KR20160097219A

KR20160097219A - Csfv 항체에 대한 개선된 진단 시험

Info

Publication number: KR20160097219A
Application number: KR1020167016192A
Authority: KR
Inventors: 우르스 페터 브루더러
Original assignee: 인터벳 인터내셔널 비.브이.
Priority date: 2013-12-19
Filing date: 2014-12-18
Publication date: 2016-08-17
Also published as: EP3084441B1; JP2017503165A; ES2668459T3; KR101848194B1; TW201530141A; RU2016129161A; WO2015091736A1; RU2689143C1; JP6383422B2; TWI611188B; CN105829892A; EP3084441A1; US20160313330A1; BR112016014010A2; US9739778B2; CN105829892B; HUE038721T2; BR112016014010B1

Abstract

본원의 발명은 수의과적 진단 분야, 구체적으로 CSFV에 대한 항체 검출 시험과 관련된다. 특히, 본 발명은 CSFV E2 단백질의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체와 공동-인큐베이션 하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 시험 샘플에서 야생형 CSFV에 대한 항체를 검출하는 방법과 관련된다. 나아가, 본 발명은 진단 시험 키트, 및 본 발명에 따른 방법의 사용과 관련된다. 이에 더해, 본 발명은 본 발명의 진단 시험 키트 및 CSFV (마커) 백신의 병용에 의하여, 야생형 CSFV로 감염된 동물과 CSFV (마커) 백신으로 CSFV에 대해 예방접종된 동물을 구별하는 방법, 및 돼지 동물 집단의 야생형 CSFV 감염을 조절하는 방법과 관련된다.

Description

CSFV 항체에 대한 개선된 진단 시험 {IMPROVED DIAGNOSTIC TEST FOR CSFV ANTIBODIES}

본원의 발명은 수의과적 진단 분야, 구체적으로 CSFV에 대한 항체 검출 시험과 관련된다. 특히 본 발명은 시험 샘플에서 야생형 CSFV에 대한 항체를 검출하는 방법과 관련된다. 나아가, 본 발명은 진단 시험 키트, 및 야생형 CSFV에 대한 항체 검출 방법의 사용과 관련된다. 이에 더해, 본 발명은 야생형 CSFV로 감염된 동물 및 CSFV 백신으로 CSFV에 대해 예방접종된 동물을 구별하는 방법, 및 돼지 동물 집단의 야생형 CSFV 감염을 조절하는 방법과 관련된다.

인간 또는 동물이 미생물 또는 미생물에 대한 항체에 양성 또는 음성인지 결정하기 위하여, 미생물 감염의 혈청진단법에 대해 다른 시험이 알려져 있다. 전형적으로 이러한 시험은 특이성을 제공하도록 정의된 항체를 사용하여 형성되었을 수 있는 면역 복합체 검출에 대한 기술을 포함한다. 종종 이 시험은 또한 신호 강도를 증폭하는 단계 및 비결합, 비특이적 또는 원치 않은 성분을 세척하는 하나 이상의 단계를 포함할 것이다. 면역 복합체의 검출은 다양한 방법, 예컨대 색 변화, 형광, 또는 입자 크기 변화 검출에 의하여 광학적으로, 또는 면역-복합체의 방사능 표지된 항원 또는 항체의 검출에 의하여 대안적으로 수행될 수 있다. 유사하게, 시험의 물리적 형태는 폭넓게 변화할 수 있으며, 예를 들어 미세적정 플레이트, 막(membrane), 딥스틱(dipstick), 바이오센서 칩, 겔 메트릭스(gel matrix), 또는 (미세-) 담체 입자, 예컨대 라텍스, 금속, 또는 폴리스티렌, 등을 포함하는 용액을 사용할 수 있다.

이러한 시험의 특정 설정에 대한 선택은 통상적으로 입력 샘플의 유형, 목적하는 시험 (양성 샘플을 올바르게 식별하는) 감도, 및 -(진정 양성 및 진정 음성 샘플을 올바르게 구분하는) 특이성에 의해 결정되며; 이러한 성질은 면역 반응의 강도와 시간, 또는 미생물의 존재에 의존한다. 나아가 시험 경제에 대한 요건, 예컨대 이것의 대규모 적용성 및 이것의 비용이 특정 형식의 선택에 결정적일 수 있다.

잘 알려진 진단 시험은: 방사선면역 분석, 면역확산, 면역형광, 면역침강, 응집, 용혈, 중화, 및 "효소-결합 면역-흡착 분석" 또는 ELISA이다. 특별히 대규모 시험에서, 액체 취급, 결과 판독 및 처리, 또는 둘 모두의 자동화가, 요건일 수 있다. 이것은 또한 전통적인 분석 형식을 보다 현대적이고 소형화된 형식, 예컨대 알파리사(AlphaLISA)™ (퍼킨 엘머(Perkin Elmer))로 대체하는 것을 요구할 수도 있다.

많이 사용되는 진단 시험은 효소 면역분석, 예컨대 ELISA류이다. 이것은 쉽게 규모가변적이고, 매우 민감할 수 있다. 샘플이 희석 범위 내에서 시험될 수 있기 때문에 추가적인 장점은 이의 결과의 동적 범위이다. 결과는 판독에 사용되는 기술적 장비의 성질 및 설정에 의존하여 임의의 흡광 단위, 전형적으로 0.1 내지 2.5 광학 밀도 (OD) 단위로 표현된다. 통상적으로 적절한 양성 및 음성 대조군 샘플이 포함되며, 최빈 샘플이 다방면으로 시험되었다. 표준화는 특정 스코어를 양성 또는 음성을 결정하기 위한 사전설정 값에 또한 일치시키는 것을 허용하고, 생물학적 의미와의 상관관계, 예를 들어: 효능 항원의 양, 또는 면역 보호 수준 항체의 양을 허용하는 (희석 범위의) 정의된 기준 샘플을 포함하는 것에 의해 얻어진다.

ELISA 설정의 많은 변형물이 알려져 있지만, 전형적으로 항원 또는 항체를 고체상, 예를 들어 미세적정 플레이트의 웰(well)에 고정화하는 것을 수행한다. 항체가 고정화된 경우, 이 시험은 '포획' 또는 '샌드위치' ELISA로 불린다. 다음, 시험 샘플이 첨가되고, 리간드 (예를 들어, 검출될 항원 또는 항체)가 결합되도록 허용한다. 이후 표지, 예를 들어 분광광도법으로 판독될 수 있는 색 반응을 유도할 수 있는 효소에 접합하는 검출자 (항체, 항원, 또는 다른 결합 성분)가 첨가된다. 다른 표지 유형은 발광, 형광, 또는 방사능을 사용하는 것일 수 있다. 표지된 검출자의 사용은 시험 감도를 증진하도록 신호 강도의 증폭을 제공하는 것을 의도하지만, 이는 또한 신호 대 잡음비를 감소시키는 배경 신호를 도입할 수 있다.

ELISA 프로토콜의 변형물에서, 시험 특이성은 '경쟁 -', '억제-', '간섭-', 또는 '블로킹 ELISA'로 불리는 시험의 경우에서 경쟁적 결합의 도입에 의해 개선된다. 이러한 분석에서 시험 샘플 내의 인자 (항체 또는 항원)는 고체상에 고정화된 분자 (항원 또는 항체)와의 결합에서 표지된 검출자 항체/항원과 경쟁한다. 이것은 경쟁 인자의 존재 또는 양을 측정하는 민감한 방법인 최대 색 신호의 감소를 일으킨다. 결과는 최대 ELISA 신호의 억제 백분율로서 표현될 수 있다.

이것의 융통성(versatility) 및 감도 때문에, ELISA류는, 예를 들어 전염병학, 감염 감시 프로그램, 또는 백신 캠페인의 효과를 입증하는 데에 일반적으로 사용된다. 이 ELISA의 사용은 또한 동물 보건 부문, 예를 들어, 보다 관련된 감염성 질병의 근절 모니터링 및 통제 조치로 확장된다. 이 측면에서의 결함이 거짓 양성은 불필요한 동물 격리 또는 도태를 일으킬 수 있고, 거짓 음성은 경계를 넘어 미검출된 보균-동물의 수송에 의해 병균을 확산시킬 수 있어, 어느 쪽이든 심각한 결과를 가질 수 있으므로 그 맥락에서 진단 시험의 감도 및 특이성의 충분한 수준이 중요하다. ELISA의 이러한 사용의 한 예는 OIE 신고대상 질병, 예컨대 돼지 동물에서 돼지 열병(Classical swine fever, CSF)의 통제이다.

돼지 콜레라 또는 돼지 열병으로도 알려진 CSF는, 전세계적으로 일어나는 종종 돼지 동물에게 치명적인 질병이다. 이것은 돼지 열병 바이러스 (CSFV)로 인해 일어나며, 또한 매우 전염성인 돼지 콜레라 바이러스로 알려져 있다. 이 질병은 많은 동물 고통, 및 상업적 돼지 농업 및 이들의 생산물에 의존하는 지구(sector)에 상당한 경제적 손실을 일으킨다.

CSFV는 플라비바이러스 과, 및 페스티바이러스 속에 속한다. 잘 알려진 다른 페스티바이러스는 양 및 돼지를 감염시키는 국경병 바이러스(BDV), 및 소, 양 및 돼지를 감염시키는 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV)이다. 어느 정도 수준의 교차-보호가 이들 관련 바이러스 사이에 나타난다. CSF 비리온은 상대적으로 작고 봉입되어 있으며, 약 12.3 kb의 양성 센스, 단일 가닥 RNA 바이러스 게놈을 포함한다. 이 게놈은 몇몇 비-구조적 바이러스 단백질에 의해 자동-절단되는 하나의 약 4000 아미노산의 큰 다단백질로 번역된다. 이것은 주요 구조적 바이러스 외피 당단백질: Erns, E1 및 E2를 일으킨다. 바이러스 및 이의 질병에 대한 리뷰는 문헌 [Moennig (2000, Vet. Microbiol., vol. 73, p. 93)]을 참조한다.

CSFV에 대한 항체 검출의 황금 기준은 바이러스 중화 시험이다. 그러나 이것이 수고롭고 어려우므로, ELISA 유형 시험이 빠른 스크리닝 및 검출에 사용되며, CSFV 항원 또는 CSFV 항체 검출에 대한 다양한 상업적 시험이 입수가능하다. 이러한 시험은 문헌 [Blome et al. (2006, Rev. Sci. Tech. (Int. Off. Epiz.), vol. 25, p. 1025)]에서 리뷰되었다. CSFV 항원에 대한 시험은 완전 바이러스 또는 특정 바이러스 (외피) 단백질, 예컨대 Erns 또는 E2 중 어느 하나를 검출한다. 유사하게, CSFV 항체에 대한 시험은 바이러스-, E2- 또는 Erns 항체를 검출한다. 항체가 동물 내에 더 긴 시간 존재하고, 검출에 대해 더 넓은 시간 윈도우(time window)를 제공하므로 표적 동물의 항체 검출은 항원 또는 바이러스 검출보다 더 민감하다. 이에 더해, 페스티바이러스 간의 교차-반응성 때문에, Erns 항원 또는 -항체의 검출에 기반한 CSFV에 대한 진단 시험은 BVD 및/또는 BVDV가 매우 만연한 지역에서는 신뢰할 수 없다. 따라서, CSFV 진단에 대한 현재의 초점은 CSFV E2 단백질에 대한 항체 검출에 있다. 리뷰는 문헌 [Schroeder et al. (2012, Rev. Sci. Tech. (Int. Off. Epiz.), vol. 31, p. 997)]을 참조한다.

(이전에 당단백질 E1, 또는 gp51-54로 알려진) CSFV E2 단백질은 CSFV 다단백질의 아미노산(aa) 690 위치에서부터 암호화 되어있다. 성숙 CSFV E2 단백질은 약 370 aa 길이이며, 이것은 E1 C-말단과 겹치는 약 22 aa의 N-말단 신호 서열이 없지만, 약 40 aa의 C-말단 막투과 영역을 포함한다 (문헌 [Ganges et al., 2005, vaccine vol. 23, p. 3741]). E2에서, 면역우성 A 도메인은 다단백질의 아미노산 위치 766 내지 866에 위치한다 (문헌 [van Rijn et al., 1993. J. of Gen. Virol., vol. 74, p. 2053]). 이 도메인에서 바이러스-중화 항체를 끌어내는 하나의 선형 B-세포 에피토프가 확인되었다: TAVSPTTLR 에피토프 (서열 1). 이 에피토프는 CSFV 다단백질의 아미노산 위치 829 내지 837에 위치하며, E2 aa 서열의 aa 140 내지 148에 대응하고, CSFV 균주들 간에 잘 보존되어 있으나, BVDV- 또는 BVD 항체와 교차-반응하지 않는다 (문헌 [Lin et al., 2000, J. of Virol., vol. 74, p. 11619]).

