ES2668459T3 - Prueba de diagnóstico mejorado para anticuerpos del VPPC - Google Patents

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Abstract

Un método de detección de anticuerpos contra el virus de la peste porcina clásica (VPPC) de tipo silvestre en una muestra de ensayo, en el que dicha muestra también puede comprender anticuerpos contra un epítopo TAVSPTTLR mutado de E2 del VPPC, comprendiendo el método una etapa que consiste en incubar dicha muestra de ensayo con un vehículo inmovilizado que comprende un epítopo TAVSPTTLR de E2 del VPPC, caracterizado por que el método comprende la co-incubación en dicha etapa con un vehículo que comprende un epítopo TAVSPTTLR mutado de E2 del VPPC.

Description

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1.5. Detección por el método de acuerdo con la invención:
El método de detección de anticuerpos contra VPPC de tipo silvestre en una muestra de ensayo de acuerdo con la invención se aplicó sobre las muestras de Kortekaas et al., 2011 (supra) descritas anteriormente.
5 El protocolo se basó en gran medida en ELISA IDEXX, con además la co-incubación. En resumen: el kit de IDEXX CSF Ab Test se empleó de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con una excepción: el diluyente de la muestra convencional del kit fue reemplazado con una versión concentrada 2x. Acto seguido, 25 µΙ (que es la mitad del volumen prescrito en el protocolo del kit de prueba) de este diluyente de muestra 2x se co-incubó en los pocillos
10 recubiertos con E2 con 50 µΙ de muestra de suero y 25 µΙ de una solución de proteína E2 del VPPC expresada con Baculovirus con epítopo TAVSPTTLR mutado, de modo que aproximadamente 1 µg de E2/pocillo estaba presente.
La proteína E2 del VPPC con epítopo TAVSPTTLR mutado que se usó en estas co-incubaciones fue la E2 que está comprendida en el virus de la vacuna vFlc-∆PTa1.
15 Los resultados obtenidos se presentan en la Figura 1C, e ilustran inmediatamente la diferencia con los resultados del mismo ensayo sin co-incubación (Figura 1B); o con un ensayo similar, sin co-incubación (Figura 1A). Todas las muestras de cerdos vacunados contra la cepa C reaccionan de forma positiva, mientras que todas las muestras de los cerdos vacunados con marcadores reaccionan de forma negativa. No se encontró efecto alguno de la
20 vacunación de refuerzo, e incluso los valores pico observados para los cerdos n.º 3163 y 3164 estaban por debajo del umbral. De este modo, una prueba DAIV eficaz es finalmente posible para una vacuna viva atenuada contra VPPC.
Cuando este experimento se repitió usando la proteína E2 del VPPC de tipo silvestre para la co-incubación (no
25 presentado en este caso), los resultados fueron totalmente diferentes: todas las muestras se calificaron como negativas, incluso las muestras de cerdos vacunados con la cepa C. En consecuencia, esto no es una alternativa útil.
La introducción de la co-incubación también se hizo en el protocolo básico de ELISA PrioCHECK® CSFV Ab 2.0
