
    
11. 제10항에 있어서, 상기 뎅기 바이러스 혈청형 중 둘 이상의 혈청형에 대한 항체가 검출될 경우 뎅기출혈열 또는 뎅기쇼크증후군으로 진단하는 것인, 정보제공방법.
    
12. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV1 재조합 항원.
    
13. 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는, 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV2 재조합 항원.
    
14. 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는, 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV3 재조합 항원.
    
15. 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는, 뎅기 바이러스 혈청형 특이 DV4 재조합 항원.

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