이 에피토프의 특이성을 사용하는 몇몇 상업적 E2 항체 시험이 개발되어 왔다: 프리오체크(PrioCHECK)® CSFV Ab 2.0 (이전에 세디테스트(Ceditest)® CSFV 2.0로 명명되었음) (모두: 스위스 슐리렌-취리히 소재 프리오닉스 아게(Prionics AG), 및 아이덱스(IDEXX) CSFV Ab 테스트® (네덜란드 후프도르프 소재, 아이덱스 유럽(IDEXX Europe) B.V.). 이 시험은 고정화된 CSFV E2 단백질을 사용하는 경쟁 ELISA이다. 임의의 E2 항체가 시험 샘플에 존재할 경우, 이들은 고정화된 CSFV E2에 결합하고, 따라서 야생형 CSFV E2의 TAVSPTTLR 에피토프에 특이적인 효소-접합된 단일클론 항체인 표지된 지표 항체와 경쟁한다; 이들 키트에 지표로서 사용되는 표지된 단일클론 항체는 V2 (프리오닉스) 또는 A18 (아이덱스)로 불리며, 린(Lin) 등, (2000, 상기 문헌 동일)에 의해 사용된 WH303 단일클론 항체와 동일한 특이성을 갖는다.

CSF에 대한 백신이 알려져 있으며 CSFV가 고질적인 국가에서 통상적으로 사용된다. 불활성화된 CSFV 백신이 비실용적이므로, 수 년 간 생-약독화 바이러스 백신이 사용되어 왔고; 가장 효과적인 것은 소위 차이나- 또는 C-균주에 기반한다. 이는 수 년의 사용으로부터 매우 신뢰할만한 실적을 갖고 있으며 또한, 비록 CSF 급증의 경우에 긴급 예방접종에 대해서만이지만, 유럽 연합에 허용된 유일한 생 약독화 백신이다. 종종 CSF에 대한 정부적 통제 프로그램 (예를 들어, EU 의회 지침 2001/89/EC)은 CSFV에 대한 항체에 혈청검사양성인 돼지의 수송을 금지하는 무역 제한 시스템에 의해 뒷받침된다.

그러나, 일부 국가는 야생 돼지 및 멧돼지의 CSFV의 자연 보유고로부터의 빈번한 재감염에 시달릴 수 있다. 결과적으로, 이따금 CSF의 급증이 일어나고, 많은 돼지가 - 감염 되었거나 비-감염된 것 모두 - 도태된다. 이것은 많은 윤리적 우려뿐만 아니라 상당한 비용을 야기한다. 또한, 긴급 예방접종을 받은 돼지는 혈청검사양성이 되므로 더 이상 수출되지 못할 수 있다. 이것은 축사의 과밀 및 나아가 경제적 손실을 야기한다.

따라서, 노력은 혈청학적 "접종된 동물로부터 감염된 것의 구별" 또는: DIVA를 허용하는 백신 개발에 초점을 맞췄다. 이 유형의 구별 시험의 기본 원리는 야생형 미생물로의 동물의 감염으로부터 혈청학적으로 구별될 수 있는 양성 또는 음성 '마커' 기능을 갖는 백신으로 표적 동물을 예방접종 하는 것이다. 예를 들어 마커 백신은 야생형 미생물에 존재하는 하나 이상의 항원이 결여될 수 있다. 예방접종된 것이 그 항원에 대해 혈청검사음성을 유지하는 반면, 감염된 표적은 이후 그 항원에 대해 혈청검사양성이 될 것이다.

CSF에 대해 사용되기 위해 개발된 DIVA 백신의 한 분류는 바이러스 소단위체, 예컨대 E2 및/또는 Erns에 기반한다. 그러나 이들은 덜 보호적이며, 완전 바이러스 백신보다 더 느린 면역성의 시작을 갖는다.

또한, CSFV의 비-예방접종 및 스탬핑-아웃 체제 하에서, 이러한 CSFV 마커 백신이 시장에 허용될 수 있는 유일한 방법은, 신뢰할 만한 동반 진단 시험과 함께 사용되는 것이다.

강하고 초기의 보호뿐만 아니라 DIVA 능력을 한 백신으로 결합하기 위한 노력에서, 기존의 C-균주 생 약독화 CSFV 백신은 코르테카스(Kortekaas) 등 (문헌 [2010, J. of Virol. Methods, vol. 163, p. 175])에 의한 재조합 DNA 기술로 변형되었으며, 이로써 이들은 CSFV E2 단백질의 A 도메인의 TAVSPTTLR 에피토프에 초점을 맞추었다. 에피토프의 일부 아미노산은 돌연변이 되거나 결실되었고, 이후 돌연변이 CSFV 바이러스가 강제 바이러스 진화에 놓여진다. TAVSPTTLR 에피토프의 다른 돌연변이를 갖는 생존가능한 돌연변이 바이러스가 얻어졌다.

E2의 C-균주 CSFV 돌연변이의 vFlc-ΔPT 계열 중, vFlc-ΔPTa1이라는 이름의 것이 추가 연구를 위해 선택되었다. 이 바이러스는 아미노산 하나의 치환, 및 두 개의 결실에 의해, E2의 TAVSPTTLR 에피토프의 돌연변이된 버전을 가지며, 원래의 TAVSPTTLR 에피토프에 대응하는 에피토프는 이후 TAGSTLRTE (서열 2)가 된다. 이 돌연변이 바이러스는 좋은 생존력을 보였으며, E2에 대한 강한 항체 반응을 유도하였다. 이에 더해, 돌연변이된 E2에 대한 토끼 항체는 부모 C-균주 바이러스의 야생형 E2를 더 이상 인식하지 않았다. 결과적으로 이것은 DIVA를 허용하는 효과적인 생 CSFV 마커 백신에 대해 이상적인 후보로 고려되었다.

vFlc-ΔPTa1 돌연변이 바이러스는 이후 표적 동물에서의 백신 효과에 대해 시험되었으며 (문헌 [Kortekaas et al., 2011, Vet. Microbiol., vol. 147, p. 11]), 부모 균주와 가까운 보호 수준을 유도한다는 것이 밝혀졌고, 효과적으로 도전 바이러스의 발산을 막았다. 그러나, 저자는 이 돌연변이 바이러스로 예방접종된 돼지의 혈청이 부모 C-균주 바이러스로 예방접종된 돼지의 혈청과 명확하게 구별될 수 없었다는 점을 발견하여 낙담했다. 이것은 E2 돌연변이 바이러스가 E2 ELISA에서 중간 내지 완전한 강도의 거짓 양성 스코어를 주는 돼지 항체를 유도하기 때문이다. 결과적으로 이것은 신뢰할 만한 CSFV 항체 구별 시험의 결여로, 새로운 DIVA 마커 백신의 시장 도입을 배제시켰다.

마커 백신으로 예방접종된 돼지의 혈청에 대한 E2 ELISA에서의 거짓 양성 스코어를 극복하기 위한 노력에서, 코르테카스 등 (2011, 상기 문헌 동일)은 ELISA에 대해 여러 수정, 예컨대: 삼차 구조 예측의 사용에 의해 사용되는 펩티드의 변형; 더 나은 구별을 허용할 수 있는 새로운 단일클론 항체의 사용; 이것이 다른 것들에 대해 효과적이라고 입증됨에 따라, 다른 블로킹 항체를 사용하는 ELISA의 변화 (문헌 [Holinka et al., 2009, Virology, vol. 384, p. 106]); 및: 허용되는 감도를 유지하면서 판독에 대한 컷-오프(cut-off) 값의 변화를 고려하였다. 모든 이들 접근법은 거짓 양성의 발생을 극복하는 데에 효과적이지 않은 것으로 밝혀졌다.

나타나 있듯, 홀린카(Holinka) 등 (2009, 상기 문헌 동일)의 결과는 다른 재조합 CSF 마커로 예방접종된 돼지의 혈청을 시험했을 때 유사 E2 ELISA를 일으키는 거짓 양성 결과를 보이지 않았다. 그러나 이들의 결과는 중요한 것으로 간주될 수 없다: 한편으로는 이들이 개별 혈청 보다는 풀을 시험하였고, 다른 한편으로는 이들의 수치가, 신호-대-잡음비가 신뢰할 만한 대규모 진단 시험의 기초를 형성하기에 너무 불리한 검출 범위 하단이기 때문이다 (0.100 내지 0.350 OD 단위; 홀린카 등 (2009, 상기 문헌 동일)의 도 3A를 참조한다).

더 나은 예는 CSFV E2의 TAVSPTTLR 에피토프를 BVDV E2의 대응하는 서열에 의해 대체함으로써 홀린카 등의 것과 매우 유사한 재조합 CSF 백신을 제작한 레이만(Reimann) 등 (2010, Vet. Microbiol., vol. 142, p. 45)에 의한 공개물이다. 코르테카스 등 (2011, 상기 문헌 동일)의 결과와 일치하게, 레이만 등은 또한 이들의 돌연변이된 E2 바이러스로 예방접종된 돼지의 혈청의, 변형되지 않은 E2 에피토프에 결합하는 교차-반응성 항체를 발견하였다. 따라서 또한 이 경우에 있어서, 거짓 양성 스코어가 얻어졌으며, DIVA 시험은 개발될 수 없었다. 이 문제를 다루기 위해 레이만 등은 비용 대 감도에서의 컷-오프 값을 조정하거나, 거짓 양성 스코어를 감소시키도록 돌연변이주 바이러스 주쇄 서열을 변형시키는 것을 제안하였다.

따라서, TAVSPTTLR 에피토프에 대한 다른 돌연변이가 이러한 돌연변이주 에피토프에 기반한 CSFV 마커 백신에 대한 동일한 쟁점을 야기함이 발견되었다: vFlc-ΔPTa1 바이러스에 기반한 CSFV 백신의 경우에서, TAVSPTTLR 에피토프에 대한 돌연변이는 그 위치의 9 개의 아미노산 중 6 개를 바꿨다. 유사하게, 레이만 등 (2010, 상기 문헌 동일)에서, E2 단백질의 대응하는 위치의 9 개 중 5 개의 다른 아미노산을 시험하자 이 문제가 또한 발생하였다.

결과적으로, 따라서 CSFV E2 단백질의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 CSFV (마커) 백신으로 예방접종된 동물에서 얻어진 혈청의 야생형 CSFV E2 항체에 대한 ELISA의 거짓 양성 스코어 문제는, 일반적인 성질이며, 현재까지 여전히 극복되지 않고 있다. CSF 백신 후보에 대한 최근의 리뷰에서, 에블레(Eble) 등 (문헌 [2013, Vet. Microbiol., vol. 162, p. 437])은 CSFV에 대해 CSFV 백신 및 대응하는 DIVA 시험의 최적의 조합이 아직 입수가능하지 않다는 이 딜레마를 확인한다.

따라서, CSFV E2의 TAVSPTTLR 에피토프에 돌연변이를 가진 CSFV 백신으로 예방접종된 동물의 샘플을 시험할 때 야생형 CSFV에 대한 항체에 대한 진단 분석에서 거짓 양성 결과를 감소시킴으로써 종래 기술의 단점을 극복하고, 당업계의 필요성에 응하려는 것이 본 발명의 목적이다.

놀랍게도 이 목적이 충족될 수 있음이 밝혀졌으며, 결과적으로 종래 기술의 단점이 DIVA를 허용하는 야생형 CSFV 항체에 대한 개선된 진단 시험에 의해 극복될 수 있다. 이 개선은, 시험 샘플이 CSFV E2의 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 고정화된 담체와 함께 인큐베이션 되는 야생형 CSFV E2 항체에 대한 진단 분석의 인큐베이션 단계의 변형에 관하며, 현재는 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체와의 공동-인큐베이션을 포함한다. 이 변형은 CSFV E2 항체에 대한 기존의 진단 분석 프로토콜의 단지 제한적인 변형에 의해 거짓 양성 결과를 완전히 감소시키는 것으로 밝혀졌다.

이 변형된 진단 방법의 유리한 효과는 여러 가지이며, 주된 것은 이 변형이 기존의 시험 프로토콜에 완전히 통합될 수 있다는 것이다. 결과적으로, 추가적인 인큐베이션 단계가 요구되지 않으며, 개선된 시험 방법은 이전보다 더 많은 시간을 요구하지 않는다. 한 지역에서의 CSF 급증의 경우 잠재적으로 매우 많은 수의 시험 샘플이 단기간에 시험될 필요가 있을 수 있음을 고려할 때 이것은 중요한 장점이다.

나아가, 이제 더 이상 대응하는 CSFV 백신 또는 원래의 진단 분석에 대해 극단적인 변화를 가져올 필요가 없다. 반대로, 이제 CSFV 백신으로 예방접종된 동물의 샘플에서 야생형 CSFV E2 항체의 검출을 위해 기존의 CSFV E2 ELISA의 기본 설정을 사용하는 것이 가능하다. 이것은 잘 확립된 특이성 및 감도 프로파일 및 이들의 입증된 신뢰성으로, 확립된 CSFV 진단 분석에 대한 의존을 허용한다.

본 변형으로, CSFV 진단 분석은 현재 감염된 것과 예방접종된 동물을 효과적으로 구별하는 데에 사용될 수 있으며, 따라서 본 발명은 DIVA 스크리닝을 허용하는 야생형 CSFV에 대한 개선된 진단 시험을 제공하고, 취약한 동물 집단에서 CSFV 발생을 조절하도록 CSFV (마커) 백신에 대해 동반 진단으로서 사용될 수 있다.

이들 유리한 효과를 향한 중요한 단계는 CSFV에 대한 예방접종을 야생형 CSFV, 또는 C-균주 백신 감염으로부터 식별하는 것에 대한 실패의 원인의 발명자에 의한 확인이었다.