30 (Prionics). Esencialmente se observaron los mismos resultados: una reducción muy eficaz de resultados falsos positivos, dejando solo las muestras verdaderas positivas que puntúan de forma positiva (en este caso: por encima del 40 % de inhibición de ELISA).
1.6. Resumen de los resultados a partir de la reevaluación de las muestras de la técnica anterior:
35 Los resultados de los experimentos descritos anteriormente se ensamblan en la Tabla 1. Esto revela que la clasificación de los animales vacunados que reciben el experimento de Kortekaas 2011 (supra), difiere cuando se sometieron a ensayo por ser positivos/sospechosos para anticuerpos VPPC, en función del método de detección de anticuerpos E2 que se aplique. Como es evidente, solamente mediante el uso de co-incubación con un vehículo que
40 comprende un epítopo TAVSPTTLR mutado de E2 del VPPC, los animales vacunados con una vacuna contra VPPC que comprende una proteína E2 del VPPC que comprende un epítopo TAVSPTTLR mutado, puede distinguirse claramente de los animales que habían sido infectados por VPPC de tipo silvestre -o vacunados contra la cepa C.
Tabla 1: Número de animales del experimento de Kortekaas 2011, puntuación sospechosa o positiva para los 45 anticuerpos contra VPPC usando diferentes métodos de detección de anticuerpos contra E2 del VPPC.
Método de detección de anticuerpos E2 del VPPC
Vacunados contra tipo silvestre Vacunados con marcador
ELISA Prionics
4/4 5/5
ELISA IDEXX
4/4 4/5
ELISA IDEXX + co-incubación con E2 de tipo silvestre
0/4 0/5
ELISA IDEXX + co-incubación con E2 mutada
4/4 0/5
Ejemplo 2: Establecimiento de la especificidad y sensibilidad de la prueba.
50 Para determinar que la especificidad y la sensibilidad de los métodos de acuerdo con la invención es al menos comparable a la de un anticuerpo comercial estándar E2 del VPPC por ELISA, un gran número de muestras (aproximadamente 900) se ensayaron usando uno de los métodos de acuerdo con la invención. Las muestras fueron disponibles por el Dr. W.L. Loeffen, de la colección de la División de Virología, Instituto Central de Veterinaria, Lelystad, Países Bajos, e incluyeron un grupo de más de 400 sueros de cerdo de campo negativo a VPPC
55 procedentes de los Países Bajos, un grupo de más de 400 muestras de cerdos infectados experimentalmente por VPPC que fueron muestreadas durante varias semanas, y un grupo de aproximadamente 80 muestras de suero de cerdos de origen mixto; este último grupo contenía sueros positivos y negativos, de los cerdos vacunados contra o
18
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acuerdo con la invención dieron lugar a diferentes clasificaciones. Los ejemplos son: las muestras n.º: 8, 25, 28, 38, y 45, que fueron clasificadas como "sospechosas" por ELISA comercial, pero de acuerdo con los métodos de la invención tendrían que ser clasificadas como "positivas" para anticuerpos contra E2 del VPPC. Del mismo modo, la muestra n.º 37 necesitaría un cambio en la clasificación de negativa a sospechosa.
5 Para solo dos muestras, n.º 23 y 75, el resultado del método de acuerdo con la invención fue negativo, mientras que la puntuación para el anticuerpo contra E2 por ELISA comercial fue positiva. Un error experimental, en cualquiera de los ensayos, puede ser una causa.