이 원인은 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 가진 E2를 포함하는 CSFV (마커) 백신이 특이적으로 백신의 돌연변이된 E2 에피토프뿐만 아니라, -동일하게 높은 친화도로 - C-균주 백신 및, 야생형 CSFV의 E2의 변형되지 않은 TAVSPTTLR 에피토프와도 결합할 수 있는 항체를 유도한다는 것으로 밝혀졌다. 이것은 야생형 CSFV 감염에 대해 예방접종된 동물의 혈청 샘플을 시험할 때 거짓 양성 스코어를 일으킨다. 반대로, 야생형 CSFV로의 감염, 또는 C-균주 백신으로의 접종으로부터 얻어진 항체, 또는 야생형 TAVSPTTLR E2 에피토프에 대한 단일클론 항체 (예를 들어: V2 (프리오닉스), A18 (아이덱스), 또는 WH303 (문헌 [Lin et al., 2000, 상기 문헌 동일])는 CSFV 백신의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 갖는 E2 단백질에 대해 아무런 상당한 친화도를 갖지 않는 것으로 밝혀졌다. 이것이 왜 야생형 CSFV E2 단백질의 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체와 공동-인큐베이션 하는 것이 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 갖는 백신에 대한 거짓 양성 스코어 쟁점을 해결하지 못했던 이유이다.

현재 이러한 현상이 어떻게 또는 왜 일어나는지는 알려져 있지 않다. 그러나, 이런 관찰을 설명할 수 있는 어떤 이론 또는 모델에 얽매이지 않고, 발명자는 CSFV E2의 TAVSPTTLR 에피토프의 3차원적 형태의 영향이 있을 것으로 추측한다; 이 3D 형태는 이것의 선형 아미노산 서열의 돌연변이에 따라 바뀐다. 이것은 명백하게 여전히 야생형 CSFV E2의 TAVSPTTLR 에피토프와 특이적으로 결합할 수 있는 돌연변이주 E2 에피토프에 대한 항체를 유도한다. 이러한 항체는 야생형 CSFV E2 단백질에 기반한 진단 분석에서 교차-반응성이며 매우 특이적인 거짓 양성 스코어를 일으킨다.

거짓 양성 시험 스코어 문제의 원인에 대한 통찰로, 발명자는 이후 이 문제를 다루는 놀라운 방법을 찾아냈으며, 확립된 E2 진단 분석의 프로토콜의 한 단계에 해법을 구현하는 것이 가능했다: 시험 샘플을 CSFV E2 단백질의 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 고정화된 담체와 인큐베이션하는 단계, 및 이에 더해: CSFV E2 단백질의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체와 공동-인큐베이션하는 단계. 이것이 거짓 양성 스코어 쟁점을 해결하였다.

이러한 절차가 일반적으로 시험 샘플의 CSFV E2 항체와 CSFV E2의 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 고정화된 담체의 적절하고 완전한 결합에 지장을 주는 것으로 예상되었고, 따라서 당업자에게 일반적으로 고려되지 않았기 때문에 진단 방법의 변형이 공동-인큐베이션의 형태를 취할 수 있다는 사실은 놀라운 일이었다.

따라서, 제1 측면에서 본 발명은 CSFV E2의 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 고정화된 담체와 함께 시험 샘플을 인큐베이션 하는 단계를 포함하고, 상기 단계에서 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체와 공동-인큐베이션 되는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플이 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프에 대한 항체를 또한 포함할 수 있는, 시험 샘플에서 야생형 돼지 열병 바이러스 (CSFV)에 대한 항체의 검출 방법과 관련된다.

본 발명에 따른 "검출 방법"은 시험 샘플의 (종종 '바이오마커'로 불리는) 값 또는 성질을 결정하고, 이후 분석 결과가 그 결과물에 소정의 의미를 부여하는 것으로 해석될 수 있는, 시험 샘플에 적용되는 생체 외(in vitro) 방법이다. 이 해석은 기준 값 또는 이전 측정에 대해, 본 방법을 사용하여 시험 샘플에 대해 얻어진 결과의 비교에 기반하며, 측정된 값이 존재하거나 없는지, 또는 증가했거나 감소했는지를 확립한다.

본 발명에서, 측정된 값은 야생형 CSFV E2 단백질의 TAVSPTTLR 에피토프에 특이적인 항체의 정성적 및 정량적 존재이다.

본 발명에 따른 방법은 다른 잘 알려진 형태 중 하나인 진단 시험일 수 있다, 예를 들어: 방사선면역-, 면역확산-, 면역형광-, 면역침강-, 응집-, 용혈-, 중화 분석, "효소-접합된 면역-흡착 분석" (ELISA), 또는 알파리사™.

여러 교재가 입수가능한 다양한 진단 시험 및 이들의 구체적인 특징을 기술한다; 예를 들어: 문헌 [J. Huebner: Antibody-antigen interactions and measurements of immunologic reactions (Chapter 9 in: Pier, Lyczak and Wetzler (eds): Immunology, infection, and immunity, ASM Press, Washington D.C., 2004, ISBN: 1555812465, p. 207-232)]; 문헌 ['Antibodies: A Laboratory Manual' (eds.: Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988, ISBN-10: 0879693142)]; 및 문헌 ['Immunoassays: A Practical Approach' (J. P. Gosling edt., Oxford University press, 2000, ISBN-10: 0199637105)].

많은 수의 상업 회사들이 진단 시험용 물질 및 시약, 또는 완전한 진단 키트를 제공할 수 있거나, 시험 및 분석을 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 방법을 위한 프로토콜, 재료, 및 조건을 고안하고 최적화하는 것은 매우 당업자의 통상적인 능력에 속한다.

당업계에 또한 잘 알려진 바와 같이, "항체"는 면역글로불린 단백질이며, 일반적으로 5 가지 군으로 존재한다. 시험 샘플에서, 항체는 전형적으로 IgG 또는 IgM 유형일 것이며, 완전 항체일 것이다. 그러나, 항체-부분이 여전히 항원-결합 부위를 함유하고 있다면, 본 발명에 따른 방법에서 시약으로, 예를 들어 2차 항체, 또는 표지된 항체로서 사용될 수 있는 다른 항체는 완전 면역글로불린, 예를 들어, 단일 사슬 항체, 또는 면역글로불린의 일부일 필요가 없고; 다른 형태일 수 있다: 이러한 부분의 (합성) 구조. 면역글로불린의 잘 알려진 하위-단편은: Fab, Fv, scFv, dAb, 또는 Fd 단편, Vh 도메인, 또는 이러한 단편 또는 도메인의 다량체(multimer)이다.

진단 분석에서 시약으로 사용되는 항체는 흔히 증여 동물을 표적 항원으로 (과-)면역화하고, 그 동물의 혈청으로부터 제조된 항체를 수확함으로써 제조된다. 잘 알려진 증여자는 토끼 및 염소이다. 또 다른 예는 난황에서 소위 IgY라는 높은 수준의 항체를 생산할 수 있는 닭이다. 대안적으로, 산업적 규모의 제조 시스템이 알려진 항체는 생체 외에서, 예를 들어, 무한증식가능(immortalized) B-림프구 배양 (하이브리도마 세포)으로부터 잘 알려진 단일클론 항체 기술을 통해 제조될 수 있다. 또한 항체 또는 이들의 단편은 클로닝된 Ig 중쇄 및/또는 경쇄 유전자의 발현을 통해 스스로 재조합 발현 시스템에서 발현될 수 있다. 이들 모두는 당업자에게 잘 알려져 있다.

본 발명 및 본 명세서를 통틀어, 항체는 이들이 지시되어 있는 표적에 기반하여 지칭될 것이다; 예를 들어: CSFV에 대한 항체는 'CSFV 항체'를, 및 'E2 항체'는 항-E2 항체라고도 알려진 E2 단백질에 대한 항체를 지칭하는 등이다.

당업계에 잘 알려진 바와 같이, 어떤 표적 '에 대해' 지시된 항체는 그 표적이 특정 분자 또는 엔티티(entity)인 그 표적의 에피토프에 특이적인 항체이다. 항체 (또는 이들의 단편)은 에피토프에 선택적 결합이 가능하다면 에피토프에 특이적이다.

항체 및 표적 간 상호작용이 특이적이고(거나) 선택적인지 아닌지는, 당업자에 의해 쉽게 평가될 수 있다. 예를 들어, 억제에 기반한 면역-분석의 결과의 특이성은 억제가 분석에 사용된 항원 또는 항체의 농도와 상관관계 있음을 설명함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 경쟁 결합 분석을 사용하여, 이 코팅된 항원에 대한 항체 결합을 50 %까지 억제하는 데에 항원이 얼마나 요구되는지를 결정할 수 있다 (문헌 [Bruderer et al., 1990, J. of Imm. Meth., vol. 133, p. 263]). 이 경우의 예로서: 야생형 CSFV E2 단백질, 및 TAVSPTLLR 에피토프-특이적 (단일클론) 항체를 사용한다.

진단 면역-분석의 맥락에서 매우 관련된 것은, 항체가 거짓 양성 결합을 보일 때, 진단 분석의 거짓 양성 결과를 초래하는 것이다. 이것은 항체가 이에 대해 생성된 것보다 에피토프에 대해 상대적으로 강한 결합에 의하여, 또는 이것의 원래 에피토프지만 이후 원래 표적보다 다른 표적에 위치하는 에피토프와의 특이적인 결합에 의하여 일어날 수 있다.

면역분석 기술 분야의 당업자는, 예를 들어 진단 분석의 다른 유형으로 결과를 확인하거나, 다른 시간 지점의 시험 샘플로 결과를 확인함으로써 어떻게 진정 및 거짓 양성 결과를 구별하는지 알고 있다.

본 발명에 따른 방법에 의하여, 야생형 CSFV의 E2 단백질에 대한 항체에 대해 시험할 때 거짓 양성 스코어의 상당한 감소를 얻을 수 있었다. 본원에서 설명되고 예시된 바와 같이, 거짓 양성 스코어의 감소는 CSFV 양성이라고 부정확하게 간주된 동물 수의 감소의 5 배 이하 (예를 들어, 50 % 초과의 ELISA 억제 내지 10 % 미만의 억제), 및 100 % 이하에 달했다.

본 발명에 따른 방법을 사용한 다양한 시험에서, vFlc-ΔPTa1에 기반한 백신으로 반복적으로 예방접종된 동물의 혈청 중 아무것도 3차 예방접종 이후 마지막 시간 지점을 측정할 때까지 양성이 되지 않은 반면, 야생형 CSFV로 감염된 돼지의 모든 혈청은 시험 결과에 기반하여, 감염 후 약 3 주 뒤에 양성이 되었다.

본 발명에 따른 방법은 또한 높은, 낮은, 음성, 또는 추정인 CSFV 항체, 뿐만 아니라 BVD- 또는 BVDV-항체를 함유하는 몇몇 혈청, 및 심지어 CSFV, BVD, 및/또는 BVDV의 일부 혼합 감염을 포함하는 중앙 수의과 협회 (네덜란드 렐리스타트)의 컬렉션으로부터의, 약 900 개 시험 샘플의 큰 세트에 대해 시험하였다. 본 발명에 따른 방법에 의하여, 거의 모든 샘플들을 우수한 특이성 및 감도로 정확하게 식별할 수 있었다. 이하의 실시예를 참조한다.

사실, 900 개의 샘플 컬렉션을 시험한 경우, 심지어 증진된 감도를 대부분의 시험된 샘플에서 본 발명에 따른 방법으로 공동-인큐베이션 하는 것을 적용할 때 관찰하였다. 이것은, 표준 상업적 CSFV E2 항체 블로킹 ELISA를 적용하는 것과 비교하여, 야생형 CSFV E2 항체에 대한 블로킹 ELISA에서 관찰되는 억제 백분율이 본 발명에 따른 방법이 적용되었을 때 여러 샘플에 대해 더 높다는 것을 의미한다. 이것은 이전에 추정으로 표시되었고 현재 양성을 스코어링 하는 5 개의 샘플 및 두 개의 이전에 음성이었고 현재는 추정인 샘플을 가져왔다 (실시예 2.3, 및 표 2를 참조한다).

본 발명에서 "야생형" 돼지 열병 바이러스는 자연 발생할 수 있는 CSFV를 지칭한다. 유전적 조성 및 생물학적 특징에 있어서 많은 변이를 생각할 수 있거나 이미 알려져 있으므로, 이것은 이러한 야생형 CSFV가 모두 동일함을 의미하지는 않는다. 그러나, 이 용어는 본 발명에서의 사용에 있어서, 예를 들어 재조합 DNA 기술에 의한 이것의 핵산 조정 또는 반복된 계대에 의한 변형, 또는 돌연변이와 같은 인간 개입의 결과인 CSFV를 배제하는 것을 의도한다.

본 발명에서 "돼지 열병 바이러스" 또는 "CSFV"는 잘 알려진 CSFV의 특징을 갖는 분류학상 페스티바이러스 속의 바이러스를 일반적으로 지칭한다. 이것은 또한 어떠한 식으로든 이로부터의 하위-분류, 예를 들어 아종, 균주, 단리물, 유전자형, 혈청형, 혈청변이주(serovar), 혈청군, 변이체, 또는 아형 등으로서의 CSFV를 포함한다. 이러한 CSFV는 이들의 분류학상 과(family) 구성원과 특징적인 특징, 예컨대 유전적, 물리적, 전자현미경적, 및 생화학적 특징뿐만 아니라 생물학적 특징, 예컨대 생리학적, 면역학적, 또는 병원성 거동을 공유한다. 혈청학적 분류 다음, 당업계에 알려진 바와 같이 다른 결정이 뉴클레오티드 시퀀싱 또는 PCR 분석에 기반할 수 있다.

본 발명의 대상인 바이러스 종이 현재 CSFV로 명명된 반면, 이것은 새로운 통찰이 신규 또는 다른 분류학상 군으로 재분류를 초래함에 따라 바뀔 수 있는 분류학상 분류라는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 그러나, 이것이 연관된 미생물 또는 이것의 특징적인 특징을 바꾸지 않고, 오직 이것의 과학적 명칭 또는 분류만이므로, 이러한 재분류된 생물은 본 발명의 범위에 남아있다.

본 발명에 따른 방법에 사용되는 "시험 샘플"은 원칙적으로 항체, 예를 들어 동물의 전혈 샘플로부터 제조된 혈장 또는 혈청 샘플을 함유하는 샘플의 임의의 유형일 수 있다. 당업자는 이러한 혈장 또는 혈청 샘플을 동물로부터 채취 및 제조하는 데에 요구되는 기술 및 재료를 잘 알고 있다.

예를 들어: 응고, 원심분리, 및 보체 불활성화 단계를 포함하는, 표준 실험실 기술에 의해 제조될 수 있고, 더 깨끗하므로, 바람직한 것은 혈청 샘플이다.

임의로 시험 샘플은, 예를 들어 신호 강도를 개선하거나, 배경 신호를 감소시키도록 더 처리되거나 정제될 수 있다. 예를 들어 항체가 단리될 수 있다. 항체 정제에 잘 알려진 기술은, 예를 들어 카프릴 산, 또는 암모늄 술페이트를 사용하는 이러한 항체의 침강, 또는 친화도 크로마토그래피를 사용하는 것이다.

본 발명에서, 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "포함하다(comprise)" (뿐만 아니라 변형물, 예컨대 "포함하는(comprising)", "포함한다(comprises)", 및 "포함한(comprised)")는, 심지어 이러한 구성요소 또는 조합이 명확히 언급되지 않아도 이 용어가 사용되는 텍스트 섹션, 문단, 청구항 등에 의해 다뤄지거나 포함되는 모든 구성요소, 및 본 발명에 대해 생각할 수 있는 임의의 가능한 조합을 지칭하며; 임의의 이러한 구성요소(들) 또는 조합의 배제를 지칭하지 않는다. 결과적으로, 임의의 이러한 텍스트 섹션, 문단, 청구항, 등은 또한, 용어 "포함한다" (또는 이것의 변형물)가 용어, 예컨대 "구성되다(consist of)", "구성되는(consisting of)", 또는 "필수적으로 구성되다(consist essentially of)"로 교체된 하나 이상의 실시양태(들)과 관련될 수 있다.

"CSFV E2의 TAVSPTTLR 에피토프"는 그 이름의 CSFV E2 단백질의 A 도메인의 잘 알려진 에피토프를 지칭하며, 9 개 아미노산 길이의 선형 에피토프이다. 이 에피토프에 부여된 명칭 "TAVSPTTLR"이, 이것이 트레오닌이 T로, 알라닌이 A 등으로 지칭되는 표준 한 글자 IUPAC 코드로 표시될 때 이 에피토프의 아미노산 서열과 일치한다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.

CSFV E2의 TAVSPTTLR 에피토프는 야생형 CSFV (문헌 [Lin et al., 2000, 상기 문헌 동일])에서 보존되어 있으며, 이것의 아미노산 서열은 본원에 서열 1로 나타나 있다.

본 발명에서, "돌연변이된" CSFV E2의 TAVSPTTLR 에피토프는, 서열 1과 하나 이상 위치에서 그 아미노산 서열이 다르다. 돌연변이는 단일 또는 여러 변화와 관련될 수 있으며, 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환, 또는 이들의 조합일 수 있다.

본 발명에 따른 방법에 사용되는 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프의 실시예는, 돌연변이주 CSFV 바이러스, 예컨대 vFlc-ΔPTa1의 E2 단백질에 존재하는 대응하는 에피토프이며 이 에피토프는: TAGSTLRTE (서열 2)이다. 또 다른 실시예는 레이만 등 (2010, 상기 문헌 동일)에 의해 기술된 바와 같은 재조합 CSFV, 예를 들어, 바이러스 pA/CP7_E1E2alf_TLA이며, 대응하는 에피토프는: TLANKDTLA (서열 3)이다.

본 발명에 따른 방법에 사용되는 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프는 천연 또는 합성인 다양한 공급원으로부터 얻을 수 있다. 가장 편리한 것은 인간의 개입에 의해, 예를 들어 재조합 DNA 기술을 통해 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 조정하고, 이어서 생체 외 재조합 발현 시스템에서 돌연변이된 에피토프를 포함하는 단백질 (예를 들어, CSFV E2 단백질, 또는 이들의 부분)의 발현에 의한, 예컨대 변형, 또는 돌연변이에 의해 CSFV E2의 TAVSPTTLR 에피토프에 돌연변이를 도입하는 것이다.

본 발명에서, "인큐베이션"은 항체와 그의 특이적인 에피토프 간의 결합을 허용하는 것을 지칭한다. 이것은 이러한 분자적 상호작용의 형성에 도움이 되는 반응 조건을 요구할 것이며 올바른 완충액, 온도 및 기간의 사용을 포함할 것이다. 본 발명의 인큐베이션에 대한 재료 및 방법은 잘 알려진 핸드북 및 상업적 시험의 공급사에 의해 제공된 지침에 기술되어 있다.

본 발명의 맥락에서 "담체"는, CSFV E2 단백질의 에피토프를 운반하고 나타낼 수 있는 거대분자적 구조를 지칭한다. 에피토프가 항체와의 결합에 접근가능 하다면 원칙적으로 모든 구조가 적절할 수 있다. 담체는 생물학적 또는 무기적 기원일 수 있으며, 천연 또는 합성, 크거나 작을 수 있고, 예를 들어 금속 입자, 고분자, 단백질 또는 탄수화물일 수 있다. 에피토프는 공유 결합에 의하거나, 모든 종류의 이온성, 정전기적, 유체역학적, 또는 분자적 상호작용을 포함하는 비-공유 결합에 의해 결합될 수 있다. 에피토프는 담체 상에 또는 내에 포함되며, 따라서, 예를 들어 단백질의 내부 구성요소로서, 또는 융합 단백질로서 이것의 일부일 수 있다. 담체는 또한, 예컨대 에피토프를 포함하는 단백질이 지질- 또는 당단백질, 또는 접합체, 등인 경우 다른 분자 또는 기를 함유할 수 있다. 에피토프를 담체에 결합시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 생화학적- 또는 재조합 DNA 기술을 포함할 수 있다.

본 발명에서, 단백질은 아미노산의 분자 사슬이다. 단백질은 미성숙 또는 성숙 단백질, 프리- 또는 프로-단백질, 또는 단백질의 면역원성 단편일 수 있다. 특히: 펩티드, 올리고펩티드 및 폴리펩티드가 단백질의 정의에 포함된다.

본 발명의 담체는 "고정화" 되었으며, 공유- 에 의하거나, 예컨대 흡착 또는 코팅 등에 의한 비-공유 결합에 의해 고체상에 결합됨을 의미한다. 이것은 고체상 자체가 고정인 것을 시사하지 않는다. 고체상은, 이것이 본 발명에 따른 검출 방법의 수행을 허용한다면 원칙적으로 임의의 고체 지지체일 수 있으며, 다른 크기, 모양 또는 형태, 예를 들어 플레이트, 입자, 막 등일 수 있다.

고체상에 담체를 고정화하기 위한 방법 및 재료는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 카르보네이트 완충액 및 염기성 pH 값의 사용을 포함할 수 있다. 대안적으로 고정화는, 예를 들어 공유 결합을 일으키는 화학적 반응, 또는 담체의 비오틴화 및 아비딘 코팅된 고체 지지체에의 결합에 의할 수 있다.

바람직하게는 고체상은 미세-적정 플레이트의 웰, 또는 알파리사 분석에 사용되는 담체 비드(bead)이다.

본 발명에서 "공동-인큐베이션"은 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체가 CSFV E2의 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 고정화된 담체 및 시험 샘플과 함께 인큐베이션 되는 것을 의미한다. 실제로 이것은 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체가 CSFV E2의 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 고정화된 담체 및 시험 샘플을 인큐베이션 하는 단계에 적용되는 인큐베이션 혼합물에, 인큐베이션에 요구되는 시간의 적어도 상당 부분 동안 존재함을 의미할 것이다. 얼마나 많은 시간이 '상당 부분'을 구성하는지는 수행되는 진단 분석에 대한 특정 프로토콜의 세부사항에 의존한다. 예를 들어, 아이덱스 CSFV Ab 시험의 제조사의 지침은, 시험 샘플 및 고정화된 E2 단백질을 인큐베이션 하는 단계에 대한 시간 기간이 2 시간 또는 밤새 (12 내지 18 시간) 중 어느 하나임을 나타낸다.

본 발명에서 '시간의 상당 부분'은 CSFV E2의 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 고정화된 담체 및 시험 샘플을 인큐베이션 하는 단계에 대한 시간의 25 % 이상을 지칭한다. 바람직하게는, 바람직한 순서대로, 시간의 50 %, 보다 바람직하게는 시간의 75, 90, 95, 99, 또는 100 %이다.

본 공동-인큐베이션은 본 발명에 따른 방법을, 시험 샘플 및 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체를 인큐베이션하는 별도의 추가적인 단계를 수행할 수 있고, CSFV E2의 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 고정화된 담체와 함께 인큐베이션 하기에 앞서 수행될 수 있는 사전-인큐베이션으로서 고려될 수 있는 인큐베이션과 구별한다. 이러한 사전-인큐베이션은 임의의 원치 않는 결합 반응을 감소시키는 데에 좋은 조절 가능성을 허용하므로 인큐베이션 프로토콜을 최적화 할 때 당업자에게 표준적인 선택이 될 수 있다. 그러나 시험의 선택성 및 특이성에 유해한 영향 없이, 이들 인큐베이션이 공동-인큐베이션으로서 한 단계에 유리하게 통합될 수 있음은 본 발명의 놀라운 발견이다.

기술된 바와 같이, 두드러진 장점 중 하나는 공동-인큐베이션이 수행될 진단 분석을 위한 추가적인 시간을 요구하지 않는다는 것이다. 추가의 장점은 표준 상업적 E2 ELISA의 기본 프로토콜이 시험 성분 또는 그 프로토콜에 현저한 수정 없이 사용될 수 있다는 것이다.

본 발명에 따른 방법의 한 실시양태에서, 검출은 효소 면역-분석에 의하여, 보다 바람직하게는 ELISA (효소 결합 면역흡착 분석)에 의한다.

ELISA류는 잘 알려져 있으며, 형식 및 프로토콜의 다양한 유형이 알려져 있다. 일반적인 장점은 이들이 빠르고 신뢰할 만한 결과를 제공하고, 쉽게 규모 증가 (scale up)될 수 있다는 것이다.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, ELISA는 간접 블로킹 ELISA이다. 당업계에 알려진 바와 같이, 이것은 시험 샘플의 항체가 고정화된 에피토프와의 결합에 대해 표지된 검출자 항체와 경쟁한다는 것을 시사한다. 시험 샘플에 항체가 더 많이 존재할 수록, 이것이 고정화된 에피토프에 더 많이 결합하며, 표지된 항체가 더 적게 유지될 수 있으며, 표지 결합의 최대 수준의 감소 (억제)를 일으킨다.

검출이 간접 블로킹 ELISA에 의하는 본 발명에 따른 방법에 대한 예시적인 프로토콜은:

- 고체상에 CSFV E2의 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체의 코팅 단계,

- 시험 샘플 및 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체를 코팅된 담체와 공동-인큐베이션 하고, 이어서 세척하는 단계,

- 표지된 2차 항체와 함께 인큐베이션 하고, 이어서 세척하는 단계,

- 발색 반응 단계, 및

- 결과의 판독 단계

의 연속적 단계의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다.

단계 중 일부는 별도로, 또는 다른 집단에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상업적 시험으로서 적용될 때, 상업적 공급사는 시험 샘플과의 공동-인큐베이션에 사용될 준비가 된 사전-코팅된 고체상을 제공할 수 있다.

임의로 프로토콜은 하나 이상의 거짓 양성 결합 반응의 블로킹-오프 단계를 추가적으로 함유할 수 있다. 전형적으로 이것은 인큐베이션- 및/또는 세척 단계에 사용되는 완충액에서 과량의 비특이적 단백질, 예를 들어, 탈지유, 또는 혈청 알부민과 함께 인큐베이션 하는 것을 포함한다.

ELISA는 이것의 시약 및 처리 단계, 예컨대 인큐베이션 단계의 온도 및 기간; 고정화 또는 검출에 사용되는 항체 또는 항원의 특이성 및 유형; 적용된 고정화의 양 및 방법; 및 사용된 인큐베이션- 및 세척 완충액의 조성의 조정에 의해 추가로 최적화 될 수 있다.