10 Tabla 2: Resultados de la detección de anticuerpos contra E2 del VPPC en un conjunto de muestras mezcladas, expresados por porcentaje de inhibición de ELISA.
N.º
Origen/tipo de muestra de suero Invención Comercial N.º Origen/tipo de muestra de suero Invención Comercial
1
pr 83-01/ Denissen 49 dpi/ VPPC 105 94 39 PPC D29 95 76
2
pr 86-01/ Alfort 120 dpi/ VPPC 105 94 40 PPC D18 75 56
3
pr 96-16/ cedipest 28 dpi/ VPPC 69 48 41 PPC D20 77 61
4
pr 96-16/ cedipest 28 dpi/ VPPC 81 51 42 PPC0123, 14 dpi 45 41
5
pr 96-16/ cedipest 28 dpi/ VPPC 61 53 43 PPC0277, 17 dpi 86 69
6
pr. 96-04/ v. Zoelen 46 dpi/ VPPC 96 77 44 PPC0650,20 dpi 76 52
7
pr 95-05/ E2vac. 35 dpi/ VPPC 95 84 45 PPC0902, 21 dpi 49 34
8
pr 95-05/ E2vac. 35 dpi/ VPPC 48 31 46 PPC0123, 20 dpi 73 53
9
pr 95-05/ E2vacc. 35 dpi/ VPPC 76 56 47 PPC0277, 25 dpi 79 62
10
pr 96-05/ Bergen 28 dpi/ VPPC 89 72 48 PPC0902, 26 dpi 85 62
11
pr 96-05/ Bergen 28 dpi/ VPPC 77 56 49 PPC0573, 26 dpi 74 56
12
pr 96-05/ Bergen 35 dpi/ VPPC 76 61 50 PPC0104, 29 dpi 89 69
13
pr 96-04 v. Zoelen 27 dpi/ VPPC 76 52 51 PPC0695, 33 dpi 81 71
14
pr 96-04 v. Zoelen 27 dpi/ VPPC 89 68 52 PPC0573, 33 dpi 85 69
15
pr 96-04 v. Zoelen 27 dpi /VPPC 76 48 53 PPC0123, 43 dpi 95 84
16
pr 96-06/ Henken 28 dpi /VPPC 77 50 54 PPC0104, 77 dpi 94 87
17
pr 96-06/ Henken 28 dpi 78 53 55 pr 90-07/te Breteler/ VDVB 8 -7
20
/VPPC
18
pr 96-06/ Henken 28 dpi /VPPC 82 56 56 pr. 83-04/ Borgers/ VDVB 6 24
19
pr 96-06/ Henken 28 dpi /VPPC 86 62 57 pr. 83-04/ Borgers/ VDVB 2 -13
20
pr 98-04/ Cedipest 49 dpv/ VPPC 74 59 58 pr. 83-04 den Otter/VDVB 12 0
21
pr 98-04/ Cedipest 49 dpv/ VPPC 88 71 59 pr 83-04/ Kossink/ VDVB 1 -5
22
pr 98-04/ Cedipest 49 dpv/ VPPC 96 83 60 pr 83-04 Poels/ VDVB 20 29
23
pr 98-04/ Cedipest 49 dpv/ VPPC 7 48 61 VEF D69 0 18
24
pr 98-04/ Cedipest 49 dpv/ VPPC 82 64 62 VEF D34 15 -6
25
pr 98-08/ aislado 97-01 (Melis) 14 dpi/VPPC 52 38 63 VEF D69 1 2
26
pr 98-08/aislado 97-01 (Melis) 18 dpi/VPPC 74 63 64 VEF 10421/96, 34 dpi -11 0
27
pr 98-08/aislado 97-01 (Melis) 15 dpi/VPPC 23 10 65 VEF NADL/Osloss, 179 dpi 3 2
28
pr 98-08/aislado 97-01 (Melis) 18 dpi/VPPC 51 37 66 VEF Arnsberg, 69 dpi -8 -2
29
pr 98-08/aislado 97-01 (Melis) 14 dpi/VPPC 6 16 67 VEF II Giessen, 64 dpi -5 -7
30
pr 98-08/aislado 97-01 (Melis) 18 dpi/aislado 12 4 68 BD"F -9 1
31
pr 98-08/aislado 97-01 (Melis) 18 dpi/VPPC 72 47 69 pr 94-13/ cepa "F"/VEF 9 -1
32
pr 98-08/aislado 97-01 (Melis) 18 dpi/VPPC 79 55 70 pr 94-13/ cepa "F"/VEF 58 45
33
PPC D33 79 67 71 pr 94-13/ cepa "F"/VEF 85 75
34
PPC D14 36 24 72 pr 97-17/ veld VPPC-VDVB 3 15
35
PPC D21 41 27 73 pr 97-17/veld VPPC-VDVB 12 29
36
PPC D26 87 61 74 pr 97-17/veld VPPC-VDVB/ VPPC 28 dpi 83 73
37
PPC D15 39 25 75 pr 97-17/veld VPPC-VDVB/ VPPC 28 dpi 14 41
38
PPC D21 58 38 76 BD+PPC D20 80 56
21

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ES14815702.7T 2013-12-19 2014-12-18 Prueba de diagnóstico mejorado para anticuerpos del VPPC Active ES2668459T3 (es)

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