효소 면역분석에 대한 일반적인 참조는 다양한 공개물, 그 중 표준 실험실 교재, 예컨대: 문헌 ['The Immunoassay Handbook (4th ed.: Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques'; D. G. Wild edt., 2013, ISBN-10: 0080970370)]; 및 문헌 ['The ELISA Guidebook' (Methods in Molecular Biology, vol. 149, J. R. Crowther, Humana Press, 2000, ISBN-10: 0896037282)]에 존재한다. 대안은 상업적 공급사의 설명서, 예컨대: 문헌 ["Technical guide for ELISA", KPL Inc., Gaithersburg, MD, USA, 2013]; 및 문헌 ["Assay guidance manual" by Eli Lilly &Co., chapter: Immunoassay methods, K. Cox et al., May 2012]이다.

추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 ELISA는 CSFV E2 항체에 대한 상업적 ELISA, 예를 들어: 이전에 세디테스트® CSFV 2.0 ELISA로 명명되었던 프리오체크 ® CSFV Ab 2.0 ELISA (양자 모두 프리오닉스 AG (스위스, 슐리렌-취리히)에서 입수가능), 또는 아이덱스 유럽 B.V. (네덜란드 후프도르프)에서 입수가능한 아이덱스 CSFV Ab 테스트와 본질적으로 유사하다. 이 측면에서 '본질적으로 유사한'은 이들 상업적 시험에 사용되는 프로토콜 및 재료를 지칭한다.

본 발명에 따른 방법의 대안적 프로토콜이 또한 고안될 수 있다. 예를 들어 본 발명에 따른 방법은 당업계에 잘 알려진 알파리사 시험의 프로토콜의 특성에 기반하여 설정될 수 있다. 이러한 시험에서, 세척 단계는 요구되지 않으며 분석이 수동으로 수행될 수 있지만 자동화된 알파리사가 바람직하다.

알파리사 프로토콜의 특징은 항원 (본원에서: CSFV E2의 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체) 및 항체 (본원에서: CSFV E2의 TAVSPTTLR 에피토프에 특이적인 (단일클론) 항체)가 담체 비드에 결합하고, 이들의 결합이 빛 발광에 의해 검출가능 하다는 것이다.

CSFV E2의 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체는 예를 들어 비오틴화 되고 아비딘-코팅된 수용자 비드에 고정화될 수 있으며, 증여자 비드와 접합된 항체와 함께 사용될 수 있다. 이러한 알파리사 시험의 한 단계는 이후 시험 샘플 및 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체와 함께 CSFV E2의 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체로 코팅된 수용자 비드를 공동-인큐베이션 하는 것을 포함할 수 있다. 이로써 양 담체가 모두 코팅되는 주변의 다른 방법 (CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프가 코팅되는 것을 포함하는 것을 포함하는 담체), 또는 중간 형태가 동등하게 가능하다. 다음 단계는 이후 항체-코팅된 증여자 비드와 함께 인큐베이션 하고, 최종적으로 결과를 판독하는 것일 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 방법의 실시양태에서, 검출은 알파리사®의 특성을 갖는 진단 시험에 의한다.

본 발명에 따른 방법은 CSFV 감염에 취약한 동물에서 유래된 샘플을 시험하는 데에 가장 유리하다. 이들은 돼지 과의 다양한 동물이다.

따라서, 본 발명에 따른 방법의 실시양태에서, 시험 샘플은 돼지 동물로부터 유래한다.

본 발명에서 "돼지"는 멧돼지 과(Suidae)의 동물, 바람직하게는 멧돼지 속(Sus)의 동물, 예를 들어: 야생 또는 집 돼지, 돼지(swine), 돼지(hog), 멧돼지, 바비루사, 또는 혹멧돼지를 말한다. 이것은 또한 이들의 성별 또는 연령을 지칭하는 임의의 명칭 예컨대: 암퇘지(sow), 수퇘지(boar), 돼지(hog), 암퇘지(gilt), 이유기 새끼 돼지(weaner), 또는 새끼 돼지(piglet)에 의해 지시되는 돼지를 포함한다.

본 발명에 따른 방법의 추가의 유리한 적용은 CSFV 마커 백신으로 CSFV에 대해 예방접종된 돼지 동물의 샘플을 시험하는 것이다.

상기에 기술되고 잘 알려진 바와 같이, 마커 백신의 항원은, 예를 들어 에피토프를 결여하거나, 야생형 버전과 비교하여 다른 버전의 에피토프를 가지는 점에서 이것이 기반한 야생형 항원과 항원적으로 다르다. 전형적으로 마커 백신의 항원은 생화학적- 또는 재조합 DNA 기술에 의해 조정 또는 변형되었으며, 결과는 마커 백신의 변형된 항원에 대한 항체 반응이 변형되지 않은 야생형 항원에 대한 항체 반응과 구별될 수 있다는 것이다. 이것은 혈청학적 "예방접종된 동물로부터 감염된 것의 구별" 또는: DIVA를 허용할 것이다.

따라서, 본 발명에 따른 방법의 실시양태에서, 시험 샘플은 CSFV 마커 백신으로 CSFV에 대해 예방접종된 돼지 동물로부터 유래한다.

본 발명에 따른 방법의 특히 유리한 적용은 CSFV (마커) 백신이 CSFV 항원으로서 CSFV E2의 TAVSPTLLR 에피토프의 돌연변이에 의해 야생형 E2에서 벗어난 CSFV E2 단백질을 포함할 때 명백해진다. 상술한 바와 같이, 이러한 백신으로 예방접종된 동물의 샘플에서, CSFV 항체에 대한 기존의 진단 시험을 사용할 때, 거짓 양성 스코어가 발견되었다. 그러나 본 발명에 따른 방법은 오직 진정 양성 스코어만을 보여준다. 이것은 돼지 농업의 수의과적 보건 및 경제에 주요한 영향을 갖는다.

따라서, 본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 시험 샘플을 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 CSFV E2 단백질을 포함하는 CSFV 백신으로 CSF에 대해 예방접종된 돼지 동물에서 얻는다.

상술한 바와 같이, 원칙적으로 많은 형태의 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 본 발명에 따른 방법에 대한 공동-인큐베이션에서의 사용에 생각할 수 있다. 그러나, 이 방법은 공동-인큐베이션에서 수행되는 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프의 경우에 마커 CSFV 백신에서와 같이 가장 유리하게 적용된다.

따라서, 본 발명에 따른 방법의 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법에 대한 공동-인큐베이션에 사용되는 담체에 포함되는 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프는, CSFV 마커 백신의 CSFV E2 단백질에 존재하는 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프와 동일하다.

추가적 고려 사항이 CSFV 마커 백신의 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프에 적용된다: 이 백신은 TAVSPTTLR 에피토프에 대한 돌연변이에도 불구하고, 표적 동물에서 CSFV에 대한 효과적인 면역 반응을 반드시 여전히 유도할 수 있어야 한다.

본 발명에서, 바람직하게는, 한편으로는 본 발명에 따른 방법에서 시험될 시험 샘플이 유래된 동물을 예방접종하는 데에 사용되는 CSFV 마커 백신의 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프와, 다른 한편으로는 본 발명에 따른 방법에 대한 공동-인큐베이션용 담체에 포함되는 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프 사이에 일치가 존재한다.

따라서, 본 발명에 따른 방법의 실시양태에서, 공동-인큐베이션용 담체에 포함되는 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프는, 시험 샘플을 얻는 돼지 동물을 예방접종하는 데에 사용되었던 CSFV 백신의 CSFV E2 단백질에 포함되는 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프와 동일하다.

당업자는 어느 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프가 이러한 돌연변이된 에피토프를 포함하는 CSFV E2 단백질을 포함하는 CSFV 마커 백신을, 효과적인 면역원이 되도록 허용하는지 완벽하게 결정할 수 있다. 예를 들어 예방접종 후, 또는 도전 감염 이후 면역학적 반응을 모니터링 하는 것, 예를 들어, 표적의 질병의 임상적 신호, 임상적 스코어링, 혈청학적 파라미터를 모니터링하는 것에 의하거나, 병원균의 재-단리, 및 거짓 예방접종된 동물에서 보여지는 반응에 대한 이들 결과를 비교하는 것에 의한다.

NB: CSFV가 매우 전염성이고, 많은 국가에서 신고대상 질병이므로, 전염성 CSFV (야생형 또는 약독화된 것 중 하나)를 함유할 수 있는 샘플의 임의의 실험실- 또는 축산학적 용도는 반드시 국가적- 또는 국제적 가이드라인에 따른 적절한 생물안전성 예방책으로 수행되어야 한다.

본 발명에 따른 방법에 대한 공동-인큐베이션에 사용되는 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체와 매칭될 수 있는 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 가진 CSFV E2 단백질을 포함하는 CSFV 백신의 예는, 당업계에 알려져 있으며 상기에 기술되어 있다. 예를 들어 코르테카스 등 (2010, 상기 문헌 동일)에서; 한 예는 서열 2에 나타난 바와 같은 아미노산 서열: TAGSTLRTE를 갖는 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 CSFV E2 단백질을 갖는, vFlc-ΔPTa1이라는 이름의 돌연변이 CSFV이다.

또 다른 예는 레이만 등에서 (2010, 상기 문헌 동일): 서열 3에 나타난 바와 같은 아미노산 서열: TLANKDTLA를 갖는 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 CSFV E2 단백질을 갖는, pA/CP7_E1E2alf_TLA라고 명명된 돌연변이 CSFV이다.

따라서, 본 발명에 따른 방법의 실시양태에서, 공동-인큐베이션에 사용되는 담체에 포함되는 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프는 아미노산 서열: TAGSTLRTE (서열 2)를 갖는다.

본 발명에 따른 방법의 대안적 실시양태에서, 공동-인큐베이션에 사용되는 담체에 포함되는 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프는 아미노산 서열: TLANKDTLA (서열 3)를 갖는다.

추가의 실시양태에서, 본 발명에 대한 시험 샘플은 코르테카스 등 (2011, 상기 문헌 동일)에 기술된 바와 같이, 예컨대 상술한 바와 같이 vFlc-ΔPTa1이라는 명칭의 돌연변이주 CSFV에 기반한 백신과 같은 CSFV 백신으로 예방접종된 돼지 동물에서 유래된다.

따라서, 본 발명에 따른 방법의 추가의 실시양태에서, CSFV 백신은 vFlc-ΔPTa1 바이러스에 기반하였다.

본 발명에 따른 방법에의 사용에 대해 기술된 담체의 두 가지 다른 실시양태는: 고체상에 고정화하는 데에 사용되는, CSFV E2의 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체, 및 공동-인큐베이션에 사용되는 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체이다. 이들 담체는 다른 형태를 가질 수 있으며, 돌연변이된- 및 야생형 TAVSPTTLR 에피토프에 대한 담체는 동일하거나 다른 유형일 수 있으며; 또한 이들은 별도이거나, 동일한 엔티티, 예를 들어, TAVSPTTLR 에피토프의 양 유형을 포함하는 하나의 담체일 수 있다.

본 발명에 따른 방법의 실시양태에서, CSFV E2의 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 고정화된 담체, 또는 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체 중 하나가 단백질이거나, 양 담체 모두가 단백질이다.

이들 단백질은 동일하거나 다를 수 있다.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, CSFV E2의 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 고정화된 담체, 또는 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체 중 어느 하나가, CSFV E2 단백질이거나, 양 담체 모두가 CSFV E2 단백질이다.

야생형- 또는 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 갖는 것 외에, 나머지 CSFV E2 단백질 담체는 또한 아미노산 서열에서 다를 수 있다; CSFV E2의 여러 예가 문헌에 기술되어 있으며, 이들의 서열은 공공 데이터베이스, 예컨데 젠뱅크(GenBank)™로부터 입수가능하다.

CSFV E2의 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 고정화된 담체가 CSFV E2 단백질일 때, 이것은 시험 샘플로부터 CSFV에 대한 항체를 검출하는 최상의 기회를 제공한다.

유사하게, CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체가 CSFV E2 단백질일 때, 이것은 포획되지 않으면 거짓 양성 결과를 일으킬 수도 있는, 동물 시험 샘플에 존재할 수 있는 임의의 교차-반응성 항체의 포획에 대한 최상의 기회를 제공한다. 이것은 CSFV E2 단백질이 자신의 에피토프의 천연 형태와 가까운 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프의 3D 형상을 제공할 것이기 때문이다.

따라서, 본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 양 담체 모두 완전한 성숙 CSFV E2 단백질이다.

그러나, 당업계에 알려진 바와 같이, C-말단 막투과 영역, 사실상 절반의 E2의 C-말단은 결합 항체에 대해 덜 관련된다 (문헌 [van Rijn et al., 1994, J. of Virology, vol. 68, p. 3934; Chang et al., 2010, Virus Res., vol. 149, p. 183]). 결과적으로, 본 발명에 따른 방법의 맥락에서 당업자는, 하나 이하의 담체가, 여전히 좋은 야생형 CSFV 항체 검출 및 좋은 거짓 양성 스코어의 감소를 허용하는 완전한 성숙 E2 단백질이지만, 이들의 부분은 아닌 - (돌연변이된) TAVSPTTLR 에피토프가 그 자체로 여전히 존재한다면 - 본 발명에 따른 야생형 CSFV 항체 검출 방법을 잘 개발하고 최적화할 수 있을 것이다.

본 발명에 따른 방법에서 CSFV E2의 (돌연변이된) TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체로서 CSFV 단백질, 또는 이들의 부분의 사용을, 공동-인큐베이션의 양 및 조건을 변화시키는 것에 의해 추가로 최적화 할 수 있다. 예를 들어 발명자는 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 갖는 CSFV E2 단백질을 잘 알려진 배큘로바이러스(baculovirus) 발현 벡터 시스템에서 발현시켰고, 상기 단백질을 정제했으며, 재조합 발현 E2 단백질을 공동-인큐베이션 분석에 사용하였다.

발현된 E2 단백질의 순도 및 양을, 예를 들어 SDS-겔 -전기영동법, 단백질 염색, 및 광-밀도계측에 의한 정량화에 의해 측정할 수 있다. 한 가지 대안은 E2에 결합하는 항체를 사용하여 TAVSPTTLR가 아닌 또 다른 에피토프 및 알려진 농도의 기준 샘플을 통해 Elisa에서 정량화하는 것이다.

단백질의 순도에 따라, 거짓 양성 스코어의 최적의 감소를 제공하면서 야생형 CSFV 항체의 최적의 검출을 얻도록 (돌연변이된) TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 E2 단백질 담체의 양을 선택한다. 본원에서 예시된 바와 같이, 전형적으로 96 웰 미세적정 플레이트의 웰 당 2 μg 미만의 E2 단백질이 요구되었다. 웰 당 1 μg 또는 심지어 0.5 μg의 양이 또한 효과적이다.

기술한 바와 같이, 야생형 CSFV 항체에 대한 기존의 상업적 진단 시험은 이들의 감도- 및 특이성 프로파일을 결정하기 위한 시험 데이터의 큰 부분에 기반하여 이들의 확실성을 확립하였다. 이것은 국제적으로 알려진 표준 양성- 및 음성 기준 샘플 세트에 의해 유지된다. 이 분석 및 기준 샘플의 조합의 신뢰도는 이들의 마케팅 권한 부여 및 이러한 분석으로 시험된 동물의 정부-통제된 수출 인증에서의 이들의 사용에 대한 기초가 된다.

이러한 확립된 분석의 이전 시험-스코어 및 기준 값에 완전한 통합을 달성하기 위한 본 발명에 따른 방법을 위해서, 시험 프로토콜에 대한 추가의 조정을 행할 수 있다. 특히 분석 프로토콜의 인큐베이션 조건을 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프가 도입된 공동-인큐베이션 단계에 추가적 성분을 수용하도록 조정할 수 있다.

발명자는 상기 단계의 인큐베이션 조건의 조정 없이 본 발명에 따른 방법이 여전히 기능하며, 거짓 양성 스코어를 감소시키는 데에 매우 효과적임을 발견하였으나; 본 발명에 따른 방법을 사용하여 확립된 표준 샘플을 시험한 경우, 이후 얻어진 정확한 OD 스코어는 이러한 표준에 대한 이전 결과를 더 높거나 낮게 벗어날 수 있다. 이것은 추가적인 화합물의 첨가가 일정 부피의 액체를 인큐베이션 혼합물에 첨가하는 것을 요구하기 때문이며, 이것이 표준 스코어로부터 벗어남을 야기하는 인큐베이션 완충액의 희석 및 예컨대 염, 안정화제, 세정제 또는 블로킹제를 포함할 수 있는 성분을 일으킬 수 있다.

따라서, 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 담체의 첨가를 수용하기 위해 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체와 공동-인큐베이션 하는 것을 포함하는 단계의 인큐베이션 조건을 조정하는 것을 포함한다.

이 "조정"이 수행될 수 있는 여러 방법이 있다. 가장 직접적인 것은 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체를 포함하는 용액을 본 발명에 따른 방법에 사용되는 인큐베이션 완충액으로 하는 것으로, 이로써 인큐베이션 완충액이 본 방법에 사용될 때 그의 최종 농도와 비교하여 증가된 농도에 있게 된다. 예를 들어, CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체를 포함하는 용액, 및 인큐베이션 완충액의 동등한 부피를 조합할 때, 이후 인큐베이션 완충액을 그 최종 용도의 2x 농도인 스톡 용액으로 제공할 수 있다. 이것은 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체를 포함하는 용액에 이미 존재하는 임의의 염 또는 완충액에 대해 정확히 하는 것을 또한 요구할 수 있다. 이 원리는 다른 부피비 및 인큐베이션 완충액 스톡 용액에 대해 대응하는 농도에 쉽게 조정될 수 있다.

대안적으로, 사용 준비된 사전혼합된 용액에 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체를 이미 포함하고, 여기서 인큐베이션 완충액이 그의 최종 사용 농도인 인큐베이션 완충액을 제공할 수 있다.

이전 예는 용액의 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체를 제공하는 것에 의존하였다. 그러나, 이것이 단백질의 안정성에 최적이 아닐 수 있으므로, 대안은 최종 사용 농도의 인큐베이션 완충액 용기 옆에, 별도의 용기에 동결 건조된 형태로 CSFV E2의 돌연변이된 에피토프를 포함하는 단백질을 제공하는 것이다. 단백질이 이후 인큐베이션 완충액으로 사용 직전에 재구성될 때, 이것은 단백질의 안정성에 영향을 미치지 않으며, 재구성은 인큐베이션 완충액의 농도를 (두드러지게) 변화시키지 않는다.

당업자는 유사한 용액에 도달하도록 다른 조합을 고안하고 최적화할 수 있을 것이다.

기술된 바와 같이, 본 발명에 따른 방법을 적용하는 선호되는 방법은 본 방법을 적용하는 데에 필요한 다양한 성분을 포함하는 진단 시험 키트를 사용하는 것에 의한다.

따라서, 본 발명의 추가의 측면은 본 발명에 따른 방법을 구현하기 위한 진단 시험 키트와 관련된다.

본 발명에서, "진단 시험 키트"는 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한 부분의 키트와 관련된다. 키트는 본 방법을 적용하기 위한 하나 이상의 성분, 특히: 고체상에 고정화된 CSFV E2의 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체, 및 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체를 포함한다. 이들은 편리한 형태 및 용기로, 임의로 샘플 희석 및 인큐베이션, 블로킹, 또는 세척 완충액, 및 임의로 어떻게 방법을 수행하고 어떻게 결과를 판독- 및 해석하는지에 대한 지침과 함께 제공되어야 한다.

한 실시양태에서, 키트는 복수의 웰을 갖는 용기, 예컨대 미세적정 플레이트를 포함할 수 있다. 용기의 웰을 본 발명에 따른 방법에 사용되는 하나 이상의 성분을 함유하도록 처리할 수 있다.

본 발명에 따른 진단 시험 키트의 바람직한 실시양태에서, TAVSPTTLR 에피토프를 갖는 CSFV E2 단백질을 미세적정 플레이트의 웰에 고정화 한다.

임의로 본 발명에 따른 진단 시험 키트를 포함하는 지침은, 예를 들어 키트의 구성요소를 포함하는 상자에 기재될 수 있거나; 그 상자의 전단지에 나타날 수 있거나; 키트 배포자 등의 인터넷 웹사이트에서 볼 수 있거나, 다운로드 가능할 수 있다.

본 발명에서, 진단 시험 키트는 또한 본 발명에 따른 방법을 포함하는 분석에 병용되기 위한, (상업적 판매와 관련된) 언급된 부분의, 예를 들어 인터넷 웹사이트 상 제공일 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 시험 키트는 추가적인 성분과 공동-인큐베이션을 수용하기 위한 변형을 갖는, 야생형 CSFV E2 항체에 대해 알려진 상업적 시험 키트 중 하나에 기반할 수 있다, 즉 예를 들어 프리오체크® CSFV Ab 2.0 (프리오닉스), 또는 아이덱스 CSFV Ab 테스트® (아이덱스)와 본질적으로 동일하다. 공동-인큐베이션에 대한 지침을 제공하기 위한 변형은 수정된 사용자 지침과 관련될 수 있다. 또한, 키트는 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체를 포함하고, 예를 들어 인큐베이션 완충액에서 재현탁될 동결 건조된 제제를 포함하는 용기를 추가적으로 제공할 수 있다. 대안적으로, 시험 키트는 공동-인큐베이션에서 인큐베이션 완충액 스톡 용액과 함께 사용되는, 그의 최종 사용 농도보다 더 높은 농도의 인큐베이션 완충액의 스톡 용액을 갖는 용기, 및 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체를 포함하는 용액을 포함하는 용기를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 진단 시험 키트의 성분을 도입하기 위한 여러 다른 실시양태는 당업자에게 생각될 수 있다. 따라서, 이러한 실시양태는 본 발명의 범위에 속한다.

따라서, 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 시험 키트는 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체를 포함하는 용기를 포함한다.

추가적 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법, 또는 본 방법에 따른 진단 시험 키트의 공동-인큐베이션에 대한 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체의 용도와 관련된다.

이러한 용도는 동물 시험 샘플의 야생형 CSFV 항체의 검출에 대해, 특별히 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 CSFV E2 단백질을 포함하는 CSFV 백신으로 CSF에 대해 예방접종된 동물의 샘플에 대해 제공된다. 이 용도는 기술된 바와 같이, 임의의 거짓 양성 스코어의 감소를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 용도는 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체의 용도와 관련된다. 바람직하게는, 담체는 단백질이며, 바람직하게는 상기 단백질은 CSFV E2 단백질이고, 바람직하게는 상기 CSFV E2 단백질은 완전한 성숙 단백질이다.

본 발명에 따른 검출 방법의 추가의 유리한 적용은 CSFV 예방접종 및 검출에 대한 DIVA 접근법에 대한 이것의 적용에 있다. 이것은 CSFV에 대해 예방접종된 동물 및 CSFV로 감염된 동물 간의 구별을 허용한다. 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 CSFV E2 단백질을 포함하는 CSF에 대한 백신의 사용에 의해 예방접종될 때, 오직 본 발명에 따른 방법, 및 거짓 양성 스코어의 후속적 제거로 본 방법에서 혈청학적 구별이 가능하다.

따라서, 추가의 측면에서, 본 발명은 야생형 CSFV로 감염된 동물 및 CSFV 백신으로 CSFV에 대해 예방접종된 동물을 구별하는 방법과 관련되며, 이로써 백신이 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 CSFV E2 단백질을 포함하고, 본 방법이 본 발명에 따른 검출 방법의 사용을 포함하거나, 본 발명에 따른 진단 시험 키트의 사용을 포함한다.

본 발명에 따른 구별 방법은 상술한 바와 같이 동물 시험 샘플을 사용하는 생체 외 진단 방법이다. 당업자는 본 발명에 따른 구별 방법이 조사된 시험 샘플에 대한 진단 스코어의 결과와 관련되는 것을 실현할 것이다. 특히 CSFV E2 단백질 항체의 검출은 이들의 존재 또는 부재 중 하나, 또는 이들의 절대값의 수준, 또는 대조군 샘플의 값과 비교한 상대값에 의한다.

본 방법에 대한 입력은 대상체로부터의 시험 샘플이며; 대상체는 바람직하게는 돼지 동물이고; 시험 샘플은 바람직하게는 혈액 샘플, 보다 바람직하게는 혈청 또는 혈장 샘플이다.

감염된 것과 예방접종된 동물의 최종 구별을 행하기 위하여, 시험 스코어는 양성 또는 음성으로 해석될 필요가 있으며; 실제로 이것은 특정 임계점 위 또는 아래에 있음을 의미한다. 이것은 시험 샘플과 함께 시험될 몇몇 표준 기준 샘플을 시험에 도입함으로써 편리하게 수행될 수 있다. 이것은 실시예에 기술되어 있다. 양성 및 음성 기준 샘플은 동물로부터 제조될 수 있거나, 여러 기관 및 기준 실험실, 예를 들어 독일 하노버 소재, 수의과 대학의 CSF에 대한 지역 기준 실험실로부터 얻을 수 있다.

시험 샘플을 양성, 음성, 또는 추정으로 스코어링한 후, 이것은 시험 샘플을 채취한 증여자 동물이 야생형 CSFV 감염에 대해 양성, 음성, 또는 추정이라고 진단하는 것에 외삽될 수 있다.

동물이 양성 (또는 추정)으로 진단된 경우, 이후 -정부 규제에 따라 - 해당 동물은 예방접종 및/또는 격리되거나, 책임 있는 방식으로 도태됨으로써 처리될 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 구별 방법의 한 실시양태에서, 본 방법은 또한 다음의 단계에서 선택되는 하나 이상의 단계를 포함한다:

- 시험 샘플을 채취하는 단계

- 양성 및 음성 기준 샘플의 결과와의 비교에 의하여, 얻은 시험 결과를 해석하는 단계.

- 얻은 샘플의 시험 결과와 소정의 컷-오프 값을 비교하는 단계.

- 샘플을 야생형 CSFV에 대한 항체 함유에 대해 양성, 음성, 또는 추정으로 스코어링하는 단계

- 샘플 증여자를 야생형 CSFV 감염에 대해 양성, 음성 또는 추정으로 진단하는 단계, 또는

- 야생형 CSFV 감염 진단으로부터의 양성 또는 추정 결과에 기반하여 샘플 증여자를 예방접종, 격리, 및/또는 도태에 의해 (추천) 처리하는 단계.

하나 이상의 바람직한 실시양태에서, 샘플은 혈청 샘플이거나, 시험 결과는 ELISA 억제 백분율의 스코어이다.

바람직한 실시양태에서, 시험 샘플은 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 CSFV E2 단백질을 포함하는 CSFV 백신으로 CSF에 대해 예방접종된 돼지 동물에서 유래된다.

대안적 측면에서, 본 발명은, 본 발명에 따른 검출 방법의 사용을 포함하거나, 본 발명에 따른 진단 시험 키트의 사용을 포함하고, 야생형 CSFV에 대한 항체의 존재를 양성 및 음성 기준 샘플의 스코어에 관해 결정하는, CSFV 감염을 진단하는 생체 외 방법과 관련된다.

본 발명의 추가의 측면에서, 본 발명에 따른 검출 방법, 또는 본 발명에 따른 진단 시험 키트를 CSFV 질병 근절, 또는 국가적 감시 프로그램에, 동반 진단으로서, CSFV 백신 예방접종과 함께 사용할 수 있다.

본 조합으로, 예방접종된 동물로부터 감염된 것의 구별을 허용하는, CSFV에 대한 DIVA 접근법이 적용될 수 있다.

따라서, 추가의 측면에서, 본 발명은 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 CSFV E2 단백질을 포함하는 CSFV 백신, 및 본 발명에 따른 진단 시험 키트의 병용에 의해 돼지 동물 집단의 야생형 CSFV 감염을 조절하는 방법과 관련된다.

본 발명이 거짓 양성 스코어의 강한 감소를 제공하므로, 예방접종된 동물의 (혈청) 샘플을 현재 야생형 CSFV에 대한 항체라고 신뢰할 만하게 식별할 수 있다. 오직 진정 양성 동물만이 지목되고, 감시-, 스탬핑 아웃-, 또는 근절 프로그램의 맥락에서 적절한 통제 및 격리 조치에 놓일 필요가 있다.

결과적으로, 이 CSFV 백신 및 진단 방법의 병용은 동물 고통 및 경제적 비용을 감소시키는 구조화된 백신-기반 CSFV 근절 프로그램에 의해 원치 않고 매우 비싼 스탬핑 아웃 정책의 대체를 허용한다.

"돼지 동물 집단"은 로컬 (농장), 지역, 또는 심지어 국가적 수준의 군으로 할 수 있다. "병용"에 대한 이 세부사항 및 프로토콜은 사용될 특정 (마커) CSFV 백신이 처방된 예방접종 프로토콜에 의존할 것이다. 또한 병용의 수행은 심사, 또는 심지어 준수해야 할 필요가 있을 수 있는 특정 정부 규제에 대한 요건 및 사유에 의존할 것이다.

일부 실시예: 통상적 예방접종의 경우, 돼지를 어릴 때 CSFV에 대해 한 번 또는 두 번 예방접종할 것이며, 예를 들어, 연 간격으로 부스터 예방접종을 할 것이다. 이들 동물을 야생형 CSFV 감염 의심이 발생할 때마다 시험할 수 있다. 대안적으로: 예방접종된 수출용 돼지를 이들의 예정 수출일 직전에 시험할 수 있다. 또한: CSFV 감염 의심 또는 CSFV 급증 상황의 경우, 예방접종 및 시험을 수 주, 심지어 수 일의 짧은 시간 간격 내에 수행할 수 있다. 이들 및 당업자가 생각할 수 있는 다른 실시양태는 모두 본 발명의 범위 내이다.

실제로, 샘플이 야생형 CSFV 항체에 대해 양성 또는 음성을 스코어링 할 때, 동일한 표적의 샘플을 다른 시간 지점에서 재시험하거나 동일 지역 또는 무리의 다른 동물을 시험하여 확인을 얻을 수 있다. 대안적으로, 결과를 다른 기술, 및 다른 유형의 샘플을 사용하여, 예를 들어, 바이러스 중화 분석, 또는 바이러스 핵산 검출에 의한 (예를 들어, PCR에 의해) 혈액, 조직, 코 점막 또는 분변 중의 바이러스 검출에 의해 확인할 수 있다.

본 발명은 이제 다음의 비-제한적인 실시예에 의해 더 설명될 것이다.

실시예

실시예 1: 돼지 샘플의 시험:

1.1. 시험 샘플:

실시예 1에 사용한 시험 샘플은 중앙 수의과 협회 (네덜란드, 렐리스타트)에서 입수했으며, 코르테카스 등 2011 (상기 문헌 동일)에 의해 기술되었다. 축약하면: 8 주 연령 혈청음성 돼지를, C-균주 또는 vFlc-ΔPTa1 바이러스 중 하나에 기반한 CSFV 백신으로 예방접종하였다. 혈액-샘플을 수 주를 통틀어 채취하였다. 혈청을 시험을 위해 준비하였다. 예방접종 후 28 일 뒤 동물을 야생형 CSFV로 도전 감염시켰다.

1.2. 종래 기술 ELISA 시험:

코르테카스 등 2011 (상기 문헌 동일)에 의해 기술된 바와 같이, 채취한 돼지 혈청을 상업적 ELISA: 프리오체크 ® CSFV Ab 2.0 (프리오닉스)를 사용하여 시험하였다. 이를 제조사의 지침에 따라 수행하였으며, 축약하면: 사전-코팅된 미세적정 플레이트를 사용하고, 키트의 샘플 완충액을 분주하였다. 대조군 샘플을 특정 웰에, 시험 샘플 (돼지 혈청)을 다른 웰에 첨가하였다. 다음 플레이트를 인큐베이션, 세척하였으며, 접합체를 분주하였다. 다시 플레이트를 인큐베이션 및 세척하였으며, 최종적으로 발색제를 첨가하고, 인큐베이션 및 이후 정지시켰다. 다음 플레이트를 OD를 측정함으로써 판독했다. ELISA 억제 백분율을 양성 표준에 기반하여 계산했다. 결과는, 필수적으로 코르테카스 등 2011 (상기 문헌 동일)의 도 4A를 재현하며, 비교 결과로서 도 1a에 도시되었다. 이 ELISA에서, 양성/음성 분리에 대한 임계점은 40 % 억제이다.

이러한 결과로부터 명확하듯: C-균주 예방접종된 돼지 (점선)의 혈청 샘플뿐만 아니라 vFlc-ΔPTa1 바이러스 마커 백신 (실선)으로 예방접종된 돼지의 샘플 모두, 시간이 지남에 따라 양성으로 나타난다; 즉, 40 % 이상의 억제를 유도한다. 결과적으로 C-균주 백신 또는 마커 CSFV 백신 (즉, vFlc-ΔPTa1 바이러스)으로 예방접종된 동물간의 명확한 구별이 이루어질 수 없었다.

1.3. 종래 기술 샘플의 재시험:

이들 코르테카스 등 2011 (상기 문헌 동일)의 혈청 샘플을 이후 CSFV E2 항체: 아이덱스 CSFV Ab 테스트® (아이덱스)에 대한 다른 상업적 ELISA를 사용하여, 제조사의 지침에 따라, 상기에 기술된 프리오닉스 ELISA의 것과 본질적으로 동일한 프로토콜로 재시험하였다.

결과는 도 1b에 나타나 있으며, 회색 수평 막대는 본 분석에서 양성/음성 분리에 대한 임계점을 나타내며, 여기서: 음성은 30 % 이하의 억제; 양성은 40 % 이상의 억제; 30 내지 40 % 억제 사이의 스코어는 추정 샘플이다. 억제 수준이 음성값인 결과는, 음성 대조군의 것보다 더 높은 OD 값을 갖는 샘플을 나타낸다. 이들은 0 % 억제값으로 간주될 수 있다.

도표로부터 명확하고, 프리오닉스 ELISA의 결과와 유사하듯, 거의 모든 샘플이 시간에 따라 양성으로 반응하고; 오직 한 마커 예방접종체 (돼지 제 3161호)만이 완전히 음성에 머물렀다. 돼지 제3163호 및 제3164호의 두 샘플은 예방접종 후 42 또는 49 일에서 스파이크 값을 나타냈고, 이것은 도전 반응과 관련될 수 있다; 재료 부족으로 샘플을 재시험 할 수 없었다.

1.4. E2 단백질

본 발명에 따른 방법에 대한 공동-인큐베이션에 사용하기 위해, C-균주의 CSFV 바이러스 및 vFlc-ΔPTa1 바이러스의 E2 유전자로부터 E2 단백질을 제조하였다. 초기에, 이들의 E2 유전자의 뉴클레오티드 서열은, 오직 침묵 돌연변이만을 사용하면서 배큘로바이러스-곤충 세포 발현 시스템에서의 발현에 최적화된 코돈이었다. 다음 최적화된 서열에 따른 DNA를 화학적으로 합성했으며 피패스트백(pFastBac)® 플라스미드 (라이프 테크놀로지스(Life technologies))에, 폴리헤드린 프로모터 뒤에 클로닝 하였다. 발현 카세트를 부위-특이적 전위에 의해 재조합 박미드(bacmid) DNA로 수송하였으며 DH10Bac 대장균 감응성 박테리아에서 증폭하였다. 다음, 박미드 DNA를 단리하고 Sf9 곤충 세포를 형질감염 하는 데에 사용하였다. 형질감염 상등액에서 채취한 재조합 배큘로바이러스를 신선한 Sf9 곤충 세포를 감염시키는 데에 사용하였다. 배큘로바이러스를 단리하였고 2 L 생물반응기에서 배양한 Sf21 곤충 세포를 감염시키는 데에 사용하였다. 양 E2 단백질을 모두 이들 생물반응기 배양물에서, 주로 상등액에서 발현시켰다. 이것을 수확하고, E2 단백질을 TAVSPTTLR 에피토프 특이적 단일클론 항체와 결합된 세파로스(Sepharose) 컬럼을 통해 친화성 컬럼 크로마토그래피에 의해 단리하였다. 정제된 E2 단백질을 컬럼으로부터 수확하고, 억제 ELISA에 의해 정량화하였다.

SDS-겔 전기영동법을 사용하여, 발현 및 정제된 E2 단백질을 특징지었다: 약 80 kDa의, 약 80 % 순도의 단일 밴드를 관찰하였다. E2를 이후 무게 표준 샘플과 비교하여 Elisa에서 정량화하였다. 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 갖는 재조합 발현 CSFV E2 단백질은 약 800 μg/ml의 정제된 스톡 용액으로 얻을 수 있다.

1.5. 본 발명에 따른 방법에 의한 검출:

본 발명에 따른 시험 샘플에서 야생형 CSFV에 대한 항체를 검출하는 방법을 상기에 기술된 코르테카스 등 2011 (상기 문헌 동일)의 샘플에 적용하였다.

프로토콜은 대개 아이덱스 ELISA에 대한 것에, 공동-인큐베이션을 더한 것에 기반한다. 축약하면: 아이덱스 CSF Ab 테스트 키트를, 키트의 표준 샘플 희석액을 2x 농축된 버전으로 대체한 것 외에 제조사의 지침에 따라 수행하였다. 약 1 μg E2/웰이 존재하도록, 이후 25 μl (시험 키트의 프로토콜에 규정된 부피의 절반)의 이 2x 샘플 희석액을 E2 코팅된 웰에서 50 μl 혈청 샘플 및 25 μl의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 갖는 배큘로바이러스 발현 CSFV E2 단백질 용액과 공동-인큐베이션 하였다.

이들 공동-인큐베이션에 사용된 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 갖는 CSFV E2 단백질은 vFlc-ΔPTa1 백신 바이러스에 포함되는 E2이다.

얻어진 결과는 도 1c에 나타나 있으며, 공동-인큐베이션이 없는 동일한 분석 (도 1b), 또는 공동-인큐베이션이 없는 유사한 분석 (도 1a)의 결과와의 차이를 바로 도시한다. 마커 예방접종된 돼지의 모든 샘플이 음성 반응한 반면 C-균주 예방접종된 돼지의 모든 샘플은 양성 반응한다. 부스터 예방접종의 영향은 발견되지 않았으며, 심지어 돼지 제3163 및 제3164호에 대해 관찰된 스파이크 값은 임계점 미만이었다. 이 방식으로 생 약독화 CSFV 백신에 대해 효과적인 DIVA 시험이 가능하다!

공동-인큐베이션 (본원에 나타나지 않음)에 야생형 CSFV의 E2 단백질을 사용하여 본 실험을 반복할 경우, 결과는 전적으로 달랐다: 모든 샘플, 심지어 C-균주 예방접종된 돼지의 샘플도 음성으로 스코어링되었다. 결과적으로, 이것은 유용한 대안이 아니다.

공동-인큐베이션의 도입이 또한 프리오체크 ® CSFV Ab 2.0 ELISA (프리오닉스)의 기본 프로토콜에서 이루어졌다. 본질적으로 동일한 결과를 관찰하였다: 양성으로 스코어링되는 (본원에서: 40 % 초과의 ELISA 억제) 진정 양성 샘플만을 남기는, 거짓 양성 결과의 매우 효과적인 감소.

1.6. 종래 기술 샘플의 재시험 결과의 요약:

본 실험의 결과는 상술한 바와 같이 표 1에 정리되어 있다. 코르테카스 2011 (상기 문헌 동일) 실험의 예방접종된 동물이 받았을 분류가, CSFV 항체에 대해 양성/추정인 것들에 대해 시험할 때 어떤 E2 항체 검출방법이 적용되었느냐에 따라 다름을 나타낸다. 분명하듯, 오직 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체와의 공동-인큐베이션을 사용하는 것에 의해서만, 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 CSFV E2 단백질을 포함하는 CSFV 백신으로 예방접종된 동물을, 야생형 CSFV 감염되거나 C-균주 예방접종된 동물로부터 명확하게 구별할 수 있다.

표 1: CSFV E2 항체 검출을 위해 다른 방법을 사용하여 CSFV 항체에 대해 추정 또는 양성으로 스코어링된, 코르테카스 2011 실험의 동물 수.

실시예 2: 시험 특이성 및 -감도의 확립.

본 발명에 따른 방법의 특이성 및 감도가 적어도 표준 상업적 CSFV E2 항체 ELISA의 것과 유사하다는 것을 결정하기 위하여, 많은 수의 샘플 (약 900 개)을 본 발명에 따른 방법 중 하나를 사용하여 시험하였다. 샘플은 W.L. 뢰펜(Loeffen) 박사에 의하여, 네덜란드 렐리스타트 소재, 중앙 수의과 협회의 바이러스학 부서의 컬렉션으로부터 입수되었으며, 400 개 초과의 네덜란드의 CSFV 음성 필드 돼지 혈청 군, 수 주에 걸쳐 채취된 400 개 초과의 실험적으로 CSFV 감염된 돼지 샘플 군, 및 혼합된 기원의 약 80 개 돼지 혈청 샘플 군을 포함한다; 이 마지막 군은 CSFV에 대해 예방접종 또는 감염된 돼지뿐만 아니라 BVDV, 또는 BDV 균주뿐만 아니라 일부 혼합 감염된 돼지의 양성 및 음성 혈청을 함유한다.

본 발명에 따른 방법의 적용에서, 모든 샘플을 사전코팅된 플레이트, 양성 및 음성 대조군 샘플, A18 단일클론 항체 접합, 발색 -반응 기질, 정지액(stop solution), 및 세척액을 사용하여, 아이덱스 CSF Ab 테스트 키트의 프로토콜 및 재료를 사용하여 시험하였다. 유일한 차이는 샘플 희석액을 본 시험 프로토콜에 따른 부피의 절반이 사용된, 희석액의 2x 농축된 버전으로 대체한 것이며; 부피의 다른 절반을 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 갖는 CSFV E2 단백질을 포함하는 용액, 즉, vFlc-ΔPTa1 바이러스에 포함된 E2 단백질의 첨가에 의해 제공하였다. 대조군 샘플은 이중으로, 시험 샘플은 한 번 시험하였다.

ELISA 억제 결과의 해석은 상업적 ELISA와 동일했다: 음성은 30 % 이하의 억제; 양성은 40 % 이상의 억제; 30 내지 40 % 억제 사이의 스코어는 추정 샘플이다.

2.1. CSFV 음성 필드 샘플:

음성 필드 혈청 군은 일반적으로 -20 내지 0 % ELISA 억제로 스코어링 된다. 결과는 도 2에 나타나 있다. 413 개 샘플의 평균 스코어는: -11 % ± 5.2 %였다. 이것은 기대와 일치한다: 모든 샘플이 추정/양성 (30 % ELISA 억제)에 대한 임계값보다 훨씬 미만으로 스코어링 되었고, 모두 본 발명에 따르는 검출 방법 및 구별 방법이 진정 음성 샘플로부터 아무런 거짓 양성 스코어를 나타내지 않았다.

2.2. CSFV 양성 실험 샘플:

시간에 따라 채취한 400 개 초과의 CSFV 양성 샘플 군의 분석은 본 발명에 따른 방법의 감도가 우수함을 증명하였다. 결과는 도 3에 나타나 있으며, 특별히 감염 후 초기 시간에, 본 발명에 따른 방법이 상업적 CSFV E2 항체 ELISA보다, 많은 샘플이 양성으로 분류되고 적은 샘플이 추정 또는 음성으로 분류되도록 허용하는 결과를 제공한다. 이것은 감염 후 14 일에서 가장 두드러지며, 감염 후 21 일에서 여전히 다소 나타난다.

결과적으로 이것은 본 발명에 따른 방법의 감도가, 진정 양성을 정확하게 검출하는 것에 있어서 적어도 상업적 CSFV E2 항체 ELISA만큼 좋거나, 달리 보면: 반대로, 기존의 CSFV E2 항체 ELISA의 한 단계로 공동-인큐베이션의 도입이 시험 감도에 유해하지 않았음을 증명한다.

2.3. 혼합된 샘플:

표준 상업적 ELISA의 것과 결과를 비교하도록 한 다양한 유형의 약 80 샘플 군을 본 발명에 따른 방법을 사용하여 시험하였다. 다양한 샘플을 'Erns 학회, "CSFV EU 기준 패널', 및 CVI 렐리스타트 내부 '페스티바이러스 기준 패널'로 알려진 패널에서 얻었다.

샘플 및 이들의 코드가, 본 발명에 따른 방법 ('발명' 열에 나타남), 또는 상업적 CSFV E2 항체 ELISA ('상품' 열에 나타남)의 사용 중 하나를 사용하여 CSFV에 대한 항체 E2의 검출 결과와 함께 표 2에 나와 있다. 샘플 번호 열은 오직 참조 목적이다: 샘플 1 내지 54는 CSFV의 다른 균주로 감염되거나, CSFV에 대해 예방접종된 동물의 필드 샘플의 혈청이다; 샘플을 다른 감염 후 일수(days post infection (dpi)) 또는 예방접종 후 일수(days post vaccination (dpv))에서 채취했다; 샘플 55 내지 60은 진정 음성; 샘플 제61 내지 67은 BVDV 감염; 샘플 68은 BDV 감염; 및 샘플 69 내지 76은 혼합 감염된 혈청이다.

결과는 ELISA 억제 스코어 백분율로서 나타나 있으며, 상업적 ELISA의 스코어링 스케쥴에 따라 분류하였다.

표 2의 결과에서 명확하듯, 시험된 샘플의 대다수에서, 본 발명에 따른 방법을 사용하여 얻어진 결과는 상업적 ELISA보다 더 많은 구별을 갖는 ELISA 억제 백분율에 대한 스코어를 수득하였다. 오직 두 경우에서만, 상업적 ELISA와 비교하여: 샘플 23 및 75, 본 발명에 따른 방법을 사용한 결과가 부정적인 방향으로 벗어났다. 이들이 시험 수행의 오류인지는 알 수 없다. 결과적으로, 본 발명에 따른 방법은 적어도 CSFV E2 항체에 대한 상업적 ELISA만큼 민감하다.

이것은 여러 샘플에 대해, 상업적 ELISA 및 본 발명에 따른 방법이 다른 분류를 가져오는 중요한 결과를 가질 수 있다. 상업적 ELISA에 의해서는 '추정'으로 분류되었지만 본 발명의 방법에 따라서는 CSFV E2 항체에 대해 '양성'으로 분류될 필요가 있을 수 있는 실시예는: 샘플 번호: 제8, 25, 28, 38, 및 45호이다. 유사하게, 샘플 제37호는 음성에서 추정으로 분류가 바뀔 필요가 있을 수 있다.

오직 두 샘플, 제23 및 75호에서, 본 발명에 따른 방법의 결과는 음성이었지만, 상업적 E2 항체 ELISA에 의한 스코어는 양성이었다. 두 분석 중 어느 하나에 있어서의 실험적 오류가 원인일 수 있다.

표 2: ELISA 억제 백분율로 나타난, 혼합 샘플 세트의 CSFV E2 항체 검출 결과.

[도면의 간단한 설명]

도 1:

코르테카스 등, 2011 (상기 문헌 동일)에 의해 기술된 샘플의 CSFV E2 항체에 대한 블로킹 ELISA에 의한 분석 결과: 비교는 표준 상업적 분석에 의한 분석과, 본 발명에 따른 방법에 의한 분석이다.

대쉬선은 C-균주 CSFV 백신으로 예방접종된 돼지 샘플, 'CS' 샘플의 결과를 나타내며; 실선은 vFlc-ΔPTa1 바이러스에 기반한 마커 백신으로 예방접종된 돼지 샘플, 'VS' 샘플의 결과를 묘사한다.

수평 회색 막대는 샘플을 야생형 CSFV E2 항체에 대해 양성, 추정, 또는 음성으로 해석하기 위한, 다른 분석에서의 임계점 스코어를 나타낸다.

도 1a: 비교 결과: 코르테카스 등, 2011 (상기 문헌 동일)의 도 4A의 재현. 사용된 E2 ELISA는 프리오체크® CSFV Ab 2.0 (프리오닉스).

도 1b: 다른 상업적 E2 ELISA, 아이덱스 CSFV Ab 테스트® (아이덱스)를 사용한, 코르테카스 등, 2011 (상기 문헌 동일)의 샘플의 재시험 결과.

도 1c: 본 발명에 따른 검출 방법을 사용한: 공동-인큐베이션이 아이덱스 CSFV Ab 테스트의 한 단계에 도입된, 코르테카스 등, 2011 (상기 문헌 동일)의 샘플의 재시험 결과.

도 2:

400 개 초과의 음성 필드 샘플에서의 CSFV 항체의 분석 결과. 시험을 아이덱스 CSFV Ab 테스트® (아이덱스)에 대한 프로토콜에 따라, 변형으로서 본 발명에 따른 방법의 공동-인큐베이션과 함께 수행하였다. 결과는 미세적정 플레이트 당 검출된 ELISA 억제 백분율의 평균으로서, 조합된 모든 샘플에 대한 결과, 및 모든 플레이트에 대한 것과 함께 나타나 있다. 최고 및 최저값은 검은 막대에 의해 연결되어 검은 마름모로, 평균은 회색 마름모에 의해 나타나 있다.

도 3:

실험적으로 CSFV 감염되고, 접종 후 2, 3, 또는 4 주차에 채취된 돼지의 400 초과의 샘플의 분석 결과. 모든 동물에서 세 가지 샘플이 입수가능하지는 않았다. 검출 방법은 '발명'으로 지시된 본 발명에 따른 방법; 또는 '상품'으로 지시된 상업적 ELISA (아이덱스 CSFV Ab 테스트) 중 어느 하나였다. 분류: 음성, 추정, 및 양성은 상업적 ELISA의 스코어링 스케쥴에 따라 각각 30 % 미만, 30 내지 40 %, 또는 40 % 초과의 ELISA 억제로 할당되고 측정된 ELISA 억제 백분율에 기반한다.

SEQUENCE LISTING <110> Intervet International BV <120> Improved diagnostic test for CSFV antibodies <130> 23678 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Classical swine fever virus <400> 1 Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu Arg 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated TAVSPTTLR epitope from CSFV E2 protein <400> 2 Thr Ala Gly Ser Thr Leu Arg Thr Glu 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated TAVSPTTLR epitope from CSFV E2 protein <400> 3 Thr Leu Ala Asn Lys Asp Thr Leu Ala 1 5

Claims

CSFV E2의 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 고정화된 담체와 시험 샘플을 인큐베이션 하는 단계를 포함하고, 상기 단계에서 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체와 공동-인큐베이션 되는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플이 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프에 대한 항체를 또한 포함할 수 있는, 시험 샘플에서 야생형 돼지 열병 바이러스 (CSFV)에 대한 항체의 검출 방법.
제1항에 있어서, 검출이 ELISA (효소 결합 면역흡착 분석)에 의한 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 시험 샘플이 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 CSFV E2 단백질을 포함하는 CSFV 백신으로 CSF에 대해 예방접종된 돼지 동물에서 얻어진 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 공동-인큐베이션에 사용되는 담체에 포함되는 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프가, 시험 샘플이 얻어지는 돼지 동물을 예방접종하는 데에 사용되었던 CSFV 백신의 CSFV E2 단백질에 포함되는 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프와 동일한 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 공동-인큐베이션에 사용되는 담체에 포함되는 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프가 아미노산 서열: TAGSTLRTE (서열 2)를 갖는 방법.
제4항 또는 제5항에 있어서, CSFV 백신이 vFlc-ΔPTa1 바이러스에 기반한 것인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, CSFV E2의 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 고정화된 담체, 또는 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체 중 어느 하나가 CSFV E2 단백질이거나, 양 담체 모두 CSFV E2 단백질인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 담체의 첨가를 수용하도록, CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체와 공동-인큐베이션 하는 것을 포함하는 단계의 인큐베이션 조건을 조정하는 것을 포함하는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 방법을 구현하기 위한 진단 시험 키트.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 방법, 또는 제9항에 따른 진단 시험 키트에서 공동-인큐베이션 하기 위한 CSFV E2의 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 담체의 용도.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 검출 방법의 사용 또는 제9항에 따른 진단 시험 키트의 사용을 포함하고, 백신이 돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 CSFV E2 단백질을 포함하는, 야생형 CSFV로 감염된 동물과 CSFV 백신으로 CSFV에 대해 예방접종된 동물을 구별하는 방법.
돌연변이된 TAVSPTTLR 에피토프를 포함하는 CSFV E2 단백질을 포함하는 CSFV 백신, 및 제9항에 따른 진단 시험 키트의 병용에 의하여 돼지 동물 집단의 야생형 CSFV 감염을 조절하는 방법.